專利名稱：利用黑米提取物預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病的組合物及其治療用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用黑米提取物預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病的組合物及該組合物的治療用途。更確切地說(shuō)，本發(fā)明涉及預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病的組合物，該組合物含有下述物質(zhì)作為有效成分花葵素(pelargonidin)、花青素苷(cyanidin glycoside)或含有花葵素和花青素苷的黑米提取物；本發(fā)明還涉及所述組合物的治療用途。
背景技術(shù)：
通常地，已知過(guò)敏性疾病是由氣道或支氣管等組織中的過(guò)敏性炎癥引起的。特別地，過(guò)敏性疾病由以下途徑引起諸如塵土、花粉、真菌、各種食物和藥物等過(guò)敏原(抗原)通過(guò)呼吸器官、消化器官或皮膚進(jìn)入個(gè)體，然后與附著于組織內(nèi)的肥大細(xì)胞表面的IgE(免疫球蛋白E)抗體結(jié)合，隨后，肥大細(xì)胞分泌組胺。組胺是在鼻粘膜中引起過(guò)敏反應(yīng)的最重要的化學(xué)介質(zhì)，其增加血管透過(guò)性而引起鼻粘膜水腫，并刺激感覺(jué)神經(jīng)末梢，誘發(fā)諸如流淚、流鼻涕、瘙癢等早期過(guò)敏反應(yīng)。除了組胺，組織中的肥大細(xì)胞還分泌出諸如嗜酸粒細(xì)胞趨化因子和白三烯等具有趨化性的化學(xué)介質(zhì)。嗜酸性細(xì)胞被上述的趨化性因子移動(dòng)到過(guò)敏形成部位(趨化作用)，引起諸如組織損傷、炎癥反應(yīng)和超敏反應(yīng)等后期過(guò)敏反應(yīng)。
哮喘、過(guò)敏性鼻炎和特應(yīng)性皮炎是過(guò)敏性疾病的例子，它們由于煙塵等引起的空氣污染而變得越發(fā)嚴(yán)重。但是，還沒(méi)有研制出令人滿意的用于治療過(guò)敏性疾病的任何有效治療劑。一旦治療停止，癥狀在幾天或幾周內(nèi)復(fù)發(fā)，這就需要改善常規(guī)治療劑的安全性和有效性。
迄今為止，治療過(guò)敏性疾病的主要治療劑是只能用于減輕癥狀的皮質(zhì)類(lèi)固醇，其不僅遠(yuǎn)未達(dá)到消除病因的根本性治療，而且還帶有嚴(yán)重的副作用(Rabe KF等，Eur Respir J Suppl.，3434s～40s，2001)。大部分治療過(guò)敏性疾病的常規(guī)治療劑只具有抑制組胺的功能，因此它們不能抑制由組織中嗜酸粒細(xì)胞聚集引起的后期反應(yīng)(這是引起炎癥的主要原因)，導(dǎo)致慢性過(guò)敏癥狀。因此，迫切需要研制出克服治療過(guò)敏性疾病的常規(guī)治療劑的缺陷的新的抗過(guò)敏藥物。
黑米(Oryza Sativa L.)，富含花色素苷(anthocyanin)類(lèi)化合物的米，是含鈣、維生素、尼克酸等遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)白米的健康食品。已知黑米具有改善人體自身穩(wěn)定調(diào)節(jié)功能和加強(qiáng)免疫功能的作用。另外，已知黑米還具有預(yù)防疾病、抗氧化、抗癌尤其是降低膽固醇的作用。
花色素苷是在植物的花或果皮的紅色部分發(fā)現(xiàn)的色素苷?；ㄉ剀帐且活?lèi)化合物，在該類(lèi)化合物中，葡萄糖的特異性羥基基團(tuán)通過(guò)醚鍵與醇、酚、醛等功能基團(tuán)相連。至今已發(fā)現(xiàn)超過(guò)200種花色素苷，包括花翠素(delphinidin)、花青素(cyanidin)、花葵素、甲基花青素(peonidin)和二甲花翠素(malvidin)。花色素苷涉及抗炎、抗微生物和降低膽固醇等作用，特別是具有抗氧化活性，該類(lèi)物質(zhì)的抗氧化活性比生育酚這一天然抗氧化劑高5～7倍(Tedesco I等，J.Nutr.Biochem.，(9)505～511，2001；Youdim KA等，Biochim.Biophys.Acta.，1523(1)117～122，2000)。但是，花色素苷類(lèi)中各化合物的具體作用還沒(méi)有得到闡釋。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人通過(guò)研究，開(kāi)發(fā)了下述治療劑，該治療劑通過(guò)抑制由嗜酸粒細(xì)胞引起的炎癥而被用于有效地治療過(guò)敏性疾病，其中所述由嗜酸粒細(xì)胞引起的炎癥是晚期過(guò)敏性疾病的反應(yīng)之一。作為結(jié)果，本發(fā)明人證實(shí)，在所研究的很多中藥和天然物質(zhì)中，黑米提取物能夠有效抑制哮喘(一種代表性過(guò)敏性疾病)。并且，本發(fā)明人還證實(shí)了包含在黑米提取物中的花色素苷尤其是花葵素和花青素苷能夠抑制嗜酸粒細(xì)胞的聚集、并能有效抑制組織內(nèi)的炎癥，因此能夠治療包括哮喘在內(nèi)的過(guò)敏性疾病，從而完成本發(fā)明。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供利用黑米提取物預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病的方法。
