專利名稱：存活蛋白衍生肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的存活蛋白衍生肽及它們對于診斷和治療目的的用途，特別是診斷和治療癌癥的用途。特別地，這些新的肽是MHC I類限制性T細(xì)胞表位，其能夠引發(fā)癌癥患者中包括原位和先體外后體內(nèi)反應(yīng)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)。特別地，這些新肽衍生自程序性細(xì)胞死亡抑制蛋白質(zhì)存活蛋白(survivin)，其是公認(rèn)的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)。
背景技術(shù)：
及現(xiàn)有技術(shù)哺乳動物的免疫系統(tǒng)對外來或相異物質(zhì)的識別和反應(yīng)的過程是復(fù)雜的。該系統(tǒng)重要的方面是T細(xì)胞反應(yīng)。此反應(yīng)需要T細(xì)胞識別并與被稱為人白細(xì)胞抗原(HLA)的細(xì)胞表面分子與肽的復(fù)合體相作用，該白細(xì)胞抗原構(gòu)成了人主要組織相容性復(fù)合體(MHC)。這些肽衍生自較大的分子，其經(jīng)細(xì)胞加工，該細(xì)胞也提呈HLA/MHC分子。T細(xì)胞和HLA/肽復(fù)合體的相互作用是受限制的，需要對于HLA分子和肽的特定組合特異的T細(xì)胞。如果不存在特異的T細(xì)胞，即使其配偶體復(fù)合體存在也不會有T細(xì)胞反應(yīng)。類似地，如果特異復(fù)合體缺失但T細(xì)胞存在也沒有反應(yīng)。
癌癥中T細(xì)胞識別細(xì)胞異常的機(jī)制也已有涉及。例如，在WO92/20356中，公開了加工成肽的基因家族，上述肽而后表達(dá)于細(xì)胞表面上并能夠通過特異的CTLs導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的裂解。將這些基因稱之為MAGE家族，且據(jù)說編碼“腫瘤排斥抗原前體”或“TRAP”分子，并且從所述分子衍生的肽被稱為“腫瘤排斥抗原”或“TRAs”。
在WO94/05304中，公開了結(jié)合到HLA-A1分子的九肽。所述參考文獻(xiàn)公開，假如已知特定肽對于特定HLA分子的特異性，人們應(yīng)當(dāng)預(yù)期特定肽結(jié)合到一種HLA分子，而不是其它分子。這是重要的，因?yàn)椴煌膫€(gè)體具有不同的HLA表型。結(jié)果，盡管作為特定HLA分子配偶體的特定肽的鑒定具有診斷和治療結(jié)果(ramification)，這些結(jié)果僅僅與具有那種特定HLA表型的個(gè)體有關(guān)。
幾種由MHC分子提呈的肽已表征，并且發(fā)現(xiàn)這些肽中的一些可攜帶可能對HLA-肽復(fù)合體功能性有影響的翻譯后修飾。因此，許多研究已將磷酸化模式的改變與惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)聯(lián)。而且，已有表明，磷酸化對于肽與I類MHC的結(jié)合可能具有中性、負(fù)效應(yīng)或甚至正效應(yīng)，并且可能產(chǎn)生區(qū)別肽的磷酸化和非磷酸化形式的磷酸肽特異的CTL，表明此CTL很可能是I類MHC-限制性CTL所有組成成分的部分。最近，已有表明，在體內(nèi)磷酸化肽實(shí)際上經(jīng)天然加工并由MHC I類分子提呈。另外，在從幾種不同的EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞分離的I類分子提取物中磷酸化肽的存在已得以證實(shí)。
因此，在MHC分子存在下衍生自腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)的肽表位能夠由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)識別為抗原已非常確定(1)。然而，盡管通常公認(rèn)大多數(shù)(如果不是全部)腫瘤是抗原性的，但是在腫瘤發(fā)展容易由免疫系統(tǒng)控制的意義上，僅僅少數(shù)腫瘤確實(shí)是免疫原性的。
為克服此局限，已開始了幾種免疫療法試驗(yàn)，例如用TAA-衍生肽接種。對于黑素瘤，已經(jīng)為此腫瘤表征了最多的CTL-限制的TAAs，通過接種已經(jīng)誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的針對抗原的CTL反應(yīng)，并且一些患者經(jīng)歷了其疾病的完全緩解(2，3)。然而，用于這些接種試驗(yàn)的大多數(shù)肽表位是黑色素細(xì)胞特異的，且這些肽不能應(yīng)用于非黑色素細(xì)胞來源的腫瘤。此外，這些TAAs的表達(dá)在來自于不同患者的腫瘤間是異質(zhì)的，甚至在來自于同一名患者的轉(zhuǎn)移瘤之間也不同。然而，在過去幾年中，在許多不同癌癥中表達(dá)的許多腫瘤特異性肽抗原已得以鑒定，即，HER-2(4)、Muc-1(5)和端粒酶(6)。
也已有顯示，通過適當(dāng)?shù)奶幚砟[瘤中存在的腫瘤抗原能夠暴露于免疫系統(tǒng)。研究表明，免疫反應(yīng)的CD8+CTL臂單獨(dú)或與CD4+Th細(xì)胞相結(jié)合構(gòu)成了適應(yīng)性免疫反應(yīng)的原初抗腫瘤效應(yīng)臂(primary anti-tumor effectorarm)。到目前為止焦點(diǎn)主要集中在免疫反應(yīng)的CTL臂上。然而，CD4T細(xì)胞反應(yīng)在腫瘤排斥中起根本的作用，尤其是在誘導(dǎo)期或在體內(nèi)CTL反應(yīng)的擴(kuò)大中，這一點(diǎn)正變得越來越清楚。因此，有效的腫瘤接種方案中II類限制性腫瘤抗原的并入也許會增加疫苗的有效性。
程序性細(xì)胞死亡是細(xì)胞自殺的遺傳程序，已提出程序性細(xì)胞死亡的抑制為參與癌癥形成的重要機(jī)制，程序性細(xì)胞死亡抑制通過延長有利于轉(zhuǎn)化突變積累的細(xì)胞的壽命導(dǎo)致癌形成(7)。存活蛋白是新近鑒定的程序性細(xì)胞死亡蛋白抑制因子(IAPs)家族成員。在大約4百萬轉(zhuǎn)錄物的全球基因表達(dá)分析中，將存活蛋白鑒定為在多種癌癥中總是上調(diào)而在正常組織中不上調(diào)的首要基因之一(8)。過表達(dá)存活蛋白的實(shí)體惡性腫瘤包括肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌以及造血惡性腫瘤(9)。另外，已報(bào)導(dǎo)黑素瘤和非黑素瘤皮膚癌系列總是存活蛋白陽性(10，11)。多數(shù)人類癌癥中存活蛋白的過表達(dá)暗示了程序性細(xì)胞死亡抑制在腫瘤發(fā)展中的普遍作用，通過對結(jié)腸和膀胱癌以及成神經(jīng)細(xì)胞瘤病例中存活蛋白的表達(dá)與不利的預(yù)后相關(guān)聯(lián)這一觀察，所述概念得以證實(shí)。相反，存活蛋白在正常的成人組織中檢測不到。這些特征使存活蛋白成為用于診斷和治療目的的合適的TAA。
因此，在過去的十年中，許多由CTLs識別的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)限制性形式的TAAs得到鑒定。由于存活蛋白在大多數(shù)人類癌癥中過表達(dá)且其功能的抑制導(dǎo)致增強(qiáng)的程序性細(xì)胞死亡，因此此蛋白可作為治療性CTL反應(yīng)的靶標(biāo)。存活蛋白蛋白質(zhì)及其潛在的診斷和治療用途公開于此處引用作為參考的(8)和US6.245.523中。存活蛋白是包含單個(gè)BIR和高電荷羧基末端卷曲區(qū)域而不是環(huán)指(RING finger)結(jié)構(gòu)的16.5kDa胞漿蛋白質(zhì)，當(dāng)該蛋白轉(zhuǎn)入B細(xì)胞前體時(shí)可抑制由生長因子(IL-3)撤消誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡。編碼存活蛋白的基因幾乎與效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體-1(EPR-1)的序列相同，但是定向于相反的方向，從而暗示存在以頭對頭構(gòu)型復(fù)制的兩種獨(dú)立基因。因此，可將存活蛋白描述為反義EPR-1產(chǎn)物。功能上，通過上調(diào)其天然的反義EPR-1產(chǎn)物而引起的對存活蛋白表達(dá)的抑制導(dǎo)致了大量程序性細(xì)胞死亡和降低的細(xì)胞生長。
US6.245.523公開了純化的存活蛋白的分離并提供編碼存活蛋白蛋白質(zhì)的核酸分子，及結(jié)合存活蛋白的抗體和其它分子。US6.245.523還公開了存活蛋白蛋白質(zhì)和其變體的抗程序性細(xì)胞死亡的活性片段，所述變體中一個(gè)氨基酸殘基插入到所公開的存活蛋白序列的N-或C-末端或中間。特別公開，此類肽應(yīng)當(dāng)包含程序性細(xì)胞死亡所需的關(guān)鍵功能殘基，例如，67位的Trp、73位的Pro和84位的Cys。
本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)了MHC I類限制性肽可衍生自存活蛋白蛋白質(zhì)，所述肽能夠結(jié)合到MHC I類HLA分子上，從而在患有多種癌癥疾病的患者中引起先體外后體內(nèi)或原位的CTL免疫反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈暗示存活蛋白作為TRAP分子，所述存活蛋白經(jīng)細(xì)胞加工成具有TRP功能性的肽。顯然，這些發(fā)現(xiàn)開辟了新的治療和診斷方法的途徑，由于腫瘤細(xì)胞廣泛表達(dá)存活蛋白的事實(shí)，所述新方法通?？蓱?yīng)用于癌癥疾病的控制中。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明第一方面涉及衍生自存活蛋白的MHC I類限制性表位，所述表位具有至少一種下列特征(i)能夠以一定親和力結(jié)合限制該表位的I類HLA分子，其中所述親和力使用如文中描述的裝配結(jié)合測定法測定以能夠半數(shù)最大回收I類HLA分子的肽量(C50值)表示最多為50μM，(ii)能夠以每104個(gè)PBLs至少1個(gè)的頻率在癌癥患者的PBL群體中引發(fā)產(chǎn)生INF-γ的細(xì)胞，所述頻率可以通過ELISPOT試驗(yàn)確定，和/或(iii)能夠原位檢測腫瘤組織中與所述表位肽起反應(yīng)的CTLs。
優(yōu)選地，本發(fā)明的肽具有這三個(gè)特征中的至少兩種，最優(yōu)選地具有所有這三種特征。
在更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了藥物組合物和用于癌癥患者的PBLs或腫瘤組織中存活蛋白反應(yīng)性T細(xì)胞的存在的先體外后體內(nèi)或原位診斷的組合物，該組合物包含如上定義的肽。
在更進(jìn)一步的方面本發(fā)明涉及用于癌癥患者的PBLs或腫瘤組織中存活蛋白反應(yīng)性T細(xì)胞存在的先體外后體內(nèi)或原位診斷的診斷試劑盒，該試劑盒包含根據(jù)本發(fā)明的肽，和此肽與I類HLA分子或此分子片段的復(fù)合體。
在另一方面還提供了檢測癌癥患者中存活蛋白反應(yīng)性T細(xì)胞存在的方法，該方法包括將腫瘤組織或血液樣品與如上所定義的復(fù)合體相接觸，并檢測該復(fù)合體與組織或血細(xì)胞的結(jié)合。
在更進(jìn)一步的方面本發(fā)明涉及能夠特異地結(jié)合本發(fā)明的肽的分子例如抗體或其片段，并涉及能夠阻斷此類分子結(jié)合的分子。
本發(fā)明重要的方面涉及本發(fā)明的肽用于癌癥治療的藥物制備方面的用途。更進(jìn)一步的方面涉及如上所述的組合物或分子用于癌癥治療的藥物制備方面的用途。
更進(jìn)一步的方面獨(dú)立地涉及治療哺乳動物例如人類中癌癥的方法，其包括以有效量的本發(fā)明的肽、組合物或分子施用于患該病的患者。
發(fā)明詳述本發(fā)明新的MHC I類限制性肽的特征在于具有幾個(gè)特征中的至少一個(gè)，所述特征之一是能夠結(jié)合限制所述肽的I類HLA分子，當(dāng)所述結(jié)合的親和力以如此處所述的裝配試驗(yàn)中I類HLA分子的半數(shù)最大回收的肽量(C50值)測量時(shí)，最多為50μM。該裝配試驗(yàn)如前所述來完成(12，13)，且該試驗(yàn)以將肽加入到肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷的細(xì)胞系T2后HLA分子的穩(wěn)定化為基礎(chǔ)。隨后，利用構(gòu)象依賴性抗體將正確折疊的穩(wěn)定HLA重鏈進(jìn)行免疫沉淀并定量肽結(jié)合。
此試驗(yàn)提供了根據(jù)它們以上述親和力結(jié)合到給定HLA等位基因分子的能力篩選候選肽的簡單方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽在一個(gè)實(shí)施方案中具有最多為30μM的C50值，例如最多為20μM的C50值，包括最多為10μM、最多為5μM和最多為2μM的C50值。
如上所述，HLA系統(tǒng)代表人類主要組織相容性(MHC)系統(tǒng)。通常，MHC系統(tǒng)控制著一系列特征移植抗原、胸腺依賴性免疫反應(yīng)、某些補(bǔ)體因子和某些疾病的誘因。更特別地，MHC編碼三種不同類型的分子，即，I類、II類和III類分子，它們決定了MHC的更加一般的特征。在這些分子中，I類分子是提呈于大多數(shù)有核細(xì)胞和血小板表面的所稱作的HLA-A、HLA-B和HLA-C分子。
本發(fā)明肽的特征在于它們結(jié)合到(受限于)特定MHC I類HLA分子的能力。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽是受限于MHC I類HLA-A分子的一種肽，所述MHC I類HLA-A分子包括HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A9、HLA-A10、HLA-A11、HLA-Aw19、HLA-A23(9)、HLA-A24(9)、HLA-A25(10)、HLA-A26(10)、HLA-A28、HLA-A29(w19)、HLA-A30(w19)、HLA-A31(w19)、HLA-A32(w19)、HLA-Aw33(w19)、HLA-Aw34(10)、HLA-Aw36、HLA-Aw43、HLA-Aw66(10)、HLA-Aw68(28)、HLA-A69(28)。更多簡單名稱也貫穿應(yīng)用于本文中，其中只用了主要的數(shù)字名稱，例如HLA-A19或HLA-A24分別代替了HLA-Aw19和HLA-A24(9)。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽受限于選自HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11和HLA-A24的MHC I類HLA種類。本發(fā)明的肽衍生自存活蛋白的已知序列，例如，公開于US6.245.523的序列。潛在具有結(jié)合特定HLA分子能力的肽的選擇可通過結(jié)合到給定的具體HLA分子的已知序列的比對來完成，從而揭示肽的特定位置上少數(shù)相關(guān)氨基酸的超優(yōu)勢度。此類優(yōu)勢氨基酸殘基此處也稱為“錨定殘基”或“錨定殘基基序”。通過依照此種基于已知序列數(shù)據(jù)的相對簡單的方法，肽可衍生自可能結(jié)合到特定HLA分子的存活蛋白蛋白質(zhì)分子，所述已知序列數(shù)據(jù)可在可進(jìn)入的數(shù)據(jù)庫中找到。此類對于一系列HLA分子分析的有代表性的實(shí)例在下表中給出
因此，作為例子，潛在具有結(jié)合到HLA-A1能力的九肽將具有下述序列之一Xaa-T-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y、Xaa-T-E-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y；Xaa-S-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y或Xaa-S-E-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y(Xaa指任意氨基酸殘基)。以類似的方式，可設(shè)計(jì)潛在具有結(jié)合到任何其它HLA分子的能力的序列。
將理解本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員將能夠鑒定給定HLA分子的其它的“錨定殘基基序”。
因此，在有用的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽包括這樣的肽，對于表中所列的每個(gè)特定HLA等位基因，所述肽的序列包含任何一個(gè)如表中所指出的氨基酸殘基。
因此，鑒定本發(fā)明肽的簡單方法包括下列步驟選擇特定的HLA分子，例如在給定的群體中以高比率出現(xiàn)的HLA分子，如上所述實(shí)施比對分析來鑒定存活蛋白蛋白質(zhì)中的“錨定殘基基序”，分離或構(gòu)建包含一個(gè)或更多已鑒定的錨定殘基的合適大小的肽，并測試所得肽(i)利用如此處所述的裝配試驗(yàn)測定的結(jié)合到特定HLA分子的能力，(ii)在如此處所述的ELISPOT試驗(yàn)所確定的肽以每104個(gè)PBLs至少1個(gè)的頻率引發(fā)癌癥患者的PBL群體中產(chǎn)生INF-γ的細(xì)胞的能力，和/或(iii)肽原位檢測腫瘤組織中與所測表位肽反應(yīng)的CTLs的能力。
