專利名稱：用于移植的軟骨細(xì)胞的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及正常人軟骨細(xì)胞的制備方法和根據(jù)該方法得到的正常人軟骨細(xì)胞。此外，本發(fā)明還涉及使用所得到的正常人軟骨細(xì)胞的軟骨治療材料。
背景技術(shù)：
軟骨細(xì)胞在組織中以細(xì)胞包埋在基質(zhì)中的狀態(tài)存在，用酶例如膠原酶處理軟骨，可從基質(zhì)成分中分離出軟骨細(xì)胞。可以考慮利用該分離的軟骨細(xì)胞，移植治療軟骨相關(guān)的疾病、特別是進(jìn)行軟骨細(xì)胞的自體移植。在人以外的動(dòng)物，例如兔子、牛等的可以得到大量細(xì)胞的情況下，實(shí)驗(yàn)證明根據(jù)該方法可進(jìn)行移植治療(例如Bentry，et al.，Nature 230385-388(1971)，Green，Clin.Orthop.124237-250(1977)，Wakitani et al.，J.Bone and Joint Surgery 71B74-80(1989)，Paige et al.，Plastic and Reconstructive Surgery961390-1398(1995)，Paige et al.，Plastic and ReconstructiveSurgery 97168-178(1996))。
至今為止，一直嘗試在人中也能培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨、耳廓軟骨和肋軟骨等軟骨細(xì)胞(Aulthouse et al.，In Vitro Cellular &Developmental Biology 25659-668(1989)，Brrittberg et al.，TheNew England Journal of Medicine 331889-895(1994)，Ting et al.，Annals of Plastic Surgery 40413-421(1998)，Rodriguez etal.，Plastic and Reconstructive Surgery 1031111-1119(1999))。
不過在人中僅能采取很少量的軟骨，因此在培養(yǎng)開始時(shí)只能使用很少量的軟骨細(xì)胞，而且使用以往的培養(yǎng)方法，會(huì)使人軟骨細(xì)胞的增殖顯著降低，并且即使增殖也會(huì)從軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變成纖維母細(xì)胞，因此用于移植治療的實(shí)際應(yīng)用是極其困難的。即，存在下述問題，在人體中為了移植需要大量正常的軟骨細(xì)胞，但卻不能得到足夠量的軟骨細(xì)胞。
為了解決該問題，本發(fā)明人曾提出下述方案將人軟骨細(xì)胞和作為飼養(yǎng)細(xì)胞的軟骨形成期的軟骨周邊細(xì)胞共同培養(yǎng)，其中的飼養(yǎng)細(xì)胞能支持軟骨細(xì)胞增殖，可迅速并且大量地培養(yǎng)人軟骨細(xì)胞(WO02/12451(2002))。可是，使用人以外的動(dòng)物的飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，存在細(xì)菌或無法預(yù)料的病毒感染的問題，為了對此進(jìn)行預(yù)防，需要進(jìn)行煩瑣的處理。
相關(guān)文獻(xiàn)1.Bentry，et al.，Nature 230385-388(1971)2.Green，Clin.Orthop.124237-250(1977)3.Wakitani et al.，J.Bone and Joint Surgery 71B74-80(1989)4.Paige et al.，Plastic and Reconstructive Surgery961390-1398(1995)5.Paige et al.，Plastic and Reconstructive Surgery97168-178(1996)6.Aulthouse et al.，In Vitro Cellular & Developmental Biology25659-668(1989)7.Brrittberg et al.，The New England Journal of Medicine331889-895(1994)8.Ting et al.