專利名稱：多孔基質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多孔基質(zhì)。更具體地說，本發(fā)明涉及預(yù)計(jì)用于動(dòng)物體并在靶組織部位原位形成的多孔基質(zhì)。
許多專利申請(qǐng)描述了凝膠或溶膠特別是水凝膠用作組織支架的用途。例如，WO00/23054描述了聚乙烯醇微球在血管阻塞或栓塞中的用途。WO 99/15211和WO00/64977描述了水凝膠作為組織支架的用途。水凝膠被植入病人體內(nèi)，以便支撐組織的生長(zhǎng)或修復(fù)。
水凝膠用作組織支架的難題在于，盡管凝膠自身可以適當(dāng)填充其所插入的洞，但是它們的擴(kuò)散性差，并且供給組織的藥物、營(yíng)養(yǎng)物或其它因子同樣不能通過凝膠進(jìn)行適當(dāng)擴(kuò)散。此問題在凝膠與活細(xì)胞一起播種(seed)的情形中尤為嚴(yán)重，這是因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)物的較差擴(kuò)散性導(dǎo)致細(xì)胞死亡過早，從而無法進(jìn)行治療。有關(guān)凝膠支架的另一個(gè)問題是，用于穩(wěn)定或固化凝膠(尤其是原位)的交聯(lián)法，能夠損壞截留細(xì)胞。
基于水溶性聚合物的支架在本領(lǐng)域內(nèi)也是公知的，例如WO 99/25391描述了聚(交酯-共-乙交酯)(PLGA)用作組織尤其是骨組織再生的聚合物支架。對(duì)聚合物進(jìn)行處理，以便形成多孔結(jié)構(gòu)。與水凝膠一樣，這些水溶性聚合物被植入病人體內(nèi)，以便支撐組織生長(zhǎng)或修復(fù)。
然而，這些水溶性聚合物的缺陷是，它們僅能填充具有開放形狀的洞，并且材料的成型方法也待優(yōu)選。此外，在支架與細(xì)胞一起播種的情形中，播種沒有效果(僅有少數(shù)孔被細(xì)胞填充)，或者是細(xì)胞在播種過程中被結(jié)構(gòu)損壞，而周圍的組織細(xì)胞也可被植入過程損壞。
WO 99/11196描述了微?；|(zhì)作為組織支架的用途，這些顆粒具有用于穩(wěn)定顆粒結(jié)構(gòu)的內(nèi)部交聯(lián)性。
同樣，PCT/GB02/02813描述了一種以藥物的形式在體內(nèi)用于靶組織內(nèi)或靶組織上的微粒材料的開放多孔基質(zhì)，所述基質(zhì)包括彼此交聯(lián)以便在二者之間限定出孔的顆粒。
本發(fā)明提供了一種多孔基質(zhì)的生產(chǎn)工藝，所述工藝包括如下步驟-使第一相成為流體狀態(tài)，-將第二相引入第一相，-使第一相和第二相混合，以確保第二相通過第一相實(shí)現(xiàn)所需的分布，以及-使第一相固化或改變狀態(tài)，而第二相就在其中。
有益的是，此工藝使基質(zhì)在插入靶細(xì)織內(nèi)或靶組織上之前成型或部分成型。
此處所用的術(shù)語“流體”是指任何流動(dòng)的物質(zhì)，并因此包括能夠流動(dòng)并順應(yīng)容器外形的液體、氣體和固體(例如粉狀、粒狀或谷粒形式、或塑料固體)。
此處所用的術(shù)語“固化”是指相變?yōu)楣虘B(tài)或半固態(tài)。
第一相可以是載體相，其中這個(gè)相承載或包含第二相的材料，或者可以是包被第二相材料的包被相。優(yōu)選的是，第一相不是液態(tài)或完全液化態(tài)的，但卻是流動(dòng)的，足以混合、承載或包被第二相。例如，第一相可以流動(dòng)但有些粘稠并包被第二相的微粒材料?；蛘呤牵谝幌嗪偷诙嗫梢允俏⒘；蚍勰┬问讲⒒旌显谝黄?。在這種情形下，還期望第一相有些軟或粘稠或同樣能夠包被第二相的任何微粒材料。
優(yōu)選的是，在一個(gè)參數(shù)例如溫度、pH、交聯(lián)、硬化或膠凝劑的引入、光線的存在/缺乏、紫外熟化改變時(shí)或者在厭氧條件下，第一相從流態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)或半固態(tài)。最優(yōu)選的是，第一相由于溫度、pH的改變或交聯(lián)、硬化或膠凝劑的引入而發(fā)生變形。在采用溫度的情形中，優(yōu)選的是，溫度足以使相工作但卻不破壞周圍的組織。燒結(jié)步驟的預(yù)先使用可應(yīng)用到任一相中。第二相優(yōu)選是固相，但也可采用液相，尤其是在液體是微粒材料的乳液或懸浮液時(shí)。在多孔基質(zhì)用作組織支架基質(zhì)的情形中，第二相任選地包含用于形成新組織的細(xì)胞。
然而，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)在無需引入細(xì)胞的前提下也可用作組織支架。當(dāng)組織支架(沒有細(xì)胞)置于所需部位處或部位上時(shí)，局部的內(nèi)源性細(xì)胞就在導(dǎo)致現(xiàn)存組織發(fā)生新的生長(zhǎng)的支架內(nèi)或圍繞該支架生長(zhǎng)。此效果由于支架現(xiàn)存的適當(dāng)生長(zhǎng)因子的存在而得以增強(qiáng)。這樣的情形特別有用，因?yàn)樾碌慕M織與引入非內(nèi)源性組織相比，幾乎沒有排斥的機(jī)會(huì)或其它免疫反應(yīng)。因此，用免疫抑制劑治療病人的需要減少了，與此有關(guān)的問題也減少了。此外，此技術(shù)對(duì)于已經(jīng)免疫妥協(xié)的病人(例如癌癥病人、非常年青的人、年長(zhǎng)的人、孕婦或患有艾滋病或乙肝的人)是有用的。