本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供黑米提取物的新的治療用途。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供利用花葵素或花青素苷預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病的方法。
本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供利用花葵素或花青素苷對(duì)細(xì)胞、組織或機(jī)體內(nèi)的嗜酸粒細(xì)胞的聚集進(jìn)行抑制的方法。
本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供花葵素或花青素苷的新的治療用途。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病的組合物，該組合物包含選自由黑米提取物、花葵素和花青素苷組成的組中的一種或多種。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病的方法，該方法包括對(duì)需要的個(gè)體施用有效量的黑米提取物、花葵素或花青素苷。
為達(dá)到本發(fā)明的另外一個(gè)目的，本發(fā)明提供抑制細(xì)胞、組織或機(jī)體中嗜酸粒細(xì)胞聚集的方法，該方法包括對(duì)需要的個(gè)體施用花葵素或花青素苷。
為達(dá)到本發(fā)明的另外一個(gè)目的，本發(fā)明提供了黑米提取物、花葵素或花青素苷在制備預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病的治療劑中的用途。
為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的另外一個(gè)目的，本發(fā)明提供了花葵素或花青素苷在制備抑制嗜酸粒細(xì)胞聚集的治療劑中的用途。
以下將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。
本發(fā)明提供預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病的組合物，該組合物包含黑米提取物。
本發(fā)明還提供預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病的組合物，該組合物包含由式1表示的花葵素(3，5，7-三羥基-2-(4-羥基苯基)-1-苯吡喃氯)(3，5，7-trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-1-benzopyrylium chloride)或其藥學(xué)上可接受的鹽或糖苷作為有效成分。
<式1>
本發(fā)明還提供預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病的組合物，該組合物包含由式2表示的花青素苷(花青素3-O-β-吡喃葡糖苷)(cyanidin 3-O-β-glucopyranoside)或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分。
<式2>
本發(fā)明還提供預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病的組合物，該組合物包含選自由黑米提取物、花葵素和花青素苷組成的組中的一種或多種作為有效成分。
本發(fā)明的黑米提取物包含由式1表示的花葵素(3，5，7-三羥基-2-(4-羥基苯基)-1-苯吡喃氯)或由式2表示的花青素苷(花青素3-O-β-吡喃葡糖苷)。
本發(fā)明的黑米(Oryza sativa L.)是顏色為黑色的米，其富含花色素苷類(lèi)化合物，并且易通過(guò)商購(gòu)獲得。
在本發(fā)明預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病的組合物中的黑米提取物可以采用相關(guān)領(lǐng)域中公知的常規(guī)提取方法從黑米(Oryza sativa L)中制備。該提取方法包括但不限于，醇提取、水提取、有機(jī)溶液提取以及超臨界流體提取等。優(yōu)選地，可以用水和有機(jī)溶劑中的一種，或使用水和有機(jī)溶劑的混合物進(jìn)行提取，所述的有機(jī)溶劑例如C1～C4低級(jí)醇、丙酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、丙三醇、丙二醇、1，3-丁二醇、正己烷、二乙醚、苯和二氯甲烷。粉碎黑米，將上述溶劑之一加入其中。通過(guò)過(guò)濾棄去殘余物，用真空蒸發(fā)器通過(guò)攪拌濃縮過(guò)濾后的溶液。去除溶劑，冷凍干燥濃縮液，使其粉末化。
