專利名稱：進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減的利斯特氏菌、含有該利斯特氏菌的疫苗及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
總體而言，本發(fā)明的領(lǐng)域涉及用于疫苗的減毒細(xì)菌。特別地本發(fā)明涉及在用于疫苗中的減毒單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)和在治療中應(yīng)用這種疫苗的方法。
背景技術(shù)：
微生物已經(jīng)被開發(fā)成為遞送異種抗原的疫苗。可以用經(jīng)過修飾以含有編碼來自不同物種的蛋白質(zhì)或抗原的核酸序列的微生物遞送異種抗原。異種抗原遞送的特別優(yōu)點(diǎn)是能治療或預(yù)防毒性或致死性病原如癌癥和病原性因子(例如HIV或乙肝病毒)所導(dǎo)致的疾病或病癥。注射天然或毒性感染因子對(duì)受體生物體具有潛在的危害。同樣，在被感染個(gè)體中偶然出現(xiàn)的癌細(xì)胞能夠隨即增殖并且同樣對(duì)受體生物體具有潛在的危害。異種抗原遞送的特別優(yōu)勢(shì)還在于已有證據(jù)表明給予減毒的或殺死的制劑或細(xì)胞不能成功地引起有效的免疫應(yīng)答，或其優(yōu)點(diǎn)還在于感染性因子或癌細(xì)胞的充分減毒的可靠性差。最近，某些細(xì)菌菌株已經(jīng)被開發(fā)成重組疫苗。例如經(jīng)修飾表達(dá)鼠瘧原蟲(Plasmodiumberghei)環(huán)子孢子抗原的減毒沙門氏菌口服疫苗在小鼠中表現(xiàn)出抗瘧疾作用(Aggarwal等人，1990，J.Exp.Med.1721083)。
可能用做異種疫苗的一類細(xì)菌是兼性細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌。針對(duì)這類細(xì)菌的免疫應(yīng)答是體液性應(yīng)答或細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答或兼有上述兩種應(yīng)答。不過，死的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌或細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌成分不能引發(fā)充分的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(Lauvau等人，2001，Science 2941735-9)。這些細(xì)菌在其宿主循環(huán)系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)中游離地度過一段生命周期，在上述系統(tǒng)遇到宿主免疫系統(tǒng)的先天抗體應(yīng)答(例如體液性)。
兼性細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌也能在宿主細(xì)胞中度過一段隔絕的生命周期，在宿主細(xì)胞中免于宿主免疫系統(tǒng)的體液應(yīng)答，而易受宿主的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答是刺激效應(yīng)T淋巴細(xì)胞(該細(xì)胞會(huì)依次成為記憶性(效應(yīng)或中樞)T淋巴細(xì)胞)的免疫應(yīng)答。在宿主細(xì)胞表面的抗原呈遞造成細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。宿主免疫系統(tǒng)的吞噬細(xì)胞可以吞入活的細(xì)菌、死的細(xì)菌或細(xì)菌成分進(jìn)入溶酶體，該溶酶體成熟成為吞噬性溶酶體并且將蛋白抗原降解成肽。吞噬細(xì)胞中的吞噬性溶酶體中的抗原肽可以通過MHC II型分子呈遞到這些吞噬細(xì)胞的表面以供CD4+T細(xì)胞識(shí)別和T輔助應(yīng)答的激活。哺乳動(dòng)物體內(nèi)任何細(xì)胞的胞漿中表達(dá)的抗原肽都可以通過MHC I型分子呈遞到該細(xì)胞的表面以供CD8+T細(xì)胞識(shí)別和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)反應(yīng)的激活。不過，死的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌或細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的成分不能侵入非吞噬細(xì)胞或不能逃脫吞噬細(xì)胞的吞噬性溶酶體而進(jìn)入胞漿，結(jié)果造成吞噬細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的激活和成熟。所以死的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌或細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌成分抗原不能直接被MHC I呈遞，而且不能激活CTL反應(yīng)。在宿主的吞噬性溶酶體中和/或胞漿中細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌產(chǎn)生蛋白的能力是充分引發(fā)有效的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答所必需要的。
最近，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株已經(jīng)被開發(fā)作為異種蛋白的細(xì)胞內(nèi)遞送載體，該載體將抗原遞送到免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)針對(duì)不允許注射致病因子的臨床病癥如癌癥(美國6,051,237號(hào)專利，Paterson；美國第6,565,852號(hào)專利)和HIV(美國5,830,702號(hào)專利，Portnoy& Paterson)的免疫應(yīng)答。作為兼性細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌，單核細(xì)胞增多性利斯特氏菌同時(shí)引發(fā)體液和細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)菌性抗原特異性的免疫應(yīng)答。隨著利斯特氏菌進(jìn)入宿主生物體的細(xì)胞，利斯特氏菌產(chǎn)生能夠使其逃脫吞噬性宿主細(xì)胞的吞噬性溶酶體的利斯特氏菌特異性蛋白，進(jìn)入細(xì)胞的胞漿。在細(xì)胞中，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌增殖，表達(dá)存活所必需的蛋白同時(shí)還表達(dá)可操作地連接到利斯特氏菌啟動(dòng)子上的異種基因。通過MHC蛋白將這些異種蛋白的肽呈遞到吞噬細(xì)胞表面，產(chǎn)生T細(xì)胞反應(yīng)。因?yàn)閱魏思?xì)胞增生利斯特氏菌是革蘭氏陽性、食品攜帶的(food-borne)的人和動(dòng)物病原，它能造成免疫妥協(xié)(immuno-compromise)個(gè)體和孕婦的嚴(yán)重感染，所以必需將這些細(xì)菌菌株減毒，以降低對(duì)宿主的毒性，同時(shí)保持疫苗的免疫原性。該毒性是對(duì)宿主的多個(gè)組織和器官如肝臟、脾臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)菌性侵入的結(jié)果。降低與使用單核細(xì)胞增生利斯特氏菌的風(fēng)險(xiǎn)而不影響其誘導(dǎo)特異于與選擇的感染性和惡性疾病相關(guān)的異種編碼抗原的獲得性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性的能力是有益的。
發(fā)明簡述總體而言，本發(fā)明提供減毒的利斯特氏菌(Listeria)，具體而言提供了單核細(xì)胞增生利斯特氏菌，以及提供了將這些利斯特氏菌應(yīng)用到疫苗中的方法。該疫苗對(duì)于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和治療和/或預(yù)防廣泛的包括癌癥在內(nèi)的疾病有用。
一方面，本發(fā)明提供了分離的進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減(例如是內(nèi)化素缺陷，如內(nèi)化素B)并含有編碼非利斯特氏菌抗原的核酸分子的利斯特氏菌。在某些實(shí)施方案中，該細(xì)菌的細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散被進(jìn)一步衰減(例如是ActA缺陷)。在某些實(shí)施方法中，該減毒利斯特氏菌屬于單核細(xì)胞增生利斯特氏菌種。在某些實(shí)施方案中，該減毒的利斯特氏菌是突變的利斯特氏菌株。在某些實(shí)施方案中，通過使該利斯特氏菌結(jié)合抗體或抗體片段而使該細(xì)菌減毒。還提供了含有所述利斯特氏菌的免疫原性組合物，其為疫苗含有該細(xì)菌和藥學(xué)上允許的載體和/或佐劑。另外，還提供了在宿主中誘導(dǎo)對(duì)非利斯特氏菌抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括對(duì)宿主給予有效量的含有減毒利斯特氏菌的組合物，還提供了預(yù)防或治療宿主疾病(如癌癥或感染性疾病)的方法，該方法包括向宿主給予有效量的含有減毒利斯特氏菌的組合物。還提供了含有減毒利斯特氏菌的分離的專門的抗原呈遞細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明提供了分離的利斯特氏菌，其進(jìn)入非吞噬細(xì)胞(例如內(nèi)化素缺陷性，如內(nèi)化素B)和細(xì)胞到細(xì)胞擴(kuò)散(例如ActA缺陷)被衰減。在某些實(shí)施方案中，該減毒的利斯特氏菌是突變的利斯特氏菌株。在某些實(shí)施方案中，利斯特氏菌的核酸已用核酸靶向性化合物加以修飾使該菌細(xì)胞到細(xì)胞間的擴(kuò)散能力減弱。在某些實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌在inlB和actA基因上含有至少一個(gè)突變(如缺失突變)。在某些實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌是單核細(xì)胞增生利斯特氏菌ΔactAΔinlB菌株(又稱為單核細(xì)胞增生利斯特氏菌actA-inlB-菌株)，該菌株保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，其檢索號(hào)是PTA-5562，或是該保藏菌株的內(nèi)化素B和ActA同時(shí)缺陷的的突變體。在某些實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌含有編碼非利斯特氏菌抗原的核酸分子。在某些實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌屬于單核細(xì)胞增生利斯特氏菌種。還提供了含有該減毒利斯特氏菌的抗原性組合物，作為疫苗，其中含有減毒利斯特氏菌和藥學(xué)上允許的載體和/或佐劑。另外，還提供了包括給予宿主有效量的含有減毒利斯特氏菌的組合物以誘導(dǎo)宿主對(duì)非利斯特氏菌抗原的免疫應(yīng)答的方法。還提供了包括向宿主給予有效量的含有減毒利斯特氏菌的組合物以預(yù)防或治療宿主疾病(如癌癥、李氏特菌病或由非利斯特氏病原體引起的疾病)的方法。進(jìn)一步提供了含有利斯特氏減毒細(xì)菌的專門的抗原呈遞細(xì)胞。
在另外的方面，本發(fā)明提供了疫苗，其中含有(a)進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減的利斯特氏菌，和(b)藥學(xué)上允許的載體和/或佐劑。在某些實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌是內(nèi)化素B缺陷的。在某些實(shí)施方案中，在該疫苗中的減毒利斯特氏菌屬于單核細(xì)胞增生利斯特氏菌種。在某些實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌是利斯特氏菌株的突變株。提供了包括向宿主給予有效量的該疫苗以誘導(dǎo)宿主對(duì)非利斯特氏菌抗原的免疫應(yīng)答的方法。還提供了包括向宿主給予有效量的該疫苗以預(yù)防或治療宿主疾病的方法。
另外，本發(fā)明提供了含有利斯特氏菌的、分離的、專門抗原呈遞的細(xì)胞，其中該利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減(例如內(nèi)化素如內(nèi)化素B缺陷)。在某些實(shí)施方案中，該細(xì)菌的細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散被進(jìn)一步衰減(例如ActA缺陷)。在某些實(shí)施方案中，在專門抗原呈遞細(xì)胞中的減毒的利斯特氏菌是突變的利斯特氏菌株。在某些實(shí)施方案中，該利斯特氏菌屬于單核細(xì)胞增生利斯特氏菌種。本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)宿主對(duì)某一抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主給予有效量的專門抗原呈遞細(xì)胞，其中減毒利斯特氏菌含有編碼抗原的核酸。另一方面，本發(fā)明提供包括給予宿主有效量的該專門的抗原呈遞細(xì)胞以預(yù)防或治療宿主疾病的方法。
另外，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞上MHC I類抗原呈遞或MHCII類抗原呈遞(體內(nèi)或體外)的方法，該方法包括用抗呈遞細(xì)胞接觸減毒的利斯特氏特細(xì)菌，其中的減毒的利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬型細(xì)胞被衰減。而且該利斯特氏菌中含有編碼包括MHC I類表位或MHC II類表位的非利斯特氏菌抗原的核酸分子。
另外，本發(fā)明提供誘導(dǎo)宿主對(duì)某一抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括下述步驟(a)用抗原呈遞細(xì)胞(例如來自宿主的抗原呈遞細(xì)胞)接觸減毒利斯特氏菌，其中的減毒利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，而且該利斯特氏菌中含有編碼該抗原的核酸分子，和(b)向宿主給予該抗原呈遞分子。
另外，本發(fā)明提供預(yù)防或治療宿主疾病(如癌癥)的方法，該方法包括向宿主給予含有突變的利斯特氏菌株的疫苗，其中相對(duì)于非突變的利斯特氏菌株，突變的利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，但保留了進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力。
另外，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)宿主對(duì)某一抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主給予有效量的含有突變的利斯特氏菌株的組合物，其中相對(duì)于非突變的利斯特氏菌株，突變的利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，但保留了進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力，而且該菌株中含有編碼該抗原的核酸分子。
另外，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞上MHC I類抗原呈遞或MHCII類抗原呈遞的方法，該方法包括用抗原呈遞細(xì)胞接觸突變的利斯特氏特菌株，其中突變的利斯特氏菌株相對(duì)非突變的利斯特氏菌株，進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，但保留了進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力，并且該菌株中含有編碼分別包含MHC I類表位或MHC II類表位的抗原的異源核酸分子。
另外，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)宿主對(duì)某一抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括下述步驟(a)在適宜的條件下用來自宿主的抗原呈遞細(xì)胞接觸突變的利斯特氏菌株充分的時(shí)間，使抗原呈遞細(xì)胞荷載(load)，其中的突變的利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，但保留了進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力，并且其中含有編碼抗原的核酸分子。和(b)向宿主給予抗原呈遞細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，該抗原是腫瘤相關(guān)抗原或源自腫瘤相關(guān)抗原。
另外，本發(fā)明提供了降低在疫苗中應(yīng)用的利斯特氏菌株的病原性的方法，該方法包括修飾該菌株使該菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞能力降低，但基本上保留了該菌株進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力。這些方法可包括編碼指導(dǎo)對(duì)于特別的非吞噬細(xì)胞的細(xì)菌趨性(侵染素)的蛋白的基因中的缺失突變，或可包括用屏蔽所述的侵染素的多克隆或單克隆抗體處理細(xì)菌，從而抑制非吞噬細(xì)胞感染。
另外，本發(fā)明提供了選擇性地將蛋白遞送到宿主吞噬(相對(duì)非吞噬性)細(xì)胞中的方法，該方法包括向宿主給予組合物，該組合物含有突變的利斯特氏菌株其相對(duì)非突變的利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減、但基本保留了進(jìn)入非吞噬細(xì)胞的能力，其中的突變的利斯特氏菌株基因組表達(dá)的蛋白在至少一個(gè)編碼侵染素(又稱為“侵染素蛋白質(zhì)”)如內(nèi)化素的基因上含有至少一個(gè)突變。
另外，本發(fā)明提供了制造疫苗的方法。例如本發(fā)明提供了制造疫苗的方法，其包括用抗原呈遞細(xì)胞在體內(nèi)或離體接觸突變的利斯特氏菌株充分的時(shí)間，使抗原呈遞細(xì)胞荷載，其中的突變的利斯特氏菌株相對(duì)于非突變的利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，但保留了進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力，并且含有編碼抗原的核酸分子。
在上述的各方面的某些實(shí)施方案中，突變的利斯特氏菌株是突變的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌株，該菌株內(nèi)化素B缺陷和/或在該編碼內(nèi)化素B(inlB)的基因上和/或調(diào)節(jié)其表達(dá)的元件上至少含有一個(gè)突變。另外，在上述各個(gè)方面的實(shí)施方案中，該突變的菌株內(nèi)化素B和actA都缺陷和/或在inlB基因和actA基因二者上和/或調(diào)節(jié)它們表達(dá)的元件上含有至少一個(gè)突變。
另外，本發(fā)明提供了多種在上述方法中有用的組合物和菌株及其應(yīng)用。例如一方面，本發(fā)明提供了含有突變的利斯特氏菌株和藥劑上允許的載體的藥物組合物，其中相對(duì)于非突變的利斯特氏菌株，突變的利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，但保留了進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，突變的菌株的基因組在編碼侵染素(例如侵染素蛋白)如內(nèi)化素的至少一個(gè)基因上和/或在調(diào)節(jié)它表達(dá)的元件中含有至少一個(gè)突變。
另外，本發(fā)明提供了一種免疫原性組合物，其中含有突變的利斯特氏菌株，其中相對(duì)非突變的利斯特氏菌株，突變的利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，但保留了進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力，并且含有編碼抗原的異源核酸分子。
一方面，本發(fā)明提供了含有突變利斯特氏菌株的疫苗，其中相對(duì)于非突變的利斯特氏菌株，突變的利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，但保留了進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力。
另外，本發(fā)明提供了專門抗原呈遞的細(xì)胞，如樹突細(xì)胞，其包含突變的利斯特氏菌株，相對(duì)于非突變的利斯特氏菌株，突變的利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，但保留了進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力。
在上述各方面的某些實(shí)施方案中，突變的利斯特氏菌株是單核細(xì)胞增生利斯特氏菌的突變株。
在上述各方面的某些實(shí)施方案中，該突變的利斯特氏菌株是內(nèi)化素B缺陷的。在上述各方面的某些實(shí)施方案中，具有內(nèi)化素B缺陷的突變的利斯特氏菌株的基因組中在編碼內(nèi)化素B(inlB)的基因、和/或調(diào)控它表達(dá)的元件上含有至少一個(gè)突變。在其它實(shí)施方案中從突變的利斯特氏菌株的基因組中缺失了inlB。
在上述各方面的另外的實(shí)施方案中，該突變的菌株的內(nèi)化素B和ActA缺陷，在某些實(shí)例方案中，該突變的菌株在inlB基因(和/或調(diào)節(jié)inlB基因表達(dá)的元件)和actA基因(和/或調(diào)節(jié)actA基因表達(dá)的元件)上含有至少一個(gè)突變。
另外，本發(fā)明提供了預(yù)防或治療宿主疾病(如癌癥)的方法。該方法包括向宿主給予含有突變的利斯特氏菌株的疫苗的方法，其中的突變的利斯特氏菌株內(nèi)化素B缺陷。
另外，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)宿主對(duì)某一個(gè)抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主給予有效量的含有突變的利斯特氏菌株的組合物，其中的突變的利斯特氏菌株內(nèi)化素B缺陷，并且含有編碼該抗原的核酸分子。
另外，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞上MHC I類抗原呈遞或MHC II類抗原呈遞的方法(在體外或體內(nèi))，該方法包括用抗原呈遞細(xì)胞和突變的利斯特氏菌株接觸，其中的突變的利斯特氏菌株的內(nèi)化素B缺陷，并且含有分別編碼包括MHC I類表位或MHC II類表位的抗原的異源核酸分子。
另外，本發(fā)明提供誘導(dǎo)宿主對(duì)某種抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括下列步驟(a)在適宜的條件用來自宿主的抗原呈遞細(xì)胞和突變的利斯特氏菌株接觸充分的時(shí)間，使抗原呈遞細(xì)胞荷載，其中的突變的利斯特氏菌株的內(nèi)化素B缺陷，而且含有編碼抗原的核酸分子；和(b)向宿主給予該抗原呈遞細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗原是腫瘤相關(guān)抗原或源自腫瘤相關(guān)抗原。
另外，本發(fā)明提供降低應(yīng)用于疫苗的利斯特氏菌株的病原性的方法，該方法包括修飾該利斯特氏菌株，使之內(nèi)化素B缺陷。
另外，本發(fā)明提供制造疫苗的方法。例如本發(fā)明提供制造疫苗的方法，其包括用抗原呈遞細(xì)胞在適宜的條件和充分的時(shí)間下接觸突變的利斯特氏菌株，使抗原呈遞細(xì)胞荷載，其中的突變的利斯特氏菌株的內(nèi)化素B缺陷。
另外，本發(fā)明提供多種組合物和在上述方法中有用的菌株以及其它應(yīng)用。例如一方面，本發(fā)明提供含有突變的利斯特氏菌株和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，其中的突變的利斯特氏菌株的內(nèi)化素B缺陷。在一個(gè)實(shí)施方案中，突變的菌株的基因組中在inlB或在調(diào)節(jié)它表達(dá)的元件上含有至少一個(gè)突變。
另外，本發(fā)明提供含有突變的利斯特氏菌株的免疫原性組合物，其中的突變的利斯特氏菌株的內(nèi)化素B突變，并且含有編碼抗原的異源核酸分子。
另外，本發(fā)明提供含有突變的利斯特氏菌株的疫苗，其中的突變的利斯特氏菌株的內(nèi)化素B缺陷。
另外，本發(fā)明提供專門的抗原呈遞細(xì)胞，如樹突細(xì)胞，其含有突變的利斯特氏菌株，其中的突變的利斯特氏菌株的內(nèi)化素B突變。
在上述各方面的某些實(shí)施方案中，該突變的利斯特氏菌株是突變的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌株。
在上述各方面的某些實(shí)施方案中，突變的利斯特氏菌株的基因組為內(nèi)化素B缺陷，其中包括在編碼內(nèi)化素B基因(inlB)和/或調(diào)控它表達(dá)的元件上至少含有1個(gè)突變。在其它實(shí)施方案中，從突變的利斯特氏菌株的基因組中缺失了inlB。
在上述各方面的其它實(shí)施方案中，該突變的菌株為內(nèi)化素B和ActA同時(shí)缺陷。在某些實(shí)施方案中，該突變的菌株在inlB基因(和/或調(diào)節(jié)inlB基因表達(dá)的元件)和actA基因(和/或調(diào)節(jié)actA基因表達(dá)的元件)雙方上含有至少一個(gè)突變。
另外，本發(fā)明提供了單核細(xì)胞增生利斯特氏菌株，該菌株同時(shí)具有內(nèi)化素如內(nèi)化素B和ActA缺陷。一方面，本發(fā)明提供了單核細(xì)胞增生利斯特氏菌株，其為內(nèi)化素B和ActA都缺陷。在某些實(shí)施方案中，inlB基因和actA基因均已經(jīng)突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，inlB基因和actA基因均已被缺失。在一個(gè)實(shí)施方案中，該菌株是單核細(xì)胞增生利斯特氏菌ΔactAΔinlB雙突變株(又稱為單核細(xì)胞增生利斯特氏菌actA-inlB-雙突變株)。該菌株在2003年10月3日保藏到美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，并且檢索號(hào)為PTA-5562。在另外的實(shí)施方案中，該菌株是定義為PTA-5562的突變的菌株。其中相對(duì)于野生型單核細(xì)胞增生利斯特氏菌該突變株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減。
還提供了包括含有上述任何菌株的疫苗的培養(yǎng)物、免疫原性組合物和藥物組合物。還提供了用于任何一個(gè)或全部上述的方法的這些特殊菌株的應(yīng)用。


圖1是注射到用所示的利斯特氏菌株或?qū)φ蛰d體免疫的小鼠后的靶細(xì)胞群。相對(duì)于非特異靶細(xì)胞，抗原特異性靶細(xì)胞的降低的水平表明在體內(nèi)產(chǎn)生了對(duì)接種疫苗的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)。圖1A表示用ΔactA突變株或ΔactAΔinlB雙突變株IV或IM疫苗接種的小鼠的體內(nèi)細(xì)胞毒性。圖1B表示用ΔactA突變株或ΔactAΔinlB雙突變株IV疫苗接種的小鼠的體內(nèi)細(xì)胞毒性。圖1C表示用ΔactAΔinlB雙突變株IV疫苗接種的小鼠的體內(nèi)細(xì)胞毒性。
