專利名稱：蒽環(huán)霉素－抗體偶聯(lián)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有導(dǎo)向于各種抗原能力的治療性偶聯(lián)物(conjugate)。所述偶聯(lián)物包含導(dǎo)向部分和化學(xué)治療藥物。導(dǎo)向部分和化學(xué)治療藥物通過含有細(xì)胞內(nèi)可裂解部分的接頭連接。
背景技術(shù)：
很多年來，能用于向人類癌癥特異性送遞化療藥物的抗體一直是特異性導(dǎo)向的藥物治療領(lǐng)域的科學(xué)家們的一個(gè)目標(biāo)。這個(gè)目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)最終可以給癌癥化學(xué)療法帶來魔力彈這個(gè)概念。朝著這個(gè)目標(biāo)的顯著進(jìn)展隨著1975年Kohler和Milstein的雜交瘤技術(shù)的出現(xiàn)，以及接之而來的制備單克隆抗體(mAbs)的能力而發(fā)展。在過去25年間，已經(jīng)制備出抗癌細(xì)胞上過量表達(dá)的很多抗原靶的mAbs。針對(duì)藥物、毒素、放射性核素或其他治療劑本身，或者它們的偶聯(lián)物，已經(jīng)臨床前，并且隨后臨床上試驗(yàn)了很多mAbs。一般情況下，mAbs本身，經(jīng)常稱作“裸mAbs”，對(duì)于患有實(shí)體腫瘤的患者以長期存活標(biāo)準(zhǔn)看還沒有成功，雖然最近用抗乳腺和結(jié)腸癌的mAb治療已經(jīng)看到存活優(yōu)勢(shì)(分別抗HER2-neu和17-1A的mAbs)。對(duì)于血液惡性腫瘤，使用裸mAbs，特別是抗B-細(xì)胞淋巴瘤(抗B-細(xì)胞表面上CD20和CD22的mAbs)實(shí)現(xiàn)更大程度成功。
然而，顯然，使用腫瘤-相關(guān)mAbs和合適的毒性劑的偶聯(lián)物比抗大多數(shù)臨床癌癥病例的裸mAbs更有效。這里，mAb還載有對(duì)于病變組織是特異性的毒性劑，除了毒性之外，其本身固有mAb的Fc部分提供的天然或重組工程效應(yīng)物功能，例如補(bǔ)體固定和ADCC(抗體依賴細(xì)胞毒性)，其設(shè)置作用機(jī)理導(dǎo)致細(xì)胞溶解作用。然而，有可能Fc部分對(duì)于治療功能不是必需的，在mAb片段情況下，其他機(jī)理，例如細(xì)胞凋亡，抑制血管生成，抑制轉(zhuǎn)移活性，和/或影響腫瘤細(xì)胞粘附，可能起作用。毒性劑最常是化療藥物，發(fā)射粒子的放射性核素，或者細(xì)菌或植物毒素。各種偶聯(lián)物類型有著它自己特定優(yōu)點(diǎn)。穿透性放射性核素和細(xì)菌和植物毒素是十分有毒的，其毒性通常比標(biāo)準(zhǔn)化療藥物高幾個(gè)數(shù)量級(jí)。這使得前兩者可以與mAbs一起使用，因?yàn)樵谂R床情形中，攝入到疾病組織中的mAbs量非常低。臨床實(shí)踐中低的mAb腫瘤攝入和癌癥化療藥物相對(duì)低毒性譜的聯(lián)合，是為什么mAb-藥物偶聯(lián)物迄今為止不能做到承諾的主要原因。
在為研究人癌癥而建立的臨床前動(dòng)物異種移植模型中，描述過能競爭性消退甚至治愈動(dòng)物腫瘤的很多mAb偶聯(lián)物。然而，在很多這樣的動(dòng)物異種移植模型中，腫瘤攝入mAb偶聯(lián)物經(jīng)常是每克組織10-50％注射劑量，而在臨床情形下，每克組織腫瘤攝入0.1-0.0001％注射劑量更正常。意料之中的是用更具有毒性的放射性核素和毒素制備的mAb偶聯(lián)物臨床上一般比用標(biāo)準(zhǔn)化療藥物制備的相應(yīng)的mAb-藥物偶聯(lián)物遠(yuǎn)遠(yuǎn)要好。然而，放射性核素mAb偶聯(lián)物由于與腫瘤定位活性相比大大過量的循環(huán)的衰變的放射性的存在經(jīng)常能產(chǎn)生大的毒性。毒素-mAb偶聯(lián)物有著雙重缺點(diǎn)大的非靶組織損傷和大的對(duì)一般使用的植物或細(xì)菌蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)性。而現(xiàn)在能制備人或人源化形式的(互補(bǔ)決定區(qū)移植的)mAbs，任何偶聯(lián)物的毒性部分的去免疫作用可能顯著阻礙進(jìn)步。
雖然目前可看到臨床研究中沒有必然的效力，但是mAb-藥物偶聯(lián)物仍然具有令人感興趣的理論優(yōu)點(diǎn)。藥物本身結(jié)構(gòu)是完全確定的，不以異構(gòu)體存在，并且通常在遠(yuǎn)離mAbs的抗原結(jié)合區(qū)的特定位點(diǎn)的非常確定的偶聯(lián)化學(xué)，可以與mAb蛋白連接。與涉及Abs和毒素的化學(xué)偶聯(lián)物相比，MAb-藥物偶聯(lián)物制備更具有可重復(fù)性，因此更有商業(yè)發(fā)展前途并且容易獲得管理批準(zhǔn)。因?yàn)檫@樣的原因，盡管碰到挫折，但是對(duì)mAb藥物偶聯(lián)物的興趣持續(xù)不斷。但是，在最近的一些情況下，臨床前結(jié)果已經(jīng)相當(dāng)有希望。在偶聯(lián)化學(xué)中繼續(xù)精益求精，最新考慮了去除或減少mAb的免疫原性質(zhì)的能力，考慮到有用的mAb-藥物偶聯(lián)物對(duì)于臨床癌癥治療的難以捉摸的前景。
對(duì)mAb-藥物偶聯(lián)物的相關(guān)早期工作發(fā)現(xiàn)，在使用化學(xué)鍵的體外和體內(nèi)臨床前試驗(yàn)期間經(jīng)常導(dǎo)致藥物效力的損失。因此，很多年以前就認(rèn)識(shí)到，理想地，一旦通過mAb成分被靶細(xì)胞內(nèi)化，為了成為有用的治療，藥物需要以它原來的形式釋放。然后上世紀(jì)八十年代和九十年代早期焦點(diǎn)大都集中在藥物和mAb之間化學(xué)接頭的性質(zhì)上。尤其是，根據(jù)腫瘤中的pH經(jīng)常低于正常生理pH的發(fā)現(xiàn)，開發(fā)了使用溫和的酸可裂解的接頭制備的偶聯(lián)物(美國專利Nos.4,542,225；4,569,789；4,618,492；和4,952,394)。這項(xiàng)研究在Trail等的劃時(shí)代文章中達(dá)到頂峰(Science 261212-215(1993))，這篇文章證明，臨床前研究中，用合適的接頭制備的mAb-阿霉素(DOX)偶聯(lián)體能用來治愈攜帶各種人腫瘤異種移植物的小鼠。使用在被導(dǎo)向的腫瘤細(xì)胞上有非常大量的受體的抗體(稱作BR96)實(shí)現(xiàn)這個(gè)有希望的結(jié)果，mAb-藥物偶聯(lián)物被高度取代(每個(gè)mAb單位6-8個(gè)DOX殘基)，以反復(fù)為基礎(chǔ)，以大劑量施用偶聯(lián)物。
在臨床情形中，腫瘤對(duì)mAbs的攝入非常低，因?yàn)檫@個(gè)變量在某種程度上是尋址的更有毒性的藥物，需要實(shí)現(xiàn)期望的治療效果。在幾種不同的mAb-藥物偶聯(lián)物的開發(fā)中使用更有毒性的藥物(美國專利Nos.5,208,020；5,416,064；5,877,296；和6,015,562)。這些努力使用藥物，例如maytansinoids和calicheamicin的衍生物，它們本質(zhì)上太有毒性不能在標(biāo)準(zhǔn)化療中使用。與mAb的偶聯(lián)使得相對(duì)于單獨(dú)化療可見到的經(jīng)常是非特異性的細(xì)胞和蛋白質(zhì)結(jié)合，相對(duì)更多的藥物被導(dǎo)向于腫瘤。由于腫瘤靶上通?？梢姷牡退娇乖Y(jié)合位點(diǎn)，象這些的藥物的敏銳毒性可能會(huì)克服臨床上見到的腫瘤-定向的mAb的低水平。在臨床前研究中，在比先前用標(biāo)準(zhǔn)藥物例如DOX，用mAb-藥物偶聯(lián)物見到的相比低得多的mAb-藥物偶聯(lián)物劑量，見到攜帶人腫瘤異種移植物的小鼠的治愈(Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA938616-8623(1996)和Hinman等，Cancer Res.533336-3342(1993))。在maytansinoid-mAb偶聯(lián)物情況下(Liu)，治療所需要的偶聯(lián)物的量比以前用DOX偶聯(lián)物(Trail，上文)需要的少50倍以上。
在這些偶聯(lián)物的開發(fā)中，認(rèn)為藥物和mAb之間的接頭對(duì)于體外和體內(nèi)保留好的抗腫瘤活性是決定性的。用分子內(nèi)可裂解部分(腙)和藥物和mAb之間的易發(fā)生還原的鍵(二硫鍵)制備所述偶聯(lián)物。體內(nèi)血清條件下腙鍵顯然是穩(wěn)定的，發(fā)現(xiàn)二硫鍵對(duì)于實(shí)際使用通常不足夠穩(wěn)定。在calicheamicins情況下，以位阻大的(成對(duì)二甲基)二硫鍵置換標(biāo)準(zhǔn)二硫鍵而制備偶聯(lián)物，或者在maytansinoids情況下用甲基二硫鍵置換標(biāo)準(zhǔn)二硫鍵而制備偶聯(lián)物。進(jìn)行這項(xiàng)工作時(shí)，對(duì)較新的蒽環(huán)霉素-取代的mAb偶聯(lián)物繼續(xù)分離工作。在較新的DOX偶聯(lián)mAbs情況下，發(fā)現(xiàn)通過僅插入腙作為可裂解單元，并且通過硫醚鍵而不是二硫鍵連接DOX和mAb，獲得卓越結(jié)果(美國專利No.5,708,146)。當(dāng)以相同的方式連接時(shí)，還使用能使每個(gè)Mab取代位點(diǎn)DOX單元數(shù)目加倍的支化接頭，獲得新的DOX-Mab偶聯(lián)物效力增加近一個(gè)數(shù)量級(jí)(King等，Bioconjugate Chem.10279-288，(1999))。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及蒽環(huán)霉素藥物的新的內(nèi)化抗體偶聯(lián)物。具體實(shí)施方案舉例來說是阿霉素(DOX)，表柔比星，嗎啉代阿霉素(嗎啉代-DOX)，氰基嗎啉代-阿霉素(氰基嗎啉代-DOX)，和2-吡咯啉基(pyrrolino)-阿霉素(2-PDOX)的偶聯(lián)物。2-PDOX是特別有毒的，其結(jié)構(gòu)中插入烯胺，其不僅作為嵌入劑和拓?fù)洚悩?gòu)酶起作用，而且還作為具有增加的毒性的烷化劑。和DOX一樣，2-PDOX具有相對(duì)好的水溶性，這意味著其能以多取代量偶聯(lián)mAbs而不沉淀mAb。下面詳細(xì)描述的藥物始終以每mAb分子8個(gè)藥物部分的平均水平(典型地測(cè)得7-9)被取代。但是藥物的數(shù)目也可以是每mAb分子6-10個(gè)分子之間的范圍。
一方面，本發(fā)明涉及一種免疫偶聯(lián)物，包括導(dǎo)向部分，蒽環(huán)霉素藥物，和通過巰基結(jié)合導(dǎo)向部分并且通過分子內(nèi)可裂解部分結(jié)合蒽環(huán)霉素化療藥物的接頭。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，導(dǎo)向部分是mAb，蒽環(huán)霉素化療藥物是DOX，2-PDOX，嗎啉代-DOX和嗎啉代氰基-DOX，并且分子內(nèi)可裂解部分是腙。
