專利名稱：引起嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(sars)的冠狀病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒學(xué)領(lǐng)域，更具體涉及新的冠狀病毒。具體提供編碼病毒蛋白(部分)的序列。此外，本發(fā)明涉及用于診斷、預(yù)防和/或治療疾病，具體是呼吸道疾病(非典型肺炎)，具體是哺乳動(dòng)物的，更具體是人的該疾病的診斷方式和方法，預(yù)防方式和方法和治療方式和方法。本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及干擾素的用途，優(yōu)選聚乙二醇化的干擾素用于預(yù)防或治療感染冠狀病毒的動(dòng)物，優(yōu)選脊椎動(dòng)物，更優(yōu)選鳥類或哺乳動(dòng)物，尤其是人，猿或嚙齒動(dòng)物，更具體是感染SARS相關(guān)的冠狀病毒(SARS-CoV)的動(dòng)物，優(yōu)選人。
最近，由于一種新的病毒在人體的致病作用結(jié)合相對(duì)容易的飛沫傳播而導(dǎo)致全球健康危機(jī)。該病毒首先在中國(guó)廣東省發(fā)現(xiàn)，在2003年2月傳播到香港，在兩個(gè)月內(nèi)其擴(kuò)散到全世界數(shù)個(gè)國(guó)家，導(dǎo)致2300例感染者中78例死亡(New Scientist Online News 1325 02 April2003)。該病毒被命名為SARS(嚴(yán)重急性呼吸綜合癥)病毒并導(dǎo)致人的呼吸疾病(非典型肺炎)。該病癥通常以發(fā)熱開始，有時(shí)伴隨寒冷或其他癥狀，包括頭疼、皮疹、腹瀉、感覺不適(不舒服)和軀體疼痛。一些人還在發(fā)病初期感受到輕微的呼吸綜合癥。
2到7天后，SARS病人發(fā)展為干咳，伴隨有或發(fā)展到?jīng)]有充足的氧氣進(jìn)入血液，可見為呼吸急促。在10％到20％的情況中，病人需要機(jī)械強(qiáng)制呼吸，最終該疾病可能導(dǎo)致病人死亡。醫(yī)院人員，兒童，老人和患有例如糖尿病或心臟病的人，或免疫系統(tǒng)低下的人形成高危人群?？雌饋斫?jīng)常發(fā)生與其他病原體的共同感染，尤其是與機(jī)會(huì)致病微生物，如人肺炎后病毒(human metapneumovirus)(hMPV)，衣原體等。
該病毒的潛伏期通常為2-7天，該疾病通過感染SARS的病人咳嗽或打噴嚏的飛沫在空氣中傳播。
目前尚未知該疾病是否可治愈。已經(jīng)使用了數(shù)種抗病毒療法，但結(jié)果各不相同。
此外，為防止疾病的傳播，重要的是能夠在早期識(shí)別該疾病。只有這樣才可以采取充分的措施隔離病人并開始隔離檢疫。目前還沒有適當(dāng)診斷工具。
因此，對(duì)開發(fā)該疾病的診斷工具和治療有著很大的需求。
本發(fā)明提供屬于冠狀病毒的分離的實(shí)質(zhì)為哺乳動(dòng)物的正義單鏈RNA病毒的核苷酸序列，該RNA病毒是SARS的致病因子。從該病毒序列(

圖1)的系統(tǒng)發(fā)生分析來看，該病毒處于一方面由TGEV(傳染性胃腸炎病毒)，PEDV(豬流行性腹瀉病毒)和229E(人冠狀病毒229E)形成的組，和另一方面由BoCo(牛冠狀病毒)和MHV(鼠肝炎病毒)形成的組，以及另外一方面AIBV(禽感染性支氣管病毒)之間的中間物?？偟膩碚f，牛冠狀病毒看起來更相似(至少對(duì)于病毒復(fù)制酶蛋白而言)。
盡管系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析提供了鑒定病毒如SARS病毒的方便方法，此處還提供其他幾種雖然有些粗糙但可能更直接的鑒定所述病毒或所述病毒的蛋白和核酸的方法。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，SARS病毒可以通過將待鑒定的病毒、蛋白或核酸與此處鑒定的病毒蛋白或核酸的序列同源性百分比而鑒定。已知病毒種類，尤其RNA病毒，經(jīng)常構(gòu)成其中一群所述病毒顯示與其他成員異質(zhì)性的準(zhǔn)種類。因此預(yù)期各分離株可能與此處提供的分離株的序列具有一定百分比的差異。
當(dāng)試圖將病毒分離株與圖2所列的序列進(jìn)行比較時(shí)，本發(fā)明提供屬于冠狀病毒的分離的實(shí)質(zhì)為哺乳動(dòng)物的正義單鏈RNA病毒(SARS)，該病毒還可以通過測(cè)定所述病毒的核酸序列，以及測(cè)定該核酸序列與圖2所列的序列的核酸一致性百分?jǐn)?shù)，比與BoCo，AIPV和PEDV的鑒定的核酸一致性百分?jǐn)?shù)高，從而鑒定與冠狀病毒在系統(tǒng)發(fā)生上是對(duì)應(yīng)的。相似的，屬于冠狀病毒的分離的實(shí)質(zhì)為哺乳動(dòng)物的正義單鏈RNA病毒(SARS)，其還可以通過測(cè)定所述病毒的氨基酸序列，以及測(cè)定該氨基酸序列與圖2所列的氨基酸序列的同源性百分比，基本上比此處提供的與BoCo，AIPV和PEDV比較的百分比高，從而鑒定與冠狀病毒在系統(tǒng)發(fā)生上是對(duì)應(yīng)的。
在該SARS病毒序列信息的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供用于診斷、預(yù)防和/或治療疾病，尤其是呼吸疾病(非典型肺炎)，具體是哺乳動(dòng)物，更具體是人的呼吸疾病的診斷方式和方法，預(yù)防方式和方法和治療方式和方法。在病毒學(xué)中，最提倡的是特定病毒感染的診斷、預(yù)防和/或治療以對(duì)導(dǎo)致所述感染的特定病毒最特異性的試劑來進(jìn)行。這種情況下這表明優(yōu)選SARS病毒感染的診斷、預(yù)防和/或治療以對(duì)SARS病毒最特異性的試劑來完成。然而這不排除特異性稍弱但足夠交叉反應(yīng)的試劑被替代使用，例如，由于它們最容易獲得和足以解決緊迫的問題。例如本發(fā)明提高動(dòng)物，具體是哺乳動(dòng)物，更具體是人類的SARS感染的病毒學(xué)診斷的方法，包括通過將樣品與SARS特異性核酸與本發(fā)明的抗體反應(yīng)來測(cè)定所述動(dòng)物的樣品中病毒分離株或其組分的存在；以及血清學(xué)診斷哺乳動(dòng)物SARS感染的方法，包括通過將所述樣品與本發(fā)明的SARS病毒特異的蛋白類(proteinaceous)分子或其片段或抗原反應(yīng)來測(cè)定所述哺乳動(dòng)物樣品中特異性針對(duì)SARS病毒或其組分的抗體的存在。
本發(fā)明還提供診斷SARS感染的試劑盒，包含本發(fā)明的SARS病毒，SARS病毒特異的核酸，蛋白類分子或其片段，抗原和/或抗體，優(yōu)選是檢測(cè)所述SARS病毒，SARS病毒特異的核酸，蛋白類分子或其片段，抗原和/或抗體的方式，所述方式例如包括本領(lǐng)域使用的可激發(fā)的基團(tuán)如熒光團(tuán)和酶檢測(cè)系統(tǒng)(合適的診斷試劑盒形式的例子包括IF，ELISA，中和分析，RT-PCR分析)。為測(cè)定是否尚未鑒定的病毒組分或其合成的類似物例如核酸，蛋白類分子或其片段可以被鑒定為SARS病毒特異的，使用例如此處提供的系統(tǒng)發(fā)生分析，通過序列同源性比較，將所述組分的核酸或氨基酸序列，例如一段核酸或氨基酸，優(yōu)選至少10個(gè)，更優(yōu)選至少25個(gè)，更優(yōu)選至少40個(gè)核苷酸或氨基酸(分別)，與提供的SARS病毒序列比較，和與已知的非SARS病毒序列(優(yōu)選使用BoCo)比較來分析是足夠的。根據(jù)與SARS或非SARS病毒序列相關(guān)程度，可以鑒定組分或合成的類似物。