優(yōu)選的提取溫度為15℃～80℃，更優(yōu)選為25℃～60℃。提取時(shí)間取決于提取溫度，但是一般為5小時(shí)～24小時(shí)，并且優(yōu)選7小時(shí)～12個(gè)小時(shí)。如果在提取中使用振蕩器，則可以提高提取效率。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在黑米中加入乙醇，接著在35℃提取7個(gè)小時(shí)，然后，通過(guò)干燥使提取液蒸發(fā)，獲得粉末狀黑米提取物(見(jiàn)實(shí)施例1)。
雖然其具體的作用機(jī)制還未被披露，但已經(jīng)確信，本發(fā)明用于預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病的組合物中所含有的由式1表示的花葵素具有強(qiáng)抗氧化活性。特別地，花葵素不但毒性小，而且更容易被吸收，使得它成為適合于對(duì)人施用的優(yōu)秀治療劑(Ross JA等，Annu Rev Nutr.，2002；2219～34，綜述)。但是，除了將其作為抗氧化劑之外，至今還未知其他用途。
本發(fā)明預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病的組合物中所含有的由式2表示的花青素苷(花青素3-O-β-吡喃葡糖苷)是屬于花色素苷類(lèi)的天然物質(zhì)，據(jù)報(bào)道，該物質(zhì)具有強(qiáng)氧化活性。
本發(fā)明預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病的組合物中所含有的由式1表示的花葵素和由式2表示的花青素苷既可以通過(guò)商購(gòu)得到，也可以通過(guò)常規(guī)合成方法進(jìn)行制備(Nakajima N等，Biosci.Biotechnol.Biochem.，61(11)1926～1928，1997，Amorini AM等，F(xiàn)ree Radic.Res.，35(6)953～966)。優(yōu)選地，可以從天然物質(zhì)中將它們進(jìn)行分離和純化。更優(yōu)選從黑米中對(duì)它們進(jìn)行分離?？梢酝ㄟ^(guò)相關(guān)領(lǐng)域公知的常規(guī)方法從黑米中對(duì)花葵素或花青素苷進(jìn)行分離和純化。特別地，可以用水或有機(jī)溶劑提取黑米中的有效成分。然后，用色譜層析法對(duì)該成分進(jìn)行分離和純化，據(jù)此獲得純的目標(biāo)化合物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用卵清蛋白致敏而誘發(fā)小鼠哮喘，研究黑米提取物對(duì)其中炎癥(過(guò)敏性疾病的主要癥狀)的抑制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的黑米提取物顯著地抑制由卵清蛋白誘發(fā)哮喘的小鼠的肺中的炎癥(見(jiàn)圖1)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，研究了黑米提取物的主要成分花色素苷類(lèi)化合物對(duì)組織中的炎癥和嗜酸粒細(xì)胞的聚集(為過(guò)敏性疾病的主要癥狀)的抑制。將諸如花葵素、花翠素、甲基花青素和花青素苷等主要的花色素苷類(lèi)化合物施用于卵清蛋白誘發(fā)的哮喘小鼠。結(jié)果證實(shí)花葵素和花青素苷顯著地抑制氣道內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞(炎癥誘發(fā)細(xì)胞)的聚集，并顯著抑制肺部的炎癥(見(jiàn)圖2～圖4，表1)。在眾多花色素苷類(lèi)化合物中，未發(fā)現(xiàn)花翠素具有上述作用。甲基花青素作用較弱。但是，花葵素和花青素苷被證實(shí)對(duì)氣道內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞的聚集和肺部炎癥具有抑制作用，提示花葵素和花青素苷可被有效地用作預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病的組合物。
因此，包含本發(fā)明的黑米提取物、花葵素或花青素苷的組合物可以有效地用于預(yù)防或治療選自下述的過(guò)敏性疾病支氣管哮喘、慢性梗阻性肺部疾病、枯草熱、血管運(yùn)動(dòng)神經(jīng)性鼻炎、肥厚性鼻炎、過(guò)敏性支氣管炎、短暫性肺部浸潤(rùn)、過(guò)敏性胃炎、過(guò)敏性腹瀉、過(guò)敏性口腔炎、腸紫癜、結(jié)節(jié)性動(dòng)脈周?chē)住㈤]塞性動(dòng)脈內(nèi)膜炎、心絞痛、心內(nèi)膜炎、蕁麻疹、血管神經(jīng)性水腫、結(jié)節(jié)性紅斑、紫癜、特應(yīng)性皮炎、水皰、交感性眼炎、過(guò)敏性結(jié)膜炎和過(guò)敏性角膜炎，所述的過(guò)敏性疾病發(fā)生于哺乳動(dòng)物中，特別是人體中。