另一方面，本發(fā)明涉及一種免疫偶聯(lián)物，包括導(dǎo)向于疾病的抗體和蒽環(huán)霉素化療藥物。近30-40年左右已經(jīng)合成幾百種蒽環(huán)霉素藥物例子，在別處對(duì)它們進(jìn)行了詳細(xì)討論(參見AnthracyclineAntibiotics；New Analogs，methods of Delivery，and Mechanismsof Action，Waldemar Priebe，Editor，ACS Symposium Series 574，American Chemical Society，Washington DC，1994)。認(rèn)為這樣的類似物在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種免疫偶聯(lián)物，包括導(dǎo)向于疾病的抗體和式I和II的蒽環(huán)霉素化療藥物
其中，A不存在或者其可以選自NH，N-烷基，N-環(huán)烷基，O，S，和CH2；虛線表示單鍵或雙鍵；并且R是H或CN；接頭通過硫化物基團(tuán)結(jié)合導(dǎo)向部分，而通過分子內(nèi)可裂解部分結(jié)合蒽環(huán)霉素化療藥物。當(dāng)A“不存在”時(shí)，通過單鍵連接每一側(cè)與A鄰接的碳原子，這樣得到五元環(huán)。
如這里使用的，“烷基”指飽和脂肪烴基，包括1-20碳原子的直鏈和支鏈基團(tuán)當(dāng)本文中提到數(shù)字范圍，如“1-20”，意思是在這種情況下烷基可以含有1個(gè)碳原子，2個(gè)碳原子，3個(gè)碳原子，等，至多包括20個(gè)碳原子)。含有1-4個(gè)碳原子的烷基稱作低級(jí)烷基。更優(yōu)選地，烷基是具有1-10個(gè)碳原子的中等大小烷基，例如，甲基，乙基，丙基，2-丙基，正丁基，異丁基，叔丁基，戊基等等。最優(yōu)選地，它是具有1-4個(gè)碳原子的低級(jí)烷基，例如甲基，乙基，丙基，2-丙基，正丁基，異丁基，或叔丁基，等等。
如這里使用的，“環(huán)烷基”指3-8元全碳單環(huán)，全碳5-元/6-元或6-元/6-元稠合雙環(huán)或多環(huán)稠合環(huán)(“稠合”環(huán)體系意思是體系中的每一個(gè)環(huán)與體系中另外一個(gè)環(huán)共有相鄰的碳原子對(duì))基團(tuán)，其中環(huán)中的一個(gè)或多個(gè)可以含有一個(gè)或幾個(gè)雙鍵，但是所有環(huán)都沒有完全偶聯(lián)的pi-電子體系。環(huán)烷基的例子不限于環(huán)丙烷，環(huán)丁烷，環(huán)戊烷，環(huán)戊烯，環(huán)己烷，環(huán)己二烯，金剛烷，環(huán)庚烷，環(huán)庚三烯等等。環(huán)烷基可以被取代或不被取代。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，分子內(nèi)可裂解部分是腙。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，mAb是導(dǎo)向于腫瘤-相關(guān)抗原的mAb。腫瘤-相關(guān)抗原定義為以比正常細(xì)胞中更高的量由腫瘤細(xì)胞或者它們的脈管系統(tǒng)表達(dá)的抗原，其中正常細(xì)胞對(duì)于患者生存所必需的細(xì)胞功能是重要的。腫瘤-相關(guān)抗原也可以是與不同正常細(xì)胞相關(guān)的抗原，例如造血細(xì)胞，B-細(xì)胞，T-細(xì)胞或骨髓細(xì)胞中的譜系抗原，從而患者能生存，伴有所述正常細(xì)胞暫時(shí)的選擇性減少，而表達(dá)相同抗原的惡性細(xì)胞被足夠破壞，以減輕患者癥狀并且還改善患者狀況。mAb還可以與血液惡性腫瘤相關(guān)的抗原反應(yīng)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，mAb選自B-細(xì)胞，T-細(xì)胞，骨髓-細(xì)胞，和其他造血細(xì)胞-相關(guān)抗原，例如B-細(xì)胞中的CD19，CD20，CD21，CD22，CD23；骨髓細(xì)胞中的CD33，CD45，和CD66；T-細(xì)胞中的IL-2(TAC或CD25)；不同造血腫瘤類型中的MUCl，肌腱蛋白，CD74，HLA-DR，CD80；各種癌中的CEA，CSAp，MUC1，MUC2，MUC 3，MUC4，PAM4，EGP-1，EGP-2，AFP，HCG，HER2/neu，EGFR，VEGF，P1GF，Le(y)，碳酸酐酶IX，PAP，PSMA，MAGE，S100，肌腱蛋白，和TAG-72，神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的肌腱蛋白，和脈管系統(tǒng)和內(nèi)皮細(xì)胞，以及一些腫瘤的支持性基質(zhì)表達(dá)的抗原。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，mAb選自LL1(抗-CD74)，LL2(抗-CD22)，hA20和利妥?，?抗-CD20)，M195(抗-CD33)，RS7(抗-上皮糖蛋白-1(EGP-1))，17-1A(抗-EGP-2)，PAM-4，BrE3，和KC4(都是抗-MUC1)，MN-14(抗-癌胚抗原(CEA))，Mu-9(抗-結(jié)腸-特異性抗原-p)，Immu 31(抗甲胎蛋白)，抗-TAG-72(例如，CC49)，抗-Tn，J591(抗-PSMA)，BC-2(抗-肌腱蛋白抗體)和G250(抗-碳酸酐酶IXmAb)。使用這些偶聯(lián)物可以定向的其他有用的抗原包括HER-2/neu，CD19，CD20(例如，C2B8，hA20，cA20，1F5Mabs)CD21，CD23，CD33，CD40，CD80，甲胎蛋白(AFP)，VEGF，EGF受體，P1GF(胎盤生長因子)，ILGF-1(胰島素樣生長因子-1)，MUC1，MUC2，MUC3，MUC4，PSMA，神經(jīng)節(jié)苷脂，HCG，EGP-2(例如，17-1A)，CD37，HLA-DR，CD30，Ia，Ii，A3，A33，Ep-CAM，KS-1，Le(y)，S100，PSA，肌腱蛋白，葉酸受體，Thomas-Friedenreich抗原，腫瘤壞死抗原，腫瘤血管生成抗原，Ga 733，IL-2(CD25)，T101，MAGE，CD66，CEA，NCA95，NCA90或其組合。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，導(dǎo)向性mAb針對(duì)隨后被抗體快速內(nèi)化的表面抗原。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，導(dǎo)向性mAb針對(duì)CD74的表面抗原。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，接頭是4-[N-馬來酰亞胺基甲基]環(huán)庚烷-1-羧酰肼基。
本發(fā)明還描述了制備本發(fā)明的組合物的方法，以及所述組合物的使用方法。
附圖的簡要描述

圖1是利用描述的方法制備的蒽環(huán)霉素-抗體偶聯(lián)物的代表性大小排阻HPLC譜圖。
圖2詳細(xì)描述1微克/毫升藥物-mAb偶聯(lián)物濃度的抗Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞的DOX-LL1偶聯(lián)物與非導(dǎo)向性MN-14抗體的DOX偶聯(lián)物相比的體外效力。DOX-LL1偶聯(lián)物與DOX-MN-14偶聯(lián)物相比，表現(xiàn)出存活細(xì)胞級(jí)分中三個(gè)數(shù)量級(jí)的差異。
圖3詳細(xì)說明裸鼠DU145前列腺異種移植物模型中單一100微克劑量的2-PDOX-RS7偶聯(lián)物的效力。
圖4詳細(xì)說明侵襲性RAJI/SCID小鼠全身腫瘤模型中單一劑量的LL1抗體的2-PDOX-和DOX-偶聯(lián)物的效力。對(duì)動(dòng)物i.v.注射Raji B-細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞，并且五天后用圖中指定的偶聯(lián)物治療。
圖5詳細(xì)說明侵襲性RAJI/SCID小鼠全身腫瘤模型中單一劑量的2-PDOX-LL1抗體與不施用偶聯(lián)物的未處理對(duì)照或者給與非導(dǎo)向性對(duì)照偶聯(lián)物2-PDOX-MN-14的動(dòng)物組相比的效力。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述除非另有說明，如這里使用的，“一個(gè)”意思是“一個(gè)或多個(gè)”。
導(dǎo)論化療藥物，例如上面討論的那些，能通過幾種方法與抗體偶聯(lián)，形成mAb-藥物偶聯(lián)物。例如，化療藥物可以在還原mAb鏈間二硫鍵之后與mAb，或其片段連接。這種方法產(chǎn)生每個(gè)抗體分子平均8-10個(gè)(取決于IgG類型)游離巰基，并且以在還原反應(yīng)中使用的硫醇的有限水平以可重復(fù)方式這樣做。這種化療藥物的連接方法是有利的，由于下面的原因首先，在親水性賴氨酸殘基上沒有暴露的mAb或其片段上內(nèi)部或半內(nèi)部位點(diǎn)中放置連接的化療藥物。由于mAb的放置了化療藥物的更多的疏水性區(qū)域而使它們保持更穩(wěn)定。第二，這樣的位點(diǎn)不改變mAb或其片段的總電荷。第三，當(dāng)使用mAb裸形式時(shí)，內(nèi)部硫醇的放置較不可能干擾特別重要的ADCC和補(bǔ)體作用。因此，選擇不干擾的連接位點(diǎn)，使得ADCC和補(bǔ)體固定，能與mAbs，或mAb片段互補(bǔ)，起藥物送遞載體作用。第四，與暴露的賴氨酸基團(tuán)上放置多個(gè)化療藥物分子相比，內(nèi)部硫醇位置的放置較不可能導(dǎo)致對(duì)化療藥物的免疫反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，與偶聯(lián)前抗體電荷相比，Ab-藥物偶聯(lián)物中抗體的總電荷不改變。這是因?yàn)樵谂悸?lián)反應(yīng)中沒有利用賴氨酸殘基，因此，沒有游離的帶正電荷的氨基被修飾形成例如中性酰胺鍵。
抗體如這里描述的，抗體指全長(即，天然存在的或者正常免疫球蛋白基因片段重組方法形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗體)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特異性結(jié)合)部分，象抗體片段。
抗體片段是抗體的一部分，例如F(ab′)2，F(xiàn)(ab)2，F(xiàn)ab′，F(xiàn)ab，F(xiàn)v，scFv(單鏈Fv)等。不考慮結(jié)構(gòu)，抗體片段結(jié)合完整抗體識(shí)別的相同的抗原，因此，它是抗體的一部分的抗原結(jié)合片段。