據(jù)此，本發(fā)明還提供了一種組織支架基質(zhì)，這種基質(zhì)包括第一相和包含在第一相之內(nèi)的第二相。優(yōu)選的是，組織支架基質(zhì)按照上述方法來制備。
本發(fā)明中所用的第一相和第二相可以用具有不同的固化或硬化特性的相似材料來制備。例如，第一相和第二相可以用具有不同的膠凝pHs或不同熔融溫度或玻璃化點(diǎn)的相似聚合物來制備。
通常，本發(fā)明的一個(gè)或兩個(gè)相包括一種或多種聚合物?？捎糜诒景l(fā)明的合成聚合物的實(shí)例包括聚(α-羥基酸)特別是聚乳酸或聚乙醇酸、聚交酯聚乙交酯共聚物、聚交酯聚乙二醇(PEG)共聚物；其它的聚酯，包括聚(ε-己內(nèi)酯)、聚(3-羥丁酸酯)、聚(s-己酸)、聚(p-二噁酮(dioxanone))和聚(丙烯富馬酸酯)；聚(原酸酯)，包括多羥基/雙烯酮乙縮醛(polyol/diketene acetals)加成聚合物(如Heller ACSSymposium Series 567，292-305，1994所述)；聚酐，包括聚(癸二酸酐)(PSA)、聚(羧基雙羧苯氧基苯氧基己烷)(PCPP)、聚[雙(對(duì)-羧苯氧基)甲烷](PCPM)以及SA、CPP和CPM的共聚物(如Tamada and Langer in Journal of Biomaterials SciencePolymer Edition，3，315-353，1992和Domb in Chapter 8 of the Handbook ofBiodegradable Polymers，ed.Domb A.J.and Wiseman R.M.，Harwood AcademicPublishers所述)；聚(氨基酸)；聚(假氨基酸)(包括James andKohn at pages 389-403of Controlled Drug Delivery Challenges and Strategies，American Chemical Society，Washington DC所述的那些)；聚磷腈，包括聚[(二氯)磷腈]、聚[(有機(jī))磷腈]聚合物的衍生物(如Schacht in Biotechnology and Bioengineering，52，102-108，1996所述)；聚磷酸酯；聚乙二醇聚丙烯嵌段共聚物(例如以PluronicsTM為商品名所出售的)。
也可以采用天然聚合物，例如絲綢、彈性蛋白、殼質(zhì)、脫乙酰的甲殼質(zhì)(chitosan)、纖維蛋白、纖維蛋白原、聚糖(包括膠質(zhì))、和藻酸酯、膠原質(zhì)、聚(氨基酸)、肽、多肽或蛋白質(zhì)。
也可以采用由這些聚合物的單體制備的共聚物，諸如可以將這些聚合物隨機(jī)摻和或者將它們混合或組合。
聚合物可以用各種方法進(jìn)行交聯(lián)，這些方法包括諸如丙烯酸酯聚合物的UV交聯(lián)、硫醇鹽或丙烯酸酯聚合物的Michael加成反應(yīng)、經(jīng)由乙烯基砜交聯(lián)的硫醇鹽聚合物、經(jīng)由琥珀酸酯或乙烯基砜的交聯(lián)、經(jīng)由肼的交聯(lián)、熱誘導(dǎo)的凍結(jié)、酶交聯(lián)(例如凝血酶與纖維蛋白原的加成)、經(jīng)由鹽或離子(特別是Ca2+離子)加成的交聯(lián)、經(jīng)由異氰酸酯(諸如1，6-己二異氰酸酯)的交聯(lián)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，采用聚(乳-共-聚乙醇)酸(PLGA)的聚酯。這些聚合物是由FDA批準(zhǔn)用于胃腸外施用的。因?yàn)镻LGA在初始階段經(jīng)由非酶水解而發(fā)生降解，所以由體外數(shù)據(jù)能夠預(yù)測(cè)體內(nèi)降解速率。PLGA降解為乳酸和乙醇酸，這些都是在體內(nèi)天然發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)。
然而，聚酯可具有為一些實(shí)施例選擇的聚合物系統(tǒng)。當(dāng)聚酯材料斷裂成分子量為約5000道爾頓時(shí)，材料就可以被細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞)攝取，因此一些感染與這些聚合物的斷裂有關(guān)。
可以合成與氨基酸的共聚物，例如乙醇酸與甘氨酸，或乳酸與賴氨酸(Barrera等人的(1993)J Am Chem Soc 115，11010-11011和Cook等人的(1997)J Biomed MatRes 35，513-523)。這些可用于固定其它分子，諸如經(jīng)由賴氨酰s-氨基部分。這些聚合物利用共價(jià)鍵，可用來將肽附著到表面上。例如，利用1，1’-羰基-二咪唑(CDI，Aldrich)作為交聯(lián)劑，可以將肽附著到聚(乳酸-共-賴氨酸)上。