圖2表示用突變的利斯特氏菌株或?qū)φ罩委熜越臃N帶有建立的CT26肺腫瘤的小鼠的肺(圖2A)?？梢栽诜紊峡吹椒无D(zhuǎn)移的斑點(diǎn)。關(guān)于小鼠生存期的另外2個(gè)研究表示在圖2B-C中。
圖3表示用IFN-γ和TNF-α細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ICS)分析來自用突變的利斯特氏菌株接種、用SL8OVA257-264肽(圖3A-B)、LLO190肽(圖3C-D)或LLO296肽(圖3E-F)刺激的小鼠的脾的CD8+T細(xì)胞結(jié)果。(PCT表示S-59/UVA失活細(xì)胞的數(shù)據(jù))。
圖4表示INF-γICS分析來自用突變利斯特氏菌接種、用SL8OVA257-264肽、活的或S-59/UVA滅活的EL-4細(xì)胞、或活的或S-59/UVA滅活的OVA表達(dá)EG7細(xì)胞刺激的小鼠的脾細(xì)胞的結(jié)果。
圖5表示IFN-γICS分析來自用不同劑量的突變的利斯特氏菌接種(靜脈內(nèi))、用SL8 OVA257-264肽刺激的小鼠的脾細(xì)胞的結(jié)果。
圖6表示IFN-γICS分析來自以不同途徑用突變的利斯特氏菌接種、用SL8 OVA257-264肽刺激的小鼠的脾細(xì)胞的結(jié)果。
圖7A和圖7B表示在體內(nèi)單核細(xì)胞增生利斯特氏菌ΔactAΔinlB株的加速清除。圖中顯示了肝中細(xì)菌水平隨時(shí)間的變化。
圖8A和圖8B表示在體內(nèi)單核細(xì)胞增生利斯特氏菌ΔactAΔinlB株的加速清除。圖中展示了在脾細(xì)胞中細(xì)菌水平的經(jīng)時(shí)變化。
圖9表示在體外進(jìn)入非吞噬細(xì)胞而不是吞噬細(xì)胞被衰減的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌ΔinlB株和單核細(xì)胞增生利斯特氏菌ΔactAΔinlB株。
圖1O表示高滴度抗利斯特氏菌血清抑制非吞噬細(xì)胞而不是吞噬細(xì)胞的攝取。
圖11A表示含有OVA抗原的DP-L4029(ΔactA)利斯特氏菌株的衰減作用作為補(bǔ)骨質(zhì)素S-59的濃度的函數(shù)和向樹突細(xì)胞系呈遞OVA抗原的測(cè)量。相對(duì)于未處理的細(xì)菌的對(duì)數(shù)滴度和抗原呈遞的百分比(線性范圍，1利斯特氏菌株/DC2.4細(xì)胞)對(duì)于nM S-59(5.5J/cm2UVA作用、洗滌1次利斯特氏菌，再用0.5J/cm2的UVA作用)作圖。
圖11B表示含有OVA抗原的DP-L4029ΔuvrAB利斯特氏菌株的衰減作為補(bǔ)骨質(zhì)素S-59的濃度的函數(shù)和向樹突細(xì)胞系呈遞OVA抗原的測(cè)量。相對(duì)于未處理的細(xì)菌的對(duì)數(shù)滴度和抗原呈遞的百分比(線性范圍，1利斯特氏菌株/DC2.4細(xì)胞)對(duì)nM S-59(劑量為5.5J/cm2UVA作用、洗滌1次利斯特氏菌，再用0.5J/cm2的UVA作用)作圖。
圖11C表示含有OVA抗原的DP-L4029(ΔactA)利斯特氏菌株的衰減作為補(bǔ)骨質(zhì)素S-59的濃度的函數(shù)和向樹突細(xì)胞系呈遞OVA抗原的測(cè)量。
圖11D表示含有OVA抗原DP-L4029ΔuvrAB(ΔactAΔuvrAB)利斯特氏菌株的衰減作為補(bǔ)骨質(zhì)素S-59的濃度的函數(shù)和向樹突細(xì)胞系呈遞OVA抗原的測(cè)量。
圖12A表示在抗利斯特氏菌免疫性存在的情況下誘導(dǎo)的OVA特異性的T細(xì)胞應(yīng)答。
圖12B表示在利斯特氏菌免疫性存在的情況下，刺激的有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。
圖12C表示利斯特氏菌免疫血清的轉(zhuǎn)換不能防止OVA特異性的CD8+細(xì)胞的致敏(priming)。
發(fā)明詳述I前言本發(fā)明提供進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減的利斯特氏菌(例如內(nèi)化素如內(nèi)化素B缺陷的突變的利斯特氏菌株)。在某些實(shí)施方案中，該減毒的利斯特氏菌的細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散進(jìn)一步衰減。在某些實(shí)施方案中，已經(jīng)通過對(duì)該菌株的修飾極大地減小了重組利斯特氏菌的毒性，并且充分保留了該菌株的免疫原性。所以，首次實(shí)現(xiàn)了該減毒利斯特氏菌的免疫原性和該菌株的毒性的成功分離。本發(fā)明提供了含有該減毒利斯特氏菌的藥物組合物、免疫原性組合物和疫苗和這些減毒利斯特氏菌和含有利斯特氏菌的組合物誘導(dǎo)包括對(duì)宿主有治療效果的免疫應(yīng)答的免疫應(yīng)答的應(yīng)用。該疫苗和方法可用于預(yù)防由利斯特氏菌造成的感染性疾病或進(jìn)行異種性抗原如腫瘤相關(guān)抗原或源自非利斯特氏菌的病原的抗原的遞送。
特別是，本發(fā)明提供減毒的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌株，該菌中已經(jīng)缺失了inlB基因(例如進(jìn)入非吞噬細(xì)胞(如通過c-met受體進(jìn)入肝細(xì)胞)被衰減的菌株，)或同時(shí)缺失了actA基因和inlB基因(例如進(jìn)入非吞噬細(xì)胞和細(xì)胞到細(xì)胞的傳遞被衰減的菌株)。據(jù)測(cè)定，和野生型單核細(xì)胞增多性利斯特氏菌株相比，該ΔactAΔinlB菌株的毒性低將近1000倍(見下述實(shí)施例2和表1)。已證明ΔactAΔinlB利斯特氏菌株和ΔinlB利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬性人細(xì)胞被衰減(見下述實(shí)施例9和圖9)。用表達(dá)異種抗原的ΔinlB和ΔactAΔinlB利斯特氏菌株接種表明能夠誘導(dǎo)出抗原特異性的T細(xì)胞(見下述實(shí)施例5-7和圖3A、3B和4-6)。另外，用表達(dá)異種抗原的ΔactAΔinlB利斯特氏菌株接種還表明能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)針對(duì)抗原特異的靶細(xì)胞的有效的強(qiáng)大的細(xì)胞毒性反應(yīng)(見下述實(shí)施例3和圖1)。而且，用表達(dá)異種抗原的ΔactAΔinlB利斯特氏菌株進(jìn)行治療性接種表明在結(jié)直腸癌的小鼠模型中能夠有效地降低肺轉(zhuǎn)移的數(shù)量和增加生存率(見下述實(shí)施例4和圖2A-C)。另外，已經(jīng)表明ΔactAΔinlB利斯特氏菌從肝和脾中的清除要比野生型利斯特氏菌、ΔactA利斯特氏菌株、或ΔinlB利斯特氏菌株快很多(見下述實(shí)施例8和圖7-8)。即actA和inlB的缺失突變組合的作用是協(xié)同的，造成當(dāng)給予高IV劑量的細(xì)菌時(shí)，從動(dòng)物的肝臟中的清除很快。
因此，本發(fā)明提供了進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減的利斯特氏菌(例如內(nèi)化素如內(nèi)化素B缺陷)，其中含有編碼非利斯特氏菌抗原的核酸分子。在某些實(shí)施方案中，該細(xì)菌細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散被進(jìn)一步衰減(例如，ActA缺陷)。在某些實(shí)施方案中，該減毒的利斯特氏菌是單核細(xì)胞增生利斯特氏菌。在某些實(shí)施方案中，該減毒的利斯特氏菌是突變的利斯特氏菌株。還提供了含有利斯特氏菌的免疫原性組合物、其為疫苗，含有細(xì)菌和藥劑上可接受的載體和/或佐劑的疫苗。另外，提供了誘導(dǎo)宿主對(duì)非利斯特氏菌抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主給予有效量的含有減毒利斯特氏菌的組合物，還提供了預(yù)防或治療宿主疾病(如癌癥或感染性疾病)的方法，該方法包括向宿主給予有效量的含有減毒利斯特氏菌的組合物。還提供了用含有減毒利斯特氏菌的專門的抗原呈遞細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了進(jìn)入非吞噬細(xì)胞(例如內(nèi)化素如內(nèi)化素B缺陷)和細(xì)胞到細(xì)胞擴(kuò)散(如ActA缺陷)被衰減的利斯特氏菌。在某些實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌是突變的利斯特氏菌株。在某些實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌在inlB和actA基因上含有至少一個(gè)突變(如缺失突變)。在某些實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌是保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，檢索號(hào)為PTA-5562的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌ΔactAΔinlB株，或該保藏菌株的突變體，該突變體為同時(shí)內(nèi)化素B和ActA缺陷。在某些實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌含有編碼非利斯特氏抗原的核酸分子。在某些實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌屬于單核細(xì)胞增生利斯特氏屬。還提供了含有減毒利斯特氏菌的的免疫原性組合物，其為疫苗同時(shí)含有減毒利斯特氏菌和藥劑上允許的載體和/或佐劑。另外提供了在宿主中誘導(dǎo)對(duì)非利斯特氏菌抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主給予有效量的含有減毒利斯特氏菌的組合物。還提供了預(yù)防或治療宿主疾病(如癌癥、利斯特氏菌病或由非利斯特氏菌病原引起的疾病)，該方法包括向宿主給予有效量的含有減毒利斯特氏菌的組合物。進(jìn)一步提供了含有減毒性利斯特氏菌的專門的抗原呈遞細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種疫苗，其中含有(a)減毒的利斯特氏菌，其中減毒性利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，和(b)藥劑上可接受的載體和/或佐劑。在某些實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌是內(nèi)化素B缺陷的。在某些實(shí)施方案中，在該疫苗中的減毒利斯特氏菌屬于單核細(xì)胞增生利斯特氏菌種。在某些實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌是突變的利斯特氏菌株。提供了在宿主中誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)非利斯特氏菌抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主給予有效量的該疫苗。還提供了預(yù)防或治療宿主疾病的方法，該方法包括向宿主給予有效量的該疫苗。
另外，本發(fā)明提供了含有減毒利斯特氏菌的專門的抗原呈遞細(xì)胞，其中的減毒利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減(如內(nèi)化素如內(nèi)化素B缺陷)。在某些實(shí)施方案中，該細(xì)菌細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散被進(jìn)一步衰減(如ActA缺陷)。在某些實(shí)施方案中，專門抗原呈遞細(xì)胞中的減毒利斯特氏菌是突變的利斯特氏菌株。在某些實(shí)施方案中，該利斯特氏菌屬于單核細(xì)胞增生利斯特氏菌種。本發(fā)明還提供了在宿主中誘導(dǎo)對(duì)某一抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主給予有效量的專門的抗原呈遞細(xì)胞，其中的減毒利斯特氏菌含有編碼抗原的核酸分子。另外，本發(fā)明還提供了預(yù)防或治療宿主疾病的方法，該方法包括向宿主給予有效量的專門的抗原呈遞細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞上MHC I類抗原呈遞或MHC II類抗原呈遞的方法(體外或體內(nèi))，該方法包括用抗原呈遞細(xì)胞和突變的利斯特氏菌接觸，其中的突變的利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，而且其中含有編碼包括MHC I類表位或MHC II類表位的非利斯特氏菌抗原的核酸分子。
另外，本發(fā)明提供在宿主中誘導(dǎo)對(duì)某種抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括下述步驟(a)用來自宿主的抗原呈遞細(xì)胞和減毒的利斯特氏菌接觸，其中減毒的利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，并且其中含有編碼該抗原的核酸分子；和(b)向宿主給予抗原呈遞細(xì)胞。
另外，本發(fā)明提供在宿主中誘導(dǎo)對(duì)某種抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主給予有效量的含有突變的利斯特氏菌株的組合物，其中相對(duì)于非突變的利斯特氏菌株，突變的利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，但保留了進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力，并且其中含有編碼該抗原的核酸分子。在宿主內(nèi)，通過突變的利斯特氏菌表達(dá)該抗原誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
本發(fā)明還提供了預(yù)防或治療宿主疾病(如癌癥)的方法，該方法包括向宿主給予包含突變的利斯特氏菌株的疫苗，其中相對(duì)于非突變的利斯特氏菌株，突變的利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，但保留了進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力。
本發(fā)明還提供了抗原呈遞細(xì)胞上誘導(dǎo)MHC I類抗原呈遞或MHC II類抗原呈遞的方法，該方法包括用抗原呈遞細(xì)胞和突變的利斯特氏菌株接觸，其中相對(duì)于非突變的利斯特氏菌株，突變的利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，但保留進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力，而且其中含有編碼分別包括MHC I類表位或MHC II類表位的抗原的異源核酸分子。
另外，本發(fā)明提供了在宿主中誘導(dǎo)對(duì)某種抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括下述步驟(a)在適宜的條件下用來自宿主的抗原呈遞細(xì)胞和突變的利斯特氏菌接觸充分的時(shí)間，使抗原呈遞細(xì)胞荷載，其中相對(duì)非突變的利斯特氏菌株，突變的利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，但保留了進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力，并且其中含有編碼抗原的核酸分子；和(b)向宿主給予抗原呈遞細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗原是腫瘤相關(guān)抗原或源自腫瘤相關(guān)抗原。
本發(fā)明提供了在宿主中誘導(dǎo)對(duì)某種抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主給予有效量的包含突變的利斯特氏菌株的組合物，其中突變的利斯特氏菌株內(nèi)化素B缺陷，并且其中含有編碼該抗原的核酸分子。在宿主中，突變的利斯特氏菌表達(dá)該抗原誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
本發(fā)明還提供了預(yù)防或治療宿主疾病(如癌癥)的方法，該方法包括向宿主給予有效量的包含突變的利斯特氏菌的疫苗，其中突變的利斯特氏菌株為內(nèi)化素B缺陷。
本發(fā)明還提供了抗原呈遞細(xì)胞上誘導(dǎo)MHCI類抗原呈遞或MHC II類抗原呈遞的方法，該方法包括用抗原呈遞細(xì)胞和突變的利斯特氏菌接觸，其中突變的利斯特氏菌內(nèi)化素B缺陷，而且其中含有編碼分別包括MHC I類表位或MHC II類表位的抗原的異源核酸分子。
另外，本發(fā)明提供了在宿主中誘導(dǎo)對(duì)某種抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括下述步驟(a)用來自宿主的抗原呈遞細(xì)胞和突變的利斯特氏菌株接觸，在適宜的條件和充分的時(shí)間下，使抗原呈遞細(xì)胞荷載，其中突變的利斯特氏菌內(nèi)化素B缺陷，并且其中含有編碼抗原的核酸分子；和(b)向宿主給予抗原呈遞細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了藥物組合物、免疫原性組合物和疫苗，含有突變的利斯特氏菌株，相對(duì)于非突變的菌株，突變的利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，但保留了進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力。在某些實(shí)施方案中，該利斯特氏菌的突變株為一個(gè)或多個(gè)侵染素缺陷，如內(nèi)化素B。例如，在某些實(shí)施方案中，該突變的利斯特氏菌株是突變的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌株，在一個(gè)或多個(gè)編碼內(nèi)化素蛋白(如內(nèi)化素B)的基因和/或在調(diào)節(jié)某個(gè)內(nèi)化素蛋白基因(如inlB基因)表達(dá)元件上含有突變。在某些實(shí)施方案中，該菌株為內(nèi)化素蛋白缺陷，如內(nèi)化素B，或另一種利斯特氏蛋白缺陷，如ActA。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了新型的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌株，該菌株為同時(shí)內(nèi)化素B和ActA缺陷。例如在某些實(shí)施方案中，同時(shí)缺失inlB基因和actA基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，該菌株是在2003年10月3日保藏到美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，其檢索號(hào)為PTA-5562的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌ΔactAΔinlB雙突變株。
II減毒利斯特氏菌已將本發(fā)明的減毒利斯特氏菌開發(fā)用于向?qū)ｉT的抗原呈遞細(xì)胞(APCs)如巨噬細(xì)胞、噬中性細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的溶酶體和/或胞質(zhì)(cytosol)表達(dá)和遞送一種或多種抗原，同時(shí)減少細(xì)菌進(jìn)入非APCs，如器官的細(xì)胞和非免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。相應(yīng)的，應(yīng)用于本發(fā)明的組合物、疫苗和方法的利斯特氏菌，進(jìn)入非吞噬行細(xì)胞(相對(duì)于未進(jìn)行相關(guān)的減毒修飾的如野生型的利斯特氏菌株的利斯特氏菌)被衰減。
此處的術(shù)語“減毒的(衰減的)利斯特氏菌”和“修飾的利斯特氏菌”(或減毒的利斯特氏菌和修飾的利斯特氏菌)互換使用，表示利斯特氏細(xì)菌(或利斯特氏菌)，其進(jìn)入非吞噬行細(xì)胞的能力(相對(duì)于野生型利斯特氏菌)被衰減?？梢悦鞔_此處描述的減毒的利斯特氏菌(如修飾的利斯特氏菌)或是非天然存在的利斯特氏菌或是天然存在的利斯特氏菌，但現(xiàn)在已經(jīng)被分離出來和/或現(xiàn)在已經(jīng)不是天然存在的形式。用于此處的術(shù)語“非減毒的利斯特氏細(xì)菌”和“未修飾的利斯特氏細(xì)菌”(或“非減毒的利斯特氏菌”和“未修飾的利斯特氏菌”)是可以互換使用的，表示利斯特氏細(xì)菌(或利斯特氏菌)不含有特別的修飾，該修飾使另外的利斯特氏細(xì)菌或利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞(相對(duì)于野生型利斯特氏菌)衰減毒。與此相對(duì)應(yīng)，野生型利斯特氏菌是未修飾的利斯特氏菌的一個(gè)例子。
在某些實(shí)施方案中，該減毒的利斯特氏細(xì)菌是突變的利斯特氏菌株成員，其中在該突變的利斯特氏菌株的基因組中的突變使該利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減。在某些實(shí)施方案中，已經(jīng)用不同于或除了突變以外的手段對(duì)該減毒利斯特氏細(xì)菌進(jìn)行修飾，使其進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減(如用抗體結(jié)合該利斯特氏菌)。
在某些實(shí)施方案中，該減毒的利斯特氏細(xì)菌不僅進(jìn)入非吞噬細(xì)胞相對(duì)于未修飾的利斯特氏菌如野生型利斯特氏菌被衰減，而且該減毒利斯特細(xì)菌細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散相對(duì)于未修飾的利斯特氏菌被進(jìn)一步衰減。在某些實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌屬于突變的利斯特氏菌株，其中含有1個(gè)或多個(gè)突變使利斯特氏菌的細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散被衰減。在某些實(shí)施方案中，已經(jīng)用不同于或除了突變以外的手段對(duì)該利斯特氏細(xì)菌進(jìn)行修飾，使其細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散被衰減(如用S-59/UVA處理)。
該減毒利斯特氏菌屬于利斯特氏菌屬，在某些實(shí)施方案中，該減毒的利斯特氏菌屬于選自單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、伊氏利斯特氏菌(Listeria ivanovii)、斯氏利斯特氏菌(Listeria seeligeri)或無害利斯特氏菌(Listeria innocua)的種。而且，本發(fā)明包括多種利斯特氏菌種的菌株的突變(例如正常表達(dá)內(nèi)化素B的菌株或等價(jià)物)，特別是這些細(xì)菌通常是病原性的和/或用侵染素入侵非吞噬性真核細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，突變的利斯特氏菌株是利斯特氏菌病原性菌株。在一個(gè)實(shí)施方案中，被突變的利斯特氏菌株產(chǎn)生至少一種侵染素。在另外的實(shí)施方案中，該菌株是單核細(xì)胞增生利斯特氏菌株、伊氏利斯特氏菌、斯氏利斯特氏菌或無害利斯特氏菌。在另外的實(shí)施方案中，該利斯特氏菌突變株是單核細(xì)胞增生利斯特氏菌突變株。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供了所述減毒利斯特氏菌的培養(yǎng)物，如突變菌株的培養(yǎng)物。
A.進(jìn)入非吞噬細(xì)胞的衰減通常，本發(fā)明的減毒的利斯特氏菌是包括一個(gè)或多個(gè)修飾的利斯特氏菌，因此相對(duì)于沒有使進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減的修飾的相同的利斯特氏菌(“未修飾的利斯特氏菌”或“非減毒的利斯特氏菌”)，其進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減(“修飾的利斯特氏菌”或“減毒的利斯特氏菌”)。進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減的利斯特氏菌對(duì)來自非吞噬細(xì)胞的細(xì)胞外環(huán)境中的非吞噬細(xì)胞中的至少一種類型的感染能力小于相同種屬的野生型的利斯特氏菌。在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型利斯特氏菌，該減毒利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞的能力至少降低大約10％、至少降低大約25％、至少降低大約50％、至少降低大約75％、或至少降低大約90％。在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于相同屬的野生型利斯特氏菌，該減毒利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞的能力至少降低大約50％。在其它的實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞的能力至少降低大約75％。
在某些實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌屬于突變的利斯特氏菌株，相對(duì)于不帶有一個(gè)或多個(gè)突變的相同的利斯特氏菌(“非突變的”利斯特氏菌株)，在該菌株的基因組上含有一個(gè)或多個(gè)能夠引起進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減的突變(“突變的”利斯特氏菌株)。相對(duì)于未修飾的(未突變的)利斯特氏菌株，該減毒利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞的能力可以降低至少大約10％、至少降低大約25％、至少降低大約50％、至少降低大約75％、或至少降低大約90％。
可以理解該減毒的利斯特氏菌，如突變的利斯特氏菌株并非必需進(jìn)入一種以上的非吞噬細(xì)胞被衰減。例如該減毒菌株可以進(jìn)入肝細(xì)胞被衰減，而不是進(jìn)入上皮細(xì)胞被衰減。在其它實(shí)例中，該減毒菌株可以進(jìn)入上皮細(xì)胞衰減而不是進(jìn)入肝細(xì)胞衰減。還可以明確特別修飾的利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞的衰減是突變指定的基因的結(jié)果，如缺失突變編碼和特定的細(xì)胞受體作用促進(jìn)了非吞噬細(xì)胞的感染的侵染素蛋白質(zhì)。例如利斯特氏ΔinlB突變菌株進(jìn)入包括肝細(xì)胞系(如HepG2)和原發(fā)性肝癌細(xì)胞在內(nèi)的表達(dá)肝細(xì)胞生長因子受體(c-met)的非吞噬細(xì)胞被衰減。
在某些實(shí)施方案中，即使該利斯特氏菌(突變的利斯特氏菌)進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，該利斯特氏菌仍然能被例如至少被樹突細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞的吞噬細(xì)胞所攝取。在一個(gè)實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力不會(huì)因?yàn)閷?duì)該菌株的修飾而減小，如侵染素的突變(例如據(jù)測(cè)定，在修飾后該菌株被吞噬細(xì)胞所攝取的能力保留了將近95％或更多)。在其它實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力被減少不超過大約10％、不超過大約25％、不超過大約50％或不超過大約75％。
