專利名稱：在人轉移性腫瘤細胞中表達的糖蛋白抗原sima135的制作方法
技術領域：
本發(fā)明總體上涉及診斷癌癥和減少哺乳動物(例如人類)癌細胞轉移的方法。具體來講，本發(fā)明涉及到一種腫瘤標記蛋白質的用途，用于產生可用來檢測細胞中該蛋白質產量增加的抗體，并涉及所述抗體的用途，用來減少產生所述腫瘤標記蛋白質的癌細胞的轉移。
背景技術：
惡性腫瘤將細胞轉移到一個新的組織并且產生次生腫瘤，而良性腫瘤不會產生次生腫瘤。這種產生次生腫瘤的過程稱為轉移，是一種復雜的過程，次生腫瘤細胞集結位點遠離初生腫瘤。腫瘤轉移仍然是癌癥患者死亡的主要原因，然而對腫瘤細胞傳播的分子機制不是很清楚。
轉移是一個多步過程，其中腫瘤細胞必需從初生瘤分離、侵入細胞基質、滲透血管，進而進入循環(huán)系統(tǒng)(intravasate)、停滯在一個較遠的位點、從血液中釋放出來(extravasate)并且生長。參見例如G.L.Nicolson(1982)Biochim.Biophis.Acta.695113-176；G.L.Nicolson和G.Poste(1983)In.Rev.Exp.Pathol.2577-181；G.Poste和I.J.Fidler(1980)Nature 283139-145；以及E.Roos(1984)Biochim.Biophis.Acta.738263-284。由于該過程復雜，據(jù)認為很多基因介導腫瘤細胞的轉移。轉移性表型確實與包括蛋白酶、粘附分子等在內的很多蛋白的表達相關。然而往往缺乏或者很難證明一種特定蛋白直接參與傳播。L.A.Liotta和W.Stetler-Stevenson(1989)J.Natl.Cancer Inst.81556-557。
人鱗狀細胞癌HEp-3提供了一個能檢測和表征實現(xiàn)轉移性傳播的基因的獨特系統(tǒng)。通過在雞尿囊絨膜(CAM)上系列傳代而繁殖的HEp-3細胞具有致瘤和自發(fā)轉移能力(T+M+)。Ossowski和E.Reich(1980a)CancerRes.402300-2309)。然而，這些細胞在體外持續(xù)生長，它們很容易形成初級腫瘤，但是隨著時間日益增長，它們轉變?yōu)榉寝D移型(T+M-)。L.Ossowski和E.Reich(1980b)Cancer Res.402310-2315)。在體外持續(xù)培養(yǎng)，它們最終轉變?yōu)榉侵铝鲂?T-M-)。轉移能力的喪失是可逆的。T+M-細胞轉到尿囊絨膜上生長2至3代將恢復形成自發(fā)瘤轉移。因而，通過改變生長條件，研究者可以操縱這些細胞的轉移能力。
人尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)直接參與HEp-3的傳播，人尿激酶型纖溶酶原激活物的特異性抗體可以抑制雞胚胎中HEp-3細胞的自發(fā)轉移性。L.Ossowski和E.Reich(1983b)Cell 35611-619。隨后發(fā)現(xiàn)，抑制uPA活性阻斷了單個的HEp-3細胞對CAM間葉細胞的侵潤。L.Ossowski(1988a)Cell 52321-328。然而，有活性的uPA顯然對腫瘤細胞進入血管內而非滲出血管是必需的。L.Ossowski(1988a)。因此，一些其他的因子也一定參與HEp-3的傳播和癌細胞的普遍傳播。J.P.Quigley等(1988)，CibaFoundation Symposium 14122-4.7，Brooks等(1993)，J.Cell Biol.122(6)1351-1359，以及Testa等，美國專利號6,245,898和6,498,014報道了利用“消減免疫(subtractive immunization)”產生單克隆抗體(mAbs)，它能識別HEp-3細胞表達的表面抗原，并且抑制在尿囊絨膜模型中腫瘤的轉移。然而，這些抗原與體內轉移不相關，并且也沒有顯示出直接參與體內轉移的過程。
因此，需要鑒定功能性參與癌細胞擴散的生物分子，以研發(fā)可用于抑制腫瘤細胞轉移至新組織的療法。也需要抑制腫瘤細胞轉移的方法和診斷癌癥的方法，以通過減少或消除癌細胞在患有癌癥的哺乳動物體內擴散而有利于控制癌癥。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及轉移細胞中產生的蛋白(SIMA135)(SEQ ID NO1)的鑒定和表征。因此，本發(fā)明提供糖基化和非糖基化形式的SIMA135。本發(fā)明同時提供特異地并且選擇地結合SIMA135和SIMA135片段的抗體。這些抗體能結合糖基化或非糖基化的SIMA135或者SIMA135片段。因此，本發(fā)明提供通過使用特異地結合SIMA135的抗體來抑制、減少或者消除癌細胞轉移的方法。本發(fā)明也提供在試驗樣品中診斷癌癥和確定癌細胞存在的方法。這些方法可用于哺乳動物，例如人類。本發(fā)明也提供含有特異地并且選擇地結合SIMA135和SIMA135片段的抗體的藥物組合物和試劑盒。本發(fā)明也提供篩選調節(jié)細胞產生SIMA135的試劑的方法。
本發(fā)明提供SIMA135和SIMA135片段。優(yōu)選地，SIMA135和SIMA135片段是非糖基化的。更優(yōu)選地，SIMA135或SIMA135片段是糖基化的。優(yōu)選地，SIMA135片段施與到生物體例如哺乳動物或者鳥類時，其是抗原性的并且能激發(fā)免疫反應。優(yōu)選地，SIMA135的抗原性片段是糖基化的。
本發(fā)明提供了結合SIMA135或SIMA135片段的抗體，例如單克隆抗體41-2。優(yōu)選地，當優(yōu)選的單克隆抗體選擇性和特異性地結合SIMA135時，抗體不是單克隆抗體41-2。優(yōu)選地，抗體是重組抗體。更優(yōu)選地，抗體是多克隆抗體。甚至更優(yōu)選地，抗體是人源化抗體。最優(yōu)選地，抗體是單克隆抗體。優(yōu)選地，抗體結合非糖基化的SIMA135或者非糖基化的SIMA135片段。更優(yōu)選地，抗體結合糖基化的SIMA135或者糖基化的SIMA135片段。
本發(fā)明提供抑制、減少或者消除癌細胞轉移的方法。所述方法涉及施與生物體其需要的能結合SIMA135的抗體。單克隆抗體41-2能結合SIMA135，也能與參與轉移的其它抗原結合，但是本方法優(yōu)選其它非單克隆抗體41-2的抗體。此種其它抗體能選擇地和特異地結合SIMA135。優(yōu)選地，生物體是哺乳動物。更優(yōu)選地，生物體是人類。優(yōu)選地，抗體非特異地結合SIMA135或者其片段。更優(yōu)選地，抗體特異地結合SIMA135或者其片段。優(yōu)選地，抗體是多克隆抗體。更優(yōu)選地，抗體是重組抗體。甚至更優(yōu)選地，抗體是單克隆抗體。最優(yōu)選地，抗體是人源化抗體。優(yōu)選地，抗體結合非糖基化的SIMA135或者非糖基化的SIMA135片段。更優(yōu)選地，抗體結合糖基化的SIMA135或者糖基化的SIMA135片段。優(yōu)選地，抗體作為藥物組合物施與需要其的生物體。
本發(fā)明也提供在生物體中診斷癌癥的方法。在一個實施方案中，結合SIMA135的抗體與獲自生物體的試驗樣品接觸，然后比較試驗樣品和無癌對照樣品結合的抗體相對數(shù)量。試驗樣品比對照樣品結合的抗體數(shù)量增多則說明生物體患有癌癥。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了在生物體診斷癌癥的免疫組織化學的方法，其中抗體與獲自生物體的試驗樣品接觸，比較試驗樣品顯示的抗體結合模式和對照樣品產生的抗體結合模式。如果使用試驗樣品產生的抗體結合模式與使用致癌對照樣品產生的抗體結合模式匹配，生物體診斷為患有癌癥。另外，如果試驗樣品的抗體結合模式不同于使用無癌對照樣品產生的抗體結合模式，這樣生物體診斷為患有癌癥。優(yōu)選地，優(yōu)選地，抗體非特異地結合SIMA135或其片段。更優(yōu)選地，優(yōu)選地，抗體特異地結合SIMA135或其片段。
本發(fā)明也提供了含有結合SIMA135或者其片段抗體以及可藥用載體的藥物組合物，條件是其中所述抗體不為單克隆抗體41-2。
本發(fā)明也提供包含結合SIMA135或者其片段的抗體以及包裝材料的試劑盒。
本發(fā)明提供鑒定能調節(jié)細胞產生SIMA135的試劑的方法。本發(fā)明還包括該方法中有效的細胞系和測試方法本身。優(yōu)選地，依照所述方法鑒定的試劑增加細胞SIMA135的產生。這種鑒定將證明某一試劑的致癌性，因此可用于致癌劑的快速試驗。更優(yōu)選地，依照該方法鑒定的試劑減少細胞SIMA135的產生。這種鑒定可證明此種試劑的抗致癌性。在一個實施方案中，將候選試劑與試驗細胞接觸，比較試驗細胞和未與該候選試劑接觸的對照細胞SIMA135的產生。與對照細胞相比，增加或者減少試驗細胞SIMA135的產生，則證明候選試劑調節(jié)細胞SIMA135的產生。優(yōu)選地，細胞是哺乳動物細胞。更優(yōu)選地，細胞是人細胞。甚至更優(yōu)選地，細胞是非轉移性的HEp3細胞。最優(yōu)選地，細胞是轉移性HEp3細胞。
附圖簡述

圖1顯示了SIMA135的氨基酸序列。信號序列為小寫字母，推斷的跨膜結構域用方框標記。12個共有的N糖基化基序(motif)用實心三角形標記。胞質酪氨酸殘基用圓圈標記。CUB結構域用下劃線標記，CUB結構域被認為跨越221位殘基到348位殘基以及417位殘基到544位殘基。胰蛋白酶消化鑒定的三個肽段和序列用上劃線標記。肽2前面的Arg殘基和肽3前面的Lys殘基用方框標記，以突出與胰蛋白酶對含有Arg/Lys的底物具特異性是一致的。胞質結構域PXXP序列用下劃線標記。在推斷的跨膜結構域之后共有的十六烷基化基序用實心圈標記。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及通過消減免疫途徑，利用命名為41-2的單克隆抗體從轉移性HEp3細胞中純化的一種糖基化蛋白質這一發(fā)現(xiàn)。該蛋白質命名為SIMA135(消減免疫M+Hep3相關的135kDa蛋白)。
SIMA135是指可以從細胞物理分離的蛋白質，這不同于通過翻譯核苷酸序列而推測得到的推定蛋白質。物理分離SIMA135對許多理由是有意義的。一個理由是，該蛋白質的分離說明該蛋白質的mRNA確實轉錄成多肽。第二，此處報道的該蛋白質的分離和鑒定說明該蛋白質是糖基化的。物理分離的糖基化蛋白質證實了多肽中的糖基化位點可以糖基化，沒有隱藏在折疊的蛋白質中而變得不能結合糖基轉移酶。由于已知糖基化參與蛋白質折疊和免疫原性的作用，這些構象是重要的。因此，當與由核苷酸序列推斷的理論上的多肽序列相比，分離SIMA135蛋白質是一個重大的進步。
