專利名稱：：聚乙二醇連接的glp－1化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及共價連接有一個或多個聚乙二醇分子的GLP-1化合物或其衍生物，并涉及可用于治療這樣的疾病或病癥的相關(guān)組合物和方法，其中所述疾病或病癥可通過降低血糖、降低食物吸收、降低胃腸排空或者降低胃腸蠕動而受益。
背景技術(shù)：
：胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)引起多種生物學(xué)效應(yīng)，例如刺激胰島素的分泌、抑制胰高血糖素的分泌、抑制胃的排空、抑制胃的蠕動或者腸的蠕動、增強葡萄糖的利用和引起體重降低。GLP-1可以進一步阻止胰腺β-細胞退化，胰腺β-細胞退化作為非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)的發(fā)展進程而出現(xiàn)。GLP-1的明顯特征是其具有刺激胰島素分泌而不出現(xiàn)低血糖癥相關(guān)危險的能力，該種低血糖癥相關(guān)危險在使用胰島素治療或者通過增加胰島素表達的一些類型的經(jīng)口治療中可以見到。GLP-1(1-37)活性很差并且兩種天然存在的截短肽即GLP-1(7-37)OH和GLP-1(7-36)NH2在體內(nèi)被迅速清除并且體內(nèi)的半衰期極短，該事實限制了涉及GLP-1肽的治療有效性。已知內(nèi)源產(chǎn)生的二肽酰肽酶IV(DPP-IV)通過移去N-末端組氨酸和丙氨酸殘基而使循環(huán)中的GLP-1肽失活，并且這是GLP-1肽體內(nèi)半衰期短的主要原因。已經(jīng)采取了多種方法使得在保持生物學(xué)活性的同時延長GLP-1肽的消除半衰期或者降低肽從體內(nèi)的清除率。美國專利號5,705,483教導(dǎo)了通過在肽的N-末端進行修飾使GLP-1肽類似物能夠抵抗DPP-IV的降解。延長GLP-1肽半衰期的一個備選方法是衍生化作用，其中將能夠阻止DPP-IV接近肽N-末端的大的酰基連接在GLP-1的多種氨基酸上(見1997年8月22日申請的題目為“GLP-1衍生物”的國際申請?zhí)朠CT/DK97/00340，其要求1996年8月30日申請的丹麥臨時申請?zhí)?931/96、1996年11月8日申請的丹麥臨時申請?zhí)?259/96和1996年12月20日申請的丹麥臨時申請?zhí)?470/96的權(quán)利)。特定的GLP-1類似物描述于2002年1月8日申請的美國專利申請系列號60/346474，以及2002年8月21日申請的美國專利申請系列號60/405,097，現(xiàn)在為2003年1月3日申請的國際申請?zhí)朠CT/US03/058203，它們的題目均為“延長的胰高血糖素樣肽-1類似物”并在文中全文引用作為參考。這些申請描述了GLP-1(7-37)OH的類似物，其中當將多種氨基酸添加到C-末端時可以得到與天然分子相比半衰期延長和清除率降低的GLP-1肽類似物。進而，具有增強潛能的GLP-1類似物描述于2001年8月23日申請的美國專利申請系列號60/314,573，現(xiàn)在為2002年8月14日申請的題目為“胰高血糖素樣肽-1類似物”的國際申請?zhí)朠CT/US02/21325(文中進行引用)。在包括胰島素分泌細胞在內(nèi)的一些細胞類型中exendin-4可以在體外(invitro)的GLP-1受體處起作用。[Goke等，J.Biol.Chem.，(1993)26819650-19655]。特定的PEG化(PEGylated)的exendin和exendin激動劑分子描述于國際申請?zhí)朠CT/US00/11814(在文中進行全文引用)。在用多種方法使GLP-1化合物與天然GLP-1相比具有更長半衰期和更大潛能的同時，也采用了另外的方法，有必要單獨使用該方法或與已知的方法聯(lián)合使用以進一步降低GLP-1化合物的清除率和提高GLP-1化合物的半衰期，從而優(yōu)化其能力使得其可以作為治療劑，該治療劑可以在較長時間階段內(nèi)以最少次數(shù)進行施用。將一個或多個分子的聚乙二醇共價連接到小的生物學(xué)活性肽諸如GLP-1或者exendin-4上會造成引入不利特性的危險，例如分子的不穩(wěn)定性和生物活性降低，該種危險可以嚴重到使所述分子不適用于治療。然而，本發(fā)明是基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即將一個或多個分子的PEG共價連接到GLP-1化合物的特定殘基上會導(dǎo)致產(chǎn)生具有生物學(xué)活性的、與天然GLP-1或者Val8-GLP-1相比(或者是相對于本發(fā)明的經(jīng)修飾exendin-4肽的天然exendin-4)半衰期延長和清除率降低的、PEG化GLP-1化合物。本發(fā)明的PEG化GLP-1化合物作為治療劑與天然GLP-1相比具有更大的有效性且更加方便，因為PEG化GLP-1化合物保留了天然GLP-1的全部或者部分的生物學(xué)活性并且與天然GLP-1化合物或者Val8-GLP-1(7-37)OH相比又具有延長的半衰期和/或降低的清除率。GLP-1(7-37)的血清半衰期僅為3-5分鐘。當皮下施用時GLP-1(7-36)酰胺可以作用大約50分鐘的時間。甚至能夠抵抗內(nèi)源蛋白酶裂解的GLP-1類似物和衍生物也沒有足夠長的半衰期以避免在24小時的階段內(nèi)進行重復(fù)施用。本發(fā)明的PEG化GLP-1化合物具有超過24小時的半衰期，這允許PEG化GLP-1化合物較少施用的同時在延長的時間階段內(nèi)維持化合物的高血液水平。此類PEG化GLP-1化合物可以在治療上使用以治療患有包括但不限于糖尿病、肥胖癥、胃和/或腸蠕動異常和胃和/或腸排空異常的疾病的受試者，具體優(yōu)點是在24小時的階段內(nèi)需要的本發(fā)明PEG化GLP-1化合物的劑量較少，在對需要此種治療的受試者的便利方面和受試者對劑量需求的順從可能性方面均有提高。發(fā)明概述文中闡述的本發(fā)明提供了共價連接有一個或多個聚乙二醇(PEG)分子的GLP-1化合物或者它們的衍生物，其中每一個PEG連在肽的Cys或者Lys氨基酸上或者羧基末端上，這導(dǎo)致產(chǎn)生了消除半衰期至少為1小時、優(yōu)選地至少為3、5、7、10、15、20小時并且最優(yōu)選地至少為24小時的PEG化GLP-1化合物。本發(fā)明的PEG化GLP-1化合物優(yōu)選地具有200ml/h/kg或者更少的清除率值，更加優(yōu)選地是180、150、120、100、80、60ml/h/kg或者更小并且最優(yōu)選地小于50、40或者20ml/h/kg。本發(fā)明的一個實施方案是包含如SEQIDNO1所示的GLP-1(7-37)OH氨基酸序列和在其選自Lys26、Lys34和Gly37的3個、2個或者1個殘基處共價連接有PEG分子的PEG化GLP-1化合物7His-Ala-Glu-10Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-15Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-20Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-25Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-30Ala-Trp-Leu-Val-Lys-35Gly-Arg-37Gly(SEQIDNO1)本發(fā)明的另一個實施方案是包含如SEQIDNO2所示的GLP-1(7-36)NH2氨基酸序列和在其選自Lys26、Lys34和Arg36的3個、2個或者1個殘基處共價連接有PEG分子的PEG化GLP-1化合物7His-Ala-Glu-10Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-15Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-20Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-25Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-30Ala-Trp-Leu-Val-Lys-35Gly-Arg(SEQIDNO2)本發(fā)明的另一個實施方案是包含式I(SEQIDNO3)的氨基酸序列的PEG化GLP-1化合物Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Xaa11-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37式I(SEQIDNO3)其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨組氨酸、2-氨基組氨酸、β-羥基組氨酸、高組氨酸(homohistidine)、α-氟甲基組氨酸或者α-甲基組氨酸；Xaa8是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Ser或者Thr；Xaa11是Thr或者Cys；Xaa12是Phe、Trp、Tyr或者Cys；Xaa16是Val、Trp、Ile、Leu、Phe、Tyr或者Cys；Xaa18是Ser、Trp、Tyr、Phe、Lys、Ile、Leu或者Val；Xaa19是Tyr、Trp或者Phe；Xaa20是Leu、Phe、Tyr或者Trp；Xaa22是Gly、Glu、Asp、Lys或者Cys；Xaa23是Gln或者Cys；Xaa24是Ala或者Cys；Xaa25是Ala、Val、Ile、Leu或者Cys；Xaa26是Lys或者Cys；Xaa27是Glu、Ile、Ala或者Cys；Xaa30是Ala、Glu或者Cys；Xaa33是Val或者Ile；Xaa34是Lys或者Cys；Xaa35是Gly或者Cys；Xaa36是Arg或者Cys；Xaa37是Gly、His、Cys、NH2或者缺乏；并且其中2個或者1個Cys殘基共價連接有PEG分子，或者3個、2個或者1個Lys殘基共價連接有PEG分子，或者羧基末端氨基酸共價連接有PEG分子；并且條件是在分子中具有2個、1個或者0個Cys。本發(fā)明的另一個實施方案是包含式II(SEQIDNO4)的氨基酸序列的PEG化GLP-1化合物Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Xaa11-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37式II(SEQIDNO4)其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨組氨酸、2-氨基組氨酸、β-羥基組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基組氨酸或者α-甲基組氨酸；Xaa8是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser或者Thr；Xaa11是Thr或者Cys；Xaa12是Phe或者Cys；Xaa16是Val、Phe、Tyr、Trp或者Cys；Xaa18是Ser、Tyr、Trp、Phe、Lys、Ile、Leu或者Val；Xaa19是Tyr或者Phe；Xaa22是Gly、Glu、Asp、Lys或者Cys；Xaa23是Gln或者Cys；Xaa24是Ala或者Cys；Xaa25是Ala、Val、Ile、Leu或者Cys；Xaa26是Lys或者Cys；Xaa27是Glu或者Cys；Xaa30是Ala或者Cys；Xaa33是Val或者Ile；Xaa34是Lys或者Cys；Xaa35是Gly或者Cys；Xaa36是Arg或者Cys；和Xaa37是Gly、Cys、NH2或者缺乏，并且其中2個或者1個Cys殘基共價連接有PEG分子，或者3個、2個或者1個Lys殘基共價連接有PEG分子，或者羧基末端氨基酸共價連接有PEG分子；并且條件是在分子中具有2個、1個或者0個Cys。本發(fā)明的另一個實施方案是包含式III(SEQIDNO5)的氨基酸序列的PEG化GLP-1化合物Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Xaa11-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47-Xaa48-Xaa49-Xaa50式III(SEQIDNO5)其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨組氨酸、2-氨基組氨酸、β-羥基組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基組氨酸或者α-甲基組氨酸；Xaa8是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Ser或者Thr；Xaa11是Thr或者Cys；Xaa12是Phe、Trp、Tyr或者Cys；Xaa16是Val、Trp、Ile、Leu、Phe、Tyr或者Cys；Xaa18是Ser、Trp、Tyr、Phe、Lys、Ile、Leu或者Val；Xaa19是Tyr、Trp或者Phe；Xaa20是Leu、Phe、Tyr或者Trp；Xaa22是Gly、Glu、Asp、Lys或者Cys；Xaa23是Gln或者Cys；Xaa24是Ala或者Cys；Xaa25是Ala、Val、Ile、Leu或者Cys；Xaa26是Lys或者Cys；Xaa27是Glu、Ile、Ala或者Cys；Xaa30是Ala、Glu或者Cys；Xaa33是Val或者Ile；Xaa34是Lys、Asp、Arg、Glu或者Cys；Xaa35是Gly或者Cys；Xaa36是Gly、Pro、Arg或者Cys；Xaa37是Gly、Pro、Ser或者Cys；Xaa38是Ser、Pro、His或者Cys；Xaa39是Ser、Arg、Thr、Trp、Lys或者Cys；Xaa40是Ser、Gly或者Cys；Xaa41是Ala、Asp、Arg、Glu、Lys、Gly或者Cys；Xaa42是Pro、Ala、Cys或者NH2或者缺乏；Xaa43是Pro、Ala、Cys、NH2或者缺乏；Xaa44是Pro、Ala、Arg、Lys、His、Cys、NH2或者缺乏；Xaa45是Ser、His、Pro、Lys、Arg、Gly、Cys、NH2或者缺乏；Xaa46是His、Ser、Arg、Lys、Pro、Gly、Cys、NH2或者缺乏；并且Xaa47是His、Ser、Arg、Lys、Cys、NH2或者缺乏；Xaa48是Gly、His、Cys、NH2或者缺乏；Xaa49是Pro、His、Cys、NH2或者缺乏；Xaa50是Ser、His、Cys、Ser-NH2、His-NH2、Cys-NH2或者缺乏；并且其中2個或者1個Cys殘基共價連接有PEG分子，或者3個、2個或者1個Lys殘基共價連接有PEG分子，或者羧基末端氨基酸共價連接有PEG分子；并且條件是如果Xaa42、Xaa43、Xaa44、Xaa45、Xaa46、Xaa47、Xaa48或者Xaa49缺乏時則下游的每一氨基酸缺乏；并且條件是在分子中具有2個、1個或者0個Cys。本發(fā)明的另一個實施方案是包含式IV(SEQIDNO6)的氨基酸序列的PEG化GLP-1化合物Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Xaa11-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47式IV(SEQIDNO6)其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨組氨酸、2-氨基組氨酸、β-羥基組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基組氨酸或者α-甲基組氨酸；Xaa8是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Ser或者Thr；Xaa11是Thr或者Cys；Xaa12是Phe、Trp、Tyr或者Cys；Xaa16是Val、Trp、Ile、Leu、Phe、Tyr或者Cys；Xaa18是Ser、Trp、Tyr、Phe、Lys、Ile、Leu或者Val；Xaa19是Tyr、Trp或者Phe；Xaa20是Leu、Phe、Tyr或者Trp；Xaa22是Gly、Glu、Asp、Lys或者Cys；Xaa23是Gln或者Cys；Xaa24是Ala或者Cys；Xaa25是Ala、Val、Ile、Leu或者Cys；Xaa26是Lys或者Cys；Xaa27是Glu、Ile、Ala或者Cys；Xaa30是Ala、Glu或者Cys；Xaa33是Val或者Ile；Xaa34是Lys、Asp、Arg、Glu或者Cys；Xaa35是Gly或者Cys；Xaa36是Gly、Pro、Arg或者Cys；Xaa37是Gly、Pro、Ser或者Cys；Xaa38是Ser、Pro、His或者Cys；Xaa39是Ser、Arg、Thr、Trp、Lys或者Cys；Xaa40是Ser、Gly或者Cys；Xaa41是Ala、Asp、Arg、Glu、Lys、Gly或者Cys；Xaa42是Pro、Ala、Cys、NH2或者缺乏；Xaa43是Pro、Ala、Cys、NH2或者缺乏；Xaa44是Pro、Ala、Arg、Lys、His、Cys、NH2或者缺乏；Xaa45是Ser、His、Pro、Lys、Arg、Cys、NH2或者缺乏；Xaa46是His、Ser、Arg、Lys、Cys、NH2或者缺乏；并且Xaa47是His、Ser、Arg、Lys、Cys、NH2或者缺乏；并且其中2個或者1個Cys殘基共價連接有PEG分子，或者3個、2個或者1個Lys殘基共價連接有PEG分子，或者羧基末端氨基酸共價連接有PEG分子；并且條件是如果Xaa42、Xaa43、Xaa44、Xaa45或者Xaa46缺乏時則下游的每一氨基酸缺乏；并且條件是在分子中具有2個、1個或者0個Cys。