專利名稱：生物活性材料與生物適合聚合物中的羧基按1∶1的比例結(jié)合,包括制備方法及相同的藥 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于生物適合聚合物與生物活性分子按1∶1的摩爾比結(jié)合，包括制備方法及相同的藥用成分。尤其是本發(fā)明通過特定的生物適合聚合物與生物活性材料中的羧基按1∶1的摩爾比結(jié)合，包括制備方法及相同的藥用成分。
背景技術(shù)：
將蛋白質(zhì)及肽用作醫(yī)藥產(chǎn)品通常受幾個問題的限制。不如說，肽或蛋白質(zhì)在活的有機(jī)體內(nèi)的吸收率非常低，其原因在于二者在進(jìn)入體內(nèi)很短時間內(nèi)就容易被蛋白酶水解或降解，同時重復(fù)操作時還會引起免疫反應(yīng)。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)或肽藥品每天注射至少一次或多次，頻繁的注射會導(dǎo)致患者的疼痛及危險，長期的注射對患者來說昂貴而且不方便。
需要嘗試研制更穩(wěn)定藥物以解決以上問題，利用生物適合聚合物改良生物活性材料(如蛋白質(zhì)、多肽)的技術(shù)已有所發(fā)展。蛋白質(zhì)或藥用活性分子與生物適合聚合物的結(jié)合，在將其應(yīng)用于生物體內(nèi)外時會體現(xiàn)出很多優(yōu)點。生物活性分子通過共價鍵與生物適合聚合物結(jié)合后，其會顯示出改良的表面性能及溶解性，這會提高其在水及有機(jī)溶劑中的溶解性。此外，生物適合聚合物還會使得與之連接的蛋白質(zhì)或多肽在有機(jī)體內(nèi)更加穩(wěn)定，增加蛋白質(zhì)的生物適合性并降低免疫反應(yīng)，也會降低腸、胃、脾、肝等對蛋白質(zhì)的清除率。
盡管生物活性材料(蛋白質(zhì)或肽)與生物適合聚合物(如PEG)的結(jié)合有許多好處，但所知方法在結(jié)合中存在一些問題。
多數(shù)的結(jié)合方法是將活性PEG鍵合到氨基酸殘基(如賴氨酸)的氨基上。當(dāng)將蛋白質(zhì)表面的活性部位連接到PEG上時，由于很多蛋白質(zhì)的一個或更多游離的賴氨酸殘基頻繁接近活性部位，蛋白質(zhì)-聚合物結(jié)合物的生物活性大大減低了。同時，蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基與活性PEG之間容易發(fā)生反應(yīng)，得到PEG-蛋白質(zhì)結(jié)合物，其中兩個或更多的PEG分子連接到一個蛋白質(zhì)分子之上。舉例來說，當(dāng)超過兩個的PEG分子連接到細(xì)胞因子(如干擾素、CSF及白介素)或多肽(如EGF、hGH、胰島素)表面時，結(jié)合物的生物活性迅速降低而導(dǎo)致失效。同時，此類反應(yīng)會隨機(jī)發(fā)生，從而導(dǎo)致了多種PEG-蛋白質(zhì)結(jié)合物，這使得所需結(jié)合物的提純復(fù)雜且困難。如果太多的聚合物分子連接到目標(biāo)蛋白質(zhì)或肽上，結(jié)合物會失去全部或大部分的生物活性。此外，如果使用了表觀活性連接劑或連接到目標(biāo)蛋白質(zhì)分子的聚合物數(shù)量不足，則結(jié)合物的治療效果降低。
為克服以上問題，已經(jīng)嘗試了采用遺傳工程將聚合物結(jié)合到蛋白質(zhì)的特定部位，以此取代將生物適合聚合物結(jié)合到蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上。然而，此方法通常改變了蛋白質(zhì)的原始性能，同時遺傳工程分子作為醫(yī)用藥物的安全性也有待改進(jìn)。
也曾通過化學(xué)改良生物活性材料結(jié)合聚合物的特定部位來解決問題。美國專利第5951974及5985263號描述了將PEG分子結(jié)合到干擾素的組氨酸殘基上，通過延長藥物在有機(jī)體內(nèi)的半衰期來提高療效。然而，本方法仍然使用了活性氨基，并會隨機(jī)在組氨酸的一些部位上產(chǎn)生PEG-IFN異構(gòu)體，這需要采用離子交換柱進(jìn)行額外的提純步驟，將所需的1∶1結(jié)合物與PEG-IFN分離。此外，較之其他的氨基酸氨基，組氨酸結(jié)合了PEG的咪唑基容易水解，使得組氨酸容易從PEG一組氨酸結(jié)合物中脫離。
美國專利第5766897號描述了大分子與突變體的結(jié)合，其中半胱氨酸殘基連接活性PEG分子。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有一個自由地二硫鍵，或者無剩余的半胱氨酸，所以非活性部位的氨基酸可能會通過突變轉(zhuǎn)變?yōu)榘腚装彼釟埢c聚合物結(jié)合。此方法將聚合物結(jié)合到了生物活性分子的特定部位，盡管具有此優(yōu)點，較之氨基或羧基的結(jié)合物，本方法產(chǎn)品的活性大大降低。
美國專利第5985265號描述了將活性部位在G-CSF和IFN的N端與PEG分子結(jié)合。然而，此類活性聚合物的反應(yīng)性較差，且反應(yīng)需要較長的時間。此外，本反應(yīng)的產(chǎn)率低且蛋白質(zhì)穩(wěn)定性差。如果蛋白質(zhì)的活性部位特別接近N端，則在N端氨基結(jié)合會導(dǎo)致生物活性大大減低或消失。
美國專利第5824778號描述了通過PEG在氨基或羧基結(jié)合G-CSF。加入過量的EDAC活化蛋白質(zhì)中的羧基，將大量的PEG結(jié)合到活性羧基上。得到的PEG-G-CSF確定為不均勻的混合物，其中含有大量結(jié)合的PEG分子，且結(jié)合物的生物活性大大降低。因此，如果在特定比例下，與聚合物連接后的生物活性分子其活性得以保持，并且得到同質(zhì)的特定部位連接體，則此類分子的臨床應(yīng)用性顯著提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明按1∶1的比例制備了PEG-生物活性分子結(jié)合物，其中PEG連接到生物活性分子的羧基上。生物活性分子的羧基較之氨基反應(yīng)性較低。據(jù)觀察，由于本結(jié)合物比天然蛋白質(zhì)(未結(jié)合)具有更長的半衰期及更高的穩(wěn)定性，因此其治療效果要高于天然蛋白質(zhì)20倍。
同時1∶1比例的結(jié)合物性能要優(yōu)于那些大于1∶1比例的結(jié)合物(在羧基或氨基結(jié)合)。
因此，本發(fā)明是關(guān)于生物適合聚合物與生物活性分子的結(jié)合，其中活性生物適合聚合物與生物活性材料中的羧基按1∶1的摩爾比結(jié)合，包括制備方法及相同的藥用成分。本發(fā)明的結(jié)合物保留了生物活性分子的生物活性，并增強(qiáng)了穩(wěn)定性、生物實用性及半衰期。


圖1為mPEG(5K)-H與z-G-CSF通過HPLC及SDS-PAGE的結(jié)合度。
圖2為(20K)-Hz-G-CSF通過HPLC及SDS-PAGE的結(jié)合度。
圖3為1∶1比例的mPEG(5K)-Hz-IFN于SDS-PAGE上。