在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽是具有選自下列序列的HLA-A2限制性的存活蛋白衍生肽FLKLDRERA(存活蛋白101-109)(SEQ ID NO1)、TLPPAWQPFL(存活蛋白5-14)(SEQ ID NO2)、ELTLGEFLKL(存活蛋白95-104)(SEQ ID NO3)、LLLGEFLKL(SEQ ID NO4)和LMLGEFLKL(SEQID NO5)。(括號中的名稱指如US6.245.523所公開的存活蛋白蛋白中的殘基位置)。LLLGEFLKL(SEQ ID NO4)是通過用“L”替代肽2位上“T”的衍生自存活蛋白96-104的序列，且LMLGEFLKL(SEQ ID NO5)是通過用“M”替代2位上“T”而衍生自存活蛋白96-104的序列。
在更有用的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽是受MHC I類HLA-B分子限制的肽，所述MHC I類HLA-B分子包括下列任何一個(gè)HLA-B5、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B12、HLA-B13、HLA-B14、HLA-B15、HLA-B16、HLA-B17、HLA-B18、HLA-B21、HLA-Bw22、HLA-B27、HLA-B35、HLA-B37、HLA-B38、HLA-B39、HLA-B40、HLA-Bw41、HLA-Bw42、HLA-B44、HLA-B45、HLA-Bw46和HLA-Bw47。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽能夠結(jié)合的MHC I類HLA-B種類選自HLA-B7、HLA-B35、HLA-B44、HLA-B8、HLA-B15、HLA-B27和HLA-B51。
在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽是具有選自下列序列的HLA-B35限制性的存活蛋白衍生肽CPTENEPDL(存活蛋白46-54)(SEQ ID NO6)、EPDLAQCFF(存活蛋白51-59)(SEQ ID NO7)、CPTENEPDY(SEQ ID NO8)和EPDLAQCFY(SEQ ID NO9)。(括號中的名稱指如US6.245.523所公開的存活蛋白蛋白質(zhì)中的殘基位置)。CPTENEPDY(SEQ ID NO8)是通過用“Y”替代肽C-末端“L”的衍生自存活蛋白46-54的序列，EPDLAQCFY(SEQID NO9)是通過用“Y”替代C-末端2位上的“F”殘基而衍生自存活蛋白51-59。
在更特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽是具有選自下列序列的HLA-A1限制性肽存活蛋白38-46(Sur38Y9)(在P9處C變?yōu)閅，MAEAGFIHY(SEQID NO38)、存活蛋白47-56(Sur47Y10)(在P10處Q變?yōu)閅，PTENEPDLAY(SEQ ID NO39))、存活蛋白92-101(Sur92-101)(QFEELTLGEF)(SEQ ID NO27)、和存活蛋白93-101(Sur93T2(在P2處E變?yōu)門，F(xiàn)TELTLGEF(SEQ ID NO36))。本發(fā)明的肽也可為HLA-A3限制性肽，例如存活蛋白18-24(Sur18K10)(在P10處F變?yōu)镵，RISTFKNWPK)(SEQ ID NO57)和/或HLA-A11限制性肽，例如存活蛋白53-62(Sur53-62)(DLAQCFFCFK)(SEQ ID NO45)和/或HLA-A2限制性肽，例如存活蛋白18-28(Sur18-28)(RISTFKNWPFL)(SEQ IDNO66)。
在更加有用的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽是受MHC I類HLA-C分子限制的肽，所述MHC I類HLA-C分子包括下列任何一種HLA-Cw1、HLA-Cw2、HLA-Cw3、HLA-Cw4、HLA-Cw5、HLA-Cw6、HLA-Cw7和HLA-Cw16。
優(yōu)選地，本發(fā)明的肽包含少于50個(gè)氨基酸殘基，并且更優(yōu)選地它包含最多20個(gè)氨基酸殘基，例如最多10個(gè)氨基酸殘基。在特定實(shí)施方案中，該肽為七肽、八肽、九肽、十肽或十一肽。
如上所述，本發(fā)明的肽衍生自存活蛋白蛋白質(zhì)或其片段。能夠從中衍生肽的存活蛋白蛋白質(zhì)來自于任何表達(dá)該蛋白質(zhì)的動物種類。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，存活蛋白起始蛋白質(zhì)來自于哺乳動物類包括嚙齒類、兔和靈長類例如人?；谒x擇的存活蛋白蛋白質(zhì)的序列，本發(fā)明的肽衍生自對存活蛋白起始材料的任何適宜的化學(xué)或酶的處理，所述處理導(dǎo)致如上所述獲得的合適大小的肽，或者本發(fā)明的肽可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟悉的任何常規(guī)肽合成方法來合成。
本發(fā)明的肽可具有衍生自存活蛋白蛋白質(zhì)的天然序列的序列。然而，對任何給定的HLA分子具有更高親和力的肽可通過替換、缺失或添加至少一個(gè)氨基酸殘基來修飾該天然序列從而衍生自此天然序列，例如，所述修飾以上述方法為基礎(chǔ)由此鑒定關(guān)于給定HLA分子的錨定殘基基序。
因此，為增加存活蛋白衍生肽的免疫原性，可在錨定位置但不是TCR接觸殘基處引入氨基酸替換，以增加肽與HLA I類分子的結(jié)合。這樣已獲得更具免疫原性的表位，例如這已提高了誘導(dǎo)癌癥反應(yīng)性CTL的能力并已證明其更適于誘導(dǎo)臨床上有意義的CTL反應(yīng)。然而，重要地，目標(biāo)癌細(xì)胞只表達(dá)和提呈天然存活蛋白衍生肽于細(xì)胞表面上。在這方面，對修飾的存活蛋白衍生肽特異的治療誘導(dǎo)的CTL與天然類似物交叉反應(yīng)，這一點(diǎn)尤其重要。
本發(fā)明也包括如此處所公開的存活蛋白衍生肽的變體和功能等同物。本上下文所用的“功能等同物”通過參考所討論序列的預(yù)定片段的相應(yīng)功能性來確定。功能等同物可通過例如由ELISPOT試驗(yàn)所闡明的對HLA I類分子相似的結(jié)合親和力或相似潛能來確定。
將理解由于插入、缺失和替換包括保守替換的數(shù)目和范圍增加，如此處所述的存活蛋白衍生肽的功能等同物或變體顯示出逐漸區(qū)別于優(yōu)選的預(yù)定序列的氨基酸序列。此區(qū)別被測量為優(yōu)選的預(yù)定序列與衍生自存活蛋白的變體或衍生自存活蛋白的功能等同物之間同源性的降低。
氨基酸序列間的同源性可利用本領(lǐng)域公知的算法來計(jì)算。當(dāng)與包含或由連續(xù)的存活蛋白衍生氨基酸殘基組成的片段具有同源性的片段優(yōu)選地與預(yù)定的存活蛋白衍生肽至少具有約90％同源性，例如至少94％同源性，包括95％、96％、97％、98％或99％同源性時(shí)，認(rèn)為所述片段在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
而且，實(shí)施本發(fā)明肽的翻譯后修飾是有利的。已有顯示，將乳腺癌MCF-7細(xì)胞或?qū)m頸癌HeLa細(xì)胞暴露于抗癌試劑(包括阿霉素、紫杉酚或UVB)導(dǎo)致了存活蛋白蛋白質(zhì)表達(dá)增加4-5倍?？拱┲委熀蟠婊畹鞍姿降淖兓话ù婊畹鞍譵RNA表達(dá)的調(diào)整并且獨(dú)立于從頭基因轉(zhuǎn)錄。相反地，通過細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑flavopiridol抑制存活蛋白Thr34上磷酸化導(dǎo)致了存活蛋白表達(dá)的喪失，并且不可磷酸化的存活蛋白Thr34→Ala與野生型存活蛋白相比顯示出加速的清除。在存活蛋白Thr34處磷酸化的順序消除增加了乳腺癌體內(nèi)異種移植模型中不依賴p53的由抗癌試劑誘導(dǎo)的腫瘤程序性細(xì)胞死亡并無毒性地抑制了腫瘤生長。這些數(shù)據(jù)表明Thr34磷酸化關(guān)鍵性地調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中的存活蛋白水平，并且p34cdc2激酶活性的隨后除去可除去腫瘤細(xì)胞中存活蛋白生存力(viability)限制點(diǎn)及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞中程序性細(xì)胞死亡。
因此，預(yù)期本發(fā)明存活蛋白衍生肽包括磷酸化的肽。天然存活蛋白磷酸肽抗原可通過掃描磷酸化位點(diǎn)Thr34周圍MHC肽結(jié)合基序的存在來鑒定。因此，可能的衍生自存活蛋白的磷酸肽序列包括TPERMAEAGF假定的HLA-B35-和/或HLA-B7-和/或HLA-B51-限制性肽抗原。此處所包括的另外的天然磷酸肽包括HLA-A2CACTPERMA和CTPERMAEA；HLA-A3FLEGCACTP；HLA-B7/HLA-B35/HLA-B51WPFLEGCACT(磷酸化Thr殘基用斜體標(biāo)記)。
本發(fā)明肽的重要特征是識別或引發(fā)產(chǎn)生INF-γ-的效應(yīng)T細(xì)胞的能力，所述細(xì)胞即特異識別癌癥患者的PBL群體或腫瘤細(xì)胞(靶細(xì)胞)中的特定肽的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTLs)。此活性可通過將來自患者的PBLs或腫瘤細(xì)胞進(jìn)行如參考文獻(xiàn)(16)和下文實(shí)施例中所述的ELISPOT試驗(yàn)而容易地確定。測定前，刺激要測定的PBL群體或腫瘤細(xì)胞是有利的，可通過使細(xì)胞與待測肽相接觸實(shí)現(xiàn)刺激。優(yōu)選地，在如此處所用的ELISPOT試驗(yàn)所確定的，所述肽能夠以每104個(gè)PBLs至少1個(gè)的頻率引發(fā)或識別產(chǎn)生INF-γ的T細(xì)胞。更優(yōu)選地此頻率為每104個(gè)PBLs至少5個(gè)，最優(yōu)選地每104個(gè)PBLs至少10個(gè)，例如每104個(gè)PBLs至少50或100個(gè)。
ELISPOT試驗(yàn)代表監(jiān)測存活蛋白肽特異的T細(xì)胞反應(yīng)的強(qiáng)大工具。然而，盡管已有顯示ELISPOT反應(yīng)性在大多數(shù)情況下與CLLs裂解靶細(xì)胞的能力相關(guān)，對此觀念的決定性證據(jù)只能直接給出。此處提供了這種直接證據(jù)，因?yàn)橐炎C實(shí)(見實(shí)施例2)通過HLA/肽復(fù)合體分離的存活蛋白反應(yīng)細(xì)胞具備裂解靶細(xì)胞的功能。另外，已證實(shí)特異識別本發(fā)明肽的分離的CTLs能夠裂解不同來源，例如黑素瘤和乳腺癌來源的HLA匹配的腫瘤細(xì)胞。此發(fā)現(xiàn)有力地證明了癌癥細(xì)胞通常加工和提呈相同的內(nèi)源性存活蛋白肽。因此，此處該發(fā)現(xiàn)的主要含義是本發(fā)明的肽經(jīng)表達(dá)并與多種不同組織學(xué)來源的腫瘤細(xì)胞上HLA分子形成復(fù)合體。這使得這些癌細(xì)胞對CTLs的破壞敏感并強(qiáng)調(diào)了存活蛋白免疫對控制不同腫瘤生長的潛在有用性。PBLs和腫瘤細(xì)胞中存在針對幾種HLA限制性存活蛋白衍生肽表位的自發(fā)性CTL-反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了此腫瘤抗原普遍的免疫治療潛力，所述肽表位來自患有三種不相關(guān)的癌癥類型，即乳腺癌、黑素瘤和CLL的患者。
因此，在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽能夠引發(fā)患有其中表達(dá)存活蛋白的癌癥疾病的患者PBL群體中產(chǎn)生INF-γ的細(xì)胞，所述癌癥疾病包括包括慢性淋巴細(xì)胞性白血病和慢性髓細(xì)胞白血病的造血惡性腫瘤、黑素瘤、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和前列腺癌。特別地，本發(fā)明的肽能夠以具有針對癌細(xì)胞系的存活蛋白表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)的T細(xì)胞形式引起免疫反應(yīng)，所述癌細(xì)胞系包括選自乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和黑素瘤細(xì)胞系FM3的細(xì)胞系。
除它們引發(fā)PBL群體和癌細(xì)胞系中免疫反應(yīng)的能力之外，已證實(shí)本發(fā)明的肽還能夠在原位，即在實(shí)體瘤組織中引發(fā)細(xì)胞溶解性免疫反應(yīng)。這已通過提供HLA-肽復(fù)合體(例如進(jìn)行多聚化和提供可檢測的標(biāo)記)及利用這類復(fù)合體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色來檢測腫瘤組織中與本發(fā)明的表位肽反應(yīng)的CTLs得以證實(shí)。因此，本發(fā)明的肽更重要的特征是它能夠原位檢測腫瘤組織中與表位肽反應(yīng)的CTLs。
預(yù)期本發(fā)明的肽除了它們結(jié)合HLA分子導(dǎo)致HLA和肽的復(fù)合體提呈于細(xì)胞表面之外，該復(fù)合體進(jìn)而作為細(xì)胞溶解性T細(xì)胞的表位或靶標(biāo)，還可引起其它類型的免疫反應(yīng)，例如導(dǎo)致產(chǎn)生針對該復(fù)合體的抗體的B-細(xì)胞反應(yīng)和/或遲發(fā)型超敏(DTH)反應(yīng)。后一類型的免疫反應(yīng)被定義為在本發(fā)明肽的注射部位充血并且可觸知的硬結(jié)。
眾所周知，不同的HLA分子在主要人類群體中具有不同的優(yōu)勢。因此，需要鑒定受限于幾種HLA I類分子的肽表位來擴(kuò)大根據(jù)本發(fā)明的方法可獲得治療的患者群體。用不同的HLA限制元件對多個(gè)存活蛋白表位的表征以兩種重要方式拓寬了此靶抗原的臨床潛力(i)其增加了適合基于存活蛋白衍生肽的免疫療法的患者數(shù)目。大約有50％的白種人和亞洲群體體表達(dá)HLA-A2抗原，大約有25％的白種人和5％的亞洲人表達(dá)HLA-A1和HLA-A3抗原，而大約有15％的白種人和30％的亞洲人表達(dá)HLA-A11抗原。盡管這些數(shù)字由于共表達(dá)而無法相加，受這些多樣性限制的肽的組合肯定能包含大多數(shù)癌癥患者，(ii)每名患者中幾種限制性元件的集體靶定可能降低由HLA-等位基因缺失而引起的免疫逃逸的危險(xiǎn)。單個(gè)HLA等位基因的缺失是關(guān)于癌細(xì)胞描述的MHC改變的重要部分，而I類表達(dá)的完全缺失是相當(dāng)罕見的事件。因此，隨著受限于不同HLA等位基因的存活蛋白表位的鑒定，目前利用等位重疊在患者中同時(shí)靶定一種以上的HLA分子是可能的。
因此，基于本發(fā)明的公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠開發(fā)高免疫原性的多表位疫苗。優(yōu)選地，應(yīng)當(dāng)設(shè)計(jì)此類疫苗，以促進(jìn)最適存活蛋白衍生肽與如下文所述的其它合適肽和/或佐劑任選組合的同時(shí)遞送。
而且，如前所述，對引發(fā)腫瘤特異性T輔助細(xì)胞免疫已有更高的關(guān)注，所述免疫即用II類MHC限制表位接種，盡管事實(shí)上腫瘤一般不表達(dá)II類MHC。這是基于最近的發(fā)現(xiàn)許多病例中疫苗誘導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)的誘導(dǎo)和功效需要腫瘤特異的CD4陽性Th細(xì)胞的共同作用。因此，推動具有更多復(fù)雜成分的疫苗開發(fā)的重要因素是對靶向多種腫瘤抗原的期望，例如通過設(shè)計(jì)包含或編碼一組仔細(xì)挑選的CTL和Th細(xì)胞表位的疫苗實(shí)現(xiàn)所述靶向。
顯然，無需引入(基因編碼)有潛在危險(xiǎn)的蛋白質(zhì)例如癌蛋白質(zhì)，多表位疫苗組成了產(chǎn)生針對衍生自幾種不同抗原的表位的免疫性的有效途徑。這類疫苗也允許針對亞優(yōu)勢和隱蔽T細(xì)胞表位的免疫力的選擇性誘導(dǎo)，這在腫瘤相關(guān)自身抗原情況下可能尤其重要，因?yàn)獒槍φ＝M織中顯著提呈的表位可能存在耐受性。而且，由于抗原提呈細(xì)胞的免疫蛋白酶體(immunoproteasome)與大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中的‘組成性’蛋白酶體間的功能差別，抗原提呈細(xì)胞可能無法提呈某些表達(dá)于腫瘤細(xì)胞上的表位。在以肽為基礎(chǔ)的疫苗的情況下，這類表位能夠以“MHC-現(xiàn)成”的形式施用，這使得能夠通過獨(dú)立于抗原攝入的外源裝載來提呈和由宿主抗原提呈細(xì)胞加工。
顯然本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)為存活蛋白衍生肽的治療及診斷應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。