此處顯示的SIMA135 cDNA編碼一個135kDa的，能特異地與mAb41-2進行特異性免疫反應的I型跨膜細胞表面蛋白質。免疫純化和氨基酸測序證實成熟的該蛋白質起始于30位的Phe，前面切除了29個氨基酸的信號肽。免疫細胞化學分析證實了此蛋白質定位于細胞表面和該蛋白質的I型定位。此外，Western印跡分析去糖基化的細胞裂解物表明由于N連接的多糖，成熟SIMA135的表觀分子量(約135kDa)和理論分子量(約90kDa)存在多達40kDa的差異，該結果與存在的12個可能的胞外糖基化位點相一致。Western印跡分析證明，SIMA135是一個酪氨酸磷酸化蛋白質，這與細胞內存在5個酪氨酸殘基相一致。另外，利用PP2抑制劑證明，Src激酶家族成員參與HEp3細胞中SIMA135的酪氨酸磷酸化。
SIMA135的結構域表明其可與例如可溶性配基、其它細胞表面蛋白質或者基質成分在內的胞外蛋白質發(fā)生相互作用，這些作用有可能通過存在于其氨基端區(qū)域推測的CUB結構域而發(fā)生。這些結構被認為介導結合許多蛋白質配基。例如，CUB結構域參與穩(wěn)定在補體級聯(lián)反應的外源凝集素分支中起作用的MASP絲氨酸蛋白酶同型二聚體(Chen和Wallis，2001)。許多II型跨膜絲氨酸蛋白酶也含有CUB結構域，CUB結構域被認為介導酶與底物的相互反應(Hooper等，2001)。此外，cubilin的CUB結構域介導結合內在因子-維生素B12和清蛋白(Yammani等，2001)。由于SIMA135胞外結構域糖基化程度很高，據(jù)認為配基結合需要依靠，至少部分需要依靠糖類部分，在細胞表面糖蛋白質CD44的多種同種型已經證實了此現(xiàn)象(Bajorath，2000)。糖基化也被認為有助于SIMA135蛋白質的折疊，以及有助于運輸至和維持在細胞表面(Gorlike等，2001；Grogan等，2002)。
SIMA135在氨基酸序列上顯示出與其它與指環(huán)狀癌相關的蛋白質(GenBank登錄號AK026622)以及非小肺細胞癌細胞系Calu6相關的蛋白質(GenBank登錄號AY026461)(Scher-Mostageer等，2001)不同。與之前已知的蛋白質相比，這些差異被認為影響SIMA135與其它分子的相互作用能力。第一個氨基酸的改變，525位Arg變?yōu)镚ln，出現(xiàn)在胞外可能的配基結合結構域；SIMA135的第二個可能的CUB結構域。第二個氨基酸的改變，709位Gly變?yōu)锳sp，位于酪氨酸殘基后的第二個殘基。此由一個非極性的氨基酸變?yōu)閹щ姾蓺埢母淖冾A期對鄰近的酪氨酸被磷酸化的能力有很大的影響，因此，也被認為影響SIMA135的結合能力，例如結合SH2結構域的能力。最后一個氨基酸的改變，827位Ser變?yōu)锳sn，位于距離PXXP基序的四個殘基處。因此，此改變可能也影響SIMA135與其它蛋白質的相互作用能力；所述其它蛋白質在此情況下為含有SH3結構域的蛋白質。
在正常結腸組織中，蛋白質SIMA135存在于結腸上皮細胞的基底和頂端表面以及存在于隱窩上皮細胞的頂端表面。與正常結腸中其明顯的定位形成對照，結腸瘤組織中的SIMA135呈混亂的和異型的分布，通過質膜和胞質染色可觀察到這種失調。在侵染結腸漿膜的深層腺體和引流血管內部，SIMA135的表達顯得較為強烈。這些結果表明，蛋白質SIMA135表達的增加更多地與癌發(fā)生的后期階段有關，例如，局部侵襲和轉移。Western印跡分析取自同一組織中的成對人瘤細胞，可在一定程度上證明這個觀點。例如，與同類系的且低轉移性的變體M-HEp3相比，SIMA135在高轉移性M+HEp3中的表達水平非常高。此外，不同類系的前列腺癌細胞系PC-3和LNCaP表現(xiàn)出相似的趨勢，前者是一個轉移性細胞系，后者是一個低轉移性細胞型，SIMA135在前者中的表達水平遠遠高于后者(Soos等，1997)。
在正常和惡性腺體的腺液中都可以觀察到明顯的游離SIMA135，此現(xiàn)象與觀察到的HEp3細胞體外釋放的該蛋白110kDa可溶形式的結果相一致。腺體組織超微結構在腫瘤發(fā)生明顯的損失是很顯然的，這可允許可溶形式的SIMA135/CDCP1釋放到結腸癌病人的體液和血管系統(tǒng)。因此，認為SIMA135作為血清或組織液標記具有實用性，對跨膜蛋白質MUC1(Rye和McGuckin，2001)、CD44(Adham等，1990)和ICAM-1(Maruo等，2002)也已提出此實用性。
I.糖基化的或者非糖基化的SIMA135、片段和其變體本發(fā)明提供可被糖基化的或不被糖基化的蛋白質SIMA135(SEQ IDNo1)、SIMA135片段和SIMA135的變體。這些蛋白質、片段和其變體可作為抗原來誘導產生結合SIMA135的抗體，例如，特異地和/或選擇性地結合SIMA135的抗體。這些選擇性結合的抗體包括那些結合SIMA135或者部分SIMA135，但不結合非SIMA135或者非SIMA135片段的其他蛋白質和蛋白質片段的抗體。這些蛋白質、片段和其變體可用于選擇特異地和選擇性地結合SIMA135的抗體。這些特異地和選擇性地結合抗體包括那些結合SIMA135或者部分SIMA135，但不結合非SIMA135或者非SIMA135片段的其他蛋白質和蛋白質片段的抗體。這些抗體的選擇性特別地表明它們結合SIMA135或者部分SIMA135，而不結合轉移性Hep3細胞裂解產物產生的一種180kDa的蛋白質(美國專利號6,498,014)，SIMA135或者其片段與抗體結合的解離常數(shù)具有相同的數(shù)量級，但這些抗體結合180kDa的蛋白質可產生至少高于結合SIMA135或者其片段兩個數(shù)量級的解離常數(shù)。這些抗體的特異性表明免疫原性的結合是表位-高變區(qū)相互作用的結果，而不是非特異的蛋白質-蛋白質相互作用的結果。非特異的蛋白質-蛋白質相互作用的解離常數(shù)一般比特異的表位-高變區(qū)相互作用的解離常數(shù)高三個數(shù)量級。抗體-抗原免疫結合對的解離常數(shù)的測定可參照Harlow等人的方法(Harlow等，AntibodiesA Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Pub.1988))，此處引用作為參考。
此處所用的SIMA135片段是指一個足夠長度的抗原性的肽段。一般來說，所述片段至少包含5個氨基酸。本發(fā)明涉及糖基化的或者非糖基化的SIMA135片段，例如糖基化的或者非糖基化的SEQ ID No1的片段，其中所述的片段包含525位的氨基酸和/或827位的氨基酸。本發(fā)明涉及SIMA135片段，例如SEQ ID No1的片段，其中所述的片段中525位的氨基酸不是谷氨酰胺和/或827位的氨基酸不是天冬酰胺。本發(fā)明涉及SIMA135片段，例如，SEQ ID No1的片段，其中所述的片段中525位的氨基酸是精氨酸和/或827位的氨基酸是絲氨酸。
變體蛋白質包括具有氨基酸替代的蛋白質，是有生物學活性的或者作為抗原時引起產生抗體。SIMA135的變體旨在包括通過缺失(也叫截短)或者添加一個或多個氨基酸至天然SIMA135的N端和/或C端；通過缺失或者添加一個或多個氨基酸至天然SIMA135的一個或多個位點處；或者通過在天然SIMA135的一個或多個位點處替代一個或多個氨基酸而自天然SIMA135衍生的蛋白質。
因此，本發(fā)明的SIMA135可以通過包括氨基酸替代、缺失、截短和插入在內的不同方法進行改變。這些操作的方法是本領域公知的。例如，多肽的氨基酸序列變體可通過突變編碼SIMA135的DNA來制備。誘變和核苷酸序列改變的方法是本領域眾所周知的。參照例如，Kunkel，Proc.Natl..Acad.Sci.USA，82；488(1985)；Kunkel等，Methods inEnzymoll，154；367(1987)；美國專利號4,873,192；Walker和Gaastra編著，Techniques in Molecular biology，MacMillan Publishing Company，New York(1983)和其中引用的參考文獻。關于合適的不影響目的蛋白質生物學活性的氨基酸替代的指南，可以參照Dayhoff等人的模型，Dayhoff等，Atlas of Protein Sequence and Structure，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，C.D.(1978)此處引用作為參考。保守的替代是優(yōu)選的，例如用另外一個具有相似特性的氨基酸替代一個氨基酸。保守的氨基酸替代是優(yōu)選的，并且包括例如天冬氨酸和谷氨酸是酸性氨基酸；賴氨酸/精氨酸/亮氨酸是堿性氨基酸；亮氨酸/異亮氨酸、甲硫氨酸/纈氨酸、丙氨酸/纈氨酸是疏水性氨基酸；絲氨酸/甘氨酸/丙氨酸/蘇氨酸是親水性氨基酸。保守的氨基酸替代也包括基于側鏈的分組。每一組中的成員可相互替代。例如，甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸是一組有脂肪族側鏈的氨基酸。這些氨基酸可以互相替代。絲氨酸和蘇氨酸是一組有脂肪族-羥基側鏈的氨基酸。天冬酰胺和谷氨酰胺是一組有酰胺基側鏈的氨基酸。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸是一組具有芳香族側鏈的氨基酸。賴氨酸、精氨酸和組氨酸是一組具有堿性側鏈的氨基酸。半胱氨酸和甲硫氨酸是一組含有硫側鏈的氨基酸。例如，用異亮氨酸或者纈氨酸替代亮氨酸、用谷氨酸替代天冬氨酸、用絲氨酸替代蘇氨酸、或者用一個結構上相關的氨基酸相似地替代一個氨基酸，這些替代可以實現(xiàn)產生本發(fā)明的變體多肽。
本發(fā)明的蛋白質可以被糖基化或者不被糖基化。通過在能夠糖基化重組蛋白質的細胞中表達這些蛋白質，這些蛋白質可以在體內被糖基化。備選地，通過使用糖轉移酶，本發(fā)明的蛋白質可以在體外被糖基化。這些蛋白質可以通過使用商品化的酶例如PNGase F(New England Biolabs，Beverly，MA)進行處理，切開任一結合的聚糖。因此，本發(fā)明的蛋白質可用來產生結合天然SIMA135、變性的SIMA135、SIMA135的特異部分、糖基化的SIMA135和非糖基化的SIMA135的抗體。