通過操縱乳酸和乙醇酸的摩爾比以及共聚物的分子量，能夠獲得不同的降解圖形。聚-L-交酯在體外具有數(shù)月至數(shù)年的降解時(shí)間。這樣長(zhǎng)的降解時(shí)間是由于聚合物的高結(jié)晶度保護(hù)其避免被水滲透。聚乙交酯具有一至數(shù)月的降解時(shí)間，而聚-D，L-交酯是非晶形的，并具有一至數(shù)月的降解時(shí)間。D、L、PLGA在體外具有數(shù)周至數(shù)月的降解時(shí)間。當(dāng)乙醇酸的比例增大時(shí)，降解速率就增大。S-己酸的均聚物在2-3年的植入周期中仍然能夠保持完整無缺。
優(yōu)選的是，至少其中一個(gè)相還包括增塑劑，所述增塑劑的例子包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、這些聚合物的聚己內(nèi)酯低分子量低聚物或常規(guī)增塑劑，例如專用于日用塑料材料的那些增塑劑，包括(但不限于)己二酸酯、磷酸酯、鄰苯二甲酸酯、sabacates、壬二酸酯和檸檬酸酯。也可采用與用來形成第一和第二相的聚合物(例如聚交酯、交酯-共-乙交酯)相同的增塑劑。
第二相通常包括播種或形成組織支架所必需的組織細(xì)胞。這些細(xì)胞可播種到包括、包含或承載在第二相內(nèi)部的微粒材料內(nèi)。
在本發(fā)明的組織支架中可采用任何動(dòng)物細(xì)胞?？墒褂玫募?xì)胞的實(shí)例包括(但不限于)骨、骨先祖細(xì)胞(諸如來自于骨)、軟骨、肌肉、肝、腎、皮膚、內(nèi)皮細(xì)胞、腸或腸內(nèi)細(xì)胞，或?qū)ｉT的細(xì)胞例如心血管細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肺細(xì)胞或其它呼吸細(xì)胞、胎盤、羊膜、絨毛膜或胎兒細(xì)胞、干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞或來自身體其它部分的重編細(xì)胞諸如重編為軟骨細(xì)胞的脂肪細(xì)胞。
在使用干細(xì)胞的情形中，它們優(yōu)選是非胚胎干細(xì)胞，例如來自成人骨髓或角膜的那些干細(xì)胞或者其它內(nèi)源性干細(xì)胞，優(yōu)選取自于待治療的病人的干細(xì)胞。
本發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)注意到，骨先祖細(xì)胞在某些條件下在體外環(huán)境中除了骨之外，還將產(chǎn)生軟骨，因此容易使軟骨骨化，從而允許骨-軟骨界面進(jìn)行組織建造。
可用于包含或引入細(xì)胞的第二相的顆粒，是待審專利申請(qǐng)PCT/GB02/02813中所述的類型。
在微粒材料用于第二相的情形中，優(yōu)選的是，顆粒是多孔的。優(yōu)選，顆粒的空隙率至少為10％，更優(yōu)選在40％以上，理想的甚至有70-97％那么高。便利的工作范圍在50-95％之間。在任何情形下，優(yōu)選的是，顆粒的孔徑至少足以將細(xì)胞容納在其內(nèi)。細(xì)胞在基質(zhì)植入時(shí)或者在這之前加入到基質(zhì)中，或者之后加入(在從內(nèi)源性細(xì)胞原位募集的情形中)。
通常，顆粒是微粒；盡管采用大細(xì)胞，但顆粒也可以在mm的范圍內(nèi)。
顆?？梢岳贸R界流體來產(chǎn)生。
理想的是，粒徑在10-80μm直徑的量級(jí)上。這意味著，粒徑通常在50μm-1mm直徑的量級(jí)上，或者優(yōu)選在250-500μm的量級(jí)上。正如所看到的，所有粒徑都是孔徑的函數(shù)。也就是說，基質(zhì)的最終應(yīng)用將決定基質(zhì)的尺寸、粒徑和孔徑。例如，在基質(zhì)不承載細(xì)胞的情形中，孔徑變得沒有什么臨界，只要仍然能夠通過基質(zhì)發(fā)生擴(kuò)散即可。此外，松弛的包裝使孔徑增大，從而使?fàn)I養(yǎng)物或其它物質(zhì)的傳送更佳，反之亦然。然而，孔徑不總是細(xì)胞大小的函數(shù)，因?yàn)榇罂卓膳c微小細(xì)胞一起播種。這些顆粒的使用具有如下優(yōu)點(diǎn)確保整個(gè)基質(zhì)保持足以使細(xì)胞生長(zhǎng)并因此容納生長(zhǎng)組織的空隙率。優(yōu)選的是，顆粒至少在其外表面上是粗糙的，因此孔還可在封閉的包裝顆粒之間形成。此外，顆粒的粗糙表面能夠改善細(xì)胞對(duì)顆粒的粘附性。
基質(zhì)可包括利用諸如另一聚合物相或無機(jī)相的附加相。包括在每個(gè)附加相中的無機(jī)材料的實(shí)例包括生物玻璃、陶瓷、羥磷灰石、玻璃、玻璃陶瓷及復(fù)合材料。將可用于促進(jìn)組織生長(zhǎng)和發(fā)育的因子加入到其中一個(gè)相或兩個(gè)相中，或者用來包被顆粒。此外，將不同的因子加入到每個(gè)相中或者加入到這個(gè)或每個(gè)包被液中。經(jīng)常加入的因子包括(但不限于)上皮生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、堿性成纖維生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和骨形成蛋白、細(xì)胞因子，包括干擾素、白細(xì)胞介素、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、雌激素、睪丸激素、激酶、化學(xué)激酶、葡萄糖或其它糖、氨基酸、石灰化因子、多巴胺、富胺寡肽例如在諸如纖連蛋白和層粘連蛋白之類的粘合蛋白中發(fā)現(xiàn)的肝素結(jié)合域、其它胺類三苯氧胺、順式鉑、肽和某些類毒素。此外，藥物、激素、酶、營(yíng)養(yǎng)物或其它治療劑或因子或它們的混合物可加入到其中一個(gè)相或兩相中。再者，可以將不同的藥物、激素、酶、抗生素、營(yíng)養(yǎng)物或其它治療劑或因子或它們的混合物加入到每個(gè)相中。