用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法在體外分析測(cè)定利斯特氏菌(如突變的利斯特氏菌)進(jìn)入非吞噬細(xì)胞是否被衰減。例如在Dramsi等人，Molecular Microbiology 16251-261(1995)和Gaillard等人，Cell 651127-1141(1991)中都描述了篩選分析單核細(xì)胞增生利斯特氏菌突變株進(jìn)入特定細(xì)胞系的能力的方法。例如測(cè)定和比較帶有特定修飾的減毒利斯特氏菌進(jìn)入特定類型的非吞噬細(xì)胞的能力和沒有修飾的相同利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞的能力，由此測(cè)定該減毒利斯特氏菌進(jìn)入特定類型的非吞噬細(xì)胞是否被衰減。與此類似，測(cè)定和比較帶有特定突變的減毒的利斯特氏菌進(jìn)入特定類型的非吞噬細(xì)胞的能力和沒有突變的利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞的能力，由此測(cè)定該減毒利斯特氏菌進(jìn)入特定類型的非吞噬細(xì)胞是否被衰減。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，該利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞的能力的減毒量的范圍從降低2倍到更大水平的衰減。在某些實(shí)施方案中，該利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞的能力的衰減至少在大約0.3log、大約1log、大約2log、大約3log、大約4log、大約5log或至少大約6log。在某些實(shí)施方案中，衰減范圍至少大約為0.3至＞8log、大約2至＞8log、大約4至＞8log、大約6至＞8log、大約0.3-8log、大約0.3-7log、大約0.3-6log、以及大約0.3-5log、以及大約0.3-4log、以及大約0.3-3log、大約0.3-2og、大約0.3-log。在某些實(shí)施方案中，該衰減范圍為大約1至＞8log、1-7log、1-6log、大約2-6log、大約2-5log、以及大約3-5log。
在某些實(shí)施方案中，通過該利斯特氏菌在宿主中的生物學(xué)作用測(cè)定本發(fā)明的利斯特氏菌的衰減。在小鼠或其它脊椎動(dòng)物上測(cè)定其LD50評(píng)價(jià)利斯特氏菌株的病原性(實(shí)施例2、表1)。LD50是將利斯特氏菌注射到脊椎動(dòng)物中引起50％脊椎動(dòng)物死亡所需的數(shù)量或劑量。比較具有特定修飾(如突變)的利斯特氏菌和不具有特定修飾的利斯特氏菌的LD50，評(píng)價(jià)衰減水平。例如如果沒有特定突變的利斯特氏菌株的LD50為103個(gè)細(xì)菌，具有特定突變的利斯特氏菌株的LD50為105菌，則該菌株被衰減，LD50增加100倍或到2log。
另外，可以在體外非常直接測(cè)定利斯特氏菌感染非吞噬細(xì)胞的能力的衰減程度。修飾的利斯特氏菌感染非吞噬細(xì)胞如肝細(xì)胞的能力可以和未修飾的利斯特氏菌或野生型利斯特氏菌感染非吞噬細(xì)胞的能力比較。在該分析中，通常在體外將修飾的和未修飾的利斯特氏菌添加到非吞噬細(xì)胞中，經(jīng)過有限定的時(shí)間周期(例如1小時(shí))，用含有慶大霉素的溶液洗滌細(xì)胞，并殺死細(xì)胞外細(xì)菌，裂解該細(xì)胞并且鋪板測(cè)定滴度。下述實(shí)施例9和實(shí)施例10提供這種分析的例子。
可以通過其它生物學(xué)作用如組織病理學(xué)程度或血清肝酶水平對(duì)這種衰減程度進(jìn)行定性測(cè)定。在用本發(fā)明的利斯特氏菌注射小鼠的臨床實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、白蛋白和膽紅素水平?？梢詫?duì)帶有或不帶有特定修飾/突變的利斯特氏菌在小鼠上的這些作用進(jìn)行比較，將其作為評(píng)價(jià)該利斯特氏菌衰減的方式。還可以用組織病理學(xué)測(cè)定和本發(fā)明相關(guān)的利斯特氏菌的衰減。從感染的脊椎動(dòng)物的多種組織中如肝、脾和神經(jīng)系統(tǒng)回收的利斯特氏菌的量也可以用于減毒水平的測(cè)定，即比較用突變的和非突變的利斯特氏菌注射的脊椎動(dòng)物中的這些值。例如，從感染組織如肝或脾中回收利斯特氏菌的量作為時(shí)間的函數(shù)可以用于通過比較用突變的和非突變的利斯特氏菌注射的小鼠中的上述值測(cè)定減毒。
相應(yīng)地，可以通過在已知是野生型利斯特氏菌靶向的小鼠的特定器官中的細(xì)菌載量測(cè)定本發(fā)明的利斯特氏菌的衰減。例如，可以將來自肝或脾的勻漿(在H2O+0.2％NP40中勻漿)稀釋液鋪板BHI瓊脂培養(yǎng)基上，通過集落計(jì)數(shù)(集落形成單位，CFU)測(cè)定本發(fā)明的利斯特氏菌的衰減?？梢詼y(cè)定該肝或脾的cfu，例如測(cè)定通過包括靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)和皮下中的任何途徑給予本發(fā)明的修飾的利斯特氏菌(如參見下述實(shí)施例8)后時(shí)程變化。另外，可以測(cè)定按照所述的競(jìng)爭性指數(shù)分析進(jìn)行給藥后，肝或脾(或任何其它選定的器官)中本發(fā)明的利斯特氏菌的時(shí)程變化，并與抗藥的野生型利斯特氏菌比較。
為了提供安全和有效的疫苗，在本發(fā)明的疫苗中的被非吞噬細(xì)胞攝取的細(xì)菌的衰減程度不需要達(dá)到完全衰減。在某些實(shí)施方案中，該衰減程度為能降低其毒性足以防止或降低該毒性癥狀不達(dá)到威脅生命的水平。
1.包含使利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減的突變的利斯特氏菌在某些實(shí)施方案中，該減毒的利斯特氏菌含有1個(gè)或多個(gè)突變，該突變使利斯特氏菌的其通常產(chǎn)生的1種或多種侵染素(又稱為侵染蛋白)如內(nèi)化素缺陷。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，該減毒的利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞的能力的衰減是通過應(yīng)用影響該細(xì)菌表達(dá)的1種或多種侵染素的突變而實(shí)現(xiàn)的。在某些實(shí)施方案中，該減毒的利斯特氏菌是突變的利斯特氏菌株成員，該菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌的1種或多種侵染素缺陷。如果利斯特氏菌或產(chǎn)生的功能性形式的侵染素的量減少、或表達(dá)部分或全部無功能的侵染素形式，或同時(shí)產(chǎn)生上述兩種情況，則該減毒的利斯特氏菌是侵染素產(chǎn)生缺陷的。同樣，如果該菌株的細(xì)菌或產(chǎn)生的功能性形式的侵染素的量減少、或表達(dá)部分或全部無功能的侵染素形式，或同時(shí)產(chǎn)生上述2種情況，則該利斯特氏菌株是侵染素產(chǎn)生缺陷的。
在某些實(shí)施方案中，減毒利斯特氏菌的基因組在編碼侵染素如內(nèi)化素的基因上含有1個(gè)或多個(gè)突變。該突變?nèi)芜x是點(diǎn)突變、插入突變、終止突變、移碼突變、或部分或全部編碼該侵染素基因的缺失。在某些實(shí)施方案中，編碼侵染素的基因(例如inlB)缺失。
在某些實(shí)施方案中，編碼侵染素基因的突變是在編碼序列上的。在這些實(shí)施方案中，編碼侵染素基因的突變使該蛋白與未突變的序列相比，其作為侵染素的功能減少。在某些實(shí)施方案中，編碼侵染素基因的突變使該蛋白完全失去功能。
在另外的實(shí)施方案中，相對(duì)于非突變的菌株，在突變菌株中，至少有1個(gè)編碼侵染素的基因的表達(dá)受到抑制。例如，該突變的利斯特氏菌的基因組可能在編碼侵染素的基因上含有至少1個(gè)突變，其中的突變阻止表達(dá)。例如，該突變可在1個(gè)或多個(gè)該基因的控制序列(如啟動(dòng)子或核糖體結(jié)合區(qū)域)上，由此導(dǎo)致降低或停止該侵染素基因的表達(dá)。另外，該突變的利斯特氏菌可以在不是編碼侵染素的基因上含有至少1個(gè)突變，但是該突變能造成1種或多種侵染素的表達(dá)水平降低。
侵染素是利斯特氏菌表達(dá)和所選宿主細(xì)胞表達(dá)受體相互作用的蛋白，該作用的結(jié)果是促進(jìn)利斯特氏菌穿透進(jìn)入宿主細(xì)胞。在利斯特氏菌的細(xì)胞壁上發(fā)現(xiàn)某些侵染素。其它侵染素由利斯特氏菌分泌。利斯特氏菌的侵染素包括不過不局限于內(nèi)化素相關(guān)蛋白家族成員(內(nèi)化素)。內(nèi)化素蛋白質(zhì)通常指導(dǎo)非吞噬細(xì)胞如肝、脾或腦細(xì)胞對(duì)利斯特氏菌的攝取。
已經(jīng)在單核細(xì)胞增生利斯特氏菌中鑒定了多個(gè)內(nèi)化素(Boland等人，Clinical Microbiology Reviews，2001，14584-640)。這些內(nèi)化素包括不過不局限于InlA、InlB、InlC、InlC2、InlD、InlE、InlF、InlG和InlH(Drams i等人，Infection and immunity，651615-1625(1997))、Raffelsbauer等人，Mol.Gen.Genet.260144-158(1988))。以前已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了編碼這些蛋白的基因序列。例如，在Gaillard等人，Cell，651127-1141(1991)中已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了inlA和inlB的序列，GenBank登錄號(hào)M67471。在Glaster等人，Science，294849-852(2001)(www.sciencemag.org/cgi/content/full/294/5543/849/DC1)Supplementary Web材料的Web表2中鑒定了編碼其它內(nèi)化素相關(guān)蛋白家族成員的基因，包括lmo0327、lmo0331、lmo0514、lmo060、lmo0732、lmo1136、lmo1289、lmo2396、lmo0171、lmo0333、lmo0801、lmo1290、lmo2026和lmo2821(可以在單核細(xì)胞增生利斯特氏菌EGD基因組，GenBank檢索號(hào)第AL591824號(hào)和/或在單核細(xì)胞增生利斯特氏菌EGD-e基因組，GenBank檢索號(hào)第NC_003210號(hào)中找到每個(gè)內(nèi)化素相關(guān)蛋白家族成員的序列。Glaser等指出了多種內(nèi)化素相關(guān)基因的定位。
在某些實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌內(nèi)化素缺陷，如上述的1種或多種內(nèi)化素蛋白質(zhì)或上述內(nèi)化素基因編碼的。在某些實(shí)施方案中，該減毒的利斯特氏菌的內(nèi)化素B或其等價(jià)物是缺陷的(取決于所用的利斯特氏菌的種)。在其它實(shí)施方案中，該減毒的利斯特氏菌的內(nèi)化素A或其等價(jià)物是缺陷的(取決于所用的利斯特氏菌的種)。在其它實(shí)施方案中，該減毒的利斯特氏菌的非內(nèi)化素A或其等價(jià)物的1種或多種內(nèi)化素是缺陷的(取決于所用的利斯特氏菌的種)。
例如，該突變的利斯特氏菌株任選是單核細(xì)胞增生利斯特氏菌株，該菌株已經(jīng)被修飾而在產(chǎn)生功能性內(nèi)化素B方面缺陷。在其它實(shí)施方案中，該單核細(xì)胞增生利斯特氏菌株被修飾，在產(chǎn)生內(nèi)化素A(InlA)以外的內(nèi)化素方面缺陷。(可以理解為包括內(nèi)化素B在內(nèi)的上述列出的內(nèi)化素功能等價(jià)物的蛋白可存在于單核細(xì)胞增生利斯特氏菌以外的利斯特氏菌種中。相應(yīng)地，在某些實(shí)施方案中，該突變的利斯特氏菌株已經(jīng)被修飾，在產(chǎn)生功能上和內(nèi)化素B等價(jià)的蛋白質(zhì)方面缺陷)。
本發(fā)明的突變的利斯特氏菌株可表達(dá)比非突變利斯特氏菌株少的野生型內(nèi)化素序列。另外，該突變的利斯特氏菌可表達(dá)內(nèi)化素的突變形式，與非突變的利斯特氏菌表達(dá)的內(nèi)化素相比，該形式是無功能的或功能減少的。在其它實(shí)施方案中，該突變的利斯特氏菌不表達(dá)特定的內(nèi)化素，如內(nèi)化素B，因?yàn)槠渲芯幋a該內(nèi)化素的大部分或全部基因序列已經(jīng)缺失。
在一個(gè)實(shí)施方案中，突變的利斯特氏菌的基因組在1個(gè)或多個(gè)內(nèi)化素基因上含有減毒性突變(包括但是不局限于上述所列出的)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減的突變的利斯特氏菌的基因組包括在選自下述組的基因上含有至少1個(gè)突變inlA基因、inlB基因、inlC基因、inlC2基因、inlD基因、inlE基因、inlF基因、inlG基因和inlH基因。在其它實(shí)施方案中，該突變利斯特氏菌基因組在選自下述組的基因上含有至少一個(gè)突變inlB基因、inlC基因、inlC2基因、inlD基因、inlE基因、inlF基因、inlG基因和inlH基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，該突變利斯特氏菌是突變的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌，其內(nèi)化素B缺陷。在其它實(shí)施方案中，該突變的利斯特氏菌是突變的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌，而且其基因組在inlB基因上含有至少一個(gè)突變。在其它實(shí)施方案中，該突變的利斯特氏菌在inlA基因以外的內(nèi)化素基因上含有至少一個(gè)突變。在其它實(shí)施方案中，該突變的利斯特氏菌在inlA基因含有至少一個(gè)突變。
在全部說明(包括圖)中，另外的術(shù)語用來表示基因突變，不管其是否使利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減的突變或是其它突變(如細(xì)胞到細(xì)胞擴(kuò)散的突變)。此處術(shù)語“xyz-”、“Δxyz”和“xyz缺失突變”是可以互換的，表示至少大部分或全部xyz基因的編碼序列的缺失突變體。(很多情況下，在這些突變體中，全部xyz基因被缺失)。例如，此處術(shù)語“inlB-”、“ΔinlB”和“inlB缺失突變”通常可以互換。
InlA(內(nèi)化素A)(Gaillard等人，Cell，651127-1141(1991)；Genbank的檢索號(hào)為NC_003210)和這些內(nèi)化素一樣，指導(dǎo)上皮細(xì)胞對(duì)利斯特氏菌的攝取。通過使利斯特氏菌內(nèi)化素A缺陷而使該菌株的衰減可改進(jìn)該疫苗在藥物和疫苗組合物的應(yīng)用中的安全性。利斯特氏菌侵入腸上皮細(xì)胞能造成以發(fā)燒、頭疼、腹瀉或惡心為特征的胃腸道感染。
InlB(內(nèi)化素B)(Gaillard等人，Cell，651127-1141(1991))Genbank檢索號(hào)AL591975(單核細(xì)胞增生利斯特氏菌株EGD，完整基因組，片段3/12，inlB基因區(qū)域nts.97008-98963)和Genbank檢索號(hào)NC_003210(單核細(xì)胞增生利斯特氏菌株EGD，完整基因組，inlB基因區(qū)域nts.457008-458963)，它們共同于此引入作為參考)指導(dǎo)肝細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞如組成血腦屏障的大腦微血管的血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)利斯特氏菌的攝取。(內(nèi)化素B的進(jìn)一步描述，參見Ireton等人，J.ofBiological Chemistry，27417025-17032(1999)；Dramsi等人，Molecular Microbiology 16251-261(1995)；Mansell等人，J.ofBiological Chemistry，27643597-43603(2001)和Bierne等人，J.of Cell Science 1153357-3367(2002)，全部在此引入作為參考)。通過使菌株的內(nèi)化素B缺陷而使利斯特氏菌的減毒可改進(jìn)該菌株在疫苗和藥物組合物中應(yīng)用的安全性。利斯特氏菌感染肝細(xì)胞能造成由于肝細(xì)胞裂解產(chǎn)生肝炎。感染腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞造成腦膜炎，其特征是頭痛、斜頸、失去平衡、慌亂、失去知覺、抽搐或死亡。成人中，利斯特氏菌引起的腦膜炎是死亡的一個(gè)重要原因。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變的利斯特氏菌株是其基因組含有一個(gè)或多個(gè)突變的利斯特氏菌株，所述的突變使該菌株相對(duì)于沒有1個(gè)或多個(gè)突變的利斯特氏菌株，其內(nèi)化素B缺陷。如果該菌株的細(xì)菌或產(chǎn)生功能性形成的內(nèi)化素B的量減少或表達(dá)的內(nèi)化素B是部分或全部無功能的，或同時(shí)發(fā)生上述兩種情況，則該利斯特氏菌株內(nèi)化素B缺陷。(應(yīng)當(dāng)理解此處的術(shù)語“內(nèi)化素B”不僅指單核細(xì)胞增生利斯特氏菌的內(nèi)化素B，還指其它種的利斯特氏菌的其等價(jià)物。)在某些實(shí)施方案中，利斯特氏菌的基因組在編碼內(nèi)化素B(inlB)基因上含有1個(gè)或多個(gè)突變。該突變?nèi)芜x是點(diǎn)突變、插入突變、終止突變、移碼突變或部分或全部編碼內(nèi)化素B序列的缺失突變。在某些實(shí)施方案中，利斯特氏菌的基因組中缺失全部或至少大部分的編碼內(nèi)化素B的序列。在某些實(shí)施方案中，缺失大部分或全部的inlB基因。在某些實(shí)施方案中，減毒利斯特氏菌產(chǎn)生無功能性的內(nèi)化素B。
在某些實(shí)施方案中，inlB的突變?cè)诰幋a序列中。在這些實(shí)施方案中，inlB的突變使內(nèi)化素B比未突變inlB序列所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)功能低。在某些實(shí)施方案中，inlB的突變使內(nèi)化素B完全不具有功能(比未突變的利斯特氏菌的大約低100％)。在某些實(shí)施方案中，突變的利斯特氏菌表達(dá)的內(nèi)化素B和未突變的利斯特氏菌的內(nèi)化素B相比，至少降低大約90％的功能性、至少降低大約75％的功能性、至少降低大約50％的功能性或至少降低大約25％的功能性。
在其它的實(shí)施方案中，相對(duì)于未突變的菌株，突變的菌株的inlB表達(dá)受到抑制。例如，該突變的利斯特氏菌的基因組在inlB上含有至少1個(gè)突變，其中的突變阻止表達(dá)。例如該突變可以在inlB的1個(gè)或多個(gè)控制序列上(如啟動(dòng)子或核糖體結(jié)合區(qū)域)，所以inlB的表達(dá)減少或停止。另外，突變的利斯特氏菌可以在不是inlB-的基因上含有至少1個(gè)突變，不過該突變還是能造成內(nèi)化素B的表達(dá)水平減小。在某些實(shí)施方案中，內(nèi)化素B的表達(dá)可以降低大約100％、至少大約90％、至少大約75％、至少大約50％或至少大約25％。
應(yīng)當(dāng)理解，侵染素(invasions)是能夠促進(jìn)感染非吞噬細(xì)胞的細(xì)菌性蛋白，可選自內(nèi)化素基因或任何其它細(xì)菌基因，所述基因編碼的產(chǎn)物促進(jìn)結(jié)合和被非吞噬細(xì)胞攝取。
通過傳統(tǒng)的突變方法可以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌突變。如化學(xué)誘變劑或放射突變后選擇突變體。還可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員重組DNA技術(shù)實(shí)現(xiàn)細(xì)菌突變。例如Camilli等人Molecular Micro.8143-147(1993)中描述的等位基因交換方法，該方法適用于產(chǎn)生如缺失突變體的突變體。(Camilli等人，引于此處作為參考)(參見下述實(shí)施例1，描述了等位基因交換的示范性應(yīng)用)。另外，也可使用在Biswas等人，J.Bacteriol.1753628-3635(1993)中描述的基因置換的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其它類似的方法。
可以用領(lǐng)域內(nèi)公知的多種方法確認(rèn)在利斯特氏菌株中存在的特定的突變，如特定的inlB突變和/或確認(rèn)該菌株的特定內(nèi)化素如內(nèi)化素B的產(chǎn)生缺陷。例如，可以克隆或測(cè)序菌株基因組的相關(guān)部分。另外，可以用編碼缺失或其它突變的邊緣區(qū)域的成對(duì)引物通過PCR確定特異性突變。還可用Southern印跡檢測(cè)細(xì)菌基因組的改變。而且，可以用領(lǐng)域內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如Western印跡分析菌株是否表達(dá)了特定的蛋白質(zhì)。還可以通過比較以前報(bào)道的表型和該菌株的表型的方法確定菌株在目的基因上含有突變。例如，可以比較以前報(bào)道的內(nèi)化素B突變體表型和該菌株的表型，以確定該菌株的內(nèi)化素B缺陷。
突變菌株任選被評(píng)價(jià)在本發(fā)明中的用處，通過評(píng)價(jià)是否該菌株進(jìn)入至少1種非吞噬細(xì)胞被衰減(參見上述II.A部分)。為了測(cè)定用于本發(fā)明的方法和組合物的適宜性，還可以對(duì)該突變菌株被吞噬細(xì)胞攝取的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。
可以通過測(cè)定菌株的LD50、菌株對(duì)野生型利斯特氏菌攻擊的防御、該菌株誘導(dǎo)針對(duì)抗原的特異性T細(xì)胞反應(yīng)的能力、該菌株誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)抗原的細(xì)胞的體內(nèi)細(xì)胞毒性反應(yīng)的能力和/或該菌株在體內(nèi)針對(duì)靶向病原體的治療效果(例如在小鼠模型申)以及其它在領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它類型的分析方法來確定用于疫苗的特定利斯特氏菌突變體如在特定的內(nèi)化素基因(例如inlB)上含有缺失突變的利斯特氏菌的適宜性。在下述的實(shí)施例2-7中展示了部分這些分析中的特異性的實(shí)施例。在下述的實(shí)施例2中例舉了測(cè)定突變的利斯特氏菌的LD50。在下述實(shí)施例5-7中，用ICS分析檢測(cè)了多種突變菌株的免疫原性。在下述實(shí)施例3中，展示了1個(gè)可以評(píng)價(jià)突變利斯特氏菌株體內(nèi)細(xì)胞毒性的例子。下述實(shí)施例4提供了突變利斯特氏菌株的治療效果分析檢測(cè)的例子。
如上所述，本發(fā)明還進(jìn)一步提供了降低利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞的能力，同時(shí)基本保留了該菌進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力的方法，該方法包括在菌株的編碼侵染素的至少一個(gè)基因上導(dǎo)入至少1個(gè)突變，以降低菌株產(chǎn)生活性侵染素的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，該侵染素是InlA以外的內(nèi)化素。
2.含有其它影響進(jìn)入非吞噬細(xì)胞修飾的利斯特氏菌。
在某些實(shí)施方案中，利斯特氏菌和對(duì)特定的侵染素蛋白質(zhì)(如內(nèi)化素B)特異的、或針對(duì)表達(dá)在該細(xì)菌表面的多抗原或重復(fù)性分子形式特異的多克隆或單克隆抗體(或它們的片段)反應(yīng)。相對(duì)于未用Ab處理的相同的利斯特氏菌株(“未調(diào)理的”利斯特氏菌株)，對(duì)選定的侵染素蛋白或多蛋白和/或大分子特異的抗體(Ab)使利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減(“抗體調(diào)理的”利斯特氏菌株)。(參見下述實(shí)施例10)。相對(duì)于未結(jié)合抗體的利斯特氏菌株，抗體結(jié)合利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞的能力可被降低至少大約10％、至少大約25％、至少大約50％、至少大約75％或至少大約90％。
在本發(fā)明的某些其它實(shí)施方案，通過封閉利斯特氏菌表面上的1個(gè)或多個(gè)關(guān)鍵部分(moieties)，使利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞的能力衰減。例如用能夠結(jié)合細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)和阻斷其結(jié)合它在非吞噬細(xì)胞表面的受體的無能性(inability)的實(shí)體封閉與利斯特氏菌進(jìn)入吞噬細(xì)胞相關(guān)的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，封閉在利斯特氏菌表面的內(nèi)化素蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，該細(xì)胞表面蛋白質(zhì)是內(nèi)化素B。在某些實(shí)施方案中，用抗體或抗體片段，如Fab片段封閉在利斯特氏菌表面的該關(guān)鍵部分。在某些實(shí)施方案中，用抗利斯特氏菌抗體或抗體片段包被利斯特氏菌表面。
在某些實(shí)施方案中，利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞的能力受到利斯特氏菌調(diào)理的影響。在某些實(shí)施方案中，用高滴度的抗利斯特氏菌血清調(diào)理減毒的利斯特氏菌。在某些實(shí)施方案中，用多克隆抗體調(diào)理減毒的利斯特氏菌。在某些實(shí)施方案中，用單克隆抗體調(diào)理減毒的利斯特氏菌。在某些實(shí)施方案中，用于通過調(diào)理作用修飾利斯特氏菌的抗體是多克隆抗利斯特氏菌抗體。在某些實(shí)施方案中，用于調(diào)理利斯特氏菌的抗體是抗內(nèi)化素抗體，如內(nèi)化素B特異的單克隆抗體或多克隆抗體或它們的片段。
可以用領(lǐng)域內(nèi)公知的方法生產(chǎn)利斯特氏菌特異性抗體，如用利斯特氏菌靜脈注射感染小鼠以產(chǎn)生高滴度的利斯特氏特異的小鼠血清，用抗利斯特氏小鼠血清溫育欲被減毒的利斯特氏菌制備調(diào)理的利斯特氏菌。本發(fā)明人表明這種獲得的調(diào)理的利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞、而不是吞噬細(xì)胞被衰減(參見下述實(shí)施例10)。
相應(yīng)地，在某些實(shí)施方案中，減毒的利斯特氏菌是經(jīng)過調(diào)理的。在某些實(shí)施實(shí)施方案中，該調(diào)理的利斯特氏菌的細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散還被衰減。例如減毒的利斯特氏菌可以是ActA缺陷(如actA缺失突變體)的調(diào)理的利斯特氏菌。