術(shù)語“抗體片段”還包括通過與特異抗原結(jié)合形成復(fù)合體的象抗體一樣作用的任何合成的或基因工程蛋白質(zhì)。例如，抗體片段包括可變區(qū)構(gòu)成的分離的片段，例如由重鏈和輕鏈可變區(qū)構(gòu)成的“Fy”片段，其中重鏈和輕鏈可變區(qū)通過肽接頭連接的重組單鏈多肽分子(“scFv蛋白質(zhì)”)，和由模擬超變區(qū)的氨基酸殘基構(gòu)成的最小識(shí)別單位?？梢砸圆煌椒?gòu)建Fv片段，得到多價(jià)和/或多特異性結(jié)合形式。多價(jià)結(jié)合形式與抗特異性表位的一個(gè)以上結(jié)合位點(diǎn)反應(yīng)，而多特異形式與一個(gè)以上表位(抗原的或甚至抗特異性抗原和不同抗原)結(jié)合。
根據(jù)這里討論的，術(shù)語抗體融合蛋白是重組產(chǎn)生的抗原-結(jié)合分子，其中具有相同或不同特異性的相同或不同天然抗體，單鏈抗體或抗體片段中的兩個(gè)或多個(gè)被連接。融合蛋白至少包括一個(gè)特異性結(jié)合位點(diǎn)。
融合蛋白的價(jià)指融合蛋白具有抗原或表位結(jié)合臂或位點(diǎn)的總數(shù)；即單價(jià)，二價(jià)，三價(jià)或多價(jià)?？贵w融合蛋白的多價(jià)意思是它利用了與抗原結(jié)合中多個(gè)相互作用的優(yōu)點(diǎn)，從而提高了與抗原結(jié)合或與不同抗原結(jié)合的親合力。特異性指抗體融合蛋白能結(jié)合多少不同類型的抗原或表位；即單特異性，二特異性，三特異性或多特異性。使用這些定義，天然抗體，例如IgG，是二價(jià)的，因?yàn)樗哂袃蓚€(gè)結(jié)合臂，但是是單特異性的，因?yàn)樗Y(jié)合一種類型的抗原或表位。單特異性多價(jià)融合蛋白對(duì)于相同的抗原或表位有一個(gè)以上結(jié)合位點(diǎn)。例如，單特異性二價(jià)抗體是具有與相同抗原反應(yīng)的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的融合蛋白。融合蛋白可以包括不同抗體成分或相同抗體成分的多個(gè)拷貝的多價(jià)或多特異性組合。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用抗體，例如單克隆抗體(mAbs)，和快速內(nèi)化抗體，以識(shí)別或結(jié)合在靶細(xì)胞是高水平表達(dá)的并且相對(duì)于正常組織優(yōu)先或只在病變細(xì)胞上表達(dá)的標(biāo)記物或腫瘤相關(guān)抗原。本發(fā)明范圍內(nèi)有用的抗體包括抗腫瘤相關(guān)抗原的抗體，例如具有如上所述性質(zhì)的抗體(并且表現(xiàn)出內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞和微生物的水平的不同性質(zhì))，對(duì)癌癥包括但不限于使用下面的mAbLL1(抗-CD74)，LL2(抗-CD22)，M195(抗-CD33)，MN3(抗-NCA90)，RS7(抗-上皮糖蛋白-1(EGP-1))，PAM-4，BrE3和KC4(都是抗-MUC1)，MN-14(抗-癌胚胎抗原(CEA))，Mu-9(抗-結(jié)腸-特異性抗原-p)，Immu 31(抗甲胎蛋白)，抗-TAG-72(例如，CC49)，抗-Tn，J591(抗-PSMA)，M195(抗-CD33)和G250(抗-碳酸酐酶IX mAb)。使用這些偶聯(lián)物可以導(dǎo)向的其他有用抗原和這樣的抗原的不同表位包括HER-2/neu，，CD19，CD20(例如，C2B8，hA20，1F5Mabs)CD21，CD23，CD25，CD30，CD33，CD37，CD40，CD74，CD80，甲胎蛋白(AFP)，VEGF，EGF受體，P1GF，MUC1，MUC2，MUC3，MUC4，PSMA，PAP，碳酸酐酶IX，TAG-72，GD2，GD3，，HCG，EGP-2(例如，17-1A)，HLA-DR，CD30，Ia，A3，A33，Ep-CAM，KS-1，Le(y)，S100，PSA，肌腱蛋白，葉酸受體，Tn或Thomas-Friedenreich抗原，腫瘤壞死抗原，腫瘤血管生成抗原，Ga733，，T101，MAGE，或者它們的組合。2002年11月15日申請(qǐng)的發(fā)明名稱是“定向送遞治療藥物的多特異性多價(jià)復(fù)合體的應(yīng)用”的美國臨時(shí)申請(qǐng)登記號(hào)No.60/426379中公開了多種上述抗原。
在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用快速內(nèi)化的抗體，然后在細(xì)胞表面上再表達(dá)，使得細(xì)胞持續(xù)吸收和增加循環(huán)抗體-化療藥物偶聯(lián)物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述藥物是蒽環(huán)霉素，并且抗體-蒽環(huán)霉素偶聯(lián)物內(nèi)化于靶細(xì)胞中，然后在細(xì)胞表面上再表達(dá)。最優(yōu)選的抗體/抗原對(duì)的例子是LL1和CD74(不變鏈，II類特異性陪伴分子，Ii)。CD74抗原在B細(xì)胞淋巴瘤，某些T細(xì)胞淋巴瘤，黑素瘤和一些其他癌上高度表達(dá)(Ong等，Immunology 98296-302(1999)).
在優(yōu)選實(shí)施方案中，在人疾病的治療中使用的抗體是人或人源化(CDR-移植到人構(gòu)架中)抗體形式；但是能使用鼠，嵌合和靈長動(dòng)物化抗體形式。對(duì)于獸醫(yī)應(yīng)用，相同物種IgG可能是最有效的載體，但是交叉物種IgGs也是有用的，例如對(duì)狗使用鼠抗體(例如，L243抗-HLA-DR mAb用于治療犬淋巴瘤)。最優(yōu)選使用相同物種免疫球蛋白(IgG)分子作為送遞試劑，使免疫反應(yīng)最小化。當(dāng)考慮反復(fù)治療時(shí)，這是特別重要的。對(duì)于人，人IgG抗體或人源化IgG抗體較不可能產(chǎn)生患者的抗-IgG免疫應(yīng)答。導(dǎo)向于內(nèi)化抗原，在與靶細(xì)胞結(jié)合之后，象hLL1和hLL2這樣的抗體快速內(nèi)化，這意味著偶聯(lián)的化療藥物快速內(nèi)化于細(xì)胞中。
免疫調(diào)節(jié)劑，例如細(xì)胞因子，也能偶聯(lián)于單克隆抗體-蒽環(huán)霉素藥物，或者能施用與本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的嵌合，人源化或人單克隆抗體-蒽環(huán)霉素藥物偶聯(lián)物不偶聯(lián)的免疫調(diào)節(jié)劑?？梢栽谑┯帽景l(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的單克隆抗體-蒽環(huán)霉素藥物偶聯(lián)物之前，同時(shí)或之后施用免疫調(diào)節(jié)劑。免疫調(diào)節(jié)劑還可以和由與不同抗原結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)抗體構(gòu)成的雜合抗體偶聯(lián)。這樣的抗原也可以是免疫調(diào)節(jié)劑。例如，在施用抗體組合的同時(shí)，之前或之后，CD40或其他免疫調(diào)節(jié)劑可以和抗-CSAp或抗-CSAp/非-CSAp抗體聯(lián)合給藥。單克隆抗體-蒽環(huán)霉素偶聯(lián)物可以與抗CD40聯(lián)合，或者與抗CD40偶聯(lián)成融合蛋白來使用。
如這里使用的，術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)劑”包括細(xì)胞因子，干細(xì)胞生長因子，淋巴毒素，例如腫瘤壞死因子(TNF)，和造血因子，例如白介素(例如，白介素-1(IL-1)，IL-2，IL-3，IL-6，IL-10，IL-12，IL-18，和IL-21)，集落刺激因子(例如，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF))，干擾素(例如，干擾素-α，β和γ)，指定為“S1因子”的干細(xì)胞生長因子，紅細(xì)胞生成素和血小板生成素。合適的免疫調(diào)節(jié)劑部分的例子包括IL-2，IL-6，IL-10，IL-12，IL-18，IL-21，干擾素-γ，TNF-α，等。
免疫調(diào)節(jié)劑是根據(jù)本發(fā)明定義的治療劑，當(dāng)存在時(shí)，它改變，抑制或刺激身體的免疫系統(tǒng)。典型地，本發(fā)明中有用的免疫調(diào)節(jié)劑刺激免疫細(xì)胞增殖或者在免疫應(yīng)答級(jí)聯(lián)中激活，例如巨噬細(xì)胞，B-細(xì)胞，和/或T-細(xì)胞。這里描述的免疫調(diào)節(jié)劑的例子是細(xì)胞因子，其是與特異性抗原接觸時(shí)一個(gè)細(xì)胞群(例如激發(fā)的T-淋巴細(xì)胞)釋放的大約5-20kD的可溶性小蛋白，它作為細(xì)胞之間細(xì)胞間介質(zhì)起作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，細(xì)胞因子的例子包括淋巴因子，單核因子，白介素，和幾種相關(guān)的信號(hào)傳遞分子，例如腫瘤壞死因子(TNF)和干擾素。趨化因子是一組細(xì)胞因子。一些白介素和干擾素是刺激T細(xì)胞或其他免疫細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子的例子。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)劑提高蒽環(huán)霉素藥物-抗體偶聯(lián)物的效力，并且在某些情況下是通過宿主的刺激物效應(yīng)細(xì)胞。
抗體-化療藥物偶聯(lián)物本發(fā)明涉及蒽環(huán)霉素藥物和抗體的偶聯(lián)物，其中蒽環(huán)霉素藥物和抗體通過包括酰肼和馬來酰亞胺的接頭連接。接頭優(yōu)選是4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酰肼。偶聯(lián)物優(yōu)選具有下式 其中n是6至10。
此外，抗體針對(duì)或識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原?？贵w可以是單克隆抗體，其抗原-結(jié)合片段或者抗體融合蛋白。抗體融合蛋白可以是多價(jià)和/或多特異性的。偶聯(lián)物中的抗體融合蛋白可以包括兩個(gè)或多個(gè)相同或不同的天然的或合成的抗體，單鏈抗體或具有相同或不同特異性的抗體片段。融合蛋白的抗體或抗體片段選自LL1，LL2，M195，MN-3，RS7，17-1A，RS11，PAM-4，KC4，BrE3，MN-14，Mu-9，Immu31，CC49，Tn抗體，J591，Le(y)抗體和G250。