因此本發(fā)明提供新的致病因子的核苷酸序列，分離的屬于冠狀病毒科的實(shí)質(zhì)為哺乳動(dòng)物的正義單鏈RNA病毒(此處也稱作SARS病毒)，和SARS病毒特異的組分或其合成的類似物。冠狀病毒首先在1937年從雞中分離到，而第一個(gè)人冠狀病毒的體外增殖由Tyrell和Bonoe在1965年完成?，F(xiàn)在這一家族大約有13個(gè)種，其感染牛，豬，嚙齒動(dòng)物，貓，狗，鳥和人。冠狀病毒顆粒是不規(guī)則形狀的，直徑大約60-220nm，具有帶區(qū)別性‘棒狀’的包膜粒(在遠(yuǎn)端為大約20nm長(zhǎng)和10nm寬)的外膜。該“冠狀”的外觀使得這一家族命名為冠狀病毒。外膜帶有兩種糖蛋白S，與細(xì)胞融合相關(guān)的刺突糖蛋白，其是主要的抗原，和M，膜糖蛋白，其與出芽和外膜形成有關(guān)。基因組與命名為N的堿性磷蛋白有關(guān)。冠狀病毒的基因組，單鏈正義RNA，長(zhǎng)度通常為27-31Kb并包含5＇甲基化的帽和3′poly-A尾，通過該RNA能直接在受感染的細(xì)胞中起mRNA作用。起初5′ORF 1(大約20Kb)被翻譯產(chǎn)生病毒聚合酶，其然后產(chǎn)生全長(zhǎng)負(fù)義鏈。負(fù)義鏈被用作模板產(chǎn)生作為“嵌套組”轉(zhuǎn)錄本的mRNA，所有的mRNA都具有相同的72核苷酸的5′非翻譯的前導(dǎo)序列和一致的3′多聚腺苷酸化的末端。如此產(chǎn)生的各mRNA是單順反子的，5′端的基因從最長(zhǎng)的mRNA開始翻譯等等。這些不平常的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)不是通過剪接產(chǎn)生，而是通過聚合酶在轉(zhuǎn)錄中產(chǎn)生。在各基因之間，存在重復(fù)的基因間序列-AACUAAAC-其與轉(zhuǎn)錄酶和細(xì)胞因子相互作用以剪接前導(dǎo)序列到各ORF的起點(diǎn)上。在一些冠狀病毒中，有大約8個(gè)ORFs，編碼上面提到的蛋白，還編碼血凝素酯酶(HE)，和若干其他機(jī)構(gòu)非機(jī)構(gòu)蛋白。當(dāng)包含的基因順序和/或氨基酸序列和/或核酸序列與原型SARS病毒充分相似時(shí)，新分離的病毒在系統(tǒng)發(fā)生上對(duì)應(yīng)于SARS病毒的，因此分類學(xué)上也對(duì)應(yīng)于SARS病毒。SARS病毒和到目前為止任何已知同一家族的其他病毒(BoCo或鼠肝炎病毒)之間的最高氨基酸序列同源性，對(duì)聚合酶蛋白部分而言為18-61％(同源性％，和病毒的同源性依賴于被檢查的聚合酶區(qū)域)，這可以通過比較圖2給出的序列與其他病毒尤其是BoCo和鼠肝炎病毒的比較而推導(dǎo)出。比提到的最高值分別具有更高同源性的單個(gè)蛋白和整個(gè)病毒分離株被認(rèn)為在系統(tǒng)發(fā)生上對(duì)應(yīng)于SARS病毒和因此分類學(xué)上對(duì)應(yīng)于SARS病毒，并通常由圖2顯示的序列結(jié)構(gòu)上對(duì)應(yīng)的核酸序列編碼。本發(fā)明提供系統(tǒng)發(fā)生學(xué)上對(duì)應(yīng)于圖2所示序列的分離的病毒的病毒。
應(yīng)該注意的是，與其他病毒相似，從不同來源分離到的SARS病毒之間將預(yù)期發(fā)現(xiàn)某種程度的變異。此外，如此處提供的SARS病毒的病毒序列或分離的SARS病毒基因的序列，例如分別與Genbank中找到的牛冠狀病毒或鼠肝炎病毒的各自核苷酸或氨基酸序列(例如登錄號(hào)NC_002306(BoCo)或NC_002645(MHV))顯示少于95％，優(yōu)選少于90％，更優(yōu)選少于80％，更優(yōu)選少于70％和最優(yōu)選少于65％的核苷酸序列同源性；或少于95％，優(yōu)選少于90％，更優(yōu)選少于80％，更優(yōu)選少于70％和最優(yōu)選少于65％的氨基酸序列同源性。
全世界SARS株的序列趨異性與其他冠狀病毒相比可能更高。
相當(dāng)數(shù)量的病毒分離株在本發(fā)明的前幾年被分離到，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些病毒具有上述相同的同源性。這些病毒的序列可以從GenBank登錄號(hào)AY274119(參見圖10)或AY278741或AY338175或AY338174或AY322199或AY322198或AY322197或AH013000或AY322208或AY322207 AY322206或AY322205或AH012999和/或以下網(wǎng)址中表示的序列http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？mode＝Undef&id＝227859&1v1＝3&keep＝1&srchmode＝1&unlock。由此本發(fā)明包括系統(tǒng)發(fā)生學(xué)上對(duì)應(yīng)于其序列如圖2所示的分離的病毒和/或例如GenBank登錄號(hào)AY274119或AY278741或AY338175或AY338174或AY322199或AY322198或AY322197或AH013000或AY322208或AY322207或AY322206或AY322205或AH012999和/或下列網(wǎng)址中所示序列http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？mode＝Undef&id＝227859&1v1＝3&keep＝1&srchmode＝1&unlock。
此處使用的術(shù)語(yǔ)“核苷酸序列同源性”顯示兩個(gè)(多)核苷酸之間存在的同源性。如果按照最大的對(duì)應(yīng)將兩個(gè)核苷酸序列比對(duì)時(shí)序列是相同的則多核苷酸具有“同源的”序列。兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸序列之間的比較通常通過在比較窗口比較兩個(gè)序列的部分以鑒定和比較局部序列區(qū)域的相似性來進(jìn)行。比較窗口通常大約20到200個(gè)連續(xù)的核苷酸。多核苷酸“序列相似性百分比”，例如百分之50，60，70，80，90，95，98，99或100序列相似性可以通過在比較窗口比對(duì)兩個(gè)最佳排列的序列而確定，其中在比較窗口的多核苷酸序列部分可以包括與參考序列(其不包括添加或刪除)相比的添加或刪除(即空隙)以使兩個(gè)序列的排列最優(yōu)化。百分比通過以下來計(jì)算(a)確定兩個(gè)序列上相同核酸堿基的位置的數(shù)目以得出匹配的位置的數(shù)目；(b)用匹配位置的數(shù)目除以比較窗口中位置的總數(shù)目；和(c)將上述的結(jié)果乘以100得到序列同源性的百分比。比較用序列排列的最優(yōu)化可以通過計(jì)算機(jī)化執(zhí)行已知道算法，或通過檢查來進(jìn)行。容易獲得的序列比較和多重序列排列算法分別是基本局部比對(duì)檢索工具(Basic Local Alignment SearchTool)(BLAST)(Altschul，S.F.等，1990.J.Mol.Biol.215403；Altschul，S.F.等，1997.Nucleic Acid Res.253389-3402)和ClustalW程序，兩者都可以從互聯(lián)網(wǎng)上獲得。其他合適的程序包括Wisconsin遺傳軟件包的GAP，BESTFIT和FASTA(遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(GCG)，Madison，WI，USA)。
這里使用的“基本上互補(bǔ)”指兩個(gè)核酸序列彼此具有至少大約65％，優(yōu)選大約70％，更優(yōu)選大約80％，再優(yōu)選90％，和最優(yōu)選大約98％的序列互補(bǔ)性。這表明引物和探針必須與其模板和靶核酸分別顯示有足夠的互補(bǔ)性以在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。因此，說明書公開的引物序列不需要反映模板結(jié)合區(qū)域的確切序列，并且可以使用簡(jiǎn)并引物?；净パa(bǔ)的引物序列是具有足夠序列互補(bǔ)性以擴(kuò)增模板產(chǎn)生引物結(jié)合和合成第二條鏈的引物。
術(shù)語(yǔ)“雜交物”指雙鏈核酸分子，或在互補(bǔ)的核苷酸之間通過氫鍵形成的雙鏈體。術(shù)語(yǔ)“雜交”或“退火”指單鏈核酸序列通過互補(bǔ)核苷酸之間的氫鍵形成雙螺旋區(qū)段的過程。