，Annals of Plastic Surgery 40413-421(1998)9.Rodrigues et al.，Plastic and Reconstructive Surgery1031111-1119(1999)10.WO 02/12451(2002)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供不用擔(dān)心細(xì)菌、病毒感染，且能迅速并大量地得到正常的人軟骨細(xì)胞或其細(xì)胞塊的方法，另外，本發(fā)明的目的是提供使用所得到的正常人軟骨細(xì)胞或其細(xì)胞塊的軟骨治療材料。即，本發(fā)明包括如下內(nèi)容(1)人軟骨細(xì)胞的制備方法，其特征在于，將從具有軟骨膜的軟骨中得到的軟骨細(xì)胞和軟骨膜共同培養(yǎng)。
(2)(1)記載的制備方法，其特征在于，該軟骨是耳廓軟骨。
(3)(1)記載的制備方法，其特征在于，將細(xì)胞單層或多層地接種1次或2次以上，培養(yǎng)，得到軟骨細(xì)胞塊。
(4)(2)記載的制備方法，其特征在于，將細(xì)胞單層或多層地接種1次或2次以上，培養(yǎng)，得到軟骨細(xì)胞塊。
(5)軟骨治療材料，其是根據(jù)上述(1)～(4)記載的制備方法得到的單獨(dú)的軟骨細(xì)胞或是由該軟骨細(xì)胞和包埋材料所組成的。
(6)權(quán)利要求5記載的軟骨治療材料，其中的包埋材料選自膠原、聚乙二醇酸、聚乳酸、藻酸、聚環(huán)氧乙烷、纖維蛋白結(jié)合劑、聚乳酸-聚乙二醇酸共聚物、蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖或人的真皮中的一種或兩種以上。


圖1是將傳代培養(yǎng)得到的軟骨細(xì)胞經(jīng)2周多層培養(yǎng)后得到的片狀的凝膠塊的照片。
圖2是用蘇木素-伊紅染色圖1的凝膠狀軟骨細(xì)胞塊的結(jié)果的照片。
圖3是對軟骨組織的分子標(biāo)記物的II型膠原進(jìn)行免疫染色的結(jié)果的照片。
圖4是從移植部分取出一部分，經(jīng)蘇木素-伊紅染色(H.E)后的結(jié)果的照片。
圖5是從移植部位取出一部分，對軟骨組織的分子標(biāo)記物的II型膠原進(jìn)行免疫染色的結(jié)果的照片。
圖6是從移植部分取出一部分，經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色的結(jié)果的照片
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人首先對曾提出的使用飼養(yǎng)細(xì)胞的方法(WO02/12451(2002))進(jìn)一步改良，發(fā)現(xiàn)可以不使用飼養(yǎng)細(xì)胞、更為簡便地培養(yǎng)-增殖耳廓軟骨等軟骨細(xì)胞的方法。以前認(rèn)為飼養(yǎng)細(xì)胞是軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)-增殖所必需的，不過，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)即使不用飼養(yǎng)細(xì)胞，也可以培養(yǎng)-增殖軟骨細(xì)胞。即，可以說本發(fā)明的方法能避免使用飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)的煩瑣操作，使操作簡化的同時(shí)，還能夠避免來自飼養(yǎng)細(xì)胞的感染等的危險(xiǎn)，是最適用于人的自體移植的方法。
此外，發(fā)現(xiàn)用所說的方法可將增殖的人軟骨細(xì)胞進(jìn)一步多層培養(yǎng)，得到軟骨塊，將其以無支持物狀態(tài)用于移植治療。
本發(fā)明所用的人軟骨是耳廓軟骨時(shí)，出于美容的考慮，優(yōu)選從耳朵后部的底部切開很少的皮膚，取出少量的軟骨組織(1×1平方厘米左右)。優(yōu)選在此時(shí)采取的軟骨組織的一面附著有軟骨膜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過該操作，從軟骨采取部位殘余的軟骨膜另一面上迅速地再生出軟骨，整體很快愈合。