B.利斯特氏菌細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散被衰減在某些實(shí)施方案中，用于所述組合物、疫苗和方法的減毒利斯特氏菌不僅進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散也被衰減。如果利斯特氏菌不能進(jìn)行從一個(gè)感染細(xì)胞(在它的胞質(zhì)中含有利斯特氏菌的細(xì)胞)到鄰近細(xì)胞中的細(xì)胞間擴(kuò)散，則該利斯特氏菌的細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散被衰減。換言之，相對(duì)于相同種屬的野生型的利斯特氏菌，減毒利斯特氏菌的生長和擴(kuò)散能力被減弱了。在某些實(shí)施方案中，利斯特氏菌的細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散的衰減被直接影響。例如在某些實(shí)施方案中，因?yàn)橄鄬?duì)于野生型，利斯特氏菌株從感染細(xì)胞形成進(jìn)入鄰近細(xì)胞的突出(protrusion)能力被削減，所以該利斯特氏菌細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散被衰減。在其它實(shí)施方案中，該利斯特氏菌細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散的衰減是因?yàn)樾〉闹苯酉魅?，但仍衰減了細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散。例如在另外的實(shí)施方案中，利斯特氏菌存在于吞噬細(xì)胞空泡中的能力被減弱。
在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型利斯特氏菌，減毒利斯特氏菌的細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散能力被降低至少大約10％、至少大約25％、至少大約50％、至少大約75％或至少大約90％。在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型利斯特氏菌，減毒利斯特氏菌的細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散能力被降低至少大約50％、至少大約75％或至少大約90％。在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型利斯特氏菌，減毒利斯特氏菌的細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散能力被降低至少大約50％。
在某些實(shí)施方案中，在減毒利斯特氏菌的基因組上含有突變，該突變減弱了該利斯特氏菌細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散。例如在某些實(shí)施方案中，減毒利斯特氏菌屬于利斯特氏菌突變株。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，該利斯特氏菌突變株的基因組中，在侵染素以外的基因上含有1個(gè)或多個(gè)突變。例如在某些實(shí)施方案中，該利斯特氏菌突變株的基因組在inlB以外的基因上含有一個(gè)或多個(gè)突變。例如該突變菌株可能還缺少一個(gè)或多個(gè)影響細(xì)胞到細(xì)胞擴(kuò)散的毒性因子。在其它實(shí)施方案中，通過其它手段衰減了利斯特氏菌的細(xì)胞到細(xì)胞擴(kuò)散。
甚至在那些減毒的利斯特氏菌細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散被衰減的實(shí)施方案中，優(yōu)選該減毒利斯特氏菌仍然能進(jìn)入吞噬細(xì)胞如樹突細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，減毒利斯特氏菌株進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力不因?yàn)樵谠摾固厥暇纤龅男揎椝鶞p弱(例如該菌株在經(jīng)過修飾后進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力保留了大約95％或更多)。在其它實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型，該減毒利斯特氏菌進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力被減弱不超過大約10％，不超過大約25％、不超過大約50％或不超過大約75％。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知確定利斯特氏菌細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散是否被衰減的體外方法。例如可以測(cè)定感染選定的培養(yǎng)細(xì)胞單層后，一段時(shí)間形成的噬菌斑的直徑。可以按照以前報(bào)導(dǎo)的方法(Sun，A.，A.Camilli，和D.A.Portnoy.1990，Isolation of Listeriamonocytogenes small-plaque mutants defective for intracellulargrowth and cell-to-cell spread.Infect.Immun.583770-3778)和該測(cè)定方法的修正(Skoble，J.，D.A.Portnoy，和M.D.Welch.2000，Three regions within ActA promote Arp2/3complex-mediatedactin nucleation and Listeria monocytogenes motility.J.Cell.Biol.150527-538)進(jìn)行L2細(xì)胞單層內(nèi)的噬菌斑分析。簡而言之，在6孔組織培養(yǎng)皿中L2細(xì)胞生長至融合，然后用細(xì)菌感染1小時(shí)。感染后，將細(xì)胞鋪到加熱到40℃的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基由含有0.8％瓊脂糖的DME、胎牛血清(如2％)和要求濃度的慶大霉素組成。培養(yǎng)基中的慶大霉素的濃度對(duì)噬菌斑的大小有很大影響，而且是選定的利斯特氏菌株的細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散能力的量度(Glomski，IJ.，M.M.Gedde，A.W.Tsang，J.A.Swanson，and D.A.Portnoy.2002.J.CellBiol.1561029-1038)。例如當(dāng)所鋪的培養(yǎng)基中含有的慶大霉素的濃度為50μg/ml時(shí)，和野生型相比，在單層感染3天后具有細(xì)菌到細(xì)菌擴(kuò)散表型缺陷的利斯特氏菌株的噬菌斑的大小被降低至少50％。另外，當(dāng)將感染的單層鋪在僅含有5μg/ml慶大霉素的瓊脂糖+培養(yǎng)基中時(shí)，具有細(xì)胞到細(xì)胞擴(kuò)散缺陷表型的利斯特氏菌株和野生型菌株的噬菌斑大小相似。所以，可以通過改變含瓊脂糖培養(yǎng)基中的慶大霉素的濃度來測(cè)定相對(duì)于野生型菌株，選定菌株在感染的細(xì)胞單層中的細(xì)胞到細(xì)胞擴(kuò)散的相對(duì)能力。任選地，通過在感染后第48小時(shí)向鋪板中添加含有中性紅(GIBCO BRL；1250稀釋到DME+瓊脂糖培養(yǎng)基中)的培養(yǎng)基，有利于噬菌斑的可見性和直徑測(cè)量。另外，可以在來自其它原代細(xì)胞或傳代細(xì)胞的單層細(xì)胞進(jìn)行噬菌斑分析。例如可以用HepG2細(xì)胞，來自肝細(xì)胞的細(xì)胞系或原代人肝細(xì)胞，評(píng)價(jià)相對(duì)于野生型利斯特氏菌株的選定突變對(duì)細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散能力。在某些實(shí)施方案中，含有使利斯特氏菌細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散衰減毒的突變或其它修飾的利斯特氏菌在高濃度慶大霉素(大約50μg/ml)下產(chǎn)生“針尖(pinpoint)”噬菌斑。
還可以不太直接(less directly)地通過利斯特氏菌在宿主中的生物學(xué)作用測(cè)定本發(fā)明的減毒利斯特氏菌株的衰減?？梢栽谛∈蠡蚱渌棺祫?dòng)物上測(cè)定其LD50評(píng)價(jià)減毒利斯特氏菌株的致病性(實(shí)施例2、表1)。LD50是將利斯特氏菌注射到脊椎動(dòng)物中引起50％脊椎動(dòng)物死亡的數(shù)量或劑量?？梢员容^具有特定突變或修飾的利斯特氏菌和不具有特定突變或修飾的利斯特氏菌的LD50值作為衰減水平的量度。例如如果沒有特定突變的利斯特氏菌株的LD50為103個(gè)細(xì)菌，具有特定突變或修飾的利斯特氏菌株的LD50為105個(gè)細(xì)菌。則該菌株已經(jīng)被減毒，其LD50增加了100倍或2log。
可以通過其它生物學(xué)作用如組織病理學(xué)范圍或血清肝酶水平對(duì)這種減毒程度進(jìn)行定性測(cè)定。在用本發(fā)明的利斯特氏菌注射小鼠的臨床實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、白蛋白和膽紅素水平。比較帶有或不帶有特定突變的利斯特氏菌在小鼠或其它脊椎動(dòng)物上的這些作用，將其作為評(píng)價(jià)該利斯特氏菌減毒的手段。還可以用組織病理學(xué)測(cè)定與本發(fā)明相關(guān)的利斯特氏菌的減毒。從感染的脊椎動(dòng)物的多種組織中如肝、脾和神經(jīng)系統(tǒng)回收的利斯特氏菌的量也可以用于減毒水平的測(cè)定，即，通過比較減毒利斯特氏菌和未減毒利斯特氏菌注射的脊椎動(dòng)物的上述值。例如從感染組織如肝或脾中回收利斯特氏菌的量作為時(shí)間的函數(shù)可以用作減毒的量度，通過比較減毒和未減毒利斯特氏菌注射的小鼠中的上述值。
為了提供安全而且有效的疫苗，本發(fā)明的疫苗相關(guān)的細(xì)菌的細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散的衰減程度不必是完全衰減。在某些實(shí)施方案中，該減毒程度為能降低其毒性足以防止或降低該毒性癥狀不達(dá)到威脅生命的水平。
1.含有影響細(xì)胞到細(xì)胞擴(kuò)散的突變的利斯特氏菌在某些實(shí)施方案中，減毒的利斯特氏菌含有一個(gè)或多個(gè)突變，該突變進(jìn)一步衰減細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散。例如在某些實(shí)施方案中，減毒的利斯特氏菌是突變的利斯特氏菌株，其與細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散相關(guān)的一種或多種利斯特氏菌蛋白質(zhì)缺陷，如選自ActA、硫辛酸蛋白連接酶、PI-PLC、PC-PLC、鋅依賴性金屬蛋白酶和LLO(或這些蛋白質(zhì)的等價(jià)物，取決于所用利斯特氏菌株的種)的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌是在選自actA、lplA、plcA、plcB、mpl和hly(或這些基因的等價(jià)物，取決于所用利斯特氏菌株的種)的基因上含有一個(gè)或多個(gè)突變的突變利斯特氏菌株，其中的在基因上的突變衰減了細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散。
在某些實(shí)施方案中，該利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減(例如一個(gè)或多個(gè)內(nèi)化素如內(nèi)化素B缺陷)，同時(shí)是一種或多種肌動(dòng)蛋白聚合蛋白缺陷。所述肌動(dòng)蛋白聚合蛋白之一是actA基因編碼的肌動(dòng)蛋白聚合酶(Kocks等人，Cell，68521-531(1992)，Genbank檢索號(hào)AL591974，nts 9456-11389)。該肌動(dòng)蛋白聚合酶蛋白質(zhì)參與在利斯特氏菌的一極宿主的F-actin募集和聚合。肌動(dòng)蛋白聚合和解聚后造成利斯特氏菌突出穿過胞質(zhì)進(jìn)入鄰近的細(xì)胞。這種運(yùn)動(dòng)能讓細(xì)菌直接從細(xì)胞到細(xì)胞擴(kuò)散，而不用進(jìn)一步暴露到細(xì)胞外環(huán)境中，能夠逃避宿主的防御，如生成抗體。在某些實(shí)施方案中，減毒利斯特氏菌任選在內(nèi)化素基因如inlB上和在actA上同時(shí)含有突變。本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案的利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞和細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散都被衰減。術(shù)語“actA-”、“ΔactA”和“actA缺失突變”在此處是可以互換使用的。
在某些實(shí)施方案中，減毒利斯特氏菌是突變的單細(xì)胞增生利斯特氏菌株，其為內(nèi)化素B和actA所編碼的肌動(dòng)蛋白聚合酶缺陷。在其它實(shí)施方案中，突變利斯特氏菌株的基因組是在inlB和actA都包含突變(例如缺失大部分或全部編碼內(nèi)化素B和ActA序列)的突變的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌株的基因組。在一個(gè)實(shí)施方案中，該菌株是在2003年10月3日，保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的檢索號(hào)是PTA-5562的ΔactAΔinlB雙突變單核細(xì)胞增生利斯特氏菌。在其它實(shí)施方案中，該菌株是指定為PTA-5562的菌株的突變體，其中該突變體相對(duì)于野生型的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌是內(nèi)化素B和ActA缺陷的。如前所示，此處的術(shù)語“actA-”和“ΔactAΔinlB”可以互換使用，指的是雙缺失突變體。
在某些實(shí)施方案中，減毒利斯特氏菌的基因組是lplA基因編碼的硫辛酸蛋白連接酶缺陷的(O’Riordan等人，Science，302462-4(2003)；Genbank檢索號(hào)NC_003210)。在某些實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌是內(nèi)化素B和硫辛酸蛋白連接酶都缺陷的。在某些實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌是在lplA基因上含有突變的突變體。在某些實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌在inlB和lplA上含有突變。在公開的美國申請(qǐng)2004/0013690中描述了某些具有范例性的lplA突變體，該文引于此作為參考。
在某些實(shí)施方案中，進(jìn)入非吞噬細(xì)胞衰減的利斯特氏菌還是一種或多種磷脂酶缺陷的。在某些實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌是一種或多種內(nèi)化素(如內(nèi)化素B)缺陷以及一種或多種磷脂酶也缺陷和/或突變的利斯特氏菌菌株。磷脂酶是一類催化磷酸甘油酯水解的酶。磷脂酶C是釋放在其它細(xì)菌通路中作為第二信使的二酰甘油的磷酸二脂酶。該酶在利斯特氏菌中的作用是在溶酶體膜上形成孔。在某些實(shí)施方案中，在本發(fā)明涉及的利斯特氏菌中突變的磷脂酶基因選自plcA、plcB和smcL。在某些實(shí)施方案中，該減毒的利斯特氏菌為PC-LPC和/或PI-PLC缺陷。在某些實(shí)施方案中，減毒利斯特氏菌在plcA和/或plcB基因(Genbank檢索號(hào)NC-003210；Angelakopolous H.等人，2002，Infect.Immun.703592-3601)上含有一個(gè)或多個(gè)突變。在某些實(shí)施方案中，減毒利斯特氏菌在smcL基因上含有突變。在某些實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌在inlB和plcA和/或plcB上含有突變。在本發(fā)明的這些實(shí)施方案中的利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞以及逃避溶酶體進(jìn)入宿主細(xì)胞的胞質(zhì)而進(jìn)行細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散被痕減。
在某些實(shí)施方案中，減毒利斯特氏菌的基因組是mpl基因編碼的鋅依賴性金屬蛋白酶(Marquis等人，J.Cell.Biol.1371381-92(1997)；Genbank檢索號(hào)NC_003210)缺陷的。在某些實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌的內(nèi)化素B和鋅依賴性金屬蛋白酶都缺陷。在某些實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌是在mpl基因上含有突變的突變體。在某些實(shí)施方案中，該減毒利斯特氏菌同時(shí)在inlB和mpl上含有減毒突變。
在某些實(shí)施方案中，進(jìn)入非吞噬細(xì)胞痕減的利斯特氏菌還是LLO缺陷的。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)侵染素(如內(nèi)化素B)缺陷的突變利斯特氏菌株還是在介導(dǎo)利斯特氏菌從最初侵入位點(diǎn)逃避和擴(kuò)散中有效的一種或多種利斯特蛋白缺陷和/或突變的。這種逃避蛋白質(zhì)包括天然的利斯特氏菌溶胞素O(LLO；Genbank檢索號(hào)M24199，引入此處作為參考)和LLO的突變形式。在某些實(shí)施方案中，減毒的利斯特氏菌的基因組在編碼LLO的基因hly上含有突變。LLO是一種能在包含有入侵的利斯特氏菌吞噬溶酶體的膜上形成孔的溶細(xì)胞素蛋白質(zhì)。這些孔能夠使利斯特氏菌逃脫吞噬溶酶體的殺傷環(huán)境進(jìn)入宿主細(xì)胞的胞質(zhì)，利斯特氏菌在細(xì)胞質(zhì)中能夠生長和擴(kuò)散到鄰近的細(xì)胞中。一種利斯特氏菌的LLO蛋白質(zhì)的可能突變體包含氨基酸替代。這種氨基酸替代可以涉及LLO蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，并且能夠通過改變最適pH或產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性而影響LLO的細(xì)胞毒性。本發(fā)明涉及的利斯特氏菌的另一種突變的LLO蛋白質(zhì)包括LLO的一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失。這種氨基酸缺失也可以通過改變產(chǎn)生的LLO蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性而影響其細(xì)胞毒性。本發(fā)明所涉及的利斯特氏菌為一種或多種內(nèi)化素缺陷，而且為LLO蛋白質(zhì)的缺陷或突變，其進(jìn)入非吞噬細(xì)胞衰減以及從吞噬溶酶體逃脫從而生長和直接從細(xì)胞到細(xì)胞擴(kuò)散衰減。在公開的美國申請(qǐng)2004/0013690中介紹了某些范例性的hly突變，引入此處作為參考。
相應(yīng)地，在某些實(shí)施方案中，進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減的利斯特氏菌的基因組的細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散被進(jìn)一步衰減，并且在一個(gè)或多個(gè)選自actA、hly、lplA、plcA、mpl和plcB的基因上含有至少一個(gè)突變。在其它實(shí)施方案中，該突變菌株的基因組在actA上含有至少一個(gè)突變。例如，被修飾的利斯特氏菌的基因組可能在inlB和選自actA、hly、lplA、plcA、mpl和plcB的基因上含有至少一個(gè)突變。另外，減毒利斯特氏菌的基因組在inlB和actA上含有至少一個(gè)突變。
可以按照上述II.A部分或下面的實(shí)施例介紹的相同方式在利斯特氏菌中引入另外的突變并篩選。多個(gè)突變通?？梢来我?。例如從野生型利斯特氏菌開始，可使用等位基因交換缺失actA基因。最后，通過等位基因交換的方法從actA突變體或actA/uvrAB突變體中缺失inlB，生成actA/inlB突變體。
在其它實(shí)施方案中，進(jìn)一步修飾本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的現(xiàn)存的突變的利斯特氏菌株以導(dǎo)入突變，減弱其進(jìn)入非吞噬細(xì)胞的能力和/或使該菌株的內(nèi)化素B缺陷。例如以前報(bào)道了許多突變的利斯特氏菌株。在Glomski等人，J.Cell.Biol.1561029(2002)中介紹了突變菌株LLO L461T(DP-L4017)，引入此處作為參考。在Skoble等人，J.of Cell Biology 150527-537(2000)中介紹了ΔactA突變體(DP-L4029)為DP-L3078菌株，于此全部引入作為參考，該菌株已經(jīng)去除了原噬菌體。(在Lauer等人，J.Bacteriol.1844177(2002)；美國專利公開號(hào)2003/0203472中介紹了原噬菌體去除(prophagecuring))。以前還報(bào)道了LLO-突變體(DP-L4027)(Lauer等人，J.ofBacteriology，1844177-4186(2002)和LLOΔ26(DP-L4042)(Decatur等人，Science 290992(2000))。這些菌株中的任何一個(gè)均、可包含產(chǎn)生本發(fā)明的突變的利斯特氏菌株的初始點(diǎn)。另外，都可以用前面介紹的等位基因交換的方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法首先用野生型利斯特氏菌產(chǎn)生多種突變利斯特氏菌株中的任何一個(gè)，然后再導(dǎo)入使進(jìn)入非吞噬細(xì)胞衰減的突變(如inlB)。
可以用前面II.A部分的評(píng)價(jià)影響侵染素的合適的突變的相同類型的分析評(píng)價(jià)進(jìn)入非吞噬細(xì)胞衰減的(例如內(nèi)化素B缺陷菌株)、細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散也衰減的特定利斯特氏菌株用于疫苗的適宜性。
應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的減毒利斯特氏菌的基因組可以含有使進(jìn)入非吞噬細(xì)胞或細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散都不被衰減的另外的突變。
2.含有影響細(xì)胞到細(xì)胞擴(kuò)散的其它修飾的利斯特氏菌在某些實(shí)施方案中，已經(jīng)用其它手段(或除了)上述的突變修飾了進(jìn)入非吞噬細(xì)胞和細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散都被衰減的利斯特氏菌。例如在某些實(shí)施方案中，已經(jīng)修飾了利斯特氏菌的利斯特氏菌核酸使該利斯特氏菌增殖衰減，進(jìn)而使細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散衰減。
在某些實(shí)施方案中，該利斯特氏菌增殖衰減是可以劑量依賴的形式控制的。在某些實(shí)施方案中，利斯特氏菌的利斯特氏菌基因表達(dá)基本上不受該微生物增殖衰減的影響。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)向個(gè)體給予疫苗時(shí)，利斯特氏菌表達(dá)了足夠水平的抗原誘導(dǎo)個(gè)體對(duì)該抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
在某些實(shí)施方案中，該細(xì)菌的核酸已經(jīng)通過與核酸靶向化合物的反應(yīng)修飾，減弱該細(xì)菌的增殖。在某些實(shí)施方案中，利斯特氏菌的核酸已經(jīng)通過與直接和核酸作用的核酸靶向化合物的反應(yīng)而修飾。在某些實(shí)施方案中，該核酸靶向化合物是核酸烷化劑。例如在某些實(shí)施方案中，核酸烷化劑是β-丙氨酸、N-(吖啶-9-類)，2-[雙(2-氯乙烯)氨基]乙酯。在某些實(shí)施方案中，核酸靶向化合物被輻射活化。在某些實(shí)施方案中，該核酸靶向化合物是UVA照射激活的補(bǔ)骨脂素化合物，而且通過與用UVA照射激活的補(bǔ)骨脂素化合物接觸減毒利斯特氏菌的核酸被修飾。例如在某些實(shí)施方案中，核酸靶向化合物是4’-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5’，8-三甲基補(bǔ)骨脂素(此處又稱為“S-59”)。在下面的實(shí)施例11中提供了利斯特氏菌的S-59/UVA失活的示范性方法。在相關(guān)美國申請(qǐng)60/446,051、60/449,153和60/511,869中還介紹了靶向化合物如交聯(lián)化合物的應(yīng)用，在此全部引入作為參考。與此相似，也全部引入相關(guān)的2004年2月6日提交的題目為“Modified Free-Living Microbes，Vaccine Compositions，andMethods of Use Thereof，”美國專利申請(qǐng)?jiān)诖俗鳛閰⒖肌?br> 在某些實(shí)施方案中，減毒利斯特氏菌不僅進(jìn)入非吞噬細(xì)胞衰減，它的核酸被修飾，使之增殖減弱(如上所述)，不僅如此，它用于修復(fù)利斯特氏核酸修飾的蛋白質(zhì)缺陷。在某些實(shí)施方案中，減毒利斯特氏菌DNA修復(fù)酶缺陷。在某些實(shí)施方案中，利斯特氏突變菌株內(nèi)化素B和修復(fù)它的核酸的修飾的蛋白質(zhì)都缺陷。例如在inlB上含有突變的利斯特氏菌的突變菌株還在任何一個(gè)與微生物DNA修復(fù)機(jī)制有關(guān)的多種基因上含有突變(Aravind等人，Nucleic Acids Research 27(5)1223-1242(1999))。在一個(gè)實(shí)施方案中，修復(fù)缺陷突變體不能制造PhrB(一種光解酶)，該酶能修復(fù)嘧啶二聚體。例如可以在phrB基因或不同利斯特氏菌種的功能等價(jià)的基因上存在另外的突變。該突變體可與微生物的紫外照射(例如UVB、UVC)聯(lián)用以在微生物的核酸上產(chǎn)生嘧啶二聚體。在其它實(shí)施方案中，內(nèi)化素B突變體還不能修復(fù)鏈間交聯(lián)。這些突變體包括但不局限于在一個(gè)或全部uvr基因，如uvrA、uvrB、uvrC和uvrD基因以及recA基因或不同微生物種屬的功能等價(jià)基因的突變。這些突變?cè)斐上鄳?yīng)的UVrA酶(ATP酶)、UvrB(解旋酶)、UvrC(核酸酶)、UvrI)(解旋酶II)和RecA(重組酶)的活性減弱。這些突變體通常與交聯(lián)化合物如補(bǔ)骨脂素聯(lián)用。在一個(gè)實(shí)施方案中，在uvrA和uvrB(uvrB)上含有減毒性突變。
相應(yīng)地，在一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)入非吞噬細(xì)胞衰減的突變的菌株的基因組還在選自phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrD和recA的至少一個(gè)基因上含有至少一個(gè)突變。例如突變利斯特氏菌的基因組可以在inlB和選自phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrD和recA的基因上含有至少一個(gè)突變。另外，減毒利斯特氏菌是在inlB、actA和uvrAB上含有至少一個(gè)突變的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌。
可以以上面II.A部分或下面相同的方式在利斯特氏菌中引入另外的突變并篩選。通常多個(gè)突變可以依次引入。例如從野生型利斯特氏菌開始，用等位基因交換使actA基因缺失。然后，用等位基因交換任選地缺失ΔactA突變體中的uvrA和uvrB基因。(2003年10月3日，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌ΔactAΔuvrB突變株保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，檢索號(hào)為PTA-5563)。最后，用等位基因交換方法從ΔactA突變體或ΔactAΔuvrB(又稱為“actA-/uvrAB-”)突變體中缺失inlB基因得到ΔactAΔinlBΔuvrB(又稱為“actA-/inlB-/uvrAB-”)突變體。