然而，如上所述，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)在無需引入細(xì)胞的前提下可用作組織支架。當(dāng)組織支架(沒有細(xì)胞)置于需要定位的部位內(nèi)或部位處時(shí)，就募集或激勵(lì)內(nèi)源性細(xì)胞，以便在支架上、支架中或圍繞支架生長(zhǎng)。此效果由于在支架中存在一種或多種上述生長(zhǎng)因子而得以加強(qiáng)。
按照本發(fā)明方法形成的組織可在體內(nèi)用作植入組織，或在體外用作組織培養(yǎng)物。例如，組織在體內(nèi)可用來代替被除去的患病、損壞或不起作用的組織，或者在體外用作組織培養(yǎng)物。有益的是，本發(fā)明可產(chǎn)生或生成三維培養(yǎng)組織，這種組織例如在藥物擴(kuò)散或攝取的研究中或者在分泌細(xì)胞的使用中可用作研究工具，其中分泌細(xì)胞為了發(fā)生分泌經(jīng)常要求細(xì)胞呈三維分布。
在基質(zhì)用于組織的情形中，優(yōu)選在固化之前將其引入組織。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，在組織于體內(nèi)使用的情形中，優(yōu)選的是，第一相在或接近動(dòng)物體溫時(shí)，或者在或接近適當(dāng)組織的pH時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)或半固態(tài)?；蛘呤?，硬化劑可用來加速固化。在任何情況下，優(yōu)選的是，使第一相固化所必需的條件對(duì)于包含在其內(nèi)的任何細(xì)胞都沒有害。
本發(fā)明還提供了一種如上所述的組織支架基質(zhì)的形成藥盒。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，第一相包括一種聚合物，這種聚合物具有低玻璃化點(diǎn)(Tg)或熔點(diǎn)，諸如在45℃之下，優(yōu)選在40℃之下，理想的是在37℃或之下，第二相包括一種聚合物，這種聚合物具有較高的玻璃化點(diǎn)或熔點(diǎn)，諸如＞55℃。第一相在45℃之上、優(yōu)選在40℃之上、理想的是在37℃之上進(jìn)行加熱，以便使聚合物粘稠或完全液化，然后將第二相引入到第一相中并進(jìn)行混合。使混合物冷卻。當(dāng)細(xì)胞存在于基質(zhì)中時(shí)，這些細(xì)胞可以在引入到第一相之前或者更優(yōu)選的是在基質(zhì)固化之前加入到第二相中。任一相還可包括生長(zhǎng)因子或其它藥物活性化合物，以便在使用時(shí)達(dá)到控釋的效果。
除了顆粒本身固有的空隙率之外，多孔結(jié)構(gòu)還由這個(gè)或每個(gè)相的顆粒之間的縫隙形成，或者通過第一相的不完全液化而形成。
在第二個(gè)實(shí)施例中，基質(zhì)優(yōu)選通過膠凝而形成。在該實(shí)施例中，第一相包括隨溫度發(fā)生膠凝(例如瓊脂糖)或隨pH發(fā)生膠凝(例如丙烯酰亞胺)或隨著硬化或膠凝劑的加入而發(fā)生膠凝(例如將凝血酶加入到纖維蛋白原中以產(chǎn)生纖維凝膠)的材料。第一相進(jìn)入流態(tài)或液態(tài)，然后與非膠凝的、優(yōu)選是固態(tài)的第二相進(jìn)行混合。使混合物冷卻或膠凝。細(xì)胞可以在與第一相混合之前或混合之后但是在凝膠發(fā)生完全膠凝之前加入到第二相中。
現(xiàn)在參照下面實(shí)例來描述本發(fā)明的實(shí)施例，這些實(shí)施例如附

圖1-3所示，其中圖1表示出利用刃天青(Resazurin)還原測(cè)定法測(cè)定的、在溫度交聯(lián)的15％PEG1000/PLGA作用下的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。數(shù)值表示減去無細(xì)胞的對(duì)照值(n＝3，±SD)之后的來自還原反應(yīng)產(chǎn)物的相對(duì)熒光單位；圖2表示出利用刃天青還原測(cè)定法測(cè)定的、在酶交聯(lián)的多孔PDLLA片作用下的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。數(shù)值表示減去無細(xì)胞的對(duì)照值(n＝3，±SD)之后的來自還原反應(yīng)產(chǎn)物的相對(duì)熒光單位；圖3表示出利用刃天青還原測(cè)定法測(cè)定的、在與人真皮纖維原細(xì)胞一起播種的酶交聯(lián)PDLLA微粒作用下的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。數(shù)值表示減去無細(xì)胞的對(duì)照值(n＝3，±SD)之后的來自還原反應(yīng)產(chǎn)物的相對(duì)熒光單位。