下面，為了得到用于移植所需要的細(xì)胞，將所采取的附有軟骨膜的耳廓軟骨切成小塊(dice)，開始單層培養(yǎng)。此時(shí)優(yōu)選向所使用的培養(yǎng)基中加入軟骨細(xì)胞增殖所必需的細(xì)胞因子。不僅該單層培養(yǎng)可以移植，而且，使用該單層培養(yǎng)所增殖的細(xì)胞，經(jīng)過多次多層培養(yǎng)，可以得到具有能用鑷子等器具收集程度的物理強(qiáng)度的、移植到機(jī)體中時(shí)不被分散、吸收的組織。多層接種的次數(shù)根據(jù)希望的組織的大小而有所不同，通常優(yōu)選3～4次。
將該組織裝入到注射筒等中，從安裝的注射針注入到軟骨缺損部位，可以將其用于鼻子變形、隆鼻、臉骨變形、臉骨缺損、額頭形成、頭蓋骨變形、頭蓋骨部分缺損、變形性關(guān)節(jié)炎、小耳癥、伴隨其他軟骨缺損的疾病或軟骨缺損部位的治療、修復(fù)。此時(shí)，還可向該軟骨組織中混入用作載體的膠原、聚乙二醇酸(PGA；polygycolic acid)、聚乳酸(polylactic acid)、藻酸鹽(Alginate)、聚環(huán)氧乙烷、纖維蛋白結(jié)合劑、聚乳酸-聚乙二醇酸共聚物、蛋白聚糖(proteoglycans)、葡萄糖胺聚糖(glucosaminoglycan)?；蛘撸部梢圆挥幂d體，將根據(jù)本發(fā)明的制備方法得到的軟骨細(xì)胞用于實(shí)際應(yīng)用。
A.人軟骨細(xì)胞本發(fā)明的軟骨細(xì)胞的制備方法可以用有附著于軟骨膜狀態(tài)的人軟骨組織的培養(yǎng)，例如耳廓軟骨、肋軟骨、關(guān)節(jié)軟骨、椎間軟骨和氣管軟骨的軟骨細(xì)胞，特別適合耳廓軟骨的軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)-增殖。
供給本發(fā)明的制備方法的軟骨細(xì)胞可以是根據(jù)公知的方法從附著在軟骨膜上的人軟骨組織得到的。通常優(yōu)選用手術(shù)刀等將摘取的軟骨組織切成小塊，用膠原酶處理，使之培養(yǎng)-增殖。其流程的具體例，如下所示。
1)將摘取的軟骨組織在抗生素物質(zhì)(例如青霉素、卡那霉素)或抗真菌劑(例如雙性霉素B)中，于4℃左右靜置一晚除菌，然后用手術(shù)刀等將軟骨組織切成小塊。
2)將切成小塊的軟骨組織轉(zhuǎn)移到含有II型膠原酶的培養(yǎng)基中，在4℃左右靜置一晚。然后，在37℃下振搖4小時(shí)。
3)然后，將處理后的組織離心，將該沉淀物用于培養(yǎng)。
通過該方法，從1平方厘米的人耳廓軟骨組織中，通過傳代1代，能得到3～5×106個(gè)細(xì)胞的軟骨細(xì)胞。此外，在本發(fā)明的培養(yǎng)方法中，可以從如FGF(例如bFGF)、IGF(例如IGF-1)和骨形成因子9(BMP9)中選擇或組合使用適當(dāng)?shù)墓脑鲋骋蜃樱貏e是能刺激軟骨增殖的物質(zhì)。
B.培養(yǎng)人軟骨細(xì)胞的方法可使用適合培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的公知培養(yǎng)基培養(yǎng)人軟骨細(xì)胞。此外，可以向培養(yǎng)基中加入胎牛血清(FBS)或人血清、皮質(zhì)醇(Hydrocortisone)，除此之外，還可以適當(dāng)加入人bFGF、人IGF-1等增殖因子(Cuevas等，Biochem.Biophy.Res.Commun.156，611-18，1988；Froger-Gaillard等，Endocrinol.124，2365-72)。作為這種培養(yǎng)基的例子，如向DME(H)培養(yǎng)基中添加了FBS(優(yōu)選10％左右)、人bFGF(優(yōu)選10ng/ml左右)、皮質(zhì)醇(優(yōu)選40ng/ml)、人IGF-1(優(yōu)選5ng/ml)的培養(yǎng)基。還可以用來自患者自身的血清，如果采用后者則會(huì)更安全。
本發(fā)明培養(yǎng)方法的具體例，如下所示。
1)原代培養(yǎng)向裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中接種軟骨細(xì)胞，于培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的適合條件(例如37℃，10％CO2的條件下)下，在二氧化碳?xì)怏w培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)直至增殖的細(xì)胞單層融合(或稱融匯，confluent)為止(通常10～14天)。