II.選擇性結合SIMA135或者SIMA135片段的抗體本發(fā)明提供結合SIMA135的抗體。優(yōu)選的用于藥物組合物的抗體包括那些抑制腫瘤轉移的抗體。腫瘤轉移的抑制可以通過例如遷移試驗、侵染試驗或者雞尿囊絨膜試驗在內的很多試驗鑒定。
通過分別使用天然的或者變性的SIMA135免疫動物，可制備識別天然折疊的SIMA135或者變性的SIMA135的抗體。通過分別使用糖基化的或者非糖基化的SIMA135免疫動物，可制備識別糖基化的或者非糖基化的SIMA135的抗體。識別不同形式SIMA135的抗體(例如，天然的或變性的，以及糖基化的或非糖基化的)對于確定一個細胞是否能夠正確折疊和糖基化SIMA135是有用的。這些抗體對于確定在轉移過程中，一種候選試劑是否能夠干涉產生SIMA135的細胞活性是有用的。因此，這些抗體可用于鑒定能用于抑制癌細胞轉移的試劑的作用。
使用完整的蛋白質或者含有目的蛋白質小段肽段的片段作為免疫抗原，可制備結合SIMA135、SIMA135片段和SIMA135變體的抗體?？捎米骺乖腟IMA135片段包括在動物中產生免疫反應的SIMA135片段。這些片段一般是五個氨基酸或者更長。用于免疫動物的蛋白質或者肽可衍生自翻譯的cDNA或者化學合成，需要的話，可將這些蛋白質共軛到載體蛋白質?；瘜W偶聯(lián)至肽的此類常用載體包括鑰孔形血藍素(KLH)，甲狀腺球蛋白，牛血清白蛋白(BSA)，和破傷風類毒素。偶聯(lián)的蛋白質或者肽然后用于免疫動物(例如，小鼠、大鼠或者兔子)。單克隆抗體41-2起初是一種用于分離SIMA135的抗體。它識別SIMA135和另外包括美國專利號6,245,898和6,498,014所描述的180kDa在內的幾種其它轉移蛋白質。基于該原因，本發(fā)明優(yōu)選的抗體是這樣的單克隆抗體，例如這些抗體選擇地和/或特異地結合SIMA135、例如所述的抗體不結合其它轉移蛋白質、例如所述的抗體識別SIMA135的表位。
根據(jù)需要可純化單克隆或者多克隆抗體，例如，通過從結合有針對所述抗體的多肽或者肽的基質上結合和洗脫。本領域的技術人員知道很多在免疫學領域用于純化和/或濃縮單克隆抗體以及多克隆抗體的常用技術(Coligan等，Unit 9，Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience，1991，引用作為參考)。
適用于結合本發(fā)明蛋白質的抗體至少對該蛋白質區(qū)域的一部分是特異的。例如，本領域的技術人員可以利用蛋白質或者肽產生本發(fā)明適當?shù)目贵w。本發(fā)明的抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體以及單克隆抗體和多克隆抗體的片段。
本發(fā)明涉及本發(fā)明的抗體用來治療性治療人和動物，本發(fā)明也涉及本發(fā)明的抗體用于制備抑制哺乳動物癌細胞轉移的藥物。
制備多克隆抗體對于本領域的研究人員來說是眾所周知的(Green等，Production of Polyclonal Antisera，在Immunochemical Protocols(Manson編著)一書中，1-5頁(Humana Press 1992)；Coligan等，Production ofPolyclonal Antisera in Rabbits，Rats，Mice and Hamsters，在CurrentProtocols in Immunology一書中，2.4.1節(jié)(1992)，此處引用作為參考。
制備單克隆抗體同樣也是常規(guī)的(Kohler和Milstein，Nature，256；495，1975；Coligan等，2.5.1-2.6.7節(jié)；和Harlow等，AntibodiesALaboratory Manual，726頁(Cold Spring Harbor Pub.1988))，此處引用作為參考。簡要地說，單克隆抗體可通過下面的步驟得到，用包含抗原的組合物注射小鼠、取血清樣品以檢驗抗體產生的存在、取出脾臟以獲得B淋巴細胞、融合B淋巴細胞和骨髓瘤細胞以產生雜交瘤、克隆雜交瘤、挑選產生抗原抗體的陽性克隆以及從雜交瘤培養(yǎng)物中分離抗體。通過許多成熟的技術，可從雜交瘤中分離和純化單克隆抗體。這些分離技術包括用蛋白質A葡聚糖的親和層析、分子篩層析和離子交換層析(Coligan等，2.7.1-2.7.12節(jié)和2.9.1-2.9.3節(jié)；Barnes等，Purification of ImmunoglobulinG(IgG)，Methods in Molecular Biology，10；79-104(Humana Press 1992))。體外和體內增殖單克隆抗體的方法對于本領域的研究人員是熟知的。體外增殖可在合適的培養(yǎng)基中完成，例如Dulbecco′s Modified Eagle培養(yǎng)基或者RPMI 1640培養(yǎng)基，任選地添加哺乳動物血清例如胎牛血清或者微量元素，以及包括例如正常小鼠腹膜滲出細胞、脾細胞、骨髓巨噬細胞在內的維持生長補充物。體外生產提供相對純的抗體制品并且允許擴大規(guī)模以產生大量目的抗體。大規(guī)模雜交瘤培養(yǎng)可通過在空氣反應器中、連續(xù)攪拌反應器中通過均相懸浮培養(yǎng)，或者固定化的或截留的細胞培養(yǎng)來完成。體內增殖可通過注射細胞克隆到與當前細胞能夠組織相容的哺乳動物，例如同基因型小鼠，以引起抗體產生瘤的生長來完成。動物在注射前任選地用碳氫化合物，尤其是例如姥鮫烷、四甲基十五烷在內的油類進行預處理。一至三周后，目的單克隆抗體可從動物的體液中回收。
本發(fā)明的抗體可衍生自“人源化的”單克隆抗體。人源化的單克隆抗體是通過轉移取自小鼠免疫球蛋白的重鏈和輕鏈中的互補決定區(qū)至人的可變結構域，然后將小鼠的構架區(qū)殘基替換為人的殘基。衍生自人源化單克隆抗體的抗體組成物的用途是消除與鼠類恒定區(qū)的免疫原性相關的潛在問題?？寺∈竺庖咔虻鞍卓勺儏^(qū)的一般技術已有報道(Orlandi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，863833(1989)。生產人源化單克隆抗體的技術已有報道(Jones等，Nature，321522，(1986)；Riechmann等，Nature，332323，(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534，(1988)；Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285，(1992)；Sandhu，Crit.Rev.Biotech，12437，(1992)以及Singer等，J.hnmunol.，1502844，(1993)，此處引用作為參考)。
此外，本發(fā)明的抗體可衍生自人的單克隆抗體。這些抗體可獲自轉基因小鼠，這些小鼠是被“設計的”對抗原性攻擊產生反應，以產生特異的人抗體。在該技術中，將人重鏈和輕鏈基因座的元件導入到取自小鼠胚胎干細胞系的株系中，該胚胎干細胞系含有內源重鏈和輕鏈基因座的定向破壞。轉基因小鼠可合成特異人抗原的人抗體，并且這些小鼠可用于產生人抗體分泌型雜交瘤。從轉基因小鼠獲得人抗體的方法已有報道(Green等，Nature Genet，713，(1994)；Lonberg等，Nature，368856，(1994)；和Taylor等，Int.Immunol，6579，(1994)，此處引用作為參考)。
本發(fā)明的抗體片段可以通過蛋白水解抗體或者在大腸桿菌(E.coli)中表達編碼片段的DNA來制備。運用常規(guī)方法，利用胃蛋白酶或者木瓜蛋白酶消化完整抗體可以得到抗體片段。例如，通過利用胃蛋白酶酶切抗體以提供標記為F(ab′)2的5S片段，從而可以得到抗體片段。巰基還原劑可以進一步地剪切此片段，并且任選地封閉由二硫鍵剪切產生的巰基基團的基團以產生3.5S Fab′單價片段。或者用胃蛋白酶酶切直接產生兩個單價的Fab′片段和一個Fc片段。這些方法已有報道(Goldenberg，美國專利號4,036,945和4,331,647，這里引用作為參考，Porter，Biochem.J，73119(1959)；Edelman等，Methods in Enzymology，1422(Academic Press 1967)和Coligan等，2.8.1-2.8.10節(jié)和2.10.1-2.10.4節(jié))。
其它的剪切抗體的方法，例如分離重鏈以形成單價輕-重鏈片段，片段的進一步剪切、或者其它酶、化學和遺傳技術也可用，只要片段結合至能被完整抗體識別的抗原上。
例如，F(xiàn)v片段包括VH和VL鏈的連接。該連接可以是非共價的(Inbar等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，692659，(1972))。備選地，可變鏈可利用分子間二硫鍵進行結合，或者用化學試劑進行交聯(lián)，例如戊二醛(Sandhu，見上文)。優(yōu)選的Fv片段包含通過肽接頭連接的VH和VL鏈。通過構建一個包含由寡核苷酸連接的編碼VH和VL區(qū)的DNA序列，可以制備這些單鏈抗原結合蛋白質(sFv)。該結構基因插入到表達載體，然后再將此載體轉入宿主細胞，例如大腸桿菌.。此重組宿主細胞合成用銜接肽橋接兩個v結構域的單鏈多肽。生產sFvs的方法已有報道(Whitlow等，MethodsA Companion to Methods in Enzymology，297，(1991)；Bird等，Science，242423，(1988)；Ladner等，美國專利號4,946,778；Pack等，Bio/Technology，111271(1993)和Sandhu，supra)。
抗體片段的另外一種形式是編碼單一互補決定區(qū)域(CDR)的肽。CDR肽(″最小識別單元″)可通過構建編碼目的抗體CDR的基因來獲得。例如，通過使用多聚酶鏈反應從抗體生成細胞的RNA合成可變區(qū)，可制備這些基因(Larrick等，MethodsA Companion to Methods in Enzymology，2106(1991))。
III.治療轉移性腫瘤和抑制腫瘤細胞轉移的方法。
本發(fā)明也包括治療轉移性腫瘤的方法。″治療轉移性腫瘤″的意思是腫瘤的轉移被阻止、延緩或者抑制。轉移性腫瘤包括在原發(fā)部位具有轉移能力的腫瘤，以及在繼發(fā)部位的轉移腫瘤。這些轉移性腫瘤可以是肺、肝、腎、乳腺、上皮細胞、甲狀腺、白血病、胰臟、子宮內膜、卵巢、頸、皮膚、結腸和淋巴樣組織的組織起源。被治療的受試者可以是除小鼠外的任何哺乳動物受試者，包括人、狗、猴子、牛等。