本發(fā)明中的“有效量”是指施用于患者后顯示預(yù)防或治療作用的化合物或提取物的量。通常，黑米提取物的施用量可以為每天1mg/kg～100mg/kg，優(yōu)選為每天10mg/kg～30mg/kg。由式1表示的花葵素的施用量可以為每天0.1mg/kg～10mg/kg，優(yōu)選為每天0.5mg/kg～2mg/kg。由式2表示的花青素苷的施用量可以為每天1mg/kg～30mg/kg，優(yōu)選為每天5mg/kg～20mg/kg。在可能的有效范圍內(nèi)，化合物和提取物可以每天施用一次或數(shù)次。黑米提取物、花葵素或花青素苷的施用量范圍可以隨施用途徑、施用對(duì)象、年齡、性別、體重、疾病的輕重程度以及患者的其他個(gè)體差異而適當(dāng)變化。包含本發(fā)明的黑米提取物、花葵素或花青素苷的組合物并不限于所述的劑型、施用途徑或方法，只要其保留有本發(fā)明的效果即可。
本文中的“個(gè)體”是指包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物。所述的個(gè)體包括需要治療的患者。
本發(fā)明的組合物能夠以多種方式和多種方法進(jìn)行制備和施用。例如，可采用口服施用、直腸施用、局部施用、腹膜內(nèi)施用、眼內(nèi)施用、肺內(nèi)施用以及鼻內(nèi)施用中的任何施用方式。并且，該組合物可以配成各種劑型，如片劑，錠劑、分散劑、懸浮劑、液體制劑、膠囊、乳膏、軟膏以及氣霧劑。
含有花葵素的本發(fā)明的組合物含有花葵素及其藥學(xué)上可接受的鹽或糖苷作為活性成分，還可以進(jìn)一步含有藥學(xué)上可接受的載體和其他治療成份。含有花青素苷的本發(fā)明的組合物含有花青素苷及其藥學(xué)上可接受的鹽，并且可以進(jìn)一步含有藥學(xué)上可接受的載體和其他治療成份。本文中的“藥學(xué)上可接受的鹽”是指由藥學(xué)上可接受的無(wú)毒的堿或酸(包括無(wú)機(jī)堿或無(wú)機(jī)酸以及有機(jī)堿或有機(jī)酸)制得的鹽。
包括用于口服施用，直腸施用，局部施用，皮下施用，以及包括肌內(nèi)施用和靜脈內(nèi)施用、眼內(nèi)施用、肺內(nèi)施用(鼻吸入或口吸入)或鼻內(nèi)施用在內(nèi)的腸胃外施用的組合物在內(nèi)，其中最適宜的施用途徑是根據(jù)疾病的特征和嚴(yán)重性以及活性成分的特性從上述途徑中選擇的途徑。根據(jù)藥學(xué)領(lǐng)域公知的一般制備方法，可以方便地制備所述組合物的單一劑量劑型。
就吸入而言，可以通過(guò)使用壓力容器或噴霧器以氣霧劑噴霧的形式對(duì)本發(fā)明的化合物或提取物進(jìn)行遞送。也可以以粉末形式通過(guò)粉末吸入裝置對(duì)本發(fā)明的化合物或提取物進(jìn)行遞送。優(yōu)選的吸入遞送裝置是定量吸入(MDI)氣霧劑，其可以通過(guò)將諸如碳氟化合物或碳?xì)浠衔锏韧七M(jìn)劑中的一種與黑米提取物或式1和式2的化合物進(jìn)行混合而配制成溶液或懸浮液的形式。
透皮制劑、氣霧劑、乳膏、軟膏、洗劑和噴霧劑是黑米提取物、花葵素或花青素苷局部施用劑型的好例子。
可以根據(jù)一般的藥學(xué)施用實(shí)用技術(shù)，將作為活性成分的黑米提取物、花葵素或花青素苷與藥學(xué)上可接受的載體進(jìn)行混合。載體可以因施用途徑(例如口服或包括靜脈注射在內(nèi)的腸胃外施用)而異。就用于口服的諸如懸浮劑、酏劑和溶液劑等液體劑型的制備而言，可以使用諸如水、乙二醇、油、醇、調(diào)味劑、消毒劑、著色劑等藥學(xué)上的常規(guī)賦型劑。用于口服的固體劑型包括粉劑、膠囊和片劑。固體劑型可以通過(guò)混合一種或多種適宜的賦形劑(如淀粉、葡萄糖、微晶纖維素、稀釋劑、粒化劑、潤(rùn)滑劑、粘合劑和崩解劑等)進(jìn)行制備。固體劑型比液體劑型更適于口服。其中使用固體的藥學(xué)載體的片劑和膠囊是口服的最方便的形式。如果需要，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的水性技術(shù)或非水性技術(shù)來(lái)包被片劑。腸胃外施用的載體包括水、適宜的油、鹽水、水溶性葡萄糖或乙二醇等。可以另外含有穩(wěn)定劑和防腐劑。諸如亞硫酸氫鈉，亞硫酸鈉和抗壞血酸等抗氧化劑是適宜的穩(wěn)定劑。防腐劑的例子包括苯扎氯銨(benzalconium chloride)、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和氯代丁醇。還可以采用下面文獻(xiàn)中所列的其他藥學(xué)上可接受的載體(Remington’s pharmaceutical sciences，19th ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA，1995)。