2)傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)可以用和原代培養(yǎng)相同的培養(yǎng)基(通常，每7天傳一代)。將原代培養(yǎng)得到的細(xì)胞傳代培養(yǎng)時(shí)，耳廓軟骨的細(xì)胞數(shù)在P0(原代培養(yǎng))→P4過程中增加了1000倍左右。而且，希望得到大量軟骨細(xì)胞時(shí)可以適當(dāng)增加傳代次數(shù)。
3)多層培養(yǎng)可以通過傳代培養(yǎng)得到的人軟骨細(xì)胞多層地接種1次或2次以上，優(yōu)選接種3～4次，進(jìn)行培養(yǎng)，得到凝膠狀的軟骨細(xì)胞塊。在所得到的軟骨細(xì)胞塊中，用包括蛋白聚糖等在內(nèi)的軟骨基質(zhì)包圍人軟骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞彼此之間通過蛋白聚糖等基質(zhì)結(jié)合，形成凝膠狀的細(xì)胞塊。
C.軟骨治療材料可以用由本發(fā)明得到的上述的傳代培養(yǎng)或多層培養(yǎng)的人軟骨細(xì)胞或細(xì)胞塊的原樣狀態(tài)或?qū)⑵浒竦缴锊牧现?，作為軟骨治療材料供給移植。作為包埋人軟骨細(xì)胞或包埋細(xì)胞塊的載體，可列舉膠原、聚乙二醇酸(PGA；polygycolic acid)、聚乳酸(polylactic acid)、藻酸鹽(Alginate)、聚環(huán)氧乙烷、纖維蛋白結(jié)合劑、聚乳酸-聚乙二醇酸共聚物、蛋白聚糖(proteoglycan)、葡萄糖胺聚糖(glucosaminoglycan)，也可以混合使用上述物質(zhì)。
此外，通過適當(dāng)選擇、組合包埋軟骨細(xì)胞的載體可使該軟骨治療材料不僅誘導(dǎo)出軟骨，還能誘導(dǎo)出內(nèi)軟骨性骨化。例如人的真皮是能夠誘導(dǎo)這種內(nèi)軟骨性骨化的載體。此外，使用促進(jìn)骨形成的生長因子也能促進(jìn)骨化，如骨形成因子(BMP)。
下面，通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。不過，下面的實(shí)施例是范例，本發(fā)明不局限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1 培養(yǎng)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基構(gòu)成向DME(H)培養(yǎng)基中添加10％FBS、10ng/ml人FGF(科研制藥)、40ng/ml皮質(zhì)醇(Sigma)和5ng/ml人IGF-1(GIBCO)。
采取軟骨從人耳朵后部底部軟骨摘取大約1平方厘米的一面的附著有軟骨膜的軟骨。
(a)軟骨細(xì)胞組分將上述得到的軟骨片用青霉素G(800u/ml)、卡那霉素(1mg/ml)和兩性霉素B(2.5ug/ml)除菌，然后，用手術(shù)刀切成小塊后，在含有03％II型膠原酶(Worthington Biochemical制造)的F-12培養(yǎng)基中，于4℃下靜置一晚。第二天在37℃下振搖4小時(shí)后，離心，將該沉淀物作為開始培養(yǎng)的細(xì)胞組分。
(b)原代培養(yǎng)將上述細(xì)胞組分接種到使用上述培養(yǎng)基的、底面積為75cm2的培養(yǎng)瓶中。將該培養(yǎng)瓶在設(shè)定CO2濃度為10％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周更換2次培養(yǎng)液。結(jié)果經(jīng)過10～14天的培養(yǎng)，軟骨細(xì)胞單層融合。將得到的細(xì)胞用于之后的傳代培養(yǎng)。
經(jīng)確認(rèn)，使用將患者自己的血液在3000rpm下離心10分鐘得到的自體血清替代FBS，也能得到相同的結(jié)果。
(c)傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)中，將1×106個(gè)原代培養(yǎng)的細(xì)胞接種到底面積為175cm2的培養(yǎng)瓶中，按照和原代培養(yǎng)相同的條件進(jìn)行培養(yǎng)。將得到的經(jīng)7天培養(yǎng)單層融合的細(xì)胞用于下面的傳代培養(yǎng)。結(jié)果在第4代時(shí)，細(xì)胞數(shù)增加到原代的1000倍左右。