圖4為相應(yīng)于EDAC添加于SDS-PAGE的量，mPEG(20K)-Hz-IFN結(jié)合物的產(chǎn)率。
圖5為相應(yīng)于EDAC的添加方法及添加于SDS-PAGE的量，mPEG(20K)-Hz-IFN結(jié)合物的反應(yīng)程度。
圖6為通過離子交換柱對mPEG(20K)-Hz-IFN的SDS-PAGE進(jìn)行提純。
圖7為通過細(xì)胞化驗比較mPEG(20K)-Hz-IFN結(jié)合物、天然G-CSF及NeulastaTM(PEG-G-CSF，Amgen研制，2002年FDA通過)的生物活性。
圖8為mPEG(20K)-Hz-IFN結(jié)合物、天然G-CSF及NeulastaTM(PEG-G-CSF，Amgen研制，2002年FDA通過)的血漿半衰期比較。
圖9為mPEG(20K)-Hz-IFN結(jié)合物、天然G-CSF及NeulastaTM(PEG-G-CSF，Amgen研制，2002年FDA通過)的WBC。
圖10為通過細(xì)胞化驗比較mPEG(12K)-Hz-IFN結(jié)合物、天然IFN及PEG-IFN(Schering-Plough研制)的生物活性。
圖11為通過細(xì)胞化驗比較mPEG(20K)-Hz-IFN結(jié)合物、天然IFN的生物活性。
圖12為通過細(xì)胞化驗比較Di-mPEG-Hz-IFN結(jié)合物、兩個PEG分子連接到一個IFN分子、單向mPEG-Hz-IFN、一個PEG分子連接到一個IFN分子的生物活性。
圖13為PEG(20K)-Hz-IFN結(jié)合物、天然IFN及PEG-IFN(Schering-Plough研制)的血漿半衰期比較。
圖14為PEG-IGN連接體于羧基和氨基的穩(wěn)定性比較。
圖15為未通過生物適應(yīng)聚合物改良的天然PTH的HPLC色譜圖。
圖16為提純之前PTH與mPEG(20k)-Hz反應(yīng)混合物(未反應(yīng)的PTH，mPEG(20K)-Hz-PTH，mPEG(20K)-Hz)的HPLC色譜圖。(峰1未反應(yīng)的帶有PEG的PTH，峰2mPEG(20k)-Hz-PTH)。
圖17為PTH與mPEG(20K)-Hz結(jié)合后經(jīng)提純的mPEG(20k0)-Hz-PTH的HPLC色譜圖。
圖18為SDS-PAGE，以庫馬西藍(lán)染色作，PTH與mPEG(20k)-Hz的反應(yīng)產(chǎn)物(線1M標(biāo)志，線2PTH，線3PTH，提純前的PTH-mPEG(20k)-Hz結(jié)合物，線4提純后的PTH-mPEG(20k)-Hz結(jié)合物)。
圖19為PTH和PEG-PTH的有機(jī)體內(nèi)生物活性。
圖20為老鼠體內(nèi)PTH和PEG-PTH的半衰期。
具體實施例方式
一方面，本發(fā)明是關(guān)于生物適合聚合物與生物活性分子的結(jié)合，其中活性生物適合聚合物與生物活性材料中的羧基按1∶1的摩爾比結(jié)合。
另一方面，本發(fā)明涉及藥用組成，包括具有治療效果的以上生物適合聚合物-生物活性分子結(jié)合物，以及藥用上可接受的載體。
進(jìn)一步說，本發(fā)明涉及生物適合聚合物與生物活性分子的按1∶1的摩爾比結(jié)合的制備方法，其中活性生物適合聚合物與生物活性材料中的羧基按結(jié)合，包括將生物活性材料結(jié)合到生物適合聚合物上的步驟，其在反應(yīng)條件下逐步添加結(jié)合劑，生物活性材料與生物適合聚合物的摩爾比為1∶1-1∶20，與結(jié)合劑的摩爾比為1∶1-1∶50，PH值2-5。
在上述方法中，EDAC作為結(jié)合劑加入，其在水溶液中易于水解，所以應(yīng)不少于5次逐步加入(最適宜的為5或6次)。
上述方法為生物適合聚合物與生物活性分子的按1∶1的摩爾比結(jié)合。換句話說，本發(fā)明通過生物適合聚合物與生物活性材料的按1∶1的摩爾比結(jié)合，進(jìn)行特定部位結(jié)合。由于阻止了聚合物結(jié)合到活性部位上，所以此類結(jié)合物保持了生物活性材料的生物活性。同時，本發(fā)明通過1∶1摩爾比的結(jié)合，避免了許多活性殘基的隨機(jī)反應(yīng)，從而不會出現(xiàn)各種異質(zhì)的混合物。此外，此類結(jié)合物還有其他優(yōu)點比如提高了有機(jī)體內(nèi)穩(wěn)定性、提高了生物活性、通過生物適應(yīng)聚合物延長了半衰期。因此，與其他方法相比較，本發(fā)明的同質(zhì)生物適合聚合物-生物活性分子結(jié)合物省時且節(jié)約成本。
WO92/16555描述了卵清蛋白于羧基或醣基處與PEG-酰肼(包含氨基酸間隔區(qū))的反應(yīng)。然而，其只描述了PEG分子的結(jié)合，沒有提及按1∶1的摩爾比將生物適合聚合物與生物活性材料的結(jié)合的制備方法，也未提及結(jié)合物的生物活性。
此外，美國專利第5824779號描述了將PEG連接至G-CSF的羧基上，但按此方法制備的結(jié)合物活性很低，原因在于幾個PEG分子隨機(jī)地連接在G-CSF的天冬酰胺酸或谷氨酸上。
對于特定連接或者根據(jù)反應(yīng)中氨基酸的Pka值的差值確定的連接聚合物的數(shù)量，控制反應(yīng)條件時存在一些問題。
當(dāng)在PH值7-8范圍進(jìn)行賴氨酸氨基反應(yīng)時，組氨酸也隨機(jī)反應(yīng)。同時，當(dāng)PH值低于6-6.5時，組氨酸較之賴氨酸更易與PEG反應(yīng)(美國專利第5951974及5985263號)。根據(jù)以上方法，在PH值小于等于3、摩爾比1∶1條件下，PEG可以連接至羧基，尤其是生物活性材料的C端。
因此，本發(fā)明是涉及生物適合聚合物與生物活性分子的結(jié)合，其中活性生物適合聚合物按1∶1的摩爾比與生物活性材料中的C端結(jié)合。
另一方面，本發(fā)明涉及藥用組成，包括藥用上可接受的結(jié)合物數(shù)量，，其中活性生物適合聚合物按1∶1的摩爾比與生物活性材料中的C端結(jié)合，以及藥用上可接受的載體。
進(jìn)一步說，本發(fā)明涉及在生物活性材料的C端，將生物適合聚合物與生物活性材料按1∶1的摩爾比結(jié)合的制備方法，其中活性生物適合聚合物與生物活性材料中的羧基按結(jié)合，包括將生物活性材料結(jié)合到生物適合聚合物上的步驟，其在反應(yīng)條件下逐步添加結(jié)合劑，生物活性材料與生物適合聚合物的摩爾比為1∶1-1∶20，與結(jié)合劑的摩爾比為1∶1-1∶50，PH值2-5。
生物適合聚合物用于生物活性分子結(jié)合的結(jié)合材料一詞，其意義為任意可以與生物活性分子連接的生物適合聚合物，如天然或合成的聚合物。
生物適合性是指與活體組織或系統(tǒng)相適合，在體內(nèi)無毒、不發(fā)炎、不引起免疫反應(yīng)以及無致癌作用。
生物適合聚合物與生物活性材料相結(jié)合，本發(fā)明采用的聚合物易溶于各種溶劑，分子量約為300-100000Da(更適宜的重量為2000-40000Da)，生物適合聚合物包括以下列舉這些，但并不局限于此聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚氧乙烯(POE)、聚對苯二酚乙二醇、聚交酯酸及其衍生物、聚丙稀酸及其衍生物、聚氨酸、聚乙烯醇、聚亞胺酯、多磷酯、聚乙烯、聚亞烷基氧化物(PAO)、多聚糖、右旋糖酐、聚乙烯吡咯啉、聚丙烯酰胺、共聚物及其他非免疫原聚合物。