本發(fā)明的另一個實施方案是包含式V(SEQIDNO7)的氨基酸序列的PEG化GLP-1化合物Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Xaa11-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Ser-Tyr-Lys-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47式V(SEQIDNO7)其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨組氨酸、2-氨基組氨酸、β-羥基組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基組氨酸或者α-甲基組氨酸；Xaa8是Gly、Val、Leu、Ile、Ser或者Thr；Xaa11是Thr或者Cys；Xaa12是Phe或者Cys；Xaa16是Val、Trp、Ile、Leu、Phe、Tyr或者Cys；Xaa22是Gly、Glu、Asp、Lys或者Cys；Xaa23是Gln或者Cys；Xaa24是Ala或者Cys；Xaa25是Ala、Val、Ile、Leu或者Cys；Xaa26是Lys或者Cys；Xaa27是Glu或者Cys；Xaa30是Ala或者Cys；Xaa33是Val或者Ile；Xaa34是Lys、Asp、Arg、Glu或者Cys；Xaa35是Gly或者Cys；Xaa36是Gly、Pro、Arg或者Cys；Xaa37是Gly、Pro、Ser或者Cys；Xaa38是Ser、Pro、His或者Cys；Xaa39是Ser、Arg、Thr、Trp、Lys或者Cys；Xaa40是Ser、Gly或者Cys；Xaa41是Ala、Asp、Arg、Glu、Lys、Gly或者Cys；Xaa42是Pro、Ala或者Cys；Xaa43是Pro、Ala或者Cys；Xaa44是Pro、Ala、Arg、Lys、His、Cys、NH2或者缺乏；Xaa45是Ser、His、Pro、Lys、Arg、Cys、NH2或者缺乏；Xaa46是His、Ser、Arg、Lys、Cys、NH2或者缺乏；并且Xaa47是His、Ser、Arg、Lys、Cys、NH2或者缺乏；并且其中2個或者1個Cys殘基共價連接有PEG分子，或者3個、2個或者1個Lys殘基共價連接有PEG分子，或者羧基末端氨基酸共價連接有PEG分子；并且條件是如果Xaa44、Xaa45、Xaa46或者Xaa47缺乏時則下游的每一氨基酸缺乏；并且條件是在分子中具有2個、1個或者0個Cys。本發(fā)明的另一個實施方案是包含式VI(SEQIDNO8)的氨基酸序列的PEG化GLP-1化合物Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Xaa11-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Ser-Tyr-Lys-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47式VI(SEQIDNO8)其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨組氨酸、2-氨基組氨酸、β-羥基組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基組氨酸或者α-甲基組氨酸；Xaa8是Gly、Val、Leu、Ile、Ser或者Thr；Xaa11是Thr或者Cys；Xaa12是Phe或者Cys；Xaa16是Val或者Cys；Xaa22是Gly、Glu、Asp、Lys或者Cys；Xaa23是Gln或者Cys；Xaa24是Ala或者Cys；Xaa25是Ala、Val、Ile、Leu或者Cys；Xaa26是Lys或者Cys；Xaa27是Glu或者Cys；Xaa30是Ala或者Cys；Xaa33是Val或者Ile；Xaa34是Lys或者Cys；Xaa35是Gly或者Cys；Xaa36是Gly或者Cys；Xaa37是Pro或者Cys；Xaa38是Ser、Pro、His或者Cys；Xaa39是Ser、Arg、Thr、Trp、Lys或者Cys；Xaa40是Ser、Gly或者Cys；Xaa41是Ala、Asp、Arg、Glu、Lys、Gly或者Cys；Xaa42是Pro、Ala或者Cys；Xaa43是Pro、Ala或者Cys；Xaa44是Pro、Ala、Arg、Lys、His、Cys、NH2或者缺乏；Xaa45是Ser、His、Pro、Lys、Arg、Cys、NH2或者缺乏；Xaa46是His、Ser、Arg、Lys、Cys、NH2或者缺乏；并且Xaa47是His、Ser、Arg、Lys、Cys、NH2或者缺乏；并且其中2個或者1個Cys殘基共價連接有PEG分子，或者3個、2個或者1個Lys殘基共價連接有PEG分子，或者羧基末端氨基酸共價連接有PEG分子；并且條件是如果Xaa44、Xaa45、Xaa46或者Xaa47缺乏時則下游的每一氨基酸缺乏；并且條件是在分子中具有2個、1個或者0個Cys。本發(fā)明的另一個實施方案是包含式VII(SEQIDNO9)的氨基酸序列的PEG化GLP-1化合物His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47-Xaa48-Xaa49-Xaa50式VII(SEQIDNO9)其中Xaa11是Thr或者Cys；Xaa12是Phe或者Cys；Xaa16是Val或者Cys；Xaa22是Gly或者Cys；Xaa23是Gln或者Cys；Xaa24是Ala或者Cys；Xaa25是Ala或者Cys；Xaa26是Lys或者Cys；Xaa27是Glu或者Cys；Xaa30是Ala或者Cys；Xaa34是Lys或者Cys；Xaa35是Gly或者Cys；Xaa36是Gly或者Cys；Xaa37是Pro或者Cys；Xaa38是Ser、Pro、His或者Cys；Xaa39是Ser、Arg、Thr、Trp、Lys或者Cys；Xaa40是Ser、Gly或者Cys；Xaa41是Ala、Asp、Arg、Glu、Lys、Gly或者Cys；Xaa42是Pro、Ala、Cys、NH2或者缺乏；Xaa43是Pro、Ala、Cys、NH2或者缺乏；Xaa44是Pro、Ala、Arg、Lys、His、Cys、NH2或者缺乏；Xaa45是Ser、His、Pro、Lys、Arg、Gly、Cys、NH2或者缺乏；Xaa46是His、Ser、Arg、Lys、Pro、Gly、Cys、NH2或者缺乏；并且Xaa47是His、Ser、Arg、Lys、Cys、NH2或者缺乏；Xaa48是Gly、His、Cys、NH2或者缺乏；Xaa49是Pro、His、Cys、NH2或者缺乏；并且Xaa50是Ser、His、Cys、Ser-NH2、His-NH2、Cys-NH2或者缺乏；其中所述的GLP-1化合物包含1到7個的進一步取代并且其中2個或者1個Cys殘基共價連接有PEG分子，或者3個、2個或者1個Lys殘基共價連接有PEG分子，或者羧基末端氨基酸共價連接有PEG分子；并且條件是如果Xaa44、Xaa45、Xaa46或者Xaa47缺乏時則下游的每一氨基酸缺乏；并且條件是在分子中具有2個、1個或者0個Cys；并且條件是如果Xaa42、Xaa43、Xaa44、Xaa45、Xaa46、Xaa47、Xaa48或者Xaa49缺乏時則下游的每一氨基酸缺乏。包括GLP-1化合物的式I-VII的優(yōu)選實施方案與GLP-1(7-37)OH或者GLP-1(7-36)NH2的不同不超過7個氨基酸、不超過6個氨基酸、不超過5個氨基酸、不超過4個氨基酸、不超過3個氨基酸。式I-VII的GLP-1化合物中第8位為纈氨酸或者甘氨酸并且在第22位為谷氨酸也是優(yōu)選的。式I-VII的GLP-1化合物中第8位為纈氨酸或者甘氨酸并且在第30位為谷氨酸也是優(yōu)選的。式I-VII的GLP-1化合物中第8位為纈氨酸或者甘氨酸并且在第37位為組氨酸或者半胱氨酸也是優(yōu)選的。式I-VII的GLP-1化合物中具有2個或者1個或者0個半胱氨酸殘基也是優(yōu)選的。每個GLP-1化合物中具有一個PEG分子也是優(yōu)選的。本發(fā)明的另一個實施方案是包含式VIII(SEQIDNO10)的氨基酸序列的PEG化GLP-1化合物Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Xaa32-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45式VIII(SEQIDNO10)其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨組氨酸、2-氨基組氨酸、β-羥基組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基組氨酸或者α-甲基組氨酸、Arg、Tyr、Ala或者Val；Xaa8是Gly、Ser、Ala或者Thr；Xaa9是Glu、Ala或者Asp；Xaa10是Gly、Ala或者Val；Xaa11是Thr、Cys或者Ala；Xaa12是Phe、Cys、Ala或者Tyr；Xaa13是Thr或者Ser；Xaa14是Ser、Ala或者Thr；Xaa15是Asp或者Glu；Xaa16是Leu、Cys、Ala、Ile、Val或者Met；Xaa17是Ser或者Ala；Xaa18是Lys或者Ala；Xaa19是Gln或者Ala；Xaa20是Met、Ala、Leu、Ile或者Val；Xaa21是Glu或者Ala；Xaa22是Glu、Cys或者Ala；Xaa23是Glu、Cys或者Ala；Xaa24是Ala或者Cys；Xaa25是Val、Cys或者Ala；Xaa26是Arg、Cys或者AlaXaa27是Leu、Cys或者Ala；Xaa28是Phe、Ala或者Tyr；Xaa29是Ile、Val、Leu、Gly或者Met；Xaa30是Glu、Cys、Ala或者Asp；Xaa31是Trp、Ala、Phe或者Tyr；Xaa32是Leu或者Ala；Xaa33是Lys或者Ala；Xaa34是Asn、Cys或者Ala；Xaa35是Gly或者Cys；Xaa36是Gly或者Cys；Xaa37是Pro或者CysXaa38是Ser、Cys、NH2或者缺乏；Xaa39是Ser、Cys、NH2或者缺乏；Xaa40是Gly、Cys、NH2或者缺乏；Xaa41是Ala、Cys、NH2或者缺乏；Xaa42是Pro、Cys、NH2或者缺乏；Xaa43是Pro、Cys、NH2或者缺乏；Xaa44是Pro、Cys、NH2或者缺乏；并且Xaa45是Ser、Cys、NH2或者缺乏；并且其中2個或者1個Cys殘基共價連接有PEG分子；并且條件是在分子中具有2個或1個Cys；進一步的條件是Xaa9、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa18、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa22、Xaa23、Xaa24、Xaa26、Xaa27、Xaa30、Xaa31、Xaa32中不多于3個為Ala；并且進一步的條件是如果Xaa1是His、Arg或者Tyr則Xaa9、Xaa10和Xaa16中至少一個是Ala；并且進一步的條件是如果Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43或者Xaa44缺乏則下游的每一氨基酸缺乏。式VIII中第7、28、29、31和32位不能為半胱氨酸否則結(jié)果會造成不可接受的活性的喪失。本發(fā)明中使用的聚乙二醇聚合物(“PEG”)優(yōu)選地具有分子量為500-100,000道爾頓，更加優(yōu)選地為20,000-60,000道爾頓，最優(yōu)選地為20,000-40,000道爾頓，可以為線性的或者分支的分子并且可以是本領(lǐng)域所述的聚乙二醇衍生物。本發(fā)明包含在需要此種刺激的受試者中刺激GLP-1受體的方法，所述的方法包括對于受試者施用此處所述的有效量的PEG化GLP-1化合物的步驟。本發(fā)明還包含在需要此種刺激的受試者中刺激GLP-1受體的方法，所述的方法包括對于受試者施用此處所述的有效量的具有SEQIDNO3-10所示序列的非PEG化GLP-1化合物的步驟，其條件是SEQIDNO3-10所示序列中的分子中具有2個或者1個Cys。需要GLP-1受體刺激的受試者包括患有非胰島素依賴型糖尿病、應(yīng)激誘導(dǎo)的高血糖癥、肥胖癥、包括例如過敏性結(jié)腸綜合征(irritablebowelsyndrome)和功能性消化不良(functionaldyspepsia)在內(nèi)的胃和/或腸蠕動或者排空疾病。發(fā)明詳述胰高血糖素樣肽1(GLP-1)是作為對食物攝取的反應(yīng)由腸L-細胞分泌的37個氨基酸的肽。在本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了許多GLP-1類似物和衍生物。本發(fā)明描述了能夠?qū)е孪胨テ谘娱L和/或清除率降低的GLP-1化合物的修飾。在肽的特定氨基酸位點摻入1個或者2個Cys殘基而提供巰基，聚乙二醇(PEG)或者PEG衍生物可以共價連接至該巰基上從而導(dǎo)致產(chǎn)生PEG化GLP-1化合物。此外，本發(fā)明的GLP-1肽、類似物或者片段中的賴氨酸殘基或者羧基末端可以與一個或多個分子的PEG或者PEG衍生物進行共價連接導(dǎo)致產(chǎn)生消除半衰期延長和/或者清除率降低的分子。GLP-1(7-37)OH具有SEQIDNO1的氨基酸序列7891011121314151617His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-1819202122232425262728Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Gly-Phe-293031323334353637Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly(SEQIDNO1)如文中所使用的術(shù)語“多肽”或者“肽”意思是指包含5個以上氨基酸殘基的氨基酸序列的任何結(jié)構(gòu)形式(例如一級、二級或者三級結(jié)構(gòu)形式)，其可以或者不可以進行進一步的修飾(例如乙?；Ⅳ然?、磷酸化、脂化或者?；?。術(shù)語“天然”指與在自然界中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列具有相同氨基酸序列的多肽。術(shù)語“天然”意在包含所討論多肽的等位基因變異體。文中使用的術(shù)語“氨基酸”具有其最廣的含義，并且包括天然存在的氨基酸和包括氨基酸變體和衍生物在內(nèi)的非天然存在氨基酸?？紤]到這種廣義的定義，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認識到此處所指的氨基酸包括例如天然存在的產(chǎn)生蛋白質(zhì)的的L-氨基酸、D-氨基酸、諸如氨基酸變體和衍生物的化學(xué)修飾氨基酸、諸如正亮氨酸、β-丙氨酸、鳥氨酸等天然存在的非產(chǎn)生蛋白質(zhì)的氨基酸和具有本領(lǐng)域已知的氨基酸特征性質(zhì)的化學(xué)合成的化合物。非天然存在的氨基酸的例子包括α-甲基氨基酸(例如α-甲基丙氨酸)、D-氨基酸、組氨酸樣氨基酸(例如2-氨基組氨酸、β-羥基組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基組氨酸和α-甲基組氨酸)、在側(cè)鏈中具有額外亞甲基的氨基酸(“高”氨基酸)以及在側(cè)鏈中的羧酸官能團被磺酸基團取代的氨基酸(例如半胱氨酸)。然而，本發(fā)明的GLP-1化合物優(yōu)選地只包含天然存在的氨基酸，除非文中提供了特別的說明。如文中所使用的術(shù)語“GLP-1化合物”包括天然的GLP-1、[GLP-1(7-37)OH或者GLP-1(7-36)NH2]、GLP-1類似物、GLP-1衍生物、GLP-1生物活性片段、延長的GLP-1或者延長的GLP-1肽的類似物或者片段(見，例如美國專利申請系列號60/346474和60/405,097)、如文中所述的在肽的具體位置包含一個或者兩個Cys殘基的exendin-4類似物和exendin-4衍生物。按照本領(lǐng)域的慣例，天然GLP-1(7-37)OH的氨基末端被指定為殘基編號7并且羧基末端為編號37。在多肽中的其它氨基酸進行連續(xù)地編號，如SEQIDNO1所示。例如，在天然分子中第12位為苯丙氨酸并且第22位為甘氨酸。如文中所使用的“GLP-1片段”或者“GLP-1化合物片段”是從GLP-1化合物的N-末端和/或者C-末端截去一個或多個氨基酸后所得到的具有生物活性的多肽。用于描述GLP-1(7-37)OH的術(shù)語可以應(yīng)用于GLP-1片段。例如GLP-1(9-36)OH意味著通過從N-末端截去兩個氨基酸并且從C-末端截去一個氨基酸所得到的GLP-1片段。片段中的氨基酸與GLP-1(7-37)OH中的相應(yīng)氨基酸表示成相同的編號。例如，如在GLP-1(7-37)OH中一樣GLP-1(9-36)OH中的第9位的是N-末端谷氨酸、第12位為苯丙氨酸并且第22位是甘氨酸。GLP-1化合物包括GLP-1類似物和exendin-4類似物。清楚地說，包含在“GLP-1化合物”內(nèi)的“exendin-4類似物”總是具有一個或者兩個Cys殘基。優(yōu)選地，GLP-1類似物具有經(jīng)過修飾的GLP-1(7-37)OH或者延長的GLP-1肽或其片段的氨基酸序列以致于在相應(yīng)位置有1、2、3、4、5或者6個氨基酸不同于GLP-1(7-37)OH或者GLP-1(7-37)OH片段或者在相應(yīng)位置有0、1、2、3、4、5或者6個氨基酸不同的延長GLP-1肽，該種延長的GLP-1肽描述于2002年8月1日申請的美國專利申請系列號60/346474和2002年8月21日申請的美國專利申請系列號60/405,097，題目均為“延長的胰高血糖素樣肽-1類似物”。最優(yōu)選的GLP-1類似物描述于文中的式I、II、III、IV、V、VI和VII。最優(yōu)選的exendin-4類似物描述于文中的式VIII。當在本發(fā)明的GLP-1化合物中提到時，術(shù)語“PEG化”指通過共價連接一個或多個聚乙二醇分子或者其衍生物而進行化學(xué)修飾的GLP-1化合物。此外，可以預(yù)計術(shù)語“PEG”是指如本領(lǐng)域已知的聚乙二醇或其衍生物(見，例如美國專利號5,445,090；5,900,461；5,932,462；6,436,386；6,448,369；6,437,025；6,448,369；6,495,659；6,515,100和6,514,491)。