因此，本發(fā)明的一個(gè)重要的方面涉及組合物，其包含因此，在更進(jìn)一步的方面本發(fā)明提供了藥物組合物，其單獨(dú)包含一種或多種本發(fā)明的肽或與其它蛋白質(zhì)或肽片段的合適的組合。在特定的實(shí)施方案中，這類其它蛋白質(zhì)或肽片段包括但不限于參與程序性細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)或其肽片段。這類蛋白質(zhì)的合適的實(shí)例可選自Bcl-2蛋白質(zhì)家族，例如，Bcl-2蛋白質(zhì)、Bcl-w蛋白質(zhì)、Mcl-1蛋白質(zhì)、Bcl-XL蛋白質(zhì)和衍生自任何這些蛋白質(zhì)的肽片段。其它已知的程序性細(xì)胞死亡抑制因子包括程序性細(xì)胞死亡蛋白質(zhì)抑制因子(IAP)家族的成員例如X-IAP、C-IAP1和C-IAP2，這些蛋白質(zhì)都相對普遍地表達(dá)而程序性細(xì)胞死亡多肽ML-IAP的抑制因子則具有相當(dāng)選擇性表達(dá)，且主要在黑素瘤中檢測到。因此，能夠引發(fā)特異性T細(xì)胞反應(yīng)，即細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)或輔助性T細(xì)胞反應(yīng)的ML-IAP片段可任選地包括于本發(fā)明的組合物中。ML-IAP的有用的肽片段包括ML-IAP245(RLQEERTCKV)(SEQ ID NO75)、ML-IAP280(QLCPICRAPV)(SEQ ID NO76)、ML-IAP90(RLASFYDWPL)(SEQ ID NO77)、ML-IAP154(LLRSKGRDFV)(SEQ ID NO78)、ML-IAP230(VLEPPGARDV)(SEQ ID NO79)、ML-IAP98(PLTAEVPPEL)(SEQ IDNO80)、ML-IAP34(SLGSPVLGL)(SEQ ID NO81)、ML-IAP54(QILGQLRPL)(SEQ ID NO82)、ML-IAP99(LTAEVPPEL)(SEQ ID NO83)、ML-IAP83(GMGSEELRL)(SEQ IDNO84)和ML-IAP200(ELPTPRREV)(SEQ ID NO85)。
另外，根據(jù)本發(fā)明的組合物可用作包含如上文定義的I類限制性表位和/或II類限制性表位的多表位疫苗。
目前優(yōu)選的多表位疫苗的實(shí)例包括“定制的”依賴于特定患者組織類型的存活蛋白衍生肽表位的組合，例如，具有HLA-A2、HLA-A3和HLA-B35表型的受試者可用包含sur1M2、sur9、sur18K10、sur46Y9、sur51Y9的疫苗接種。另外，本發(fā)明的藥物組合物可有利地包含至少一種另外的免疫原性蛋白質(zhì)或其肽片段，該蛋白質(zhì)或肽片段選自不屬于或衍生自存活蛋白蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)或肽片段。在特定的實(shí)施方案中，所述免疫原性蛋白質(zhì)或其片段衍生自如上文所述的Bcl-2蛋白質(zhì)家族。另外的免疫原性的衍生自Bcl-2的肽是HLA-A2限制性肽，其具有選自下列的序列Bcl172、Bcl180、Bcl208和Bcl214。
由于本發(fā)明的肽是相對小的分子，需要在這類組合物中組合所述肽與多種物質(zhì)，例如佐劑，以產(chǎn)生疫苗、免疫原性組合物等等。廣義定義的佐劑是促進(jìn)免疫反應(yīng)的物質(zhì)。通常，佐劑的選擇是弗氏完全或不完全佐劑、或滅活的百日咳桿菌(B.pertussis)生物，用于例如與明礬沉淀的抗原組合。Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples & Practice(第二版，1986)的61-63頁提供了有關(guān)佐劑的全面討論。然而，Goding指出，當(dāng)目標(biāo)抗原為小分子量或是弱免疫原性抗原時(shí)，建議連接免疫原性載體。這類載體分子的實(shí)例包括匙孔血藍(lán)蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白和家禽免疫球蛋白。已認(rèn)為多種皂苷提取物可用作免疫原性組合物中的佐劑。近來，已有建議用粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)(一種熟知的細(xì)胞因子)作為佐劑(WO97/28816)。
因此，本發(fā)明包括進(jìn)一步包含任何佐劑物質(zhì)的治療組合物，所述佐劑包括任何上述佐劑或其組合。也可預(yù)期，抗原，即本發(fā)明的肽與佐劑可以以任何適當(dāng)?shù)男蛄蟹謩e施用。
本發(fā)明的藥物組合物中抗原的選擇依賴于本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定的參數(shù)。如已提到的，本發(fā)明的每種不同肽由特定的HLA分子提呈到細(xì)胞表面上。同樣，如果將接受治療的患者關(guān)于HLA表型進(jìn)行分類，則選擇已知結(jié)合到該特定HLA分子的一種或多種肽。
備選地，目標(biāo)抗原基于多種HLA表型在給定群體中的優(yōu)勢來選擇。例如，HLA-A2是白種群體體中最優(yōu)勢的表型，因此包含結(jié)合到HLA-A2的存活蛋白衍生肽的組合物將在大部分該群體中有活性。然而，本發(fā)明的組合物也可包含兩種或更多存活蛋白衍生肽的組合，每種肽特異地與不同的HLA分子相互作用以便覆蓋目標(biāo)群體的更大比例。因此，作為實(shí)例，藥物組合物可包含受限于HLA-A分子的肽與受限于HLA-B分子的肽的組合，例如，包括那些對應(yīng)于目標(biāo)群體中HLA表型優(yōu)勢的HLA-A和HLA-B分子，例如HLA-A2和HLA-B35。另外，組合物可包含受限于HLA-C分子的肽。
可以預(yù)期，本發(fā)明有用的免疫原性組合物除此處所定義的存活蛋白衍生肽之外，還可包含免疫學(xué)上有效量的如此處所定義的存活蛋白蛋白質(zhì)或其免疫原性片段。
藥物組合物中本發(fā)明的免疫原性肽的量可依賴于特定應(yīng)用而不同。然而，免疫原的單次劑量優(yōu)選為大約10μg至大約5000μg，更優(yōu)選地大約50μg至大約2500μg例如約100μg至約1000μg。施用的方式包括皮內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi)施用，延時(shí)釋放制劑形式的植入物，等等。此處包含本領(lǐng)域公知的任何和所有施用形式。而且包含本領(lǐng)域公知的適于配制可注射的免疫原性肽組合物的任何和所有常規(guī)劑型，例如凍干形式和溶液劑、懸浮劑或乳劑形式，如需要的話，上述形式中包含常規(guī)藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、防腐劑、佐劑、緩沖劑組分，等等。
本發(fā)明組合物的免疫保護(hù)效果可利用幾種方法測定。在下文的實(shí)施例中提供了其實(shí)例。WO97/28816(如前)中有關(guān)于如何測定由免疫原性組合物引起的CTL反應(yīng)的進(jìn)一步的實(shí)例。成功的免疫反應(yīng)也可通過免疫后DTH反應(yīng)的出現(xiàn)和/或特異識別疫苗組合物的肽的抗體的檢測來測定。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物是能夠引發(fā)針對癌癥疾病的免疫反應(yīng)的免疫原性組合物或疫苗。如此處所用，表達(dá)“免疫原性組合物或疫苗”指引發(fā)針對癌細(xì)胞的至少一種類型免疫反應(yīng)的組合物。因此，這種免疫反應(yīng)可為上述提及類型的任何一種CTL反應(yīng)，該反應(yīng)中產(chǎn)生能夠識別提呈于細(xì)胞表面的HLA/肽復(fù)合體的CTLs，導(dǎo)致細(xì)胞裂解，即疫苗引發(fā)經(jīng)接種受試者產(chǎn)生對癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性效應(yīng)的效應(yīng)T細(xì)胞；產(chǎn)生抗癌抗體的B細(xì)胞反應(yīng)；和/或DTH類型的免疫反應(yīng)。
在有用的實(shí)施方案中，針對癌癥疾病的免疫原性反應(yīng)通過施用本發(fā)明的肽引發(fā)，上述施用既可通過將MHC I類分子裝載到來自患者的抗原提呈細(xì)胞(APCs)上；通過從患者中分離PBLs并用肽孵育細(xì)胞后將細(xì)胞注射回患者；或通過從患者中分離前體APCs并利用細(xì)胞因子和抗原使細(xì)胞分化成專職APCs后將細(xì)胞注射回患者來實(shí)現(xiàn)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，治療癌癥患者的方法是這樣的一種方法，此方法通過先體外后體內(nèi)地將肽呈遞給患者的抗原提呈細(xì)胞(APCs)，然后將經(jīng)過處理的APCs注射回患者中進(jìn)行肽的施用。實(shí)施此方案至少有兩種備選的方法。一種備選方法是從癌癥患者中分離APCs并將MHC I類分子與肽一起孵育(裝載)。裝載MHC I類分子意味著孵育APCs和肽以便帶有對所述肽特異的MHC I類分子的APCs將結(jié)合肽并因此能將該肽提呈給T細(xì)胞。然后，將APCs重新注射進(jìn)患者體內(nèi)。另一備選方法依賴于最近在樹突細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域做出的發(fā)現(xiàn)。在這種情況下，將單核細(xì)胞(是樹突細(xì)胞的前體)從患者中分離出來并在體外利用細(xì)胞因子和抗原使單核細(xì)胞分化為專職APC(或樹突細(xì)胞)。這在實(shí)施例3和5中描述，其中貼壁的PBLs(主要是單核細(xì)胞)在體外與GM-CSF、IL-4和TNF-α一起培養(yǎng)。隨后，將體外產(chǎn)生的DCs與肽一起脈沖并注射進(jìn)患者體內(nèi)。
由于存活蛋白似乎在大多數(shù)癌癥形式中表達(dá)的事實(shí)，本發(fā)明的疫苗能夠用來控制其中表達(dá)存活蛋白的任何癌癥疾病類型是非?？赡艿摹Ｒ虼?，作為實(shí)例，本發(fā)明的疫苗組合物針對包括慢性淋巴細(xì)胞性白血病和慢性髓性白血病的造血惡性腫瘤、黑素瘤、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和前列腺癌是免疫活性的。
根據(jù)上述描述，技術(shù)人員將容易理解本發(fā)明的肽可以作為癌癥診斷工具，當(dāng)肽是衍生自在所有癌癥類型中均表達(dá)的存活蛋白時(shí)尤其如此。因此，本發(fā)明的肽為開發(fā)有關(guān)癌癥疾病診斷和預(yù)后的通用方法提供了基礎(chǔ)。因此，在其它有用的實(shí)施方案中本發(fā)明的組合物是用于先體外后體內(nèi)或原位診斷癌癥患者中存在的組合物，例如基于PBLs或腫瘤組織中存活蛋白反應(yīng)性T細(xì)胞的檢測進(jìn)行診斷。
因此，在更進(jìn)一步的方面，提供了用于先體外后體內(nèi)或原位診斷PBLs或腫瘤組織中存活蛋白反應(yīng)性T細(xì)胞的存在的診斷試劑盒，該試劑盒包含一種或多種本發(fā)明的肽，和檢測癌癥患者中存活蛋白反應(yīng)性T細(xì)胞存在的方法，所述方法包含將腫瘤組織或血液樣品與本發(fā)明肽和I類HLA分子或此分子片段的復(fù)合體接觸，并檢測復(fù)合體與組織或血細(xì)胞的結(jié)合。
另一有用的診斷或預(yù)后方法是以在異源動物種類中產(chǎn)生抗體為基礎(chǔ)，所述抗體為例如針對本發(fā)明的人存活蛋白衍生肽的鼠抗體，然后所述抗體可用于，例如診斷提呈該肽的癌細(xì)胞的存在。對于這類免疫目的，肽的量可低于體內(nèi)治療過程所用量，例如上面提到的量。通常，優(yōu)選的劑量可為大約1μg至大約750μg肽?；诶帽景l(fā)明的肽的免疫也可以產(chǎn)生單克隆抗體。因此，本發(fā)明還涉及分子，尤其是單克隆或多克隆抗體，包括其片段，該分子能夠特異地結(jié)合本發(fā)明的肽，還涉及能夠阻斷此類結(jié)合的分子，例如針對針對本發(fā)明肽的單克隆或多克隆抗體而產(chǎn)生的抗體。
在一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的肽與I類HLA分子或此分子片段的復(fù)合體，其可作為診斷試劑，例如如上所述。此復(fù)合體可通過任何常規(guī)方法包括下文實(shí)施例所述的方法來制備。這種復(fù)合體可為單體的或多體的。
本發(fā)明提供了減輕或治愈癌癥疾病的方法。因此，將如上文所定義的肽用于癌癥治療藥物的制備是本發(fā)明更進(jìn)一步的方面。本發(fā)明更進(jìn)一步的方面涉及如上文所定義的分子或組合物用于制備癌癥治療藥物的用途。優(yōu)選地，癌癥疾病與存活蛋白的表達(dá)有關(guān)，癌癥疾病包括例如，包括慢性淋巴細(xì)胞性白血病和慢性髓性白血病的造血惡性腫瘤、黑素瘤、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和前列腺癌。此用途包括對患所述疾病的患者施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物、能夠特異結(jié)合本發(fā)明肽的分子和/或能夠阻斷此種分子結(jié)合的分子。
在一些情況下，聯(lián)合使用本發(fā)明與常規(guī)癌癥治療例如放射療法或化學(xué)療法將是適當(dāng)?shù)摹?br> 現(xiàn)在將以下面的非限制性實(shí)施例和附圖對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)描述，其中

圖1說明了ELISPOT中所測的患者CLL1對于無肽、Sur1肽(LTLGEFLKL，SEQ ID NO10)和Sur9肽(ELTLGEFLKL，SEQ ID NO3)的T細(xì)胞反應(yīng)。將PBLs用肽刺激一次后，以每孔6×105個(gè)細(xì)胞一式兩份接種平板。利用CCD掃描裝置和計(jì)算機(jī)系統(tǒng)計(jì)算出每種肽的斑點(diǎn)的平均數(shù)，圖2說明了ELISPOT中所測的患者CLL1對于無肽、肽類似物SurlL2(LLLGEFLKL，SEQ ID NO4)和肽類似物Sur1M2(LMLGEFLKL，SEQ ID NO5)的T細(xì)胞反應(yīng)。將PBLs用肽刺激一次后，以每孔104個(gè)細(xì)胞一式兩份接種平板。利用CCD掃描裝置和計(jì)算機(jī)系統(tǒng)計(jì)算出每種肽的斑點(diǎn)的平均數(shù)，圖3顯示了ELISPOT中所測的患者CLL2和CLL3對于無肽(黑條形)、Sur1肽(LTLGEFLKL，SEQ ID NO10)(灰條形)、Sur9肽(ELTLGEFLKL，SEQ ID NO3)(白條形)、肽類似物SurlL2(LLLGEFLKL，SEQ ID NO4)(淺灰條形)和肽類似物Sur1M2(LMLGEFLKL，SEQ ID NO5)(深灰條形)的反應(yīng)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)用每孔105個(gè)細(xì)胞一式兩份進(jìn)行，并計(jì)算出斑點(diǎn)的平均數(shù)，圖4代表用ELISPOT試驗(yàn)所分析的T細(xì)胞對于無肽(黑條形)、Sur1肽(LTLGEFLKL，SEQ ID NO10)(灰條形)、Sur9肽(ELTLGEFLKL，SEQID NO3)(白條形)的反應(yīng)，其中上述T細(xì)胞分離自患者M(jìn)el1、Mel2和Mel3的腫瘤浸潤淋巴結(jié)并在體外刺激一次。每個(gè)實(shí)驗(yàn)以每孔105個(gè)細(xì)胞一式兩份進(jìn)行。每個(gè)實(shí)驗(yàn)中還包括兩個(gè)未加肽的孔。對每名患者計(jì)算出每種肽的斑點(diǎn)的平均數(shù)，圖5顯示了存活蛋白特異的CTLs的功能活性。CTLs是利用包被存活蛋白的磁珠分離自黑素瘤浸潤的淋巴結(jié)。(A)黑素瘤細(xì)胞系HLA-A2陽性FM3(三角形)和HLA-A2陰性FM45(正方形)的特異裂解。(B)乳腺癌細(xì)胞系HLA-A2陽性MCF-7(三角形)和HLA-A2陰性BT-20(正方形)的特異裂解，圖6顯示了乳腺癌患者的PBL中存活蛋白反應(yīng)性CTLs的頻率。通過ELISPOT檢測三名乳腺癌患者(分別上、中和下)中的反應(yīng)性。對于每名患者，在不存在肽、存在sur1肽、存在sur9和存在修飾的sur1M2肽時(shí)進(jìn)行測定。每孔使用1×104個(gè)效應(yīng)細(xì)胞。該圖描述了反應(yīng)性細(xì)胞的定量；灰色柱形代表產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞的平均數(shù)，圖7說明了HLA-35對存活蛋白衍生肽的結(jié)合，以及通過存活蛋白衍生肽對HLA-B35分子的肽介導(dǎo)的回收的分析。在50、5、0.5、0.05和0.005mM肽存在下，將代謝標(biāo)記的T2-B35細(xì)胞的裂解物在4℃下孵育。在裝配試驗(yàn)中分析HLA-B35的回收并在IEF-凝膠電泳后利用ImageGaugephosphorimager軟件(FUJI photo film有限公司，日本)定量。C50值是與HLA-B35的半最大結(jié)合所需肽的濃度，圖8顯示了癌癥患者的PBLs中所觀察到的自發(fā)性T細(xì)胞反應(yīng)。A)ELISPOT試驗(yàn)所測定的無肽(白條形)、有sur51-59(黑條形)或sur46-54(灰條形)時(shí)體外刺激的PBLs中的IFNγ斑點(diǎn)形成細(xì)胞的數(shù)目，所述PBLs來自患者CLL5(105個(gè)細(xì)胞/孔)、HEM12(105個(gè)細(xì)胞/孔)和HEM8(5×104個(gè)細(xì)胞/孔)，B)與肽脈沖的成熟自體樹突細(xì)胞培養(yǎng)10天的來自HEM12的1.7×105個(gè)PBL中斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)。柱形代表兩次測量的平均值。
圖9表明了針對黑素瘤患者中的天然和修飾的存活蛋白肽的自發(fā)T細(xì)胞反應(yīng)。A)用ELISPOT試驗(yàn)所測得的來自患者FM25的PBLs(4×103個(gè)細(xì)胞/孔)和TILs(7×104個(gè)細(xì)胞/孔)以及來自患者FM45的TILs(104個(gè)細(xì)胞/孔)中針對sur51-59和sur51Y9的斑點(diǎn)形成細(xì)胞的數(shù)目。B)在ELISPOT試驗(yàn)中測量的來自FM74的TILs(5×103個(gè)細(xì)胞/孔)中針對sur46和surf46Y9的斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)。柱形代表了利用扣除非特異IFNγ釋放的兩次測定的平均值。