本發(fā)明的一個實施方案提供了治療患者轉移性腫瘤的方法，此方法通過施與患者治療有效量的本發(fā)明的腫瘤轉移抑制抗體。本發(fā)明的腫瘤轉移抑制抗體已經在前文進行了描述。優(yōu)選的腫瘤轉移抑制抗體包括那些選擇性地結合SIMA135或者其片段的抗體。
腫瘤轉移抑制抗體可以單獨給藥或者結合可藥用載體?？伤幱幂d體包括所有溶劑，例如脂肪、油類、水、鹽溶液、脂類、脂質體、樹脂、粘合劑、充填劑、分散介質、細胞培養(yǎng)介質等，或者其組合，這些溶劑對受試者沒有毒性。
依照本發(fā)明，有效成分可以與載體以任何方便的和實際的方式進行結合，例如通過溶解、懸浮、乳化、混合、膠囊化、吸附等，并且如果必需，可通過加工將組合的組合物制成丸劑或者片劑。這些操作對這些領域的技術人員是常規(guī)的。
抗體的治療有效量視疾病狀態(tài)和其它的臨床因素而定，例如患者的體重和狀態(tài)、患者對治療的反應、制劑類型和給藥途徑。治療有效的化合物的精確劑量可由此研究領域的技術人員決定。作為一般的規(guī)則，抗體的治療有效量可以在每單位劑型約0.5μg到約2g的范圍內。一個單位劑型指用于哺乳動物治療中，物理上分離的適合作為單個劑量的單位每個單位含有預定量的活性物質，這些與任何所需藥用載體結合的活性物質計劃產生預期的治療效果。本發(fā)明的方法考慮了單次及多次給藥，可以同時或者在一段長時間階段給藥。
腫瘤轉移抑制抗體的給藥可以以任意方便的方式來完成，這些方式包括通過氣溶膠吸入、注射、口服、輸液、植入或者移植。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體通過皮下(s.c.)、腹膜內(i.p.)、動脈內(i.a.)或者靜脈內(i.v.)注射施與患者。
IV.診斷哺乳動物癌癥的方法本發(fā)明也包括通過檢測SIMA135的表達來診斷受試者轉移性腫瘤的方法。
轉移性腫瘤包括在原發(fā)部位具有轉移能力的腫瘤，以及在繼發(fā)部位的轉移腫瘤。這些轉移性腫瘤可以是肺、肝、腎、乳腺、上皮細胞、甲狀腺、白血病、胰臟、子宮內膜、卵巢、頸、皮膚、結腸和淋巴組織的組織起源。
通過使用結合SIMA135或者SIMA135片段的抗體，可以檢測SIMA135的表達。多克隆抗體和單克隆抗體都可使用。
在一個實施方案中，樣品取自受試者，例如活組織檢測樣品取自于疑似有轉移性腫瘤的組織。通常在檢測進行之前處理樣品?？捎玫臏y定方法包括ELISA、RIA、EIA、Western印跡分析、免疫組織染色等。根據(jù)所用的測定方法，抗原或者抗體可以被酶、熒光團或者放射性同位素所標記。參考例如，Coligan等，Current Protocols in Immunology，John Wiley &Sons Inc.，New York，N.Y.(1994)；Frye等，Oncogen，41153-1157，1987。
樣品的處理根據(jù)所使用的檢測SIMA135的測定方法而不同。例如，活體組織的細胞可進行裂解，并且細胞裂解產物被用于例如Western印跡分析。對于例如Whole Cell ELISA測定方法的測定，細胞在測定前可先用如PBS漂洗，然后在含有0.25％戊二醛的PBS中固定。
比較通過使用前文所述的任意一種方法檢測到的SIMA135或者SIMA135片段的表達與組織的正常部分中同樣抗原的表達。當抗原的表達水平比正常組織中的表達有實質的增加，預示為轉移性腫瘤。實質的增加意味著至少增加約20％，優(yōu)選地，至少增加約25％，更優(yōu)選地，至少增加約35％。
在另一個實施方案中，免疫組織化學可用于診斷生物體內的轉移性腫瘤。在此實施方案中，樣品取自生物體，例如活組織檢測樣品取自于疑似有轉移性腫瘤的組織。樣品可被固定在載玻片上并且與此處所公開的抗體接觸，此處公開的是結合SIMA135的抗體。抗體可以被酶、熒光團或者放射性同位素標記。參考例如，Coligan等，Current Protocols inimmunology，John Wiley & Sons Inc.，New。在抗體結合到SIMA135后，抗體的位置通過使用已知的技術確定。異種染色、整個組織樣品中SIMA135的廣泛表達、以及惡性腺體中的染色表明轉移性癌癥。
V.含有選擇性地結合SIMA135或者其片段的抗體和包裝材料的試劑盒本發(fā)明提供了含有選擇性地結合SIMA135的抗體和包裝材料的試劑盒。此類試劑盒對于運輸和存儲用于治療和檢測癌癥的抗體是有用的。這些試劑盒尤其可被實驗室的醫(yī)藥工作者用于檢測取自生物體組織樣品中的轉移性癌癥。此外，這些試劑盒可用于醫(yī)藥工作者用來配制含有本發(fā)明抗體的藥物組合物。
包裝材料可以給抗體提供一個被保護的環(huán)境。例如，包裝材料可以防止抗體被污染。此外，包裝材料可以防止溶解的抗體變干。
可用作包裝材料的適合材料的實例包括玻璃、塑料、金屬等。這些材料可被硅烷化以避免抗體吸附到這些包裝材料上。
VI.包含選擇性地結合SIMA135或者SIMA135片段的抗體以及可藥用載體的藥物組合物本發(fā)明的藥物組合物包括結合SIMA135的抗體，這些抗體制劑成藥物組合物并且給藥動物宿主，例如人類患者，其有多種適合施用的被選擇途徑，例如口服或者腸胃外施用，通過靜脈內、肌肉內、局部或者皮下途徑。
因此，抗體可通過結合例如惰性稀釋劑或者可同化的可食載體在內的可藥用載體而全身給藥，例如口服。它們可包封在硬殼的或軟殼的明膠膠囊中、可壓縮成片劑、或者可直接與患者的食物混合。對于經口的治療性服用，這些抗體可與一種或者多種賦形劑結合，并且以可吸收的片劑、口腔含化片劑、含片劑、膠囊劑、酏劑、懸浮液、糖漿、糯米紙囊劑等形式使用。這些組合物和制品應該至少含有0.1％的抗體。組合物和制品的比例當然可以是多樣的，并且方便地為給定單位劑型重量的約2％到約60％之間。在這些治療上有用的組合物中，一種或者多種抗體的量是可獲得有效劑量水平的量。當口服給藥時，本發(fā)明的組合物可優(yōu)選地在明膠膠囊中給藥。
片劑、含片劑、丸劑、膠囊劑等也可含有如下組分粘合劑，例如西黃芪樹膠、阿卡膠、玉米淀粉或者明膠；賦形劑，例如磷酸二鈣；崩解劑，例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸等；潤滑劑，例如硬脂酸鎂；甜化劑，例如蔗糖、果糖、乳糖或者天冬甜精；或者調味劑，例如薄荷、冬綠樹油，或者櫻桃調味料，這些組分可被添加。當單位劑型是膠囊劑時，除上述種類的材料之外，其可含有液體載體，例如植物油或者聚乙二醇。多種其他材料可作為包衣或者改進固體單位劑型的物理形狀。例如，片劑、丸劑或者膠囊劑可包衣有明膠、蠟、蟲膠或者糖等。糖漿或者酏劑可含有一種抗體或者多種抗體、作為甜化劑的蔗糖或者果糖、作為防腐劑的羥苯甲酸甲酯和羥苯甲酸丙酯、染料以及調味劑例如櫻桃和橙色香料。用于制備任何單位劑型的材料當然應該是可藥用的并且所使用的量基本上沒有毒性。此外，一種抗體或者多種抗體可摻入到持續(xù)釋放制劑和設備中。
本發(fā)明的一種或者多種抗體可以通過灌輸或者注射，由靜脈內或者腹膜內給藥。一種或者多種抗體的溶液可用水制備，任選地混合無毒性表面活性劑。也可以在甘油、液體聚乙二醇、甘油醋酸脂和其混合物以及在油中制備分散劑。在存儲和使用的通常條件下，這些制劑含有防腐劑以防止微生物的生長。
用于注射或者灌輸?shù)暮线m的藥物劑型包括含有一種或者多種抗體的無菌水溶液、分散劑、無菌干粉，這些干粉適用于無菌可注射的、可灌輸?shù)娜芤夯蛘叻稚┑呐R時制備，其任選地被包囊在脂質體中。在所有情況下，最終的劑型在制造和存儲的條件下應該是無菌的、液體的和穩(wěn)定的。液態(tài)載體可以是溶劑或者液態(tài)分散介質，其包括例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液態(tài)的聚乙二醇等)、植物油、無毒性的甘油脂類和其合適的混合物。適當?shù)牧鲃有钥梢员痪S持，例如，通過形成脂質體、在分散劑的情況下通過維持所需的顆粒大小、或通過使用表面活性劑。防止微生物的活性可通過多種抗細菌劑和抗真菌劑產生，例如，羥苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫汞柳酸鈉等。在許多情況下，藥物劑型優(yōu)選地含有等滲劑，例如糖、緩沖劑或者氯化鈉。可注射組合物的延長吸收可以通過在組合物中使用延緩吸收的試劑例如單硬脂酸鉛和明膠而產生。
通過將所需量的一種或者多種抗體與多種上述列舉的其它成分混合到適當?shù)娜軇┲锌芍苽錈o菌可注射溶液，并根據(jù)需要進行過濾滅菌。
VII.鑒定調控細胞SIMA135產生的試劑的方法本發(fā)明提供了鑒定增加或者減少細胞SIMA135產生的試劑的方法。一般來講，該方法包括將候選試劑與試驗細胞接觸，并且確定試驗細胞相對于未接觸候選試劑的對照細胞，其SIMA135的產生是否增加或者減少。
試驗細胞和對照細胞產生的SIMA135可通過使用許多領域公認的方法來檢測。這些方法已被通過包括放射免疫測定法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、使用熒光標記的抗體等在內的免疫學方法例證過。
候選試劑的許多樣品可按照官方的United States Pharmacopeia、官方的National Formulary以及它們附錄中所描述的方法進行篩選。簡要地說，候選試劑的例子包括碳氫化合物、環(huán)狀有機分子、二環(huán)有機分子、芳香基有機分子、烷基有機分子等。Merck Manual，Merck ResearchLaboratories，Whitehouse Station，N.J.第17版，Beers和Berkow，1999，Merck Index，Merck Research Laboratories，Whitehouse Station，N.J.第13版，2001。
例如下面章節(jié)里舉例說明的轉移性HEp3細胞可用做本發(fā)明方法中的試驗細胞和對照細胞。然而，該方法也可在正常產生SIMA135的細胞中實行，或者通過重組的方法。例如，提供用來生產SIMA135的表達構建體可導入這樣的細胞，所述細胞為在導入所述表達盒之前不產生SIMA135的細胞。轉化的細胞然后可用于本發(fā)明方法中用來鑒定調控SIMA135產生的試劑。利用此細胞系統(tǒng)，上文所述的檢測SIMA135存在和數(shù)量的診斷方法可用于測定試驗和對照細胞產生的SIMA135。