在其它實(shí)施方案中，可以進(jìn)一步修飾本領(lǐng)域已知的現(xiàn)存的利斯特氏菌株突變體以引入能夠減弱其進(jìn)入非吞噬細(xì)胞能力的突變和/或使菌株內(nèi)化素B缺陷。例如共同未決美國臨時(shí)申請(qǐng)60/446,051，提交于2003年2月6日，以L4029/uvrAB(參見該申請(qǐng)的實(shí)施例7)描述了ΔactAΔuvrB菌株的構(gòu)建。該菌株可包含產(chǎn)生本發(fā)明的突變利斯特氏菌株的起點(diǎn)。另外，可以用上面介紹的等位基因交換方法或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法從野生型利斯特氏菌首先生成任何一種突變的利斯特氏菌株，然后向該菌株導(dǎo)入使該細(xì)菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞的能力減弱的突變(如inlB)。
可以用上述II.A部分的評(píng)價(jià)影響侵染素合適突變的方法同樣的方法評(píng)價(jià)用于疫苗的特定減毒利斯特氏菌株(如內(nèi)化素B缺陷菌株)(同時(shí)細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散也衰減的)的適宜性。
在美國臨時(shí)申請(qǐng)60/446,051、60/449,153和60/511,869(分別引入作為參考)中提供了有關(guān)制備和評(píng)價(jià)含有使利斯特氏菌修復(fù)其已被修飾的核酸的能力減弱的基因突變的減毒利斯特氏菌的其它信息。與此相似，2004年2月6日提交的名為“Modified Free LivingMicrobes，Vaccine Compositions，and Methods of Use Thereof，”的相關(guān)的美國專利申請(qǐng)也引于此作為參考。
C.抗原和異種蛋白質(zhì)表達(dá)在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，減毒利斯特氏菌(例如突變的利斯特氏菌)含有編碼抗原的核酸分子。在某些實(shí)施方案中，該抗原是利斯特氏菌抗原。或該抗原是非利斯特氏菌抗原。在本發(fā)明的某些但不是全部實(shí)施方案中，該編碼抗原的核酸相對(duì)突變利斯特氏菌是異源的。該編碼抗原的核酸分子可被整合到突變利斯特氏菌的基因組中?；蛟摼幋a該抗原的核酸分子可以在利斯特氏菌內(nèi)的質(zhì)粒中等。
突變利斯特氏菌株中的異源核酸所表達(dá)的抗原可以相對(duì)于給予突變利斯特氏菌株的宿主動(dòng)物為自體的或異源的，其中的菌株是疫苗或其它組合物中的一部分。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知制備含有能表達(dá)抗原的異源核酸的利斯特氏菌的常用方法?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的重組DNA方法(參見如Sambrook和Russell，Molecular CloningA Laboratory Manual，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2000))改變?cè)摾固厥暇？乖蛩钠魏?或變體的編碼序列操作性連接到適當(dāng)?shù)目刂菩蛄猩弦詫?shí)現(xiàn)該抗原序列在利斯特氏菌中的表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知合適的啟動(dòng)子序列。例如hly啟動(dòng)子適合用于該表達(dá)構(gòu)建體。在某些實(shí)施方案中，該表達(dá)構(gòu)建體含有抗原編碼序列，還含有操作性連入的信號(hào)肽序列。在某些實(shí)施方案中，該抗原序列直接或間接融合到編碼至少一部分利斯特氏菌蛋白質(zhì)如LLO的序列上。在Laue r等人，J.Bacteriol.18441777-4186(2002)中和美國專利公開號(hào)2003/0203472A1中介紹了適于在利斯特氏菌中表達(dá)抗原的整合性載體的詳細(xì)例子包括pPL2和pPL1，全部引入此處作為參考。
該異源核酸序列可以編碼至少一種特異性蛋白質(zhì)抗原或其它蛋白質(zhì)，例如提供緩解性治療疾病的蛋白質(zhì)。可改變利斯特氏菌以含有一個(gè)或多個(gè)編碼一種或多種抗原或其它目的蛋白質(zhì)的序列。編碼特異性抗原的異源核酸序列不限于確定的核酸序列，但是當(dāng)給予到個(gè)體時(shí)，該序列足以提供能夠引發(fā)目的免疫應(yīng)答的抗原表達(dá)。編碼其它蛋白質(zhì)的異源序列與之相似，編碼給定蛋白質(zhì)的序列可以變化，只要能表達(dá)目的蛋白質(zhì)以在給予個(gè)體后，提供期望的效果(如緩解效果)。該異源序列可以表達(dá)為和特定疾病有關(guān)的抗原。表達(dá)這種抗原的利斯特氏菌可以用做疫苗，其中該疫苗可以用做預(yù)防性治療或治療性治療。能用這種疫苗治療的疾病包括但不局限于感染性疾病、自體免疫性疾病、過敏、癌癥以及其它過度增生性疾病。
本發(fā)明涉及的利斯特氏菌可以被改變以含有編碼腫瘤相關(guān)抗原或源自腫瘤相關(guān)抗原的抗原的異源核酸序列。已經(jīng)鑒定了大量能被T細(xì)胞識(shí)別的腫瘤相關(guān)抗原(Renkvist等人，Cancer，Immunol Innumother503-15(2001))。這些腫瘤相關(guān)抗原可以是分化抗原(如PSMA、酪氨酸酶、gp100)、組織特異性抗原(如PAP、PSA)、發(fā)育抗原、腫瘤相關(guān)的病毒性抗原(如HPV 16 E7)、癌-睪抗原(如MAGE、BAGE、NY-ESO-1)、胚抗原(如CEA、甲種胎兒球蛋白)、癌蛋白抗原(如Ras、p53)、過度表達(dá)蛋白質(zhì)抗原(如ErbB2(Her2/Neu)、MUC1)或突變蛋白質(zhì)抗原?？杀划愒春怂嵝蛄芯幋a的腫瘤相關(guān)抗原包括但是不局限于707-AP、Annexin II、AFP、ART-4、BAGE、β-連環(huán)蛋白/m、BCL-2、bc r-abl、bcr-ablp190、bcr-abl p210、BRCA-1、BRCA-2、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27/m、CDK-4/m、CEA(Huang等人，Exper.Rev.Vaccines(2002)149-63)、CT9、CT10、Cyp-B、Dek-cain、DAM-6(MAGE-B2)、DAM-10(MAGE-B1)、EphA2(Zantek等人，Cell Growth Differ.(1999)10629-38；Carles-Kinch等人，CancerRes.(2002)622840-7)、ELF2M、ETV6-AMLl、G250、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、GAGE-8、GnT-V、gp100、HAGE、HER2/neu、HLA-A*0201-R170I、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT、hTRT、iCE、細(xì)胞凋亡抑制劑(如survivin)、KIAA0205、K-ras、LAGE、LAGE-1、LDLR/FUT、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-6、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-D、MART-1、MART-1/Melan-A、MC1R、MDM-2、間皮素(mesothelin)、肌球蛋白/m、MUC1、MUC2、MUM-1、MUM-2、MUM-3、neo-polyA聚合酶、NA88-A、NY-ESO-1、NY-ESO-1a(CAG-3)、PAGE-4、PAP、蛋白酶3(Molldrem等人，Blood(1996)882450-7；Molldrem等人，Blood(1997)902529-34)、P15、p190、Pml/RARα、PRAME、PSA、PSM、PSMA、RAGE、RAS、RCAS1、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-2、SART-3、SP17、SPAS-1、TEL/AML1、TPI/m、酪氨酸酶、TARP、TRP-1(gp75)、TRP-2、TRP-2/INT2、WT-1和或是翻譯的NY-ESO-ORF2或CAMEL蛋白質(zhì)、或源自NY-ESO-1和LAGE-1基因。本發(fā)明的減毒利斯特氏菌可含有能夠引發(fā)腫瘤特異性免疫應(yīng)答的任何腫瘤相關(guān)抗原，這些抗原包括將被鑒定的抗原。利斯特氏菌可被改變以含有一個(gè)以上的編碼一種以上腫瘤相關(guān)抗原的異源序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗原是間皮素(mesothelin)(Argani等人，Clin Cancer Res.7(12)3862-8(2001))、Sp17(Lim等人，Blood 97(5)1508-10(2001))、gp100(Kawakami等人，Proc.Natl.Acad.Sci美國916458(1994))、PAGE-4(Brinkmann等人，Cancer Res.59(7)1445-8(1999))、TARP(Wolfgang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.美國97(17)9437-42(2000))或SPAS-1(美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2002/0150588)。
在某些實(shí)施方案中，異源核酸編碼的抗原與腫瘤相關(guān)抗原不相同，但是源自腫瘤相關(guān)抗原。例如突變利斯特氏菌表達(dá)的抗原可包括腫瘤相關(guān)抗原片段、腫瘤相關(guān)抗原變體或腫瘤相關(guān)抗原變體的片段。某些情況下，疫苗中的的抗原如腫瘤抗原，當(dāng)序列和宿主的內(nèi)源序列不同時(shí)，該抗原能誘導(dǎo)比較顯著的免疫應(yīng)答。在某些實(shí)施方案中，腫瘤相關(guān)抗原的變體或腫瘤相關(guān)抗原變體的片段和腫瘤相關(guān)抗原或它們相應(yīng)的片段存在一個(gè)或多個(gè)氨基酸不同。源自腫瘤相關(guān)抗原的抗原將含有在向宿主給予該突變利斯特氏菌時(shí)，能夠誘導(dǎo)希望的免疫應(yīng)答的至少一個(gè)表位序列。
相應(yīng)地，在某些實(shí)施方案中，減毒利斯特氏菌含有編碼抗原如間皮素(mesothelin)、SPAS-1、蛋白酶-3、EphA2、SP-17、gp100、PAGE-4、TARP、Her-2/neu、WT-1、NY-ESO-1、PSMA、K-ras或CEA、或源自這些蛋白質(zhì)之一的抗原的核酸分子。在某些實(shí)施方案中，減毒利斯特氏菌含有編碼抗原如間皮素(mesothelin)、SPAS-1、蛋白酶-3、SP-17、gp100、PAGE-4、TARP、Her-2/neu、WT-1、NY-ESO-1、PSMA、K-ras或CEA或源自這些蛋白質(zhì)之一的抗原的核酸分子。在某些實(shí)施方案中，減毒利斯特氏菌含有編碼抗原如間皮素(mesothelln)、SPAS-1、蛋白酶-3、EphA2、SP-17、gp100、PAGE-4、TARP、WT-1、NY-ESO-1或CEA或源自這些蛋白質(zhì)之一的抗原的核酸分子。在某些實(shí)施方案中，減毒利斯特氏菌含有編碼抗原如間皮素、SPAS-1、蛋白酶-3、SP-17、gp100、PAGE-4、TARP、WT-1、NY-BSO-1或CEA或源自這些蛋白質(zhì)之一的抗原的核酸分子。在某些實(shí)施方案中，減毒利斯特氏菌含有編碼人間皮素或源自人間皮素抗原的核酸分子。在其他實(shí)施方案中，減毒利斯特氏菌含有編碼人EphA2或源自人EphA2的核酸分子。在其他實(shí)施方案中，減毒利斯特氏菌含有編碼人NY-ESO-1或源自人NY-ESO-1抗原的核酸分子。
在某些實(shí)施方案中，減毒利斯特氏菌表達(dá)的異種抗原是蛋白酶-3或源自蛋白酶-3的抗原。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原含有HLA-A2.1-限制性肽PR1(aa169-177；VLQELNVTV(AEQ ID NO1))。可以從下述參考文獻(xiàn)得到蛋白酶3和/或PR1表位的信息美國專利5,180,819，Molldrem等人，Blood，902529-2534(1997)、Molldrem等人，Cancer Research，592675-2681(1999)、Molldrem等人，Nature Medicine，61018-1023(2000)和Molldrem等人，Oncogene，21；8668-8673(2002)。
或者，本發(fā)明的減毒利斯特氏菌可被改變以含有編碼自體免疫疾病特異性抗原的異源核酸序列。在T細(xì)胞介導(dǎo)的自體免疫疾病中，T細(xì)胞對(duì)自身抗原的應(yīng)答造成自體免疫疾病。用于用本發(fā)明的疫苗治療自體免疫疾病的抗原中的抗原的類型是可以靶向造成自體免疫疾病的特異性T細(xì)胞。例如該抗原可以部分T細(xì)胞受體，特異型地針對(duì)引起自體免疫應(yīng)答的T細(xì)胞的獨(dú)特型，其中加到本發(fā)明的疫苗中的抗原將引發(fā)針對(duì)這些引起自體免疫應(yīng)答的T細(xì)胞特異性的免疫應(yīng)答。消除這些T細(xì)胞可作為治療機(jī)制緩解自體免疫疾病。另外可以加入能引起針對(duì)在自體免疫疾病中針對(duì)自身抗原產(chǎn)生的抗體或針對(duì)分泌該抗體的特異性B細(xì)胞克隆的免疫應(yīng)答的抗原。例如可在利斯特氏菌中引入獨(dú)特型抗原，其能夠引起針對(duì)在自體免疫疾病中這些B細(xì)胞和/或與自體抗原反應(yīng)的抗體抗獨(dú)特型的免疫應(yīng)答。
在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，抗原源自人或動(dòng)物病原體。病原體任選是病毒、細(xì)菌、真菌或原生動(dòng)物、在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原是病原體產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或病原體產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的片段和/或變體。
例如抗原可以源自人類免疫缺陷病毒(如gp120、gp160、gp41、gag抗原，如p24gag和p55gag以及源自pol、env、tat、Vif、reV、nef、vpr、vpu和HIV的LTR區(qū)域的蛋白質(zhì))、貓科動(dòng)物免疫缺陷病毒或人或動(dòng)物的皰疹病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原源自1型和2型單純皰疹病毒(HSV)(如gD、gB、gH、急早期蛋白質(zhì)，如ICP27)、來自巨細(xì)胞病毒(如gB和gH)、源自Epstein-Barr病毒或來自水痘-帶狀皰疹病毒(如gpI、II或III)(參見如Chee等人(1990)巨細(xì)胞病毒(J.K.McDougall，ed.，Springer Verlag，pp.125-169；McGeoch等人，(1988)J.Gen.Virol.691531-1574；美國專利5,171,568；Baer等人，(1984)Nature 310207-211和Davison等人，(1986)J.Gen.Virol.671759-1816)。
在某些實(shí)施方案中，抗原源自肝炎病毒如乙肝病毒(例如乙肝表面抗原)、甲肝病毒、丙肝病毒、丁肝病毒、戊肝病毒或已肝病毒。參見WO 89/04669、WO 90/11089和WO 90/14436。肝炎抗原可以是表面、核心或其他相關(guān)抗原。HCV基因組編碼多個(gè)病毒蛋白質(zhì)，包括E1和E2。參見，Houghton等人，Hepatology 14381-388(1991)。
抗原為病毒性抗原時(shí)任選來自下列任一種病毒小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如脊髓灰質(zhì)炎病毒，鼻病毒等)、杯狀病毒科、披膜病毒科(例如風(fēng)疹病毒、革登病毒等)、黃病毒科、冠狀病毒科、呼腸孤病毒科(如輪狀病毒等)、雙RNA病毒科、棒狀病毒科(例如狂犬病病毒等)、正粘病毒科(如A、B和C型流感病毒等)、絲狀病毒科、副粘病毒科(例如腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒等)、布尼亞病毒科(Bunyaviridae)、沙粒病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科(例如HTLV-I、HTLV-11、HIV-1、HIVI11b、HIVSF2、HTVLAV、HIVLAI、HIVMN、HIV-1CM235、HIV-2、猿免疫缺陷病毒(SIV))、乳頭瘤病毒、壁虱腦炎病毒等。關(guān)于這些或其它病毒的介紹參見例如Virology，3rd Edition(W.K.Joklik ed.1988)、Fundamental Virology，3rd Edition(B.N.Fields，D.M.Knipe，and P.M.Howley，Eds.1996)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原是Flu-HA(Morgan等人，J.Immunol.160643(1998))。
在某些其它實(shí)施方案中，抗原來自細(xì)菌性病原體。如分枝桿菌屬、芽孢桿菌屬、耶爾森氏菌屬、沙門氏菌屬、奈瑟菌氏屬、疏螺旋菌屬(例如Os pA或Os pB或它們的衍生物)、衣原體或博德特氏桿菌屬(例如P.69、PT和FHA)、或來自寄生蟲如瘧原蟲屬或弓形蟲屬。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原來自結(jié)核分枝桿菌(如ESAT-6、85A、85B、72F)、炭疽桿菌(如PA)、鼠疫桿菌(如，F(xiàn)1，V)。另外，適于應(yīng)用于本發(fā)明的抗原可以得自或來自已知的導(dǎo)致疾病的病原體，所述疾病包括但是不局限于Diptheria、百日咳、破傷風(fēng)、結(jié)核、細(xì)菌性的或真菌性肺炎、中耳炎、淋病、霍亂、傷寒、腦膜炎、單核細(xì)胞增多癥、鼠疫、細(xì)菌性痢疾或沙門氏菌病、軍團(tuán)桿菌病、萊姆病、麻風(fēng)病、瘧疾、鉤蟲病、盤尾絲蟲病、血吸蟲病、Trypamasomialsis、Lesmaniasis、賈第蟲病(Giardia)、阿米巴病、絲蟲病、Borelia和旋毛蟲病。進(jìn)一步抗原可以得自或來自非傳統(tǒng)性的病原體。如庫魯病、克-雅病(CJD)、搔癢病、傳染性水貂腦病和慢性消耗性病的病原體或來自類蛋白質(zhì)性感染粒子，如和瘋牛病有關(guān)的朊病毒。
在其它實(shí)施方案中，抗原得自或來自與神經(jīng)退化性疾病(如阿爾茨海默氏病)、代謝性疾病(如I型糖尿病)和藥物成癮癥(如尼古丁成癮)的發(fā)作或惡化有關(guān)的生物物質(zhì)?；蚝斜磉_(dá)抗原的突變的利斯特氏菌株的組合物用于疼痛治療，而且該抗原氏疼痛受體或其它與疼痛信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的物質(zhì)。
在某些實(shí)施方案中，該抗原序列可是密碼子優(yōu)化的以與表達(dá)抗原的利斯特氏菌宿主偏愛的密碼子匹配。另外，編碼融合到抗原性肽的信號(hào)肽的序列可是密碼子優(yōu)化的以與利斯特氏菌宿主密碼子偏愛匹配。關(guān)于抗原密碼子優(yōu)化和利斯特氏菌中的信號(hào)肽的信息可以參見美國臨時(shí)申請(qǐng)60/532,598，提交于2003年12月24日。引入此處作為參考。
D.減毒利斯特氏菌的免疫原性在某些實(shí)施方案中，減毒利斯特氏菌(例如突變的利斯特氏菌株)能在宿主動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，該免疫應(yīng)答是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，由減毒利斯特氏菌誘導(dǎo)的有效的免疫應(yīng)答含有T細(xì)胞應(yīng)答，如CD4+T細(xì)胞應(yīng)答或CD8+T細(xì)胞應(yīng)答或這兩種應(yīng)答。
可以通過體外和體內(nèi)方法測(cè)定這些細(xì)胞免疫應(yīng)答，由此判斷本發(fā)明的利斯特氏菌的免疫應(yīng)答是否有效?？梢酝ㄟ^比較減毒利斯特氏菌的這些測(cè)量值和未減毒利斯特氏菌的這些值確定對(duì)任何特定抗原或異源蛋白質(zhì)的效果?？梢詼y(cè)定通過已經(jīng)和利斯特氏菌群混合的抗原呈遞細(xì)胞對(duì)目的蛋白質(zhì)或抗原的呈遞。利斯特氏菌可以和適當(dāng)?shù)目乖蔬f細(xì)胞或細(xì)胞系混合，例如樹突細(xì)胞，并且可以測(cè)定樹突細(xì)胞向可以識(shí)別該蛋白質(zhì)或抗原的T細(xì)胞的抗原呈遞。如果利斯特氏菌表達(dá)了足夠的該蛋白質(zhì)或抗原，它將被樹突細(xì)胞加工成肽片段并且以I型或MHCII類的形式呈遞給T細(xì)胞。為了檢測(cè)呈遞的蛋白質(zhì)或抗原，可以使用對(duì)該特定蛋白質(zhì)或抗原有反應(yīng)的T細(xì)胞克隆或T細(xì)胞系。該T細(xì)胞可以是T細(xì)胞雜交瘤，其中的T細(xì)胞通過和癌癥細(xì)胞系融合被永生化。這種T細(xì)胞雜交瘤、T細(xì)胞克隆或T細(xì)胞系可包括CD8+或CD4+T細(xì)胞。樹突細(xì)胞可以呈遞給CD8+或CD4+T細(xì)胞，該呈遞取決于抗原的加工途徑。CD8+T細(xì)胞識(shí)別MHC I類抗原，同時(shí)CD4+識(shí)別MHC II類抗原。T細(xì)胞通過它的受體特異性地識(shí)別呈遞的抗原而被刺激，結(jié)果產(chǎn)生特定的蛋白質(zhì)，如IL-2、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)或干擾素γ(IFN-γ)，可以定量測(cè)定這些物質(zhì)(例如用ELISA分析、ELISPOT分析或細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ICS))。關(guān)于詳細(xì)的免疫原性測(cè)定分析的例子可參見下面的實(shí)施例5-7。
另外，可設(shè)計(jì)雜交瘤含有報(bào)告基因，如β-半乳糖苷酶，其通過呈遞抗原對(duì)T細(xì)胞雜交瘤的刺激而活化?？梢酝ㄟ^其對(duì)底物如氯苯酚紅-B-半乳糖苷(造成顏色改變)的活性方便測(cè)定β-半乳糖苷酶的產(chǎn)生的增加。該顏色改變可以直接加以測(cè)定作為特異性抗原呈遞的指示。
其它測(cè)定本發(fā)明的利斯特氏菌疫苗的抗原表達(dá)的體外和體內(nèi)方法為本領(lǐng)域技術(shù)所知。還可用利斯特氏菌直接測(cè)定特定異種抗原的表達(dá)。例如可向細(xì)胞群中加入放射性標(biāo)記的氨基酸，可以測(cè)定摻入特定蛋白質(zhì)的放射性的量?？煞蛛x細(xì)胞群合成的該種蛋白質(zhì)，例如通過凝膠電泳或毛細(xì)管電泳，可定量測(cè)量放射性的量進(jìn)而評(píng)價(jià)特定蛋白質(zhì)的表達(dá)水平?；蛘?，該蛋白質(zhì)可無放射性表達(dá)而是采用多種方法使之可見，如用酶聯(lián)抗體或熒光標(biāo)記抗體的ELISA分析或通過凝膠電泳和Western印跡檢測(cè)。
另外，在某些實(shí)施方案中，表達(dá)異種抗原或自體抗原的減毒利斯特氏菌(如突變的利斯特氏菌株)誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)或帶有這種抗原的細(xì)胞的體內(nèi)細(xì)胞毒性(參見下述實(shí)施例3)。在某些實(shí)施方案中，表達(dá)異種或自體抗原的減毒利斯特氏菌具有治療效果(參見下述實(shí)施例4)。
雖然有這種可能，和未減毒的利斯特氏菌相比，對(duì)利斯特氏菌的修飾可降低蛋白質(zhì)表達(dá)水平，但應(yīng)當(dāng)理解在某些實(shí)施方案中，減毒利斯特氏菌在免疫原性組合物或疫苗中仍然有效。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，減弱對(duì)非吞噬細(xì)胞的侵入和充足的蛋白表達(dá)二者相結(jié)合是很重要的。疫苗的效力通常和可被微生物遞送的抗原的劑量有關(guān)。利斯特氏菌對(duì)非吞噬細(xì)胞侵入的減弱程度可以達(dá)到幾個(gè)log，而利斯特氏菌基因表達(dá)仍充分保持。如果用相同劑量的減毒利斯特氏菌和無減毒修飾的利斯特氏菌比較，在減毒利斯特氏菌群中獲得的抗原表達(dá)(用上述討論的方法評(píng)價(jià))是無減毒修飾的利斯特氏菌的抗原表達(dá)的至少1％、5％、10％、25％、50％、75％或至少90％。因?yàn)閷?duì)非吞噬細(xì)胞的侵入可減弱幾個(gè)log，所以減毒利斯特氏菌的劑量可安全地增加幾個(gè)log，當(dāng)接種時(shí)，相對(duì)于無減毒修飾的利斯特氏菌，減毒利斯特氏菌可產(chǎn)生更大量的抗原。
III.含有減毒利斯特氏菌的疫苗和其他組合物除了此處描述的減毒利斯特氏菌之外，本發(fā)明提供了多種含有該減毒利斯特氏菌的組合物，包括免疫原性組合物、藥物組合物、細(xì)胞和疫苗(在上述II.A-C部分和下述實(shí)施例中范例性地介紹了在本發(fā)明組合物中有用的減毒利斯特氏菌)。
例如本發(fā)明提供藥物組合物，其含有(a)減毒利斯特氏菌，該菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，并且含有編碼非利斯特氏菌抗原的核酸分子，和(b)藥劑上允許的賦形劑。本發(fā)明還提供了藥物組合物，其含有(a)減毒利斯特氏菌，該菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞和細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散被衰減，和(b)藥劑上允許的載體。
本發(fā)明還提供了含有突變利斯特氏菌株和藥劑上允許的載體的藥物組合物，其中的突變的利斯特氏菌株相對(duì)于未突變的利斯特氏菌株，進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，但該菌保留了進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力。在某些實(shí)施方案中，突變利斯特氏菌株內(nèi)化素B缺陷。在另一實(shí)施方案中，突變菌株的基因組在至少一個(gè)編碼侵染素如內(nèi)化素B這種內(nèi)化素的基因上含有至少一個(gè)突變。在另一實(shí)施方案中，從菌株的基因組中缺失了inlB的編碼序列(或基因)。在另外的實(shí)施方案中，inlB和actA的編碼序列(或基因)都被缺失。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知多種藥劑允許的適用于細(xì)菌菌株的載體。
本發(fā)明還提供了降低藥物組合物毒性的方法，該方法包括向宿主給予利斯特氏菌第一菌株，包括用突變的利斯特氏菌株替代該第一菌株，其中的突變利斯特氏菌株相對(duì)于第一利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，但保留了進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力。在某些實(shí)施方案中，突變利斯特氏菌株內(nèi)化素B缺陷。在其他實(shí)施方案中，該突變菌株內(nèi)化素B和ActA缺陷。
本發(fā)明還提供了含有此處所描述的減毒利斯特氏菌的免疫原性組合物。例如本發(fā)明提供含有減毒利斯特氏菌的免疫原性組合物，該菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，并且含有編碼非利斯特氏菌抗原的核酸分子。本發(fā)明還提供了含有減毒利斯特氏菌的免疫原性組合物，該菌是進(jìn)入非吞噬細(xì)胞和細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散被衰減。