圖10說明了存活蛋白衍生肽對于HLA-A1的結(jié)合親和力。用Phosphorimager將I類MHC重鏈的條帶定量。穩(wěn)定化的HLA-A1重鏈的量與所加肽的結(jié)合親和力直接相關(guān)。由40、4、0.4、0.04μM Sur93-101(線形)、Sur93T2(正方形)、Sur49-58(圓形)或流感A，PB1 591-599(三角形)誘導(dǎo)HLA-A1的肽介導(dǎo)的回收(任意單位)，圖11顯示了針對HLA-A1限制性肽的自發(fā)性反應(yīng)。針對存活蛋白衍生肽的自發(fā)性T細(xì)胞反應(yīng)由ELISPOT試驗(yàn)來測定。在來自黑素瘤患者的5×104體外刺激的PBL或TIL中，對Sur92-101、Sur38Y9、Sur47Y10和Sur93T2反應(yīng)形成肽特異IFNγ斑點(diǎn)的平均數(shù)目。在對來自黑素瘤(Mel)患者的6個(gè)PBL樣品和3個(gè)TIL樣品的分析中觀察到了所顯示的肽特異反應(yīng)。非特異的IFNγ斑點(diǎn)已扣除。橫條形多次測量的范圍，圖12顯示了針對HLA-A11限制性肽的自發(fā)性反應(yīng)。針對存活蛋白衍生肽的自發(fā)性T細(xì)胞反應(yīng)由ELISPOT試驗(yàn)來測定。在來自癌癥患者的5×104個(gè)體外刺激的PBL或TIL中，對Sur53-62反應(yīng)形成肽特異IFNγ斑點(diǎn)的平均數(shù)目。在對5名黑素瘤(Mel)患者(5PBL，1 TIL)和2名CLL(CLL)患者(PBL)的分析中觀察到了所顯示的肽特異反應(yīng)。非特異的IFNγ斑點(diǎn)已扣除。橫條形多次測量的范圍，圖13說明了針對HLA-A3限制性肽的自發(fā)性反應(yīng)。針對存活蛋白衍生肽的自發(fā)性T細(xì)胞反應(yīng)由ELISPOT試驗(yàn)來測定。在來自黑素瘤患者的5×104個(gè)體外刺激的PBL或TIL中，對Sur18K10反應(yīng)形成肽特異IFNγ斑點(diǎn)的平均數(shù)目。在對來自黑素瘤(Mel)患者的23個(gè)PBL樣品和4個(gè)TIL樣品的分析中觀察到了所顯示的肽特異反應(yīng)。非特異的IFNγ斑點(diǎn)已扣除。橫條形多次測量的范圍，圖14說明了針對HLA-A2限制性肽的自發(fā)性反應(yīng)。針對存活蛋白衍生肽的自發(fā)性T細(xì)胞反應(yīng)由ELISPOT試驗(yàn)來測定。在來自癌癥患者的5×104個(gè)體外刺激的PBL中，對11聚體肽Sur18-28反應(yīng)形成肽特異IFNγ斑點(diǎn)的平均數(shù)目。在對2名黑素瘤(Mel)、6名CLL(CLL)和2名乳腺癌(MC)患者的分析中觀察到了所顯示的肽特異反應(yīng)。非特異的IFNγ斑點(diǎn)已扣除。橫條形多次測量的范圍，圖15說明了通過ELISPOT試驗(yàn)所測定的針對存活蛋白衍生肽的自發(fā)性T細(xì)胞反應(yīng)。在來自5名黑素瘤患者(mel25、mel26、mel3、mel6、mel39)、兩名CLL患者(CLL1、CLL54)和2名乳腺癌患者(breast11、breast15)的105個(gè)體外刺激的PBL中，對sur6-14(LPPAWQPFL)反應(yīng)形成肽特異IFNγ斑點(diǎn)的平均數(shù)目。非特異的IFNγ斑點(diǎn)已扣除，圖16說明了4名患者(▲RW、●KN、-WWE、■GB)的免疫療法后對LDH、膽堿酯酶、肌酸酐、血紅蛋白、白細(xì)胞和血小板穩(wěn)定檢測的實(shí)驗(yàn)值，和圖17表明了通過IFNγELISPOT來評定的存活蛋白肽免疫性的動力學(xué)分析。PBMCs在首次DC接種之前和接種后3個(gè)月獲得。描述了高于背景的IFNγ斑點(diǎn)形成細(xì)胞的數(shù)目。
在下表中，列出了此處所用的肽的氨基酸序列和它們各自的SEQ IDNOs
實(shí)施例1癌癥患者中針對程序性細(xì)胞死亡抑制因子蛋白質(zhì)存活蛋白的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的鑒定概述利用衍生自存活蛋白的CTL表位，通過ELISPOT分析研究了針對來自慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)患者外周血中和黑素瘤患者腫瘤浸潤淋巴結(jié)中此類抗原的特異性T細(xì)胞反應(yīng)。在6名黑素瘤患者的3名和4名CLL患者的3名中檢測到了針對存活蛋白衍生肽表位的CTL反應(yīng)。在來自6名健康對照的PBL中未檢測到T細(xì)胞反應(yīng)。因此，存活蛋白衍生肽可作為抗癌免疫療法策略的重要和可廣泛應(yīng)用的靶標(biāo)。
導(dǎo)言篩選存在HLA-A*0201(HLA-A2)結(jié)合肽基序的存活蛋白蛋白質(zhì)并在成功鑒定后，通過ELISPOT試驗(yàn)將此肽用于白血病和黑素瘤患者中特異性T細(xì)胞反應(yīng)的測試。在兩種患者群體中均檢測到了針對兩種存活蛋白衍生肽表位的CTL反應(yīng)，而健康對照中未能檢測到T細(xì)胞反應(yīng)。這些數(shù)據(jù)表明存活蛋白代表被自體T細(xì)胞識別的廣泛表達(dá)的腫瘤抗原。
材料與方法患者和正常對照將來自4名診斷為CLL(命名為CLL1-4)的患者的外周靜脈血樣品和來自6名正常個(gè)體的血樣品收集到肝素化管中。利用Lymphoprep分離來分離PBLs并在含10％二甲亞砜的胎牛血清(FCS)中冷凍。另外，來自腫瘤浸潤淋巴結(jié)的T淋巴細(xì)胞從6名黑素瘤患者(命名為mel1-6)獲得。將剛切除的淋巴結(jié)切成小碎片，壓碎使細(xì)胞釋放進(jìn)培養(yǎng)液并冷藏。從4名黑素瘤患者得到PBLs。如利用HLA-A2特異抗體BB7.2通過FACS分析所測定的，所包括的所有個(gè)體都是HLA-A2陽性。此抗體純化自雜交瘤上清液?；颊邩悠返米缘湹腟tate University Hospital，Herlev。在做任何這些測量之前均從患者處獲得知情同意。
存活蛋白衍生肽所有肽均來自Research Genetics(Huntsville，AL，美國)且以如HPLC和MS分析所核實(shí)的大于90％的純度提供。所用的肽在表1中列出表1.此研究中所檢測的肽及它們對HLA-A2的結(jié)合親和力
a下標(biāo)所列的數(shù)值范圍指肽在如US6.245.523所公開的存活蛋白序列中肽的位置。
bC50值是如下所述測定的對HLA-A2的半最大結(jié)合所需肽的濃度。用于肽與I類MHC分子結(jié)合的裝配試驗(yàn)用于合成肽與I類MHC分子結(jié)合的裝配試驗(yàn)如所述(12，13)的來完成，其中所述I類MHC分子經(jīng)[35S]-甲硫氨酸代謝標(biāo)記。裝配試驗(yàn)以將肽加入到肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷的T2細(xì)胞系后I類分子的穩(wěn)定化為基礎(chǔ)。隨后，利用構(gòu)象依賴性抗體免疫沉淀正確折疊的穩(wěn)定MHC重鏈。IEF電泳后將凝膠置于phosphorImager屏曝光，并利用Imagequant PhosphorImager程序(Molecular Dynamics，Sunnyvale，加拿大)定量肽結(jié)合。
PBLs的抗原刺激為增加ELISPOT試驗(yàn)的靈敏度，分析之前將PBLs在體外刺激一次(14，15)。新鮮的和從前冷凍的PBLs在ELISPOT試驗(yàn)中得出了相似結(jié)果。第0天，將PBLs或壓碎的淋巴結(jié)解凍，置于AIM V培養(yǎng)基(LifeTechnologies，Roskilde，丹麥)、5％熱滅活的人血清和2mM L-谷氨酰胺中以2×106個(gè)細(xì)胞的濃度2ml每孔接種24孔板(Nunc，丹麥)，上述孔中存在10μM肽。每個(gè)實(shí)驗(yàn)中均包括一個(gè)不含肽的孔。兩天后，向培養(yǎng)物中加入300IU/ml重組白介素-2(IL-2)(Chiron，Ratingen，德國)。第12天用ELISPOT試驗(yàn)測定培養(yǎng)細(xì)胞的反應(yīng)性。
ELISPOT試驗(yàn)用于定量肽表位特異的釋放干擾素-γ的效應(yīng)細(xì)胞的ELISPOT試驗(yàn)如(16)中完成。簡言之，用抗-IFN-γ-抗體(1-D1K，Mabtech，Nacka，瑞典)包被硝酸纖維素底的96孔板(MultiScreen MAIP N45，Millipore，Hedehusene，丹麥)?？捉?jīng)洗滌，用AIM V培養(yǎng)基封閉后，將不同細(xì)胞濃度的細(xì)胞一式兩份加入。然后將肽加入每孔并將板孵育過夜。第二天，在加入生物素化的二級抗體(7-B6-1-生物素，Mabtech)之前，棄去培養(yǎng)基并洗孔。將板孵育2小時(shí)，洗滌并將抗生物素蛋白-酶綴合物(AP-抗生物素蛋白，Calbiochem，Life Technologies)加入每孔。將板在室溫下孵育1小時(shí)并向每孔中加入酶底物NBT/BCIP(Gibco，Life Technologies)，室溫下孵育5-10分鐘。出現(xiàn)暗紫色斑點(diǎn)時(shí)即通過自來水洗滌終止反應(yīng)。利用AlphaImager系統(tǒng)(Alpha Innotech，San Leandro，CA，美國)計(jì)數(shù)斑點(diǎn)并可從斑點(diǎn)形成細(xì)胞的數(shù)目計(jì)算出肽特異的CTL頻率。對每一種肽抗原的測試均一式兩份地進(jìn)行。
結(jié)果存活蛋白衍生肽對HLA-A2的結(jié)合利用主要的HLA-A2特異性錨定殘基(17)，篩選存活蛋白蛋白質(zhì)的氨基酸序列以尋找最可能的HLA-A2九肽和十肽表位。合成了十種存活蛋白衍生肽并檢測了對HLA-A2的結(jié)合。來自HIV-1pol476-484(ILKEPVHGV，SEQ ID NO11)(表1)的表位用作陽性對照。對于陽性對照，I類MHC的半最外回收所需的肽濃度(C50值)為0.7μM。比較起來，命名為Sur9(ELTLGEFLKL，SEQ ID NO3)的肽以C50＝10μM的親和力結(jié)合。命名為Sur6(FLKLDRERA，SEQ ID NO1)和Sur8(TLPPAWQPFL，SEQ ID NO2)的肽分別以C50＝30μM結(jié)合HLA-A2，而Sur1(LTLGEFLKL，SEQ ID NO10)和Sur3(KVRRAIEQL，SEQ ID NO13)結(jié)合較弱(C50＞100μM)。所檢測肽中的5種(Sur2、Sur4、Sur5、Sur7、和Sur10)不結(jié)合到HLA-A2。
由于Sur1是弱HLA-A2結(jié)合劑，所以合成了兩種分別命名為Sur1L2和Sur1M2的類似肽，在上述類似肽中分別用更好的錨定殘基(亮氨酸或甲硫氨酸)代替了2位上天然的蘇氨酸。所述兩種都以與陽性對照幾乎一樣高的親和力(C50＝1μM)結(jié)合到HLA-A2上。
CLL患者中對存活蛋白的CTL反應(yīng)在ELISPOT試驗(yàn)中檢測之前，將來自4名HLA-A2陽性CLL患者的PBLs在體外刺激一次。選擇此方法以增加ELISPOT的靈敏度。所有上面10種存活蛋白衍生肽都包括在實(shí)驗(yàn)的第一線(first line)中。檢測了針對Sur1和Sur9的反應(yīng)并且只有這些肽的數(shù)據(jù)在圖中給出。圖1顯示了如患者CLL1中所測定的針對Sur1和Sur9的CTL反應(yīng)性。每個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)肽反應(yīng)性產(chǎn)生INF-γ的細(xì)胞。利用CCD掃描裝置和計(jì)算機(jī)系統(tǒng)計(jì)算出了每種肽的斑點(diǎn)平均數(shù)目。在CLL1患者中每6×105個(gè)細(xì)胞中檢測出52個(gè)Sur9肽特異性斑點(diǎn)(在扣除不加入肽的斑點(diǎn)后)(圖1)。未檢測到針對弱HLA-A2結(jié)合肽Sur1的反應(yīng)，然而患者對強(qiáng)HLA-A2結(jié)合肽類似物Sur1M2反應(yīng)強(qiáng)烈(每104個(gè)細(xì)胞35個(gè)肽特異性斑點(diǎn))(圖2)。在此患者中未檢測到針對另一種強(qiáng)HLA-A2結(jié)合肽類似物Sur1L2的反應(yīng)(圖2)?；颊逤LL2對于Sur9反應(yīng)強(qiáng)烈(每105個(gè)細(xì)胞128個(gè)肽特異性斑點(diǎn))卻對Sur1反應(yīng)微弱(每105個(gè)細(xì)胞22個(gè)肽特異性斑點(diǎn))(圖3)。針對Sur1L2類似物的反應(yīng)相對于天然表位只是稍微增強(qiáng)，而患者對于Sur1M2肽的反應(yīng)與針對十聚體肽Sur9相似地強(qiáng)烈?；颊逤LL3中觀察到針對Sur9的微弱反應(yīng)(圖3)。該患者中未觀察到針對Sur1和修飾的Sur1肽的反應(yīng)。在最后一名患者CLL4中未檢測到存活蛋白反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。為研究是否能在健康個(gè)體中檢測出針對存活蛋白的反應(yīng)，分析了來自6名健康HLA-A2陽性對照的PBLs。在任何對照中均未檢測到針對任何存活蛋白衍生肽的反應(yīng)。
黑素瘤患者中針對存活蛋白的CTL反應(yīng)對分離自HLA-A2陽性黑素瘤患者的腫瘤浸潤淋巴結(jié)的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行了檢測。將剛切除的淋巴結(jié)切成小碎片并壓碎從而將細(xì)胞釋放進(jìn)培養(yǎng)液。在ELISPOT試驗(yàn)中檢測之前在體外用肽將細(xì)胞刺激一次。在6名所分析的患者中的3名中檢測到存活蛋白特異性T細(xì)胞反應(yīng)。在患者M(jìn)el2和Mel3中檢測到強(qiáng)烈的Sur9反應(yīng)。在這些患者中也檢測到較弱的針對Sur1肽的反應(yīng)(圖4)。在Mel1中針對微弱結(jié)合肽Sur1的反應(yīng)比針對較強(qiáng)HLA-A2結(jié)合劑Sur9的反應(yīng)要強(qiáng)(圖4)。在來自最后三名黑素瘤患者(Mel4-6)的腫瘤浸潤淋巴結(jié)中未檢測到反應(yīng)。檢測了來自兩名存活蛋白反應(yīng)患者M(jìn)el1和Mel2和來自兩名非反應(yīng)患者M(jìn)el4和Mel5的PBLs。在來自任何這些患者的PBLs中均未檢測到針對Sur9或Sur1的反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例2癌癥患者中原位或先體外后體內(nèi)的針對衍生自存活蛋白的MHC I類限制性T細(xì)胞表位的自發(fā)細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)概述乳腺癌、白血病和黑素瘤患者中的原位及先體外后體內(nèi)的針對衍生自存活蛋白的MHC I類限制性T細(xì)胞表位的自發(fā)細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)已得到闡明。而且，通過包被MHC/肽復(fù)合體的磁珠分離的存活蛋白反應(yīng)性T細(xì)胞對于不同組織類型的HLA匹配的腫瘤是細(xì)胞毒性的。作為普遍的腫瘤抗原，存活蛋白可作為抗癌免疫療法的可廣泛應(yīng)用的靶標(biāo)。
材料與方法用于T細(xì)胞染色和T細(xì)胞分選的HLA-肽復(fù)合體的構(gòu)建利用生物素蛋白質(zhì)連接酶(BirA)將酶促生物素化的識別位點(diǎn)與HLAA*0201胞外結(jié)構(gòu)域(殘基1-275)的5’-末端融合并且融合體在大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)中表達(dá)。該重組蛋白質(zhì)通過大小排阻層析(SephadexG25，Pharmacia)和離子交換(mono-Q，Pharmacia)層析從溶于8M尿素的包函體中得到純化。在修飾的存活蛋白肽Sur1M2(LMLGEFLKL，SEQ IDNO5)或MAA肽gp100154-163的存在下，在體外通過稀釋使HLA A*0201折疊，并隨后如前所述將其生物素化(35，36)。在用Pharmacia SephadexG25柱凝膠過濾除去未結(jié)合的生物素后，用鏈霉親和素-FITC連接的葡聚糖分子(由丹麥DAKO的L.Winther友情提供)將所述蛋白質(zhì)多聚化以產(chǎn)生用于免疫組織化學(xué)的多價(jià)HLA-葡聚糖化合物。HLA A*0201構(gòu)建體是Mark M.Davis博士(Dept.of Microbiology and Immunology，StanfordUniversity，Palo Alto，CA)的友好贈品。細(xì)胞分離如前所述(37)來完成。簡言之，將5×106個(gè)鏈霉親和素連接的磁珠(Dynal，Oslo，挪威)在200μl冷的PBS中洗滌兩次，加入0.5μg肽/A*0201單體并將混合物在室溫下孵育15分鐘。洗滌兩次后將磁珠與PBLs以1∶10的比例混合，且隨后孵育1小時(shí)后在磁場中沉淀珠子結(jié)合的細(xì)胞。重復(fù)一次此沉淀步驟。
免疫組織化學(xué)染色將組織切片干燥過夜且隨后在冷丙酮中固定5分鐘，用于用FITC-連接的多聚化肽/MHC復(fù)合體染色。所有孵育步驟均在室溫和黑暗中完成(i)45分鐘一級抗體(1∶100稀釋)，(ii)Cy 3-連接的山羊抗小鼠(1∶500稀釋；編號115-165-100，Jackson ImmunoResearch，從德國漢堡的Dianova處獲得)孵育45分鐘，和最后(iii)多聚體75分鐘。每步之間將載玻片在PBS/BSA 0.1％中洗滌兩次10分鐘。將載玻片在vectashield中封片并保存在冰箱中直到在共焦顯微鏡下觀察為止。