在本發(fā)明的PEG化GLP-1化合物中，優(yōu)選地是PEG(或其衍生物)共價連接到GLP-1化合物的一個或多個賴氨酸或者半胱氨酸殘基上。最優(yōu)選地是PEG共價連接到GLP-1化合物的一個或多個半胱氨酸殘基上。對于本發(fā)明的PEG化的exendin-4類似物，PEG是連接到一個或者兩個半胱氨酸殘基上，該半胱氨酸殘基是在式VIII中所確定的位點被引入到exendin-4或者exendin-4類似物中的。任選地，通過接頭或者間隔物分子(見美國專利6,268,343中描述的示例性的間隔物分子)可以將PEG分子連接到GLP-1化合物上。在文中用于定義GLP-1化合物的術(shù)語中，標明了所替代的氨基酸和其位置，然后是親本肽的名稱。例如，Glu22-GLP-1(7-37)OH指GLP-1(7-37)OH中正常情況下為甘氨酸的第22位被谷氨酸替代的GLP-1化合物；Val8Glu22-GLP-1(7-37)OH(或者V8E22-GLP-1(7-37)OH)指GLP-1(7-37)OH中正常情況下為丙氨酸的第8位和為甘氨酸的第22位分別被纈氨酸和谷氨酸替代的GLP-1化合物。Val8-exendin4指exendin4中正常情況下為絲氨酸的第8位被纈氨酸替代的GLP-1化合物。本發(fā)明的GLP-1化合物優(yōu)選地具有促胰島素活性?！按僖葝u素活性”指作為對升高的葡萄糖水平做出反應(yīng)而刺激胰島素分泌的活性，從而導(dǎo)致細胞攝取葡萄糖并降低血液葡萄糖水平。通過本領(lǐng)域已知的方法可以測定促胰島素活性，該方法包括使用體內(nèi)實驗和測定GLP-1受體結(jié)合活性或者受體活化的體外測定法，例如分別描述于Gelfand等的EP619,322和美國專利號5,120,712中的采用胰島細胞或者胰島素瘤細胞的測定法。常規(guī)情況下通過測定胰島素水平或者C-肽水平來測定人體內(nèi)的促胰島素活性。為了本發(fā)明的目的，使用體外GLP-1受體信號測定法來確定本發(fā)明的PEG化GLP-1化合物是否表現(xiàn)出體內(nèi)的促胰島素活性。促胰島素活性是能夠用于闡明PEG化GLP-1化合物具有生物學(xué)活性的一種活性。如文中所使用的“體外潛能”是在基于細胞的測定法中對肽活化GLP-1受體的能力的測定。體外潛能可以表示為“EC50”，其為在單一劑量反應(yīng)實驗中能夠?qū)е?0％活性的化合物的有效濃度。為了本發(fā)明的目的，體外潛能可以通過采用穩(wěn)定表達人GLP-1受體的HEK-293細胞的熒光測定法進行確定。這些HEK-293細胞穩(wěn)定整合了具有cAMP反應(yīng)元件(CRE)所驅(qū)動表達的β-內(nèi)酰胺酶(BLAM)基因的載體。GLP-1化合物(或者激動劑)與受體的相互作用啟動了能夠?qū)е耤AMP反應(yīng)元件激活和β-內(nèi)酰胺酶隨后表達的信號。當β-內(nèi)酰胺酶CCF2/AM底物被β-內(nèi)酰胺酶(PanVeraLLC)斷裂后會釋放出熒光，因而為了測量GLP-1激動劑的潛能可以將β-內(nèi)酰胺酶CCF2/AM底物添加至已經(jīng)暴露于特定量的GLP-1激動劑的細胞。測定法進一步描述于Zlokarnik等(1998)Science27984-88中。實施例4中所列出的化合物的EC50值是使用上面描述的BLAM測定法進行確定的。通過對Val8-GLP-1(7-37)OH或者作為對照的天然GLP-1進行測定并指定對照為100％的參考值來確定相對體外潛能。術(shù)語“血漿半衰期”指在血漿中循環(huán)的相關(guān)分子的一半被清除之前的時間。一個備選使用的術(shù)語是“消除半衰期”。在血漿半衰期或者消除半衰期的上下文中使用的術(shù)語“延長”或者“更長”是指在可比條件下進行確定的相對于參考分子(例如非PEG化形式的肽或者天然肽)而言PEG化GLP-1化合物的半衰期具有統(tǒng)計學(xué)意義上的增加。本發(fā)明的PEG化GLP-1化合物的消除半衰期優(yōu)選地為至少一小時，更加優(yōu)選地至少3、5、7、10、15、20小時并且最優(yōu)選地為至少24小時。在實施例5中所報導(dǎo)的半衰期為消除半衰期；就是它對應(yīng)著消除的終末log-線性速率。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當理解半衰期是一個導(dǎo)出參數(shù)，它作為清除率和分布容積兩者的函數(shù)而變化。清除率是對身體消除藥物的能力的測量。例如，由于對藥物的修飾而使得清除率下降時，可以預(yù)計半衰期提高了。然而只有當分布容積沒有改變時，這種相互關(guān)系是精確的。通過方程t≈0.693(V/C)給出了一種有用的在終末log-線性半衰期(t)、清除率(C)和分布容積(V)之間的近似關(guān)系。清除率并不表示有多少藥物被去除，而是由于清除而完全沒有藥物的生物體液諸如血液或者血漿的體積。清除率表示為單位時間內(nèi)的體積。本發(fā)明的PEG化GLP-1化合物的清除率優(yōu)選地為200ml/h/kg或者更少，更加優(yōu)選地為180、150、120、100、80、60ml/h/kg或者更少并且最優(yōu)選地為50、40或者20ml/h/kg或者更少(見實施例5)。在本發(fā)明中，在GLP-1或者GLP-1類似物肽中的第7、28、29、31或者32位沒有摻入Cys氨基酸，因為摻入后會導(dǎo)致所得肽的活性喪失?？梢钥紤]所有其它的殘基用半胱氨酸進行替代，但是優(yōu)選地是此種半胱氨酸摻入到GLP-1或者GLP-1類似物肽中選自第11、12、16、22、23、24、25、26、27、30、34、35、36和37位中的位點，優(yōu)選地是每個分子不超過2個或者1個Cys氨基酸。當GLP-1分子中存在Cys氨基酸時，甚至更加優(yōu)選地是它們位于選自第22、26、34、35、36和37位的位點，甚至更加優(yōu)選地存在于第26和/或34位。所得到的分子是Cys氨基酸被PEG化的，這導(dǎo)致產(chǎn)生了在保留全部或者部分生物學(xué)活性的同時又具有與未修飾的分子或者天然分子相比半衰期更長的修飾的分子。在本發(fā)明中，備選的GLP-1或者GLP-1類似物肽是在第18、22和26位的1個、2個或者3個賴氨酸殘基處進行PEG化或者在肽的羧基末端的氨基酸進行PEG化。本發(fā)明的另一個實施方案是具有如SEQIDNO3-10所示序列的非PEG化GLP-1化合物，其條件是在分子中有2或者1個Cys。申請者發(fā)現(xiàn)在GLP-1化合物中的特定位置上的殘基可以用Cys進行替代并且仍然保留著生物學(xué)活性。這些非PEG化GLP-1化合物是在生產(chǎn)本發(fā)明的PEG化GLP-1化合物過程中使用的中間物。這些化合物也可以用作治療劑來治療那些不需要延長半衰期的疾病，例如過敏性結(jié)腸綜合征。一旦制備和純化了本發(fā)明使用的肽，可以通過向Cys或者Lys殘基或者羧基末端氨基酸共價連接至少一個PEG分子來進行修飾。通過連接聚合物賦予難以處理的肽或者蛋白質(zhì)分子適當?shù)男绿匦远⒉粚?dǎo)致喪失其功能性是困難的。在本領(lǐng)域已經(jīng)描述過廣泛的多種方法來產(chǎn)生共價連接的PEG并且本發(fā)明使用的具體方法不用于限制(綜述文章見Roberts，M.等，AdvancedDrugDeliveryReviews，54459-476，2002)。PEG的羧基末端連接可以通過使用重組GLP-1肽作為前體的酶偶聯(lián)或者本領(lǐng)域已知的備選方法進行，該備選方法描述于例如美國專利4,343,898或者InternationalJournalofpeptide&ProteinResearch.43127-38，1994。蛋白質(zhì)的PEG化可以克服與使用肽或者蛋白質(zhì)作為治療劑相關(guān)的許多藥理學(xué)和毒物學(xué)/免疫學(xué)問題。然而，對于任何具體的肽，還不確定肽的PEG化形式與肽的非PEG化形式相比是否具有明顯的生物活性損失。PEG化蛋白質(zhì)的生物活性可受一些因素影響，這些因素例如i)PEG分子的大??；ii)連接的具體位置；iii)修飾的程度；iv)不利的連接條件；v)是否使用接頭用于連接或者聚合物是否直接連接；vi)有害副產(chǎn)物的產(chǎn)生；vii)活化的聚合物造成的損傷；或者viii)電荷的保留。根據(jù)所使用的偶聯(lián)反應(yīng)，細胞因子的聚合物修飾尤其會導(dǎo)致生物活性的急劇降低。[Francis，G.E.，等，(1998)PEGylationofcytokinesandothertherapeuticproteinsandpeptidestheimportantceofbiologicaloptimizationofcouplingtechniques，Intl.J.Hem.681-18]。本發(fā)明的PEG化GLP-1化合物具有天然GLP-1或者更加優(yōu)選地具有Val8-GLP-1(7-37)OH的至少0.5％的體外生物學(xué)活性。更加優(yōu)選地，本發(fā)明的PEG化GLP-1化合物具有天然GLP-1或者更加優(yōu)選地具有Val8-GLP-1(7-37)OH的至少1％或者3％的體外生物學(xué)活性。此種生物學(xué)活性可以通過如文中所述的(實施例4)體外潛能測定法或者本領(lǐng)域已知的其它GLP-1測定法進行確定。雖然如在具體的測定法中測量的那樣本發(fā)明的一些PEG化GLP-1化合物的生物學(xué)活性低于天然GLP-1或者Val8-GLP-1(7-37)OH的生物學(xué)活性；但是這種活性的降低可以通過化合物延長的半衰期和/或更低的清除率值以及通過GLP-1化合物的延長的消除半衰期這一有利的特性進行補償。還進一步考慮將exendin-4中與在GLP-1肽中發(fā)現(xiàn)的能夠容納半胱氨酸殘基而生物學(xué)活性沒有消除的位點相類似的位置用半胱氨酸進行替代，并且導(dǎo)致產(chǎn)生仍具有與GLP-1受體結(jié)合能力的exendin-4類似物。優(yōu)選地，本發(fā)明的每個exendin-4類似物有不超過2或者1個Cys氨基酸。優(yōu)選地，Cys存在于分子中選自第11、12、16、22、23、24、25、26、27、30、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43和44位(見式VIII)的位點；優(yōu)選地選自第22、26、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43和44位的位點；甚至更加優(yōu)選地是第26和/或34位的位點。分子中存在的Cys氨基酸共價連接有PEG分子上導(dǎo)致產(chǎn)生與天然exendin-4相比消除半衰期更長的PEG化exendin-4類似物。本發(fā)明的PEG化exendin-4類似物肽(如式VIII所描述)優(yōu)選地具有非PEG化的exendin-4類似物的至少0.5％、1.0％、3％、10％、30％或者50％的生物學(xué)活性。野生型exendin4的序列為HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPS(SEQIDNO11)。PEG的典型形式是具有末端羥基的線性聚合物，并且分子式為HO-CH2CH2-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH，此處n為大約8-大約4000。末端的氫可以用保護基團例如烷基或者烷醇基進行取代。優(yōu)選地，PEG具有至少一個羥基，更加優(yōu)選地是它具有末端羥基。就是該羥基優(yōu)選地被激活與肽進行反應(yīng)。對于本發(fā)明有用的PEG可以有多種形式。本領(lǐng)域存在多種PEG衍生物并且它們適用于本發(fā)明。(見，例如美國專利號5,445,090、5,900,461、5,932,462、6,436,386、6,448,369、6,437,025、6,448,369、6,495,659、6,515,100和6,514,491以及Zalipsky，S.BioconjugateChem.6150-165,1995)。共價連接到本發(fā)明GLP-1化合物上的PEG分子并不是意在用于限制具體的類型。PEG的分子量優(yōu)選地為500-100,000道爾頓并且更加優(yōu)選地為20,000-60,000道爾頓并且最優(yōu)選地為20,000-40,000道爾頓。PEG可以是線性的或者分支的并且本發(fā)明的PEG化GLP-1化合物可以具有1、2、3、4、5或者6個被連接到肽上的PEG分子。最優(yōu)選地是每個PEG化GLP-1化合物分子上具有一個PEG分子；然而，當每個肽分子上不止一個PEG分子時，則優(yōu)選地是不多于6個。還進一步考慮了將PEG分子的兩個末端成為同功能化的或者異功能化，從而將兩個或者多個GLP-1化合物交聯(lián)在一起。本發(fā)明提供了具有一個或多個PEG分子共價連接到其上的GLP-1化合物。一種用于制備本發(fā)明PEG化GLP-1化合物的方法涉及到PEG-馬來酰亞胺的使用，以將PEG直接連接到肽的巰基上。通過在肽的上述位點加上或者插入一個Cys殘基可以引入巰基的功能性。巰基功能性還可以引入到肽的側(cè)鏈上(例如含巰基酸的賴氨酸ε-氨基的?；饔?。本發(fā)明PEG化過程利用邁克爾加成(Michaeladdition)形成穩(wěn)定的硫醚接頭。反應(yīng)是高度特異的并且在有其它官能團存在的溫和條件下進行。PEG馬來酰亞胺作為反應(yīng)聚合物用來制備充分定義的生物活性的PEG-蛋白質(zhì)輟合物。優(yōu)選地是在過程中使用相對于PEG馬來酰亞胺而言超出一摩爾的含巰基GLP-1化合物從而驅(qū)動反應(yīng)進行完全。反應(yīng)優(yōu)選地是在室溫下pH4.0和9.0之間反應(yīng)15-40小時進行。使用常規(guī)分離方法將過多的非PEG化的含巰基肽容易地從PEG化的產(chǎn)物中分離出來。制作PEG化GLP-1化合物的可以仿效的條件在實施例1中進行了闡述。半胱氨酸的PEG化可以通過使用PEG馬來酰亞胺或者分叉PEG馬來酰亞胺來完成。GLP-1化合物具有多種的生物學(xué)活性。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)GLP-1刺激胰島素的釋放，從而導(dǎo)致細胞攝取葡萄糖并且血糖水平降低[見，例如，Mojsov，S.，(1992)Int.J.peptideProteinResearch，40333]。GLP-1在治療非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)方面特別有希望，因為它不出現(xiàn)在當前的NIDDM治療中出現(xiàn)的低血糖癥的危險。還可以考慮將GLP-1用于對肥胖癥、過敏性結(jié)腸綜合征和功能性消化不良。考慮了本發(fā)明PEG化GLP-1化合物的用途，包括在制造用于治療非胰島素依賴型糖尿病、肥胖癥、中風、心肌梗死、過敏性結(jié)腸綜合征或者功能性消化不良的藥物中的用途。PEG化GLP-1化合物可以同本領(lǐng)域已知的其它修飾組合在一起來增加GLP-1半衰期(見，例如2002年8月1日申請的美國專利申請系列號60/346474和2002年8月21日申請的美國專利申請系列號60/405,097)并且因此增加的化合物的半衰期甚至高于單獨的PEG化或者其它單獨的修飾方法。如文中所使用，術(shù)語“GLP-1化合物”還包括文中所述的化合物的可藥用鹽。本發(fā)明的GLP-1化合物可以具有足夠酸的、足夠堿的或者兩者的官能團，并且相應(yīng)地能夠與許多無機堿和無機酸和有機酸的任何一種發(fā)生反應(yīng)形成鹽。通常采用的形成酸加成鹽的酸是無機酸和有機酸，無機酸例如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、磷酸等等，有機酸例如對甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、檸檬酸、苯甲酸、乙酸等等。此種鹽的例子包括硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磷酸鹽、一磷酸氫鹽、二磷酸氫鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、醋酸鹽、丙酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、丙烯酸鹽、甲酸鹽、異丁酸鹽、己酸鹽、庚酸鹽、丙炔酸鹽、草酸鹽、丙二酸鹽、琥珀酸鹽、琥珀酸鹽、癸二酸鹽、延胡索酸鹽、馬來酸鹽、丁炔-1，4-二酸酯、乙炔-1，6-二酸酯、苯甲酸鹽、氯苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、磺酸鹽、二甲苯磺酸鹽、苯乙酸鹽、丙酸苯酯、丁酸苯酯、檸檬酸鹽、乳酸鹽、γ-羥基丁酸鹽、羥乙酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、丙磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽、萘-2-磺酸鹽、扁桃酸鹽等等。堿加成鹽包括那些無機堿來源的鹽，例如銨或者堿或者堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽等等。因此對于制備本發(fā)明的鹽有用的此類堿包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、碳酸鉀等等。本發(fā)明的PEG化GLP-1化合物特別適合于腸胃外施用，它們還可以經(jīng)口、鼻施用或者通過吸入進行遞送。腸胃外施用包括例如全身施用例如通過肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下或者腹膜內(nèi)注射。PEG化GLP-1化合物可以與作為治療上述疾病的藥物組合物的一部分的可藥用載體、稀釋劑或者賦形劑一起施用于受試者。藥物組合物可以是溶液，如果腸胃外施用時可以是GLP-1化合物混懸液或者用二價金屬離子例如鋅絡(luò)合的GLP-1化合物混懸液。適宜的藥物載體包含不與肽或者肽衍生物發(fā)生相互作用的惰性成分。