通過抗體內(nèi)化可以導(dǎo)向于這種腫瘤相關(guān)抗原。偶聯(lián)物用于導(dǎo)向于癌，肉瘤，淋巴瘤，白血病，神經(jīng)膠質(zhì)瘤或皮膚癌，例如黑素瘤。腫瘤相關(guān)抗原優(yōu)選選自CD74，CD22，EPG-1，CEA，結(jié)腸-特異性抗原-p粘蛋白(CSAp)，碳酸酐酶IX，HER-21neu，，CD19，CD20，CD21，CD23，CD25，CD30，CD33，CD40，CD45，CD66，NCA90，NCA95，CD80，甲胎蛋白(AFP)，VEGF，EGF受體，P1GF，MUC1，MUC2，MUC3，MUC4，PSMA，GD2，GD3神經(jīng)節(jié)甘脂，HCG，EGP-2，CD37，HLA-D-DR，CD30，Ia，li，A3，A33，Ep-CAM，KS-1，Le(y)，S100，PSA，肌腱蛋白，葉酸受體，Tn和Thomas-Friedenreich抗原，腫瘤壞死抗原，腫瘤血管生成抗原，Ga 733，IL-2，MAGE，和它們的組合。更優(yōu)選地，腫瘤相關(guān)抗原選自CD74，CD19，CD20，CD22，CD33，EPG-1，MUC1，CEA和AFP。這些腫瘤相關(guān)抗原可以是B-細(xì)胞，T-細(xì)胞，骨髓細(xì)胞的譜系抗原(CDs)，或與血液惡性腫瘤相關(guān)的抗原。
偶聯(lián)物的抗體部分可以是鼠，嵌合，靈長動(dòng)物化的，人源化，或人抗體部分。抗體可以是完整免疫球蛋白或者其抗原-結(jié)合片段，例如IgG或者其片段。優(yōu)選地，抗體針對(duì)B-細(xì)胞，例如選自CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD30，CD37，CD40，CD52，CD74，CD80，和HLA-DR的抗原?？贵w，其抗原-結(jié)合片段或融合蛋白優(yōu)選選自LL1，LL2，L243，C2B8，A20，MN-3，M195，MN-14，抗-AFP，Mu-9，PAM-4，RS7，RS11和17-1A。更優(yōu)選地，抗體是LL1，LL2，L243，C2B8，或hA20。另外，抗體通過與抗體上還原的二硫鍵連接的接頭與藥物連接，其可以是抗體上的鏈間二硫鍵。
偶聯(lián)物的蒽環(huán)霉素藥物部分選自柔紅霉素，阿霉素，表柔比星，2-吡咯啉基阿霉素，嗎啉代-阿霉素，和氰基嗎啉代-阿霉素。此外，蒽環(huán)霉素藥物可通過13-酮基部分與抗體連接。優(yōu)選地，每分子抗體有6-10個(gè)分子的蒽環(huán)霉素藥物。另外，抗體-蒽環(huán)霉素偶聯(lián)物內(nèi)化到靶細(xì)胞中，然后抗原在細(xì)胞表面上再表達(dá)。
本發(fā)明涉及這里描述的偶聯(lián)物的制備方法，其中接頭首先與蒽環(huán)霉素藥物偶聯(lián)，從而產(chǎn)生蒽環(huán)霉素藥物-接頭偶聯(lián)物，并且其中蒽環(huán)霉素藥物-接頭偶聯(lián)物接著偶聯(lián)硫醇還原的單克隆抗體或抗體片段。與硫醇還原的單克隆抗體或抗體片段偶聯(lián)之前可以將蒽環(huán)霉素藥物-接頭偶聯(lián)物純化，但是不必須這樣做。因此，優(yōu)選地，在與硫醇還原的單克隆抗體或抗體片段偶聯(lián)之前不需要純化蒽環(huán)霉素藥物-接頭偶聯(lián)物。偶聯(lián)物的制備方法應(yīng)該如此，使得蒽環(huán)霉素藥物上第二反應(yīng)官能團(tuán)不被破壞。另外，偶聯(lián)物的制備方法不應(yīng)該破壞蒽環(huán)霉素藥物上的烷基化基團(tuán)。偶聯(lián)物中的蒽環(huán)霉素藥物優(yōu)選是2-吡咯啉基-阿霉素，嗎啉代-阿霉素或氰基嗎啉代-阿霉素。
為了與抗體偶聯(lián)，分別將化療藥物分子活化，使得它們包含在中性pH下對(duì)硫醇反應(yīng)特異性的游離馬來酰亞胺基團(tuán)。當(dāng)化療藥物帶有反應(yīng)性酮時(shí)，利用可商購的接頭4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酰肼(M2C2H；Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)[MolecularBiosciences，Inc.，Boulder，CO也提供其三氟乙酸鹽]能將酮轉(zhuǎn)化為腙，如下文方案I所示。
在方案I中，藥物是化療藥物，優(yōu)選蒽環(huán)霉素藥物，并且R基團(tuán)是氫原子或任選地被羥基(-OH)取代的C1-C6烷基。
方案1不受理論約束，認(rèn)為接頭M2C2H在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中是特別有用的基團(tuán)，有兩個(gè)原因。第一，認(rèn)為接頭中的環(huán)己基穩(wěn)定腙官能團(tuán)。重要的是使用的腙鍵對(duì)于血清條件基本上是穩(wěn)定的，并且環(huán)己基鄰近形成的腙，導(dǎo)致與更標(biāo)準(zhǔn)的直鏈烷基相比更穩(wěn)定的腙。第二，一旦化療藥物-mAb偶聯(lián)物內(nèi)化到細(xì)胞中，則酮與這種羧酰肼反應(yīng)產(chǎn)生的腙被裂解。
對(duì)于還原的mAb上可獲得的巰基稍微過量(1-5倍摩爾)的馬來酰亞胺-取代的化療藥物在水溶液中與還原的mAb混合。在中性，接近中性或低于中性pH下進(jìn)行反應(yīng)，優(yōu)選大約pH4至大約pH7。讓成分進(jìn)行大約5至大約30分鐘短時(shí)間的反應(yīng)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，就反應(yīng)時(shí)間和pH來說可以優(yōu)化反應(yīng)條件。下面方案所示的化療藥物-mAb偶聯(lián)物(其中n是1-10的整數(shù)，優(yōu)選1-8)，然后通過大小排阻色譜法和疏水性相互作用色譜柱從化療藥物和其他緩沖成分分離。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物是蒽環(huán)霉素并且n是6-10的整數(shù)。
化療藥物-mAb偶聯(lián)物上面的條件對(duì)于2-PDOX是最優(yōu)的。反應(yīng)條件要最優(yōu)，因?yàn)檫@保證只有mAb的自由產(chǎn)生的硫醇基團(tuán)與馬來酰亞胺活化的藥物反應(yīng)，而反應(yīng)條件對(duì)2-PDOX的烯胺不起作用。令人驚奇的是硫醇-馬來酰亞胺偶聯(lián)能在可烷基化的基團(tuán)的存在下進(jìn)行，例如烯胺基團(tuán)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用的化療藥物是蒽環(huán)霉素藥物。這些藥物包括原來這組成員之一，阿霉素(DOX，如下所示)，及其異構(gòu)體，表柔比星代表的一大類衍生物。
DOX阿霉素和表柔比星都在癌癥治療中廣泛使用。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，化療藥物包括高毒性2-PDOX的類似物，即，嗎啉代-和氰基嗎啉代-阿霉素(分別是嗎啉代-DOX和氰基嗎啉代DOX)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，化療藥物包括柔紅霉素。
本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的蒽環(huán)霉素藥物包含多個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)，可以稱作第二反應(yīng)官能團(tuán)，在藥物與接頭偶聯(lián)之前和/或藥物-接頭偶聯(lián)物與mAb偶聯(lián)之前，要求用現(xiàn)有技術(shù)中公知的保護(hù)基團(tuán)將其保護(hù)；保護(hù)作用是必須的，這樣不會(huì)破壞反應(yīng)基團(tuán)的完整性。參見Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis(John Wiley & Sons第二版1991。反應(yīng)基團(tuán)包括蒽環(huán)霉素藥物中的蒽醌核心中的羰基；某些條件下可以與親核試劑反應(yīng)的基團(tuán)。其他反應(yīng)基團(tuán)包括位于蒽環(huán)霉素藥物分子中的各種醇基；某些條件下可以與親電試劑反應(yīng)的基團(tuán)。最后，其他反應(yīng)基團(tuán)包括DOX中存在的胺基和2-PDOX中存在的烯胺；這兩種都與親電試劑反應(yīng)。在帶有烷基化基團(tuán)(例如，2-PDOX的烯胺)的蒽環(huán)霉素藥物情況下，需要控制反應(yīng)條件，使得烷基化基團(tuán)的完整性不被破壞。
2-PDOX嗎啉代-DOX 氰基嗎啉代-DOX蒽環(huán)霉素類這類藥物中，為了制備更大或更小毒性的免疫偶聯(lián)物，以它們不同的毒性為基礎(chǔ)，可以互換毒性1-10,000倍范圍不同(3-4個(gè)數(shù)量級(jí))的各個(gè)藥物。蒽環(huán)霉素類能通過幾種機(jī)理對(duì)靶細(xì)胞施加毒性作用，包括抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶2(top 2)，插入到DNA中，氧化還原反應(yīng)和結(jié)合某些細(xì)胞內(nèi)或膜蛋白。另外，可以設(shè)計(jì)具有另外的細(xì)胞殺傷機(jī)理的類似物，例如被烷基化的可能性。舉例的類似物是帶有烷基化部分的蒽環(huán)霉素類，如2-PDOX類似物的情況。在這個(gè)例子中，烷基化部分是烯胺基團(tuán)。在2-PDOX類似物中，吡咯啉環(huán)中的烯胺在生理?xiàng)l件下對(duì)于親核試劑是高反應(yīng)性的。
藥物組合物和給藥方法本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及含有本發(fā)明的mAb-藥物偶聯(lián)物和藥學(xué)可接受載體或賦形劑的藥物組合物。所謂“藥學(xué)可接受載體”意指但不限于無毒固體，半固體或液體填料，稀釋劑，膠囊化材料或者本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的配制輔助劑。稀釋劑，例如多元醇，聚乙二醇和葡聚糖，可以用來提高偶聯(lián)物的生物半壽期。
本發(fā)明還涉及治療哺乳動(dòng)物疾病的方法，包括施用這里描述的抗體和蒽環(huán)霉素藥物的偶聯(lián)物。本發(fā)明方法還包括在其他標(biāo)準(zhǔn)治療法之前、同時(shí)或之后施用這里描述的抗體-蒽環(huán)霉素偶聯(lián)物，其中所述標(biāo)準(zhǔn)治療法選自放射療法，手術(shù)和化學(xué)療法。
本發(fā)明意在包括治療哺乳動(dòng)物疾病的方法，包括施用導(dǎo)向于相同病細(xì)胞上不同抗原或相同抗原的不同表位的抗體和蒽環(huán)霉素藥物偶聯(lián)物中的兩種或多種。另外，本發(fā)明意在包括治療哺乳動(dòng)物疾病的方法，包括在以第二種抗體為基礎(chǔ)的治療之前、同時(shí)或之后施用抗體和蒽環(huán)霉素藥物的偶聯(lián)物，使得與偶聯(lián)物中的抗體相比，第二抗體為基礎(chǔ)的治療中第二抗體導(dǎo)向于病變細(xì)胞上的不同抗原或相同抗原的不同表位。