細(xì)胞毒性測試用于CTL介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的常規(guī)[51Cr]-釋放測定如(13)中所述的來進(jìn)行。靶細(xì)胞是自體EBW轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系，HLA-A2陽性乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(從ATCC獲得)、HLA-A2陽性黑素瘤細(xì)胞系FM3(38)、HLA-A2陰性乳腺癌細(xì)胞系BT-20(從ATCC獲得)和HLA-A2陰性黑素瘤細(xì)胞系FM45(38)。如通過RT-PCR所檢測的，所有癌細(xì)胞系均表達(dá)存活蛋白(數(shù)據(jù)未顯示)。
ELISPOT試驗(yàn)ELISPOT試驗(yàn)用于對肽表位特異性釋放IFN-γ的效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行定量且從前已有描述(39)。簡言之，用抗IFN-γ的抗體(1-D1K Mabtech，瑞典)包被硝酸纖維素底的96孔板(MultiScreen MAIP N45，Millipore)并用AIMV(GibcoBRL，Life Technologies Inc.，Gaithersbury，MD，美國)封閉非特異性結(jié)合。將不同細(xì)胞濃度的淋巴細(xì)胞與特異性肽和T2細(xì)胞一起加入并在37℃下孵育過夜。兩次洗滌后加入生物素化的檢測抗體(7-B6-1-生物素，Mabtech)。利用堿性磷酸酶-親和素和各自的底物(GibcoBRL)顯現(xiàn)特異性結(jié)合。在暗紫色斑點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)即終止此反應(yīng)，利用AlphaImager系統(tǒng)(AlphaInnotech，San Leandro，CA，美國)將斑點(diǎn)定量。用于ELISPOT的肽是Sur1、Sur9和如實(shí)施例1所述的Sur1的類似肽Sur1M2。
結(jié)果HLA-A2/存活蛋白反應(yīng)性T細(xì)胞的原位染色在實(shí)施例1中，鑒定了白血病和黑素瘤中由T細(xì)胞識別的兩種存活蛋白衍生肽表位，即Sur1。通過用更好的錨定殘基(甲硫氨酸；Sur1M2)替換2位的蘇氨酸，Sur1對HLA-A2的弱結(jié)合親和力得到極大提高。此措施使得可以構(gòu)建穩(wěn)定的HLA-A2/肽復(fù)合體。這些復(fù)合體利用葡聚糖分子得以多聚化，所述葡聚糖分子與鏈霉親和素和FITC連接。多聚化的MHC復(fù)合體用于對丙酮固定的冰凍材料染色。利用共焦激光顯微鏡，Sur1M2/HLA-A*0201反應(yīng)性CTLs能夠容易地在腫瘤微環(huán)境中原位檢測到。我們描述了III期黑素瘤患者的原發(fā)腫瘤和崗哨淋巴結(jié)以及原發(fā)乳腺癌病灶中的此類細(xì)胞。為確保染色的特異性，做了一系列的陰性對照。無論肽/HLA-葡聚糖多聚體與同一腫瘤上衍生自黑素瘤分化抗原gp100的肽的使用，還是在來自于HLA-A2陰性供體的腫瘤樣品情況下使用Sur1M2/HLA-葡聚糖多聚體均未得出陽性染色。
分離的存活蛋白反應(yīng)性CTLs裂解不同來源的腫瘤細(xì)胞系為表征存活蛋白反應(yīng)性CTLs的功能性能力，通過包被HLA-A2/Sur1M2復(fù)合體的磁珠將這些細(xì)胞分離(36)。將剛切除的黑素瘤浸潤淋巴結(jié)切成碎片并壓碎使細(xì)胞釋放進(jìn)培養(yǎng)液。分離前將細(xì)胞在體外用肽刺激一次。分離后一天加入IL-2并在第5天通過ELISPOT或在標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放試驗(yàn)中對這些細(xì)胞殺死腫瘤細(xì)胞的能力進(jìn)行測試。首先，通過ELISPOT分析可能證實(shí)利用修飾的Sur1M2/HLA-A2復(fù)合體分離的CTLs也對天然Sur1肽起反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。第二，測試了存活蛋白反應(yīng)性CTLs對于HLA-A2陽性黑素瘤細(xì)胞系FM3(圖5A)和HLA-A2陽性乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(圖5B)的細(xì)胞毒性。分離的T細(xì)胞有效地裂解了兩種HLA-A*0201細(xì)胞系。與此相反，未觀察到針對HLA-A2陰性黑素瘤細(xì)胞系FM45(圖5A)或HLA-A2陰性乳腺癌細(xì)胞系BT-20(圖5B)的細(xì)胞毒性。通過ELISPOT測量PBL中的存活蛋白反應(yīng)性通過ELISPOT檢查了來自十名HLA-A2陽性乳腺癌患者的PBLs中存活蛋白反應(yīng)性T細(xì)胞的存在。分析前，為增加測試的靈敏度將PBLs在體外刺激一次。檢查了對于下列存活蛋白肽的反應(yīng)性Sur1、Sur9和Sur1M2。在十名HLA-A2陽性乳腺癌患者的六名中檢測到了存活蛋白特異性T細(xì)胞。圖6中給出了代表性實(shí)例。來自兩名患者的PBLs中檢測到針對Sur1和修飾的類似物Sur1M2但不是針對Sur9(圖6，上部，中部)的反應(yīng)，三名患者中檢測到針對Sur9而不是針對Sur1或Sur1M2(圖6底部)的反應(yīng)，一名患者僅應(yīng)答Sur1M2。與此相反，在來自20名健康HLA-A2陽性供體的PBLs中未檢測到存活蛋白反應(yīng)。相似地，檢查了來自14名HLA-A2陽性黑素瘤患者的PBLs。存活蛋白反應(yīng)存在于這些患者的7名中(表2)。兩名患者對Sur9肽起反應(yīng)，三名對Sur1M2肽起反應(yīng)，一名對Sur1和SurM2都起反應(yīng)，一名對所有三種肽都起反應(yīng)。在實(shí)施例1中，測試了3名慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)患者中針對存活蛋白的T細(xì)胞反應(yīng)(表2；CLL1、CLL2、CLL3)。利用來自三名另外的CLL患者的PBLs擴(kuò)大了這些研究。顯著地，所有患者產(chǎn)生了針對至少一種存活蛋白表位的T細(xì)胞應(yīng)答(表2；CLL5、CLL6、CLL7)。另外，檢查了來自一名患有慢性髓性白血病(CML)患者的PBLs。在此患者中，鑒定出了針對所有三種肽的反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。表2中概述了這些數(shù)據(jù)。
表2.通過ELISPOT檢測的在PBLs中含有存活蛋白肽-特異性T淋巴細(xì)胞的患者
a)每104個(gè)細(xì)胞中反應(yīng)細(xì)胞的頻率；檢查了14名患者。
b)每104個(gè)細(xì)胞中反應(yīng)細(xì)胞的頻率；檢查了10名患者。
c)每105個(gè)細(xì)胞中反應(yīng)細(xì)胞的頻率；檢查了14名患者。
實(shí)施例3癌癥患者中針對存活蛋白衍生肽的HLA-B35-限制性免疫反應(yīng)概述在此研究中，鑒定和表征了兩種受限于HLA-B35的衍生自存活蛋白的表位。針對這兩種肽表位的特異性T細(xì)胞反應(yīng)性存在于來自患有不同造血惡性腫瘤和黑素瘤的患者的外周血液中。C末端錨定殘基的替換提高了被黑素瘤患者的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的識別。而且，證實(shí)了原發(fā)黑素瘤病灶中原位針對存活蛋白的自發(fā)性細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)。這些表位擴(kuò)大了將來的疫苗策略適用性，此策略以涉及惡性腫瘤的存活蛋白肽以及有關(guān)患者的HLA圖譜為基礎(chǔ)。
在實(shí)施例1和2中，研究了HLA-A2限制性的衍生自存活蛋白的T細(xì)胞表位。由于HLA-A2只在大約30％的白種人群體中表達(dá)(63)，需要鑒定受限于其它HLA I類分子的肽表位以擴(kuò)大可以治療的患者比例。在此研究中，來自受限于HLA-B35的存活蛋白的兩個(gè)新的T細(xì)胞表位得以鑒定，HLA-B35在9％的白種人群體中表達(dá)(63)，并檢測了患有不同造血惡性腫瘤和黑素瘤的患者中這些存活蛋白肽的自發(fā)性免疫反應(yīng)。
材料與方法患者收集癌癥患者的外周靜脈血液樣品，利用Lymphoprep分離來分離PBLs，HLA分型(Department of Clinical Immunology，UniversityHospital，哥本哈根)并冷凍在含有10％DMSO的FCS中。篩選出10名HLA-B35陽性患者用于進(jìn)一步的分析。這些患者分別患有黑素瘤、CLL、濾泡性淋巴瘤(FL)、擴(kuò)散性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)和多發(fā)性骨髓瘤(MM)。在收集血液樣品之時(shí)，患者在前面四個(gè)月中未進(jìn)行過醫(yī)學(xué)上的治療。另外，從三名黑素瘤患者中收集分離自淋巴結(jié)的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)并冷凍于含10％DMSO的FCS中。
肽七種合成的存活蛋白衍生肽用于此研究Sur6-14、Sur11-19、Sur34-43、Sur46-54、Sur51-59、Sur46Y9、Sur51Y9和一種衍生自EBV的肽EBNA3A457-466(63)。所有肽均從Research Genetics(Huntsville，AL)獲得，并以如通過HPLC和MC分析證實(shí)的＞90％的純度提供。這些肽在下面表3中列出。
表3.存活蛋白衍生肽對HLA-B35的結(jié)合
用于肽與MHC I類分子結(jié)合的裝配試驗(yàn)實(shí)施例1和實(shí)施例2中所描述的裝配試驗(yàn)用于測定合成肽對于用[S35]甲硫氨酸代謝標(biāo)記的HLA-B35分子的結(jié)合親和力。簡言之，此試驗(yàn)以肽介導(dǎo)的空HLA分子的穩(wěn)定化為基礎(chǔ)，所述HLA分子是在細(xì)胞裂解時(shí)釋放自用HLA-B35穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的TAP缺陷型細(xì)胞系T2(由J.Haurum博士友情提供，Symphogen ApS，Lyngby，丹麥)。用依賴構(gòu)象的mAb W6/32免疫沉淀穩(wěn)定折疊的HLA分子。通過IEF電泳分離HLA分子，將凝膠暴露于phosphorimager屏(成像板，F(xiàn)UJI photo film有限公司，日本)，分析并利用ImageGauge phosphorimager軟件(FUJI photo film有限公司，日本)定量正確折疊的HLA分子的量。
PBLs的抗原刺激為增加ELISPOT試驗(yàn)的靈敏度，分析前在體外將淋巴細(xì)胞用肽刺激一次(14，15)。將PBLs或TILs解凍并在96孔板中用50μM各自的肽表位在26℃下刺激2小時(shí)(每種肽5×105-106個(gè)細(xì)胞)，合并后再培養(yǎng)10天，所述培養(yǎng)在37℃下in x-vivo中用5％的人血清(HS)以2×106個(gè)細(xì)胞每孔在24孔板(Nunc，Roskilde，丹麥)中進(jìn)行。孵育的第二天，加入40μg/mlIL-2(Apodan A/S，丹麥)。第十天在ELISPOT試驗(yàn)中測試培養(yǎng)細(xì)胞的反應(yīng)性。
ELISPOT試驗(yàn)用于對收集自癌癥患者的PBLs或TILs中的肽特異性釋放IFN-γ的效應(yīng)細(xì)胞定量的ELISPOT試驗(yàn)，如實(shí)施例1中所述的來完成。簡言之，用針對人的IFN-γ的mAb 7.5μg/ml(1-D1K；Mabtech，Nacka，瑞典)包被硝酸纖維素底的96孔板。在x-vivo(x-vivo 15TM BioWhittacker，MolecularApplications Aps，丹麥)中洗滌和封閉孔并以不同濃度一式兩份加入細(xì)胞。對于抗原提呈，將含有和不含10μM肽的104個(gè)T2-B35細(xì)胞加入每孔中。將板孵育過夜，棄去細(xì)胞并洗滌孔后加入生物素化的二級抗體(7-B6-1-生物素；Mabtech)。在室溫下將板孵育2小時(shí)，洗滌并加入親和素-堿性磷酸酶綴合物(AP-親和素；Calbiochem，Life Technologies，Inc.)。室溫下孵育1小時(shí)后，加入酶底物氮藍(lán)四唑/磷酸5-溴-4-氯-3-吲哚基酯(編號K0598，DakoCytomation Norden A/S)，暗紫色斑點(diǎn)在3-7分鐘內(nèi)顯現(xiàn)。通過用自來水洗滌終止反應(yīng)。利用Alpha Imager系統(tǒng)(Alpha Innotech，San Leandro，加拿大)計(jì)數(shù)斑點(diǎn)，并從斑點(diǎn)形成細(xì)胞的數(shù)目計(jì)算出肽特異性T細(xì)胞的頻率。
對于每種肽抗原所有試驗(yàn)均一式兩份地進(jìn)行，并且將培養(yǎng)在同一孔中的淋巴細(xì)胞在含有和不含有肽時(shí)以相等的細(xì)胞數(shù)目測試，以測量培養(yǎng)物中肽特異性細(xì)胞的數(shù)目。
樹突細(xì)胞(DCs)的成熟培養(yǎng)2小時(shí)后從PBLs中分離貼壁細(xì)胞。將這些細(xì)胞在含有10％FCS的RPMI 1640中(GibcoTM Invitrogen公司，英國)再培養(yǎng)10天。每隔一天加入800ng/ml GM-CSF(PreproTech，倫敦，英國)和40ng/mlIL-4(PreproTech)。第10天，通過加入50ng/ml TNF-α(PreproTech)使DCs成熟。成熟后，將DCs釋放并在3μg/ml β2-微球蛋白存下與20μM肽一起在26℃下脈沖2小時(shí)。
肽特異性T細(xì)胞的分離如實(shí)施例2中所述的利用sur51Y9/HLA-B35包被的磁珠分離抗原特異性細(xì)胞。通過將2.5μg單體與5×106個(gè)磁珠在40μl PBS中室溫下孵育20分鐘，將生物素化的HLA-B35單體和sur51Y9(獲得自ProImmune，牛津，英國)與鏈霉親和素包被的磁珠(Dynabeads M-280，Dynal A/S，Oslo，挪威)偶聯(lián)在一起。利用磁性裝置(Dynal，A/S，Oslo，挪威)用PBS將磁性復(fù)合體洗滌三次，并隨后與含有5％BSA的PBLs以1∶10的比率混合，并非常輕柔地旋轉(zhuǎn)1小時(shí)。將與磁性復(fù)合體結(jié)合的抗原特異性CD8+T細(xì)胞輕柔地洗滌二次或三次。分離的細(xì)胞在補(bǔ)加5％人血清的x-vivo中重懸浮幾次并孵育2小時(shí)后將磁珠釋放并從細(xì)胞懸浮液中移走。分離的抗原特異性CD8+T細(xì)胞用于ELISPOT試驗(yàn)以分析天然和修飾肽之間的交叉反應(yīng)性。
通過變性梯度凝膠電泳(DGGE)進(jìn)行TCR克隆型作圖人類TCR BV區(qū)域1-24的DGGE克隆型作圖已有詳細(xì)描述(66)。簡言之，利用Purescript Isolation試劑盒(Gentra Systems Inc.MN)分離RNA并利用TCR beta鏈可變區(qū)的引物連同共同的恒定區(qū)引物通過PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄的cDNA。用計(jì)算機(jī)程序MELT87確保如果將50bp的富含GC的序列(GC-夾子)連接在恒定區(qū)引物的5’末端，那么擴(kuò)增的DNA分子適合于DGGE分析。DGGE分析在含有20％-80％的尿素和甲酰胺梯度的6％的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行。電泳在1×TAE緩沖液中54℃恒溫下以160V進(jìn)行4.5小時(shí)。
免疫組織化學(xué)染色利用如實(shí)施例2中所述的方法，將多聚化的肽/HLA復(fù)合體用于鑒定癌癥患者的腫瘤病灶中原位的抗原特異性T細(xì)胞。生物素化的sur51Y9/HLA-B35單體由英國牛津的Proimmune有限公司提供。將生物素化的sur51Y9/HLA-B35單體用鏈霉親和素-FITC-連接的葡聚糖分子(由丹麥Glostrup，DAKO的L.Winther友情提供)多聚化以產(chǎn)生用于免疫組織化學(xué)的多價(jià)HLA-葡聚糖化合物。將組織切片干燥過夜并隨后在冷丙酮中固定5分鐘。所有的孵育步驟均在黑暗中室溫下完成(a)一級抗體(1∶100稀釋)45分鐘；(b)Cy3-連接的山羊抗小鼠抗體(1∶500稀釋；編號115-165-100；Jackson ImmunoResearch，獲得自Dianova，漢堡，德國)45分鐘；及最后(c)多聚體75分鐘。每步之間，在PBS/BSA 0.1％中洗滌載玻片兩次10分鐘。將載玻片在vectashield中封片并保存在冰箱中直到在共焦顯微鏡(Leica)下觀察。
HLA-B35結(jié)合存活蛋白衍生肽的鑒定根據(jù)HLA-B35的肽結(jié)合基序(67)篩選存活蛋白的氨基酸序列以尋找?guī)в绣^定殘基的九聚體和十聚體肽。篩選出包含脯氨酸作為2位N-末端錨定殘基和苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或酪氨酸作為C-末端錨定殘基的5種肽(表3)。裝配試驗(yàn)顯示出能夠有效穩(wěn)定HLA-B35的兩種肽sur51-59(EPDLAQCFF，SEQ ID NO7)和sur46-54(CPTENEPDL，SEQ IDNO6)。另外，兩種肽sur34-43(TPERMAEAGF，SEQ ID NO20)和sur6-14(LPPAWQPFL，SEQ ID NO18)顯示出弱穩(wěn)定性，而剩余的肽根本不穩(wěn)定HLA-B35。HLA-B35的半數(shù)最大回收所需的肽濃度(C50)估計(jì)為對于sur51-59為13μM和對于sur46-54為20μM。比較起來，來自EBNA3A458-466(YPLHEQHQM，SEQ ID NO21)的陽性對照表位C24具有估計(jì)為0.8μM的C50值。