可以采用的標準藥物制劑技術(shù)如Remington′sPharmaceuticalSciences，MackPublishingCompany，Easton，PA中描述的那些技術(shù)。用于腸胃外施用的適宜藥物載體包括例如無菌水、生理鹽水、抑菌鹽(含有約0.9％mg/ml苯甲醇的鹽)、磷酸緩沖鹽、Hank′s液、林格乳酸鹽等等。適宜賦形劑的一些例子包括乳糖、右旋糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇和甘露醇。本發(fā)明的PEG化GLP-1化合物可以配制成施用后血漿水平可以維持有效范圍達一段延長的時間階段的制劑。影響口服肽遞送的主要障礙是由于肽被酸和酶的降解導(dǎo)致生物利用率差、通過上皮細胞膜的吸收較差和暴露于消化道酸性pH環(huán)境后肽轉(zhuǎn)變成不溶的形式。對于肽如本發(fā)明包含的那些肽的口服遞送系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的。例如，可以使用微球體包裹PEG化GLP-1化合物然后經(jīng)口遞送。例如，可以將PEG化GLP-1化合物包裹在由商業(yè)可得的生物可降解的聚合物聚(丙交酯共乙交酯)-COOH和作為填充劑的橄欖油組成的微球體內(nèi)。見Joseph等(2000)Diabetologia431319-1328。微球體技術(shù)的其它類型也是商業(yè)可得的，例如Alkermes的Medisorb和Prolease生物可降解聚合物。Medisorb聚合物可以用任何丙交酯異構(gòu)體產(chǎn)生。丙交酯∶乙交酯的比率可以在0∶100和100∶0之間變動，這允許具有較廣范圍的聚合物特性。這使得可以設(shè)計出吸收時間為幾周至幾個月的遞送系統(tǒng)和可植入裝置。Emisphere公司還發(fā)表了很多文章討論肽和蛋白質(zhì)經(jīng)口遞送技術(shù)。例如見Leone-bay等的WO9528838，其公開了促進吸收的包含經(jīng)修飾氨基酸的特定載體。文中所述的PEG化GLP-1化合物可以用于治療患有多種疾病和病癥的受試者。本發(fā)明包含的PEG化GLP-1化合物通過作用于稱作“GLP-1受體”的受體而發(fā)揮它們的生物學(xué)效應(yīng)(見Dillon等(1993)CloningandFunctionalExpressionoftheHumanGlucagon-likePeptide-1(GLP-1)Receptor，Endocrinology，1331907-1910)。因而可以用本發(fā)明的PEG化GLP-1化合物治療患有對GLP-1受體刺激或者GLP-1化合物施用具有有利反應(yīng)的疾病和/或病癥的受試者。這些受試者被稱作是“需要用GLP-1化合物進行治療的”或者“需要GLP-1受體活化的”。受試者包括患有非胰島素依賴型糖尿病、胰島素依賴型糖尿病、中風(見Efendic的WO00/16797)、心肌梗塞(見Efendic的WO98/08531)、肥胖癥(見Efendic的WO98/19698)、手術(shù)后代謝改變(見Efendic的美國專利號6,006,753)、功能性消化不良和過敏性結(jié)腸綜合征(見Efendic的WO99/64060)的受試者。受試者還包括需要用GLP-1化合物預(yù)防治療的受試者，例如處于發(fā)展成非胰島素依賴型糖尿病危險之中的受試者(見WO00/07617)。另外的受試者包括那些具有葡萄糖耐性障礙或者空腹葡萄糖障礙的、相對于受試者的身高和體格體重高出正常體重25％的、行部分胰腺切除術(shù)的、一個或兩個雙親中患有非胰島素依賴型糖尿病的、患有妊娠期糖尿病的以及患有急性或者慢性胰腺炎的、處于發(fā)展成非胰島素依賴型糖尿病危險之中的受試者。本發(fā)明的PEG化GLP-1化合物可以用于使血糖水平正?；⒆柚挂认佴?細胞退化、誘導(dǎo)β-細胞增殖、刺激胰島素基因轉(zhuǎn)錄、上調(diào)IDX-1/PDX-1或其它生長因子、改善β-細胞功能、活化休眠β-細胞、使細胞分化成β-細胞、刺激β-細胞復(fù)制、抑制β-細胞凋亡、調(diào)節(jié)體重以及誘導(dǎo)體重降低。PEG化GLP-1化合物的“有效量”是當施用于需要GLP-1受體活化的受試者后能夠?qū)е庐a(chǎn)生目的治療和/或預(yù)防效果而沒有導(dǎo)致產(chǎn)生不可接受副作用的量?！澳康闹委熜Ч卑ㄏ旅娴囊环N或多種1)與疾病或者不良狀況相關(guān)癥狀的改善；2)與疾病或者不良狀況相關(guān)癥狀發(fā)作的延緩；3)與缺乏治療相比壽命的延長和4)與缺乏治療相比生活質(zhì)量更高。例如，治療糖尿病的PEG化GLP-1化合物的“有效量”是這樣一種量，即與缺乏治療相比血糖濃度得到更好地控制，由此使糖尿病并發(fā)癥如視網(wǎng)膜病、神經(jīng)病變或者腎臟疾病發(fā)作延緩的量。用于預(yù)防糖尿病的PEG化GLP-1化合物的“有效量”是指與缺乏治療相比能夠延緩血糖水平升高發(fā)作的量，這種血糖的升高需要用抗低血糖的藥物磺酰尿、噻唑烷二酮類、胰島素和/或氯苯呱哌嗪進行治療。施用于受試者的PEG化GLP-1化合物的“有效量”還取決于疾病的類型和嚴重程度以及受試者的特征，例如總體健康狀況、年齡、性別、體重以及對藥物的耐受。一般情況下，施用本發(fā)明的PEG化GLP-1化合物會導(dǎo)致血漿濃度在大約5pmol/L至大約200pmol/L的范圍內(nèi)。經(jīng)測定Val8-GLP-1(7-37)OH的最適血漿水平為30pmol/L至大約200pmol/L之間。對于成年人，本發(fā)明的PEG化GLP-1化合物的一般劑量范圍為從大約0.01mg/天至大約1000mg/天。劑量范圍優(yōu)選地為大約0.1mg/天至大約100mg/天，更加優(yōu)選地為大約1.0mg/天至大約10mg/天?！笆茉囌摺笔遣溉閯游铮瑑?yōu)選地是人，但是也可以是動物，例如作為陪伴動物(例如狗、貓等等)、農(nóng)場動物(例如母牛、綿羊、豬、馬等等)和實驗室動物(例如大鼠、小鼠、豚鼠等等)。通過使用液相或者固相肽合成技術(shù)的標準方法可以制備用于產(chǎn)生本發(fā)明PEG化GLP-1化合物的肽。肽合成儀可以商業(yè)獲得，例如位于FosterCityCA的AppliedBiosystems公司。用于固相合成的試劑可以從例如MidwestBiotech(Fishers，IN)商業(yè)獲得。根據(jù)廠商的說明書，固相肽合成儀可以用于阻斷干擾基團、保護欲進行反應(yīng)的氨基酸、未反應(yīng)氨基酸的偶聯(lián)、脫偶聯(lián)以及帽化反應(yīng)。一般地，在室溫下、在一種惰性溶劑如二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮或者亞甲基氯中、并且在偶聯(lián)劑如二環(huán)己基碳二亞胺和1-羥基苯并三唑和堿例如二異丙基乙胺存在的情況下，將N-氨基甲?；Ｗo的氨基酸和樹脂上的生長肽鏈的N-末端氨基酸偶聯(lián)起來。使用試劑如三氟乙酸或者哌啶將N-氨基甲?；Ｗo基從所得到的肽樹脂中去除并且將下一個所期望的N-保護的氨基酸加入到肽鏈上而重復(fù)偶聯(lián)反應(yīng)。適宜的胺保護基在本領(lǐng)域是眾所周知的并且描述于Green和Wuts，“ProtectingGroupsinorganicSynthesis”，JohnWileyandSons，1991，其全文引用作為參考。實例包括叔丁氧羥基(tBoc)和芴甲氧羰基(Fmoc)。還可以使用標準的自動固相合成方案并使用叔丁氧羥基或者芴甲氧羰基α-氨基酸和適當?shù)膫?cè)鏈保護來合成肽。在合成完畢之后，使用標準的氟化氫方法將肽從固相支持物上斷裂下來同時使側(cè)鏈脫保護。然后使用反相層析在VydacC18柱上應(yīng)用0.1％三氟乙酸(TFA)中的乙腈梯度將粗制的肽進一步純化。為了去除乙腈，將肽從含有0.1％TFA、乙腈和水的溶液中低壓冷凍干燥。通過分析型反相層析證實其純度。通過質(zhì)譜對肽進行證實。肽可以溶解在中性pH的含水緩沖液中。通過下面的實施例對本發(fā)明進行闡明，但無論如何這些實施例不意味著對本發(fā)明進行限制。實施例實施例1-GLP-1相關(guān)類似物的PEG化在允許硫醚鍵形成的條件下進行PEG化反應(yīng)。具體而言，溶液的pH范圍為大約4-9并且含巰基肽的濃度范圍為超過甲氧基PEG2-MAL濃度1-10摩爾。在室溫下進行正常的PEG化反應(yīng)。然后使用反相HPLC或者大小排阻層析(SEC)分離PEG化GLP-1肽。使用分析型RP-HPLC、HPLC-SEC、SDS-PAGE和/或MALDI質(zhì)譜對PEG化GLP-1類似物進行表征。為了產(chǎn)生通過硫醚鍵與PEG共價連接的衍生物，將含巰基GLP-1肽與40kDa的聚乙二醇-馬來酰亞胺(PEG-馬來酰亞胺)進行反應(yīng)。例如，將肽Cex-51-C(V8E22I33C40GLP-1，長度為45aa，7.5mg，1.8μmol)溶解于2ml含有20mMEDTA的200mM磷酸鹽緩沖液pH7.4。然后用氬清洗溶液。向該溶液中加入40mg甲氧基PEG2-MAL即一種分叉的PEG馬來酰亞胺(Lot#PT-02B-10，ShearwaterPolymers，Inc.，Huntsville，Alabama)(PEG肽為0.55∶1的摩爾/摩爾比)。反應(yīng)進行2小時。然后通過RP-HPLC純化得到25mgPEG化肽，通過大小排阻HPLC對PEG化的肽進行表征并且測試了其體外活性。實施例2-40kDa-PEG-馬來酰亞胺與GLP類似物進行反應(yīng)使用馬來酰亞胺活化的分叉的40kDamPEG(ShearwaterPolymers，Inc.)將GLP-1類似物例如C16E22V8GLP和V8C38GLP在所導(dǎo)入的半胱氨酸殘基上進行選擇性的PEG化。對于PEG化反應(yīng)，將欲PEG化的肽溶解于100mMTRIS緩沖液pH8.0中并且加入的肽要超過40kDa-mPEG1.25倍的摩爾濃度。在室溫下攪拌2-3小時進行反應(yīng)然后在大約5℃的條件下在10mM檸檬酸鹽，10mM磷酸鹽，pH7.4中透析(7kDa膜)過夜。通過陰離子交換層析使用中性pH的NaCl梯度在Mono-Q柱(AmershamBiosciencesCorp，Piscataway，NJ)上將PEG化GLP分子進行純化。實施例3-DSPE-3.4kDa-PEG-馬來酰亞胺與GLP-1類似物反應(yīng)使用馬來酰亞胺活化的用一種脂即二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)終止的3.4kDamPEG(ShearwaterPolymers，Inc.)將GLP-1類似物例如C16E22V8GLP-1和V8C38GLP-1在所導(dǎo)入的半胱氨酸殘基上進行選擇性PEG化。對于PEG化反應(yīng)，將肽溶解于100mMTRIS緩沖液pH8.0中并且加入的肽要超過DSPE-3.4kDa-PEG馬來酰亞胺1.25倍的摩爾濃度。將無水乙醇加入至大約17％以幫助DSPE-3.4kDa-PEG-馬來酰亞胺溶解。在室溫下攪拌2-3小時進行反應(yīng)然后在大約5℃的條件下在10mM檸檬酸鹽，10mM磷酸鹽，pH7.4中透析(7kDa膜)過夜。通過陰離子交換層析使用中性pH的NaCl梯度在Mono-Q柱(AmershamBiosciencesCorp，Piscataway，NJ)上將PEG化GLP分子進行純化。實施例4-體外活性測定將使用PanVeraLLCCRE-BLAM系統(tǒng)表達人GLP-1受體的HEK-293細胞以20,000-40,000個細胞/孔/100μl含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基接種于多聚-d-賴氨酸包被的96孔黑色、透明底的培養(yǎng)板中。在接種后的第二天，將培養(yǎng)基輕輕地拍打出去并加入80μl無血清的DMEM培養(yǎng)基。在接種后的第三天，向每個孔中加入20μl含有0.5％BSA和不同濃度PEG化GLP-1化合物的無血清DMEM培養(yǎng)基以便制作出劑量-反應(yīng)曲線。通常，為了產(chǎn)生劑量-反應(yīng)曲線使用了含有3納摩爾-30納摩爾PEG化肽的14個稀釋濃度，從該曲線中可以確定EC50值。在與PEG化肽孵育5小時后，加入20μlβ-內(nèi)酰胺酶底物(CCF2/AM，PanVeraLLC)并繼續(xù)孵育1小時，此時在細胞熒光計上測定熒光強度。該測定法進一步描述于Zlokarnik等(1998)，Science，27884-88。如所描述，測試了下面的PEG化GLP-1肽并將EC50值在下面列出(將V8GLP-1的EC50值設(shè)為100％)V8C16-3.4kDaDPSE-PEG4％V8-3.4kDaPEG-FMOC87％V8C38-3.4kDaDPSE-PEG18％V8C38-40kDaPEG3％V8E22C16-40kDaPEG0.7％V8E22I33C40-40kDaPEG(CEX-51)9.4+/-1.5％[n＝5]實施例5-衍生的GLP-1肽的藥物代謝動力學(xué)分析對于雄性SD大鼠以0.1mg/kg的劑量通過靜脈內(nèi)(IV)或者皮下(SC)途徑施用PEG化GLP-1類似物(V8E22I33C40-40kDaPEG(PEG化的、C40-修飾的CEX-51))。在給藥后的0-336小時內(nèi)不同時間將動物進行放血處理(對于IV施用，每個時間點取2只動物，對于SC施用每個時間點取3只動物)。從每一個樣品收集血漿并且用放射免疫測定法進行分析。使用模型依賴(對于IV所得的數(shù)據(jù))和模型非依賴(對于SC所得的數(shù)據(jù))的方法(WinNonlinPro)計算藥物代謝動力學(xué)參數(shù)。藥物代謝動力學(xué)參數(shù)報告于下表1。通過IV進行施用的PEG化GLP-1類似物的消除半衰期大約為1.5天，而通過SC進行施用的PEG化GLP-1類似物的消除半衰期大約為1.3天。沒有不利臨床觀察與經(jīng)IV或者SC施用0.1mg/kg的V8E22I33C40-40kDaPEG相關(guān)。對于化合物可以觀察到延長的消除半衰期、降低的清除率以及相對高的皮下生物利用率(大約60％)。表1-a所觀察的血漿濃度最大值。b所觀察的達血漿濃度最大值的時間。c所測定的從0到無窮大的血漿濃度-時間曲線下的面積。d以天計的消除半衰期。e作為生物利用率函數(shù)的總的身體清除率。f作為生物利用率函數(shù)的穩(wěn)態(tài)時的分布容積。g生物利用率的百分數(shù)。當將V8-GLP(7-37)OH以10μg/kg的劑量以同樣的IV途徑施用于Fischer344大鼠后，如下面所列所得到的清除率和消除半衰期極其不同。清除率1449ml/hr/kgt1/2(小時)0.05對于雄性獼猴以0.1mg/kg的劑量通過靜脈內(nèi)(IV)或者皮下(SC)途徑施用PEG化GLP-1類似物(V8E22I33C40-40kDaPEG(PEG化的、C40-修飾的CEX-51))。在給藥后的0-336小時內(nèi)不同時間將動物進行放血處理。從每一個樣品收集血漿并且用放射免疫測定法進行分析。使用模型依賴(對于IV所得的數(shù)據(jù))和模型非依賴(對于SC所得的數(shù)據(jù))的方法計算藥物代謝動力學(xué)參數(shù)(WinNonlinPro)。藥物代謝動力學(xué)參數(shù)報告于下表2。通過IV施用的PEG化GLP-1類似物的消除半衰期大約為59.5小時而通過SC施用的PEG化GLP-1類似物的消除半衰期大約為61.6小時。表2.a所觀察的血漿濃度最大值。b所觀察的達血漿濃度最大值的時間。c所測定的從0到無窮大的血漿濃度-時間曲線下的面積。d消除半衰期。e作為生物利用率函數(shù)的總的身體清除率。f作為生物利用率函數(shù)的分布容積。SD＝標準差實施例6-衍生的GLP-1肽的藥物動力學(xué)分析對于雄性的C57BL/6OlaHsd-Lepob小鼠以3nmol/kg(12.33mg/kg＝0.62μg(微克)/50g小鼠)或者10nmol/kg(41mg/kg＝2μg(微克)/50g小鼠)的劑量，經(jīng)皮下(SC)途徑施用PEG化GLP-1類似物(V8E22I33C40-40kDaPEG(PEG化的、C40-修飾的CEX-51))，對應(yīng)的對照小鼠只接受載體。在上午11:00點將動物進行單次注射PEG化GLP-1類似物或者載體(每個時間點6只小鼠)。然后將小鼠進行禁食過夜并進行IPTGG處理(1g右旋糖/kg，腹膜內(nèi)注射)。在葡萄糖注射之前和之后的15、30、60、90和120分鐘之后重復(fù)取樣用于測定葡萄糖和胰島素。藥物動力學(xué)參數(shù)公布于下表。序列表<110>伊萊利利公司<120>聚乙二醇連接的GLP-1化合物<130>X-16020<140>60/456081<141>2003-03-19<160>10<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>31<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>1HisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArgGly202530<210>2<211>30<212>PRT<213>人<400>2HisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>3<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>Xaa在位置1L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨組氨酸、2-氨基組氨酸、b-羥基組氨酸、高組氨酸、a-氟甲基組氨酸或者a-甲基組氨酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>Xaa在位置2是Ala，Gly，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>Xaa在位置5是Thr或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>Xaa在位置6是Phe，Trp，Tyr，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>Xaa在位置10是Val，Trp，Ile，Leu，Phe，Tyr，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>Xaa在位置12是Ser，Trp，Tyr，Phe，Lys，Ile，Leu，或Val<220><221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>Xaa在位置13是Tyr，Trp，或Phe<220><221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>Xaa在位置14是Leu，Phe，Tyr，或Trp<220><221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>Xaa在位置16是Gly，Glu，Asp，Lys，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)<223>Xaa在位置17是Gln或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(18)..