在一些實(shí)施方案中，單獨(dú)的mAb-藥物偶聯(lián)物或者含有本發(fā)明的mAb-藥物偶聯(lián)物和藥學(xué)可接受載體或賦形劑的藥物組合物可以在對(duì)受試者治療的方法中使用，包括對(duì)受試者施用治療有效量的本發(fā)明的mAb-藥物偶聯(lián)物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，受試者是哺乳動(dòng)物。例舉的哺乳動(dòng)物包括人，豬，綿羊，山羊，馬，小鼠，狗，貓，牛等。可以用本發(fā)明的mAb-藥物偶聯(lián)物治療的疾病包括癌癥，例如皮膚癌，頭頸癌，肺癌，乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，子宮內(nèi)膜癌，宮頸癌，結(jié)腸癌，直腸癌，膀胱癌，腦癌，胃癌，胰腺癌，淋巴系統(tǒng)癌。通過施用治療有效量的本發(fā)明的mAb-藥物偶聯(lián)物可以治療患有B-或T-細(xì)胞癌，非何杰金氏淋巴瘤，何杰金氏病，淋巴細(xì)胞或髓細(xì)胞白血病，多發(fā)性骨髓瘤，肉瘤和黑素瘤的患者。
本發(fā)明的mAb-藥物偶聯(lián)物可以靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，鞘內(nèi)，膀胱內(nèi)或腫瘤內(nèi)給藥。偶聯(lián)物可以以反復(fù)和/或周期為基礎(chǔ)，以藥團(tuán)劑或輸注給與。根據(jù)藥物的劑量和就副作用而言的偶聯(lián)物的耐受性，輸注可以重復(fù)一次或多次，由負(fù)責(zé)的主治醫(yī)師決定。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白能憑經(jīng)驗(yàn)確定本發(fā)明的mAb-藥物偶聯(lián)物的有效量。對(duì)需要治療癌癥的受試者施用和一種或幾種藥學(xué)可接受賦形劑組合的藥物組合物藥物。要理解，當(dāng)對(duì)人患者給藥時(shí)，在合理醫(yī)學(xué)判定范圍內(nèi)由負(fù)責(zé)的主治醫(yī)師決定本發(fā)明的藥劑或組合物的總的日用量。對(duì)于特定患者的特定治療有效劑量水平取決于多個(gè)因素要實(shí)現(xiàn)的細(xì)胞反應(yīng)的類型和程度；使用的特異性mAb-藥物偶聯(lián)物或組合物的活性；使用的特異性mAb-藥物偶聯(lián)物或組合物；患者的年齡，體重，一般健康狀況，性別和飲食；給藥時(shí)間，給藥途徑，和藥劑排泄速度；治療持續(xù)時(shí)間；與特定藥劑聯(lián)合或同時(shí)使用的藥物等醫(yī)藥領(lǐng)域公知的因素。例如，本領(lǐng)域公知藥物起始劑量是比實(shí)現(xiàn)期望的治療效果所需要的劑量更低的水平，并且逐漸增加劑量，直到實(shí)現(xiàn)期望的效果。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，在其他標(biāo)準(zhǔn)治療法包括放療、手術(shù)或化療之前、同時(shí)或之后施用抗體-蒽環(huán)霉素偶聯(lián)物。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，施用抗體和蒽環(huán)霉素藥物的一種或多種偶聯(lián)物，偶聯(lián)物導(dǎo)向于病變細(xì)胞上相同抗原或相同抗原上的不同表位。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在另一種以抗體為基礎(chǔ)的治療之前、同時(shí)或之后給與抗體和蒽環(huán)霉素藥物的偶聯(lián)物。這種附加的以抗體為基礎(chǔ)的治療可以包括施用兩種或多種以抗體為基礎(chǔ)的治療，包括裸治療，其中單獨(dú)給與抗體或者與另一種治療藥劑聯(lián)合施用，該藥劑是與抗體偶聯(lián)的或沒有偶聯(lián)的。偶聯(lián)可以使用本文公開的接頭或其他類型的接頭。當(dāng)給與兩種以抗體為基礎(chǔ)的治療時(shí)，這些治療無論施用哪一種抗體，第二種抗體導(dǎo)向于相同病變細(xì)胞上不同的抗原或相同抗原上的不同表位。第二種抗體也與另一種(不同)藥物或者與治療性同位素偶聯(lián)，這樣提供以抗體為基礎(chǔ)的治療。也理解這種治療能聯(lián)合，在施用增強(qiáng)抗腫瘤效果或預(yù)防或減輕治療偶聯(lián)物的脊髓抑制效果的細(xì)胞因子之前，同時(shí)或之后施用。
上面確定的每一種治療方法另外可以包括施用一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑。這些免疫調(diào)節(jié)劑可以選自干擾素，細(xì)胞因子，干細(xì)胞生長因子，集落-刺激因子，淋巴毒素和其他造血因子。干擾素優(yōu)選α-干擾素，β-干擾素或γ-干擾素，造血因子可以選自紅細(xì)胞生成素，血小板生成素，白介素(ILs)，集落刺激因子(CSF)，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)。白介素可以選自IL-1，IL-2，IL-3，IL-6，IL-10，IL-12，IL-18，和IL-21。免疫調(diào)節(jié)劑或造血因子可以在免疫偶聯(lián)物治療之前，期間或之后施用。施用免疫調(diào)節(jié)劑來增強(qiáng)施用的本發(fā)明偶聯(lián)物的效力。
試劑盒本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案還涉及在合適的容器中含有單克隆抗體和蒽環(huán)霉素藥物的偶聯(lián)物的試劑盒。偶聯(lián)物優(yōu)選包括含有酰肼和馬來酰亞胺的接頭。在無菌容器中提供液體，冷凍或凍干形式的單克隆抗體-蒽環(huán)霉素藥物偶聯(lián)物。在對(duì)需要治療的患者施用之前能將單克隆抗體-蒽環(huán)霉素藥物偶聯(lián)物稀釋或重新配制。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，其中通過接頭連接蒽環(huán)霉素藥物和抗體的蒽環(huán)霉素藥物和抗體偶聯(lián)物含有酰肼和馬來酰亞胺，并且其中至少一種免疫調(diào)節(jié)劑進(jìn)一步與抗體偶聯(lián)。然后根據(jù)這里描述的，對(duì)需要治療的患者施用單獨(dú)的偶聯(lián)物或者與其它治療聯(lián)合施用。
不限制本發(fā)明的范圍，通過下面的實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。
實(shí)施例概述根據(jù)最初Nagy等的描述(Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.932464-2469(1996))為基礎(chǔ)，利用改進(jìn)的方法制備2-吡咯啉基-阿霉素。利用公開的方法(Acton等，J.Med.Chem.27638-645(1984))從阿霉素合成嗎啉代-DOX和氰基嗎啉代-DOX。
實(shí)施例12-PDOX的合成2-吡咯啉基-阿霉素(2-PDOX)的合成4-碘代丁醛2-(3-氯丙基)-1，3-二-氧戊環(huán)(1.3mL；10mM)溶解于含有30克碘化鈉(200毫摩爾；20-倍過量)的200毫升丙酮中。將溶液回流24小時(shí)后蒸發(fā)至干。在下面的反應(yīng)中使用粗混合物。阿霉素鹽酸鹽(550毫克，946微摩爾)溶解于6.5毫升的DMF中，并且加入3.86克(19.48毫摩爾，20-倍過量)的4-碘代丁醛，接著加入500微升N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)。五分鐘之后，通過在Waters NovaPakC-18柱子上用梯度洗脫通過反相HPLC將材料純化。梯度是90∶10洗脫劑A至70∶30洗脫劑B，每分鐘75毫升，經(jīng)40分鐘，其中洗脫劑A是0.1％三氟乙酸(TFA)并且洗脫劑B是含有0.1％ TFA的90％乙腈。電子噴射質(zhì)譜證實(shí)產(chǎn)物的身份，M+H+＝596。
實(shí)施例22-PDOX與抗-CD22抗體人源化LL2(hLL2)的偶聯(lián)a)2-PDOX的活化2-PDOX(5.95毫克；1×10-5摩爾)與一摩爾當(dāng)量的商業(yè)上可購得的接頭4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酰肼(M2C2H；Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)(2.88毫克；1×10-5摩爾)在0.5毫升二甲亞砜(DMSO)中混合。反應(yīng)混合物在50-60℃下在減壓下被加熱30分鐘。通過制備RP-HPLC純化期望的產(chǎn)物，使用下面成分構(gòu)成的梯度0.3％乙酸銨和90％乙腈，pH 4.4中0.3％乙酸銨，從大多數(shù)沒有反應(yīng)的2-PDOX(洗脫，早大約0.5分鐘)和從沒有反應(yīng)的M2C2H(更早洗脫)分離期望的產(chǎn)物。通過參考相對(duì)于乙腈/乙酸銨緩沖液中2-PDOX的標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品(496nm)的UV吸收水平估計(jì)回收的量。如果不是立即使用，將馬來酰亞胺活化的2-PDOX冷凍并且凍干。當(dāng)需要與抗體進(jìn)一步反應(yīng)時(shí)，采用最小量的DMSO。
b)hLL2 IgG的還原4℃下用100微升1.8M Tris HCl緩沖液處理1-毫升LL2抗體樣品(8-12mg/mL)，接著用3微升2-巰基乙醇處理。讓還原反應(yīng)進(jìn)行10分鐘，并且通過在含有1mM EDTA作為抗氧化劑的0.1M乙酸鈉，pH 5.5中平衡過的兩個(gè)連續(xù)G-50-80 Sephadex旋轉(zhuǎn)柱純化還原的抗體。通過280nm UV吸光度分析產(chǎn)物，通過Ellman反應(yīng)，在410nm檢測(cè)，測(cè)定每摩爾抗體硫醇基的數(shù)目。這些還原條件導(dǎo)致每個(gè)抗體產(chǎn)生大約8-12個(gè)硫醇基，相應(yīng)于抗體鏈間二硫鍵的完全還原。