為提高sur46-54和sur51-59的結(jié)合親和力，將C末端氨基酸用更好的錨定殘基酪氨酸來代替(67)。在裝配試驗(yàn)中分析由修飾的肽介導(dǎo)的HLA-B35的回收，并估計(jì)出C50值對于sur51Y9是1.5μM和對于sur46Y9是4μM(圖7)。
針對天然肽表位的自發(fā)性免疫反應(yīng)最初，分析了五名患者對于四種天然HLA-B35結(jié)合肽sur51-59、sur46-54、sur34-43和sur6-14的自發(fā)性免疫反應(yīng)。這五名患者患有不同的造血惡性腫瘤HEM8和HEM18患有MM，HEM12患有FL，HEM9患有DLBCL和CLL5患有CLL。
十天的體外刺激后對PBLs進(jìn)行INF-γELISPOT試驗(yàn)，以檢測肽前體CTLs。檢測出針對兩種天然HLA-B35結(jié)合肽sur51-59和sur46-54的自發(fā)性免疫反應(yīng)。兩名患者HEM12和CLL5對sur51-59和sur46-54均顯示出反應(yīng)，而HEM8只顯示出針對sur51-59的反應(yīng)(圖8A和B)。在剩余兩名患者HEM9和HEM18中未檢測到反應(yīng)，且在任何患者中均沒檢測到針對弱結(jié)合肽sur34-46和sur6-14的反應(yīng)。
將體外刺激的備選方法用于患者HEM12中，即將PBLs與用sur51-59脈沖的成熟自體樹突細(xì)胞共培養(yǎng)從而體外刺激CTL反應(yīng)。此培養(yǎng)的PBLs在ELISPOT中顯示出針對sur51-59的強(qiáng)烈反應(yīng)性(圖8B)。
修飾肽的增強(qiáng)識別如上所述，為提高HLA-B35親和力的肽修飾導(dǎo)致了HLA-B35相對于天然肽的5-10倍高的親和力。通過ELISPOT試驗(yàn)將一組五名黑素瘤患者用于分析針對天然和修飾肽的自發(fā)性免疫反應(yīng)。PBL樣品在體外刺激后進(jìn)行分析，而直接分析TIL樣品。在來自五名患者中的三名的PBLs或TILs中觀察到自發(fā)性免疫反應(yīng)。FM25在PBL和TIL樣品中均顯示出針對sur51-59和sur51Y9的反應(yīng)性(圖9A)。FM45只對修飾肽sur51Y9起反應(yīng)，在TILs中可檢測到強(qiáng)烈反應(yīng)。在此患者中未獲得PBLs(圖9A)。FM74在TIL中顯示出針對sur46Y9的強(qiáng)烈反應(yīng)，但未檢測到針對天然肽的反應(yīng)(圖9B)。在來自FM74的PBLs中也觀察到針對sur46Y9的弱反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。
天然和修飾肽之間的交叉反應(yīng)性Sur51Y9對HLA-B35的高親和力使得用sur51Y9產(chǎn)生HLA-B35的穩(wěn)定單體成為可能。在來自不同癌癥患者的腫瘤浸潤淋巴結(jié)和PBLs中存活蛋白反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的存在已經(jīng)確定，用此類HLA-B35/Sur51Y9復(fù)合體包被磁珠并將這些磁珠用于從患者CLL5的PBL中分離存活蛋白肽反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞。此患者顯示出針對sur51-59的強(qiáng)烈反應(yīng)。如通過顯微術(shù)所顯現(xiàn)的，珠子緊密結(jié)合到特異性細(xì)胞的細(xì)胞表面(數(shù)據(jù)未顯示)，容許通過磁場沉淀抗原特異性細(xì)胞。分離的sur51Y9特異性細(xì)胞強(qiáng)烈應(yīng)答sur51-59(圖9)，而在剩余的PBLs中未能檢測到應(yīng)答(數(shù)據(jù)未顯示)。此分離通過RT-PCR/DGGE為基礎(chǔ)的TCR克隆型作圖來分析。此技術(shù)允許對復(fù)雜細(xì)胞群體中的T細(xì)胞克隆性(clonality)的分析，甚至只要獲得少數(shù)細(xì)胞就可分析。這些分析表明8個(gè)不同的克隆得以分離(數(shù)據(jù)未顯示)。
抗原特異性T細(xì)胞原位存在于黑素瘤病灶中利用與鏈霉親和素和FITC連接的葡聚糖分子將sur51Y9/HLA-B35單體多聚化。利用實(shí)施例2中所述的方法將多聚化的MHC復(fù)合體用于對丙酮固定的冰凍材料染色?？乖禺愋约?xì)胞用共焦激光顯微鏡觀察。分析了來自三名患者的原發(fā)黑素瘤切片，并在一名患者的腫瘤微環(huán)境中能夠在原位容易地檢測到Sur51Y9/HLA-B35反應(yīng)性CTLs。用針對粒酶B的mAb的共染色表明這些存活蛋白特異性CTLs釋放粒酶B，發(fā)揮細(xì)胞毒素的活性，將HLA-B35陰性黑素瘤患者用作對照(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例4具有不同HLA-A限制譜的新的衍生自存活蛋白的CTL表位的鑒定概述以癌癥患者中的CTL反應(yīng)為基礎(chǔ)表征了新的HLA-A1-、HLA-A2-、HLA-A3-和HLA-A11-限制性存活蛋白表位。這些表位顯著增加了適合基于存活蛋白衍生肽的免疫療法的患者數(shù)。另外，幾種限制元件的集體靶定可能降低HLA-等位基因缺失造成的免疫逃逸的危險(xiǎn)。
材料與方法患者患者樣品獲得自德國的University of Würzburg大學(xué)和丹麥Herlev的University Hospital。在做任何這些測量之前均獲得了患者的知情同意。組織分型在丹麥哥本哈根的Department of Clinical Immunology，University Hospital進(jìn)行。利用Lymphoprep分離來分離患有黑素瘤、乳腺癌和慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)患者的外周血淋巴細(xì)胞(PBL)并冷凍在含有10％二甲亞砜的胎牛血清(FCS)中。而且，獲得了來自黑素瘤患者的原發(fā)病灶和腫瘤浸潤淋巴結(jié)的T淋巴細(xì)胞。將剛切除的腫瘤組織切成小快并壓碎以釋放用于冷藏的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)。
肽所有的肽都購買自Invitrogen(Carlsbad，CA，美國)并以如通過HPLC和MS分析所證實(shí)的＞80％的純度提供。所有用到的肽在下面表4、實(shí)施例5中列出。
細(xì)胞系人T2細(xì)胞系是B-LCL.174和T-LCL CEM細(xì)胞的TAP1和TAP2缺陷雜種，因此只在細(xì)胞表面表達(dá)低水平的HLA I類分子(HLA-A*0201和HLA-B*5101)。用HLA-A*0301轉(zhuǎn)染的T2細(xì)胞由牛津的John RadcliffeHospital IMM的A McMicheael博士友情提供。用HLA-A*1101轉(zhuǎn)染的T2細(xì)胞由瑞典斯德哥爾摩Karolinska Institute MTC的M Masucci博士友情提供。BM36.1細(xì)胞系也是TAP功能缺陷的并具有與T2相似的表型，在表面低水平表達(dá)HLA I類(HLA-A*0101和HLA-B*3501)。BM36.1細(xì)胞由德國柏林的Humboldt University的A Ziegler博士友情提供。
用于肽結(jié)合MHC I類分子的裝配試驗(yàn)如前所述(12)，在裝配試驗(yàn)中測定合成肽(Invitrogen，Carlsbad，CA，美國)對用[35S]-甲硫氨酸代謝標(biāo)記的HLA-A1、-A2、-A3或-A11分子的結(jié)合親和力。此試驗(yàn)以細(xì)胞裂解時(shí)從TAP缺陷細(xì)胞系中所釋放的空HLA分子的肽介導(dǎo)的穩(wěn)定化為基礎(chǔ)。利用HLA I類特異的構(gòu)象依賴性mAb W6/32將穩(wěn)定折疊的HLA分子免疫沉淀，并通過等電聚焦(IEF)凝膠電泳將其分離。用ImageGauge Phosphorimager程序(FUJI photo film公司，Carrollton，TX，美國)定量MHC重鏈條帶。條帶的強(qiáng)度與試驗(yàn)中所回收的肽結(jié)合的I類MHC復(fù)合體的量是成比例的。其次，HLA分子的穩(wěn)定化程度與所加肽的結(jié)合親和力是直接相關(guān)的。用于分析HLA分子回收的肽濃度對于HLA-A1和HLA-A11是40、4、0.4、0.04μM，而對于HLA-A2和HLA-A3是100、10、1、0.1、0.01μM。隨后對每種肽計(jì)算出C50值，其為足以達(dá)到半最大穩(wěn)定化的肽濃度。
PBL的抗原刺激為增加ELISPOT試驗(yàn)靈敏度，分析前在體外刺激一次PBL。第0天，將PBL或壓碎的淋巴結(jié)解凍并以2ml/孔中2×106個(gè)細(xì)胞接種24孔板(Nunc，Roskilde，丹麥)，所述細(xì)胞存在于10μM肽存在下的含有5％熱滅活的人血清和2mM L-谷氨酰胺的x-vivo培養(yǎng)基(BioWhittaker，Walkersville，Maryland)中。兩天后，向培養(yǎng)物中加入20IU/ml的重組白介素-2(IL-2)(Chiron，Ratingen，德國)。第10天在ELISPOT中測試所培養(yǎng)細(xì)胞的反應(yīng)性。
ELISPOT試驗(yàn)如前面描述的(16)，用ELISPOT試驗(yàn)定量肽表位特異的γ干擾素釋放性效應(yīng)細(xì)胞。簡言之，用抗-IFN-γ-抗體(1-DlK，Mabtech，Nacka，瑞典)包被硝酸纖維素底的96孔板(MultiScreen MAIP N45，Millipore，Hedehusene，丹麥)。將孔洗滌，用X-vivo培養(yǎng)基封閉，并將細(xì)胞以不同細(xì)胞濃度一式兩份加入。然后每孔中加入肽并將板孵育過夜。第二天，在加入生物素化的二次抗體(7-B6-1-生物素，Mabtech)之前，棄去培養(yǎng)基并洗滌孔。將板孵育2小時(shí)，洗滌并將抗生物素蛋白-堿性磷酸酶綴合物(Calbiochem，Life Technologies，Inc，San Diego，CA，美國)加入每孔。將板在室溫下孵育1小時(shí)，洗滌，并在每孔中加入酶底物NBT/BCIP(DakoCytomation Norden A/S，Glostrup，丹麥)并在室溫下孵育5-10分鐘。暗紫色斑點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)即通過自來水洗滌來終止反應(yīng)。利用ImmunoSpot_Series 2.0分析儀(CTL分析儀，LLC，Cleveland，美國)計(jì)數(shù)斑點(diǎn)并可從斑點(diǎn)形成細(xì)胞的數(shù)目計(jì)算出肽特異的CTL頻率。對每種肽抗原的所有測試均一式兩份地進(jìn)行。
結(jié)果HLA-A1限制性存活蛋白表位的鑒定存活蛋白衍生肽對HLA-A1的結(jié)合利用主要的HLA-A1錨定殘基3位上的天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)和C末端的酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)篩選存活蛋白蛋白質(zhì)的氨基酸序列以尋找最可能的HLA-A1九聚體或十聚體肽表位。因此，合成了六種存活蛋白衍生肽并檢測了與HLA-A1的結(jié)合(表4)。另外，包括兩種肽Sur38-46(MAEAGFIHC)(SEQ ID NO23)和Sur47-56(PTENEPDLAQ)(SEQ IDNO25)，盡管它們只含有主要錨定殘基中的一個(gè)，因?yàn)橥ㄟ^在http//syfpeithi.bmiheidelberg.com/可獲得的Rammensee等人的預(yù)測算法將這兩種肽鑒定為可能的良好結(jié)合物。估計(jì)每種肽的C50值，其為HLA-A1的半最大穩(wěn)定化所需的肽濃度(表4)。然而，這些肽中只有一種Sur92-101(QFEELTLGEF)(SEQ ID NO27)以與已知陽性對照表位相似高的親和力結(jié)合，所述陽性對照表位來自如圖10中例示的流感A蛋白質(zhì)堿性聚合酶1(PB1)(VSDGGPNLY)。Sur93-101(FEELTLGEF)(SEQ ID NO24)對HLA-A1具有低結(jié)合親和力，而所分析的其它肽中沒有肽結(jié)合到HLA-A1(表4)。因此，我們合成了許多類似肽，在其中更好的錨定殘基代替了天然氨基酸。我們在C末端引入酪氨酸(Y)分別代替半胱氨酸(C)或谷氨酰胺(Q)來修飾兩種肽Sur38-46(MAEAGFIHC)(SEQ ID NO23)和Sur47-56(PTENEPDLAQ)(SEQ ID NO25)。兩種修飾肽都強(qiáng)烈地結(jié)合到HLA-A1上(表4)。另外，我們用輔助錨定蘇氨酸(T)或絲氨酸(S)替換兩種肽Sur92-101和Sur93-101中2位上的氨基酸。這些修飾對Sur92-101與HLA-A1的結(jié)合不具有正效應(yīng)。相反，Sur93T2(FTELTLGEF)(SEQ IDNO36)對HLA-A1以高親和力結(jié)合(表4)。圖10說明了與來自流感的陽性對照表位相比，天然低親和力肽Sur93-101、高親和力修飾肽Sur93T2和非結(jié)合肽Sur49-58的結(jié)合。最后，我們在C末端用酪氨酸(Y)修飾了Sur14-22、Sur34-43、Sur49-58、Sur51-59、Sur92-101和Sur93-101，然而這沒有提高任何這些肽對于HLA-A1的結(jié)合親和力(數(shù)據(jù)未顯示)。
癌癥患者中針對存活蛋白衍生肽的HLA-A1限制性CTL反應(yīng)通過ELISPOT分析了來自六名黑素瘤患者的PBL和來自三名黑素瘤患者的TIL中，特異針對四種高親和力的存活蛋白衍生的肽Sur38Y9、Sur47Y10、Sur 92-101和Sur93T2中任何一種的CTL的存在。在所有來自九名所分析患者的三個(gè)PBL樣品和一個(gè)TIL樣品中觀察到針對至少一種存活蛋白衍生肽的T細(xì)胞反應(yīng)性。如圖11中所示，來自一名患者M(jìn)el.A1-3的PBL具有針對所有4種肽Sur38Y9、Sur47Y10、Sur 92-101和Sur93T2的T細(xì)胞反應(yīng)。Mel.A1-2顯示出針對Sur47Y10、Sur 92-101和Sur93T2的反應(yīng)，而在Mel.Al-1/TIL和Mel.A1-4/PBL中分別觀察到針對Sur47Y10和Sur93T2的反應(yīng)(圖11)。
另外，通過ELISPOT試驗(yàn)了十名黑素瘤患者的針對天然肽Sur93-101、Sur38-46和Sur47-56的免疫反應(yīng)性；然而，在任何這些肽中都未檢測到肽特異反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。
HLA-A1限制性存活蛋白表位的鑒定存活蛋白衍生肽對HLA-A11的結(jié)合篩選存活蛋白蛋白質(zhì)的氨基酸序列以尋找九聚體或十聚體肽，所述肽含有相應(yīng)于HLA-A3超家族包括HLA-A3和HLA-A11的結(jié)合基序的結(jié)合基序。根據(jù)Rammensee等人的預(yù)測算法選擇了含有主要錨定殘基在2位的亮氨酸(L)和C末端的賴氨酸(K)的肽序列，和在這些位置上具有相關(guān)氨基酸的肽序列(表4)。
從存活蛋白的蛋白質(zhì)序列預(yù)測了十三種肽并分析了其與HLA-A11和HLA-A3的結(jié)合。這些肽中的三種Sur53-62(DLAQCFFCFK)(SEQ IDNO47)、Sur54-62(LAQCFFCFK)(SEQ ID NO42)和Sur112-120(KIAKETNNK)(SEQ ID NO44)以高親和力結(jié)合HLA-A11，所述親和力與來自EBV核抗原4(AVFDRKSDAK)(SEQ ID NO63)的病毒的表位結(jié)合HLA-A11的親和力相當(dāng)。另外，一種肽Sur112-121(KIAKETNNKK)(SEQ ID NO51)與HLA-A11弱結(jié)合(表4)。
癌癥患者中針對存活蛋白衍生肽的HLA-A11限制性CTL反應(yīng)測試了來自五名黑素瘤患者和兩名CLL患者的PBL針對四種HLA-A11結(jié)合肽Sur53-62、Sur54-62、Sur112-120、和Sur112-121的T細(xì)胞反應(yīng)性。通過ELISPOT，我們能夠檢測來自兩名黑素瘤患者M(jìn)el.A11-1、Mel.A11-2的PBL中針對存活蛋白衍生肽Sur53-62的反應(yīng)(圖12)。另外，我們能夠在來自患者M(jìn)el.A11-2的腫瘤浸潤淋巴結(jié)的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)中檢測到Sur53-62特異性T細(xì)胞(圖12)。在兩年時(shí)間內(nèi)從患者M(jìn)el.A11-1所采集的五個(gè)不同血液樣品中觀察到針對存活蛋白肽Sur53-62的強(qiáng)免疫反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。
HLA-A3限制性存活蛋白表位的鑒定存活蛋白衍生肽對HLA-A3的結(jié)合另外分析了經(jīng)預(yù)測結(jié)合HLA-A3超家族的存活蛋白衍生肽與HLA-A3的結(jié)合。只有兩種肽Sur112-120(KIAKETNNK)(SEQ ID NO44)和Sur112-121(KIAKETNNKK)(SEQ ID NO57)以高親和力結(jié)合HLA-A3，與病毒表位流感A核蛋白265-273(ILRGSVAHK)(SEQ ID NO74)相似(表4)。而且，兩種肽Sur53-62(DLAQCFFCFK)(SEQ ID NO47)和Sur95-103(ELTLGEFLK)(SEQ ID NO43)弱結(jié)合到HLA-A3。