(18)<223>Xaa在位置18是Ala或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(19)..(19)<223>Xaa在位置19是Ala，Val，Ile，Leu，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(20)..(20)<223>Xaa在位置20是Lys或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(21)..(21)<223>Xaa在位置21是Glu，Ile，Ala，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(24)..(24)<223>Xaa在位置24是Ala，Glu，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(27)..(27)<223>Xaa在位置27是Val或Ile<220><221>MISC_FEATURE<222>(28)..(28)<223>Xaa在位置28是Lys或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(29)..(29)<223>Xaa在位置29是Gly或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(30)..(30)<223>Xaa在位置30是Arg或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(31)..(31)<223>Xaa在位置31是Gly，His，Cys，缺失，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(31)..(31)<223>酰胺化<400>3XaaXaaGluGlyXaaXaaThrSerAspXaaSerXaaXaaXaaGluXaa151015XaaXaaXaaXaaXaaPheIleXaaTrpLeuXaaXaaXaaXaaXaa202530<210>4<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>Xaa在位置1是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨組氨酸、2-氨基組氨酸、b-羥基組氨酸、高組氨酸、a-氟甲基組氨酸或者a-甲基組氨酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>Xaa在位置2是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>Xaa在位置5是Thr或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>Xaa在位置6是Phe或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>Xaa在位置10是Val，Phe，Tyr，Trp，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>Xaa在位置12是Ser，Tyr，Trp，Phe，Lys，Ile，Leu，或Val<220><221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>Xaa在位置13是Tyr或Phe<220><221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>Xaa在位置16是Gly，Glu，Asp，Lys，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)<223>Xaa在位置17是Gln或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(18)..(18)<223>Xaa在位置18是Ala或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(19)..(19)<223>Xaa在位置19是Ala，Val，Ile，Leu，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(20)..(20)<223>Xaa在位置20是Lys或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(21)..(21)<223>Xaa在位置21是Glu或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(24)..(24)<223>Xaa在位置24是Ala或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(27)..(27)<223>Xaa在位置27是Val或Ile<220><221>MISC_FEATURE<222>(28)..(28)<223>Xaa在位置28是Lys或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(29)..(29)<223>Xaa在位置29是Gly或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(30)..(30)<223>Xaa在位置30是Arg或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(31)..(31)<223>Xaa在位置31是Gly，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(31)..(31)<223>酰胺化<400>4XaaXaaGluGlyXaaXaaThrSerAspXaaSerXaaTyrLeuGluXaa151015XaaXaaXaaXaaXaaPheIleXaaTrpLeuXaaXaaXaaXaaXaa202530<210>5<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>Xaa在位置1是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨組氨酸、2-氨基組氨酸、b-羥基組氨酸、高組氨酸、a-氟甲基組氨酸或者a-甲基組氨酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>Xaa在位置2是Ala，Gly，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>Xaa在位置5是Thr或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>Xaa在位置6是Phe，Trp，Tyr，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>Xaa在位置10是Val，Trp，Ile，Leu，Phe，Tyr，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>Xaa在位置12是Ser，Trp，Tyr，Phe，Lys，Ile，Leu，或Val<220><221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>Xaa在位置13是Tyr，Trp，或Phe<220><221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>Xaa在位置14是Leu，Phe，Tyr，或Trp<220><221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>Xaa在位置16是Gly，Glu，Asp，Lys，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)<223>Xaa在位置17是Gln或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(18)..(18)<223>Xaa在位置18是Ala或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(19)..(19)<223>Xaa在位置19是Ala，Val，Ile，Leu，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(20)..(20)<223>Xaa在位置20是Lys或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(21)..(21)<223>Xaa在位置21是Glu，Ile，Ala，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(24)..(24)<223>Xaa在位置24是Ala，Glu，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(27)..(27)<223>Xaa在位置27是Val或Ile<220><221>MISC_FEATURE<222>(28)..(28)<223>Xaa在位置28是Lys，Asp，Arg，Glu，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(29)..(29)<223>Xaa在位置29是Gly或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(30)..(30)<223>Xaa在位置30是Gly，Pro，Arg，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(31)..(31)<223>Xaa在位置31是Gly，Pro，Ser，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(32)..(32)<223>Xaa在位置32是Ser，Pro，His或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(33)..(33)<223>Xaa在位置33是Ser，Arg，Thr，Trp，Lys，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(34)..(34)<223>Xaa在位置34是Ser，Gly，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(35)..(35)<223>Xaa在位置35是Ala，Asp，Arg，Glu，Lys，Gly，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(36)..(36)<223>Xaa在位置36是Pro，Ala，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(36)..(36)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(37)..(37)<223>Xaa在位置37是Pro，Ala，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(37)..(37)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(38)..(38)<223>Xaa在位置38是Pro，Ala，Arg，Lys，His，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(38)..(38)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(39)..(39)<223>Xaa在位置39是Ser，His，Pro，Lys，Arg，Gly，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(40)..(40)<223>Xaa在位置40是His，Ser，Arg，Lys，Pro，Gly，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(40)..(40)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(41)..(41)<223>Xaa在位置41是His，Ser，Arg，Lys，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(41)..(41)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(42)..(42)<223>Xaa在位置42是Gly，His，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(42)..(42)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(43)..(43)<223>Xaa在位置43是Pro，His，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(43)..(43)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(44)..(44)<223>Xaa在位置44是Ser，His，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(44)..(44)<223>酰胺化<400>5XaaXaaGluGlyXaaXaaThrSerAspXaaSerXaaXaaXaaGluXaa151015XaaXaaXaaXaaXaaPheIleXaaTrpLeuXaaXaaXaaXaaXaaXaa202530XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa3540<210>6<211>41<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的構(gòu)建體<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>Xaa在位置1是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨組氨酸、2-氨基組氨酸、b-羥基組氨酸、高組氨酸、a-氟甲基組氨酸或者a-甲基組氨酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>Xaa在位置2是Ala，Gly，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>Xaa在位置5是Thr或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>Xaa在位置6是Phe，Trp，Tyr，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>Xaa在位置10是Val，Trp，Ile，Leu，Phe，Tyr，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>Xaa在位置12是Ser，Trp，Tyr，Phe，Lys，Ile，Leu，Val<220><221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>Xaa在位置13是Tyr，Trp，或Phe<220><221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>Xaa在位置14是Leu，Phe，Tyr，或Trp<220><221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>Xaa在位置16是Gly，Glu，Asp，Lys或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)<223>Xaa在位置17是Gln或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(18)..(18)<223>Xaa在位置18是Ala或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(19)..(19)<223>Xaa在位置19是Ala，Val，Ile，Leu，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(20)..(20)<223>Xaa在位置20是Lys或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(21)..(21)<223>Xaa在位置21是Glu，Ile，Ala，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(24)..