(d)多層培養(yǎng)將傳代培養(yǎng)中得到的軟骨細(xì)胞按照1×106個(gè)/cm2的密度接種3次，使之成多層，實(shí)施多層培養(yǎng)。培養(yǎng)2周后，形成片狀的凝膠塊(圖1)。對該凝膠狀的軟骨細(xì)胞塊進(jìn)行蘇木素-伊紅(H.E)染色時(shí)，細(xì)胞表現(xiàn)出多層化，細(xì)胞之間是通過基質(zhì)結(jié)合的(圖2)。此外，對軟骨組織的分子標(biāo)記物的II型膠原進(jìn)行免疫染色時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)著色，表明該細(xì)胞外基質(zhì)是軟骨特異性的基質(zhì)(圖3)。
實(shí)施例2 軟骨細(xì)胞的移植首先，從傳代培養(yǎng)或多層培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶中去除培養(yǎng)基后，用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，將該收集的細(xì)胞通過注射等吸引加以收獲。將收獲到注射筒中的軟骨細(xì)胞用注射針注入到裸鼠的軟骨缺損部位。該移植經(jīng)過6個(gè)月后，從移植部位采取出一部分，進(jìn)行組織學(xué)上的研究，確認(rèn)其成活。即，用蘇木素-伊紅(H.E)染色所采取的組織，表現(xiàn)出細(xì)胞多層化，細(xì)胞之間通過基質(zhì)結(jié)合的(圖4)。此外，對軟骨組織的分子標(biāo)記物的II型膠原進(jìn)行免疫染色時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)著色，表明該細(xì)胞外基質(zhì)是軟骨特異性基質(zhì)(圖5)。而且，表現(xiàn)出甲苯胺藍(lán)染色的異染性(metachromasia)，暗示存在軟骨細(xì)胞的標(biāo)記物蛋白聚糖(圖6)。綜上所述，移植的軟骨細(xì)胞形成了軟骨組織。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性根據(jù)本發(fā)明，能夠不用擔(dān)心細(xì)菌-病毒的感染，可以迅速并且大量地得到正常的人軟骨細(xì)胞或其細(xì)胞塊。
權(quán)利要求
1.人軟骨細(xì)胞的制備方法，其特征在于，將從具有軟骨膜的軟骨得到的軟骨細(xì)胞和軟骨膜一起培養(yǎng)。
2.權(quán)利要求1記載的制備方法，其特征在于，該軟骨是耳廓軟骨。
3.權(quán)利要求1記載的制備方法，其特征在于將培養(yǎng)細(xì)胞單層地或多層地接種1次或2次以上，培養(yǎng)，得到軟骨細(xì)胞塊。
4.權(quán)利要求2記載的制備方法，其特征在于將培養(yǎng)細(xì)胞單層地或多層地接種1次或2次以上，培養(yǎng)，得到軟骨細(xì)胞塊。
5.軟骨治療材料，其是根據(jù)權(quán)利要求1～4記載的制備方法得到的單獨(dú)的人軟骨細(xì)胞或是該軟骨細(xì)胞和包埋材料組成的。
6.權(quán)利要求5記載的軟骨治療材料，其中的包埋材料選自膠原、聚乙二醇酸、聚乳酸、藻酸、聚環(huán)氧乙烷、纖維蛋白結(jié)合劑、聚乳酸-聚乙二醇酸共聚物、蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖或人的真皮中的一種或兩種以上。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供不用擔(dān)心細(xì)菌、病毒感染，且能迅速并大量地得到正常的人軟骨細(xì)胞或其細(xì)胞塊的方法，該人軟骨細(xì)胞的制備方法的特征在于，從具有軟骨膜的軟骨得到軟骨細(xì)胞，例如耳廓軟骨，將其與軟骨膜共同培養(yǎng)?；颍撊塑浌羌?xì)胞的制備方法的特征在于，將培養(yǎng)細(xì)胞以單層或多層地接種1次或2次以上，進(jìn)行培養(yǎng)，得到軟骨細(xì)胞塊。
文檔編號(hào)A61L27/00GK1774502SQ20048001008
公開日2006年5月17日 申請日期2004年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月15日
發(fā)明者矢永博子 申請人:矢永博子, 矢永克