本發(fā)明采用的生物適合聚合物不僅包括線性聚合物，還包括以下聚合物可溶性的、非抗原性聚合物，其連接在活性功能基上，這樣可通過脂肪族連接殘基進(jìn)行親核取代(美國專利第5643575、5994455號)。此外還有多支臂、單功能、水解穩(wěn)定性聚合物，其具有兩個連接片斷(中心碳原子周圍具有聚合物支臂)；一個可活化的殘基以連接到生物活性材料上，如蛋白質(zhì)；以及支鏈，其可以是氫、甲基或者其他連接片斷美國專利第5932462號)。本發(fā)明使用的生物適合聚合物還可以是有支臂的PEG，其中的功能基可通過帶有殘基的連接支臂與生物活性材料相結(jié)合(WO00/33881)。
其中，PEG是本發(fā)明中最普通的生物適合聚合物。通常，PEG是一種無毒、親水性的聚合物，帶有重復(fù)單元HO-(CH2CH2O)n-H。各種蛋白質(zhì)與PEG結(jié)合后可以在血漿中延長半衰期，提高穩(wěn)定性，降低免疫原性。
連接到生物活性材料(蛋白質(zhì)、肽)上的PEG分子量范圍約為1000-100000Da，超過1000Da的PEG的毒性很低。1000-6000Da范圍的PEG分布于整個體內(nèi)并于腎中清除。40000Da的支臂PEG分布于血液或器官內(nèi)，包括肝臟，并于肝臟內(nèi)產(chǎn)生代謝變化。
由于各種分子量范圍的PEG都購買得到，所以其是最合適的生物適合聚合物。每一個氧乙烯基單元都具有親水性，可以結(jié)合2-3個水分子。PEG從甲氧基聚氧乙烯(易于合成)中衍生出一端功能基，PEG不易發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)，其相關(guān)技術(shù)已得到較大發(fā)展。
生物活性材料生物活性分子是指所有可以與生物適合聚合物結(jié)合的親核試劑，且結(jié)合之后至少會保持一定的生物活性。此處提到的生物活性不局限于生理或藥用上活性。舉例來說，一些含酶類的親核試劑，其結(jié)合物可在有機(jī)溶劑中催化反應(yīng)。相似地，一些包含蛋白質(zhì)的聚合物結(jié)合物，如刀豆球蛋白或免疫球蛋白，可以于實驗室內(nèi)用作診斷之用。通常，生物活性分子可以通過重組或化學(xué)法從天然或合成的材料中分離，包括蛋白質(zhì)、肽、多肽、酶、生物藥劑、基因、質(zhì)?；蛴袡C(jī)殘基。
包括蛋白質(zhì)、肽、多肽但不僅僅局限于此血紅蛋白、血清蛋白(如含有因子VII、VIII及IX的血液因子)、免疫球蛋白、細(xì)胞活素(如白介素)、α-、(β-γ-干擾素、集落刺激因子包括G-CSF和GM-CSF、血小板來自生長因子(PDGF)、磷脂酶激活蛋白(PLAP)，以及甲狀腺激素(PTH)。其他基因生物或藥用蛋白質(zhì)包括胰島素、植物蛋白(如凝集素及蓖麻毒蛋白)、腫瘤壞死因子(TNF)及相關(guān)的等位基因、成長因子(如組織成長因子TGF、TGFβ和表皮成長因子)、激素類(如濾泡刺激激素、甲狀腺刺激激素、抗利尿激素、色素激素、黃體激素-釋放激素及其衍生物)、降鈣素、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、人造腦啡肽、生長調(diào)節(jié)素、紅細(xì)胞生成素、下丘腦釋放因子、促乳素、促性腺激素、纖溶酶原激活物、肽釋放生長因子(GHRP)、胸腺體液因子(THF)，諸如此類。免疫球蛋白類包括IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及其片斷。
當(dāng)兩個或更多生物適合聚合物連接到低分子量多肽(如干擾素、G-CSF)時，此結(jié)合物的生物活性相當(dāng)?shù)?。此外，?dāng)相對高反應(yīng)性的氨基連接兩個或更多生物適合聚合物時，在1∶1化合物中分離結(jié)合物并不容易。然而，本發(fā)明提供了1∶1化合物中生物適合聚合物-IFN或生物適合聚合物-G-CSF的選擇性制備，其中此類結(jié)合物生物活性高，半衰期延長，生物利用率優(yōu)異。
本發(fā)明的生物活性材料還包括任意經(jīng)證實具有生物活性的多肽。這包括氨基酸族，抗致敏低聚物，抗體片斷，線性抗原(參閱美國專利4946778)，結(jié)合分子包括抗體或片斷的融合，多株抗體，單株抗體，催化抗體，核苷酸，寡核苷酸等。
生物活性材料也包括酶類。酶類包括碳水化合物酶、蛋白水解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶及連接酶；未限定的特殊酶包括天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脫氨酶、腺苷脫氨酶、過氧化岐化酶、內(nèi)毒素酶、過氧化氫酶、糜蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、腺苷二磷酸酶、酪氨酸酶及膽紅素氧化酶等；碳水化合物酶包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖苷酶、牛乳糖苷酶、葡糖腦苷脂、葡萄木二糖酶等。
上述例子是本發(fā)明中適合與生物適合聚合物結(jié)合的生物活性親核試劑。即使以上并未提到，所有帶有親核基的適宜生物活性材料均包含于本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明所用生物活性材料要求至少有一個羧基，使得其與聚合物結(jié)合。
本發(fā)明的結(jié)合物具有生物活性，并以醫(yī)藥應(yīng)用為目的。包含生物活性材料的聚合物結(jié)合物，其有效醫(yī)用劑量可通過哺乳動物進(jìn)行測試。
生物適合聚合物-生物活性材料結(jié)合物的制備為將生物適合聚合物與生物活性分子結(jié)合，聚合物的一個端基需轉(zhuǎn)化成反應(yīng)性功能基。此過程稱為活化，其產(chǎn)物稱作活化聚合物。舉例來說，將聚乙烯(烯化氧化物，PAO)與肽或蛋白質(zhì)結(jié)合，可將其一個羥基轉(zhuǎn)化為反應(yīng)功能基(如碳化)，由此得到室溫下可溶的活化PAO。此基團(tuán)包括單取代的聚乙烯(烯化氧化物)衍生物，如mPEG，或者其他合適的、含有Cl 4端基烷基取代PAO。
此處所用的反應(yīng)功能基指的是活化生物適合聚合物，使之與生物活性材料相連接的基團(tuán)或殘基。
本發(fā)明的反應(yīng)功能基，從可以與羧酸反應(yīng)的功能基和反應(yīng)性羰基中選擇。舉例來說，首選胺或者肼及酰肼功能基(如?；ｋ?、卡巴肼、氨基脲、硫卡巴腙等)。
此處提到的“羧基結(jié)合劑”(以下稱為結(jié)合劑)，指的是可以將生物活性材料中的羧基與生物適合聚合物(已經(jīng)過活化處理)結(jié)合的任何試劑。