術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”指通過磷酸連接(如，磷酸二酯，烷基和芳基磷酸酯，硫代磷酸酯)或非磷酸連接(肽，氨基磺酸酯及其他)而結(jié)合的核苷酸單體的短序列(通常6到100個(gè)核苷酸)。寡核苷酸可以包含具有修飾的堿基(如5-甲基胞嘧啶)和修飾的糖基(如2′-O-甲基核糖基，2′-O-甲氧基乙基核糖基，2′-氟核糖基，2′-氨基核糖基等)的修飾的核苷酸。寡核苷酸可以包括天然產(chǎn)生的或合成的雙鏈或單鏈DNA和雙鏈和單鏈RNA分子，它們具有環(huán)狀，分支和線形形狀和任選包括能夠形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域(如，莖環(huán)和環(huán)-莖-環(huán)結(jié)構(gòu))。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“引物”指當(dāng)放置于誘導(dǎo)與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物合成的條件下，即，在存在核苷酸和聚合因子如DNA聚合酶的情況下以及在合適溫度和pH下能夠退火到擴(kuò)增靶使得DNA聚合酶附于其上作為DNA合成起始點(diǎn)的寡核苷酸。為獲得擴(kuò)增中最大的效率(擴(kuò)增)引物優(yōu)選是單鏈的。優(yōu)選引物是寡聚脫氧核糖核苷酸。引物必須足夠長(zhǎng)以在存在聚合因子的情況下引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。引物的具體長(zhǎng)度取決于許多因素，包括溫度和引物的來源。這里使用的“雙向引物對(duì)”指通常用在DNA擴(kuò)增如PCR擴(kuò)增中的一個(gè)正向和一個(gè)反向引物。
術(shù)語(yǔ)“探針”指能夠識(shí)別靶核酸序列分析物或其cDNA衍生物并與互補(bǔ)序列形成氫鍵鍵合的二鏈體的單鏈寡核苷酸序列。
術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)謹(jǐn)程度”或“嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件”指影響雜交物穩(wěn)定性的雜交條件，例如，溫度，鹽濃度，pH，甲酰胺濃度等。這些條件通過經(jīng)驗(yàn)優(yōu)化以達(dá)到引物或探針與其靶核酸序列特異結(jié)合的最大化和非特異結(jié)合的最小化。使用的術(shù)語(yǔ)包括探針或引物以可檢測(cè)的比其他序列大的程度(如至少是背景的兩倍)雜交到其靶序列的條件。嚴(yán)謹(jǐn)條件是序列依賴性的，并且在不同的環(huán)境中是不同的。更長(zhǎng)的序列在更高的溫度實(shí)現(xiàn)特異性雜交。通常，嚴(yán)謹(jǐn)條件通常選擇為在限定的離子強(qiáng)度和pH下大約比具體序列的熔點(diǎn)溫度(Tm)低大約5℃。Tm是其中50％的互補(bǔ)靶序列雜交到完全匹配的探針或引物的溫度(在限定的離子強(qiáng)度和pH下)。通常，嚴(yán)謹(jǐn)條件是在pH 7.0到8.3，對(duì)于短的探針或引物(如10到50個(gè)核苷酸)而言溫度至少大約30℃和對(duì)長(zhǎng)的探針或引物而言(如超過50個(gè)核苷酸)至少大約60℃，鹽濃度低于大約1.0M Na+離子，通常大約0.01到1.0M Na+離子濃度(或其他鹽)。嚴(yán)謹(jǐn)條件還可以通過添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺而完成。示例的低嚴(yán)謹(jǐn)性條件或“嚴(yán)謹(jǐn)性降低的條件”包括用30％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS的緩沖液在37℃雜交和用2×SSC在40℃清洗。示例的高嚴(yán)謹(jǐn)條件包括在50％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS在37℃雜交，和用0.1×SSC在60℃清洗。雜交方法是本領(lǐng)域公知的，并描述于例如Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons Inc.，1994。
術(shù)語(yǔ)“抗體”包括抗原結(jié)合形式的抗體(如Fab，F(xiàn)(ab)2)。術(shù)語(yǔ)“抗體”常常指基本上由免疫球蛋白基因及其片段編碼的多肽，其特異性結(jié)合和識(shí)別分析物(抗原)。然而，雖然各種不同的抗體片段可以一完整抗體的消化物形式定義，本領(lǐng)域技術(shù)人員能認(rèn)識(shí)到這樣的片段還可以從頭化學(xué)合成或利用重組DNA技術(shù)合成。因此，這里使用的術(shù)語(yǔ)抗體還包括例如單鏈Fv，嵌合抗體(即包含不同種類的恒定區(qū)和可變區(qū))，人源化抗體(即，包含來自非人源的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR))及其抗體復(fù)共軛對(duì)配合物(如雙特異性抗體)的抗體片段。
術(shù)語(yǔ)“干擾素”通常理解成已知具有不同生物活性的脊椎動(dòng)物糖蛋白和蛋白，所述活性例如至少在產(chǎn)生這些物質(zhì)的動(dòng)物種類中的抗病毒，抗增殖，和免疫調(diào)節(jié)活性。干擾素涉及一類由T細(xì)胞，纖維母細(xì)胞及其他細(xì)胞在病毒感染和其他生物學(xué)和合成的刺激作用下產(chǎn)生的小蛋白和糖蛋白細(xì)胞因子(15-28KD)。干擾素結(jié)合細(xì)胞膜上的特定受體；它們的作用包括誘導(dǎo)酶，抑制細(xì)胞增殖，抑制病毒增殖，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞胞吞作用，和提高T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。根據(jù)物理化學(xué)性質(zhì)，細(xì)胞來源，誘導(dǎo)模式和抗體反應(yīng)，干擾素被分為五個(gè)主要的類(α，β，γ，τ和ω)和幾個(gè)亞類(通過阿拉伯?dāng)?shù)字和字母表示)。
簡(jiǎn)單來說，本發(fā)明提供分離的實(shí)質(zhì)為哺乳動(dòng)物的正義單鏈RNA病毒(SARS)，其屬于冠狀病毒和通過測(cè)定所述病毒基因組的合適片段的核酸序列以及在系統(tǒng)發(fā)生樹分析中對(duì)其進(jìn)行測(cè)試而鑒定為系統(tǒng)發(fā)生上與冠狀病毒對(duì)應(yīng)，其中最大可能性樹使用100 bootstraps和jumbles產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)其在系統(tǒng)發(fā)生上與對(duì)應(yīng)于BoCo(牛冠狀病毒，如Genbank登錄號(hào)NC_002306)，MHV(鼠肝炎病毒，如登錄號(hào)NC_002645)，AIBV(禽傳染性支氣管病毒，如登錄號(hào)NC_001451)，PEDV(豬流行性腹瀉病毒)，TGEV(傳染性胃腸病毒，如登錄號(hào)no.NC 003436)或229E(人冠狀病毒229E，如登錄號(hào)NC_003045)的病毒分離株相比較而言更接近對(duì)應(yīng)于具有圖2所示序列的病毒分離株。上述所有具有GenBank登錄號(hào)的病毒序列據(jù)信在系統(tǒng)發(fā)生上對(duì)應(yīng)于圖2所示序列的病毒。
用于系統(tǒng)發(fā)生樹分析的各個(gè)合適的核酸基因組片段為例如任何在圖2中揭示的RAP-PCR片段EMC-1到-14和RDG-1，其導(dǎo)致圖1所示的系統(tǒng)發(fā)生樹分析。