例1經(jīng)由溫度觸發(fā)的固化的交聯(lián)在此例中，第一相包括聚(乙二醇)/聚(DL-交酯)摻和顆粒(10wt％聚乙二醇)，第二相包括用常規(guī)的微粒瀝濾法制造的多孔聚(DL-交酯)顆粒。將這兩種組分混合到一起(20∶80至80∶20的比例范圍)，然后加熱到60℃，從而產(chǎn)生展性材料，這種材料由外科醫(yī)生成型并施加到缺陷部位。在該例中，第一相在處理溫度(聚合物的玻璃化溫度之上)不完全液化，但變成“粘稠的”半固體。在另一個(gè)實(shí)例中，(不同聚合物摻和組合物)第一相在40-60℃(聚合物熔化轉(zhuǎn)變點(diǎn)之上)可完全液化。隨后第二相的多孔顆粒與仍然為液態(tài)的第一相混合到一起。材料然后由外科醫(yī)生成型并施加到缺陷部位。
例1A溫度觸發(fā)的固化聚合物摻和組合物、它們的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(用示差掃描量熱法測(cè)定的)以及交聯(lián)溫度的其它實(shí)例如下表所示。
例1b溫度觸發(fā)的具有細(xì)胞播種的交聯(lián)通過在置于電熱板上的陶瓷瓦上加熱組分(1.70g的PLGA，0.3g的PEG1000)并物理混合熔融狀態(tài)的組分，來制造熔融摻合物。將材料冷卻、從瓦上拿下，并且在液氮中冷卻之后立即進(jìn)行切割和研磨。研磨的摻合物在使用之前儲(chǔ)存在真空干燥器內(nèi)。用示差掃描量熱法測(cè)定玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，而溫度取自轉(zhuǎn)變區(qū)域的中點(diǎn)。PLGA的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度在43℃測(cè)定，而摻合物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度在16℃測(cè)定。
在與人真皮纖維原細(xì)胞(和無細(xì)胞的對(duì)照物)一起播種的支架(三份重復(fù)樣品)上測(cè)定靜態(tài)培養(yǎng)物中的細(xì)胞生長(zhǎng)。研磨的摻和材料(80mgs的15％PEG1000/5050DL研磨摻合物)在37℃于6mm的PDMS模具中預(yù)先燒結(jié)15分鐘。然后將細(xì)胞懸浮液加入到材料(100μl完全介質(zhì)中的5×105人真皮纖維原細(xì)胞(@p8，50歲的老年供體/面式活檢))中，并用刮勺按壓材料，然后在37℃再燒結(jié)1小時(shí)。然后將支架從PDMS模具中拿出并置于完全培養(yǎng)介質(zhì)中。通過用100μl的完全介質(zhì)取代細(xì)胞懸浮液，來制備無細(xì)胞的對(duì)照物。支架在完全介質(zhì)中培養(yǎng)17天(靜態(tài)培養(yǎng)物)，而全介質(zhì)每3-4天改變一次。
用刃天青還原測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖(圖1)，并且每3-4天讀取一次數(shù)值。將支架從培養(yǎng)物中取出，在PBS中洗滌并在無血清的介質(zhì)中于1ml的10μg/ml刃天青溶液中放置1小時(shí)。然后將溶液等分(3×150μl)到96孔板內(nèi)，在具有350nm激發(fā)頻率和590nm發(fā)射頻率的板式讀數(shù)器上讀取熒光強(qiáng)度。
例2通過膠凝固化在此例中，第一相是由在25℃之上經(jīng)歷液體-凝膠轉(zhuǎn)變的Pluronics F127溶液(在緩沖液或介質(zhì)中為20wt％)組成的。第二相包括用常規(guī)的微粒瀝濾法制造的多孔聚(DL-交酯)顆粒。將這兩種組分混合到一起(以可能的大范圍比例，諸如100μls的第一相和100mgs的第二相)，并在室溫之下保持為液體。然后使組分經(jīng)注射運(yùn)送到缺陷部位，在該部位材料在達(dá)到37℃之后發(fā)生膠凝。
例3通過膠凝固化在此例中，第一相是由在加入凝血酶之后膠凝的纖維蛋白原溶液(例如在緩沖液或介質(zhì)中為30-200mg/ml)組成的。第二相包括用常規(guī)的微粒瀝濾法制造的多孔聚(DL-交酯)顆粒。將這兩種組分混合到一起(以可能的大范圍比例，諸如100μls的第一相和100mgs的第二相)，并在準(zhǔn)備注射的注射器內(nèi)保持為液體。然后在注射到缺陷部位之后與凝血酶溶液混合(用雙筒注射器)(產(chǎn)生最終的凝血酶濃度為諸如1-1000單位/ml)，從而導(dǎo)致第一相發(fā)生交聯(lián)和膠凝。
例3a細(xì)胞填充的多孔PDLLA片(1-2mm的大片)的交聯(lián)通過溶劑澆注和微粒瀝濾、用80％重量分?jǐn)?shù)的鹽產(chǎn)生多孔PDLLA片。使45wt％PDLLA的DCM溶液(2ml中含有900mgs)與3.6g的鹽粒(在研磨和篩過之后為63-106μm的尺寸分?jǐn)?shù)，平均尺寸＝88±27μm)混合。然后將含有鹽的聚合物溶液傾注到陶瓷瓦上，并放置過夜以使溶劑蒸發(fā)。將聚合物鹽組合物從瓦上拿下并人工切成1-2mm大小的片。通過在水中浸漬并攪拌過夜，而將鹽從片中瀝濾出來。