本發(fā)明所用結(jié)合劑包括如下幾種，但并不局限于此EDAC[N-(3-二甲基-氨丙基)-N’-乙烷基碳二亞胺氫氯]、DIC[1，3-二異丙基碳二亞胺]、DCC[雙環(huán)己基碳二亞胺]及EDC[1-乙烷基-3-(3-二甲氨基丙烷基)-碳二亞胺]，最適宜的結(jié)合劑為EDAC。
本發(fā)明結(jié)合物的制備方法包括以下步驟含有親核試劑的生物活性分子與活化的生物適合聚合物發(fā)生取代反應(yīng)，并且足夠的結(jié)合物至少保持一部分生物活性分子內(nèi)在的生物活性。
生物活性材料與過量的生物適合聚合物反應(yīng)，以此制得1∶1比例的生物活性材料-生物適合聚合物結(jié)合物。舉例來說，在制備蛋白質(zhì)-聚合物、肽-聚合物、酶-聚合物、抗體-聚合物以及藥物-聚合物過程中，生物活性材料與生物適合聚合物比例控制在1∶1-1∶20，更適宜的比例為1∶1-1∶10。用以活化生物活性材料羧基的試劑可作如下選擇，但并不局限于此。例如EDAC([N-(3-二甲基-氨丙基)-N’-乙烷基碳二亞胺氫氯])；水溶性碳二亞胺基，如3-[2-嗎啉基-(4)-乙烷基]；5-異唑鹽，如p-甲苯磺酸鹽，伍德沃試劑K。
本發(fā)明中生物活性材料與EDAC的摩爾比控制在1∶1-1∶50，更適宜的比例為1∶1-1∶30，最適宜的比例為1∶1-1∶20。然而，當(dāng)EDAC分不少于5次逐步加入(最適宜的為5或6次)加入，而不是20倍摩爾一次加入時，PEG-生物活性材料結(jié)合物的產(chǎn)量提高，其原因在于EDAC在水溶液中容易發(fā)生水解。
生物活性材料與活化聚合物的結(jié)合反應(yīng)依賴與水溶液(起緩沖作用)的PH值。通常，蛋白質(zhì)/多肽的反應(yīng)緩沖PH值為2-5，更適宜的范圍為2.5-4.5。本發(fā)明得到了此類物質(zhì)穩(wěn)定的最佳反應(yīng)條件及產(chǎn)量結(jié)合反應(yīng)的最佳溫度范圍為0-60℃，更適宜的范圍4-30℃。溶劑的溫度不應(yīng)超過蛋白質(zhì)或多肽的變性溫度。同時，適宜的反應(yīng)時間為10min-5h，制得的結(jié)合物可以通過柱層析或滲濾(或二者結(jié)合)恢復(fù)或提純。
藥用合成本發(fā)明還涉及藥用合成，包括活化生物適合聚合物-生物活性材料結(jié)合物作為活性成分的有效劑量。
“藥用可接受性”指的是人服用后不會導(dǎo)致過敏或相似的反應(yīng)。
生物適合聚合物-生物活性材料結(jié)合物作為藥用合成的成分可以單獨，或者與藥用可接受的載體復(fù)合，以此用作疾病預(yù)防及治療。
藥用可接受的載體指的是藥用可接受的分子、成分或介質(zhì)，如溶液、稀釋液、賦形劑或溶劑等，利用其將生物活性材料在器官或組織之間傳輸。
本發(fā)明的藥用組成可通過如下路線執(zhí)行口服、局部注射、注射，其配方包括生物適合聚合物-生物活性材料結(jié)合物作為活性成分的有效劑量。本發(fā)明用于口服的配方包括藥丸、藥片、包衣片劑、顆粒、包藥干糊片、酏劑、硬質(zhì)及軟質(zhì)膠囊、溶液、糖漿、乳劑、懸浮液或噴霧等；注射用配方包括注射液、微膠囊及其他。
可利用靜止性的無機(jī)或有機(jī)添加劑，根據(jù)已知的方法確定藥用配方。舉例來說，乳糖、玉米淀粉及其衍生物、滑石、硬脂酸及硬脂酸鹽可用于制備藥丸、藥片及硬質(zhì)膠囊；軟質(zhì)膠囊及栓劑的添加劑可以使用油、蠟、半固態(tài)或液態(tài)的多元醇、天然或固態(tài)油；溶液及糖漿劑的添加劑可使用水、蔗糖、轉(zhuǎn)化酶、葡萄糖及多元醇；注射用溶液的添加劑可使用水、乙醇、甘油、多元醇、植物油等。注射用溶液可用作防腐劑、止痛劑、增溶劑及穩(wěn)定劑的組合。局部用配方也可用作麻醉劑、稀釋液、潤滑劑及防腐劑的組合。微膠囊或移植術(shù)的添加劑可以使用共聚物、羧基乙酸或乳酸。
本發(fā)明中生物適合聚合物-生物活性材料結(jié)合物的劑量隨以下因素變化，生物活性材料的吸收率、溶解度、患者年齡、性別、環(huán)境及疾病程度等。
本發(fā)明中生物適合聚合物-生物活性材料結(jié)合物的注射間隔從每天一次、兩天一次至每周、兩周一次遞減。因此，藥品的毒性及影響檢測頻率也相應(yīng)降低。
通過以下的例子對本發(fā)明進(jìn)行深入的闡述及論證。單獨列出的例子用以說明而不是局限本發(fā)明，其中有很多沒有背離本發(fā)明的精神及范圍的變化。
1.通過生物活性材料的羧基制備生物適合聚合物-生物活性材料結(jié)合物例1制備mPEG(12000)-Hz-G-CSF結(jié)合物1mgG-CSF溶液(0.00005mmol，Dong-A Pharm.LEUCOSTIM)，以50mM的MES緩沖溶液(PH3.0)透析(Centricon-10，Amicon，USA)處理，使得最終濃度達(dá)到2mg/ml。對此蛋白質(zhì)溶液，加入6.6mg的mPEG(12000)-Hz(ISU Chemical，Korea，0.0005mmol)。接下來將2mgEDAC溶解于20μl的d-H20中配制2μl EDAC溶液(0.001mmol，20倍摩爾過量)。反應(yīng)在室溫(20-25℃)攪拌條件下進(jìn)行1h。1h后，通過清除柱或離子交換柱除去未反應(yīng)的G-CSF及過量的試劑，得到0.3mg以上的mPEG(12000)-Hz-G-CSF結(jié)合物。改變EDAC用量從20-200倍摩爾過量，mPEG(12000)用量從10-20倍摩爾過量，重復(fù)進(jìn)行實驗。當(dāng)EDAC用量超過50倍摩爾過量時，可觀察到兩個或更多mPEG(12000)-Hz連接到G-CSF上。
例2制備mPEG(5000)-Hz-G-CSF結(jié)合物1mgG-CSF溶液(0.00005mmol，)，以50mM的MES緩沖溶液(PH3.0)透析(Centricon-10，Amicon，USA)處理，使得最終濃度達(dá)到5mg/ml。對此蛋白質(zhì)溶液，加入1.3mg的mPEG(5000)-Hz(ISU Chemical，Korea，0.00025mmol)。接下來將2mgEDAC溶解于20μl的d-H2O中配制2μl EDAC溶液(0.001mmol，20倍摩爾過量)。反應(yīng)在室溫(20-25℃)攪拌條件下進(jìn)行1h。1h后，通過清除柱或離子交換柱除去未反應(yīng)的G-CSF及過量的試劑，得到0.3mg以上的mPEG(5000)-Hz-G-CSF結(jié)合物。圖1為通過SDS-PAG所制mPEGE(5000)-Hz-G-CSF結(jié)合物產(chǎn)品及HPLC剖面圖(排阻色譜法)。
例3制備mPEG(20000)-Hz-G-CSF結(jié)合物1mgG-CSF溶液(0.00005mmol，)，以50mM的MES緩沖溶液(PH3.0)透析(Centricon-10，Amicon，USA)處理，使得最終濃度達(dá)到5mg/ml。對此蛋白質(zhì)溶液，加入5mg的mPEG(20000)-Hz(ISU Chemical，Korea，0.00025mmol)。接下來將2mgEDAC溶解于20μl的d-H20中配制2μl EDAC溶液(0.001mmol，20倍摩爾過量)。反應(yīng)在室溫(20-25℃)攪拌條件下進(jìn)行1h。1h后，通過清除柱或離子交換柱除去未反應(yīng)的G-CSF及過量的試劑，得到0.3mg以上的mPEG(20000)-Hz-G-CSF結(jié)合物。圖2為通過SDS-PAGE所制mPEG(20000)-Hz-G-CSF結(jié)合物產(chǎn)品圖(排阻色譜法)。