本發(fā)明的方法也可在體內實行。在下面章節(jié)的例證中，候選試劑可被施與試驗動物。組織樣品可取自試驗動物，比較該組織樣品中細胞產生的SIMA135和取自對照動物組織樣品中細胞產生的SIMA135。與對照動物相比，試驗動物SIMA135產生增加說明候選試劑增加SIMA135產生。與對照動物相比，試驗動物SIMA135產生減少說明候選試劑減少SIMA135產生。SIMA135的測定可通過上文診斷章節(jié)提供的任意一種分析方法來測定。許多種動物都可用于本發(fā)明的方法。這些動物的實例包括兔子、大鼠、小鼠、猴子等。
本發(fā)明的方法可在體外實行。例如試驗細胞和對照細胞可在組織培養(yǎng)基上生長。這就允許候選試劑在體外與試驗細胞接觸。試驗細胞產生的SIMA135然后可與上文描述的對照細胞產生的SIMA135比較，以確定候選試劑是否增加或者減少細胞的SIMA135產生。
體外和體內方法將確定試驗試劑促進和降低或阻止轉移的能力。促進作用的測定可鑒定該試劑為致癌劑或者增強劑。此測定實際應用于快速致癌試劑的鑒定。降低或者阻止作用的測定可鑒定該試劑為癌癥抑制劑。此測定實際應用于抗癌劑的鑒定。
實施例I細胞系和雜交瘤人頸腺癌HeLa、纖維肉瘤HT1080、結腸腺癌DLD-1和SW480、乳腺癌MCF7、前列腺癌PC-3、前列腺癌淋巴節(jié)轉移瘤LNCaP、肺癌A549和桿狀腎癌G401細胞獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American TypeCulture Collection(Rockville，MD))。人肝癌HuH7和HLE、胃癌MKN45和STKM-1細胞由Peter Vogt博士(The Scripps Research Institute，LaJolla，CA)提供；乳腺癌MDA-MB-231細胞由Liliana Ossowski博士(MountSinai School of Medicine，NY)提供。人鱗狀細胞癌HEp3細胞獲自在雞胚胎的尿囊絨膜(CAM)連續(xù)傳代的實體瘤(Testa，1992；Brooks等，1993)。HEp3細胞的轉移性變種，M+HEp3，使用前培養(yǎng)時間要少于20天。低轉移性變種，M-HEp3，使用前至少在培養(yǎng)基上培養(yǎng)80天。人微血管內皮細胞(HEC)和皮成纖維細胞(HDF)獲自Clonetics(San Diego，CA)，并且分別用EGM-2MV和FGM-2培養(yǎng)基(Clonetics)培養(yǎng)。癌細胞系作為單細胞層培養(yǎng)在添加10％FBS(HyClone，Logan，UT)、丙酮酸鈉、青霉素/鏈霉素和非必需氨基酸(Invitrogen)的DMED(Invitrogen，Carlsbad，CA)中培養(yǎng)，并且在增濕的、5％CO2環(huán)境下、37℃生長。產生MoAb41-2的雜交瘤通過前文描述的消減免疫途徑產生(Brooks等，1993)。雜交瘤培養(yǎng)和mAbs純化由The Scripps Research Institute的Protein and NucleicAcids Core Facility使用標準程序完成。
實施例II試劑蛋白酶抑制劑、正常的小鼠IgG、抗FLAG M2 mAb、DAB試劑和Gill蘇木精購自Sigma(St.Louis，MO)。反轉錄、PCR試劑和pCR-II Topo載體購自Invitrogen。PP2購自Calbiochem(La Jolla，CA)。
實施例III蛋白質純化、肽測序和蛋白質分析免疫共沉淀作用在未標記或者35S標記的HEp3細胞(5×107)細胞裂解物上進行。代謝標記在含有Tran35S標記(100μCi/ml；ICN，Costa Mesa，CA)的無甲硫氨酸/半胱氨酸的DMEM中過夜實施。細胞徹底地用PBS漂洗，然后溶解在含有0.1M Tris(pH8.0)、0.1％Triton X-100、150mMNaCl、5mM EDTA、10μM反式環(huán)氧琥珀酰-L亮氨酰酰氨基(4-胍基)丁烷、20μg/ml大豆胰蛋白酶抑制劑和25μg/ml抑酶肽的緩沖液中。細胞裂解物用蛋白質G-Sepharose(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)在4℃預先清潔30分鐘，然后與20μg的mAb 41-2或者nmIgG在4℃孵育過夜。免疫復合體用蛋白質G-Sepharose沉淀出，在聚丙烯酰胺凝膠電泳前，復合體在還原性SDS上樣緩沖液中煮沸變性。對于35S標記的蛋白質，將凝膠干燥并且在-80℃曝光于膠片?；蛘?，將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(Millipore，Bedford，MA)。切下明顯的考馬斯染色的135kDa條帶，然后用胰蛋白酶消化。所得的肽通過高壓液相色譜法來分離，并且用Procise 494蛋白質測序儀(Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)進行測序。胰蛋白酶消化和肽段測序由The Scripps Research Institute的Proteinand Nucleic Acids Core Facility完成。肽段序列通過使用可自NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI)網站獲得的算法檢索GenBank數(shù)據(jù)庫。使用Prosite數(shù)據(jù)庫(Blom等，1999)、SMART算法(Schultz等，1998)、PSORT算法(Nakai和Kanehisa，1992)和NetPhos 2.0算法(Blom等，1999)分析完整的SIMA135蛋白質序列的結構區(qū)、細胞加工信號和共有的翻譯后修飾基序。
實施例IV表達構建體和瞬時轉染在真核表達載體pME18S-FL3中的SIMA135 cDNA(GenBank登錄號AK026622)作為日本NEDO人類cDNA測序計劃的一部分而完成，并且由Hiroko Hata博士(Dept.of Virology，Institute of Medical Science，University of Tokyo)友情提供。SIMA135 FLAGin構建體是通過PCR在親本構建體的終止密碼子前放置編碼FLAG表位(DYKDDDDK)的序列完成的。對這兩種構建體測序。使用Superfect reagent(Qiagen，Valencia，CA)，根據(jù)廠商所述將SIMA135或者SIMA135 FLAGin表達構建體瞬時傳染HeLa細胞(4×105)。細胞在含有10mM Tris(pH8.0)、150mM NaCl、1％TritonX-100、5mM EDTA和lx Complete mini EDTA-無蛋白酶抑制劑混合物(Roche，Indianapolis，IN)的冰冷緩沖液中裂解。不溶物通過14000轉/分離心10分鐘除去。
實施例V克隆HEp3細胞的SIMA135cDNA總RNA利用RNeasy試劑盒(Qiagen)分離，并且在利用Superscript II反轉錄酶進行反轉錄反應中，取2μg作為模板。PCR用1μl所得的cDNA為模板、使用引物TCCCCACCGTCGTTTTCC(SEQ ID NO2)和GGTTAGGAACACGGACGGGTG(SEQ ID NO3)(依據(jù)GenBank登錄號AK026622設計的)，以及校正酶Platinum Pfx DNA聚合酶來實施。PCR的循環(huán)條件是94℃，3分鐘，94℃，30秒、55℃，30秒、72℃，150秒，30個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。凝膠純化PCR產物(Qiagen)，使用Platinum Taq DNA聚合酶加腺嘌呤尾，然后克隆到pCR-II Topo載體并測序。
實施例VII免疫熒光用SIMA135 FLAGin表達構建體瞬時轉染的HeLa細胞，HEp3細胞平鋪在蓋玻片上。37℃孵育48小時后，用PBS清洗細胞，然后在2％甲醛中固定。用于和抗FLAG mAb孵育的HeLa細胞未被透化或者通過在含有0.5％TritonX-100的PBS中室溫孵育5分鐘被透化。兩種細胞類型都在含有5％BSA的PBS中封閉。接著與mAb 41-2(5μg/ml)或者抗FLAG M2mAb(4μg/ml)在封閉液中4℃孵育過夜，用PBS清洗細胞，然后與連接有Alexa Fluor 546的山羊抗小鼠IgG(2μg/ml)(Molecular Probes)孵育。標記的細胞用BioRad 1024MRC2掃描共聚焦成像系統(tǒng)進行觀察和照相。
實施例VIINorthern印跡分析人12泳道多組織Northern印跡(Clontech)用[α-32P]dCTP標記的(Ambion)SIMA135 cDNA的EcoRI/Hind III DNA插入片段，在UltraHyb溶液(Ambion)中68℃雜交過夜。印跡用最終的嚴格度0.1x SSC，0.1％SDS，68℃漂洗，然后在-80℃曝光于膠片。印跡用β-肌動蛋白cDNA再次探測以確定每個泳道RNA上樣的一致性。
實施例VIIIWestern印跡分析細胞裂解產物、無血清培養(yǎng)基和免疫沉淀的蛋白質通過8％SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離，然后轉移到硝酸纖維素膜上(Millipore)。膜在含有5％脫脂奶粉的PBS中封閉，然后與mAb 41-2(2μg/ml)，抗FLAG M2 mAb(0.8μg/ml)或者抗磷酸酪氨酸mAb(1μg/ml，Upstate Biotechnology，LakePlacid，NY)在4℃孵育過夜。在充分漂洗后，膜與山羊抗小鼠IgG(0.16μg/ml，Pierce，Rockford，I1)在室溫孵育2小時，免疫反應性帶通過增強型化學發(fā)光(Pierce)來檢測。