c)活化的2-PDOX與還原的hLL2的偶聯(lián)用馬來酰亞胺基活化的2-PDOX處理來自上面b)的硫醇還原的抗體，不用使含水/DMSO混合物中DMSO的最終濃度達(dá)到高于25％。4℃下反應(yīng)15分鐘之后，通過用0.2M乙酸銨，pH 4.4中平衡過的G-50-80旋轉(zhuǎn)柱洗脫，接著通過在相同緩沖液中平衡過的SM-2 Bio-Beads的柱子滲濾，獲得沒有未反應(yīng)馬來酰亞胺基-DOX的期望的產(chǎn)物。通過在280和496nm下通過UV掃描分析產(chǎn)物，從而估計(jì)2-PDOX與mAb的摩爾比。通過MALDI-TOF質(zhì)譜分析測(cè)得2-PDOX與Mab之絕對(duì)比。UV和MS分析都證明在這組反應(yīng)條件下獲得每摩爾hLL2抗體7-8單位的2-PDOX的取代比例。通過大小排阻HPLC(GF-250柱，Bio-Rad，Hercules CA)，流速1毫升/分鐘，0.2M乙酸鹽緩沖液，pH 5.0，使用設(shè)置在496nm的UV檢測(cè)器，基本上所有的檢測(cè)峰在LL2抗體的滯留時(shí)間附近洗脫出來。這表明產(chǎn)物中存在極少游離藥物。2-PDOX-hLL2偶聯(lián)物樣品等份分為單級(jí)分，典型是0.1-1.0mg，冷凍備用，或者將它們凍干。根據(jù)需要，將它們解凍并且重新配制用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例32-PDOX與抗-CD74抗體人源化LL1(hLL1)的偶聯(lián)a)2-PDOX的活化2-PDOX(5.95毫克；1×10-5摩爾)與一摩爾當(dāng)量的商業(yè)上可購得的接頭4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酰肼(M2C2H；Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)(2.88毫克；1×10-5摩爾)在0.5毫升DMSO中混合。反應(yīng)混合物在50-60℃下在減壓下被加熱30分鐘。通過制備RP-HPLC純化期望的產(chǎn)物，使用下面成分構(gòu)成的梯度0.3％乙酸銨和90％乙腈，pH 4.4中0.3％乙酸銨，從大多數(shù)沒有反應(yīng)的2-PDOX(洗脫，早大約0.5分鐘)和從沒有反應(yīng)的M2C2H(更早洗脫)分離期望的產(chǎn)物。通過參考相對(duì)于乙腈/乙酸銨緩沖液中2-PDOX的標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品(496nm)的UV吸收水平估計(jì)回收的量。如果不是立即使用，將馬來酰亞胺活化的2-PDOX冷凍并且凍干。當(dāng)需要與抗體進(jìn)一步反應(yīng)時(shí)，采用最小量的二甲基甲酰胺(DMF)或DMSO。
b)hLL1 IgG的還原4℃下用100微升1.8M Tris HCl緩沖液處理1-毫升hLLl抗體樣品(8-12mg/mL)，接著用3微升2-巰基乙醇處理。讓還原反應(yīng)進(jìn)行10分鐘，并且通過在含有1mM EDTA作為抗氧化劑的0.1M乙酸鈉，pH 5.5中平衡過的兩個(gè)連續(xù)G-50-80Sephadex旋轉(zhuǎn)柱純化還原的抗體。通過280nm UV吸光度分析產(chǎn)物，通過Ellman反應(yīng)，在410nm檢測(cè)，測(cè)定每摩爾抗體硫醇基的數(shù)目。這些還原條件導(dǎo)致每個(gè)抗體產(chǎn)生大約8-10個(gè)硫醇基，相應(yīng)于抗體鏈間二硫鍵的完全還原。
c)活化的2-PDOX與還原的hLL1的偶聯(lián)用來自a)的馬來酰亞基胺活化的2-PDOX處理來自上面b)的硫醇還原的抗體，含水/DMSO混合物中DMSO的最終濃度是15％。4℃下反應(yīng)15分鐘之后，通過用0.2M乙酸銨，pH 4.4中平衡過的G-50-80旋轉(zhuǎn)柱洗脫，接著通過在相同緩沖液中平衡過的SM-2 Bio-Beads的柱子滲濾，獲得沒有未反應(yīng)馬來酰亞胺硫醇-DOX的期望的產(chǎn)物。通過在280和496nm下通過UV掃描分析產(chǎn)物，從而估計(jì)2-PDOX與mAb的摩爾比。通過MALDI-TOF質(zhì)譜分析測(cè)得2-PDOX與Mab之絕對(duì)比。UV和MS分析證明在這組反應(yīng)條件下獲得每摩爾hLL1抗體7-8單位的2-PDOX的取代比例。通過大小排阻HPLC分析(GF-250柱，Bio-Rad，Hercules CA)，流速1毫升/分鐘，0.2M乙酸鹽緩沖液，pH 5.0，使用設(shè)置在496nm的UV檢測(cè)器，基本上一個(gè)檢測(cè)峰在hLL1抗體的滯留時(shí)間附近洗脫出來。這表明產(chǎn)物中存在極少或沒有游離藥物。2-PDOX-hLL1偶聯(lián)物樣品等份分為單一級(jí)分，典型是0.1-1.0mg，冷凍備用，或者將它們凍干。根據(jù)需要，將它們解凍并且重新配制用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例4DOX與抗-CD74抗體hLL1的偶聯(lián)a)DOX的活化DOX(1×10-5摩爾)與一摩爾當(dāng)量的商業(yè)上可購得的接頭4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酰肼(M2C2H；PierceChemical Co.，Rockford，IL)(2.88毫克；1×10-5摩爾)在0.5毫升DMSO中混合。反應(yīng)混合物在50-60℃下被加熱30分鐘。通過制備RP-HPLC純化下面所示期望的中間體，使用下面成分構(gòu)成的梯度0.3％乙酸銨和90％乙腈，pH 4.4中0.3％乙酸銨，從沒有反應(yīng)的DOX(洗脫，早大約0.5分鐘)和從沒有反應(yīng)的M2C2H(更早洗脫)分離期望的產(chǎn)物。
通過參考相對(duì)于乙腈/乙酸銨緩沖液中DOX的標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品(496nm)的UV吸收水平估計(jì)沒有反應(yīng)的DOX的量。如果不是立即使用，將馬來酰亞胺活化的DOX冷凍并且凍干。當(dāng)需要與抗體進(jìn)一步反應(yīng)時(shí)，采用最小量的DMF或DMSO。
b)hLL1 IgG的還原4℃下用100微升1.8M Tris HCl緩沖液處理1-毫升hLL1抗體樣品(10mg/mL)，接著用3微升2-巰基乙醇處理。讓還原反應(yīng)進(jìn)行10分鐘，并且通過在含有1mM EDTA作為抗氧化劑的0.1M乙酸鈉，pH 5.5中平衡過的兩個(gè)連續(xù)G-50-80 Sephadex旋轉(zhuǎn)柱純化還原的抗體。通過280nm UV吸光度分析產(chǎn)物，通過Ellman反應(yīng)，在410nm檢測(cè)，測(cè)定每摩爾抗體硫醇基的數(shù)目。這些還原條件導(dǎo)致每個(gè)抗體產(chǎn)生大約8-10個(gè)硫醇基，相應(yīng)于抗體鏈間二硫鍵的完全還原。
c)活化的DOX與還原的hLL1的偶聯(lián)用來自上面a)的馬來酰亞胺基活化的DOX處理來自上面b)的硫醇還原的抗體，含水/DMSO混合物中DMSO的最終濃度是15％。4℃下反應(yīng)15分鐘之后，通過用0.2M乙酸銨，pH 4.4中平衡過的G-50-80旋轉(zhuǎn)柱洗脫，接著通過在相同緩沖液中平衡過的SM-2 Bio-Beads的柱子滲濾，獲得沒有未反應(yīng)馬來酰亞胺基-DOX的期望的產(chǎn)物。通過在280和496nm下通過UV掃描分析產(chǎn)物，從而估計(jì)DOX與mAb的摩爾比。通過MALDI-TOF質(zhì)譜分析測(cè)得DOX與Mab之絕對(duì)比。UV和MS分析都證明在這組反應(yīng)條件下獲得每摩爾hLL1抗體7-8單位的DOX的取代比例。通過大小排阻HPLC(GF-250柱，Bio-Rad，Hercules CA)，流速1毫升/分鐘，0.2M乙酸鹽緩沖液，pH 5.0，使用設(shè)置在496nm的UV檢測(cè)器，基本上一個(gè)檢測(cè)峰在hLL1抗體的滯留時(shí)間附近洗脫出來。痕跡(見圖1；496nm下的UV檢測(cè)器，設(shè)置檢測(cè)DOX)表明阿霉素-LL1偶聯(lián)物基本上是9分鐘左右滯留時(shí)間的單一峰，沒有聚集的蛋白質(zhì)物質(zhì)或游離DOX(滯留時(shí)間14分鐘左右)。這表明產(chǎn)物中存在極少或沒有游離藥物。DOX-hLL1偶聯(lián)物樣品等份分為單級(jí)分，典型是0.1-1.0mg，冷凍備用，或者將它們凍干。根據(jù)需要，將它們解凍并且重新配制用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例5阿霉素與hLL1的偶聯(lián)和dox-hLL1偶聯(lián)物的配制a)阿霉素與SMCC酰肼反應(yīng)在13毫升1∶2甲醇∶乙醇(無水)中混合90mg的阿霉素(1.56×10-4mol)和60.23mg的SMCC酰肼，并且加入10.4微升三氟乙酸。室溫下避光將混合物攪拌4小時(shí)。然后將反應(yīng)溶液通過0.22微米注射器過濾器過濾到100mL圓底燒瓶中。加入75微升二異丙基乙胺并且在300℃下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)溶劑。殘余物用4×40mL乙腈接著用1×40mL二乙醚研制，并且在高真空下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上干燥成粉末。將粉末再溶解于5mL無水甲醇，再如上所述蒸發(fā)至干，然后在-200℃下貯存直到需要。
b)用二硫蘇糖醇還原h(huán)LL1-IgG在20mL圓底燒瓶中混合8.4mL的hLL1-IgG(10.3mg/mL，5.78×10-7mol)，160微升0.1M磷酸鈉緩沖液，pH 7.5，500微升的0.2M EDTA，pH 7.0，和290微升的去離子水。通過在真空和氬氣氛之間將溶液循環(huán)六次而將混合物去氧。通過通入氬氣10分鐘而將新制備的40mM二硫蘇糖醇(DTT)水溶液(0.015g于2.4mL水中，2.3×10-5摩爾；對(duì)于IgG 40-倍摩爾過量)去氧，并且向去氧hLL1抗體溶液加入640微升的這種DTT水溶液。得到的混合物在37℃下溫育1小時(shí)。通過用去氧10mM PBS/100mM L-組氨酸，pH 7.4緩沖液滲濾(一個(gè)30K過濾器，氬氣下，4℃下)，純化還原的抗體。持續(xù)加入緩沖液，直到總的濾液體積是300mL。還原的hLL1溶液(hLL1-SH)的體積減小到10mL。
c)阿霉素-SMCC與hLL1-SH的偶聯(lián)和偶聯(lián)物的純化活化的阿霉素(1.9mL，2.09×10-5摩爾，對(duì)于IgG 36-倍過量)溶解于二甲亞砜(DMSO)溶液，并且室溫下氬氣下緩慢加入hLL1-SH抗體溶液(40mL)。DMSO的最終濃度是5％。溫和攪拌下讓反應(yīng)在4℃下進(jìn)行40分鐘。將反應(yīng)混合物加載于BioBeadTM(Bio-Rad，RichmondCA)柱(1.5cm直徑×34cm高，用10mM PBS/100mM L-組氨酸，pH 7.4緩沖液平衡過)，并且以2mL/min洗脫。在Amicon過濾裝置中濃縮產(chǎn)物偶聯(lián)物并且在凍干之前配制用于通過0.22微米注射過濾器過濾。
d)偶聯(lián)物配制和凍干向40mL的上面的hLL1-dox溶液加入8mL的0.5M甘露糖醇水溶液和0.48mL的1％吐溫20，得到最終濃度1.64mg/mL hLL1-dox，82.5mM甘露糖醇，和0.01％吐溫20。以1mg和10mg dox-hLL1數(shù)量(分別3和10mL小瓶)凍干樣品，在干冰上冷凍，并且在真空下凍干48小時(shí)。真空封閉小瓶，在-20℃避光密閉貯存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例6抗體的嗎啉代-DOX和氰基嗎啉代-DOX偶聯(lián)物的制備利用Acton等的方法(J.Med.Chem.27-638-645(1984))，通過用2，2′-氧-雙[乙醛]對(duì)阿霉素還原性烷基化來制備嗎啉代-DOX和氰基嗎啉代-DOX。