例4制備mPEG(5000)-Hz-IFN結(jié)合物四只試管分別盛有200ugIFN溶液(0.00001mmol，Korea Green Cross Corp.，Green Alpha)，分別以50mM的MES緩沖溶液(PH3.0)透析(Centricon-10，Amicon，USA)處理，使得最終濃度達(dá)到1mg/ml。對每只試管，加入2.16mg的mPEG(5000)-Hz。接下來將2mgEDAC溶解于20μl的d-H2O中配制0.8μl EDAC溶液(0.001mmol，40倍摩爾過量)。反應(yīng)在室溫(20-25℃)攪拌條件下進(jìn)行1h。1h后，通過清除柱或離子交換柱除去未反應(yīng)的IFN及過量的試劑。圖3為通過SDS-PAGE所制mPEG(5000)-Hz-IFN結(jié)合物圖。
例5制備mPEG(12000)-Hz-IFN結(jié)合物1mgIFN溶液(0.00005mmol，)，以50mM的MES緩沖溶液(PH3.0)透析(Centricon-10，Amicon，USA)處理，使得最終濃度達(dá)到1mg/ml。對此蛋白質(zhì)溶液，加入6.6mg的mPEG(12000)-Hz(0.0005mmol)。接下來將2mgEDAC溶解于20μl的d-H2O中配制2μl EDAC溶液(0.001mmol，20倍摩爾過量)。反應(yīng)在室溫(20-25℃)攪拌條件下進(jìn)行1h。1h后，通過清除柱或離子交換柱除去未反應(yīng)的IFN及過量的試劑，得到0.3mg以上的mPEG(12000)-Hz-IFN結(jié)合物。
例6制備mPEG(20000)-Hz-IFN結(jié)合物四只試管分別盛有200ugIFN溶液(0.00001mmol)，分別以50mM的MES緩沖溶液(PH3.0)透析(Centricon-10，Amicon，USA)處理，使得最終濃度達(dá)到2mg/ml。對每只試管，加入4.32mg的mPEG(20000)-Hz(0.0002mmol，ISU Chemical，Korea)。接下來將2mgEDAC溶解于20μl的d-H20中配制1μl(50倍摩爾過量)或4μl EDAC溶液(200倍摩爾過量)。此外，加入50倍摩爾過量得硫代NHS以加速反應(yīng)并比較結(jié)果。反應(yīng)在室溫(20-25℃)攪拌條件下進(jìn)行1h。每組樣品的反應(yīng)條件如下表所示。1h后，通過清除柱或離子交換柱除去未反應(yīng)的IFN及過量的試劑。每組反應(yīng)的產(chǎn)量通過SDS-PAGE比較。

作為結(jié)果，對于200倍摩爾過量EDAC的反應(yīng)，有著太多的PEG連接到IFN的羧基上，從而使得1∶1摩爾比例PEG-IFN結(jié)合物的分離不成功，而且PEG的連接數(shù)量也不好估計。對于50倍摩爾過量EDAC的反應(yīng)，1∶1摩爾比例PEG-IFN結(jié)合物由于其在SDS-PAGE上過于分散而不易區(qū)別，造成此現(xiàn)象的原因在于EDAC用量過大。硫代NHS的加入加強(qiáng)了反應(yīng)效率，但與不加硫代NHS(圖4)在反應(yīng)控制上并無區(qū)別。
此外，下表列出了反應(yīng)效率與EDAC添加次數(shù)的關(guān)系

作為結(jié)果，EDAC逐步加入到反應(yīng)體系中時，1∶1摩爾比例mPEG-IFN結(jié)合物的產(chǎn)量較高(圖5)。當(dāng)EDAC加入量超過50倍摩爾過量時，即使逐步加入EDAC也會有兩個或更多的PEG隨機(jī)連接到IFN上(如圖5所示)。
例7制備mPEG(20000)-Hz-IFN結(jié)合物1mgIFN溶液(0.00005mmol，)，以50mM的MES緩沖溶液(PH2.5)透析(Centricon-10，Amicon，USA)處理，使得最終濃度達(dá)到5mg/ml。對此蛋白質(zhì)溶液，加入10.8mg的mPEG(20000)-Hz(0.0005mmo，10倍摩爾過量)。接下來將2mgEDAC溶解于20μl的d-H20中配制2μl EDAC溶液(0.001mmol，20倍摩爾過量)。反應(yīng)在室溫(20-25℃)攪拌條件下進(jìn)行1h。1h后，通過清除柱或離子交換柱除去未反應(yīng)的IFN及過量的試劑，得到0.3mg以上的mPEG(20000)-Hz-IFN結(jié)合物。
例81∶1摩爾比例mPEG(20000)-Hz-IFN結(jié)合物的提純將mPEG(20000)-Hz-IFN結(jié)合物(例6)以10mM醋酸鈉緩沖溶液(PH4.4)稀釋至1mg/ml，然后將mPEG(20000)-Hz-IFN反應(yīng)混合物置于SP-凝膠快速流動柱(5×50mm，總?cè)莘e1ml)中，此設(shè)備使用前已利用醋酸鈉緩沖溶液(PH4.4)平衡處理過。用3倍柱體積的緩沖溶液清洗過后，使用含有500mM NaCl的10mM醋酸鈉緩沖溶液(PH4.4)，將1∶1摩爾比例的mPEG(20000)-Hz-IFN從未反應(yīng)的IFN中分離出來。以上提純的mPEG(20000)-Hz-IFN經(jīng)證實為結(jié)合物，其中一個PEG連接到了IFN的羧基上(圖6)。
例9PEG-G-CSF結(jié)合物生物活性的測定，CPE化驗按下列步驟進(jìn)行于60mm的盤(RPMI-1640介質(zhì)，10％ FBS，37℃，5％ CO2)上培養(yǎng)2.5×106的M-NFS-60細(xì)胞(5×105細(xì)胞/ml)。每一份天然的G-CSF及mPEG(20000)-Hz-G-CSF(例3)均稀釋至1mg/ml，然后加入到96個盤中(每個1×104細(xì)胞)，并連續(xù)稀釋。盤子在37℃下培養(yǎng)2天，接著每一個均用50XTT裝備(Roche，德國)處理，并于37℃再處理4h；利用ELISA讀數(shù)器在490nm處讀出盤子的O.D.值。
作為結(jié)果，本發(fā)明的mPEG(20000)-Hz-G-CSF保持了與mPEG(20000)-G-CSF結(jié)合物相似的活性，其中連接到G-CSF的氨基上(圖7)。
例10PEG-G-CSF結(jié)合物半衰期的測定利用克他命/Rumpun將7周大、重220-240克的Sprague-Dawley鼠(每組5只)麻醉，并通過手術(shù)將PE管插入每只鼠的腔靜脈中。待鼠恢復(fù)后，利用靜脈注射將100ug/kg的mPEG(20000)-Hz-G-CSF(例3)注入。作為對比，PBS和100μg/kg的天然G-CSF用作安慰劑及控制劑。
注射后0、0.5、1、2、4、6、12、24、48h的時間間隔內(nèi)，利用插管抽取300μl的血液。通過離心過濾(13000rpm，10min，4℃)分離血清并于零下20℃貯存以做進(jìn)一步的研究。