上述黑米提取物、花葵素或花青素苷可以以食品組合物的形式提供，用于預(yù)防和治療過(guò)敏性疾病。本發(fā)明的食品組合物包括功能性食品、營(yíng)養(yǎng)添加劑、健康食品和食品添加劑等所有可能的類(lèi)型?？梢愿鶕?jù)相關(guān)領(lǐng)域公知的常規(guī)方法將這些食品組合物制成各種形式。例如，作為健康食品，本發(fā)明提取物本身可以被制成茶、汁和飲料的形式或顆粒、膠囊和粉末的形式。
為制備功能性食品，可以將本發(fā)明的提取物或化合物加入以下物質(zhì)中飲料(包括酒精飲料)，水果及其加工食品(例如罐頭水果、瓶裝食品、果醬和果子醬等)，魚(yú)、肉及其加工食品(例如火腿、香腸和咸牛肉等)，面包和面條(小麥面條、蕎麥面條、拉面(ramyun)、意大利式細(xì)面條和通心面等)，果汁，各種飲料，餅干，面筋，乳制品(例如黃油和奶酪等)，植物油，人造奶油，植物蛋白，經(jīng)高壓殺菌的食品，冷凍食品和各種調(diào)味品(例如豆醬、醬油和調(diào)味汁等)等。
為了用作食品添加劑，本發(fā)明的提取物或化合物被優(yōu)選制成粉末或濃縮物形式。
在本發(fā)明的食品組合物中，本發(fā)明的提取物或化合物的優(yōu)選含量為占該組合物總重量的1重量％～90重量％。更優(yōu)選為10重量％～50重量％。如上面所解釋的那樣，黑米提取物、花葵素或花青素苷抑制嗜酸粒細(xì)胞(炎癥誘發(fā)細(xì)胞)的聚集和組織炎癥，因而包含上述黑米提取物、花葵素或花青素苷的健康食品組合物能有效地用作預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病的補(bǔ)充物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供黑米提取物、花葵素或花青素苷的治療性用途。特別地，本發(fā)明提供花葵素或花青素苷在制備抑制所需的細(xì)胞、組織或個(gè)體中嗜酸粒細(xì)胞聚集的治療劑中的用途。除了花葵素或花青素苷以外，所述的治療劑還可以進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的載體。所述藥學(xué)上可接受的載體已在上面舉例說(shuō)明。
本發(fā)明還提供黑米提取物、花葵素或花青素苷在制備預(yù)防和治療過(guò)敏性疾病的治療劑中的用途。所述的過(guò)敏性疾病已在上面舉例說(shuō)明。


圖1是一組顯微照片，該顯微照片顯示用黑米提取物處理由卵清蛋白誘發(fā)哮喘的小鼠后，對(duì)該小鼠肺部炎癥的抑制。
A野生型小鼠，B由卵清蛋白誘發(fā)哮喘的小鼠，C用黑米提取物(10mg/kg)處理的小鼠。
圖2顯示用花色素苷類(lèi)化合物處理由卵清蛋白誘發(fā)哮喘的小鼠后，分別對(duì)小鼠氣道內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞聚集的抑制率。
1野生型小鼠，2由卵清蛋白誘發(fā)哮喘的小鼠，3用花葵素(0.5mg/kg)處理后的小鼠，4用花葵素(1.25mg/kg)處理后的小鼠，
5用甲基花青素(0.5mg/kg)處理后的小鼠，6用甲基花青素(1.25mg/kg)處理后的小鼠，7用花翠素(0.5mg/kg)處理后的小鼠，8.用花翠素(1.25mg/kg)處理后的小鼠。
圖3是一組顯微照片，該顯微照片顯示用花葵素處理由卵清蛋白誘發(fā)哮喘的小鼠后，對(duì)小鼠肺部炎癥的抑制。
A野生型小鼠，B由卵清蛋白誘發(fā)哮喘的小鼠，C用花葵素(1.25mg/kg)處理后的小鼠，D用花翠素(1.25mg/kg)處理后的小鼠。
圖4是一組顯微照片，該顯微照片顯示用花青素苷處理由卵清蛋白誘發(fā)哮喘的小鼠后，對(duì)小鼠肺部炎癥的抑制。
A野生型小鼠，B由卵清蛋白誘發(fā)的哮喘小鼠，C用花青素苷(1.5mg/kg)處理后的小鼠，D用花青素苷(4.5mg/kg)處理后的小鼠。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明將通過(guò)下面的實(shí)施例進(jìn)行更詳細(xì)的描述。但是，下面顯示的實(shí)施例只是用以說(shuō)明本發(fā)明；本發(fā)明的范圍不應(yīng)該被解釋為僅限于此。
<實(shí)施例1>黑米提取物的制備將黑米(韓國(guó)生產(chǎn)，京東市場(chǎng)，韓國(guó)漢城)粉碎，向其中加入100％乙醇，然后在35℃提取7小時(shí)。蒸發(fā)獲得的提取物，冷凍干燥剩余物，獲得粉末狀黑米提取物。
<實(shí)施例2>黑米提取物對(duì)哮喘的抑制作用的檢測(cè)在該實(shí)施例中，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以研究黑米提取物是否能夠通過(guò)抑制由卵清蛋白誘發(fā)哮喘的小鼠的炎癥從而抑制過(guò)敏性哮喘。
首先，為制備哮喘動(dòng)物模型，將200μl卵清蛋白溶液(將200μg的卵清蛋白和1000μg的氧化鋁凝膠溶解于生理鹽水中)分別注入20只10周齡的雌鼠(C57BL/6，Damul Science，大田，韓國(guó))的腹腔中。兩周后，用200μl卵清蛋白溶液(2％w/v(重量/體積))噴灑每只小鼠使其致敏。在第21天、22天、23天再用200μl的1％卵清蛋白溶液噴射，在第25天再用10％卵清蛋白溶液噴灑以進(jìn)行致敏。