這些DOX類似物以對(duì)于DOX和2-PDOX類似物如上所述相同的方式與M2C2H偶聯(lián)。氰基嗎啉代-DOX在室溫下在無水甲醇(代替DMSO)中用10％摩爾過量的酰肼偶聯(lián)過夜。去除溶劑，接著通過急驟層析法提供腙。電噴射質(zhì)譜分析M+H m/e 872，M+Na 894；M-H 870。以類似方式，使用1.5當(dāng)量試劑，采用SMCC-酰肼在無水甲醇中反應(yīng)4小時(shí)將嗎啉代-DOX衍生化為它的腙，并且通過急驟層析純化產(chǎn)物。電噴射質(zhì)譜分析M+H m/e 847，M-H m/e 845，M+Cl m/e 881。
如上面實(shí)施例2-4中所述，將抗體的鏈間二硫鍵還原為游離硫醇，產(chǎn)生二硫化物-還原的mAbs，利用實(shí)施例2，3，和4的c)部分中描述的相同的方法制備偶聯(lián)物。制備下面的嗎啉代-DOX和氰基嗎啉代-DOX的mAb偶聯(lián)物嗎啉代-DOX-抗體偶聯(lián)物mRS7偶聯(lián)物藥物與mAb取代之比6.4∶1。
mMN-14偶聯(lián)物藥物與mAb取代之比8.9∶1。
氰基嗎啉代-DOX-抗體偶聯(lián)物mRS7偶聯(lián)物藥物與mAb取代之比5.3∶1。
mMN-14偶聯(lián)物藥物與mAb取代之比7.0∶1。
實(shí)施例7蒽環(huán)霉素-抗體偶聯(lián)物的體外效力從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)獲得RajiB-淋巴瘤細(xì)胞，并且在加有谷氨酰胺，丙酮酸鹽，青霉素和鏈霉素(LifeTechnologies，Grand Island，NY)的含有12.5％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。簡要地說，在24-孔板的孔中，3.75×105個(gè)細(xì)胞與指定濃度的藥物-mAb偶聯(lián)物在1.5mL組織培養(yǎng)基中溫育2天。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有20毫升培養(yǎng)基的T25燒瓶中，并且溫育最多21天，或者直到細(xì)胞擴(kuò)增16-倍。在第0天，第2天，然后每3-5天使用臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。從沒有處理的細(xì)胞的生長速度計(jì)算加倍時(shí)間，從處理的細(xì)胞擴(kuò)增16-倍需要的時(shí)間計(jì)算存活比例，假定處理不影響加倍時(shí)間。能容易檢測(cè)單個(gè)的保留的活細(xì)胞。在1微克/毫升藥物-mAb偶聯(lián)物濃度下，DOX-LL1偶聯(lián)物表現(xiàn)出與DOX-MN-14偶聯(lián)物相比存活細(xì)胞比例的三個(gè)數(shù)量級(jí)的差異。見圖2。
實(shí)施例8用蒽環(huán)霉素-抗體偶聯(lián)物治療帶腫瘤動(dòng)物a)對(duì)實(shí)體腫瘤異種移植模型的治療用DU145人前列腺癌細(xì)胞對(duì)無胸腺裸鼠組皮下注射。大約兩周之后，當(dāng)動(dòng)物體內(nèi)長出可觸摸的前列腺腫瘤異種移植物時(shí)，用單劑量的藥物-抗體偶聯(lián)物2-PDOX-RS7治療一半動(dòng)物，另一半保持未處理(對(duì)照)。圖3說明未處理小鼠中腫瘤異種移植物生長與用2-PDOX-RS7治療的小鼠異種移植物生長。證明用藥物-抗體偶聯(lián)物治療動(dòng)物，在延遲異種移植物生長方面的治療性效果。
b)動(dòng)物模型中全身癌的治療NCr-SCID小鼠，每組10個(gè)動(dòng)物，通過尾靜脈注射對(duì)每個(gè)動(dòng)物靜脈內(nèi)注射2.5×106人Burkitt′s B-細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Raji的懸浮液。五天之后，動(dòng)物未接受處理或者用單劑量的350微克DOX-LL1或150微克2-PDOX-LL1治療。圖4給出試驗(yàn)結(jié)果。沒有接受處理的動(dòng)物由于全身癌癥而癱瘓并且在注射Raji細(xì)胞之后23天左右死亡。用LL1抗體的DOX-和2-PDOX-偶聯(lián)物治療的動(dòng)物存活延長的時(shí)間，相當(dāng)于對(duì)于2-PDOX-LL1-治療的動(dòng)物壽命延長四倍左右，相對(duì)于DOX-LL1治療的動(dòng)物壽命延長甚至更多。
c)動(dòng)物模型中全身癌的治療NCr-SCID小鼠，每組10個(gè)動(dòng)物，通過尾靜脈注射對(duì)每個(gè)動(dòng)物靜脈內(nèi)注射2.5×106人Burkitt′s B-細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Raji的懸浮液。五天之后，動(dòng)物未接受處理或者用單劑量的150微克2-PDOX-LL1或150微克2-PDOX-MN-14(非特異性對(duì)照抗體偶聯(lián)物)治療。圖5給出試驗(yàn)結(jié)果。沒有接受處理的動(dòng)物由于全身癌癥而癱瘓并且在注射Raji細(xì)胞之后23天左右死亡。用2-PDOX-MN-14偶聯(lián)物處理的動(dòng)物也是如此。用2-PDOX-LL1抗體偶聯(lián)物治療的動(dòng)物存活延長的時(shí)間。
從上面的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確認(rèn)本發(fā)明的基本特征，不脫離本發(fā)明的精神和范圍，能對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改變和修飾，使它適合各種應(yīng)用和條件而不用過度的試驗(yàn)。這里引用的所有的專利，專利申請(qǐng)和公開物在此全文引作參考。
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權(quán)利要求
1.蒽環(huán)霉素藥物和抗體的偶聯(lián)物，其中所述蒽環(huán)霉素藥物和所述抗體通過包含酰肼和馬來酰亞胺的接頭連接。
2.權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中所述接頭是4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酰肼。
3.具有下式的權(quán)利要求1的偶聯(lián)物
4.權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中mAb針對(duì)腫瘤-相關(guān)抗原。
5.權(quán)利要求4的偶聯(lián)物，其中內(nèi)化抗體導(dǎo)向于所述腫瘤-相關(guān)抗原。
6.權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中所述偶聯(lián)物導(dǎo)向于癌，肉瘤，淋巴瘤，白血病，神經(jīng)膠質(zhì)瘤或皮膚癌。
7.權(quán)利要求6的偶聯(lián)物，其中所述皮膚癌是黑素瘤。
8.權(quán)利要求4的偶聯(lián)物，其中所述腫瘤-相關(guān)抗原選自CD74，CD22，EPG-1，CEA，結(jié)腸-特異性抗原-p粘蛋白(CSAp)，碳酸酐酶IX，HER-2/neu，CD19，CD20，CD21，CD23，CD25，CD30，CD33，CD40，CD45，CD66，NCA90，NCA95，CD80，甲胎蛋白(AFP)，VEGF，EGF受體，P1GF，MUC1，MUC2，MUC3，MUC4，PSMA，GD2，GD3神經(jīng)節(jié)苷脂，HCG，EGP-2，CD37，HLA-D-DR，CD30，Ia，Ii，A3，A33，Ep-CAM，KS-1，Le(y)，S100，PSA，肌腱蛋白，葉酸受體，Tn和Thomas-Friedenreich抗原，腫瘤壞死抗原，腫瘤血管生成抗原，Ga 733，IL-2，MAGE，和它們的組合。
9.權(quán)利要求8的偶聯(lián)物，其中所述腫瘤-相關(guān)抗原選自CD74，CD19，CD20，CD22，CD33，EPG-1，MUC1，CEA和AFP。
10.權(quán)利要求4的偶聯(lián)物，其中所述腫瘤-相關(guān)抗原包括B-細(xì)胞，T-細(xì)胞，骨髓細(xì)胞的譜系抗原(CDs)，或與血液惡性腫瘤相關(guān)的抗原。
11.權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中所述抗體選自LL1，LL2，L243，C2B8，A20，MN-3，M195，MN-14，-AFP，Mu-9，PAM-4，RS7，RS11和17-1A。
12.權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中所述接頭連接抗體上的還原的二硫鍵。
13.權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中所述蒽環(huán)霉素藥物選自柔紅霉素，阿霉素，表柔比星，2-吡咯啉阿霉素，嗎啉代-阿霉素，和氰基嗎啉代-阿霉素。
14.權(quán)利要求13的偶聯(lián)物，其中所述蒽環(huán)霉素藥物通過13-酮基部分與抗體連接。
15.權(quán)利要求12的偶聯(lián)物，其中所述還原的二硫鍵是抗體上的鏈間二硫鍵。
16.權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中所述抗體是鼠抗體，嵌合抗體，靈長動(dòng)物化抗體，人源化抗體，或人抗體。
17.權(quán)利要求16的偶聯(lián)物，其中所述抗體是IgG的片段。
18.權(quán)利要求16的偶聯(lián)物，其中所述抗體針對(duì)B-細(xì)胞。
19.權(quán)利要求18的偶聯(lián)物，其中所述抗體針對(duì)選自CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD30，CD 37，CD40，CD52，CD74，CD80，和HLA-DR的抗原。
20.權(quán)利要求19的偶聯(lián)物，其中所述抗體是LL1，LL2，L243，C2B8，或hA20。
21.權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中每分子抗體有6-10個(gè)蒽環(huán)霉素藥物分子。
22.權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中抗體-蒽環(huán)霉素偶聯(lián)物內(nèi)化到靶細(xì)胞中。
23.權(quán)利要求22的偶聯(lián)物，其中抗體-蒽環(huán)霉素偶聯(lián)物內(nèi)化到靶細(xì)胞中，并且在細(xì)胞表面上再表達(dá)抗原。
24.權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中抗體總的電荷沒有改變。