合適的開放閱讀框(ORF)包括編碼病毒聚合酶的ORF(ORF 1a)。當(dāng)發(fā)現(xiàn)分析的聚合酶與具有包含圖2的氨基酸片段EMC-1，EMC-2，EMC-3，EMC-4，EMC-5，EMC-13和/或EMC-14具有至少60％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％的總氨基酸一致性時(shí)，分析的病毒分離株包含本發(fā)明的SARS病毒分離株。
另一個(gè)用于系統(tǒng)發(fā)生分析的合適的開放閱讀框(ORF)包括編碼N蛋白的ORF。當(dāng)發(fā)現(xiàn)分析的N蛋白與包含圖2的EMC-8序列編碼的N蛋白具有至少60％，更優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％的總氨基酸一致性時(shí)，則分析的病毒分離株包含本發(fā)明的SARS分離株。
用于系統(tǒng)發(fā)生分析另一合適的開放閱讀框(ORF)包括編碼刺突蛋白S的ORF。當(dāng)發(fā)現(xiàn)分析的S蛋白與包含圖2所示的S蛋白的EMC7的翻譯2序列和RDG1的翻譯1序列編碼的S蛋白具有至少60％，更優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％的總氨基酸一致性，則分析的病毒分離株包含本發(fā)明的SARS分離株。SARS病毒的SORF似乎位于臨近ORF lab(編碼病毒聚合酶)的位置，這將SARS病毒與牛冠狀病毒和鼠肝炎病毒區(qū)分開，并在S蛋白和病毒聚合酶之間具有2a基因和HE基因。
本發(fā)明還提供分離的或重組的核酸或其來自本發(fā)明病毒的病毒特異的功能性片段。分離的或重組核酸包含圖2所示的序列或能與該序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的同源物的序列。具體的，本發(fā)明提供適合鑒定SARS病毒核酸的引物和/或探針。
此外，本發(fā)明提供含有本發(fā)明核酸的載體。首先提供載體，例如包含SARS病毒基因組(部分)的質(zhì)粒載體，含SARS基因組(部分)的病毒載體(例如，但不限于痘病毒，反轉(zhuǎn)錄病毒，桿狀病毒)，或含其他病毒或其他病原體基因組(部分)的SARS病毒。
此外，本發(fā)明提高含本發(fā)明的核酸或載體的宿主細(xì)胞。含有SARS病毒聚合酶組分的質(zhì)?；虿《据d體在原核細(xì)胞中產(chǎn)生用于在相關(guān)細(xì)胞類型(細(xì)菌，昆蟲細(xì)胞，真核細(xì)胞)中表達(dá)組分。含SARS病毒基因組全長(zhǎng)或部分拷貝的質(zhì)?；虿《据d體在原核細(xì)胞中產(chǎn)生以用于在體外或體內(nèi)表達(dá)病毒核酸。后一載體可以含有其他病毒序列以產(chǎn)生嵌合病毒或嵌合病毒蛋白，可以缺少病毒基因組的部分以產(chǎn)生復(fù)制缺陷型的病毒，以及可以包含突變，缺失和插入以產(chǎn)生減毒病毒。
SARS病毒傳染性拷貝(野生型，減毒的，復(fù)制缺陷的或嵌合的)可使用上面描述的尖端技術(shù)通過共表達(dá)聚合酶組分而生產(chǎn)。
此外，可使用瞬間表達(dá)或穩(wěn)定表達(dá)一種或多種全長(zhǎng)或部分SARS病毒蛋白的真核細(xì)胞。這樣的細(xì)胞可通過轉(zhuǎn)染(蛋白或核酸載體)，感染(病毒載體)或轉(zhuǎn)導(dǎo)(病毒載體)而制備，并可用于完成上述野生型，減毒的，復(fù)制缺陷的或嵌合的病毒。
嵌合病毒可能對(duì)生產(chǎn)防護(hù)兩種或多種病毒的重組疫苗特別有用。例如，可以預(yù)想表達(dá)一種或多種人肺炎后病毒蛋白的SARS病毒載體或表達(dá)一種或多種SARS病毒蛋白的肺炎后病毒載體將保護(hù)接種有此種載體的個(gè)體免受以上兩種病毒的感染。這樣的特異性嵌合病毒對(duì)本發(fā)明是特別有用的，因?yàn)樵赟ARS病毒感染的病人中懷疑經(jīng)常發(fā)生例如人肺炎后病毒的共同感染。減毒的和復(fù)制缺陷的病毒可以如建議用于其他病毒的一樣以活疫苗用于免疫接種目的。最近，Subbarao，K.等，J.Virol.78(7)，3572-3577，2004)顯示小鼠可以受在先的全病毒免疫的保護(hù)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由本發(fā)明核酸編碼的蛋白類分子或冠狀病毒特異的病毒蛋白或其功能片段。有用的蛋白類分子例如來自本發(fā)明的病毒衍生的任何基因或基因組片段。此處提供的分子，或其抗原性片段，例如用于診斷方法或試劑盒和藥物組合物，例如亞單位疫苗和抑制肽。特別有用的是包含病毒聚合酶蛋白，刺突蛋白，核殼體或其抗原片段作為抗原或亞單位免疫原，但是也可以使用未活化的全病毒。特別有用的還是那些由鑒定用于系統(tǒng)發(fā)生分析的重組核酸片段編碼的蛋白類物質(zhì)，當(dāng)然優(yōu)選的是那些在用于系統(tǒng)發(fā)生分析的優(yōu)選ORF范圍內(nèi)，特別是在體內(nèi)(如用作保護(hù)性目的或提供診斷抗體)或體外(如通過噬菌體展示技術(shù)或其他用于產(chǎn)生合成抗體的技術(shù))引發(fā)SARS病毒特異的抗體。
此處還提供抗體，包括特異性地與含有蛋白類分子或其SARS病毒特異的功能性片段的抗原反應(yīng)的天然的多克隆或單克隆抗體，或合成的(如(噬菌體)文庫(kù)衍生的結(jié)合分子)抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠使用分離的病毒材料和/或重組表達(dá)的病毒蛋白開發(fā)(單克隆)抗體。Sui等(Proc.Natl.Acad.Sci.101(8)，2536-2541，2004)已經(jīng)通過噬菌體展示方法瞬時(shí)表達(dá)了刺突蛋白的片段并發(fā)現(xiàn)數(shù)個(gè)抗體。這些抗體之一顯示針對(duì)S(刺突)蛋白N末端261-672個(gè)氨基酸(其對(duì)應(yīng)于圖2所示的S蛋白EMC7翻譯2和RDG1翻譯1的序列)，并且該抗體還顯示具有中和性質(zhì)，表明其可能是成功的疫苗的候選物。此外Subbarao等(同上)也顯示來自SARS病毒感染的小鼠的血清由于中和抗體的存在能阻斷Vero細(xì)胞單層中100TCID50的SARS病毒的感染。
這樣的抗體還用于鑒定病毒分離株為SARS病毒的方法，包括將所述病毒分離株或其組分與此處提供的抗體反應(yīng)。這可以通過例如使用純化的或未純化的SARS病毒或其部分(蛋白，多肽)使用ELISA，RIA，F(xiàn)ACS或相似形式的抗原檢測(cè)分析(Current Protocols in Immunology)來完成。或者，被感染的細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物可以通過經(jīng)典的免疫熒光或免疫組化技術(shù)用于鑒定病毒抗原。這一方面特別有用的是針對(duì)SARS病毒蛋白的抗體，所述SARS病毒蛋白由包含一種或多種圖2所示片段的核苷酸序列編碼。
其他鑒定病毒分離株為SARS病毒的方法包括將所述病毒分離株或其組分與本發(fā)明的病毒特異的核酸反應(yīng)。
以這種方式本發(fā)明提供利用本發(fā)明方法可以鑒定病毒分離株為分類學(xué)上對(duì)應(yīng)于正義單鏈RNA病毒的哺乳動(dòng)物病毒，而正義單鏈RNA病毒鑒定為極可能屬于冠狀病毒科的SARS病毒屬。
這種方法在病毒學(xué)診斷哺乳動(dòng)物的SARS病毒感染的方法中有用，所述方法例如包括通過將所述樣品于本發(fā)明的核酸或抗體反應(yīng)，從而測(cè)定所述哺乳動(dòng)物樣品中病毒分離株或其組分的存在。