細(xì)胞在G-CSF介質(zhì)培養(yǎng)24小時后，96盤中的每一個都添加1.5×104細(xì)胞。每一個按上述方法貯存的血清樣品均稀釋100次，并將50μl的稀釋樣品加入到每一個盤中。將這些盤在CO2氣氛下于37℃培養(yǎng)48h，然后每一個均用50XTT裝備(Roche，德國)處理，并于37℃再處理4h；利用ELESA讀數(shù)器在490nm處讀出盤子的O.D.值。
圖8對(20000)-Hz-G-CSF(例3)與天然G-CSF及NeulastaTM(PEG連接到G-CSF的N端)的半衰期進(jìn)行了比較。本發(fā)明的mPEG(20000)-Hz-G-CSF(例3)較之天然G-CSF具有更長的半衰期，與NeulastaTM的半衰期相近。
例11PEG-G-CSF處理小鼠的白細(xì)胞(WBC)測定從查爾斯河公司(Atsugi，日本)購買7周大、重220-240克的Sprague-Dawley鼠，并將100ug/kg的mPEG(20000)-Hz-G-CSF(例3)注射到小鼠的尾部靜脈中。
將相同數(shù)量的天然G-CSF及鹽溶液作為控制劑，分別注入。注射后0、6、12、24、48、72、96h的時間間隔內(nèi)抽取血液樣本。WBC數(shù)量利用圖9所示的自動血液分析儀(Cysmex K-4500)進(jìn)行測量。結(jié)果顯示，本發(fā)明的mPEG(20000)-Hz-G-CSF較之天然G-CSF及NeulastaTM均具有更高的WBC數(shù)量。
例12PEG-IFN結(jié)合物生物活性的測定利用血球計將MDBK細(xì)胞計算在7.5×105細(xì)胞/ml濃度內(nèi)，并將其置于5％的FBS/MEM介質(zhì)內(nèi)。將mPEG(12000)-Hz-IFN(例5)稀釋至濃度為100IU(1mg/ml＝2×108IU)。每個盤中加入100μl 5％的FBS/MEM介質(zhì)以及100μl的稀釋樣品，并且連續(xù)稀釋。然后向96個盤的每一個中均加入100μl細(xì)胞懸浮液，于37℃培養(yǎng)20h；向每個盤中加入100μl稀釋100倍的水泡性口炎病毒(VSV，ATCC VR-158)于37℃培養(yǎng)20h。除去96個盤中含有VSV的培養(yǎng)基溶液，向每個盤中加入50μl 0.05％結(jié)晶紫染料溶液，利用ELISA讀數(shù)器在550nm處讀出每個盤子的O.D.值，以此來確定IFN的活性。結(jié)果顯示，mPEG(12000)-Hz-IFN(例5)保持了天然IFN 40-50％的活性，與PEG-IFN(Schering-Plough，USA，PEG連接到IFN的氨基上，F(xiàn)DA通過)具有相近的活性。(圖10)同時，經(jīng)測定，mPEG(20000)-Hz-IFN(例6)的活性大約為天然IFN的40％(圖11)。
此外，利用CPE化驗，對Di-mPEG-Hz-IFN(兩個PEG連接到一個IFN上)與單向-PEG-IFN(1∶1化合，兩個PEG連接到一個IFN上)的活性進(jìn)行了比較，結(jié)果單向-PEG-IFN顯示出高生物活性(圖12)。
例13PEG-IFN結(jié)合物半衰期的測定將MDBK細(xì)胞計算在7.5×105細(xì)胞/m濃度內(nèi)，并將其置于5％的FBS/MEM介質(zhì)內(nèi)。向96個盤的每一個中均加入100μl細(xì)胞懸浮液；通過靜脈注射將mPEG(20000)-Hz-IFN(例6)注入小鼠體內(nèi)，其后得到血清并稀釋50倍。向每個盤中加入稀釋的血清，在CO2培養(yǎng)器中培養(yǎng)20h。
每個盤中加入稀釋100倍的水泡性口炎病毒(VSV，ATCC VR-158)，繼續(xù)培養(yǎng)20h。除去每個盤中的病毒基溶液，加入50μl 0.05％結(jié)晶紫染料溶液，利用微板塊讀數(shù)器讀出550nm的吸光率，以此來測量IFN的半衰期。圖13顯示了通過羧基結(jié)合的mPEG(20000)-Hz-IFN(例6)的半衰期，并與天然FIN及PEG-IFN進(jìn)行了比較。本發(fā)明的mPEG(20000)-Hz-IFN較天然FIN及PEG-IFN更長的半衰期。
例14PEG-IFN結(jié)合物的穩(wěn)定性例6中制備并提純的mPEG(20000)-Hz-IFN以及PEG-IFN的穩(wěn)定性，其中帶支臂的PEG(10K)2-NHS(依據(jù)文獻(xiàn)中的方法連接在IFN的氨基上，然后利用清除柱分離單向PEG-IFN)通過觀察完整IFN在SDS-PAGE上的解離而測定，測定之前將其置于PBS溶液中在4℃條件下培養(yǎng)。每一樣品的濃度調(diào)整到1mg/ml。結(jié)果顯示，大約2周以后，約有14％的完整IFN從通過氨基結(jié)合的PEG-IFN中解離，然而本發(fā)明通過羧基結(jié)合的mPEG(20000)-Hz-IFN，即使在6個月后也沒有檢測到IFN的解離(圖14)。
例15mPEG(5000)-Hz-PTH結(jié)合物的制備將1mg人體PTH(甲狀腺激素，0.00012mmol，1-84aa，Dong-Kook Pharm.，Korea)與3.0mg活化mPEG(5000)-Hz置于0.5ml的50mM緩沖溶液MES(PH4.4)中，在室溫攪拌條件下反應(yīng)10min；將2.5μl濃度為100ug/μl的EDAC(0.00125mmol，10倍摩爾過量)加入，進(jìn)而在室溫攪拌條件下反應(yīng)1h。未反應(yīng)的mPEG(5000)-Hz及PTH利用Centricon-10(Amicon，USA)清除，制得0.4mg的mPEG(5000)-Hz-PTH。
例16mPEG(12000)-Hz-PTH結(jié)合物的制備將1mg人體PTH(0.00012mmol)與7.14mg活化mPEG(12000)-Hz(0.0006mmol，5倍摩爾過量，ISU Chemical，Korea)置于0.5ml的50mM緩沖溶液MES(PH4.4)中，在室溫攪拌條件下反應(yīng)10min；將2.5μl濃度為100ug/μl的EDAC(0.00125mmol，10倍摩爾過量)加入，進(jìn)而在室溫攪拌條件下反應(yīng)1h。未反應(yīng)的mPEG(12000)-Hz及PTH利用Centricon-10(Amicon，USA)清除，制得0.3mg的mPEG(12000)-Hz-PTH。
例17mPEG(20000)-Hz-PTH結(jié)合物的制備將1mg人體PTH(0.00012mmol)與12mg活化mPEG(20000)-Hz(0.0006mmol，5倍摩爾過量，ISU Chemical，Korea)置于0.5ml的50mM緩沖溶液MES(PH4.4)中，在室溫攪拌條件下反應(yīng)10min；將2.5μl濃度為100ug/μl的EDAC(0.00125mmol，10倍摩爾過量)加入，進(jìn)而在室溫攪拌條件下反應(yīng)1h。未反應(yīng)的mPEG(20000)-Hz及PTH利用Centricon-30(Amicon，USA)清除，制得0.3mg的mPEG(20000)-Hz-PTH。