另外，本發(fā)明提供了含有突變利斯特氏菌株的免疫原性組合物，其中的突變利斯特氏菌株相對(duì)于非突變利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，但保留了進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力，而且含有編碼抗原的異源核酸分子。在某些實(shí)施方案中，該菌株內(nèi)化素B缺陷，而且含有編碼抗原的異源核酸分子。在其他實(shí)施方案中，該突變菌株的內(nèi)化素B和ActA都缺陷。
本發(fā)明還提供了多種含有此處描述的減毒利斯特氏菌的疫苗組合物。例如本發(fā)明提供了疫苗，其含有(a)減毒的利斯特氏菌，該菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，而且含有編碼非利斯特氏菌抗原的核酸分子和(b)藥劑上允許的載體和/或佐劑。本發(fā)明進(jìn)一步提供了疫苗，其含有(a)減毒的利斯特氏菌，該菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞和細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散被衰減，和(b)藥劑上允許的載體和/或佐劑。本發(fā)明進(jìn)一步提供了疫苗，其含有(a)減毒的利斯特氏菌，該菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，和(b)藥劑上允許的載體或佐劑。在某些實(shí)施方案中，此處描述的疫苗含有一種類型以上的減毒利斯特氏菌。例如在某些實(shí)施方案中，疫苗含有多種不同類型的減毒利斯特氏菌。不同類型的減毒利斯特氏菌在其表達(dá)的抗原和/或它們的修飾和突變特征上彼此不同。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有突變利斯特氏菌株的疫苗，其中的突變菌株相對(duì)于未突變利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，但保留了進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力。在某些實(shí)施方案中，該菌株為內(nèi)化素B缺陷。在其他實(shí)施方案中，在疫苗中的突變菌株內(nèi)化素B和ActA都缺陷。在某些實(shí)施方案中，疫苗含有1種以上的突變利斯特氏菌株，每個(gè)進(jìn)入非吞噬細(xì)胞都被衰減。
用于此處的術(shù)語“疫苗”包括預(yù)防性疫苗，如用于為了使個(gè)體在接觸抗原時(shí)產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答，預(yù)先接觸含有該抗原的物質(zhì)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，以此增加對(duì)該物質(zhì)或載有該物質(zhì)的細(xì)胞的抵抗能力的疫苗。術(shù)語“疫苗”還包括治療性疫苗，如給予已患有與疫苗抗原相關(guān)的疾病的個(gè)體的疫苗，其中的疫苗能激發(fā)個(gè)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，以此增加抵抗該疾病或載體該抗原的細(xì)胞的能力。
本領(lǐng)域已知這種疫苗組合物的給予方法，包括體外、口、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、淋巴內(nèi)、鼻內(nèi)和皮下途徑給藥。疫苗組合物還可以進(jìn)一步含有領(lǐng)域公知的如佐劑或共刺激分子這種添加成分，以此促進(jìn)對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答。例如共刺激分子含有一種或多種選自GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-14、IL-15、B7.1、B7.2和B7-DC的因子，而且任選包含在本發(fā)明的疫苗組合物中。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其它刺激分子。
疫苗制劑為領(lǐng)域內(nèi)公知并可以包括多種添加劑，如防腐劑、穩(wěn)定劑、佐劑、抗生素和其他物質(zhì)。添加穩(wěn)定劑如乳糖、或谷氨酸-鈉(MSG)使疫苗制劑在多種條件下保持穩(wěn)定。如溫度變化或凍干過程。疫苗制劑還可包括如無菌水或鹽水的懸液。在某些實(shí)施方案中，疫苗是含有一種或多種藥劑允許的適用于非腸道或口服給藥的賦形劑的冷凍或凍干制劑。在其他實(shí)施方案中，疫苗是含有一種或多種藥劑允許的適用粘膜給藥或以氣溶膠給藥的賦形劑的冷凍的或凍干制劑。
可用體內(nèi)模型評(píng)價(jià)疫苗的效力，如在小鼠模型上。可以對(duì)疫苗提供針對(duì)特定疾病的或預(yù)防性或治療性能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。例如對(duì)于感染性疾病，用所需量的本發(fā)明的適宜的疫苗接種一群小鼠，該細(xì)菌表達(dá)感染性疾病相關(guān)抗原。該抗原可來自利斯特氏菌本身或是異種抗原。然后用和疫苗抗原相關(guān)的感染性物質(zhì)感染小鼠，評(píng)價(jià)其對(duì)感染的抵抗能力?？梢韵鄬?duì)于對(duì)照組(或未進(jìn)行疫苗接種，或僅用載體接種或不表達(dá)該適當(dāng)?shù)目乖睦固厥暇慕臃N)觀察該感染性疾病的進(jìn)展。
當(dāng)是癌癥疫苗時(shí)，可以用腫瘤細(xì)胞模型，其中在用本發(fā)明的含有目的腫瘤相關(guān)抗原或衍生自腫瘤相關(guān)抗原的利斯特氏菌接種之前(治療性模型)或之后(預(yù)防性模型)，將表達(dá)目的腫瘤抗原的腫瘤細(xì)胞系注射到一群小鼠中。用含有腫瘤抗原的利斯特氏菌的接種和沒有接種的、或用載體接種的、或用不表達(dá)目的抗原的利斯特氏菌接種的對(duì)照群相比較。在這種模型上通過腫瘤注射后腫瘤體積作為時(shí)間的函數(shù)或通過腫瘤注射后生存數(shù)量作為時(shí)間的函數(shù)對(duì)疫苗的效力進(jìn)行評(píng)價(jià)。通常，相對(duì)于陰性對(duì)照(如未接種的樣品)，疫苗會(huì)在多數(shù)或全部時(shí)間點(diǎn)導(dǎo)致腫瘤體積的減小，而且還會(huì)導(dǎo)致中值生存期延長。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，用突變利斯特氏菌接種的這些小鼠的腫瘤體積小于或等于對(duì)照小鼠的腫瘤體積。在一個(gè)實(shí)施方案中，用突變利斯特氏菌接種的小鼠的腫瘤體積至少幾乎相同于對(duì)照組小鼠的腫瘤體積。在另外的實(shí)施方案中，用突變利斯特氏菌接種的小鼠的腫瘤體積比對(duì)照小鼠的腫瘤體積小至少大約10％、至少大約20％、至少大約30％、至少大約40％或至少大約50％。在其他實(shí)施方案中，在腫瘤植入小鼠后的至少7、14、30或至少60天后觀察到腫瘤體積的差異。在一個(gè)實(shí)施方案中，用突變利斯特氏菌接種的小鼠的中值生存時(shí)間和用對(duì)照利斯特氏菌接種的小鼠幾乎相同。在其他實(shí)施方案中，用減毒利斯特氏菌接種的小鼠的中值生存時(shí)間比用對(duì)照利斯特氏菌接種的小鼠長至少大約1天、至少大約3天或至少大約5天。在其他實(shí)施方案中，用減毒利斯特氏菌接種的小鼠的中值生存時(shí)間比用對(duì)照利斯特氏菌接種的小鼠長至少大約10天、至少大約20天、至少大約30天。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用突變的利斯特氏菌的接種所用的利斯特氏菌的劑量和對(duì)照利斯特氏菌的劑量幾乎相同。在其他實(shí)施方案中，突變利斯特氏菌的接種以比對(duì)照利斯特氏菌的接種劑量高至少大約2、大于5、大約10、大約102、大約103或至少大約104倍的水平安全進(jìn)行。
除了測(cè)量疫苗的效力之外，還測(cè)定了安全性和毒性。這種測(cè)定安全性的方法包括測(cè)定突變利斯特氏菌進(jìn)入吞噬細(xì)胞的數(shù)量，和未突變的利斯特氏菌比較。在某些實(shí)施方案中，突變利斯特氏菌內(nèi)化素B缺陷。在另外的實(shí)施方案中，該突變利斯特氏菌內(nèi)化素B和ActA都缺陷。
一方面，本發(fā)明提供了使用于疫苗中的利斯特氏菌株的致病性降低的方法，包括修飾菌株使之進(jìn)入非吞噬細(xì)胞的能力降低，但基本保留該菌株進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用于疫苗中的利斯特氏菌株的致病性降低的方法，包括修飾該菌株使之內(nèi)化素B缺陷。在某些實(shí)施方案中，該菌株進(jìn)一步被修飾成ActA缺陷。
另一方面，本發(fā)明提供了制造疫苗的方法。例如本發(fā)明提供了制造疫苗的方法，包括在適當(dāng)?shù)臈l件下用專門的抗原呈遞細(xì)胞和減毒的利斯特氏菌(如突變的利斯特氏菌株)接觸，經(jīng)過足夠的時(shí)間，使專門的抗原呈遞細(xì)胞荷載，其中的利斯特氏菌相對(duì)于未修飾的利斯特氏菌如野生型進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減(如帶有內(nèi)化素B缺陷)，但保留了進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力，并且含有編碼抗原的異源核酸分子。在另一方面，本發(fā)明提供了含有利斯特氏菌的專門的抗原呈遞細(xì)胞其中的利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減。本發(fā)明還提供了含有突變的利斯特氏菌株的專門的抗原呈遞細(xì)胞，其中突變的利斯特氏菌株相對(duì)于未突變的利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，但保留了進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力。在某些實(shí)施方案中，突變的利斯特氏菌和專門的抗原呈遞細(xì)胞在體內(nèi)或離體接觸。在某些實(shí)施方案中，專門的抗原呈遞細(xì)胞是樹突細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，專門的抗原呈遞細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。關(guān)于某些范例性抗原的介紹可以參見上述II.C部分。
IV.誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法和治療方法本發(fā)明還提供誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和治療和/或預(yù)防疾病的方法，該方法包括應(yīng)用所述的減毒利斯特氏菌、細(xì)胞、組合物和疫苗(在上述II.A-D部分和下面的實(shí)施例中介紹了用于本發(fā)明的方法的范例性的減毒利斯特氏菌；在上述III部分介紹了范例性的組合物、疫苗和細(xì)胞)。
例如本發(fā)明提供了誘導(dǎo)宿主對(duì)非利斯特氏菌抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主給予有效量的含有進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減的、并且含有編碼非利斯特氏菌抗原的核酸分子的利斯特氏菌的組合物。本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)宿主對(duì)抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主給予有效量的含有進(jìn)入非吞噬細(xì)胞和細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散都被衰減的利斯特氏菌的組合物，其中的突變的利斯特氏菌株含有編碼抗原的核酸。本發(fā)明進(jìn)一步提供了誘導(dǎo)宿主對(duì)抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括向宿主給予有效量的含有(a)進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減的利斯特氏菌和(b)藥劑上允許的載體和/或佐劑的疫苗。
本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)宿主對(duì)抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主給予有效量的含有突變利斯特氏菌株的組合物，其中的突變利斯特氏菌株相對(duì)于未突變的利斯特氏菌株，進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，不過保留了進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力，而且含有編碼該抗原的核酸。該免疫應(yīng)答可以是細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，該免疫應(yīng)答是CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。在其他實(shí)施方案中，該免疫應(yīng)答是CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。在其他的實(shí)施方案中，在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答同時(shí)包括CD8+和CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。對(duì)于某些范例性抗原的介紹參見上述II.C部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原是腫瘤相關(guān)抗原或衍生自腫瘤相關(guān)抗原。在某些實(shí)施方案中，該突變菌株內(nèi)化素B缺陷。在一個(gè)實(shí)施方案中，該突變菌株內(nèi)化素B和ActA都缺陷。
另一方面，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)專門抗原呈遞細(xì)胞上MHC I類抗原呈遞(在體外、在體內(nèi)或離體)的方法，該方法包括用專門的抗原呈遞細(xì)胞和突變的利斯特氏菌株接觸，其中的突變的利斯特氏菌株相對(duì)于未突變的利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，不過保留了進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力，而且含有編碼包含MHC I類表位的抗原的異源核酸分子。在某些實(shí)施方案中，該突變菌株內(nèi)化素B缺陷。在其他實(shí)施方案中，該突變菌株內(nèi)化素B和ActA都缺陷。
另外，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞上MHC I類抗原呈遞或MHCII類抗原呈遞(或在體內(nèi)或在體外)的方法，該方法包括用抗原呈遞細(xì)胞和利斯特氏菌接觸，其中的利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，并且含有編碼包含MHC I類表位或MHC II類表位的非利斯特氏菌抗原的核酸分子。本發(fā)明進(jìn)一步提供了誘導(dǎo)專門的抗原呈遞細(xì)胞上MHC II類抗原呈遞(在體外、在體內(nèi)或離體)的方法，該方法包括用專門的抗原呈遞細(xì)胞和突變的利斯特氏菌株接觸，其中的突變的利斯特氏菌株相對(duì)于未突變的利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，但保留了進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力，并且含有編碼包括MHC II類表位的抗原的異源核酸分子。在某些實(shí)施方案中，該突變的利斯特氏菌株內(nèi)化素B缺陷。在其他實(shí)施方案中，該突變菌株內(nèi)化素B和ActA都缺陷。
本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)宿主對(duì)抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主給予有效量的含有減毒利斯特氏菌的專門的抗原呈遞細(xì)胞，其中的減毒利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，并且含有編碼該抗原的核酸。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括下述步驟(a)在適當(dāng)?shù)臈l件下，用來自宿主的抗原呈遞細(xì)胞接觸減毒的利斯特氏菌，經(jīng)過足夠的時(shí)間使抗原呈遞細(xì)胞荷載，其中的減毒利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，而且含有編碼該抗原的核酸分子，和(b)向宿主給予該抗原呈遞細(xì)胞。本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括下述步驟(a)在適當(dāng)?shù)臈l件下，用來自宿主的抗原呈遞細(xì)胞接觸突變的利斯特氏菌株，經(jīng)過足夠的時(shí)間使抗原呈遞細(xì)胞載荷，其中的突變的利斯特氏菌株相對(duì)于未突變的利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，但保留進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力，而且含有編碼抗原的核酸分子，和(b)向宿主給予該抗原呈遞細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗原是腫瘤相關(guān)抗原或是衍生自腫瘤相關(guān)抗原。在某些實(shí)施方案中，該突變菌株內(nèi)化素B缺陷。在其他實(shí)施方案中，該突變菌株內(nèi)化素B和ActA都缺陷。
在另一方面，本發(fā)明提供了選擇性地遞送異種蛋白質(zhì)進(jìn)入宿主吞噬細(xì)胞的方法，該方法包括向宿主給予含有突變利斯特氏菌株的組合物，其中該菌相對(duì)于未突變利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，但基本保留了進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力，其中的突變的利斯特氏菌株的基因組在至少一種編碼侵染素如內(nèi)化素的基因上含有至少一個(gè)突變。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了用所述的減毒利斯特氏菌預(yù)防或治療宿主疾病(如癌癥、感染性疾病或利斯特氏菌病)的方法。例如，本發(fā)明提供了預(yù)防或治療宿主疾病的方法，包括向宿主給予有效量的含有減毒利斯特氏菌的組合物，該細(xì)菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，而且含有編碼非利斯特氏菌抗原的核酸分子。本發(fā)明還提供了預(yù)防或治療宿主疾病的方法，包括向宿主給予有效量的含有減毒利斯特氏菌的組合物，該細(xì)菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞和細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散都被衰減。本發(fā)明進(jìn)一步提供了預(yù)防或治療宿主疾病的方法，包括向宿主給予有效量的含有(a)減毒利斯特氏菌，該菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，和(b)藥劑上允許的載體和/或佐劑的疫苗。
一方面，本發(fā)明提供了預(yù)防或治療宿主疾病的方法，該方法包括向宿主給予含有突變利斯特氏菌株的疫苗，其中的突變的利斯特氏菌株相對(duì)于未突變的利斯特氏菌株進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，但保留了進(jìn)入吞噬細(xì)胞的能力。通過誘導(dǎo)針對(duì)和疾病有關(guān)的抗原的有治療作用的免疫應(yīng)答實(shí)現(xiàn)疾病的預(yù)防或治療。在某些實(shí)施方案中，突變菌株內(nèi)化素B缺陷。在其他實(shí)施方案中，突變菌株內(nèi)化素B和ActA都缺陷。在一個(gè)實(shí)施方案中，該疾病是癌癥。在其他實(shí)施方案中，該疾病是自體免疫性疾病。在另外的實(shí)施方案中，該疾病是感染性疾病或由病原體如病毒、細(xì)菌、真菌或原生動(dòng)物所引起的其他疾病。
本發(fā)明還提供了預(yù)防或治療宿主疾病的方法，包括向宿主給予有效量的專門抗原呈遞的細(xì)胞，該細(xì)胞含有減毒的利斯特氏菌，其中的減毒的利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有利斯特氏菌的醫(yī)用組合物，其中的利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，而且含有編碼非利斯特氏菌抗原的核酸分子。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了醫(yī)用利斯特氏菌，其中的利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，并且含有編碼非利斯特氏菌抗原的核酸分子。
本發(fā)明還提供了含有利斯特氏菌的醫(yī)用組合物，其中的細(xì)菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減。本發(fā)明還提供了醫(yī)用利斯特氏菌，其中的細(xì)菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減。
另外，本發(fā)明還提供了用于醫(yī)藥的利斯特氏菌的組合物，其中的細(xì)菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞和細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散都被衰減。本發(fā)明還提供了用于醫(yī)藥的利斯特氏菌，其中的細(xì)菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞和細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散都被衰減。
另外，本發(fā)明還提供了利斯特氏菌在制造用于治療與利斯特氏菌無關(guān)和/或不是利斯特氏菌引起的疾病的藥物中的應(yīng)用，其中的利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，并且其中含有編碼非利斯特氏菌抗原的核酸分子。例如，在某些實(shí)施方案中，該疾病是癌癥，而且該抗原是腫瘤抗原或是衍生自腫瘤抗原的抗原。
本發(fā)明還提供了利斯特氏菌在制造用于治療與利斯特氏菌無關(guān)和/或不是利斯特氏菌引起的疾病的藥物中的應(yīng)用，其中的細(xì)菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減。在某些實(shí)施方案中，該利斯特氏菌細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散還被衰減。在某些實(shí)施方案中，該疾病是癌癥，而且該抗原是腫瘤抗原或是衍生自腫瘤抗原的抗原。
在某些實(shí)施方案中，減毒利斯特氏菌在癌癥的預(yù)防或治療中的應(yīng)用包括向個(gè)體的免疫系統(tǒng)的細(xì)胞遞送減毒的利斯特氏菌，以此預(yù)防或治療癌癥，或向具有增加的風(fēng)險(xiǎn)因子的個(gè)體遞送減毒的利斯特氏菌，如環(huán)境接觸和/或家族性質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，用疫苗治療的個(gè)體曾經(jīng)切除過腫瘤和/或曾經(jīng)患過癌癥。
減毒利斯特氏菌或含有減毒利斯特氏菌的組合物的遞送可以采用任何適當(dāng)?shù)姆椒ǎǖ痪窒抻谄?nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、淋巴內(nèi)、經(jīng)口或鼻內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，腸胃外遞送減毒的利斯特氏菌。在某些實(shí)施方案中，用粘膜遞送。
在某些實(shí)施方案中，結(jié)合免疫刺激性制劑，向宿主給予含有減毒利斯特氏菌的組合物。可以同時(shí)、相繼或分別給予減毒利斯特氏菌和免疫刺激性制劑。免疫刺激性制劑的例子包括但是不局限于IL-2、IL-12、GMCSF、IL-15、B7.1、B7.2、B7-DC和IL-14。在某些實(shí)施方案中，免疫刺激性制劑是抗體或靶向T細(xì)胞調(diào)節(jié)分子的小分子。例如在某些實(shí)施方案中，免疫刺激性制劑是CTLA-4或BTLA-4。在某些實(shí)施方案中，免疫刺激性制劑是能靶向調(diào)節(jié)T細(xì)胞的制劑。例如用于綴合減毒利斯特氏菌的免疫刺激性制劑可以是抗CD25抗體、抗LAG-3抗體或環(huán)磷酰胺。
所述方法中的宿主是任意的脊椎動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物包括馴養(yǎng)動(dòng)物、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物(sport animals)和靈長類動(dòng)物，包括人。
給予宿主的藥物組合物或疫苗的劑量根據(jù)宿主種屬、宿主的大小和宿主的病情或疾病相應(yīng)變化。組合物的劑量還取決于給予組合物的頻率和給予途徑。在某些實(shí)施方案中，單個(gè)劑量含有大約102到大約1012個(gè)減毒利斯特氏菌的生物體。在某些實(shí)施方案中，單個(gè)劑量含有大約106到大約1011個(gè)減毒利斯特氏菌的生物體。在其他實(shí)施方案中，單個(gè)劑量的藥物組合物或疫苗含有大約107到大約1010個(gè)減毒生物體。
V.試劑盒本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有本發(fā)明的減毒利斯特氏菌(如前面介紹的和在下面的實(shí)施例中的)的試劑盒(或制造的商品)。
一方面，本發(fā)明提供了試劑盒，其含有(a)含有利斯特氏菌的組合物，其中的利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，并且含有編碼非利斯特氏菌抗原的核酸分子；和(b)將該組合物用于預(yù)防或治療宿主的疾病的說明書。在某些實(shí)施方案中，該說明書在試劑盒上或試劑盒中的標(biāo)簽上。在其他實(shí)施方案中，該說明書在包含于試劑盒中的插入物上。
另一方面，本發(fā)明提供了試劑盒，其含有(a)含有利斯特氏菌的組合物，其中的利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，并且含有編碼非利斯特氏菌抗原的核酸分子；和(b)將該組合物給予宿主的說明書。在某些實(shí)施方案中，該說明書在試劑盒上或試劑盒中的標(biāo)簽上。在其他實(shí)施方案中，該說明書在包含在試劑盒中的插入物上。在某些實(shí)施方案中，該說明書在試劑盒上或試劑盒中的標(biāo)簽上。在其他實(shí)施方案中，該說明書在包含在試劑盒內(nèi)的插入物上。
另一方面，本發(fā)明提供了試劑盒，其含有(a)含有利斯特氏菌的組合物，其中的利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減；和(b)將該組合物用于預(yù)防或治療宿主疾病的說明書。在某些實(shí)施方案中，該利斯特氏菌的細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散還被衰減。在某些實(shí)施方案中，該說明書在試劑盒上或試劑盒中的標(biāo)簽上。在其他實(shí)施方案中，該說明書在包含在試劑盒內(nèi)的插入物上。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了試劑盒，其含有(a)含有利斯特氏菌的組合物，其中的利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減；和(b)將該組合物給予宿主的說明書。在某些實(shí)施方案中，該利斯特氏菌的細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散還被減毒。在某些實(shí)施方案中，該說明書在試劑盒上或試劑盒中的標(biāo)簽上。在其他實(shí)施方案中，該說明書在包含在試劑盒內(nèi)的插入物上。