(24)<223>Xaa在位置24是Ala，Glu或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(27)..(27)<223>Xaa在位置27是Val或Ile<220><221>MISC_FEATURE<222>(28)..(28)<223>Xaa在位置28是Lys，Asp，Arg，Glu，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(29)..(29)<223>Xaa在位置29是Gly或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(30)..(30)<223>Xaa在位置30是Gly，Pro，Arg，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(31)..(31)<223>Xaa在位置31Gly，Pro，Ser，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(32)..(32)<223>Xaa在位置32是Ser，Pro，His，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(33)..(33)<223>Xaa在位置33是Ser，Arg，Thr，Trp，Lys，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(34)..(34)<223>Xaa在位置34是Ser，Gly，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(35)..(35)<223>Xaa在位置35是Ala，Asp，Arg，Glu，Lys，Gly，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(36)..(36)<223>Xaa在位置36是Pro，Ala，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(36)..(36)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(37)..(37)<223>Xaa在位置37是Pro，Ala，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(37)..(37)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(38)..(38)<223>Xaa在位置38是Pro，Ala，Arg，Lys，His，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(38)..(38)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(39)..(39)<223>Xaa在位置39是Ser，His，Pro，Lys，Arg，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(40)..(40)<223>Xaa在位置40是His，Ser，Arg，Lys，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(40)..(40)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(41)..(41)<223>Xaa在位置41是His，Ser，Arg，Lys，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(41)..(41)<223>酰胺化<400>6XaaXaaGluGlyXaaXaaThrSerAspXaaSerXaaXaaXaaGluXaa151015XaaXaaXaaXaaXaaPheIleXaaTrpLeuXaaXaaXaaXaaXaaXaa202530XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa3540<210>7<211>41<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的構(gòu)建體<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>Xaa在位置1是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨組氨酸、2-氨基組氨酸、b-羥基組氨酸、高組氨酸、a-氟甲基組氨酸或者a-甲基組氨酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>Xaa在位置2是Gly，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>Xaa在位置5是Thr或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>Xaa在位置6是Phe或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>Xaa在位置10是Val，Trp，Ile，Leu，Phe，Tyr，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>Xaa在位置16是Gly，Glu，Asp，Lys，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)<223>Xaa在位置17是Gln或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(18)..(18)<223>Xaa在位置18是Ala或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(19)..(19)<223>Xaa在位置19是Ala，Val，Ile，Leu，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(20)..(20)<223>Xaa在位置20是Lys或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(21)..(21)<223>Xaa在位置21是Glu或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(24)..(24)<223>Xaa在位置24是Ala或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(27)..(27)<223>Xaa在位置27是Val或Ile<220><221>MISC_FEATURE<222>(28)..(28)<223>Xaa在位置28是Lys，Asp，Arg，Glu，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(29)..(29)<223>Xaa在位置29是Gly或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(30)..(30)<223>Xaa在位置30是Gly，Pro，Arg，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(31)..(31)<223>Xaa在位置31是Gly，Pro，Ser，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(32)..(32)<223>Xaa在位置32是Ser，Pro，His，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(33)..(33)<223>Xaa在位置33是Ser，Arg，Thr，Trp，Lys，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(34)..(34)<223>Xaa在位置34是Ser，Gly，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(35)..(35)<223>Xaa在位置35是Ala，Asp，Arg，Glu，Lys，Gly，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(36)..(36)<223>Xaa在位置36是Pro，Ala，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(37)..(37)<223>Xaa在位置37是Pro，Ala，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(38)..(38)<223>Xaa在位置38是Pro，Ala，Arg，Lys，HisCys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(38)..(38)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(39)..(39)<223>Xaa在位置39是Ser，His，Pro，Lys，Arg，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(40)..(40)<223>Xaa在位置40是His，Ser，Arg，Lys，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(40)..(40)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(41)..(41)<223>Xaa在位置41是His，Ser，Arg，Lys，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(41)..(41)<223>酰胺化<400>7XaaXaaGluGlyXaaXaaThrSerAspXaaSerSerTyrLysGluXaa151015XaaXaaXaaXaaXaaPheIleXaaTrpLeuXaaXaaXaaXaaXaaXaa202530XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa3540<210>8<211>41<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的構(gòu)建體<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>Xaa在位置1是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨組氨酸、2-氨基組氨酸、b-羥基組氨酸、高組氨酸、a-氟甲基組氨酸或者a-甲基組氨酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>Xaa在位置2是Gly，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>Xaa在位置5是Thr或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>Xaa在位置6是Phe或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>Xaa在位置10是Val或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>Xaa在位置16是Gly，Glu，Asp，Lys或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)<223>Xaa在位置17是Gln或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(18)..(18)<223>Xaa在位置18是Ala或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(19)..(19)<223>Xaa在位置19是Ala，Val，Ile，Leu，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(20)..(20)<223>Xaa在位置20是Lys或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(21)..(21)<223>Xaa在位置21是Glu或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(24)..(24)<223>Xaa在位置24是Ala或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(27)..(27)<223>Xaa在位置27是Val或Ile<220><221>MISC_FEATURE<222>(28)..(28)<223>Xaa在位置28是Lys或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(29)..(29)<223>Xaa在位置29是Gly或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(30)..(30)<223>Xaa在位置30是Gly或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(31)..(31)<223>Xaa在位置31是Pro或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(32)..(32)<223>Xaa在位置32是Ser，Pro，His，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(33)..(33)<223>Xaa在位置33是Ser，Arg，Thr，Trp，Lys，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(34)..(34)<223>Xaa在位置34是Ser，Gly，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(35)..(35)<223>Xaa在位置35是Ala，Asp，Arg，Glu，Lys，Gly，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(36)..(36)<223>Xaa在位置36是Pro，Ala，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(37)..(37)<223>Xaa在位置37是Pro，Ala，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(38)..(38)<223>Xaa在位置38是Pro，Ala，Arg，Lys，His，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(38)..(38)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(39)..(39)<223>Xaa在位置39是Ser，His，Pro，Lys，Arg，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(40)..(40)<223>Xaa在位置40是His，Ser，Arg，Lys，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(40)..(40)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(41)..(41)<223>Xaa在位置41是His，Ser，Arg，Lys，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(41)..(41)<223>酰胺化<400>8XaaXaaGluGlyXaaXaaThrSerAspXaaSerSerTyrLysGluXaa151015XaaXaaXaaXaaXaaPheIleXaaTrpLeuXaaXaaXaaXaaXaaXaa202530XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa3540<210>9<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>Xaa在位置5是Thr或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>Xaa在位置6是Phe或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>Xaa在位置10是Val或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>Xaa在位置16是Gly或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)<223>Xaa在位置17是Gln或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(18)..(18)<223>Xaa在位置18是Ala或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(19)..(19)<223>Xaa在位置19是Ala或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(20)..(20)<223>Xaa在位置20是Lys或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(21)..(21)<223>Xaa在位置21是Glu或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(24)..