例18mPEG(12000)-Hz-PTH結(jié)合物的制備將1mg人體PTH(0.00012mmol)與14.4mg活化mPEG(12000)-Hz(0.0012mmol，10倍摩爾過量，ISU Chemical，Korea)置于0.5ml的50mM緩沖溶液MES(PH2.5)中，在室溫攪拌條件下反應(yīng)10min；將5μl濃度為100ug/μl的EDAC(0.0025mmol，20倍摩爾過量)加入，進(jìn)而在室溫攪拌條件下反應(yīng)1h。未反應(yīng)的mPEG(12000)-Hz及PTH利用Centricon-10(Amicon，USA)清除，制得0.2mg的mPEG(12000)-Hz-PTH。
例19mPEG(20000)-Hz-PTH結(jié)合物的制備將1mg人體PTH(0.00012mmol)與24mg活化mPEG(20000)-Hz(0.0012mmol，10倍摩爾過量，ISU Chemical，Korea)置于0.5ml的50mM緩沖溶液MES(PH2.5)中，在室溫攪拌條件下反應(yīng)10min；將5μl濃度為100ug/μl的EDAC(0.0025mmol，20倍摩爾過量)加入，進(jìn)而在室溫攪拌條件下反應(yīng)1h。未反應(yīng)的mPEG(20000)-Hz及PTH利用Centricon-30(Amicon，USA)清除，制得0.2mg的mPEG(20000)-Hz-PTH。
例20mPEG-Hz-PTH結(jié)合物分析上述例子中得到的PEG-PTH結(jié)合物及天然PTH采用以下HPLC條件測定HPLC洗提條件柱LiChroCART 125-4RP-8(5um)(Merck，USA)溶劑A含0.1％TFA的去離子水B含0.1％TFA的乙腈流量0.8ml/min探測器220nmUV探測器注射體積20μl

利用對于HPLC的LiChroCART 125-4RP-8(5um)，在220nm只探測到PTH及其他蛋白質(zhì)，未探測到PEG。PTH的RT通過HPLC測定。未經(jīng)聚合物改良的PTH在6.8min處有一個尖銳的峰，逐漸增加至18min又再次降低(圖15)。
位于上表1、2之間的洗提條件范圍內(nèi)，按上述方法制備的mPEG-Hz-PTH在6.8min及7.3min處進(jìn)行洗提處理，以分別除去未反應(yīng)的PTH及PEG-PTH，位于上表1、2之間的洗提條件范圍內(nèi)。
結(jié)合之后，提純之前共有3種產(chǎn)物(未反應(yīng)的PTH、mPEG(20000)-Hz-PTH、mPEG(20000)-Hz)，在220nm只探測到未反應(yīng)的PTH、mPEG(20000)-Hz-PTH，沒有探測到未反應(yīng)的mPEG(20000)-Hz(圖16)。
圖17為HPLC上最終提純后的mPEG(20000)-Hz-PTH，圖18為mPEG(20000)-Hz-PTH與PTH反應(yīng)后以庫馬西藍(lán)染色的SDS-PAGE。
例21mPEG-PTH結(jié)合物在生物體外生物活性的測定根據(jù)PEG的分子量，使用分子量為5000(5K)、12000(12K)及20000(20K)的活化mPEG-Hz進(jìn)行生物活性測定。通過測量c-AMP的數(shù)量來比較天然PTH、mPEG(5000)-Hz-PTHmPEG、(12000)-Hz-PTH及mPEG(20000)-Hz-PTH的體外生物活性，其中c-AMP通過使用UMR-106細(xì)胞系的c-AMP kit(Amersham Pharmacia，RPN225，USA)合成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著PEG分子量的增加，mPEG-Hz-PTH的生物活性降低。此外還發(fā)現(xiàn)，10-8摩爾濃度的mPEG(5000)-Hz-PTH、mPEG(12000)-Hz-PTH及mPEG(20000)-Hz-PTH分別保持40％、30％、20％的未反應(yīng)PTH的活性(圖19)。
例22mPEG-Hz-PTH的半衰期測定通過靜脈注射，將100ug/kg的PTH及mPEG-Hz-IFN(例6)分別注入每一個雄性小鼠(重300-350g)體內(nèi)。注射后0、5、10、15、30、60及120min的時間間隔內(nèi)，利用插管抽取血液。通過離心過濾(13000rpm，10min，4℃)分離血清，mPEG-Hz-PTH的半衰期通過計算保留的PTH濃度而直接測量，其中濃度通過通過使用c-AMP kit(Amersham Pharmacia，RPN 225，USA)測量血漿中c-AMP的濃度得到。
結(jié)果顯示，15min后未探測到未反應(yīng)的PTH和mPEG(5000)-Hz-PTHmPEG，但1h、2h后分別探測到了mPEG(12000)-Hz-PTH及mPEG(20000)-Hz-PTH(圖20)。
已論述了本發(fā)明的首選設(shè)備，在不違背本發(fā)明精神情況下，熟練操作者也可以采用其他設(shè)備，還包括在此處聲明的真正范圍內(nèi)對本發(fā)明的改良及變動。以上例子深入描述、論證了本發(fā)明范圍內(nèi)的具體裝置。單獨給出的例子是為了說明而不是限制本發(fā)明，在不違背本發(fā)明精神情況下可進(jìn)行很多變化。
本發(fā)明是提供了一種1∶1摩爾比的生物適合聚合物-生物活性材料結(jié)合物，其中活性生物適合聚合物與生物活性材料中的羧基結(jié)合，如蛋白質(zhì)或多肽；同時還包括制備方法。本結(jié)合物增強(qiáng)了生物實用性，延長了半衰期，體內(nèi)穩(wěn)定性增強(qiáng)，這使得其作為醫(yī)用藥物時可以降低使用頻率。
權(quán)利要求
1.一種生物適合聚合物-生物活性材料的結(jié)合物，其中活性生物適合聚合物與生物活性材料中的羧基按1∶1的摩爾比結(jié)合。
2.如權(quán)利要求1所述結(jié)合物，其特征為生物適合聚合物可做如下選擇聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚氧乙烯(POE)、聚對苯二酚乙二醇、聚交酯酸及其衍生物、聚丙稀酸及其衍生物、聚氨酸、聚乙烯醇、聚亞胺酯、多磷酯、聚乙烯、聚亞烷基氧化物(PAO)、多聚糖、右旋糖酐、聚乙烯吡咯啉、聚丙烯酰胺及其他共聚物。
3.如權(quán)利要求1所述結(jié)合物，其特征為生物活性材料可做如下選擇血紅蛋白、血清蛋白(如含有因子VII、VIII及IX的血液因子)、免疫球蛋白、細(xì)胞活素、α-、(β-γ-干擾素、集落刺激因子包括G-CSF和GM-CSF、血小板來自生長因子、磷脂酶激活蛋白(PLAP)，以及甲狀腺激素(PTH)。其他基因生物或藥用蛋白質(zhì)包括胰島素、植物蛋白(如凝集素及蓖麻毒蛋白)、腫瘤壞死因子(TNF)及相關(guān)的等位基因、成長因子(如組織成長因子TGFec、TGFβ和表皮成長因子)、激素類(如濾泡刺激激素、甲狀腺刺激激素、抗利尿激素、色素激素、黃體激素-釋放激素及其衍生物)、降鈣素、降鈣素基因相關(guān)肽、人造腦啡肽、生長調(diào)節(jié)素、紅細(xì)胞生成素、下丘腦釋放因子、促乳素、促性腺激素、纖溶酶原激活物、肽釋放生長因子、胸腺體液因子。
4.如權(quán)利要求1所述結(jié)合物，其特征為生物活性材料可選擇干擾素、G-CSF或甲狀腺激素。
5.藥用合成包括藥用可接受數(shù)量的結(jié)合物(依據(jù)聲明1)及藥用可接受的載體。