實(shí)施例用下述實(shí)施例解釋本發(fā)明，不過本發(fā)明不局限于此。
實(shí)施例1.構(gòu)建突變利斯特氏菌株A.制備突變的利斯特氏菌株利斯特氏菌株來自10403S(Bishop等人，J.Immunol.1392005(1987))。用已有的SOE-PCR和等位基因交換的方法(Camilli等人，Mol.Microbiol.8143(1993))產(chǎn)生帶有所示基因的符合讀框的(in-frame)缺失的利斯特氏菌株。在Glomski等人J.Cell.Biol.1561029(2002)中介紹了突變菌株LLO L461T(DP-L4017)，引入此處作為參考。ΔactA突變株(DP-L4029)是在Skoble等人，J.of Cell Biology，150527-537(2000)中介紹的DP-L3078菌株，引入此處作為參考，其去除了原噬菌體。(在(Lauer等人，J.Bacteriol.1844177(2002)、美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2003/0203472)中介紹了原噬菌體去除(curing))。以前還報(bào)道了LLO-突變體(DP-L4027)(Lauer等人，J.of Bacteriology，1844177-4186(2002))、和LLOΔ26(DP-L4042)(Decatur等人，Science290992(2000))。在共同未決的美國臨時(shí)申請(qǐng)60/446,051(提交于2003年2月6日)中介紹了名為L4029/uvrAB的ΔactAΔuvrAB菌株的構(gòu)建(參見該申請(qǐng)的實(shí)施例7)。DP-L4029uvrAB(又稱為ΔactAΔuvrAB或actA-/uvrAB-)在2003年10月3日保藏于ATCC，檢索號(hào)為PTA-5563。
B.通過等位基因交換使利斯特氏菌中缺失inlB所構(gòu)建的pKSV7-dl inlB。
可以通過如Gamilli等人，Mol.Microbiol.8143-147(1993)中所描述的等位基因交換實(shí)現(xiàn)利斯特氏菌DP-L4029(或從其它選定的突變菌株或從野生型利斯特氏菌)中的inlB缺失。可以用拼接重疊延伸(SOE)PCR制備用于等位基因交換步驟的構(gòu)建體(construct)。內(nèi)化素B基因的來源是列在Genbank中的序列，其檢索號(hào)是AL591975(單核細(xì)胞增生利斯特氏菌株EGD，完整基因組、片段3/12；inlB基因區(qū)域nts.97008-98963)，引入此處作為參考，和/或列在Genbank中的檢索號(hào)為NC-003210(單核細(xì)胞增生利斯特氏菌株EGD，完整基因組，inlB基因區(qū)域nts.457008-458963)，引入此處作為參考。
在初次PCR反應(yīng)中，用下述模板和引物擴(kuò)增分別從利斯特氏菌inlB基因的5’端和3’端上游和下游大約1000bp的序列模板DP-L4056或DP-L4029基因組DNA引物對(duì)1(用于擴(kuò)增inlB 5’端的上游區(qū)域)Lm-96031F5’-GTTAAGTTTCATGTGGACGGCAAAG(SEQ ID NO2)(Tm72℃)Lm-(3’inlB-R+)97020R5’-AGGTCTTTTTCAGTTAACTATCCTCTCCTTGATTCTAGTTAT(SEQ ID NO3)(Tm114℃)(下劃線的序列和InlB的羧基末端的下游區(qū)域互補(bǔ)。)擴(kuò)增子大小(bp)1007引物對(duì)2(用于擴(kuò)增inlB3’端的下游區(qū)域)Lm-(5’inlB-F+)98911F5’-CAAGGAGAGGATAGTTAACTGAAAAAGACCTAAAAAAGAAGGC(SEQ ID NO4)(Tm118℃)(下劃線序列和InlB的氨基末端的下游區(qū)域互補(bǔ)。)Lm-99970R5’-TCCCCTGTTCCTATAATTGTTAGCTC(SEQ ID NO5)(Tm74℃)擴(kuò)增子大小(bp)1074在二次PCR反應(yīng)中，利用在引物對(duì)1的反向引物和引物對(duì)2的正向引物間的互補(bǔ)性，通過SOE PCR將初次PCR擴(kuò)增子融合。結(jié)果得到精確的inlB編碼序列nts.97021-98910＝1889bp缺失。下面的模板和引物用于次級(jí)PCR反應(yīng)模板純凈的初次PCR反應(yīng)產(chǎn)物引物對(duì)Lm-96043F5’-GTGGACGGCAAAGAAACAACCAAAG(SEQ ID NO6)(Tm74℃)
Lm-99964R5’-GTTCCTATAATTGTTAGCTCATTTTTTTC(SEQ ID NO7)(Tm74℃)(擴(kuò)增子大小(bp)2033)完成該構(gòu)建流程的操作如下用Vent DNA聚合酶(NEB)和10μl洗滌后的利斯特氏菌DP-L4056或DP-L4029在30℃的過夜培養(yǎng)物進(jìn)行初次PCR反應(yīng)(3個(gè)溫度循環(huán))。用1％的瓊脂糖凝膠檢測(cè)預(yù)計(jì)大小的利斯特氏菌擴(kuò)增子(1007bp和1074bp)。凝膠純化初次PCR反應(yīng)物，用GeneClean(BIO 101)洗脫DNA。
用大約等量的每種初次PCR反應(yīng)物作為模板(ca.5μl)進(jìn)行二次PCR反應(yīng)。用1％的瓊脂糖凝膠確定來自二次PCR反應(yīng)的預(yù)計(jì)大小的利斯特氏菌擴(kuò)增子(2033bp)。用Taq聚合酶將腺苷殘基添加到利斯特氏菌dl inlB擴(kuò)增子的3’末端。
然后將該利斯特氏菌dl inlB擴(kuò)增子插入到pCR2.1-TOPO載體中。用XhoI和KpnI酶切pCR2.1-TOPO-dl inlB質(zhì)粒DNA，凝膠純化2123bp片段。該KpnI/XhoI 2123bp片段插入到已經(jīng)用KpnI和XhoI酶切并且用CIAP處理過的pKSV7載體中(pKSV7-dl inlB)。然后測(cè)定在pKSV7-d1inlB中的dl inlB序列的保真度。用pKSV7-dl inlB質(zhì)粒通過等位基因交換從目的利斯特氏菌株中缺失inlB基因。
C.構(gòu)建抗原表達(dá)菌株制備突變利斯特氏菌株，其表達(dá)截短形式的模型抗原卵白蛋白(OVA)、名為AH1(SPSYVYHQF)(SEQ ID NO8)的來自小鼠結(jié)直腸癌的免疫顯性表位(CT26)和改變的表位AH1-A5(SPSYAYHQF(SEQ IDNO9)；Slansky等人，Immunity，13529-538(2000)。用pPL2整合性載體(Lauer等人，J.Bacteriol.1844177(2002)；美國專利公開號(hào)2003/0203472)得到含有單拷貝整合到利斯特氏菌基因組的無害位點(diǎn)(innocuous site)的OVA和AH1-A5/OVA重組利斯特氏菌株。
i.表達(dá)OVA利斯特氏菌的構(gòu)建(DP-L4056)。
首先制備由溶血素-缺失的LLO與截短的OVA融合組成的并包含于pPL2整合載體(pPL2/LLO-OVA)中的抗原表達(dá)盒。在PSA(Phage fromScottA)的附著位點(diǎn)tRNAArg-attBB’處將pPL2/LLO-OVA導(dǎo)入到噬菌體-去除的(phage-cured)的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌株DP-L4056中得到利斯特氏-OVA疫苗菌株。
用下述的模板和引物通過PCR擴(kuò)增溶血素缺失LLO來源DP-L4056基因組DNA引物正向引物(KpnI-LLO nts.1257-1276)5’-CTCTGGTACCTCCTTTGATTAGTATATTC(SEQ ID NO10)(TmLLO-spec52℃。整體80℃)反向引物(BamHI-XhoI-LLO nts.2811-2792)5’-CAATGGATCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATCCC(SEQ ID NO11)(TmLLO-spec52℃。整體102℃)用下述的模板和引物還通過PCR擴(kuò)增截短的OVA來源來自DP-E3616大腸桿菌的pDP 3616質(zhì)粒DNA(Higgins等人，Mol.Molbiol.311631-1641(1999))。
引物正向引物(XhoI-NcoI OVA cDNA nts.174-186)5’-ATTTCTCGAGTCCATGGGGGGTTCTCATCATC(SEQ ID NO12)(TmOVA-spec60℃。整體88℃)反向引物(XhoI-NotI-HindIII)5’-GGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTT(SEQ ID NO13)(Tm整體82℃)完成該構(gòu)建過程的操作包括首先是用KpnI和BamHI切割LLO擴(kuò)增子，并插入到KpnI/BamHI位點(diǎn)導(dǎo)入到pPL2載體中(pPL2-LLO)。然后用XhoI和NotI切割OVA擴(kuò)增子并插入到已經(jīng)經(jīng)過XhoI/NotI切割的pPL2-LLO中(注意該pPL2載體不含有任何XhoI位點(diǎn)；pDP-3616含有1個(gè)XhoI位點(diǎn)，該位點(diǎn)在OVA的反向引物設(shè)計(jì)中形成的)。用限制性分析(KpnI-LLO-XhoI-OVA-NotI)和測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建體pPL2/LLO-OVA。通過轉(zhuǎn)化將pPL2/LLO-OVA質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌中，然后通過Lauer等人所述的接合方法使之導(dǎo)入并整合到利斯特氏菌(DP-L4056)中(或其他目的利斯特氏菌株中，如ΔinlB突變體或ΔactAΔinlB雙突變體)。
可以在美國臨時(shí)申請(qǐng)名稱為“Free Living Microbe BasedVaccine Compositions”，美國系列號(hào)60/511,869，提交于2003年10月15日的專利的實(shí)施例8中發(fā)現(xiàn)表達(dá)OVA的抗原表達(dá)盒插入的描述。
ii.表達(dá)AH1/OVA或AH1-A5/OVA的利斯特氏菌株的構(gòu)建。
為了制備表達(dá)AH1/OVA或AH1-A5/OVA的抗原序列的利斯特氏菌株，首先從寡核苷酸制備攜帶該抗原的插入片段，然后連接到pPL2-LLO-OVA載體中(如上述描述制備的)。
用下述寡核苷酸制備AH1或AH1-A5的插入片段AH1表位插入片段(ClaI-PstI相容末端)上鏈(Top strand)寡核苷酸(AH1 Top)5’-CGATTCCCCTAGTTATGTTTACCACCAATTTGCTGCA(SEQ ID NO14)下鏈(Bottom strand)寡核苷酸(AH1 Bottom)5’-GCAAATTGGTGGTAAACATAACTAGGGGAAT(SEQ ID NO15)AH1-A5表位插入片段(ClaI-AvaII相容性末端)AH1-A5表位序列為SPSYAYHQF(SEQ ID NO9)(5’-AGT CCA AGTTAT GCA TAT CAT CAA TTT-3’)(SEQ ID NO16)Top5’-CGATAGTCCAAGTTATGCATATCATCAATTTGC(SEQ ID NO17)Bottom5’-GTCGCAAATTGATGATATGCATAACTTGGACTAT(SEQ IDNO18)將該既定表位的寡核苷酸對(duì)等摩爾比混合，95℃加熱5分鐘。讓該寡核苷酸混合物緩慢冷卻。然后按照200∶1的摩爾比將退火的寡核苷酸對(duì)與用相應(yīng)限制性酶消化制備的pPL2-LLO/OVA質(zhì)粒連接。用限制性分析和/或測(cè)序鑒定該新的構(gòu)建體。
通過轉(zhuǎn)化將該質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌中，然后通過Lauer等人所述的接合方法使之導(dǎo)入并整合到利斯特氏菌(DP-L4056)中(或其他目的利斯特氏菌株中，如ΔinlB突變體或ΔactAΔinlB雙突變體)。
實(shí)施例2.利斯特氏菌致病性研究用IV感染小鼠測(cè)定某些突變利斯特氏菌株的中值致死劑量(LD50)。用三份所述菌株的5倍稀釋液IV感染3到5只雌性C57BL/6小鼠。每天觀測(cè)小鼠，連續(xù)10天，并且當(dāng)其表現(xiàn)出痛苦征兆時(shí)處死小鼠。計(jì)算中值致死劑量。其數(shù)據(jù)如下述表1所示。結(jié)果表明和actA缺失聯(lián)用時(shí)的內(nèi)化素B缺陷(ΔinlB、ΔactAΔinlB和ΔactAΔinlAB)的突變利斯特氏菌株的毒性較小。僅ΔinlB的菌株表現(xiàn)出和野生利斯特氏菌相似的毒性。
表1.減毒的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌株

實(shí)施例3.單細(xì)胞增生利斯特氏菌接種小鼠的體內(nèi)細(xì)胞毒性活性評(píng)價(jià)用一系列實(shí)驗(yàn)對(duì)接種小鼠體內(nèi)裂解抗原特異性靶細(xì)胞的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，如表2所示，通過靜脈內(nèi)(IV)或肌肉內(nèi)(IM)用單核細(xì)胞增生利斯特氏菌株DP-L4029(ΔactA)、DP-L4029ΔinlB(ΔactAΔinlB)和經(jīng)改造表達(dá)AH1-A5的相同的菌株接種Balb/c小鼠。表達(dá)AH1-A5的利斯特氏菌構(gòu)建體還表達(dá)溶血素缺失LLO和截短的OVA(參見上述實(shí)施例1.C)。接種劑量為0.1LD50。在RPMI1640培養(yǎng)基中收獲10個(gè)原初Balb/c小鼠的脾，制備靶細(xì)胞群。分離該細(xì)胞并且裂解紅細(xì)胞。計(jì)數(shù)白細(xì)胞并分成兩等份。用0.5μg/ml的靶(AH1，SPSYVYHQF(SEQ ID NO8)，購自SynPep，Dublin，CA)或?qū)φ?β-gal，TPHPARIGL(SEQ ID NO19))的特異性肽37℃的條件下對(duì)每組進(jìn)行脈沖處理90分鐘。然后用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，再用PBS+0.1％BSA洗滌2次。將細(xì)胞按照1×107/mL重懸浮在溫?zé)岬腜BS+0.1％BSA(10mL或小于10mL)中用于用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE，Molecular Probes公司，Eugene OR)進(jìn)行標(biāo)記。向靶細(xì)胞懸浮液中加入1.25μl的5mM的CFSE儲(chǔ)液，并將樣品渦旋混合。向?qū)φ占?xì)胞懸浮液中加入10倍稀釋的CFSE儲(chǔ)液，并將樣品渦旋混合。將細(xì)胞在37℃溫育10分鐘。通過添加大量(＞40ml)的冰預(yù)冷的PBS使染色終止。用PBS在室溫下洗滌細(xì)胞2次，然后重懸并計(jì)數(shù)。將每種細(xì)胞懸浮液稀釋到50×106/mL，并且各取100μl混勻的細(xì)胞，經(jīng)過尾靜脈注射到原初的或疫苗接種6天后的小鼠上。在12-24小時(shí)后，收獲脾，并用流式細(xì)胞術(shù)分析共5×106個(gè)細(xì)胞。計(jì)數(shù)高(靶)和低(對(duì)照)的熒光峰，并用二者的比確定相對(duì)于HBSS對(duì)照群的靶細(xì)胞裂解的百分比。結(jié)果如表2和圖1A所示。(本實(shí)施例的表中所示的是3只小鼠的平均值，而在圖中則表示為單個(gè)小鼠的代表性的柱狀圖)。當(dāng)用IV而不是IM給藥時(shí)，用ΔactAinlB接種和用ΔactA的相比，顯示抗原特異性體內(nèi)細(xì)胞毒性的改善。
表2.按照所示接種的Balb/c小鼠體內(nèi)細(xì)胞毒性(靶細(xì)胞相對(duì)于未接種的對(duì)照樣本的殺傷百分比)

按照表3通過IV接種，用表達(dá)AH1-A5的ΔactA和ΔactAΔinlB雙突變這兩種菌株進(jìn)行了另一項(xiàng)研究。在這個(gè)研究中，用β-gal、AH-1或P60-217(KYGVSVQDI(SEQ ID NO20)利斯特氏菌特異性對(duì)照)脈沖(pulsed)原初脾細(xì)胞。β-gal脈沖的細(xì)胞用低CFSE標(biāo)記，而AH1和P60-217脈沖的細(xì)胞用高CFSE標(biāo)記。在第5天，用β-gal和AH1脈沖的細(xì)胞注射到各組的2只小鼠中。在第5天，向各組剩下的另外2只小鼠中注射β-gal和P60-217脈沖的細(xì)胞。結(jié)果如表3和圖1B所示。
表3.按照所示接種的Balb/c小鼠體內(nèi)細(xì)胞毒性(靶細(xì)胞相對(duì)于未接種的對(duì)照樣本的殺傷百分比)

按照表4通過IV接種有或沒有AH1-A5的ΔactAΔinlB雙突變體進(jìn)行了另一項(xiàng)研究。在這個(gè)研究中，用β-gal、AH1或AH1-A5(SPSYAYHQF(SEQ ID NO9))脈沖原初脾細(xì)胞。β-gal脈沖的細(xì)胞用低CFSE標(biāo)記，AH1或AH1-A5脈沖的細(xì)胞用高CFSE標(biāo)記。在第6天，上述用β-gal和AH-1脈沖的細(xì)胞注射到各組的3只小鼠中。在第6天，向各組剩下的3只小鼠中注射β-gal和AH1-A5脈沖的細(xì)胞。結(jié)果如表4和圖1C所示。
表4.按照所示接種的Balb/c小鼠體內(nèi)細(xì)胞毒性(靶細(xì)胞相對(duì)于未接種的對(duì)照樣本的殺傷百分比)

實(shí)施例4.用ΔactAΔinlB雙突變單核細(xì)胞增生利斯特氏菌的治療性接種使用Blab/c小鼠，將CT26腫瘤細(xì)胞(ATCC CRL-2639)注射到小鼠中(2×105在100μL HBSS中，IV)建立肺轉(zhuǎn)移。CT26細(xì)胞是表達(dá)MMTV gp70表位AH1的鼠結(jié)腸腺癌(該細(xì)胞被進(jìn)一步修飾使之表達(dá)人腫瘤抗原，但該特性與此處所示數(shù)據(jù)沒有關(guān)系)。用一系列研究對(duì)用ΔactAΔinlB單核細(xì)胞增生利斯特氏菌作為有效的治療性疫苗菌株進(jìn)行評(píng)價(jià)。在一個(gè)研究中，用經(jīng)修飾可表達(dá)AH1-A5的ΔactA單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、和經(jīng)修飾可表達(dá)AH1-A5的ΔactAΔinlB單核細(xì)胞增生利斯特氏菌免疫13只小鼠的組。所有菌株在BHI(BrainHeart Infusion，F(xiàn)isher Scientific)培養(yǎng)基中，于37℃、300轉(zhuǎn)/分鐘的條件下生長，并且在使用前冷凍保存。將各菌株的冷凍存儲(chǔ)物稀釋到HBSS中，在植入腫瘤4天后，用1×107CFU，100μL將各菌株經(jīng)靜脈內(nèi)接種到小鼠中，并且用100μL HBSS作為對(duì)照。在植入腫瘤20天后，每組各處死3只小鼠并收獲肺(如圖2A所示)。
觀察每組剩下的10只小鼠的存活(未出示數(shù)據(jù))。在10只小鼠的組中進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)(僅是存活的，未從任何1只小鼠中收獲肺)，在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，使用ΔactA AH1-A5和ΔactAΔinlB AH1-A5以及表達(dá)OVA的L461T作為無關(guān)抗原對(duì)照，在另外一個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用表達(dá)FluHA的ΔactA作為無關(guān)抗原。在圖2B和2C分別表示這些實(shí)驗(yàn)的存活結(jié)果。AH1抗原對(duì)小鼠而言是內(nèi)源性的，所以任何免疫作用將會(huì)打破小鼠的免疫耐受性。結(jié)果表明ΔactAΔinlB突變體是能夠打破這些模型的耐受性的有效的疫苗，而且它能夠顯著提高荷瘤小鼠的存活。
實(shí)施例5.在肌肉內(nèi)給藥后各種單核細(xì)胞增生利斯特氏菌的免疫原性將100μL含有0.1LD50的表5所示單核細(xì)胞增生利斯特氏菌的HBSS通過IM注射到C57BL/6小鼠(每組3只)中。所有菌株在BHI(Brain Heart Infusion，F(xiàn)isher Scientific)培養(yǎng)基中，于37℃、300轉(zhuǎn)/分鐘的條件下生長，并且在使用前冷凍保存。在接種后第7天處死小鼠，收取脾，并用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法(ICS)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
為了ICS，將來自接種和對(duì)照組的小鼠的脾細(xì)胞在存在BrefeldinA(Pharmingen)的情況下，和下述物質(zhì)溫育5小時(shí)，這些物質(zhì)是SL8OVA257-264肽(SL8 OVA抗原，SIINFEKL(SEQ ID NO21)Invitrogen，San Diego，CA)(該肽能刺激OVA特異的CD8+細(xì)胞)、LLO190(NEKYAQAYPNVS(SEQ ID NO22)，Invitrogen)(利斯特氏菌溶胞素的MHC II類表位)或LLO296(VAYGRQVYL(SEQ ID NO23)，Invitrogen)(利斯特氏菌溶胞素的MHC I類表位)。Brefeldin A能夠抑制刺激T細(xì)胞時(shí)的細(xì)胞因子的分泌。脾細(xì)胞和不相關(guān)性MHC I類肽溫育作為對(duì)照。用20ng/mL PMA(佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酯，Sigma)和2μg/mL的離子霉素(Sigma)刺激的脾細(xì)胞作為IFN-γ和TNF-α細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色的陽性對(duì)照。為了檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞因子的表達(dá)，用FITC-抗-CD4mAb(RM4-5)和PerCP抗CD8mAb(53-6.7)進(jìn)行細(xì)胞染色，并用Cytofix/Cytoperm溶液(Pharmingen)固定和透化，然后用PE綴合的抗TNFαmAb(MP6-XT22)和APC綴合的抗IFN-γmAb(XMG1.2)在冰上染色30分鐘。用流式細(xì)胞術(shù)(FACScalibur，Becton Dickinson，Mountain View，CA)確定表達(dá)細(xì)胞內(nèi)IFN-γ和/或TNFα的細(xì)胞的百分比，并用CELLQuest軟件(Becton Dickins on ImmunocytometrySystem)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。FACScalibur能夠區(qū)分所有在各種抗體上的熒光標(biāo)記，通過門控(gating)被抗IFN-γ或抗TNFα、或者被這兩種染色的CD8+和CD4+的細(xì)胞確認(rèn)合適的細(xì)胞。結(jié)果如圖3A-F所示。ΔactAΔinlB菌株是比較有效的引發(fā)OVA特異免疫應(yīng)答的菌株之一。
表5.用多種單核細(xì)胞增生利斯特氏菌株接種C57BL/6

實(shí)施例6.對(duì)單核細(xì)胞增生利斯特氏菌株在C57BL/6小鼠中誘導(dǎo)的OVA特異免疫性的評(píng)價(jià)將200μL含有0.1LD50的表6所示菌株的HBSS通過IV注射到C57BL/6小鼠(每組3只)中。ΔinlB菌株注射的劑量過高，這些小鼠沒有生存7天。在接種后第7天處死小鼠，收取脾，按照實(shí)施例5中的ICS方法，對(duì)針對(duì)異種抗原卵白蛋白(OVA)、針對(duì)利斯特氏菌抗原、LLO的抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)行評(píng)價(jià)。除了用OVA、SL8(OVA257-264)和LLO(LLO190-201，LLO296-304)的T細(xì)胞表位刺激接種小鼠和對(duì)照小鼠的脾細(xì)胞之外，還用來自C57BL/6小鼠的鼠thymoma(EL-4)刺激細(xì)胞5小時(shí)，而且用編碼卵白蛋白(EG-7)的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EL-4細(xì)胞。使用活的或用150μM的補(bǔ)骨脂素S-59和3J/cm2UVA光(FX 1019輻射裝置，Baxter Fenwal，Round Lake，IL)失活后的刺激細(xì)胞。用S-59失活指的是光化學(xué)處理(PCT)，并且造成該細(xì)胞的徹底失活。針對(duì)IFN-γ的除了LLO刺激樣本的結(jié)果如圖4所示。當(dāng)用最佳的T細(xì)胞表位SL8或完整的腫瘤細(xì)胞、活的或失活的刺激5小時(shí)的時(shí)候，可以觀察到對(duì)接種小鼠脾細(xì)胞的相當(dāng)?shù)拇碳?。用完整?xì)胞刺激的結(jié)果表明OVA特異性T細(xì)胞識(shí)別腫瘤細(xì)胞的內(nèi)源性O(shè)VA水平。ΔactAΔinlB菌株相對(duì)用肽和完整細(xì)胞刺激導(dǎo)致較強(qiáng)的OVA特異應(yīng)答。
表6.用多種單核細(xì)胞增生利斯特氏菌株接種C57BL/6

為了觀察劑量反應(yīng)，用單核細(xì)胞增生利斯特氏菌野生型、經(jīng)修飾可表達(dá)OVA的ΔactA和ΔactAΔinlB菌株進(jìn)行了另一項(xiàng)研究。在200μL含有下述物質(zhì)的HBSS野生型為5×104、5×103、5×102、5×101；ΔactA為1×107、1×106、1×105、5×104、1×104；ΔactAΔinlB為1×108、1×107、1×106、1×105、5×104經(jīng)IV注射到C57BL/6小鼠(每組3只)中。在接種7天后處死小鼠，收取脾，并用ICS評(píng)價(jià)，用SL8、LLO190和LLO296肽刺激。結(jié)果示于圖5。
實(shí)施例7.經(jīng)過不同途徑對(duì)小鼠給藥時(shí)表達(dá)LLO-OVA的ΔactAΔinlB單核細(xì)胞增生利斯特氏菌雙突變體的免疫原性用ΔactA(DP-L4029)單核細(xì)胞增生利斯特氏菌或ΔactAΔinlB單核細(xì)胞增生利斯特氏菌雙突變體注射Balb/c小鼠，兩種突變體均經(jīng)過改造表達(dá)OVA抗原。用在HBSS中的1×107CFU的ΔactA或1×108CFU的ΔactAΔinlB，以200μL經(jīng)過IV(靜脈內(nèi))以100μL經(jīng)過SC(皮下)、以100μL經(jīng)過IM(肌肉內(nèi)，每條腿的四頭肌各50μL)、以50μL經(jīng)過IM(25μL每條腿的脛骨肌)、以50μL經(jīng)過ID(皮內(nèi))、或以200μL經(jīng)過IP(腹膜內(nèi))向小鼠注射給藥(每組3只)。接種經(jīng)過7天后，取出脾并按照實(shí)施例5(僅對(duì)SL8，僅對(duì)IFN-γ)，用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色進(jìn)行評(píng)價(jià)(ICS)。圖6顯示了脾中CD-8+OVA特異性T細(xì)胞的％，表明經(jīng)過多種途徑給藥，actA/inlB突變體比ΔactA產(chǎn)生的應(yīng)答更大，同時(shí)IV、IP和IM途徑表現(xiàn)出更高的應(yīng)答。
實(shí)施例8.ΔactAΔinlB單核細(xì)胞增生利斯特氏菌突變體在原初免疫活性(competent)C57BL/6小鼠中的體內(nèi)生長動(dòng)力學(xué)盡管和野生型相比，減毒的利斯特氏菌株能夠給予更高劑量，但對(duì)于開發(fā)能夠被迅速清除感染并且不損傷主要感染器官如肝或脾的安全疫苗非常重要。