在與人真皮纖維原細(xì)胞(和無細(xì)胞的對(duì)照物)一起播種的支架(三份重復(fù)樣品)上測(cè)定靜態(tài)培養(yǎng)物中的細(xì)胞生長(zhǎng)。多孔PDLLA片(2×120mgs)經(jīng)輕微攪拌在血清(2mls)中包被1小時(shí)。通過將120mgs血清包被的PDLLA放置到1ml的細(xì)胞懸浮液中并輕微攪拌1小時(shí)，而完成細(xì)胞播種(在血清的介質(zhì)中為1.2×106c/ml，人真皮纖維原細(xì)胞@p8，50歲的老年供體/面式活檢)。將無細(xì)胞的對(duì)照物在無血清的介質(zhì)中放置1小時(shí)。細(xì)胞固定之后，將片在無Ca2+的HBSS中進(jìn)行洗滌。將纖維蛋白原+凝血酶溶液(160μl的100mgml纖維蛋白原和10U/ml的凝血酶)加入到片中并與之混合，除去過量的液體，然后使片交聯(lián)15分鐘。將支架在完全介質(zhì)(添加有胎牛血清的DMEM)中培養(yǎng)17天(靜態(tài)培養(yǎng)物)，而全介質(zhì)每3-4天改變一次。
用刃天青還原測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖(圖2)，并且每3-4天讀取一次數(shù)值。將支架從培養(yǎng)物中取出，在PBS中洗滌并在無血清的介質(zhì)中于1ml的10μg/ml刃天青溶液中放置1小時(shí)。然后將溶液等分(3×150μl)到96孔板內(nèi)，在具有350nm激發(fā)頻率和590nm發(fā)射頻率的板式讀數(shù)器上讀取熒光強(qiáng)度。
例3b細(xì)胞填充的多孔PDLLA片(250-500μm的小片)的交聯(lián)通過溶劑澆注和微粒瀝濾、用90％重量分?jǐn)?shù)的鹽產(chǎn)生多孔PDLLA片。使45wt％PDLLA的DCM溶液(2ml中含有900mgs)與8.1g的研磨鹽粒(在乳缽和臼中研磨之后沒有過篩)混合。然后將含有鹽的聚合物溶液放置到陶瓷瓦上，并放置過夜以使溶劑蒸發(fā)。將聚合物鹽組合物從瓦上拿下并用乳杯和臼研磨。通過在水中浸漬并攪拌過夜，而將鹽從片中瀝濾出來。鹽瀝濾之后將多孔片過篩，并保留250-500μm的分?jǐn)?shù)。
多孔PDLLA片(40mgs)經(jīng)輕微攪拌而用血清進(jìn)行包被。然后將片在PBS中進(jìn)行洗滌。通過將多孔片在無血清的介質(zhì)中于1ml的細(xì)胞懸浮液(9×105個(gè)細(xì)胞/ml)中放置并輕微攪拌1小時(shí)，而將人真皮纖維原細(xì)胞(來自成人供體@通道15)播種到多孔片上。
細(xì)胞固定之后，將纖維蛋白原+凝血酶溶液(160μl的100mgml纖維蛋白原和5U/ml的凝血酶)加入到片中并與之混合，除去過量的液體，然后使片交聯(lián)30分鐘。
將支架上的細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)測(cè)定72小時(shí)。然后將支架從培養(yǎng)物中取出，在PBS中洗滌并在無血清的介質(zhì)中于1ml的10μg/ml刃天青溶液中放置1小時(shí)。然后將溶液等分(3×150μl)到96孔板內(nèi)，在具有350nm激發(fā)頻率和590nm發(fā)射頻率的板式讀數(shù)器上讀取熒光強(qiáng)度。在24與72小時(shí)之間，來自支架的RFU值從296RFU增大到569RFU(在減去背景之后)。
例3cPDLLA微粒與細(xì)胞的交聯(lián)將4g的PDLLA溶解到20ml的二氯甲烷中，從而生成20wt％的溶液。將聚(乙烯醇)(88％水解的)溶解到蒸餾水中，從而給出通過0.45μm過濾器進(jìn)行過濾的0.05wt％溶液。用均化器以6,000rpm的速度將PVA溶液分散15分鐘，然后將PDLLA/dcm溶液注入分散的PVA溶液中?；旌衔镌跀嚢柽^夜以使DCM蒸發(fā)之前再均化5分鐘。然后，微粒在凍干之前在離心機(jī)中用蒸餾水洗滌3次。用亮場(chǎng)顯微鏡和圖像分析法測(cè)定微粒直徑在20μm(±10μm)。
將人真皮纖維原細(xì)胞(來自于50歲的老年供體/面式活檢，在通道8)重新懸浮到少量的全介質(zhì)(50μl中有5×105c細(xì)胞)中。使該細(xì)胞懸浮液與100μl的纖維蛋白原/凝血酶溶液(HBSS中含有150mg/ml的纖維蛋白原和15U/ml的凝血酶)混合，然后將此溶液加入到200mgs的微粒中并混合。將所生成的糊放到6mm的PDMS立方體成型模具中并在37℃放置40分鐘，以使交聯(lián)完成。通過用50μl的完全介質(zhì)取代細(xì)胞懸浮液，來制備無細(xì)胞的對(duì)照物。將支架在完全介質(zhì)中培養(yǎng)17天(靜態(tài)培養(yǎng)物)，而全介質(zhì)每3-4天改變一次。