本發(fā)明的方法原則上可通過使用任何核酸擴(kuò)增方法進(jìn)行，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR；Mullis 1987，U.S.專利4,683,195，4,683,202，歐洲專利4,800,159)或通過使用擴(kuò)增反應(yīng)，例如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR；Barany 1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88189-193；EP專利申請(qǐng)320,308)，自維持的序列復(fù)制(3SR；Guatelli等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874-1878)，鏈置換擴(kuò)增(SDA；U.S.專利5,270,184，歐洲專利5,455,166)，轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS；Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173-1177)，Q-β復(fù)制酶(Lizardi等，1988，Bio/Technology 61197)，滾環(huán)擴(kuò)增(RCA；U.S.專利5,871,921)，基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)，切割酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(U.S.專利號(hào)5,719,028)，等溫和嵌合引物引發(fā)的核酸擴(kuò)增(ICAN)，分叉-延伸擴(kuò)增方法(RAM；U.S.專利5,719,028和5,942,391)或其他合適的用于核酸擴(kuò)增的方法。
為擴(kuò)增對(duì)一種或多種擴(kuò)增引物具有少量錯(cuò)配的核酸，擴(kuò)增反應(yīng)可以在嚴(yán)謹(jǐn)度降低的條件下進(jìn)行(如，使用38℃的退火溫度，或在存在3.5mM MgCl2的情況下進(jìn)行PCR擴(kuò)增)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠選擇合適的嚴(yán)謹(jǐn)度條件。
選擇此處引物使得與待擴(kuò)增的各具體序列的不同鏈上存在的它們的靶區(qū)域“基本上”互補(bǔ)(即，至少65％，更優(yōu)選至少80％互補(bǔ))。可以使用含例如肌醇?xì)埢虿淮_定的堿基的引物序列，或甚至是當(dāng)與靶序列比較時(shí)含有一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配的引物?？偟膩碚f，顯示與靶DNA或RNA寡核苷酸序列具有至少65％，優(yōu)選至少80％同源性的序列被考慮合適用于本發(fā)明的方法。當(dāng)使用低嚴(yán)謹(jǐn)度雜交條件時(shí)序列錯(cuò)配不是非常關(guān)鍵的。
擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)原則上可以通過任何合適的本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。檢測(cè)片段可以直接染色或標(biāo)記上放射性標(biāo)記物，抗體，發(fā)光染料，熒光染料或酶試劑。直接DNA染色包括例如嵌入染料如吖啶橙，溴化乙錠，單疊氮化乙錠或Hoechst染料。
此外，DNA或RNA片段可以通過將標(biāo)記的dNTP堿基摻入到合成的片段中而檢測(cè)?？梢越Y(jié)合核苷酸堿基的檢測(cè)標(biāo)記包括，例如熒光素，花青染料或BrdUrd。
使用基于探針的檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)，用于本發(fā)明的合適的檢測(cè)方法可以包括例如酶免疫分析(EIA)形式(Jacobs等，1997，J.Clin.Microbiol.35，791-795)。為通過EIA方法進(jìn)行檢測(cè)，使用在擴(kuò)增反應(yīng)中的正向或反向引物可以包括捕獲基團(tuán)，如生物素基團(tuán)以固定靶DNA PCR擴(kuò)增子到例如，鏈親和素包被的微量培養(yǎng)板的孔上用于后續(xù)的靶DNA擴(kuò)增子的EIA檢測(cè)(參見下文)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解在EIA中可以采用其他的將靶DNA PCT擴(kuò)增子固定化的基團(tuán)。
此處公開的用于檢測(cè)靶DNA的探針優(yōu)選只結(jié)合到被DNA擴(kuò)增方法擴(kuò)增的至少部分DNA序列區(qū)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠無需過多的實(shí)驗(yàn)，如此處所述，基于靶DNA的核苷酸序列制備用于檢測(cè)的合適的探針。此外，互補(bǔ)的核苷酸序列，無論DNA或RNA或靶DNA化學(xué)合成的類似物適合用作本發(fā)明方法中的種類特異的檢測(cè)探針，只要這樣的互補(bǔ)鏈在采用的擴(kuò)增反應(yīng)中得到擴(kuò)增。
用于此處的合適的檢測(cè)方法可以例如包括將擴(kuò)增子固定和通過例如Southern雜交探查其DNA序列。其他的形式可以包括上述的EIA形式。為方便檢測(cè)結(jié)合，特異的擴(kuò)增子檢測(cè)探針可以包括標(biāo)記部分例如熒光團(tuán)，生色團(tuán)，酶或放射標(biāo)記，從而利于監(jiān)控探針與擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)合。這樣的標(biāo)記物是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括例如異硫氰酸熒光素(FITC)，β-半乳糖苷酶，辣根過氧化物酶，鏈親和素，生物素，地高辛，35S或125I。其他的例子對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
檢測(cè)還可以通過稱作反向線雜交(reverse line blot)(RLB)的分析進(jìn)行，例如Van den Brule等(2002，J.Clin.Microbiol.40，779-787)的描述。為此，RLB探針優(yōu)選合成具有5′氨基以用于后續(xù)固定在例如羧基包被的尼龍膜上。RLB形式的優(yōu)點(diǎn)在于該系統(tǒng)容易使用，和速度，使得可以高通量處理樣品。
使用核酸探針檢測(cè)RNA或DNA片段是本領(lǐng)域公知的。大多數(shù)情況下這些方法包括靶核酸與探針雜交，接著進(jìn)行雜交后洗滌。特異性通常是雜交后洗滌的功能，關(guān)鍵的因素是離子強(qiáng)度和最終洗滌溶液的溫度。對(duì)核酸雜交物而言，Tm可以從Meinkoth和Wahl等式估計(jì)，Anal.Biochem.，138267-284(1984)Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中M是單價(jià)陽(yáng)離子的摩爾濃度，％GC是核酸中鳥嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，％甲酰胺是雜交溶液中甲酰胺的百分比，L是雜交物堿基對(duì)的長(zhǎng)度。Tm是50％互補(bǔ)的靶序列雜交到完全匹配的探針的溫度(在限定的離子強(qiáng)度和pH下)。對(duì)每1％錯(cuò)配Tm降低大于1℃，因此雜交和/或洗滌條件可以被調(diào)節(jié)為與所需的一致性的序列雜交。例如，如果需要具有＞90％一致性的序列，Tm可以降低10℃。通常，選擇嚴(yán)謹(jǐn)條件大約比特定序列和其互補(bǔ)序列在限定的離子強(qiáng)度和pH下的熔點(diǎn)溫度(Tm)低大約5℃。不過，非常嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件可以比熔點(diǎn)溫度(Tm)低1，2，3，4℃下進(jìn)行雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)謹(jǐn)度條件可以比熔點(diǎn)溫度(Tm)低6，7，8，9或10℃下進(jìn)行雜交和/或洗滌；低嚴(yán)謹(jǐn)度條件可以比熔點(diǎn)溫度(Tm)低11，12，13，14，15或20℃下進(jìn)行雜交和/或洗滌。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解使用上述等式，雜交和洗滌組合物和所需的Tm，在雜交和/或洗滌溶液中嚴(yán)謹(jǐn)程度的改變是內(nèi)在描述的。如果所需程度的錯(cuò)配產(chǎn)生Tm小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，優(yōu)選提高SSC濃度以使用更高的溫度。對(duì)核酸雜交的大量指導(dǎo)見于Tijssen，Laboratory Techniques inBiochemistm and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic AcidProbes，第一部分，第二章，“雜交原理總述和核酸探針分析策略”，Elsevier.New York(1993)；和Current Protocols in Molecular Biology，第二章，Ausubel等編輯，Greene Publishing and Wiley-Interscience，NewYork(1995)。