用單核細(xì)胞增生利斯特氏菌DP-L4056(野生型)、DP-L4029(ΔactA)、DP-L4406(ΔinlB)或ΔactAΔinlB菌株注射C57BL/6小鼠。注射為IV如表7所示水平的100μL HBSS，包括HBSS對(duì)照組在內(nèi)，每組35只小鼠。所有的菌株均在BHI培養(yǎng)基(Brain Heart Infusion，F(xiàn)isher Scientific)中、在37℃下、300轉(zhuǎn)/分鐘的條件下生長，并且在使用前冷凍保存。按照表7所示的時(shí)間點(diǎn)每組處死3只小鼠，取出血、脾、肝用于分析。在含有0.05％的Triton X-100的5mL雙蒸水中勻漿肝和脾，通過系列稀釋液鋪板到BHI/鏈霉素平板中，測(cè)定存活的利斯特氏菌的數(shù)目。用10％緩沖的甲醛固定每組2只小鼠的肝和脾。在圖7A和8A中顯示了每個(gè)肝和脾的CFU結(jié)果。按照?qǐng)D7B和8B所示的菌株濃度重復(fù)該實(shí)驗(yàn)。
野生型利斯特氏菌對(duì)小鼠的感染在給藥后8-11天內(nèi)消除。野生型利斯特氏菌的數(shù)量持續(xù)顯著增加超過4天，并且在第11天時(shí)下降到在脾和肝中檢測(cè)的最低水平。有意思的是，ΔinlB突變體在脾和肝中表現(xiàn)出相似的動(dòng)力學(xué)在第11天誘導(dǎo)無菌免疫。相反，ΔactA突變體的數(shù)目只在最初的24小時(shí)內(nèi)在肝中、但是未在脾中增加超過10倍，而且在感染4天后終于降低。ΔactAΔinlB雙突變體盡管給予了最高劑量，但是和其它3種菌株相比，在肝中被非常迅速地清除，并在第4天誘導(dǎo)無菌免疫細(xì)菌加速清除與其在腫瘤治療模型中誘導(dǎo)有效的保護(hù)性和抗原特異性免疫的能力形成對(duì)比。
表8.減毒單核細(xì)胞增生利斯特氏菌的體內(nèi)生長動(dòng)力學(xué)研究的劑量和取樣程序

實(shí)施例9.多種單核細(xì)胞增多性利斯特氏菌株體外感染非吞噬細(xì)胞和吞噬細(xì)胞的比較用野生型、ΔactA、ΔinlB和ΔactAΔinlB單核細(xì)胞增生利斯特氏菌株與人單核細(xì)胞系THP-1(ATCC#TIB-202)、初級(jí)人單核細(xì)胞、人肝細(xì)胞系HepG2(來自Drew Pardoll，Johns Hopkins University，也可獲自ATCC#HB8065)、或初級(jí)人肝細(xì)胞(In vitro Technologies，Baltimore，MD)溫育(37℃，5％CO2)。使用Ficoll分級(jí)(gradient)純化淋巴細(xì)胞，然后用綴合到單核細(xì)胞特異性抗體(Miltenyi Biotec)上的磁珠分離單核細(xì)胞從全血中制備初級(jí)人單核細(xì)胞。在補(bǔ)充有10％加熱失活的胎牛血清(FBS)、23.8mM碳酸氫鈉、1×非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES緩沖液和1mM丙酮酸鈉的RPMI培養(yǎng)基中孵育THP-1和人單核細(xì)胞。將5×105CFU利斯特氏菌株添加到5×105THP-1細(xì)胞中，以及將3.5×107CFU添加到3.5×105單核細(xì)胞細(xì)胞中，在補(bǔ)充有20％加熱失活的胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和1×非必需氨基酸的Eagle基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Minimal Essential Media Eagle)中孵育HepG2細(xì)胞。將1×106CFU利斯特氏菌株添加到1×105HepG2細(xì)胞中。在添加利斯特氏菌之前，在肝細(xì)胞生長孵育培養(yǎng)基(HepatocyteGrowth Incubation Media)(In vitro Technologies)中孵育初級(jí)人肝細(xì)胞，在添加利斯特氏菌后在補(bǔ)充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和1×非必需氨基酸的DMEM培養(yǎng)基中孵育初級(jí)人肝細(xì)胞。將3.5×106CFU利斯特氏菌株添加到3.5×105肝細(xì)胞中。溫育1小時(shí)后，為了殺死全部細(xì)胞外細(xì)菌，用含有慶大霉素(50μg/mL)的完全培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞。然后用225μL無菌水裂解細(xì)胞，然后添加25mL10×PBS。將獲得的溶液系列稀釋鋪到BHI上，對(duì)每個(gè)樣本的細(xì)菌滴度進(jìn)行評(píng)價(jià)。利斯特氏菌感染細(xì)胞的數(shù)目除以添加到細(xì)胞的利斯特氏菌，以此確定該菌株的感染性，針對(duì)野生型菌株進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
結(jié)果表示在圖9中。如圖9所示，所有的菌株都能以相似的比率感染THP-1細(xì)胞和人肝細(xì)胞，這表明缺少ActA或InlB不會(huì)影響對(duì)吞噬細(xì)胞的感染。不過，缺少InlB的利斯特氏菌株對(duì)肝細(xì)胞的感染顯著降低。用ΔinlB或ΔactAΔinlB這些InlB無效突變菌株感染時(shí)，對(duì)人肝細(xì)胞的感染降低了將近60％，對(duì)HepG2細(xì)胞的感染降低了將近80％。這些研究表明InlB蛋白質(zhì)缺失能通過防止培養(yǎng)的和初級(jí)肝細(xì)胞的感染而選擇性地被吞噬細(xì)胞所攝取。
實(shí)施例10.調(diào)理的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌在體外對(duì)非吞噬細(xì)胞和吞噬細(xì)胞的感染的比較用來自經(jīng)過靜脈給予ΔactA利斯特氏突變體(1∶20稀釋)或?qū)φ誋BSS感染的小鼠的高滴度的利斯特氏菌特異性小鼠血清與野生型利斯特氏菌在冰上預(yù)溫育1小時(shí)。分別在1和10MOIs下，于37℃感染吞噬性樹突細(xì)胞樣細(xì)胞系(DC2.4)和非吞噬性結(jié)腸上皮細(xì)胞系(Caco-2)1小時(shí)。洗滌細(xì)胞3次去除細(xì)胞外細(xì)菌。在50mg/ml慶大霉素存在下再培養(yǎng)細(xì)胞2小時(shí)，以此殺死殘留的細(xì)胞外細(xì)菌。用含0.01％Triton X-100的dH2O裂解細(xì)胞，以測(cè)定對(duì)細(xì)胞系的感染性。將系列稀釋物鋪到BHI瓊脂板上，測(cè)定存活的利斯特氏菌數(shù)目。
如圖10所示，和來自接種小鼠的高滴度免疫血清溫育的ΔactA利斯特氏菌感染非吞噬細(xì)胞系Caco-2，而不是吞噬性樹突細(xì)胞系DC2.4的能力降低。由調(diào)理的利斯特氏菌的對(duì)非吞撒細(xì)胞的感染的下降和用缺失actA和inlB的減毒利斯特氏菌株產(chǎn)生的結(jié)果相當(dāng)(圖9)。不想被理論所束縛，用利斯特氏特異性抗體(靶向內(nèi)化素的單克隆抗體，或多克隆抗體Abs)可能封閉ΔactA利斯特氏菌表面的能進(jìn)行體內(nèi)非吞噬細(xì)胞感染的受體。
實(shí)施例11.S-59補(bǔ)骨脂索UVA處理利斯特氏菌的范例。
利斯特氏菌的ΔactAΔuvrAB突變株(DP-L4029uvrAB)經(jīng)修飾可表達(dá)OVA抗原。用不同濃度的補(bǔ)骨脂素S-59處理該菌株和經(jīng)修飾可表達(dá)OVA的DP-L4029。利斯特氏菌株在37℃下生長過夜，并且將2mL等份(aliquot)稀釋到100mL的BHI中，在37℃下生長將近4小時(shí)，達(dá)到OD600為0.5(將近1×109CFU/mL)。將5mL等份的每種利斯特氏菌加入到15mL的試管中，在2300×g離心20分鐘，去除上清，將細(xì)菌重懸到5mL PBS中，最終大約為1×109CFU/mL。對(duì)于uvrAB突變菌株，將3mM S-59儲(chǔ)液33.3μL稀釋到10mL PBS中以提供10μM溶液，并且向利斯特氏菌中加入適當(dāng)?shù)确莸脑撊芤?，使其終濃度為10、20、30、40、50、60、70、80、90和100nM，同時(shí)，對(duì)于DP-L4029，加入S-59，使其在5mL的終體積中，終濃度為100、200、400、800和1000nM。將這些菌轉(zhuǎn)移到6孔培養(yǎng)板中，接受0.5J/cm2劑量的照射(FX1019 UVA裝置)。將樣本轉(zhuǎn)移到15mL的試管中，添加5mL PBS，然后在2300×g下離心20分鐘，以此洗滌未反應(yīng)的補(bǔ)骨脂素。去除上清并且將細(xì)菌重懸在5mL的PBS中，再轉(zhuǎn)移到新的6孔板中。為了將補(bǔ)骨脂素的單加成物(monoadduct)轉(zhuǎn)變成交聯(lián)物，這些菌接受5.5J/cm2劑量的UVA照射。將每種利斯特氏菌株的樣本在72℃加熱3小時(shí)，使之被加熱殺死。
用鼠DC 2.4細(xì)胞系(來自Dana Farber Cancer Institute的樹突細(xì)胞系，參見Shen等人，J Immuno1158(6)2723-30(1997))和B3Z T細(xì)胞雜交瘤(得自Dr.Shastri，University of California，Berkeley)評(píng)價(jià)細(xì)菌樣本的抗原呈遞。B3Z是lacZ可誘導(dǎo)性CD8+T細(xì)胞雜交瘤，當(dāng)識(shí)別MHC I類分子的OVA抗原時(shí)，該細(xì)胞能表達(dá)β半乳糖酶基因。用β半乳糖苷酶的底物CPRG(氯酚紅-β-D-吡喃半乳糖苷，Calbiochem，La Jolla，CA)的代謝檢測(cè)β半乳糖苷酶的產(chǎn)生水平，該水平與由DC 2.4細(xì)胞呈遞的OVA的抗原量直接相關(guān)。在含有10％FBS(胎牛血清，HyClone)的PRMI1640培養(yǎng)基(RPMI，Invitrogen)中維持DC 2.4細(xì)胞和B3Z T細(xì)胞雜交瘤。將200μL等份的DC2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)移到96孔培養(yǎng)板中(每孔1×105DC 2.4)。將50μL細(xì)菌樣本的母液系列稀釋到450μL PBS中使之達(dá)到1×105CFU/mL(S-59處理樣本是CFU相等的，即S-59處理前的集落形成單位數(shù))。將各稀釋度的20μL等份轉(zhuǎn)移到含DC 2.4細(xì)胞的孔中，使之達(dá)到大約1×104、1×105、1×106、1×107或1×108CFU/mL。另外，只加20μL等份的PBS作為陰性對(duì)照。樣本在37℃、5％CO2下溫育1小時(shí)。用PBS洗滌平板3次，去除細(xì)胞外細(xì)菌。將200μL等份B3Z T細(xì)胞(1×105個(gè)細(xì)胞)和100μg/ml慶大霉素(Sigma)添加到每個(gè)孔中。作為陽性對(duì)照，將100nM SL8 OVA257-264肽(SL8 OVA抗原，SIINFEKL(SEQ ID NO21)，Invitrogen，San Diego，CA)添加到各含1×105的DC2.4和B3Z細(xì)胞的孔中。樣本在37℃、5％CO2下溫育過夜。在400×g離心平板3分鐘，并用250μL PBS洗滌各孔。向各個(gè)孔中加入含100μM 2-巰基乙醇、9mM MgCl2、0.125％ Igepal CA-630((Octaphenoxy)polyethoxyethanol，Sigma)和0.15mM CPRG的100μL的PBS。樣本在37℃溫育至少4小時(shí)。用讀板儀在595nm下(655nm參考測(cè)量)測(cè)量吸光度。
用S-59處理樣本的結(jié)果如表8A、圖11A和圖11B(按照每個(gè)DC 2.4細(xì)胞1個(gè)利斯特氏菌，不扣除本底水平的情況下計(jì)算抗原呈遞)所示。兩種加熱殺死的菌株的結(jié)果表現(xiàn)出滴度低于檢測(cè)限(完全失活)，在B3Z分析中，該加熱殺死的細(xì)菌不能呈遞OVA抗原。結(jié)果表明uvrAB突變株顯示非常強(qiáng)的抗原呈遞，即使增殖減弱至檢測(cè)限，而非uvrAB突變株在抗原呈遞上顯示極大的下降(作為增殖減弱的函數(shù))(至大約基本完全失活的基底水平)。這表明uvrAB突變菌株保留了補(bǔ)骨脂素減毒的利斯特氏菌的MHC I類呈遞的能力，而且提供了具有有效免疫應(yīng)答和顯著增強(qiáng)安全性水平的疫苗。
表8A在不同濃度補(bǔ)骨脂素S-59下經(jīng)UVA處理的利斯特氏菌的Log衰減和OVA抗原呈遞

*未處理的百分比、按照每DC2.4細(xì)胞1個(gè)利斯特氏菌測(cè)定。
用相同菌株進(jìn)行了另一項(xiàng)研究。在這個(gè)研究中，利斯特氏菌在BHI中，于37℃下生長過夜。按照1∶50將這些菌稀釋到BHI中，并且在37℃下、300轉(zhuǎn)/分鐘的條件下生長至OD600為0.5，此時(shí)取出50mL該溶液轉(zhuǎn)移到干凈的搖瓶中，添加S-59使之達(dá)到表12B所示的水平。在37℃、300轉(zhuǎn)/分鐘的條件下培養(yǎng)這些樣本大約1小時(shí)(OD600大約1.0，大約1×109/mL)，取出1mL等份用于評(píng)價(jià)滴度，將剩下的部分轉(zhuǎn)移的150mM的培養(yǎng)皿中，在6J/cm2的劑量下照射(FX1019)。測(cè)定照射后每個(gè)樣本的滴度，并且如上述方法測(cè)定OVA抗原呈遞?？稍诒?B、圖11C和圖11D中看到結(jié)果(按照每個(gè)DC2.4細(xì)胞10利斯特氏菌的抗原呈遞，不扣除本底進(jìn)行計(jì)算)。結(jié)果表明母本菌株抗原呈遞在基本上完全失活時(shí)是基底水平，而uvrAB突變株，在超過基本完全失活將近10倍范圍的S-59濃度，還表現(xiàn)出充分的抗原呈遞。
表8B在細(xì)菌生長過程中存在不同濃度補(bǔ)骨脂素S-59下經(jīng)UVA處理的利斯特氏菌的Log衰減和OVA抗原呈遞

*未處理的百分比、按照每DC2.4細(xì)胞10個(gè)利斯特氏菌測(cè)定。
實(shí)施例12當(dāng)存在預(yù)存免疫性(pre-existing immunity)和/或抗體時(shí)，利斯特氏菌突變體刺激抗原特異性應(yīng)答的效力經(jīng)過IP將0.1LD50的野生型利斯特氏菌感染C57BL/6小鼠1次或3次(間隔10天)，由此誘導(dǎo)出預(yù)存抗利斯特氏菌免疫性。當(dāng)最后一次暴露于0.1 LD50的所示利斯特氏菌株32天后，經(jīng)ip對(duì)帶有利斯特氏免疫性(1或3vx)以及原初小鼠接種。7天后收取脾，用針對(duì)IFN-g的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法測(cè)定OVA特異性CD8+T細(xì)胞的頻率(frequency)。結(jié)果如圖12A所示。發(fā)現(xiàn)在預(yù)存免疫性小鼠中的OVA特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的致敏，其能夠抵御致死量的野生型利斯特氏菌感染。
通過腹膜內(nèi)用0.1LD50的野生型利斯特氏菌，使所有C57BL/6小鼠感染，由此誘導(dǎo)出預(yù)存抗利斯特氏菌免疫性。用0.1LD50所示利斯特氏菌株70天后經(jīng)ip接種小鼠。21天后，向小鼠皮下植入2e5 B16-OVA腫瘤細(xì)胞并每周測(cè)量腫瘤2次。結(jié)果如圖12B所示。腫瘤研究表明當(dāng)存在抗利斯特氏菌免疫性時(shí)激發(fā)的OVA特異性免疫應(yīng)答能夠有效地抵御B16-OVA腫瘤的攻擊。
通過靜脈內(nèi)用0.1LD50的所示利斯特氏菌感染C57BL/6小鼠感染4次，由此得到高滴度免疫血清。收取免疫和非免疫血清，用利斯特氏菌特異性ELISA測(cè)定滴度。在第-1天和第1天，用200μL的鹽水、血清(免疫或非免疫的)、或兔多克隆抗利斯特氏菌抗體iv注射原初的C57BL/6小鼠。在第0天，用0.1LD50的ΔactA-OVA利斯特氏菌經(jīng)iv接種小鼠?；厥掌?，用針對(duì)IFN-g的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法測(cè)定OVA特異性CD8+T細(xì)胞的頻率。結(jié)果如圖12C所示。結(jié)果顯示利斯特氏特異性抗體的被動(dòng)轉(zhuǎn)移到原初小鼠上沒有降低處理小鼠的初級(jí)OVA特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的致敏(priming)。
此處列舉的所有出版物、專利、專利申請(qǐng)和檢索號(hào)(同時(shí)包括多核苷酸和多肽序列)全部引入此處作為參考，用于相同的目的，就如同每個(gè)出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)具體和單獨(dú)引入在此作為參考。
PCT/RO/134表關(guān)于保藏的微生物或其它生物材料的說明(PCT實(shí)施細(xì)則第13條之二)PCT/RO/134表關(guān)于保藏的微生物或其它生物材料的說明(PCT實(shí)施細(xì)則第13條之二)PCT/RO/134表
權(quán)利要求
1.分離的利斯特氏菌，其進(jìn)入非吞噬細(xì)胞方面被減毒并含有編碼非利斯特氏菌抗原的核酸分子。
2.權(quán)利要求1的減毒利斯特氏菌，其細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散還被減毒。
3.權(quán)利要求2的減毒利斯特氏菌，其在選自actA、1p1A、p1cA、p1cB、mp1和h1y中的一個(gè)或多個(gè)基因上含有至少一個(gè)突變。
4.權(quán)利要求3的減毒利斯特氏菌，其在actA上含有突變。
5.權(quán)利要求2的減毒利斯特氏菌，其中該菌的核酸經(jīng)過與核酸靶向化合物反應(yīng)而被修飾，使該菌的增殖能力減弱。
6.權(quán)利要求5的減毒利斯特氏菌，其中該菌的核酸與由UVA輻射激活的補(bǔ)骨脂素接觸而被修飾。
7.權(quán)利要求1的減毒利斯特氏菌，其為一種或多種內(nèi)化素缺陷。
8.權(quán)利要求7的減毒利斯特氏菌，其為內(nèi)化素B缺陷。
9.權(quán)利要求8的減毒利斯特氏菌，其在in1B基因上含有突變。
10.權(quán)利要求8的減毒利斯特氏菌，其細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散還被衰減。
11.權(quán)利要求10的減毒利斯特氏菌，其為ActA缺陷。
12.權(quán)利要求11的減毒利斯特氏菌，其在actA和in1B上含有至少一個(gè)突變。
13.權(quán)利要求1的減毒利斯特氏菌，其屬于單核細(xì)胞增生利斯特氏菌種。
14.權(quán)利要求1的減毒利斯特氏菌，其中的抗原是腫瘤相關(guān)抗原或源自腫瘤相關(guān)抗原。
15.權(quán)利要求14的減毒利斯特氏菌，其中的抗原是選自間皮素(mesothelln)、sp17、PAGE-4、gp-100、PSMA、K-ras、TARP、蛋白酶3、WT-1、NY-ESO-1、CEA、Her-2和SPAS-1的腫瘤相關(guān)抗原或源自腫瘤相關(guān)抗原。
16.權(quán)利要求1的減毒利斯特氏菌，其中的抗原是感染性疾病抗原或源自感染性疾病抗原。
17.含有權(quán)利要求1的減毒利斯特氏菌的免疫原性組合物。
18.疫苗，含有(a)權(quán)利要求1的減毒利斯特氏菌和(b)藥學(xué)上允許的載體或佐劑。
19.在宿主中誘導(dǎo)對(duì)非利斯特氏菌抗原的免疫應(yīng)答的方法，包括向宿主給予有效量的含有權(quán)利要求1的減毒利斯特氏菌的組合物。
20.預(yù)防或治療宿主疾病的方法，包括向宿主給予有效量的含有權(quán)利要求1的減毒利斯特氏菌的組合物。
21.含有權(quán)利要求1的減毒利斯特氏菌株的專門的抗原呈遞細(xì)胞。
22.分離的利斯特氏菌，其進(jìn)入非吞噬細(xì)胞以及細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散都被減毒。
23.權(quán)利要求22的減毒利斯特氏菌，其在選自actA、1p1A、p1cA、p1cB、mp1和h1y中的一個(gè)或多個(gè)基因上含有至少一個(gè)突變。
24.權(quán)利要求23的減毒利斯特氏菌，其在actA上含有突變。
25.權(quán)利要求22的減毒利斯特氏菌，其中該菌的核酸經(jīng)過與核酸靶向化合物反應(yīng)而被修飾，使該菌的增殖能力減弱。
26.權(quán)利要求25的減毒利斯特氏菌，其中該細(xì)菌的核酸與由UVA輻射激活的補(bǔ)骨脂素接觸而被修飾。
27.權(quán)利要求22的減毒利斯特氏菌，其中減毒利斯特氏菌為一個(gè)或多個(gè)內(nèi)化素缺陷。
28.權(quán)利要求27的減毒利斯特氏菌，其為內(nèi)化素B缺陷。
29.權(quán)利要求28的減毒利斯特氏菌，其在in1B基因上含有至少一個(gè)突變。
30.權(quán)利要求28的減毒利斯特氏菌，其為ActA缺陷。
31.權(quán)利要求30的減毒利斯特氏菌，其中的減毒利斯特氏菌在actA和in1B上含有至少一個(gè)突變。
32.權(quán)利要求22的減毒利斯特氏菌，其屬于單核細(xì)胞增生利斯特氏菌種。
33.權(quán)利要求22的減毒利斯特氏菌，其含有編碼非利斯特氏菌抗原的核酸分子。
34.權(quán)利要求33的減毒利斯特氏菌，其中的非利斯特氏菌抗原是腫瘤相關(guān)抗原或源自腫瘤相關(guān)抗原。
35.權(quán)利要求34的減毒利斯特氏菌，其中的抗原是選自間皮素(mesothelin)、sp17、PAGE-4、gp-100、PSMA、K-ras、TARP、蛋白酶3、WT-1、NY-ESO-1、CEA、Her-2和SPAS-1的腫瘤相關(guān)抗原或源自腫瘤相關(guān)抗原。
36.權(quán)利要求33的減毒利斯特氏菌，其中的非利斯特氏菌抗原是感染性疾病抗原或源自感染性疾病抗原。
37.含有權(quán)利要求22的減毒利斯特氏菌的免疫原性組合物。
38.疫苗，含有(a)權(quán)利要求22的減毒利斯特氏菌和(b)藥學(xué)上允許的載體或佐劑。
39.在宿主中誘導(dǎo)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，包括向宿主給予有效量的含有權(quán)利要求22的減毒利斯特氏菌的組合物，其中的減毒利斯特氏菌含有編碼該抗原的核酸。
40.預(yù)防或治療宿主疾病的方法，包括向宿主給予有效量的含有權(quán)利要求22的減毒利斯特氏菌的組合物。
41.含有權(quán)利要求22的減毒利斯特氏菌株的專門的抗原呈遞細(xì)胞。
42.菌株，其選自保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的檢索號(hào)為PTA-5562的單核細(xì)胞增生性利斯特氏菌ΔactAΔin1B菌株或該保藏菌株的內(nèi)化素B和ActA都缺陷的突變體。
43.權(quán)利要求42的菌株，該菌株是保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、其檢索號(hào)為PTA-5562的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌的菌株。
44.含有權(quán)利要求42的菌株的免疫原性組合物。
45.疫苗，含有(a)權(quán)利要求42的菌株和(b)藥學(xué)上允許的載體或佐劑。
46.在宿主中誘導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，包括向宿主給予有效量的含有權(quán)利要求42的菌株的組合物，其中該菌株含有編碼該抗原的核酸。
47.預(yù)防或治療宿主疾病的方法，包括向宿主給予有效量的含有權(quán)利要求42的菌株的組合物。
48.含有權(quán)利要求42的菌株的專門的抗原呈遞細(xì)胞。
49.疫苗，含有(a)利斯特氏菌，其中減毒的利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減和(b)藥學(xué)上允許的載體或佐劑。
50.權(quán)利要求49的疫苗，其中的減毒利斯特氏菌為一種或多種內(nèi)化素缺陷。
51.權(quán)利要求49的疫苗，其中的減毒利斯特氏菌為內(nèi)化素B缺陷。
52.權(quán)利要求49的疫苗，其中的減毒利斯特氏菌在in1B基因上含有突變。
53.權(quán)利要求49的疫苗，其中該減毒利斯特氏菌屬于單核細(xì)胞增生利斯特氏菌種。
54.預(yù)防或治療宿主疾病的方法，包括向宿主給予有效量的權(quán)利要求49的疫苗。
55.在宿主中誘導(dǎo)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，包括向宿主給予有效量的權(quán)利要求49的疫苗，其中減毒的利斯特氏菌含有編碼該抗原的核酸。
56.含有利斯特氏菌的分離的專門的抗原呈遞細(xì)胞，其中的利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減。
57.在宿主中誘導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，包括向宿主給予有效量的權(quán)利要求56的專門的抗原呈遞細(xì)胞，其中的減毒利斯特氏菌含有編碼該抗原的核酸。
58.預(yù)防或治療宿主疾病的方法，包括向宿主給予有效量的權(quán)利要求56的專門的抗原呈遞細(xì)胞。
59.在體外誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞上的MHC I類抗原呈遞或MHC II類抗原呈遞的方法，包括用抗原呈遞細(xì)胞接觸利斯特氏菌，其中的利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，并且含有編碼包括MHC I類表位或MHC II類表位的非利斯特氏菌抗原的核酸分子。
60.在宿主中誘導(dǎo)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，包括下述步驟(a)用來自宿主的抗原呈遞細(xì)胞和利斯特氏菌接觸，其中的利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，并且含有編碼該抗原的核酸分子；和(b)向宿主給予該抗原呈遞細(xì)胞。
61.含有利斯特氏菌的藥用組合物，其中的利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被衰減，并且含有編碼非利斯特氏菌抗原的核酸分子。
62.含有利斯特氏菌的藥用組合物，其中的利斯特氏菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞衰減。
63.權(quán)利要求62的組合物，其中的細(xì)菌細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散還被衰減。
64.試劑盒，含有(a)含有權(quán)利要求1的利斯特氏菌的組合物和(b)用于應(yīng)用該組合物預(yù)防或治療宿主疾病的說明書。
65.試劑盒，含有(a)含有權(quán)利要求22的利斯特氏菌和(b)用于應(yīng)用該組合物預(yù)防或治療宿主疾病的說明書。
66.試劑盒，含有(a)包含進(jìn)入非吞噬細(xì)胞衰減的利斯特氏菌的組合物和(b)用于應(yīng)用該組合物預(yù)防或治療宿主疾病的說明書。
全文摘要
本發(fā)明提供了進(jìn)入非吞噬細(xì)胞被減毒的利斯特氏菌屬和包括給予含有該減毒利斯特氏菌組合物誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的多種方法。其中一些減毒利斯特氏菌是在編碼侵染素如內(nèi)化素B的基因中至少含有一個(gè)突變的突變利斯特氏菌。一些減毒的利斯特氏菌的細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散被進(jìn)一步減毒。本發(fā)明還提供了在本發(fā)明的方法中有用的藥物組合物和疫苗，另外還提供了制造和改進(jìn)疫苗的方法。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1758923SQ200480006657
公開日2006年4月12日 申請(qǐng)日期2004年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月6日
發(fā)明者T·W·小杜本斯基, D·G·布羅克施泰特, D·庫克 申請(qǐng)人:塞魯斯公司