用刃天青還原測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖(圖2)，并且每3-4天讀取一次數(shù)值。將支架從培養(yǎng)物中取出，在PBS中洗滌并在無血清的介質(zhì)中于1ml的10μg/ml刃天青溶液中放置1小時(shí)。然后將溶液等分(3×150μl)到96孔板內(nèi)，在具有350nm激發(fā)頻率和590nm發(fā)射頻率的板式讀數(shù)器上讀取熒光強(qiáng)度。
例4多孔顆粒在此例中，用常規(guī)的鹽瀝濾技術(shù)產(chǎn)生大孔顆粒(≥500μm)。用乳缽和臼對(duì)鹽進(jìn)行研磨，然后過篩，從而將尺寸合適的部分保留下來。理想的是，鹽粒的大小為50-100μm。然后在熔融相或適當(dāng)?shù)娜軇┲校果}粒與聚(DL-交酯)混合。鹽的填充在50與90wt％之間。然后，通過研磨和切割，將整塊的鹽/聚合物組合物固體(在冷卻或溶劑提取之后)處理成大的顆粒。隨后，通過在水中攪拌至少24小時(shí)，而將鹽從組合物中瀝濾出來。
在另一個(gè)實(shí)例中，利用諸如超臨界CO2、通過常規(guī)的氣體發(fā)泡技術(shù)，可以處理鹽/聚合物組合物。在另一個(gè)實(shí)例中，利用諸如超臨界CO2、通過常規(guī)的氣體發(fā)泡技術(shù)，可以制造多孔聚合物片。
權(quán)利要求
1.一種多孔基質(zhì)的生產(chǎn)工藝，所述工藝包括如下步驟—使第一相成為流體狀態(tài)，—將第二相引入第一相，—使第一相和第二相混合，以確保第二相通過第一相實(shí)現(xiàn)所需的分布，以及—使第一相固化，而第二相就在第一相內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其特征在于，第一相是粘稠的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的工藝，其特征在于，第一相包被第二相。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的工藝，其特征在于，在一個(gè)參數(shù)改變時(shí)，第一相從流態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)或半固態(tài)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的工藝，其特征在于，所述參數(shù)是溫度、pH、硬化劑的引入、光線的存在/缺乏、紫外熟化、紅外熟化，或者在厭氧條件下。
6.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的工藝，其特征在于，第二相是固相。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的工藝，其特征在于，第二相是液相。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的工藝，其特征在于，所述液相是微粒材料的乳液或懸浮液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的工藝，其特征在于，所述微粒材料是多孔的。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的工藝，其特征在于，所述微粒材料是多孔的，所述顆粒的空隙率在10-97％之間。
11.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的工藝，其特征在于，將細(xì)胞加入到一個(gè)相中。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的工藝，其特征在于，將所述細(xì)胞加入到第二相中。
13.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的工藝，其特征在于，第一和第二相是具有不同固化特性的相似材料。
14.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的工藝，其特征在于，所述相包括聚合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的工藝，其特征在于，所述聚合物選自聚(α-羥基酸)、聚乳酸或聚乙醇酸、聚交酯聚乙交酯共聚物、聚交酯聚乙二醇(PEG)共聚物、聚酯、聚(ε-己內(nèi)酯)、聚(3-羥丁酸酯)、聚(s-己酸)、聚(對(duì)-二噁酮)、聚(丙烯富馬酸酯)、聚(原酸酯)、多羥基/雙烯酮乙縮醛(polyol/diketene acetals)加成聚合物、聚酐、聚(癸二酸酐)(PSA)、聚(羧基雙羧苯氧基苯氧基己烷)(PCPP)、聚[雙(對(duì)-羧苯氧基)甲烷](PCPM)、SA、CPP和CPM的共聚物、聚(氨基酸)、聚(假氨基酸)、聚磷腈、聚[(二氯)磷腈]、聚[(有機(jī))磷腈]聚合物的衍生物、聚磷酸酯；聚乙二醇聚丙烯嵌段共聚物、天然聚合物、絲綢、彈性蛋白、殼質(zhì)、脫乙酰的甲殼質(zhì)(chitosan)、纖維蛋白、纖維蛋白原、聚糖(包括膠質(zhì))、藻酸酯、膠原質(zhì)、聚(氨基酸)、肽、多肽或蛋白質(zhì)、由這些聚合物的單體制備的共聚物、這些聚合物的隨機(jī)摻和物或者它們的混合物或組合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的工藝，其特征在于，所述聚合物是能夠生物降解的。