實施例IX生物化學表征方法為了切除N連接的聚糖，M+HEp3細胞和SIMA135FLAGin表達構建體瞬時轉染的HeLa細胞的細胞裂解物(50μl)，在0.5％SDS、1％β-巰基乙醇中100℃10分鐘以變性和還原，然后用PNGase F(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)37℃孵育45分鐘。為分析SIMA135酪氨酸磷酸化的基態(tài)水平，亞匯合培養(yǎng)的HEp3和HeLa(作為陰性對照)細胞在含有50mMNaF和1mM Na3VO4的無血清DMEM中37℃孵育30分鐘，然后用冷PBS漂洗。為了抑制Src激酶家族磷酸化，HEp3細胞與PP2(50μm)在不含NaF和Na3VO4的無血清DMEM中37℃孵育30分鐘。然后細胞在含有50mMTris(pH7.4)、150mM NaCl、1％Triton X-100、1mM苯甲基磺酰氟、1mM苯甲咪、25μg/ml抑酶肽、25μg/ml亮胰蛋白酶肽、50mM NaF和1mMNa3VO4的冰冷緩沖液中裂解。不溶物通過14000轉/分鐘離心10分鐘去除。免疫沉淀是按照前文所述的方法實施，對300μg的細胞溶解物使用1μgmAb 41-2或者nmIgG(作為陰性對照)。為了測定溶解的SIMA135的存在，接近匯合的HEp3細胞用PBS清洗三次，然后在無血清的條件培養(yǎng)基中孵育24小時。收集培養(yǎng)基并且在4℃，10,000g離心，然后用截留分子量為30,000kDa的微米離心過濾器(Millipore)將其濃縮10倍。細胞裂解物按照上文所述方法收集。
實施例X免疫組織化學取自三個患者的紀錄為人腺癌結腸組織樣品的低溫切片(6μm)在鋅-福爾馬林中固定15分鐘，用PBS簡短漂洗，然后非特異結合位點通過在含有3％BSA的PBS中孵育而封閉。使用mAb 41-2(5μg/ml)且4℃過夜。特異性抗體結合通過添加連接有生物素的抗小鼠抗體(Pierce)，接著通過添加能用DAB試劑顯色的連接有辣根過氧化酶的中性親和素(neutravidin)(Pierce)被檢測到。切片用Gill蘇木精復染。
實施例XImAb 41-2識別在高轉移性人瘤HEp3細胞中以升高水平表達的135kDa抗原被抗體mAb 41-2識別的抗原已被鑒定和表征。作為確定被抗體mAb41-2識別的抗原重要性的最初步驟，用mAb 41-2對細胞裂解物(20μg)實施Western印跡分析，其中所述細胞裂解物制備自高轉移(M+)和低轉移(M-)HEp3細胞，且在非還原條件下電泳。在兩種細胞型中通過消減免疫產生的單克隆抗體41-2(mAb)都檢測到了大約135kDa的單一條帶。與用來產生mAb 41-2的消減免疫途徑相一致的是，免疫反應性蛋白質在M+HEp3細胞的表達水平高于M-HEp3細胞。用高轉移(M+)和低轉移(M-)HEp3細胞制備的細胞裂解物進行的平行考馬斯染色的凝膠表明，M+HEp3和M-HEp3細胞提取物的總蛋白質圖型和含量是無差別的。mAb41-2在免疫反應性上的差異表明，兩種細胞系間的關聯(lián)抗原在表達水平上有顯著的差異。
實施例XII鑒定mAb 41-2識別的來自轉移性HEp3細胞的抗原將純化的mAb 41-2用于免疫沉淀實施例XI中M+HEp3細胞的抗原。用mAb 41-2或者正常小鼠IgG從M+HEp3細胞中免疫沉淀的35S標記的蛋白質于還原條件下在SDS-PAGE上分析。干燥凝膠且在-80℃過夜曝光于膠片。從放射性標記的HEp3細胞免疫沉淀的主要蛋白質的分子量約135kDa。這與實施例XI中檢測到的抗原的分子量一致。在用未標記HEp3細胞進行的平行實驗中，免疫沉淀的蛋白質被轉移到PVDF膜上，將135kDa的蛋白質帶切下來，進行胰蛋白酶消化，并且對分離的片斷從N端測序。獲得了3個主要的肽序列。檢索GenBank無重復蛋白質數(shù)據(jù)庫表明，每個肽段序列與一個未公布的登錄號為BAB15511的理論序列完全或者幾乎完全匹配，此蛋白質序列翻譯自登錄號為AK026622的未公布cDNA。
肽1FEIALPRESQITVLG(I)KXGTSEQ ID No4BAB15511 FEIALPRESNITVLIKXGT SEQ ID No5肽2XXXXIPGSTTNPE SEQ ID No6BAB15511 VEYYIPGSTTNPE SEQ ID No7肽3XYXLQVPSDILH SEQ ID No8BAB15511 SYSLQVPSDILH SEQ ID No9鑒定的蛋白質被命名為消減免疫的M+HEp3相關的135kDa蛋白質(subtractiveimmunizationM+HEp3associated135kDa protein；SIMA135)，其完整序列在圖1中顯示。為了證實SIMA135和由mAb 41-2特異識別的蛋白質是同一蛋白質，用HEp3細胞、未轉化的HeLa細胞和用SIMA135 cDNA瞬時傳染的HeLa細胞的細胞裂解物進行Western印跡。使用mAb 41-2探測，Western印跡分析非還原條件下電泳的總細胞裂解物(25μg)，這些細胞裂解物來自HEp3細胞、未轉染的HeLa細胞和用SIMA135 cDNA瞬時傳染的HeLa細胞。mAb 41-2與HEp3細胞和用SIMA135 cDNA瞬時傳染的HeLa細胞中存在的同樣的135kDa蛋白質帶發(fā)生反應，但是在未轉染的HeLa細胞中沒有此帶。為了提供其它的證明，通過反轉錄PCR，從HEp3細胞克隆SIMA135 mRNA的蛋白質編碼區(qū)。DNA序列分析由此方法產生的兩個克隆，證明了SIMA135 mRNA是由這些細胞表達的。在GenBank登錄號為AK026622和來自HEp3細胞的SIMA135序列之間，鑒定出四個核苷酸差異核苷酸1684G→A、1847T→C、2236G→A和2590G→A。第二個轉換是沉默的，其余的轉換導致氨基酸分別地改變525Arg→Gln、709Gly→Asp和827Ser→Asn。
實施例XIII
SIMA135的結構特征SIMA135蛋白質序列包括863個氨基酸(SEQ ID No.1-圖1)，且其推算的分子量為92.9kDa。序列分析鑒定有以下結構特征。一個推斷的切割氨基末端信號肽預測出現(xiàn)在Ala29后。此特征與肽1的序列一致，表明成熟的SIMA135起始于Phe30，其推測的分子量是90.1kDa。一個可能的跨膜結構域預測(Hartmann等，1989)定向SIMA135的羧基端位于細胞內，此跨膜結構域跨距666到686位殘基(圖1方框所示)。12個共有的N糖基化基序在圖1中指出。一個共有的I型十六烷基化基序(IICCV)(Hansen等，1999)位于687到691位殘基。存在5個PXXP基序(圖1)，PXXP基序在其他蛋白質中被表明介導結合至Src同源區(qū)(SH)3(Pawson，1995；Mayer，2001)。5個酪氨酸殘基(圖1中圓圈所示)可能是磷酸化位點。兩個鄰近位置的酪氨酸殘基(Tyr734和Tyr743)出現(xiàn)在結合SH2結構域(Songyang等，1993)的共有序列(YXXL/I)中。SIMA135與GenBank無重疊數(shù)據(jù)庫中其他被證實的蛋白質缺少同源性。然而，SIMA135確實與推斷的蛋白質CDCP1有很高的同源性，CDCP1通過翻譯報道的核苷酸序列(Scherl-Mostageer等，2001)而確定。此外，SIMA135蛋白質的跨距221到348殘基和417到544殘基的兩個區(qū)域被鑒定為與CUB(補體蛋白亞組分Clr/Cls、urchin胚生長因子和骨(bone)形態(tài)發(fā)生蛋白)結構域有低同源性(Bock和Beckmann，1993)。這些結構域據(jù)報道參與介導蛋白質-蛋白質相互作用(Chen和Wallis，2001；Sieron等，2000)。由Scherl-Mostageer和其合作者描述的第三個推測的CUB結構域跨越545到660位殘基(Scherl-Mostageer等，2001)，其在我們用以檢索SIMA135氨基酸序列和CDCP1推測的氨基酸序列所使用的檢索算法的同源性檢出閾值之下。
實施例XIVSIM135在正常和惡性細胞和組織中的表達模式來自12個正常人組織的polyA+RNA(每個泳道1μg)的Northern印跡分析通過用α32P標記的SIMA135 cDNA探針進行探測來完成。β-肌動蛋白mRNA的水平作為上樣量被顯示。12個正常人組織中SIMA135的表達模式通過Northern印跡分析檢測，Northern印跡分析使用α32P標記的2.8kb SIMA135 cDNA探針進行雜交。一條大約6.0kb的條帶在骨骼肌和結腸以最高水平檢測到，其在腎、小腸、胎盤和肺中以較低水平表達。在外周血白細胞也出現(xiàn)了一條6.0kb的幾乎不能檢測到的信號。此外，一個相當弱的、約3.3kb的信號出現(xiàn)在骨骼肌、結腸、胎盤和肺中。SIMA135mRNA在腦、心、胸腺、脾或者肝中沒有檢測到。根據(jù)SIMA135和CDCP1cDNA7和基因組的序列對比(數(shù)據(jù)未顯示)表明，通過Northern印跡分析檢測到的兩個SIMA135轉錄物非?？赡苁怯墒褂肧IMA-1353’UTR中備選的多聚腺苷酸化信號產生。較長的且較高表達的轉錄物被認為由使用一個更靠近3’的共有多聚腺苷酸化信號(核苷酸59507)產生，然而較短的且較低表達的轉錄物很有可能由使用一個位于核苷酸31867的低效率多聚腺苷酸化信號的變體產生。這些不同的轉錄物也有可能由SIMA135前體mRNA的備選剪接產生。
在16個人細胞系、14個人癌細胞系和2個正常人細胞系中，用mAb41-2探測的SIMA135蛋白質表達通過非還原條件下的Western印跡分析分析，其中每個細胞系等量的細胞裂解蛋白質(20μg)被電泳。SIMA135在轉移性HEp3細胞中的表達最高，前列腺癌細胞系PC3和結腸癌細胞系DLD-1也顯示出高的表達水平。中等水平的抗原在纖維肉瘤細胞系HT1080、胃癌細胞系MKN45和STKM-1、結腸癌細胞系SW480和非轉移性前列腺癌細胞系LNCaP中被檢測到。低水平的SIMA135在2個肝癌細胞系、兩個乳腺癌細胞系、肺癌細胞系A549和腎桿狀瘤細胞系G401中被檢測到。SIMA135在正常人微血管內皮細胞和皮成纖維細胞中沒有被檢測到。在許多人癌細胞系中表達不同水平的SIMA135蛋白質，然而兩個正常人細胞類型中沒有表達該蛋白質。
實施例XVSIMA135是一種細胞表面的磷酸化的糖蛋白免疫組織化學被用來鑒定HEp3細胞以及瞬時轉染SIMA135表達構建體的HeLa細胞中SIMA135的細胞定位。該表達構建體含有一個在蛋白質SIMA135C末端融合的FLAG表位。HEp3細胞和mAb41-2孵育在質膜上顯出強烈的染色。瞬時轉染FLAG標記的SIMA135的HeLa細胞中，當和mAb41-2孵育也在膜上顯出同樣強烈的染色。此外，SIMA135的C末端被確定是細胞內的，因為當瞬時轉染的HeLa細胞用0.5％TritonX-100透化處理可允許抗體進入到FLAG標簽定位的細胞內，并且當與抗FLAG表位的mAb孵育時，與抗FLAG mAb孵育的細胞顯出了強烈的細胞膜染色，然而與抗FLAG mAb孵育的未透化細胞顯出低或者接近背景的染色。未轉染的HeLa細胞與mAb 41-2或者抗FLAG表位mAb孵育時，其基本上無染色。這些數(shù)據(jù)證實了推斷的細胞表面定位和SIMA135的I型定位。在瞬時轉染SIMA135 FLAG標簽表達構建體的HeLa細胞中，用mAb 41-2和抗FLAG mAb染色觀察到了一致結果，更加證實了SIMA135是mAb 41-2的靶抗原。