(24)<223>Xaa在位置24是Ala或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(28)..(28)<223>Xaa在位置28是Lys或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(29)..(29)<223>Xaa在位置29是Gly或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(30)..(30)<223>Xaa在位置30是Gly或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(31)..(31)<223>Xaa在位置31是Pro或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(32)..(32)<223>Xaa在位置32是Ser，Pro，His或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(33)..(33)<223>Xaa在位置33是Ser，Arg，Thr，Trp，Lys，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(34)..(34)<223>Xaa在位置34是Ser，Gly，或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(35)..(35)<223>Xaa在位置35是Ala，Asp，Arg，Glu，Lys，Gly或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(36)..(36)<223>Xaa在位置36是Pro，Ala，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(36)..(36)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(37)..(37)<223>Xaa在位置37是Pro，Ala，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(37)..(37)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(38)..(38)<223>Xaa在位置38是Pro，Ala，Arg，Lys，His，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(38)..(38)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(39)..(39)<223>Xaa在位置39是Ser，His，Pro，Lys，Arg，Gly，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(40)..(40)<223>Xaa在位置40是His，Ser，Arg，Lys，Pro，Gly，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(40)..(40)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(41)..(41)<223>Xaa在位置41是His，Ser，Arg，Lys，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(41)..(41)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(42)..(42)<223>Xaa在位置42是Gly，His，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(42)..(42)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(43)..(43)<223>Xaa在位置43是Pro，His，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(43)..(43)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(44)..(44)<223>Xaa在位置44是Ser，His，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(44)..(44)<223>酰胺化<400>9HisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyGlyProXaa202530XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa3540<210>10<211>39<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的構(gòu)建體<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>Xaa在位置1是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨組氨酸、2-氨基組氨酸、b-羥基組氨酸、高組氨酸、a-氟甲基組氨酸或者a-甲基組氨酸、Arg、Tyr<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>Xaa在位置2是Gly，Ser，Ala，或Thr<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>Xaa在位置3是Glu，Ala，或Asp<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>Xaa在位置4是Gly，Ala，或Val<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>Xaa在位置5是Thr，Cys，或Ala<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>Xaa在位置6是Phe，Cys，Ala，或Tyr<220><221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>Xaa在位置7是Thr或Ser<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>Xaa在位置8是Ser，Ala，或Thr<220><221>MISC_FEATURE<222>(9)..(9)<223>Xaa在位置9是Asp或Glu<220><221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>Xaa在位置10是Leu，Cys，Ala，Ile，Val，或Met<220><221>MISC_FEATURE<222>(11)..(11)<223>Xaa在位置11是Ser或Ala<220><221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>Xaa在位置12是Lys或Ala<220><221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>Xaa在位置13是Gln或Ala<220><221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>Xaa在位置14是Met，Ala，Leu，Ile，或Val<220><221>MISC_FEATURE<222>(15)..(15)<223>Xaa在位置15是Glu或Ala<220><221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>Xaa在位置16是Glu，Cys，或Ala<220><221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)<223>Xaa在位置17是Glu，Cys，或Ala<220><221>MISC_FEATURE<222>(18)..(18)<223>Xaa在位置18是Ala或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(19)..(19)<223>Xaa在位置19是Val，Cys，或Ala<220><221>MISC_FEATURE<222>(20)..(20)<223>Xaa在位置20是Arg，Cys，或Ala<220><221>MISC_FEATURE<222>(21)..(21)<223>Xaa在位置21是Leu，Cys，或Ala<220><221>MISC_FEATURE<222>(22)..(22)<223>Xaa在位置22是Phe，Ala，或Tyr<220><221>MISC_FEATURE<222>(23)..(23)<223>Xaa在位置23是Ile，Val，Leu，Gly，或Met<220><221>MISC_FEATURE<222>(24)..(24)<223>Xaa在位置24是Glu，Cys，Ala，或Asp<220><221>MISC_FEATURE<222>(25)..(25)<223>Xaa在位置25是Trp，Ala，Phe，或Tyr<220><221>MISC_FEATURE<222>(26)..(26)<223>Xaa在位置26是Leu或Ala<220><221>MISC_FEATURE<222>(27)..(27)<223>Xaa在位置27是Lys或Ala<220><221>MISC_FEATURE<222>(28)..(28)<223>Xaa在位置28是Asn，Cys，或Ala<220><221>MISC_FEATURE<222>(29)..(29)<223>Xaa在位置29是Gly或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(30)..(30)<223>Xaa在位置30是Gly或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(31)..(31)<223>Xaa在位置31是Pro或Cys<220><221>MISC_FEATURE<222>(32)..(32)<223>Xaa在位置32是Ser，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(32)..(32)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(33)..(33)<223>Xaa在位置33是Ser，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(33)..(33)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(34)..(34)<223>Xaa在位置34是Gly，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(34)..(34)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(35)..(35)<223>Xaa在位置35是Ala，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(35)..(35)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(36)..(36)<223>Xaa在位置36是Pro，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(36)..(36)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(37)..(37)<223>Xaa在位置37是Pro，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(37)..(37)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(38)..(38)<223>Xaa在位置38是Pro，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(38)..(38)<223>酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(39)..(39)<223>Xaa在位置39是Ser，Cys，缺乏，或經(jīng)修飾的殘基<220><221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>酰胺化<400>10XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa151015XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa202530XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa3權(quán)利要求1.PEG化GLP-1化合物，其包含共價連接有至少一個PEG分子的GLP-1化合物，其中每一個PEG連接到化合物的Cys或者Lys氨基酸上或者羧基末端氨基酸上并且其中PEG化GLP-1化合物的消除半衰期至少為1小時。2.PEG化GLP-1化合物，其中所述的PEG化GLP-1化合物包含如SEQIDNO1所示的GLP-1(7-37)OH的氨基酸序列在選自第26位Lys、第34位Lys和第37位Gly中的3個、2個或者1個殘基處共價連接有PEG分子。3.PEG化GLP-1化合物，其中所述的PEG化GLP-1化合物包含如SEQIDNO2所示的GLP-1(7-36)OH的氨基酸序列在選自第26位Lys、第34位Lys和第36位Arg中的3個、2個或者1個殘基處共價連接有PEG分子。4.包含式I(SEQIDNO3)氨基酸序列的PEG化GLP-1化合物Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Xaa11-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37式I(SEQIDNO3)其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨組氨酸、2-氨基組氨酸、β-羥基組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基組氨酸或者α-甲基組氨酸；Xaa8是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Ser或者Thr；Xaa11是Thr或者Cys；Xaa12是Phe、Trp、Tyr或者Cys；Xaa16是Val、Trp、Ile、Leu、Phe、Tyr或者Cys；Xaa18是Ser、Trp、Tyr、Phe、Lys、Ile、Leu或者Val；Xaa19是Tyr、Trp或者Phe；Xaa20是Leu、Phe、Tyr或者Trp；Xaa22是Gly、Glu、Asp、Lys或者Cys；Xaa23是Gln或者Cys；Xaa24是Ala或者Cys；Xaa25是Ala、Val、Ile、Leu或者Cys；Xaa26是Lys或者Cys；Xaa27是Glu、Ile、Ala或者Cys；Xaa30是Ala、Glu或者Cys；Xaa33是Val或者Ile；Xaa34是Lys或者Cys；Xaa35是Gly或者Cys；Xaa36是Arg或者Cys；Xaa37是Gly、His、Cys、NH2或者缺乏；并且其中2個或者1個Cys殘基共價連接有PEG分子，或者3個、2個或者1個Lys殘基共價連接有PEG分子，并且條件是在分子中具有2個、1個或者0個Cys。5.包含式II(SEQIDNO4)的氨基酸序列的PEG化GLP-1化合物Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Xaa11-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37式II(SEQIDNO4)其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨組氨酸、2-氨基組氨酸、β-羥基組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基組氨酸或者α-甲基組氨酸；Xaa8是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser或者Thr；Xaa11是Thr或者Cys；Xaa12是Phe或者Cys；Xaa16是Val、Phe、Tyr、Trp或者Cys；Xaa18是Ser、Tyr、Trp、Phe、Lys、Ile、Leu或者Val；Xaa19是Tyr或者Phe；Xaa22是Gly、Glu、Asp、Lys或者Cys；Xaa23是Gln或者Cys；Xaa24是Ala或者Cys；Xaa25是Ala、Val、Ile、Leu或者Cys；Xaa26是Lys或者Cys；Xaa27是Glu或者Cys；Xaa30是Ala或者Cys；Xaa33是Val或者Ile；Xaa34是Lys或者Cys；Xaa35是Gly或者Cys；Xaa36是Arg或者Cys；和Xaa37是Gly、Cys、NH2或者缺乏，并且其中2個或者1個Cys殘基共價連接有PEG分子，或者3個、2個或者1個Lys殘基共價連接有PEG分子，并且條件是在分子中具有2個、1個或者0個Cys。6.