另一方面，本發(fā)明提供用于種屬檢測(cè)靶RNA或DNA的寡核苷酸探針。此處檢測(cè)探針被選擇為“基本”與通過本發(fā)明的擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的雙鏈核酸的一條鏈互補(bǔ)。優(yōu)選探針與固定的，如生物素標(biāo)記的，來自靶RNA或DNA的擴(kuò)增子的反義鏈基本互補(bǔ)。
允許本發(fā)明的檢測(cè)探針包含與其靶序列的一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配?？偟膩碚f，顯示與靶寡核苷酸序列至少65％，更優(yōu)選至少80％同源性的序列被考慮適合用于本發(fā)明的方法。單克隆和多克隆的抗體都可以用于本發(fā)明的檢測(cè)目的，例如，免疫分析，其中它們可以用于液相或結(jié)合到固相載體。此外，這些免疫分析中的單克隆抗體以各種方式可檢測(cè)地標(biāo)記?？梢允褂枚喾N免疫分析形式來選擇與特定蛋白(或其他分析物)特異性反應(yīng)的抗體。例如，固相ELISA免疫分析通常被用于選擇特異性與蛋白免疫反應(yīng)的單克隆抗體。參見Harlow和Lane，Antibodies，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications，New York(1988)，其描述可用于測(cè)得選擇性結(jié)合的免疫分析形式和條件。能夠利用本發(fā)明抗體的免疫分析類型的例子是直接或間接形式的競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析。這樣的免疫分析的例子是放射免疫分析(RIA)和夾心(免疫測(cè)定)分析。使用本發(fā)明的抗體檢測(cè)抗原可以使用以正向，反向或同時(shí)的模式運(yùn)行的免疫分析，包括生理樣品的免疫組化分析來完成。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，或可以容易地認(rèn)識(shí)其他的免疫分析形式而無需過多的實(shí)驗(yàn)。
抗體可以結(jié)合到許多不同的載體并用來檢測(cè)靶分子的存在。公知的載體的例子包括玻璃，聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，右旋糖苷，尼龍，淀粉酶，天然的和修飾的纖維素，聚丙烯酰胺，瓊脂糖和磁鐵。為本發(fā)明的目的載體的性質(zhì)可以是可溶的或不可溶的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解其他合適的結(jié)合單克隆抗體的載體，或能夠使用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)確知這些載體。
本發(fā)明還提供血清學(xué)診斷哺乳動(dòng)物SARS病毒感染的方法，包括通過將所述哺乳動(dòng)物的樣品與本發(fā)明的蛋白類分子或其片段或抗原反應(yīng)，從而測(cè)定所述樣品中特異性針對(duì)SARS病毒或其組分的抗體的存在。
此處提供的方法在診斷SARS病毒感染的診斷試劑盒中特別有用，不管是病毒學(xué)還是血清學(xué)的診斷。這樣的試劑盒或分析可以例如包括本發(fā)明的病毒，核酸，蛋白類分子或其片段，抗原和/或抗體。
還提供本發(fā)明的病毒，核酸，蛋白類分子或其片段，抗原，和/或抗體的用途以生產(chǎn)藥物組合物，例如，用于治療或預(yù)防SARS病毒感染和/或治療或預(yù)防非典型肺炎，特別是人的。優(yōu)選包含如圖2的EMC7序列的翻譯2和RDG序列的翻譯1所示的刺突蛋白的部分氨基酸序列的肽被用于制備治療性或預(yù)防性的肽。還優(yōu)選，包含如圖2的EMC7序列的翻譯2和RDG序列的翻譯1所示的刺突蛋白的氨基酸序列的蛋白被用于制備亞單位疫苗。此外，如圖2的EMC8的翻譯所示的冠狀病毒核殼體已知對(duì)引發(fā)針對(duì)冠狀病毒的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫特別有用，并可以用于制備亞單位疫苗。
病毒的減毒可以通過開發(fā)用于此目的的現(xiàn)成方法來完成，包括但不限于使用其他種類的相關(guān)病毒，通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或/和組織/細(xì)胞培養(yǎng)連續(xù)傳代，通過細(xì)胞培養(yǎng)在低于37℃(冷適應(yīng))連續(xù)傳代，分子克隆定點(diǎn)突變和相關(guān)病毒之間的基因或基因片段交換。
如Sui等(同上)所示，人源化的中和抗體已被制備，其顯示與SARS病毒刺突蛋白的N末端261-672個(gè)氨基酸反應(yīng)。
包含本發(fā)明的病毒，核酸，蛋白類分子或其片段，抗原和/或抗體的藥物組合物可以例如用于治療或預(yù)防SARS病毒感染和/或呼吸疾病的方法，包括向個(gè)體提供本發(fā)明的藥物組合物。當(dāng)所述個(gè)體包括人時(shí)這是最有用的。抗SARS病毒蛋白的抗體，尤其時(shí)抗SARS病毒刺突蛋白的抗體，優(yōu)選針對(duì)如圖2的EMC7的翻譯2和RDG的翻譯1所示氨基酸序列的抗體，也可以作為被動(dòng)疫苗用于預(yù)防或治療目的。從其他冠狀病毒已知刺突蛋白是非常有效的抗原，針對(duì)刺突蛋白的抗體可以用于預(yù)防和治療的免疫接種。
本發(fā)明還提供獲得用于治療非典型肺炎的抗病毒劑的方法，包括使用本發(fā)明的病毒建立細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物，用候選抗病毒劑處理所述培養(yǎng)物或動(dòng)物，并測(cè)定所述抗病毒劑對(duì)所述病毒的作用或其對(duì)培養(yǎng)物或動(dòng)物的感染。這樣的抗病毒劑的例子包括這里提供的SARS病毒中和抗體，或其功能性組分，但也獲得其他性質(zhì)的抗病毒劑。本發(fā)明還提供本發(fā)明的抗病毒劑在制備藥物組合物中的應(yīng)用，具體用于制備治療非典型肺炎，尤其是由SARS病毒感染引起的非典型肺炎的藥物組合物，并提供包含本發(fā)明的抗病毒劑的藥物組合物，用于治療或預(yù)防SARS病毒感染或非典型肺炎的方法，所述方法包括向個(gè)體提供這樣的藥物組合物。
具體地，本發(fā)明提供包含干擾素，尤其是聚乙二醇化的干擾素的藥物組合物。
通常，所有的干擾素形式對(duì)本發(fā)明都是有用的，因?yàn)橐阎械母蓴_素形式具有至少一些減輕病毒感染(癥狀)的活性。然而，應(yīng)該理解優(yōu)先使用來自受感染的宿主或處于被病毒感染的危險(xiǎn)的宿主的干擾素。此外，最優(yōu)選使用干擾素α，尤其是對(duì)影響人的冠狀病毒如SARS感染而言，人干擾素α。α干擾素是由人體在感染的刺激下產(chǎn)生的天然蛋白。其也被稱作干擾素α-2b。I類干擾素α家族由具有臨床價(jià)值的抗感染和抗腫瘤活性的小蛋白組成。應(yīng)該理解α干擾素可以單獨(dú)給藥或與β或γ干擾素共同給藥。