成熟的SIMA135理論上的分子量是90.1kDa。然而，用mAb 41-2檢測到的該蛋白質的表觀分子量是135kDa。瞬時轉染SIMA135 FLAG標簽表達構建體的HeLa細胞的細胞裂解物在酶活性優(yōu)化的條件下，用N糖苷酶F進行處理以確定分子量上的差異是否應歸于N糖基化。蛋白質在還原條件下通過Western印跡分析檢測，其使用未處理的(-)和N糖苷酶F(PNGaseF)處理的(+)來自瞬時轉染SIMA135 FLAGin表達構建體的HeLa細胞裂解物與抗FLAG表位mAb反應。屬于SIMA135的條帶被標明。一條非特異的交叉反應帶在表觀上位于80kDa。N糖苷酶F處理導致SIMA135在135kDa處的條帶消失，取而代之的是一條位于約95到105kDa寬的較低分子量條帶(數(shù)據(jù)未顯示)。M+HEp3細胞的細胞裂解物也用mAb 41-2進行免疫共沉淀，并且用N糖苷酶F處理。按照此方法檢測到的蛋白質也顯示出相似的減小的分子量。因此，SIMA135表觀分子量中多達30到40kDa應歸于N糖基化，這與該蛋白質胞外區(qū)域中大量共有的糖基化位點相一致(圖1，SEQ ID No.1)。
SIMA135的細胞內區(qū)含有5個酪氨酸殘基(圖1)。在還原條件下，用抗磷酸酪氨酸抗體對來自HEp3細胞裂解物與mAb 41-2免疫沉淀的蛋白質進行Western印跡分析，以確定這些殘基每個是否都被磷酸化。免疫沉淀用來自HEp3和HeLa(陰性對照)細胞裂解物與正常小鼠IgG(nmIgG)或者mAb 41-2反應。免疫沉淀的蛋白質用抗磷酸酪氨酸抗體(Anti-P-Tyr)和mAb 41-2探測，以分別標明磷酸化的蛋白質和全長SIMA135的存在。細胞裂解蛋白質與mAb 41-2免疫沉淀。細胞裂解物制備自未處理的(-)或者用PP2(50μM)在37℃孵育30分鐘的(+)HEp3細胞?？沽姿崂野彼峥贵w檢測到了來自HEp3細胞與mAb 41-2免疫沉淀的135kDa蛋白質。當免疫沉淀的蛋白質用mAb 41-2探測時，同樣的蛋白質條帶也被檢測到。Western印跡分析也對來自HeLa細胞的裂解物與mAb 41-2免疫沉淀的蛋白質，以及作為對照的HEp3細胞裂解物與正常小鼠IgG免疫沉淀的蛋白質實施。
當用抗磷酸酪氨酸抗體或mAb 41-2探測時，兩種免疫沉淀都是無免疫反應性的，這證明了用HEp3細胞所觀察到的免疫反應的特異性。參與SIMA135酪氨酸磷酸化的Src激酶家族成員用PP2進行檢測，PP2是一種Src家族選擇性酪氨酸激酶抑制劑(Hanke等，1996)。用抗磷酸酪氨酸抗體對來自HEp3細胞裂解物與mAb 41-2免疫沉淀的蛋白質所進行的Western印跡分析表明，用PP2處理30分鐘的HEp3細胞與未處理的HEp3細胞相比，其SIMA135酪氨酸磷酸化的水平有明顯的降低(約75％)。用mAb41-2對同樣免疫沉淀的蛋白質所進行的Western印跡分析表明，大約等量的SIMA135蛋白質存在于膜上的兩個泳道。這些數(shù)據(jù)表明，在HEp3細胞SIMA135酪氨酸磷酸化過程中，Src激酶家族成員參與其中。
許多整合的細胞表面蛋白質例如c-met(Wajih等，2002)和CD44(Goebeler等，1996)也以可溶性分子形式產生。用mAb 41-2探測進行的Western印跡分析用來檢驗HEp3細胞是否產生可溶形式的SIMA135。HEp3細胞培養(yǎng)物用PBS充分漂洗，然后用無血清(SF)培養(yǎng)基孵育20小時。條件培養(yǎng)基(CM)被收集并且細胞物質通過離心被除去，培養(yǎng)基然后濃縮10倍。抗體mAb 41-2在HEp3 SFCM中，檢測到了一條約110kDa的免疫反應條帶。來自HEp3細胞裂解物的細胞相關SIMA135在135kDa處被檢測到。相反地，不產生SIMA135的未轉染HeLa細胞，在細胞裂解物和濃縮的SFCM中都沒有產生免疫反應條帶。這些數(shù)據(jù)表明，HEp3細胞釋放可溶形式的SIMA135并且可溶形式呈現(xiàn)為低分子量免疫反應性蛋白質。
實施例XVI正常和患癌結腸中SIMA135的表達免疫組織化學分析被用來確定正常和患癌結腸中SIMA135的體內定位。用mAb 41-2作為一級抗體對切片(6μm)進行染色。典型的正常結腸粘膜表明SIMA135的上皮表達(彩色照片中的棕紅色，未顯示)。結腸癌顯示SIMA135異質的和廣泛的表達。SIMA135由在結腸絨膜的侵入惡性腺體里的細胞表達。SIMA135由在結腸微絨膜的引流血管腔里的惡性上皮細胞表達。在正常結腸粘膜中，SIMA135由上皮細胞專有地表達，并且其均勻地出現(xiàn)在結腸腔襯細胞的腔和基底表面以及腺體隱窩襯細胞的頂端表面(數(shù)據(jù)未顯示)。在隱窩的杯狀細胞內含物和腺體腔內粘液中存在強烈的染色，這也證實了可溶形式的SIMA135是由結腸上皮細胞產生的想法。在結腸癌樣品中，SIMA135廣泛的和異質的表達，同時在惡性腺內的粘液中局部增強。許多侵入的癌細胞團被深度染色，這表明SIMA135存在于基部、頂生和側生膜以及腺體粘液內。一個明顯的趨勢是癌細胞在結腸微絨毛深層更惡性的、侵入腺體處強烈的染色以及在引流血管中經常出現(xiàn)的強烈的SIMA135抗原陽性有聯(lián)系。用二級抗體而不是一級抗體孵育的對照切片是無染色的。
實施例XVII遵循上文敘述的HeLa細胞轉染方法，7個不同的細胞系被用于研究和監(jiān)視SIMA135 mRNA的表達。在這些細胞系中，克隆3號產生顯著的和合適的堿基對信號。
這些細胞系在體外研究中的輸送能力、在SCID小鼠中轉移和產生瘤的能力以及在SCIP小鼠中寄居次生器官的能力也被研究?？寺?號被確定為能夠從疏松的膜和體內脫離和移行，并且寄居次生器官。這些結果證明了SIMA135是一種操縱轉移的關鍵的和中樞的因子。轉化的克隆3號細胞作為鑒定促進或者抑制/減少惡性細胞轉移的試劑的細胞系統(tǒng)也是有用的。
按照上文的傳染方法，7個不同的細胞系被用來研究SIMA135表達的效果。這些細胞系在圖8中得到圖解。遵循上文所述的SIMA135 mRNA檢測的分析方法，這7個細胞系得到分析。圖7表明監(jiān)視SIMA135 mRNA的這7個細胞系RT-PCR分析的結果。對照和無關的RT-PCR數(shù)據(jù)在圖1的左手部分。圖的右手部分顯示了一條用SIMA135特異引物產生的600bp擴增信號。未轉化的HeLa細胞無信號得到，HeLa 4號也無信號得到，現(xiàn)在被稱為克隆3號的Eff(2)3號產生一條實質的600bp信號。這些數(shù)據(jù)表明克隆3號細胞有升高水平的SIMA135 mRNA。
這7個細胞系的樣品被裂解，并且細胞內含物按照標準Western印跡方法，通過與MoAb 41-2結合進行分析以確定SIMA135的存在。Western印跡的裂解物制備自7個不同細胞系，并用MoAb 41-2探測。結果表明克隆3號(Eff(2)3號)產生大量水平的SIMA135免疫反應性蛋白質。此克隆的細胞系比我們的高轉移性HEp-3細胞系M+產生更多的SIMA135蛋白質。克隆4號和親本HeLa細胞不產生可檢測的SIMA135蛋白質。
一旦確定SIMA135陰性細胞和SIMA135過表達細胞已獲得，這些細胞被用于試驗它們的惡性潛力，即在SCID小鼠中生長和形成瘤的能力以及在SCID小鼠中寄居次生器官的能力。表I是兩個單獨試驗類型的總結表格A顯示實驗轉移性測定法的結果，其中目的細胞被直接接種(i.v.)到鼠的尾部靜脈。幾星期以后，被接種小鼠的所選器官被用來與分析人細胞(人DNA)在總器官(小鼠DNA)背景中的存在。分析用實時PCR完成，其所用的人特異性引物依據(jù)下列參考文獻所述的alu重復序列(A.Zijlstra等，Cancer Research，2002)。表格A顯示的結果表明克隆3號細胞在小鼠的肺和骨髓中寄居和/或生長，其水平大量地超過相似地接種克隆4號細胞的小鼠的水平。克隆3號顯然不遍及蔓延所接種的小鼠，因為在此所顯示的另外一個器官即胰腺僅含有接近背景水平的克隆3號和克隆4號細胞。
表1的表格B包括標準的自發(fā)轉移測定法的結果，其中所用的細胞被皮下地接種到SCID小鼠側腹，瘤允許發(fā)展到100mg，然后所選的器官(通常是肺)被用來分析次生轉移沉著物。次生轉移通過同樣的對人DNA特異的實時aluPCR方法測量。結果表明克隆3號和克隆4號形成大約相等尺寸的初生瘤(毫克重量-mg)。然而，克隆3號顯示轉移到肺的水平至少多于克隆4號10倍。其或許超過10倍，因為克隆4號肺中的細胞水平接近背景(50-100個細胞)，即幾乎不能檢測到的水平。
結果表明，導入或者表達SIMA135蛋白質到正常地不產生該蛋白質的細胞可賦予這些細胞惡性特性。為了表征這兩個克隆的特性，這可能表明為什么它們獲得惡性潛力，我們對這些克隆進行了一些細胞生物學實驗。細胞生長和增殖試驗在按照上文所述方法通過細胞培養(yǎng)物實施。這兩種克隆的體外生長是相似的，并且也與親代的HeLa細胞相似。然而，單獨的增殖速率不是它們有差別的惡性潛力的原因。
也進行了跨孔遷移試驗，其中目的細胞被強制地遷移通過一個插入在兩個室之間的孔過濾器得到完成。試驗用培養(yǎng)基進行。結果在圖10顯示。上室包含培養(yǎng)基中的細胞，而下室包括含有胎牛血清(FCS)的濃縮培養(yǎng)基以吸引上室的遷移細胞。結果表明克隆3號細胞比克隆4號遷移性大。這可能是SIMA135過表達細胞獲得的特性之一，這在它們的惡性潛力中幫助了它們。初步的數(shù)據(jù)也表明，克隆3號細胞顯得比克隆4號細胞對用化合物ara C化學誘導的細胞程序性死亡有更強的抵抗力。
表I兩個HeLa克隆的體內惡性；克隆4號(SIMA-135陰性)和克隆3號(SIMA135過表達)接種到SCID小鼠
*基于對提取自靜脈內接種2周和皮下接種4周后的離體器官的總DNA實施的實時alu PCR參考文獻Adham IM，KlemmU，Maier WM和Engel W.，(1990)，Hum.Genet.，84125-128.