17.根據(jù)權(quán)利要求14-16任一項(xiàng)所述的工藝，其特征在于，所述聚合物是交聯(lián)的。
18.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的工藝，其特征在于，將增塑劑加入到其中一相或兩相中。
19.一種組織支架基質(zhì)，所述基質(zhì)包括第一、載體相和包含在第一相之內(nèi)的第二、懸浮相，所述基質(zhì)還包括細(xì)胞。
20.一種根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的工藝制備的組織支架基質(zhì)。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的組織支架基質(zhì)，其特征在于，第二相包括細(xì)胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求19-21任一項(xiàng)所述的組織支架基質(zhì)，其特征在于，將細(xì)胞播種到包含或承載在第二相內(nèi)的微粒材料中。
23.根據(jù)權(quán)利要求19-22任一項(xiàng)所述的組織支架基質(zhì)，其特征在于，所述細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求19-23任一項(xiàng)所述的組織支架基質(zhì)，其特征在于，所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求19-24任一項(xiàng)所述的組織支架基質(zhì)，其特征在于，所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
26.根據(jù)權(quán)利要求23-25任一項(xiàng)所述的組織支架基質(zhì)，其特征在于，所述細(xì)胞是骨、骨先祖細(xì)胞、心血管細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肺細(xì)胞或其它呼吸細(xì)胞、腸或腸內(nèi)細(xì)胞、軟骨、肌肉、肝、腎、皮膚、或?qū)ｉT的細(xì)胞例如胎盤、羊膜、絨毛膜或胎兒細(xì)胞、干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、或來自身體其它部分的重編細(xì)胞諸如重編為軟骨細(xì)胞的脂肪細(xì)胞。
27.根據(jù)權(quán)利要求19-26任一項(xiàng)所述的基質(zhì)，其特征在于，所述基質(zhì)還包括可用于促進(jìn)組織生長(zhǎng)和發(fā)育的因子。
28.根據(jù)權(quán)利要求19-27任一項(xiàng)所述的基質(zhì)，其特征在于，所述基質(zhì)還包括上皮生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、堿性成纖維生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和骨形成蛋白、細(xì)胞因子，包括干擾素、白細(xì)胞介素、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、雌激素、睪丸激素、激酶、化學(xué)激酶、葡萄糖或其它糖、氨基酸、石灰化因子、多巴胺、富胺寡肽例如在諸如纖連蛋白和層粘連蛋白之類的粘合蛋白中發(fā)現(xiàn)的肝素結(jié)合域、其它胺類三苯氧胺、順式鉑、肽和某些類毒素。
29.根據(jù)權(quán)利要求19-28任一項(xiàng)所述的基質(zhì)，其特征在于，所述基質(zhì)在兩相中還包括藥物、激素、酶、抗生素、營(yíng)養(yǎng)物或其它治療劑或因子或它們的混合物。
30.根據(jù)權(quán)利要求19-27任一項(xiàng)所述的基質(zhì)，其特征在于，所述基質(zhì)的每個(gè)相包括不同的藥物、激素、酶、抗生素、營(yíng)養(yǎng)物或其它治療劑或因子或它們的混合物。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種適合用作組織支架的多孔基質(zhì)。所述基質(zhì)在插入到靶組織部位處或其內(nèi)之前進(jìn)行成型，或經(jīng)危害最小的侵入式方法進(jìn)行注射。基質(zhì)可與靶組織細(xì)胞一起播種或用來支撐局部?jī)?nèi)源性組織的生長(zhǎng)。基質(zhì)可含有生長(zhǎng)因子或其它藥物可接受的部分例如抗生素。
文檔編號(hào)A61L27/36GK1816360SQ200480007759
公開日2006年8月9日 申請(qǐng)日期2004年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月27日
發(fā)明者理查德·梅爾維爾·弗朗斯, 羅賓·安德魯·奎克 申請(qǐng)人:瑞根泰克有限公司