用10％卵清蛋白致敏誘發(fā)哮喘的上述小鼠被分成兩組，一組用作不進(jìn)行任何試劑處理的陰性對(duì)照，另一組用10mg/kg黑米提取物進(jìn)行處理。通過(guò)腹膜內(nèi)注射來(lái)施用黑米提取物，在第24天和第25天對(duì)卵清蛋白處理后的小鼠進(jìn)行兩次注射。
用黑米提取物處理后48小時(shí)，用醚(ether)殺死小鼠。研究每只小鼠肺部的炎癥。結(jié)果如圖1所示，與野生型的正常小鼠(見(jiàn)圖1A)相比，由卵清蛋白(哮喘誘發(fā)抗原)誘發(fā)哮喘的小鼠的支氣管炎癥明顯加重(見(jiàn)圖1B)。但是，黑米提取物的施用明顯減輕支氣管炎癥(見(jiàn)圖1C)。因此，證實(shí)了黑米提取物能夠有效地抑制哮喘。
<實(shí)施例3>黑米提取物中所含有的花葵素對(duì)氣道內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞聚集的作用具有上述哮喘抑制作用的黑米提取物的主要成分是花色素苷類(lèi)化合物。在該實(shí)施例中，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，研究了黑米提取物的主要活性成分花色素苷類(lèi)化合物是否能夠抑制哮喘，以及明確是哪種花色素苷確實(shí)可以抑制哮喘。
采用與上述實(shí)施例2相同的方法誘發(fā)小鼠哮喘，然后將所述小鼠分成四組，一組用作陰性對(duì)照，其他三組用作實(shí)驗(yàn)組，分別進(jìn)行甲基花青素、花翠素和花葵素(0.5mg/kg，1.25mg/kg)處理。通過(guò)腹膜腔內(nèi)注射來(lái)施用每組化合物，在用卵清蛋白處理后的第24天和第25天，對(duì)小鼠進(jìn)行兩次注射。
處理后的第二天，用醚殺死每只小鼠。然后，將微型管與氣管相連。通過(guò)所述微型管注射PBS(磷酸鹽緩沖鹽水，0.8ml)，并通過(guò)該微型管進(jìn)行回收，重復(fù)兩次，獲得支氣管肺泡沖洗液(BALF)。離心該沖洗液，以分離氣道內(nèi)腔細(xì)胞以及從細(xì)胞和肺部分泌的各種蛋白。
用細(xì)胞離心涂片器(cytospin)將分離的細(xì)胞固定在載玻片上，并用Diff-quick染色溶液染色。用連接在Carzeiss顯微鏡(型號(hào)AXIOVERT25-CEL)上的數(shù)碼相機(jī)拍照。每個(gè)樣本挑選5個(gè)隨機(jī)區(qū)域，進(jìn)行嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，在圖2中顯示每個(gè)樣本中的嗜酸粒細(xì)胞百分比。
如圖2所示，接觸卵清蛋白的小鼠氣道內(nèi)的嗜酸粒細(xì)胞百分比為58％。相反地，在采用花葵素、甲基花青素和花翠素等花色素苷處理過(guò)的各組小鼠中，其氣道內(nèi)的嗜酸粒細(xì)胞聚集則受到抑制。特別地，在施用0.5mg/kg和1.25mg/kg的花葵素的情況中，其氣道內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞百分比分別降至30％和20％。證實(shí)了花葵素與其它花色素苷類(lèi)化合物相比能更有效地抑制氣道內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞的聚集。
<實(shí)施例4>花葵素對(duì)哮喘炎癥的抑制作用在該實(shí)施例中，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，研究了先前已被證實(shí)大量地抑制氣道內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞聚集的花葵素是否能夠通過(guò)抑制肺部的炎癥來(lái)抑制過(guò)敏性哮喘。
將如上述實(shí)施例2的由10％卵清蛋白誘發(fā)哮喘的小鼠分成三組；第一組用作不進(jìn)行任何試劑處理的陰性對(duì)照，第2組用作陽(yáng)性對(duì)照，用1.25mg/kg花翠素進(jìn)行處理，第3組用1.25mg/kg花葵素進(jìn)行處理。在卵清蛋白處理后的第24天和第25天，通過(guò)腹膜腔內(nèi)注射對(duì)小鼠施用兩次上述每種化合物。
用每種化合物處理后48小時(shí)，用醚殺死小鼠。研究每只小鼠肺部的炎癥。結(jié)果如圖3所示，與正常的野生型小鼠相比(見(jiàn)圖3A))，在由卵清蛋白(哮喘誘發(fā)抗原)誘發(fā)的小鼠中，支氣管炎癥顯著加重(見(jiàn)圖3B))。另一方面，花葵素的施用顯著減輕炎癥(見(jiàn)圖3C)。在用1.25mg/kg和0.5mg/kg的花葵素處理過(guò)的兩組中，花葵素的炎癥抑制作用是顯著的(數(shù)據(jù)未顯示)。相反地，花翠素(另外一種花色素苷)(1.25mg/kg)沒(méi)有明顯地抑制支氣管炎癥(圖3D)。