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所有刊物、專利和專利申請此處引用作為參考。雖然在上述的說明書中，已描述的本發(fā)明涉及其優(yōu)選的實施方案，給出的許多詳情是用于闡明目的，本領域的技術人員明白的，本發(fā)明可有其它的實施方案，并且此處描述的某一詳情可在沒有脫離本發(fā)明基本原則的基礎上被相當大的改動。
序列表<110>諾瓦提斯公司<120>在人轉移性腫瘤細胞中表達的糖蛋白抗原SIMA135<130>4-33290<160>9<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>836<212>PRT<213>人<400>1Met Ala Gly Leu Asn Cys Gly Val Ser Ile Ala Leu Leu Gly Val Leu1 5 10 15Leu Leu Gly Ala Ala Arg Leu Pro Arg Gly Ala Glu Ala Phe Glu Ile20 25 30Ala Leu Pro Arg Glu Ser Asn Ile Thr Val Leu Ile Lys Leu Gly Thr35 40 45Pro Thr Leu Leu Ala Lys Pro Cys Tyr Ile Val Ile Ser Lys Arg His50 55 60Ile Thr Met Leu Ser Ile Lys Ser Gly Glu Arg Ile Val Phe Thr Phe65 70 75 80Ser Cys Gln Ser Pro Glu Asn His Phe Val Ile Glu Ile Gln Lys Asn85 90 95
Ile Asp Cys Met Ser Gly Pro Cys Pro Phe Gly Glu Val Gln Leu Gln100 105 110Pro Ser Thr Ser Leu Leu Pro Thr Leu Asn Arg Thr Phe Ile Trp Asp115 120 125Val Lys Ala His Lys Ser Ile Gly Leu Glu Leu Gln Phe Ser Ile Pro130 135 140Arg Leu Arg Gln Ile Gly Pro Gly Glu Ser Cys Pro Asp Gly Val Thr145 150 155 160His Ser Ile Ser Gly Arg Ile Asp Ala Thr Val Val Arg Ile Gly Thr165 170 175Phe Cys Ser Asn Gly Thr Val Ser Arg Ile Lys Met Gln Glu Gly Val180 185 190Lys Met Ala Leu His Leu Pro Trp Phe His Pro Arg Asn Val Ser Gly195 200 205Phe Ser Ile Ala Asn Arg Ser Ser Ile Lys Arg Leu Cys Ile Ile Glu210 215 220Ser Val Phe Glu Gly Glu Gly Ser Ala Thr Leu Met Ser Ala Asn Tyr225 230 235 240Pro Glu Gly Phe Pro Glu Asp Glu Leu Met Thr Trp Gln Phe Val Val245 250 255Pro Ala His Leu Arg Ala Ser Val Ser Phe Leu Asn Phe Asn Leu Ser260 265 270
Asn Cys Glu Arg Lys Glu Glu Arg Val Glu Tyr Tyr Ile Pro Gly Ser275 280 285Thr Thr Asn Pro Glu Val Phe Lys Leu Glu Asp Lys Gln Pro Gly Asn290 295 300Met Ala Gly Asn Phe Asn Leu Ser Leu Gln Gly Cys Asp Gln Asp Ala305 310 315 320Gln Ser Pro Gly Ile Leu Arg Leu Gln Phe Gln Val Leu Val Gln His325 330 335Pro Gln Asn Glu Ser Asn Lys Ile Tyr Val Val Asp Leu Ser Asn Glu340 345 350Arg Ala Met Ser Leu Thr Ile Glu Pro Arg Pro Val Lys Gln Ser Arg355 360 365Lys Phe Val Pro Gly Cys Phe Val Cys Leu Glu Ser Arg Thr Cys Ser370 375 380Ser Asn Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Lys His Lys Ile Ser Phe Leu385 390 395 400Cys Asp Asp Leu Thr Arg Leu Trp Met Asn Val Glu Lys Thr Ile Ser405 410 415Cys Thr Asp His Arg Tyr Cys Gln Arg Lys Ser Tyr Ser Leu Gln Val420 425 430Pro Ser Asp Ile Leu His Leu Pro Val Glu Leu His Asp Phe Ser Trp435 440 445
Lys Leu Leu Val Pro Lys Asp Arg Leu Ser Leu Val Leu Val Pro Ala450 455 460Gln Lys Leu Gln Gln His Thr His Glu Lys Pro Cys Asn Thr Ser Phe465 470 475 480Ser Tyr Leu Val Ala Ser Ala Ile Pro Ser Gln Asp Leu Tyr Phe Gly485 490 495Ser Phe Cys Pro Gly Gly Ser Ile Lys Gln Ile Gln Val Lys Gln Asn500 505 510Ile Ser Val Thr Leu Arg Thr Phe Ala Pro Ser Phe Arg Gln Glu Ala515 520 525Ser Arg Gln Gly Leu Thr Val Ser Phe Ile Pro Tyr Phe Lys Glu Glu530 535 540Gly Val Phe Thr Val Thr Pro Asp Thr Lys Ser Lys Val Tyr Leu Arg545 550 555 560Thr Pro Asn Trp Asp Arg Gly Leu Pro Ser Leu Thr Ser Val Ser Trp565 570 575Asn Ile Ser Val Pro Arg Asp Gln Val Ala Cys Leu Thr Phe Phe Lys580 585 590Glu Arg Ser Gly Val Val Cys Gln Thr Gly Arg Ala Phe Met Ile Ile595 600 605Gln Glu Gln Arg Thr Arg Ala Glu Glu Ile Phe Ser Leu Asp Glu Asp610 615 620
Val Leu Pro Lys Pro Ser Phe His His His Ser Phe Trp Val Asn Ile625 630 635 640Ser Asn Cys Ser Pro Thr Ser Gly Lys Gln Leu Asp Leu Leu Phe Ser645 650 655Val Thr Leu Thr Pro Arg Thr Val Asp Leu Thr Val Ile Leu Ile Ala660 665 670Ala Val Gly Gly Gly Val Leu Leu Leu Ser Ala Leu Gly Leu Ile Ile675 680 685Cys Cys Val Lys Lys Lys Lys Lys Lys Thr Asn Lys Gly Pro Ala Val690 695 700Gly Ile Tyr Asn Gly Asn Ile Asn Thr Glu Met Pro Arg Gln Pro Lys705 710 715 720Lys Phe Gln Lys Gly Arg Lys Asp Asn Asp Ser His Val Tyr Ala Val725 730 735Ile Glu Asp Thr Met ValTyr Gly His Leu Leu Gln Asp Ser Ser Gly740745 750Ser Phe Leu Gln Pro Glu Val Asp Thr Tyr Arg Pro Phe Gln Gly Thr755 760 765Met Gly Val Cys Pro Pro Ser Pro Pro Thr Ile Cys Ser Arg Ala Pro770 775 780Thr Ala Lys Leu Ala Thr Glu Glu Pro Pro Pro Arg Ser Pro Pro Glu785 790 795 800
Ser Glu Ser Glu Pro Tyr Thr Phe Ser His Pro Asn Asn Gly Asp Val805 810 815Ser Ser Lys Asp Thr Asp Ile Pro Leu Leu Ser Thr Gln Glu Pro Met820 825 830Glu Pro Ala Glu835<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2tccccaccgt cgttttcc 18<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3ggttaggaac acggacgggtg 21<210>4<211>20<212>PRT<213>人<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(18)<223>Xaa可為任一天然存在的氨基酸<400>4Phe Glu Ile Ala Leu Pro Arg Glu Ser Gln Ile Thr Val Leu Gly Ile1 5 10 15Lys Xaa Gly Thr20<210>5<211>19<212>PRT<213>人<220>
<221>misc_feature<222>(17)..(17)<223>Xaa可為任一天然存在的氨基酸<400>5Phe Glu Ile Ala Leu Pro Arg Glu Ser Asn Ile Thr Val Leu Ile Lys1 5 10 15Xaa Gly Thr<210>6<211>13<212>PRT<213>人<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(4)<223>Xaa可為任一天然存在的氨基酸
<400>6Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Pro Gly Ser Thr Thr Asn Pro Glu1 5 10<210>7<211>13<212>PRT<213>人<400>7Val Glu Tyr Tyr Ile Pro Gly Ser Thr Thr Asn Pro Glu1 5 10<210>8<211>12<212>PRT<213>人<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>Xaa可為任一天然存在的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>Xaa可為任一天然存在的氨基酸<400>8Xaa Tyr Xaa Leu Gln Val Pro Ser Asp Ile Leu His1 5 10<210>9<211>12<212>PRT<213>人
權利要求
1.具有SEQ ID NO1的蛋白質，其為糖基化的或者非糖基化的。
2.糖基化的或者非糖基化的SEQ ID NO1的片段，其中所述片段含有525位氨基酸和/或827位氨基酸。
3.根據(jù)權利要求1所述的SEQ ID NO1的蛋白質的變體，其中所述的變體中525位氨基酸是精氨酸和/或827位氨基酸是絲氨酸。
4.特異地結合根據(jù)權利要求1所述的蛋白質的抗體，其中所述的抗體不是mAb 41-2。
5.特異地結合根據(jù)權利要求2所述的片段的抗體，其中所述的抗體不是mAb 41-2。
6.特異地結合根據(jù)權利要求3所述的變體的抗體，其中所述的抗體不是mAb 41-2。
7.根據(jù)權利要求5或6所述的抗體，其中所述的抗體是單克隆或者多克隆抗體。
8.根據(jù)權利要求5或6所述的抗體，其用于治療性治療人和動物體。
9.根據(jù)權利要求5或6所述的抗體，其用于制備抑制哺乳動物中癌細胞轉移的藥物。
10.根據(jù)權利要求9所述的抗體，其中的癌細胞是鱗狀細胞癌細胞、前列腺癌細胞、結腸癌細胞、纖維肉瘤、胃癌細胞、肝癌細胞、乳腺癌細胞、肺癌細胞和腎桿狀癌細胞。
11.根據(jù)權利要求10所述的抗體，其中的癌細胞是Hep3細胞。
12.藥物組合物，其包含根據(jù)權利要求5或6所述的抗體以及可藥用載體。
13.試劑盒，其包含根據(jù)權利要求5或6所述的抗體以及包裝材料。
14.根據(jù)權利要求5或6所述的抗體用于癌癥的診斷方法，其包括(a)將根據(jù)權利要求5到8中任意一項所述的抗體與獲自哺乳動物的試驗樣品接觸，以及；(b)確定抗體與試驗樣品的結合是否比抗體與非癌組織的對照樣品的結合程度更大。
15.根據(jù)權利要求5或6所述的抗體用于癌癥的診斷方法，其包括(a)觀察根據(jù)任何一項權利要求所述的抗體與組織切片的結合并且(b)確定是否所述抗體導致組織樣品的異種染色，是否所述抗體表明SIMA135的廣泛表達遍及組織樣品，或者是否所述抗體染色結腸漿膜的惡性腺體。
16.根據(jù)權利要求5或6所述的抗體用于確定試驗樣品是否含有轉移性細胞，其包括(a)將試驗樣品與根據(jù)權利要求5到8中任意一項所述的抗體接觸，并且，(b)將抗體與試驗樣品的結合以及抗體與含有非轉移性Hep3細胞的對照樣品的結合進行比較，其中與抗體與對照樣品的結合相比較，抗體與試驗樣品的結合增強表明試驗樣品含有轉移性HEp3細胞。
17.根據(jù)權利要求5或6所述的抗體用于確定試劑的癌轉移調控能力，其包括該試劑與表達SIMA-135的細胞組合以產生受試細胞，確定自受試細胞的SIMA-135表達是否大于或者小于該細胞與此試劑組合前細胞表達的量。
18.根據(jù)權利要求5或6所述的抗體用于確定候選試劑是否調控細胞產生SIMA-135，其包括(a)將試驗細胞與候選試劑接觸，并且(b)確定相對于對照的SIMA135產生，試驗細胞的SIMA135產生是否增加或者減少。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種這樣的蛋白質，其為一種腫瘤標記蛋白質。此蛋白質可用于制備結合此腫瘤標記蛋白質的抗體。這些抗體可用于減少或者消除產生此腫瘤標記蛋白質的癌細胞轉移。此外，本發(fā)明提供了可用于診斷癌癥和癌細胞轉移的方法。
文檔編號A61K39/395GK1761750SQ200480007463
公開日2006年4月19日 申請日期2004年2月18日 優(yōu)先權日2003年2月19日
發(fā)明者J·P·奎格利, J·D·霍珀, J·E·泰斯塔 申請人:諾瓦提斯公司, 斯克里普斯研究所