包含式III(SEQIDNO5)的氨基酸序列的PEG化GLP-1化合物Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Xaa11-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47-Xaa48-Xaa49-Xaa50式III(SEQIDNO5)其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨組氨酸、2-氨基組氨酸、β-羥基組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基組氨酸或者α-甲基組氨酸；Xaa8是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Ser或者Thr；Xaa11是Thr或者Cys；Xaa12是Phe、Trp、Tyr或者Cys；Xaa16是Val、Trp、Ile、Leu、Phe、Tyr或者Cys；Xaa18是Ser、Trp、Tyr、Phe、Lys、Ile、Leu或者Val；Xaa19是Tyr、Trp或者Phe；Xaa20是Leu、Phe、Tyr或者Trp；Xaa22是Gly、Glu、Asp、Lys或者Cys；Xaa23是Gln或者Cys；Xaa24是Ala或者Cys；Xaa25是Ala、Val、Ile、Leu或者Cys；Xaa26是Lys或者Cys；Xaa27是Glu、Ile、Ala或者Cys；Xaa30是Ala、Glu或者Cys；Xaa33是Val或者Ile；Xaa34是Lys、Asp、Arg、Glu或者Cys；Xaa35是Gly或者Cys；Xaa36是Gly、Pro、Arg或者Cys；Xaa37是Gly、Pro、Ser或者Cys；Xaa38是Ser、Pro、His或者Cys；Xaa39是Ser、Arg、Thr、Trp、Lys或者Cys；Xaa40是Ser、Gly或者Cys；Xaa41是Ala、Asp、Arg、Glu、Lys、Gly或者Cys；Xaa42是Pro、Ala、Cys或者NH2或者缺乏；Xaa43是Pro、Ala、Cys、NH2或者缺乏；Xaa44是Pro、Ala、Arg、Lys、His、Cys、NH2或者缺乏；Xaa45是Ser、His、Pro、Lys、Arg、Gly、Cys、NH2或者缺乏；Xaa46是His、Ser、Arg、Lys、Pro、Gly、Cys、NH2或者缺乏；并且Xaa47是His、Ser、Arg、Lys、Cys、NH2或者缺乏；Xaa48是Gly、His、Cys、NH2或者缺乏；Xaa49是Pro、His、Cys、NH2或者缺乏；Xaa50是Ser、His、Cys、Ser-NH2、His-NH2、Cys-NH2或者缺乏；并且其中2個或者1個Cys殘基共價連接有PEG分子，或者3個、2個或者1個Lys殘基共價連接有PEG分子，并且條件是如果Xaa42、Xaa43、Xaa44、Xaa45、Xaa46、Xaa47、Xaa48或者Xaa49缺乏時則下游的每一氨基酸缺乏；并且條件是在分子中具有2個、1個或者0個Cys。7.包含式IV(SEQIDNO6)的氨基酸序列的PEG化GLP-1化合物Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Xaa11-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47式IV(SEQIDNO6)其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨組氨酸、2-氨基組氨酸、β-羥基組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基組氨酸或者α-甲基組氨酸；Xaa8是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Ser或者Thr；Xaa11是Thr或者Cys；Xaa12是Phe、Trp、Tyr或者Cys；Xaa16是Val、Trp、Ile、Leu、Phe、Tyr或者Cys；Xaa18是Ser、Trp、Tyr、Phe、Lys、Ile、Leu或者Val；Xaa19是Tyr、Trp或者Phe；Xaa20是Leu、Phe、Tyr或者Trp；Xaa22是Gly、Glu、Asp、Lys或者Cys；Xaa23是Gln或者Cys；Xaa24是Ala或者Cys；Xaa25是Ala、Val、Ile、Leu或者Cys；Xaa26是Lys或者Cys；Xaa27是Glu、Ile、Ala或者Cys；Xaa30是Ala、Glu或者Cys；Xaa33是Val或者Ile；Xaa34是Lys、Asp、Arg、Glu或者Cys；Xaa35是Gly或者Cys；Xaa36是Gly、Pro、Arg或者Cys；Xaa37是Gly、Pro、Ser或者Cys；Xaa38是Ser、Pro、His或者Cys；Xaa39是Ser、Arg、Thr、Trp、Lys或者Cys；Xaa40是Ser、Gly或者Cys；Xaa41是Ala、Asp、Arg、Glu、Lys、Gly或者Cys；Xaa42是Pro、Ala、Cys、NH2或者缺乏；Xaa43是Pro、Ala、Cys、NH2或者缺乏；Xaa44是Pro、Ala、Arg、Lys、His、Cys、NH2或者缺乏；Xaa45是Ser、His、Pro、Lys、Arg、Cys、NH2或者缺乏；Xaa46是His、Ser、Arg、Lys、Cys、NH2或者缺乏；并且Xaa47是His、Ser、Arg、Lys、Cys、NH2或者缺乏；并且其中2個或者1個Cys殘基共價連接有PEG分子，或者3個、2個或者1個Lys殘基共價連接有PEG分子，并且條件是如果Xaa42、Xaa43、Xaa44、Xaa45或者Xaa46缺乏時則下游的每一氨基酸缺乏；并且條件是在分子中具有2個、1個或者0個Cys。8.包含式V(SEQIDNO7)的氨基酸序列的PEG化GLP-1化合物Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Xaa11-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Ser-Tyr-Lys-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47式V(SEQIDNO7)其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨組氨酸、2-氨基組氨酸、β-羥基組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基組氨酸或者α-甲基組氨酸；Xaa8是Gly、Val、Leu、Ile、Ser或者Thr；Xaa11是Thr或者Cys；Xaa12是Pbe或者Cys；Xaa16是Val、Trp、Ile、Leu、Phe、Tyr或者Cys；Xaa22是Gly、Glu、Asp、Lys或者Cys；Xaa23是Gln或者Cys；Xaa24是Ala或者Cys；Xaa25是Ala、Val、Ile、Leu或者Cys；Xaa26是Lys或者Cys；Xaa27是Glu或者Cys；Xaa30是Ala或者Cys；Xaa33是Val或者Ile；Xaa34是Lys、Asp、Arg、Glu或者Cys；Xaa35是Gly或者Cys；Xaa36是Gly、Pro、Arg或者Cys；Xaa37是Gly、Pro、Ser或者Cys；Xaa38是Ser、Pro、His或者Cys；Xaa39是Ser、Arg、Thr、Trp、Lys或者Cys；Xaa40是Ser、Gly或者Cys；Xaa41是Ala、Asp、Arg、Glu、Lys、Gly或者Cys；Xaa42是Pro、Ala或者Cys；Xaa43是Pro、Ala或者Cys；Xaa44是Pro、Ala、Arg、Lys、His、Cys、NH2或者缺乏；Xaa45是Ser、His、Pro、Lys、Arg、Cys、NH2或者缺乏；Xaa46是His、Ser、Arg、Lys、Cys、NH2或者缺乏；并且Xaa47是His、Ser、Arg、Lys、Cys、NH2或者缺乏；并且其中2個或者1個Cys殘基共價連接有PEG分子，或者3個、2個或者1個Lys殘基共價連接有PEG分子，并且條件是如果Xaa44、Xaa45、Xaa46或者Xaa47缺乏時則下游的每一氨基酸缺乏；并且條件是在分子中具有2個、1個或者0個Cys。9.包含式VI(SEQIDNO8)的氨基酸序列的PEG化GLP-1化合物Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Xaa11-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Ser-Tyr-Lys-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47式VI(SEQIDNO8)其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨組氨酸、2-氨基組氨酸、β-羥基組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基組氨酸或者α-甲基組氨酸；Xaa8是Gly、Val、Leu、Ile、Ser或者Thr；Xaa11是Thr或者Cys；Xaa12是Phe或者Cys；Xaa16是Val或者Cys；Xaa22是Gly、Glu、Asp、Lys或者Cys；Xaa23是Gln或者Cys；Xaa24是Ala或者Cys；Xaa25是Ala、Val、Ile、Leu或者Cys；Xaa26是Lys或者Cys；Xaa27是Glu或者Cys；Xaa30是Ala或者Cys；Xaa33是Val或者Ile；Xaa34是Lys或者Cys；Xaa35是Gly或者Cys；Xaa36是Gly或者Cys；Xaa37是Pro或者Cys；Xaa38是Ser、Pro、His或者Cys；Xaa39是Ser、Arg、Thr、Trp、Lys或者Cys；Xaa40是Ser、Gly或者Cys；Xaa41是Ala、Asp、Arg、Glu、Lys、Gly或者Cys；Xaa42是Pro、Ala或者Cys；Xaa43是Pro、Ala或者Cys；Xaa44是Pro、Ala、Arg、Lys、His、Cys、NH2或者缺乏；Xaa45是Ser、His、Pro、Lys、Arg、Cys、NH2或者缺乏；Xaa46是His、Ser、Arg、Lys、Cys、NH2或者缺乏；并且Xaa47是His、Ser、Arg、Lys、Cys、NH2或者缺乏；并且其中2個或者1個Cys殘基共價連接有PEG分子，或者3個、2個或者1個Lys殘基共價連接有PEG分子，并且條件是如果Xaa44、Xaa45、Xaa46或者Xaa47缺乏時則下游的每一氨基酸缺乏；并且條件是在分子中具有2個、1個或者0個Cys。10.包含式VII(SEQIDNO9)的氨基酸序列的PEG化GLP-1化合物His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47-Xaa48-Xaa49-Xaa50式VII(SEQIDNO9)其中Xaa11是Thr或者Cys；Xaa12是Phe或者Cys；Xaa16是Val或者Cys；Xaa22是Gly或者Cys；Xaa23是Gln或者Cys；Xaa24是Ala或者Cys；Xaa25是Ala或者Cys；Xaa26是Lys或者Cys；Xaa27是Glu或者Cys；Xaa30是Ala或者Cys；Xaa34是Lys或者Cys；Xaa35是Gly或者Cys；Xaa36是Gly或者Cys；Xaa37是Pro或者Cys；Xaa38是Ser、Pro、His或者Cys；Xaa39是Ser、Arg、Thr、Trp、Lys或者Cys；Xaa40是Ser、Gly或者Cys；Xaa41是Ala、Asp、Arg、Glu、Lys、Gly或者Cys；Xaa42是Pro、Ala、Cys、NH2或者缺乏；Xaa43是Pro、Ala、Cys、NH2或者缺乏；Xaa44是Pro、Ala、Arg、Lys、His、Cys、NH2或者缺乏；Xaa45是Ser、His、Pro、Lys、Arg、Gly、Cys、NH2或者缺乏；Xaa46是His、Ser、Arg、Lys、Pro、Gly、Cys、NH2或者缺乏；并且Xaa47是His、Ser、Arg、Lys、Cys、NH2或者缺乏；Xaa48是Gly、His、Cys、NH2或者缺乏；Xaa49是Pro、His、Cys、NH2或者缺乏；并且Xaa50是Ser、His、Cys、Ser-NH2、His-NH2、Cys-NH2或者缺乏；其中所述的GLP-1化合物包含1到6個的進一步取代并且其中2個或者1個Cys殘基共價連接有PEG分子，或者3個、2個或者1個Lys殘基共價連接有PEG分子，并且條件是如果Xaa44、Xaa45、Xaa46或者Xaa47缺乏時則下游的每一氨基酸缺乏；并且條件是在分子中具有2個、1個或者0個Cys；并且條件是如果Xaa42、Xaa43、Xaa44、Xaa45、Xaa46、Xaa47、Xaa48或者Xaa49缺乏時則下游的每一氨基酸缺乏。11.權(quán)利要求10的PEG化GLP-1化合物，其中進一步的替代選自下列替代中的至少一種a)第7位His被D-組氨酸、脫氨組氨酸、2-氨基組氨酸、β-羥基組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基組氨酸或者α-甲基組氨酸替代；b)第8位Ala被Gly、Val、Leu、Ile、Ser或者Thr替代；c)第12位Phe被Trp或者Tyr替代；d)第16位Val被Trp、Ile、Leu、Phe或者Tyr替代；e)第18位Ser被Trp、Tyr、Phe、Lys、Ile、Leu或者Val替代；f)第19位Tyr被Trp或者Phe替代；g)第20位Leu被Phe、Tyr或者Trp替代；h)第22位Gly被Glu、Asp或者Lys替代；i)第25位Ala被Val、Ile或者Leu替代；j)第27位Glu被Ile或者Ala替代；k)第30位Ala被Glu替代；l)第33位Val被Ile替代；并且m)第34位Lys被Asp、Arg或者Glu替代。12.包含式VIII(SEQIDNO10)的氨基酸序列的PEG化GLP-1化合物Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Xaa32-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45式VIII(SEQIDNO10)其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨組氨酸、2-氨基組氨酸、β-羥基組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基組氨酸或者α-甲基組氨酸、Arg、Tyr、Ala或者Val；Xaa8是Gly、Ser、Ala或者Thr；Xaa9是Glu、Ala或者Asp；Xaa10是Gly、Ala或者Val；Xaa11是Thr、Cys或者Ala；Xaa12是Phe、Cys、Ala或者Tyr；Xaa13是Thr或者Ser；Xaa14是Ser、Ala或者Thr；Xaa15是Asp或者Glu；Xaa16是Leu、Cys、Ala、Ile、Val或者Met；Xaa17是Ser或者Ala；Xaa18是Lys或者Ala；Xaa19是Gln或者Ala；Xaa20是Met、Ala、Leu、Ile或者Val；Xaa21是Glu或者Ala；Xaa22是Glu、Cys或者Ala；Xaa23是Glu、Cys或者Ala；Xaa24是Ala或者Cys；Xaa25是Val、Cys或者Ala；Xaa26是Arg、Cys或者AlaXaa27是Leu、Cys或者Ala；Xaa28是Phe、Ala或者Tyr；Xaa29是Ile、Val、Leu、Gly或者Met；Xaa30是Glu、Cys、Ala或者Asp；Xaa31是Trp、Ala、Phe或者Tyr；Xaa32是Leu或者Ala；Xaa33是Lys或者Ala；Xaa34是Asn、Cys或者Ala；Xaa35是Gly或者Cys；Xaa36是Gly或者Cys；Xaa37是Pro或者CysXaa38是Ser、Cys、NH2或者缺乏；Xaa39是Ser、Cys、NH2或者缺乏；Xaa40是Gly、Cys、NH2或者缺乏；Xaa41是Ala、Cys、NH2或者缺乏；Xaa42是Pro、Cys、NH2或者缺乏；Xaa43是Pro、Cys、NH2或者缺乏；Xaa44是Pro、Cys、NH2或者缺乏；并且Xaa45是Ser、Cys、NH2或者缺乏；并且其中2個或者1個Cys殘基共價連接有PEG分子；并且條件是在分子中具有2個或1個Cys；進一步的條件是Xaa9、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa18、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa22、Xaa23、Xaa24、Xaa26、Xaa27、Xaa30、Xaa31、Xaa32中不多于3個為Ala；并且進一步的條件是如果Xaa1是His、Arg或者Tyr則Xaa9、Xaa10和Xaa16中至少一個是Ala；并且進一步的條件是如果Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43或者Xaa44缺乏則下游的每一氨基酸缺乏。13.對需要刺激GLP-1受體的受試者刺激GLP-1受體的方法，其中所述的方法包括對受試者施用有效量的權(quán)利要求1-12中任意一項所述的PEG化GLP-1化合物的步驟。14.權(quán)利要求13的方法，其中對受試者進行非胰島素依賴型糖尿病的治療。15.權(quán)利要求13的方法，其中對受試者進行非胰島素依賴型糖尿病的預(yù)防性治療。16.權(quán)利要求13的方法，其中對受試者進行肥胖癥、中風、心肌梗塞、突然發(fā)作、過敏性結(jié)腸綜合征或者功能性消化不良的治療。17.權(quán)利要求1-13中任意一項所述的PEG化GLP-1化合物的用途，其中所述的用途是用于制備治療非胰島素依賴型糖尿病、肥胖癥、中風、心肌梗塞、過敏性結(jié)腸綜合征或者功能性消化不良的藥物。18.權(quán)利要求17的用途，其中藥物用于治療非胰島素依賴型糖尿病。19.權(quán)利要求17的用途，其中藥物用于治療肥胖癥。20.權(quán)利要求17的用途，其中藥物用于治療過敏性結(jié)腸綜合征或者功能性消化不良。全文摘要本發(fā)明提供了偶聯(lián)有至少一個聚乙二醇分子或其衍生物的GLP－1化合物，導(dǎo)致產(chǎn)生了與其非PEG化肽相比半衰期延長和清除率減慢的生物活性肽。這些PEG化GLP－1化合物和組合物可用于治療能夠通過降低血液葡萄糖、抑制胃和/或腸蠕動和胃和/或腸排空或者抑制食物攝取而受益的糖尿病、肥胖癥、過敏性結(jié)腸綜合征和其它疾病。文檔編號A61K38/00GK1832959SQ200480007436公開日2006年9月13日申請日期2004年3月19日優(yōu)先權(quán)日2003年3月19日發(fā)明者R·D·迪馬其,W·格萊斯納,R·L·小米利肯,A·M·維克,張連山申請人:伊萊利利公司