<實(shí)施例5>黑米提取物中的花青素苷對(duì)氣道內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞聚集和對(duì)哮喘炎癥的抑制作用在該實(shí)施例中，研究了黑米提取物中含有的花青素苷對(duì)氣道內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞聚集和對(duì)哮喘的抑制能力。
為制備哮喘動(dòng)物模型，在實(shí)驗(yàn)第1天和第10天，將0.5ml的卵清蛋白溶液(將500μg的卵清蛋白和10mg的氧化鋁凝膠溶解于1ml的PBS溶液中)分別注入20只5周齡的雌鼠(Balb/c，Orient，漢城)腹腔內(nèi)。在第21、22、23天，用所述卵清蛋白溶液噴灑每只小鼠以誘發(fā)哮喘。
將采用卵清蛋白誘發(fā)哮喘的小鼠(n＝15)被分成三組，一組用作不進(jìn)行任何試劑處理的陰性對(duì)照，另兩組用作實(shí)驗(yàn)組，每組分別用1.5mg/kg和4.5mg/kg花青素苷進(jìn)行處理。從第2天到第23天，一天一次連續(xù)口服施用花青素苷。
最后一次致敏后24小時(shí)，用醚殺死每只小鼠，然后，將微型管與氣管相連。通過(guò)所述微型管注射0.8ml的PBS，并由該微型管進(jìn)行回收，重復(fù)兩次，將獲得的支氣管肺泡沖洗液(BALF)離心，以分離氣道內(nèi)腔細(xì)胞和從細(xì)胞及肺部分泌的各種蛋白。
用細(xì)胞離心涂片器將分離的細(xì)胞固定在載玻片上，并用Diff-quick染色溶液染色。用連接在Carzeiss顯微鏡(型號(hào)AXIOVERT 25-CEL)上的數(shù)碼相機(jī)拍照。每個(gè)樣本挑選5個(gè)隨機(jī)區(qū)域，進(jìn)行嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)樣本中的嗜酸粒細(xì)胞百分比顯示在表1中。
<表1>

如表1所示，接觸卵清蛋白的小鼠的氣道內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞百分比(陰性對(duì)照)是63％，而嗜酸粒細(xì)胞在氣道內(nèi)的聚集被證實(shí)受到所施用的花青素苷的抑制。準(zhǔn)確地，隨著花青素苷濃度的增加，嗜酸粒細(xì)胞在氣道內(nèi)的百分比與陰性對(duì)照相比，分別降到49％和38％。證實(shí)了花青素苷有效地抑制氣道內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞的聚集。還分析了被殺死小鼠的肺細(xì)胞中的炎癥，結(jié)果在圖4中顯示。如圖4所示，與正常的野生型小鼠相比(圖4A)，在由卵清蛋白(哮喘誘發(fā)抗原)(圖4B)誘發(fā)的小鼠中，支氣管炎癥顯著加重。但是，花青素苷的施用明顯減輕了所述炎癥(圖4C和圖4D)。
<實(shí)施例6>含有本發(fā)明的黑米提取物的飲料組合物的制造通過(guò)將在上面實(shí)施例1中獲得的黑米提取物(25％)、維生素A(0.15％)、維生素D(0.2％)、維生素B2(0.15％)，維生素C(2.0％)，?；撬?3.0％)，聚葡萄糖(2.5％)和純化水混合在一起，制備飲料組合物。
工業(yè)實(shí)用性如上所述，已經(jīng)證實(shí)了花葵素和花青素苷或包含花葵素和花青素苷的黑米提取物能夠抑制組織內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞的聚集并由此對(duì)過(guò)敏性炎癥具有抑制作用。因此，本發(fā)明的花葵素、花青素苷或黑米提取物能有效地用于預(yù)防或治療伴有組織炎癥和嗜酸粒細(xì)胞聚集的過(guò)敏性疾病。所述疾病例如，過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏性結(jié)膜炎、哮喘、慢性梗阻性肺部疾病、特應(yīng)性皮炎和過(guò)敏性腹瀉等。
權(quán)利要求
1.預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病的方法，該方法包括對(duì)需要的個(gè)體施用有效量的黑米提取物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的黑米提取物包括由式1表示的花葵素或由式2表示的花青素苷。
3.預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病的方法，該方法包括對(duì)需要的個(gè)體施用有效量的由式1表示的花葵素、其藥學(xué)上可接受的鹽或糖苷， <式1>
4.預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病的方法，該方法包括對(duì)需要的個(gè)體施用有效量的由式2表示的花青素苷或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中所述的花青素苷為花青素3-O-β-吡喃葡糖苷， <式2>
5.抑制細(xì)胞、組織或機(jī)體內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞聚集的方法，該方法包括對(duì)需要的個(gè)體施用由式1表示的花葵素、其藥學(xué)上可接受的鹽或糖苷。