25.權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中蒽環(huán)霉素藥物帶有烷基化部分。
26.權(quán)利要求25的偶聯(lián)物，其中烷基化部分是烯胺。
27.權(quán)利要求26的偶聯(lián)物，其中蒽環(huán)霉素藥物是2-吡咯啉基-阿霉素。
28.制備權(quán)利要求1的偶聯(lián)物的方法，其中接頭首先與蒽環(huán)霉素藥物偶聯(lián)，從而產(chǎn)生蒽環(huán)霉素藥物-接頭偶聯(lián)物，并且其中所述蒽環(huán)霉素藥物-接頭偶聯(lián)物接著偶聯(lián)硫醇-還原的單克隆抗體或抗體片段。
29.權(quán)利要求28的方法，其中在與硫醇-還原的單克隆抗體或抗體片段偶聯(lián)之前不純化蒽環(huán)霉素藥物-接頭偶聯(lián)物。
30.制備權(quán)利要求1的偶聯(lián)物的方法，其中蒽環(huán)霉素藥物上第二個(gè)反應(yīng)性官能不受破壞。
31.制備權(quán)利要求1的偶聯(lián)物的方法，其中蒽環(huán)霉素藥物上的烷基化基團(tuán)不受破壞。
32.制備權(quán)利要求1的偶聯(lián)物的方法，其中所述蒽環(huán)霉素藥物是2-吡咯啉基-阿霉素，嗎啉代-阿霉素，或氰基嗎啉代-阿霉素。
33.一種治療哺乳動(dòng)物疾病的方法，包括施用權(quán)利要求1的抗體和蒽環(huán)霉素藥物的偶聯(lián)物。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
35.權(quán)利要求33的方法，其中抗體-藥物偶聯(lián)物是靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，鞘內(nèi)，膀胱內(nèi)或腫瘤內(nèi)給藥。
36.權(quán)利要求33的方法，其中抗體-藥物偶聯(lián)物是作為藥團(tuán)或輸液給藥。
37.權(quán)利要求33的方法，其中抗體-藥物偶聯(lián)物是以反復(fù)和/或周期為基礎(chǔ)給藥。
38.權(quán)利要求33的方法，其中哺乳動(dòng)物患有癌癥。
39.權(quán)利要求33的方法，其中哺乳動(dòng)物患有皮膚癌，頭頸癌，肺癌，乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，子宮內(nèi)膜癌子，宮頸癌，胃癌，結(jié)腸癌，直腸癌，膀胱癌，腦癌，胰腺癌，淋巴系統(tǒng)癌，肉瘤或黑素瘤。
40.權(quán)利要求33的方法，其中哺乳動(dòng)物患有B-或T-細(xì)胞癌。
41.權(quán)利要求40的方法，其中哺乳動(dòng)物患有非何杰金氏淋巴瘤，何杰金氏病，淋巴細(xì)胞白血病，髓細(xì)胞白血病，或多發(fā)性骨髓瘤。
42.權(quán)利要求39的方法，其中哺乳動(dòng)物患有黑素瘤。
43.權(quán)利要求33-42任一項(xiàng)的方法，其中抗體-蒽環(huán)霉素偶聯(lián)物在其他標(biāo)準(zhǔn)治療法之前、同時(shí)或之后施用。
44.權(quán)利要求43任一項(xiàng)的方法，其中所述標(biāo)準(zhǔn)治療法選自放射療法，手術(shù)和化學(xué)療法。
45.一種治療哺乳動(dòng)物疾病的方法，包括施用導(dǎo)向于相同病變細(xì)胞上不同抗原或相同抗原的不同表位的抗體和蒽環(huán)霉素藥物偶聯(lián)物中的兩種或多種。
46.一種治療哺乳動(dòng)物疾病的方法，包括在第二種以抗體為基礎(chǔ)的治療之前、同時(shí)或之后施用抗體和蒽環(huán)霉素藥物的偶聯(lián)物，使得與偶聯(lián)物中的抗體相比，第二抗體為基礎(chǔ)的治療中的第二抗體導(dǎo)向于病變細(xì)胞上的不同抗原或相同抗原的不同表位。
47.權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中所述抗體是單克隆抗體。
48.權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中所述抗體是抗體片段。
49.權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中所述抗體是抗體融合蛋白。
50.權(quán)利要求49的偶聯(lián)物，其中所述抗體融合蛋白是多價(jià)的。
51.權(quán)利要求49的偶聯(lián)物，其中所述抗體融合蛋白是多特異性的。
52.權(quán)利要求49的偶聯(lián)物，其中所述抗體融合蛋白包括兩個(gè)或多個(gè)相同或不同的天然的或合成的抗體，單鏈抗體或具有相同或不同特異性的抗體片段，其中所述抗體或抗體片段選自LL1，LL2，M195，MN-3，RS7，17-1A，RS11，PAM-4，KC4，BrE 3，MN-14，Mu-9，Immu31，CC49，Tn抗體，J591，Le(y)抗體和G250。
53.一種在合適的容器中含有單克隆抗體和蒽環(huán)霉素藥物的偶聯(lián)物的試劑盒，其中所述蒽環(huán)霉素藥物和所述抗體通過包含酰肼和馬來酰亞胺的接頭連接。
54.權(quán)利要求53的試劑盒，其中在無菌容器中提供液體，冷凍或凍干形式的單克隆抗體-蒽環(huán)霉素藥物偶聯(lián)物。
55.權(quán)利要求54的試劑盒，其中單克隆抗體-蒽環(huán)霉素藥物偶聯(lián)物被稀釋或重新配制用于對(duì)患者給藥。
56.權(quán)利要求43的方法，進(jìn)一步包括施用一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑。
57.權(quán)利要求44的方法，進(jìn)一步包括施用一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑。
58.權(quán)利要求45-46任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括施用一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑。
59.權(quán)利要求56的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑選自干擾素，細(xì)胞因子，干細(xì)胞生長因子，集落-刺激因子，淋巴毒素和其他造血因子。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述干擾素是α-干擾素，β-干擾素或γ-干擾素。
61.權(quán)利要求59的方法，其中所述造血因子選自白介素，集落刺激因子，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述白介素選自IL-1，IL-2，IL-3，IL-6，IL-10，IL-12，IL-18，和IL-21。
63.權(quán)利要求59的方法，其中所述造血因子選自紅細(xì)胞生成素，血小板生成素，G-CSF和GM-CSF。
64.權(quán)利要求59的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑或造血因子在免疫偶聯(lián)物治療之前，期間或之后施用。
65.權(quán)利要求59的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑增強(qiáng)所述偶聯(lián)物的效力。
66.權(quán)利要求57的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑選自干擾素，細(xì)胞因子，干細(xì)胞生長因子，集落-刺激因子，淋巴毒素和其他造血因子。
67.權(quán)利要求66的方法，其中所述干擾素是α-干擾素，β-干擾素或γ-干擾素。
68.權(quán)利要求66的方法，其中所述造血因子選自白介素，集落刺激因子，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子。
69.權(quán)利要求68的方法，其中所述白介素選自IL-1，IL-2，IL-3，IL-6，IL-10，IL-12，IL-18，和IL-21。
70.權(quán)利要求66的方法，其中所述造血因子選自紅細(xì)胞生成素，血小板生成素，G-CSF和GM-CSF。
71.權(quán)利要求66的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑或造血因子在免疫偶聯(lián)物治療之前，期間或之后施用。
72.權(quán)利要求66的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑增強(qiáng)所述偶聯(lián)物的效力。
73.權(quán)利要求58的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑選自干擾素，細(xì)胞因子，干細(xì)胞生長因子，集落-刺激因子，淋巴毒素和其他造血因子。
74.權(quán)利要求73的方法，其中所述干擾素是α-干擾素，β-干擾素或γ-干擾素。
75.權(quán)利要求73的方法，其中所述造血因子選自白介素，集落刺激因子，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子。
76.權(quán)利要求75的方法，其中所述白介素選自IL-1，IL-2，IL-3，IL-6，IL-10，IL-12，IL-18，和IL-21。
77.權(quán)利要求73的方法，其中所述造血因子選自紅細(xì)胞生成素，血小板生成素，G-CSF和GM-CSF。
78.權(quán)利要求73的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑或造血因子在免疫偶聯(lián)物治療之前，期間或之后施用。
79.權(quán)利要求73的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑增強(qiáng)所述偶聯(lián)物的效力。
80.一種蒽環(huán)霉素藥物和抗體的偶聯(lián)物，其中所述蒽環(huán)霉素藥物和所述抗體通過包含酰肼和馬來酰亞胺的接頭連接，并且其中免疫調(diào)節(jié)劑進(jìn)一步與所述抗體偶聯(lián)。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有導(dǎo)向于各種抗原能力的治療性偶聯(lián)物。偶聯(lián)物含有導(dǎo)向抗體或其抗原結(jié)合片段和蒽環(huán)霉素化療藥物。靶向抗體和蒽環(huán)霉素化療藥物通過包括酰肼部分的接頭連接。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1764478SQ200480007880
公開日2006年4月26日 申請(qǐng)日期2004年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月24日
發(fā)明者G·L·格里菲思斯 申請(qǐng)人:免疫醫(yī)療公司