遺傳工程技術(shù)使得幾家公司可以大規(guī)模生產(chǎn)α干擾素，其被稱作重組人α干擾素，或簡(jiǎn)稱rhIFN或rIFN-α。它以商品名例如Viraferon(Schering-Plough生產(chǎn))，Roferon-A(Roche生產(chǎn))和Wellferon(GlaxoSmithKline生產(chǎn))。干擾素αN3，或Alferon N，是另外的干擾素α形式，來自人白血病并含有多個(gè)種類的干擾素α。
使用上述干擾素的一個(gè)缺點(diǎn)是血清的半壽期短和干擾素α蛋白被快速清除。然而已經(jīng)顯示聚乙二醇分子(PEG)連接到干擾素，產(chǎn)生使干擾素α-2a免受體內(nèi)蛋白酶快速降解的屏障并維持其在更長(zhǎng)的劑量期間內(nèi)穩(wěn)定抑制靶病毒的能力。
如上述已經(jīng)討論的蛋白例如干擾素的PEG化，被用于防止從血流中被快速清除并最終快速降解藥物。已經(jīng)顯示血清中半壽期延長(zhǎng)超過2倍(Shannon A.Marshall，Drug Discovery Today Volume 8，Issue 5，March 2003，212-221頁(yè))。聚乙二醇化的IFNα-2b具有相對(duì)與標(biāo)準(zhǔn)的IFNα-2b(7-9小時(shí))延長(zhǎng)的血清半壽期(40小時(shí))。聚乙二醇化的IFNα-2a的大小更大使得腎小球?yàn)V過降低，與標(biāo)準(zhǔn)的IFNα-2a(6-9小時(shí))相比顯著延長(zhǎng)其血清半壽期(72-96小時(shí))(Bruce A.Luxon MD ClinicalTherapeutics，Volume 24，Issue 9，September 2002，1363-1383頁(yè))。
蛋白的PEG化是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，標(biāo)準(zhǔn)的聚乙二醇化的干擾素可以從Roche(PEGASYS(干擾素α2a)和Schering-Plough(PEG-Intron A)商購(gòu)得到或研制中的PEG-Alfacon，聚乙二醇化形式的Infergen(R)(Interferon alfacon-1)(一種生物工程化的I型干擾素α)。
Schering-Plough已經(jīng)開發(fā)半合成形式的IntronA，通過將12-kDa單-甲氧基聚乙二醇連接到蛋白(PEG Intron)以滿足長(zhǎng)時(shí)間作用的干擾素α蛋白的要求同時(shí)提供顯著的臨床優(yōu)點(diǎn)。PEG化降低干擾素α-2b蛋白的比活性，同時(shí)PEG Intron的效力不依賴于蛋白濃度，與IntronA標(biāo)準(zhǔn)在分子和細(xì)胞水平上具有可比性。PEG Intron具有在動(dòng)物和人的研究中增強(qiáng)的藥物動(dòng)力學(xué)譜[參見Yu-Sen Wang等，2002Advanced Drug Delivery Reviews，Volume 54，Issue 4，17，547-570頁(yè)]。在PEGASYS中，40kD分支的可移動(dòng)的PEG被共價(jià)結(jié)合到干擾素α2a分子上并提供選擇性保護(hù)屏障而不顯著降低結(jié)合位點(diǎn)的感受性。
應(yīng)當(dāng)理解聚乙二醇化的分子的藥物動(dòng)力學(xué)行為依賴于PEG的大小和PEG部分與蛋白之間連接的結(jié)構(gòu)(Shannon A.Marshall，DrugDiscovery Today Volume 8，Issue 5，March 2003，212-221頁(yè))。已知具有較小PEG的干擾素降解迅速，需要更經(jīng)常的服藥。因此具有較大PEG的干擾素是優(yōu)選的。
因此，本發(fā)明包含所有類型的聚乙二醇化的干擾素或未來的連接有提供選擇性保護(hù)屏障的尚未知曉的分子的干擾素以使干擾素免于降解而不顯著降低結(jié)合位點(diǎn)的感受性。不同干擾素的組合也包含在本發(fā)明中。
本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案之一是干擾素用于預(yù)防性治療以防止冠狀病毒感染的應(yīng)用。在冠狀病毒感染之前或感染過程中對(duì)猿類進(jìn)行預(yù)防性或治療性處理對(duì)在人中實(shí)施這樣的預(yù)防或治療具有良好的和有用的預(yù)測(cè)價(jià)值。
如在實(shí)驗(yàn)部分所示，在病毒顆粒感染之前給藥干擾素能夠顯著延遲感染和感染后的作用。應(yīng)當(dāng)理解給到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的病毒攻擊是高劑量的，其不會(huì)或幾乎不會(huì)在“自然”感染中出現(xiàn)。應(yīng)當(dāng)理解在“自然”條件下的病毒攻擊將等于大約10-105 TCID50的攻擊，遠(yuǎn)低于本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中使用濃度。此外，實(shí)驗(yàn)中的病毒攻擊最大部分施用于支氣管內(nèi)，即病毒發(fā)揮其主要的感染活性的地方。通常，通過呼吸空氣遇到病毒，首先該空氣將經(jīng)過鼻腔和/或口腔，在那里通過鼻腔和/或口腔上皮和粘膜的大部分病毒會(huì)被過濾(阻止)?？傊?，在我們的實(shí)驗(yàn)中即使使用極高的劑量，我們能顯示干擾素的效果，該事實(shí)表明此效果比通常在感染性病毒劑量下發(fā)生的效果甚至更顯著。因此據(jù)信預(yù)防性給藥將產(chǎn)生對(duì)冠狀病毒感染持續(xù)的和有力的的防護(hù)。
對(duì)于高傳染性和/或空氣傳播形式的病毒例如SARS病毒而言，這是尤其重要的。預(yù)防性治療對(duì)受感染威脅的人，例如SARS病毒的情形下，醫(yī)院人員，兒童，老人和具有糖尿病或心臟病或免疫力弱等潛在狀況的人而言是非常受歡迎的。
有可能的是，SARS-CoV感染在某些人中是無癥狀的，或在其他人中導(dǎo)致非呼吸系統(tǒng)的癥狀。沒有足夠的證據(jù)排除無癥狀的，或非典型的感染者能傳播該疾病。因此，對(duì)于預(yù)防冠狀病毒如SARS-CoV感染，預(yù)防性治療實(shí)際上是必需的。
然而，我們的數(shù)據(jù)還顯示干擾素也適于冠狀病毒的治療，即當(dāng)病毒感染已經(jīng)發(fā)生之時(shí)。我們的體內(nèi)數(shù)據(jù)顯示在給藥干擾素后致病效果被至少延遲了。
本領(lǐng)域中人源和鼠源的干擾素以國(guó)際單位(“IU”)定量。這里使用的干擾素“單位”(區(qū)別與“IU”)表示通過分析測(cè)定的抑制一半數(shù)量攻擊病毒空斑的含干擾素材料稀釋度的倒數(shù)，攻擊的病毒是水泡性口炎病毒(“VSV”)。如此定量的干擾素“單位”通常被發(fā)現(xiàn)為一個(gè)“IU”干擾素量的約十分之一。或者，干擾素可以以μg/kg體重的方式定量。
干擾素以1μg/kg到3μg/kg的劑量給藥。當(dāng)干擾素被聚乙二醇化時(shí)，劑量可以較小的頻率遞送。根據(jù)本發(fā)明，冠狀病毒疾病的治療包括每天給藥0.01-6μg/kg的聚乙二醇化的干擾素，以適合劑型促進(jìn)所述劑量的干擾素與所述動(dòng)物口腔和咽粘膜的接觸。優(yōu)選干擾素劑量為每天0.1-4μg/kg，更優(yōu)選每天0.3-3μg/kg。
干擾素可以任何可用的方式給藥，包括但不限于，口服，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，肺部和鼻腔途徑，其中所述組合物為溶液，懸液或氣溶膠噴劑，尤其是細(xì)微顆粒的氣溶膠噴劑。