6.抑制細(xì)胞、組織或機(jī)體內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞聚集的方法，該方法包括對(duì)需要的個(gè)體施用由式2表示的花青素苷或其藥學(xué)上可接受的鹽。
7.如權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述的過(guò)敏性疾病選自支氣管哮喘、慢性梗阻性肺部疾病、枯草熱、血管運(yùn)動(dòng)神經(jīng)性鼻炎、肥厚性鼻炎、過(guò)敏性支氣管炎、短暫性肺部浸潤(rùn)、過(guò)敏性胃炎、過(guò)敏性腹瀉、過(guò)敏性口腔炎、腸紫癜、結(jié)節(jié)性動(dòng)脈周?chē)住㈤]塞性動(dòng)脈內(nèi)膜炎、心絞痛、心內(nèi)膜炎、蕁麻疹、血管神經(jīng)性水腫、結(jié)節(jié)性紅斑、紫癜、特應(yīng)性皮炎、水皰、交感性眼炎、過(guò)敏性結(jié)膜炎和過(guò)敏性角膜炎。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述的過(guò)敏性疾病是支氣管哮喘或慢性梗阻性肺部疾病。
9.預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病的組合物，該組合物包含選自由黑米提取物、由式1表示的花葵素和由式2表示的花青素苷組成的組中的一種或多種。
10.黑米提取物在制備預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病的治療劑中的用途。
11.花葵素、其藥學(xué)上可接受的鹽或糖苷在制備預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病的治療劑中的用途。
12.花青素苷在制備預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病治療劑中的用途，其中所述的花青素苷為花青素3-O-β-吡喃葡糖苷。
13.如權(quán)利要求10～12任一項(xiàng)所述的用途，其中，所述的過(guò)敏性疾病選自支氣管哮喘、慢性梗阻性肺部疾病、枯草熱、血管運(yùn)動(dòng)神經(jīng)性鼻炎、肥厚性鼻炎、過(guò)敏性支氣管炎、短暫性肺部浸潤(rùn)、過(guò)敏性胃炎、過(guò)敏性腹瀉、過(guò)敏性口腔炎、腸紫癜、結(jié)節(jié)性動(dòng)脈周?chē)住㈤]塞性動(dòng)脈內(nèi)膜炎、心絞痛、心內(nèi)膜炎、蕁麻疹、血管神經(jīng)性水腫、結(jié)節(jié)性紅斑、紫癜、特應(yīng)性皮炎、水皰、交感性眼炎、過(guò)敏性結(jié)膜炎和過(guò)敏性角膜炎。
14.由式1表示的花葵素、其藥學(xué)上可接受的鹽或糖苷在制備抑制所需細(xì)胞、組織或個(gè)體內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞聚集的治療劑中的用途。
15.由式2表示的花青素苷或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備抑制所需細(xì)胞、組織或個(gè)體內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞聚集的治療劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用黑米提取物預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病的組合物及該組合物的治療用途。更確切地說(shuō)，本發(fā)明涉及預(yù)防或治療過(guò)敏性疾病的組合物，該組合物含有下述物質(zhì)作為有效成分花葵素(pelargonidin)、花青素苷(cyanidin glycoside)或含有花葵素和花青素苷的黑米提取物；本發(fā)明還涉及所述組合物的治療用途?；?、花青素苷或含有花葵素和花青素苷黑米提取物抑制組織內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞的聚集，并由此對(duì)過(guò)敏性炎癥具有抑制作用，因而可將上述物質(zhì)有效地用于預(yù)防或治療與炎癥和嗜酸粒細(xì)胞聚集有關(guān)的過(guò)敏性疾病，所述的過(guò)敏性疾病例如過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏性結(jié)膜炎、哮喘、慢性梗阻性肺部疾病、特應(yīng)性皮炎、過(guò)敏性腹瀉等。
文檔編號(hào)A61K36/00GK1784224SQ200480011842
公開(kāi)日2006年6月7日 申請(qǐng)日期2004年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月4日
發(fā)明者金宰弘 申請(qǐng)人:塞爾米科斯株式會(huì)社