6.一種生物適合聚合物與生物活性材料的按1∶1的摩爾比結(jié)合的制備方法，其中活性生物適合聚合物與生物活性材料中的羧基結(jié)合，包括將生物活性材料結(jié)合到生物適合聚合物上的步驟，其在反應(yīng)條件下逐步添加結(jié)合劑，生物活性材料與生物適合聚合物的摩爾比為1∶1-1∶20，與結(jié)合劑的摩爾比為1∶1-1∶50，PH值2-5。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征為生物適合聚合物需經(jīng)可以與羧酸和反應(yīng)性羰基反應(yīng)的功能基活化，可以與羧酸和反應(yīng)性羰基反應(yīng)。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征為生物適合聚合物可做如下選擇聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚氧乙烯(POE)、聚對苯二酚乙二醇、聚交酯酸及其衍生物、聚丙稀酸及其衍生物、聚氨酸、聚乙烯醇、聚亞胺酯、多磷酯、聚乙烯、聚亞烷基氧化物(PAO)、多聚糖、右旋糖酐、聚乙烯吡咯啉、聚丙烯酰胺及其他共聚物。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征為生物活性材料可做如下選擇血紅蛋白、血清蛋白(如含有因子VII、VIII及IX的血液因子)、免疫球蛋白、細(xì)胞活素(如白介素)、α-、(β-γ-干擾素、集落刺激因子包括G-CSF和GM-CSF、血小板來自生長因子、磷脂酶激活蛋白(PLAP)，以及甲狀腺激素(PTH)。其他基因生物或藥用蛋白質(zhì)包括胰島素、植物蛋白(如凝集素及蓖麻毒蛋白)、腫瘤壞死因子(TNF)及相關(guān)的等位基因、成長因子(如組織成長因子TGFec、TGFβ和表皮成長因子)、激素類(如濾泡刺激激素、甲狀腺刺激激素、抗利尿激素、色素激素、黃體激素-釋放激素及其衍生物)、降鈣素、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、人造腦啡肽、生長調(diào)節(jié)素、紅細(xì)胞生成素、下丘腦釋放因子、促乳素、促性腺激素、纖溶酶原激活物、肽釋放生長因子、胸腺體液因子。
10.依據(jù)權(quán)利要求6制備的生物適合聚合物-生物活性材料結(jié)合物，其二者的摩爾比為1∶1。
11.生物適合聚合物-生物活性材料結(jié)合物，其中生物適合聚合物按1∶1的比例連接在生物活性材料的C端。
12.如權(quán)利要求11所述的結(jié)合物，其特征為生物適合聚合物可做如下選擇聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚氧乙烯(POE)、聚對苯二酚乙二醇、聚交酯酸及其衍生物、聚丙稀酸及其衍生物、聚氨酸、聚乙烯醇、聚亞胺酯、多磷酯、聚乙烯、聚亞烷基氧化物(PAO)、多聚糖、右旋糖酐、聚乙烯吡咯啉、聚丙烯酰胺，及其他共聚物。
13.如權(quán)利要求11所述的結(jié)合物，其特征為生物活性材料可做如下選擇血紅蛋白、血清蛋白(如含有因子VII、VIII及IX的血液因子)、免疫球蛋白、細(xì)胞活素(如白介素)、α-、(β-γ-干擾素、集落刺激因子包括G-CSF和GM-CSF、血小板來自生長因子、磷脂酶激活蛋白(PLAP)，以及甲狀腺激素(PTH)。其他基因生物或藥用蛋白質(zhì)包括胰島素、植物蛋白(如凝集素及蓖麻毒蛋白)、腫瘤壞死因子(TNF)及相關(guān)的等位基因、成長因子(如組織成長因子TGFec、TGFβ和表皮成長因子)、激素類(如濾泡刺激激素、甲狀腺刺激激素、抗利尿激素、色素激素、黃體激素-釋放激素及其衍生物)、降鈣素、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、人造腦啡肽、生長調(diào)節(jié)素、紅細(xì)胞生成素、下丘腦釋放因子、促乳素、促性腺激素、纖溶酶原激活物、肽釋放生長因子、胸腺體液因子。
14.如權(quán)利要求13所述的結(jié)合物，其特征為生物活性材料可選擇干擾素、G-CSF或甲狀腺激素。
15.藥用合成包括藥用可接受數(shù)量的結(jié)合物(依據(jù)11)及藥用可接受的載體。
16.一種生物適合聚合物與生物活性材料的按1∶1的摩爾比在生物活性材料的C端結(jié)合的制備方法，其中活性生物適合聚合物與生物活性材料中的羧基結(jié)合，包括將生物活性材料結(jié)合到生物適合聚合物上的步驟，其在反應(yīng)條件下逐步添加結(jié)合劑，生物活性材料與生物適合聚合物的摩爾比為1∶1-1∶20，與結(jié)合劑的摩爾比為1∶1-1∶50，PH值2-5。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，生物適合聚合物需經(jīng)可以與羧酸和反應(yīng)性羰基反應(yīng)的功能基活化，可以與羧酸和反應(yīng)性羰基反應(yīng)。
18.依據(jù)權(quán)利要求16的結(jié)合物，生物適合聚合物可做如下選擇聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚氧乙烯(POE)、聚對苯二酚乙二醇、聚交酯酸及其衍生物、聚丙稀酸及其衍生物、聚氨酸、聚乙烯醇、聚亞胺酯、多磷酯、聚乙烯、聚亞烷基氧化物(PAO)、多聚糖、右旋糖酐、聚乙烯吡咯啉、聚丙烯酰胺及其他共聚物。
19.依照權(quán)利要求16的結(jié)合物，生物活性材料可做如下選擇血紅蛋白、血清蛋白(如含有因子VII、VIII及IX的血液因子)、免疫球蛋白、細(xì)胞活素(如白介素)、α-、(β-γ-干擾素、集落刺激因子包括G-CSF和GM-CSF、血小板來自生長因子、磷脂酶激活蛋白(PLAP)，以及甲狀腺激素(PTH)。其他基因生物或藥用蛋白質(zhì)包括胰島素、植物蛋白(如凝集素及蓖麻毒蛋白)、腫瘤壞死因子(TNF)及相關(guān)的等位基因、成長因子(如組織成長因子TGFec、TGFβ和表皮成長因子)、激素類(如濾泡刺激激素、甲狀腺刺激激素、抗利尿激素、色素激素、黃體激素-釋放激素及其衍生物)、降鈣素、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、人造腦啡肽、生長調(diào)節(jié)素、紅細(xì)胞生成素、下丘腦釋放因子、促乳素、促性腺激素、纖溶酶原激活物、肽釋放生長因子、胸腺體液因子。
20.依據(jù)權(quán)利要求16制備的生物適合聚合物-生物活性材料結(jié)合物，其中生物適合聚合物連接到生物活性材料C端的摩爾比為1∶1。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于生物適合聚合物與生物活性分子的結(jié)合，其中活性生物適合聚合物與生物活性材料中的羧基按1∶1的摩爾比結(jié)合，包括制備方法及相同的藥用成分。
文檔編號A61K47/48GK1767858SQ200480008483
公開日2006年5月3日 申請日期2004年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月28日
發(fā)明者樸明玉 申請人:百聚生物有限公司