為了增加對HLA-A3的結(jié)合親和力，修飾了檢測不到結(jié)合的一些肽。因此，我們合成了兩種類似肽Sur54-62和Sur113-122，在其中2位上用更好的錨定殘基亮氨酸(L)代替了天然的丙氨酸(A)。Sur54L2(LLQCFFCFK)(SEQ ID NO56)以高親和力結(jié)合HLA-A3，而Sur113L2(ILKETNNKKK)(SEQ ID NO59)只是弱結(jié)合(表4)。另外，我們合成了四種類似肽Sur5-13、Sur13-22、Sur18-27、和Sur53-61，在其中用更好的錨定殘基賴氨酸(K)代替了C末端天然的苯丙氨酸(F)。Sur5K9(TLPPAWQPK)(SEQ ID NO54)和Sur18K10(RISTFKNWPK)(SEQ IDNO58)以高親和力結(jié)合到HLA-A3上，而與天然類似物相比，所述替換對于Sur13K9(FLKDHRISTK)(SEQ ID NO57)和Sur53K9(DLAQCFFCK)(SEQ ID NO55)對HLA-A3的結(jié)合無可檢測的效果。
癌癥患者中針對存活蛋白衍生肽的HLA-A3限制性CTL反應(yīng)分析了來自黑素瘤患者的九個(gè)樣品(5個(gè)PBL和4個(gè)TIL)針對兩種天然高親和力HLA-A3結(jié)合肽Sur112-120和Sur112-121以及兩種天然弱結(jié)合肽Sur53-62和Sur95-103的免疫反應(yīng)。然而，通過ELISPOT在任何這些患者中均未檢測出針對這些肽的免疫反應(yīng)。隨后，分析了相同的患者中針對三種高親和力的經(jīng)修飾的存活蛋白衍生肽Sur5K9、Sur18K10、和Sur54L2的自發(fā)性免疫反應(yīng)性。在來自三名患者M(jìn)el.A3-1、Mel.A3-2、Mel.A3-3的TIL樣品中檢測到針對Sur18K10的CTL反應(yīng)性(圖13)。未檢測到針對另外兩種肽Sur5K9和Sur54L2的反應(yīng)。為進(jìn)一步證實(shí)這些反應(yīng)，分析了來自另外18名黑素瘤患者的PBL的針對Sur18K10的CTL反應(yīng)性。在這些患者中發(fā)現(xiàn)了三名應(yīng)答患者M(jìn)el.A3-4、Mel.A3-5、和Mel.A3-6，導(dǎo)致在所分析的27名患者中共有6名應(yīng)答患者(表13)。
新的HLA-A2限制性存活蛋白表位的鑒定11聚體存活蛋白衍生肽對HLA-A2的結(jié)合利用主要的HLA-A2特異性錨定殘基，篩選存活蛋白蛋白質(zhì)的氨基酸序列尋找最可能的HLA-A2 11聚體肽表位。合成了六種存活蛋白衍生肽并檢測了其對HLA-A2的結(jié)合。沒有檢測到以與已知的陽性對照表位相似的高親和力結(jié)合的肽，所述陽性對照表位來自EB病毒BMLF280-288肽(GLCTLVAML)(SEQ ID NO72)(表4)。對于陽性對照，HLA-A2的半數(shù)最大回收所需的肽濃度(C50值)是0.9μM。比較起來，Sur18-28(RISTFKNWPFL)(SEQ ID NO67)和Sur86-96(FLSVKKQFEEL)(SEQID NO69)弱結(jié)合到HLA-A2(分別C50＝69μM和72μM)。然而，兩種已知的HLA-A2限制性存活蛋白表位以相似的方式弱結(jié)合到HLA-A2；Sur95-104(ELTLGEFLKL)(SEQ ID NO43)以中等親和力(C50＝10μM)結(jié)合而Sur96-104(LTLGEFLKL)(SEQ ID NO10)只是弱結(jié)合(C50＞100μM)。剩余四種所檢測的11-聚體肽(Sur4-14(PTLPPAWQPFL)(SEQ ID NO66)、Sur54-64(LAQCFFCFKEL)(SEQ IDNO68)、Sur88-98(SVKKQFEELTL)(SEQ ID NO70)、和Sur103-113(KLDRERAKNKI)(SEQ ID NO74))不結(jié)合到HLA-A2。
癌癥患者中針對存活蛋白衍生肽的HLA-A2限制性CTL反應(yīng)最初分析了來自10名癌癥患者(2名黑素瘤(Mel)、6名CLL(CLL)和2名乳腺癌(MC)患者)的PBL以研究兩種弱結(jié)合11聚體肽Sur18-28和Sur86-96是否由HLA-A2提呈并由癌癥患者的免疫系統(tǒng)識別。在10名所分析患者中的2名(CLL-1、CLL-2，圖14)的PBL中發(fā)現(xiàn)了針對Sur18-28的CTL反應(yīng)，而未檢測到針對Sur86-96的反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。為進(jìn)一步證實(shí)這些Sur18-28特異性反應(yīng)，分析了來自另外12名患者(7名黑素瘤、1名CLL和4名乳腺癌患者)的PBL針對此肽的CTL反應(yīng)性。在這些患者中，4名患者(CLL-3、MC-1、MC-2、Mel.A2-1)具有通過ELISPOT可檢測的Sur18-28特異性免疫活性(圖14)。因此，總共22名所分析患者中的6名的PBL具有針對Sur18-28的CTL反應(yīng)。
HLA-B7限制性存活蛋白表位的鑒定存活蛋白衍生肽對HLA-B7的結(jié)合篩選存活蛋白蛋白質(zhì)的氨基酸序列以尋找九到十個(gè)氨基酸組成的肽，所述肽含有根據(jù)HLA-B7的肽結(jié)合基序的錨定殘基。選出了5種肽并在裝配試驗(yàn)中分析了它們穩(wěn)定HLA-B7的能力。估計(jì)每種肽的C50值，其為HLA-B7的半最大穩(wěn)定化所需的肽濃度(表4)。兩個(gè)存活蛋白衍生肽sur6-14(LPPAWQPFL)(SEQ ID NO18)和sur11-19(QPFLKDHRI)(SEQID NO19)弱穩(wěn)定HLA-B7，所述肽具有超過100μM的C50值；而sur46-54(CPTENEPDL)(SEQ ID NO6)、sur51-59(EPDLAQCFF)(SEQ IDNO7)和sur34-43(TPERMAEAGF)(SEQ ID NO20)不結(jié)合到HLA-B7(表4)。
癌癥患者中針對存活蛋白衍生肽的HLA-B7限制性CTL反應(yīng)檢測了來自5名黑素瘤患者(mel25、mel26、mel3、mel6、mel39)、2名CLL患者(CLL1、CLL54)和2名乳腺癌患者(breast11、breast15)的HLA-B7陽性PBL針對弱HLA-B7結(jié)合肽sur6-14(LPPAWQPFL)(SEQ IDNO18)和sur11-19(QPFLKDHRI)(SEQ ID NO19)的T細(xì)胞反應(yīng)性。我們能夠在一名CLL患者和一名乳腺癌患者的PBL中檢測到針對存活蛋白衍生肽sur6-14的強(qiáng)自發(fā)性CTL反應(yīng)(圖15)。另外，我們能夠在黑素瘤患者mel3中檢測到針對此肽的弱反應(yīng)(圖15)。
癌癥患者中針對存活蛋白衍生肽的HLA等位基因限制性免疫反應(yīng)概述利用前面實(shí)施例所述的肽與MHC I類分子結(jié)合的裝配試驗(yàn)，測試了一系列包含9-11個(gè)氨基酸殘基的存活蛋白衍生肽對于下列HLA等位基因的結(jié)合HLA-A1、HLA-A3、HLA-A11和HLA-B7。另外，利用也如上所述的ELISPOT試驗(yàn)測試了幾種肽引發(fā)CTL免疫反應(yīng)的能力。
結(jié)果，包括前面實(shí)施例中所獲得的結(jié)果的概述在下面表4中給出
表4.所選擇的存活蛋白衍生肽的C50和ELISPOT數(shù)據(jù)
i通過ELISPOT觀察到的一名淋巴瘤患者(HEM34)中針對肽Sur112-120的反應(yīng)。ii通過ELISPOT檢測到的3名淋巴瘤患者(HEM9、11、34)中針對肽Sur53-62的反應(yīng)。iv通過ELISPOT觀察到的黑素瘤患者(FM-TIL95)中的弱反應(yīng)。vii通過ELISPOT觀察到的黑素瘤患者(PM6)中針對Sur112-121的反應(yīng)，該反應(yīng)在轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)懸液中最明顯，而在來自原發(fā)腫瘤的TIL和PBL中較弱。
viii通過ELISPOT在CLL患者(CLL9)中觀察到針對肽Sur6-14的反應(yīng)，并在淋巴瘤患者(HEM21)中觀察到較弱的反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例5利用存活蛋白衍生肽作為免疫原的治療試驗(yàn)方法概述用經(jīng)修飾的HLA-A2限制性存活蛋白表位，即sur1M2肽對5名嚴(yán)重預(yù)處理的IV期黑素瘤患者接種，所述表位由自愿使用(in a compassionateuse setting)的自體樹突細(xì)胞提呈。如通過ELISPOT試驗(yàn)所測的，4名患者產(chǎn)生針對此表位的強(qiáng)T細(xì)胞反應(yīng)。而且，原位肽/HLA-A2多聚體染色揭示出存活蛋白反應(yīng)性細(xì)胞浸潤到內(nèi)臟和軟組織轉(zhuǎn)移瘤(metastases)中。顯著地，未觀察到接種相關(guān)的毒性。這些數(shù)據(jù)證實(shí)誘導(dǎo)針對存活蛋白的T細(xì)胞反應(yīng)，甚至在晚期黑素瘤患者中誘導(dǎo)也是可行的，且這些接種是良好耐受的。
材料與方法患者合格標(biāo)準(zhǔn)和治療方案所有臨床方法均根據(jù)赫爾辛基宣言(Declaration of Helsinki)且在治療前為所有患者提供知情同意。當(dāng)至少兩種不同的化學(xué)的、免疫的或化學(xué)免疫治療后VI期皮膚或血管膜黑素瘤患者的病情仍然惡化時(shí)，他們適于用來研究。另外，患者必須18歲或以上，表達(dá)HLAA*0201并患有通過頭顱、胸部和腹部的計(jì)算層析X射線照相術(shù)掃描證實(shí)的可測量的疾病?；颊叩腒arnofsky指數(shù)必須為60％或更好。接種前的4周內(nèi)不允許有全身的化學(xué)、和/或免疫療法。重要的排除標(biāo)準(zhǔn)是CNS轉(zhuǎn)移、主動自身免疫或傳染性疾病、妊娠和哺乳、以及顯著的精神異常的證據(jù)。肽脈沖的樹突細(xì)胞如前所述產(chǎn)生(82)。簡言之，將來自白細(xì)胞除去法(leukapheresis)的PBMCs在LymphoprepTM(Nycomed Pharma)上分離，以等分試樣冷凍并儲存在液氮中。接種前的一周，將PBMCs解凍、洗滌并培養(yǎng)在含有慶大霉素、谷氨酰胺和熱滅活的自體血漿的培養(yǎng)基中。在第1和第5天，加入IL-4和GM-CSF。為分化成熟的DCs，在第6天加入TNF-γ和前列腺素E2。在第7天，將顯示出成熟DCs的表型和形態(tài)學(xué)特征即面紗(veiled)外觀和＝75％的CD83表達(dá)的細(xì)胞用經(jīng)修飾的衍生自存活蛋白的HLA-A2限制性存活蛋白96-104表位LMLGEFLKL(SEQ ID NO 10)(Clinalfa瑞士)14脈沖。只有當(dāng)?shù)?和第5天取自培養(yǎng)物的樣品的微生物測試證明是無菌的，才能將細(xì)胞用于接種。
對于前兩次接種，對患者以七天間隔進(jìn)行接種，然后以28天間隔進(jìn)行進(jìn)一步的接種。將總共10-20×106個(gè)成熟的存活蛋白96-104脈沖的DCs懸浮在含有1％人血清白蛋白的PBS中，并以每個(gè)注射部位1.5×106個(gè)DCs等分試樣在靠近局部淋巴結(jié)的大腿的腹內(nèi)側(cè)區(qū)域進(jìn)行皮內(nèi)注射。引流(draining)淋巴結(jié)被除去和/或輻射過的四肢除外。在不存在患者健康狀態(tài)嚴(yán)重惡化或出現(xiàn)CNS轉(zhuǎn)移的情況下，5次接種后重復(fù)白細(xì)胞除去法。
臨床和免疫反應(yīng)的測量接種前和接種后每三個(gè)月或如果有疾病發(fā)展的嚴(yán)重臨床病征時(shí)，進(jìn)行CT掃描。為檢測存活蛋白96-104特異性的IFN-γ釋放，每三個(gè)月利用PBMCs通過ELISPOT試驗(yàn)監(jiān)視免疫反應(yīng)。為增加ELISPOT試驗(yàn)的靈敏度，在10μM肽存在下，在24孔板(Nunc，丹麥)中以每ml 1×106個(gè)細(xì)胞的濃度體外刺激PBMCs一次，所述細(xì)胞存在于添加了5％熱滅活的人血清和2mM L-谷氨酰胺的X-vivo培養(yǎng)基(Bio Whittaker，Walkersville，Maryland)中。兩天后，加入40IU/ml的重組白介素-2(IL-2)(Chiron，Ratingen，德國)。10天后測試細(xì)胞反應(yīng)性。為此，用抗IFN-γ抗體(1-D1KMabtech，瑞典)包被硝酸纖維素底的96孔板(MultiScreen MAIP N45，Millipore，Glostrup，丹麥)。以每孔200μl X-vivo培養(yǎng)基中104-105個(gè)細(xì)胞加入淋巴細(xì)胞連同104個(gè)T2細(xì)胞和終濃度為2μM的相應(yīng)肽。在37℃下過夜孵育和兩次洗滌后，加入生物素化的檢測抗體(7-B6-1-生物素，Mabtech，瑞典)，利用堿性磷酸酶-抗生物素蛋白連同各自的底物(GibcoBRL)顯現(xiàn)其特異性結(jié)合。當(dāng)暗紫色斑點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)終止此反應(yīng)，所述斑點(diǎn)利用AlphaImager系統(tǒng)(Alpha Innotech，San Leandro，CA，美國)來定量。
還通過多聚化存活蛋白96-104/HLA-A*0201復(fù)合體在接種部位以及內(nèi)臟、軟組織或皮膚轉(zhuǎn)移瘤原位追蹤了存活蛋白96-104/HLA-A*0201反應(yīng)性CD8+T淋巴細(xì)胞。在所有患者中皮內(nèi)注射24小時(shí)后將免疫部位切除，如果容易得到，只將選定患者(患者KN和GB)中的轉(zhuǎn)移性病灶除去，或在治療目的(curative intent)中除去(患者WW)。對于多聚體肽/MHC復(fù)合體的染色方法最近已有描述(68)。通過在HLA-A*0201胞外結(jié)構(gòu)域(殘基1-275)的5’端引入酶促生物素化識別位點(diǎn)來產(chǎn)生多聚化的存活蛋白96-104/HLA-A*0201復(fù)合體。通過大小排阻(Sephadex G25，Pharmacia，Erlangen，德國)和離子交換(mono-Q，Pharmacia)層析來純化重組蛋白質(zhì)，并在各自肽和β2-微球蛋白存在下通過稀釋使所述重組蛋白質(zhì)折疊。在Sephadex G25柱上凝膠過濾后，用連接到葡聚糖分子的鏈霉親和素-FITC(由丹麥哥本哈根DAKO的L.Winther友情提供)將所述蛋白質(zhì)多聚化以產(chǎn)生多價(jià)的HLA-葡聚糖復(fù)合體。將各自樣品的冷藏切片干燥過夜并隨后在冷丙酮中固定5分鐘。所有孵育步驟均在黑暗中室溫下如下進(jìn)行(i)抗-CD8抗體(1∶100，克隆HIT8a，Pharmingen，San Diego，CA)45分鐘，(ii)Cy3-連接的山羊抗小鼠(1∶500稀釋，編號115-165-100，Dianova，漢堡，德國)45分鐘，最后(iii)多聚體75分鐘。每步驟之間在PBS/BSA 0.1％中洗滌載玻片兩次10分鐘。最后，將載玻片在vectashield中封片并在Leica共焦顯微鏡(TCS 4D，Leica，曼海姆，德國)下觀察。
結(jié)果患者特征、毒性和臨床發(fā)病病程5個(gè)極晚期的IV期黑素瘤患者得以參加，兩名患有血管膜黑素瘤、一名患有軟組織黑素瘤而剩余兩名患有皮膚黑素瘤。由于癥狀性腦轉(zhuǎn)移的表現(xiàn)，一名患者在兩次接種后取消治療。其它4名患者接受治療多達(dá)15次接種。一名患者在剩余轉(zhuǎn)移瘤的外科切除術(shù)后在無腫瘤狀態(tài)下死于心博停止。另一名患者(RW)在10次接種后由于內(nèi)臟轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)而取消治療。一名患者在15次接種后繼續(xù)進(jìn)行研究。在表5中概述了詳細(xì)的患者特征、先前的治療、接種的次數(shù)和存活狀態(tài)。
無較大的毒性發(fā)生。因此，血紅蛋白、白細(xì)胞和血小板以及乳酸脫氫酶、肌酸酐和膽堿酯酶未受接種治療的影響(圖16)。在注射部位未觀察到全身或局部毒性的病征。而且，未檢測到受損傷口的治愈、出血病癥、心臟功能異常、脈管炎和炎性腸病。在一名患者(WW)中，預(yù)先存在的肝轉(zhuǎn)移在接種治療下能夠得以穩(wěn)定，但仍出現(xiàn)了新的腎上腺轉(zhuǎn)移。不幸的是，此患者由于心搏停止而死亡，盡管治療性手術(shù)后無腫瘤。接種開始后僅4周在患者PB中檢測到腦轉(zhuǎn)移。因此，在僅僅兩次DC注射后，不得不將此患者排除在進(jìn)一步的接種之外。其它3名患者表現(xiàn)出在他們的一般健康狀態(tài)下無實(shí)質(zhì)損傷的轉(zhuǎn)移性疾病的慢速發(fā)展。顯著地，對于患者KN，能夠達(dá)到13個(gè)月的總體生存(從接種開始到死亡)，盡管在接種開始時(shí)有嚴(yán)重的轉(zhuǎn)移性負(fù)荷(load)和快速的疾病發(fā)展。患者GB在用存活蛋白肽脈沖的DCs接種開始后的14個(gè)月仍保持在方案中。然而，應(yīng)該注意，兩名患者(RW和GB)都接受過用于腫瘤控制的其他局部治療皮下腫瘤的放射療法(RW)或局部化學(xué)療法(GB)。
存活蛋白特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)為監(jiān)視細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)的動力學(xué)，通過IFN-γ的ELISPOT試驗(yàn)測試接種前和接種后三個(gè)月所獲得的PBMCs對于經(jīng)修飾的存活蛋白96-104表位的反應(yīng)性。分析前，為增加試驗(yàn)的靈敏度在體外刺激PBMCs一次。在所有4名所測試的患者中，存活蛋白96-104反應(yīng)性T細(xì)胞的誘導(dǎo)是明顯的(圖17)。針對其它HLA-A*0201限制性存活蛋白肽，即未修飾的存活蛋白96-104和鄰近的Sur9表位的反應(yīng)性分析證實(shí)了在兩名患者(KN和RW)中針對這些肽的T細(xì)胞反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。
在外周血液中腫瘤特異性T細(xì)胞反應(yīng)測量的預(yù)后和臨床價(jià)值已被反復(fù)置疑；因此，我們還在原位通過肽/MHC多聚體染色，測試了腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中存活蛋白96-104/HLA-A*0201反應(yīng)性CD8+T淋巴細(xì)胞的存在。為證實(shí)此方法，我們首先分析了來自24小時(shí)內(nèi)發(fā)生在接種部位的遲發(fā)型超敏反應(yīng)的組織樣品。此分析證實(shí)了早期觀察肽脈沖的DC的皮內(nèi)注射誘導(dǎo)強(qiáng)烈的肽特異性炎性T細(xì)胞浸潤。隨后，將肽/MHC多聚體染色方法應(yīng)用于軟組織和內(nèi)臟轉(zhuǎn)移瘤，顯示了在CD8+浸潤中存活蛋白96-104/HLA-A*0201反應(yīng)性細(xì)胞的存在。此觀察表明接種不僅誘導(dǎo)具有預(yù)期特異性的T細(xì)胞，而且賦予它們必要的歸巢(homing)能力。
表5.接種試驗(yàn)患者特征概述
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序列表<110>E·P·T·施特拉騰M·H·安諾生<120>存活蛋白衍生肽及其用途<130>31757PC0l<150>US 60/352,284<151>2003-01-30<160>85<170>FastSEQ for Windows版本4.0<210>1<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>Sur53K9肽<400>69Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu1 5 10<210>70<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Sur53K9肽<400>70
Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu1 5 10<210>71<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Sur53K9肽<400>71Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys Ile1 5 10<210>72<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Sur53K9肽<400>72Gly Leu Cys Thr Leu Val Ala Met Leu1 5<210>73<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Sur53K9肽<400>73Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val1 5<210>74<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Sur53K9肽<400>74Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His Lys1 5<210>75<211>10
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Sur53K9肽<400>75Arg Leu Gln Glu Glu Arg Thr Cys Lys Val1 5 10<210>76<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Sur53K9肽<400>76Gln Leu Cys Pro Ile Cys Arg Ala Pro Val1 5 10<210>77<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Sur53K9肽<400>77Arg Leu Ala Ser Phe Tyr Asp Trp Pro Leu1 5 10<210>78<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Sur53K9肽<400>78Leu Leu Arg Ser Lys Gly Arg Asp Phe Val1 5 10<210>79<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Sur53K9肽
<400>79Val Leu Glu Pro Pro Gly Ala Arg Asp Val15 10<210>80<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Sur53K9肽<400>80Pro Leu Thr Ala Glu Val Pro Pro Glu Leu1 5 10<210>81<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Sur53K9肽<400>81Ser Leu Gly Ser Pro Val Leu Gly Leu1 5<210>82<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Sur53K9肽<400>82Gln Ile Leu Gly Gln Leu Arg Pro Leu1 5<210>83<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Sur53K9肽<400>83Leu Thr Ala Glu Val pro Pro Glu Leu1 5<210>84
<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Sur53K9肽<400>84Gly Met Gly Ser Glu Glu Leu Arg Leu1 5<210>85<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Sur53K9肽<400>85Glu Leu Pro Thr Pro Arg Arg Glu Val1 權(quán)利要求
1.衍生自存活蛋白的MHC I類限制性表位肽，所述表位具有至少一種下列特征(i)能夠以一定親和力結(jié)合限制該表位的I類HLA分子，其中所述親和力使用如文中描述的裝配結(jié)合測定法測定以能夠半數(shù)最大回收I類HLA分子的肽量(C50值)表示最多為50μM，(ii)能夠以每104個(gè)PBLs至少1個(gè)的頻率引發(fā)癌癥患者的PBL群體中的產(chǎn)生INF-γ的細(xì)胞，所述頻率可以通過ELISPOT試驗(yàn)確定，和/或(iii)能夠原位檢測腫瘤組織中與所述表位肽起反應(yīng)的CTLs。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其具有最多為30μM的C50值。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任意一項(xiàng)的肽，其具有最多為20μM的C50值。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的肽，該肽受限于MHC I類HLA-A分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的肽，該肽受限于MHC I類HLA種類，所述HLA種類選自HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11和HLA-A24。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的肽，該肽受限于HLA-A2。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任意一項(xiàng)的肽，該肽選自FLKLDRERA(SEQID NO1)、TLPPAWQPFL(SEQ ID NO2)、ELTLGEFLKL(SEQ IDNO3)、LLLGEFLKL(SEQ ID NO4)和LMLGEFLKL(SEQID NO5)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的肽，該肽受限于MHC I類HLA-B分子。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的肽，該肽受限于MHC I類HLA-B種類，所述HLA-B種類選自HLA-B7、HLA-B35、HLA-B44、HLA-B8、HLA-B15、HLA-B27和HLA-B51。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的肽，該肽受限于HLA-B35或HLA-B7。
11.根據(jù)權(quán)利要求8-10中任意一項(xiàng)的肽，該肽選自CPTENEPDL(SEQID NO6)、EPDLAQCFF(SEQ ID NO7)、CPTENEPDY(SEQ ID NO8)、EPDLAQCFY(SEQ ID NO9)、LPPAWQPFL(SEQ ID NO18)和QPFLKDHRI(SEQ ID NO19)。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的肽，其含有至多20個(gè)氨基酸殘基。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的肽，其含有至多10個(gè)氨基酸殘基。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的肽，該肽為九肽或十肽。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的肽，該肽為哺乳動物物種的存活蛋白的天然序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的肽，其衍生自人存活蛋白。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的肽，該肽通過替換、缺失或添加至少一個(gè)氨基酸殘基而衍生自存活蛋白的天然序列。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的肽，該肽為磷酸化的。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的肽，該肽包含US6.245.523中所公開的天然存活蛋白的Thr34。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的肽，對于每一特定的HLA等位基因，該肽包含如下列表中所顯示的氨基酸殘基的任意一個(gè)
21.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的肽，其能夠以每104個(gè)PBLs至少10個(gè)的頻率在癌癥患者的PBL群體中引發(fā)產(chǎn)生INF-γ的細(xì)胞。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的肽，該肽能夠在患有表達(dá)存活蛋白的癌癥疾病患者的PBL群體中引發(fā)產(chǎn)生INF-γ的細(xì)胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的肽，其中癌癥疾病選自包括慢性淋巴細(xì)胞性白血病和慢性髓性白血病的造血惡性腫瘤、黑素瘤、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和前列腺癌。
24.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的肽，該肽能夠在患有癌癥疾病的患者的PBL群體中引發(fā)產(chǎn)生INF-γ的細(xì)胞，所述產(chǎn)生INF-γ的細(xì)胞具有針對癌細(xì)胞系的存活蛋白表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)，所述癌細(xì)胞系包括選自乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和黑素瘤細(xì)胞系FM3的細(xì)胞系。
25.藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1-24任意一項(xiàng)的肽。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求4的肽與根據(jù)權(quán)利要求8的肽的聯(lián)合。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求6的肽與根據(jù)權(quán)利要求10的肽的聯(lián)合。
28.根據(jù)權(quán)利要求25-27任意一項(xiàng)的組合物，該組合物是能夠引發(fā)針對癌癥疾病的免疫反應(yīng)的疫苗。
29.根據(jù)權(quán)利要求25-28中任意一項(xiàng)的組合物，其還含有免疫原性蛋白質(zhì)或者肽片段，所述蛋白質(zhì)或肽片段選自不屬于或衍生自存活蛋白蛋白質(zhì)家族的蛋白質(zhì)或者肽片段。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的組合物，其中不屬于或衍生自存活蛋白蛋白質(zhì)家族的蛋白質(zhì)或肽片段是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡的蛋白質(zhì)或其肽片段。
31.根據(jù)權(quán)利要求29的組合物，其中選自不屬于或衍生自存活蛋白蛋白質(zhì)家族的蛋白質(zhì)或其肽片段的免疫原性蛋白質(zhì)或肽片段是Bcl-2或其肽片段。
32.根據(jù)權(quán)利要求25-31任意一項(xiàng)的組合物，該組合物是多表位疫苗。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的組合物，其中疫苗能夠引發(fā)針對其中表達(dá)存活蛋白的癌癥疾病的免疫反應(yīng)。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的組合物，其中癌癥疾病選自包括慢性淋巴細(xì)胞性白血病和慢性髓性白血病的造血惡性腫瘤、黑素瘤、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和前列腺癌。
35.根據(jù)權(quán)利要求33或34的組合物，其中疫苗在接種的受試者中引發(fā)產(chǎn)生具有針對癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)的效應(yīng)T細(xì)胞。
36.組合物，其用于先體外后體內(nèi)或原位診斷PBLs中或腫瘤組織中存活蛋白反應(yīng)性T細(xì)胞的存在，該組合物含有根據(jù)權(quán)利要求1的肽。
37.診斷試劑盒，其用于先體外后體內(nèi)或原位診斷PBLs中或腫瘤組織中存活蛋白反應(yīng)性T細(xì)胞的存在，該試劑盒包含根據(jù)權(quán)利要求1-24任意一項(xiàng)的肽。
38.根據(jù)權(quán)利要求1的肽與I類HLA分子或此分子的片段的復(fù)合體。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的復(fù)合體，該復(fù)合體是單體的。
40.根據(jù)權(quán)利要求38的復(fù)合體，該復(fù)合體是多聚體的。
41.檢測存活蛋白反應(yīng)性T細(xì)胞存在的方法，該方法包括將腫瘤組織或血液樣品與根據(jù)權(quán)利要求38的復(fù)合體接觸并檢測所述復(fù)合體與所述組織或血細(xì)胞的結(jié)合。
42.分子，其能夠特異結(jié)合根據(jù)權(quán)利要求1-24任意一項(xiàng)的肽。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的分子，該分子是抗體或其片段。
44.分子，其能夠阻斷根據(jù)權(quán)利要求42或43的分子的結(jié)合。
45.權(quán)利要求1-24中任意一項(xiàng)所定義的肽的用途，用于制備治療癌癥的藥物。
46.根據(jù)權(quán)利要求25的組合物、根據(jù)權(quán)利要求42的分子或根據(jù)權(quán)利要求44的分子的用途，用于制備治療癌癥的藥物。
47.根據(jù)權(quán)利要求45或46的用途，其中所要治療的疾病是其中表達(dá)存活蛋白的癌癥疾病。
48.根據(jù)權(quán)利要求46的用途，其中癌癥疾病選自包括慢性淋巴細(xì)胞性白血病和慢性髓性白血病的造血惡性腫瘤、黑素瘤、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和前列腺癌。
49.根據(jù)權(quán)利要求45-48任意一項(xiàng)的用途，該用途與其他治療相結(jié)合。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的用途，其中所述其他治療是放射療法或化學(xué)療法。
全文摘要
本發(fā)明涉及衍生自腫瘤相關(guān)抗原存活蛋白的MHC I類限制性肽，此肽能夠以高親和力結(jié)合I類HLA分子，能夠在癌癥患者的PBL群體中引發(fā)產(chǎn)生INF－γ的細(xì)胞，并且能夠原位檢測腫瘤組織中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，還涉及含有所述肽的治療和診斷組合物和其用途。
文檔編號A61K38/00GK1767848SQ200480007052
公開日2006年5月3日 申請日期2004年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月30日
發(fā)明者E·P·T·施特拉騰, M·H·安諾生 申請人:蘇瓦克有限公司