關(guān)鍵的是聚乙二醇化的干擾素以適合的劑型給藥，從而保證所述劑型中的干擾素與在治療的人或動(dòng)物口腔和咽部粘膜最大接觸。干擾素與粘膜的接觸可以通過使治療溶液在口腔或咽部的駐留時(shí)間最大化而增強(qiáng)。因此，當(dāng)病人被要求將干擾素溶液在口腔保持一段時(shí)間時(shí)似乎能獲得最好的結(jié)果。干擾素與治療的人或動(dòng)物鳥類，嚙齒類的口腔和咽部粘膜接觸和隨后與其淋巴系統(tǒng)接觸，毫無疑問是最有效的給藥免疫治療量的聚乙二醇化的干擾素的方法。
例如，干擾素可以以液體(溶液)或固體劑型給藥。因此，干擾素可以溶解在通常含有穩(wěn)定量(1-5wt％)血清的緩沖水溶液中給藥。根據(jù)本發(fā)明，合適的作為干擾素載體的緩沖液的例子是通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備的磷酸鹽緩沖液。
本發(fā)明還考慮提供固體劑型的干擾素，如在有或沒有咀嚼幫助下適于通過口腔唾液的接觸溶解的錠劑。這樣的單一劑型被配制以在口腔中與口腔和咽部粘膜接觸溶解后釋放大約1到約1500IU干擾素。因此，根據(jù)本發(fā)明，單一劑型干擾素可以通過本領(lǐng)域公知的用于形成壓縮藥片例如咀嚼的微生素的技術(shù)制備。相似的，干擾素可以摻入到基于淀粉的凝膠制劑中形成在口腔中與口腔粘膜接觸后溶解和釋放干擾素的錠劑。用于本發(fā)明的固體單一劑型的干擾素可以利用本領(lǐng)域公知的制劑技術(shù)制備。這樣的制劑的pH從約4到約8.5。當(dāng)然，在加工這樣的單一劑型時(shí)應(yīng)當(dāng)避免在加入干擾素后在超過50℃加熱該劑型前制劑。動(dòng)物用的固體劑型的例子是含有效量干擾素的糖塊。
或者，干擾素可以使用干擾素的緩沖水溶液作為基礎(chǔ)添加有熱量或無熱量的甜味劑，香料油和藥物可接受的表面活性劑/分散劑制成具有口味或沒有口味的溶液或糖漿。
還考慮能夠?qū)е赂蓴_素在呼吸道或胃的細(xì)胞表達(dá)以防止冠狀病毒感染的基因治療方法。
當(dāng)然，本發(fā)明的任何藥物的臨床使用是由醫(yī)生作出的臨床決定并且該治療的確切過程留給臨床醫(yī)生合理判斷，所有的這些治療過程被視為是本發(fā)明的范圍。
另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是與其他預(yù)防或治療冠狀病毒感染的治療一起給藥干擾素。這樣的其他治療例如是疫苗，抗體和/或抗病毒劑，選自完整滅活病毒疫苗，減毒疫苗，亞單位疫苗，重組疫苗，被動(dòng)免疫的抗體，核苷酸類似物例如三唑核苷，RNA依賴的RNA聚合酶抑制劑和蛋白酶抑制劑。
干擾素與疫苗給藥同時(shí)使用將促進(jìn)疫苗的效果。首先，治療的組合將增加直至更好的效果。然后，與疫苗共同給藥干擾素還會(huì)使免疫接種的免疫反應(yīng)更有效。通常免疫反應(yīng)是緩慢的，需要數(shù)天才能達(dá)到有效抵抗病毒顆粒的足夠高的抗體滴度。當(dāng)沒有干擾素共同給藥時(shí)，病毒將有機(jī)會(huì)增殖到巨大的數(shù)量，以至不能被免疫系統(tǒng)克服。然而與干擾素一起，病毒的量將保持沒有或低值，任何傳染性病毒爆發(fā)(如果有的話)將被免疫系統(tǒng)容易地控制。
預(yù)防和/或治療冠狀病毒感染還可以包括與其他抗病毒化合物，例如基于核苷酸的化合物如三唑核苷(如Rebetol(三氮唑核苷，USP))的組合治療。這些化合物通過呈遞病毒復(fù)制中合成的核苷、干擾病毒復(fù)制而起作用，但其或是阻止病毒蛋白的形成或不產(chǎn)生功能性的蛋白。干擾素的共同給藥將進(jìn)一步減緩病毒復(fù)制。三唑核苷和干擾素形式的組合將幫助降低病毒負(fù)載量。
根據(jù)本發(fā)明，對(duì)治療反應(yīng)的另一疾病是腫瘤疾病。因此，根據(jù)以上說明單獨(dú)或與其他藥物或治療共同給藥干擾素可幫助實(shí)現(xiàn)減輕癌癥，例如惡性淋巴癌，黑色素瘤，間皮瘤，Burkitt淋巴瘤和鼻炎癌以及其他腫瘤疾病，尤其是那些已知或懷疑的病毒病源的疾病和例如Hodgkin病和白血病。
其他對(duì)本發(fā)明治療反應(yīng)的疾病是在人，鳥類，豬，犬類和貓的冠狀病毒起源的傳染性疾病。人冠狀病毒是冠狀病毒229E和新發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒HcoV-NL(參見歐洲專利申請(qǐng)03078772.5)。
數(shù)個(gè)其他的冠狀病毒可以在動(dòng)物中導(dǎo)致全身性疾病，包括貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)，豬的凝血腦脊髓炎病毒(HEV)，和一些禽傳染性支氣管病毒(IBV)株和鼠肝炎病毒(MHV)株。這些冠狀病毒能在肝臟，肺，腎，腸，脾，腦，脊髓，視網(wǎng)膜和其他組織中復(fù)制。免疫療法在MHV和FIPV的組織損傷中起作用，細(xì)胞因子是疾病的一些指征。值得注意的是，在具有貓向腸的冠狀病毒持續(xù)的隱性感染的貓中，可能產(chǎn)生有毒性的病毒突變和導(dǎo)致致命的一種全身性疾病傳染性腹膜炎。
本發(fā)明還包括用于測(cè)試預(yù)防性和/或治療性方法和/或制劑的動(dòng)物模型。已經(jīng)顯示猿類能感染SARS病毒，從而顯示臨床癥狀，更重要的，在由SARS病毒導(dǎo)致的非典型肺炎的人中發(fā)現(xiàn)相似的組織形態(tài)。或在病毒感染前或感染過程中使猿類接受預(yù)防的或治療的處理，將對(duì)人對(duì)象中進(jìn)行這樣的預(yù)防或治療具有良好的和有用的預(yù)測(cè)價(jià)值。
本發(fā)明在實(shí)施例中進(jìn)一步闡述，但不限于此。
圖例圖1分離株HK39849的核苷酸序列與其遺傳最相似的種類之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。通過最大相似性分析使用100bootstraps和3jumbles產(chǎn)生系統(tǒng)樹。刻度代表每個(gè)樹核苷酸變化的數(shù)目。
圖2SARS病毒部分的13個(gè)克隆的核苷酸序列。還包括在可能的情況下，推定的多肽序列和該多肽序列與冠狀病毒家族其他成員的比對(duì)。
圖3SARS病毒基因組的示意圖，指示圖2的核苷酸序列相對(duì)于基因組的位置和基于與其他冠狀病毒的同源性推定的開放閱讀框。刺突蛋白和核殼蛋白之間區(qū)域的基因結(jié)構(gòu)不確定。EMC1-EMC14和RDG1如圖2提供的序列。CDC和BIN1-2通過個(gè)人通訊分別從CDC(W.Bellini博士，Centers for Disease Control&Prevention，National Centersfor Infectious Diseases，1600 Clifton Road，Atlanta GA 30333，USA)和BNI(C.Drosten博士和H.Schmitz博士教授，Bernard Nocht Institute，Bernard-Nocht Str.74，D-20359 Hamburg，Germany)得到的序列。
圖4SARS病毒和緊密相關(guān)的冠狀病毒S蛋白N末端氨基酸的比較。HCV OC43＝人冠狀病毒分離株OC43；MHV A59＝鼠肝炎病毒分離株A59，BCV＝牛冠狀病毒。
圖5從感染的細(xì)胞培養(yǎng)物濃縮上清獲得的SARS病毒陰性對(duì)照EM照片。
圖6SARS冠狀病毒的感染導(dǎo)致短尾獼猴(cynomolgusmacaques)的肺部和腎臟損傷。福爾馬林固定的石蠟包埋的組織用蘇木精和曙紅染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。有彌散的肺泡損傷(a)，和肺泡腔(b)充滿混有炎性細(xì)胞和細(xì)胞碎片的高蛋白類分泌液。在細(xì)支氣管的腔內(nèi)(c)和在周圍的肺實(shí)質(zhì)組織內(nèi)是一些多核的合胞體細(xì)胞(箭頭)。腎收集小管(d)含有相似的多核合胞體細(xì)胞。原始放大倍數(shù)a×12.5；b×50；c×100；d×250。
圖7用SCV感染家貓和雪貂。家貓(A，n＝6)和雪貂(B，n＝6)以106TCID50通過呼吸途徑感染，咽刮片的SCV分泌通過實(shí)時(shí)PCR定量。每組四個(gè)動(dòng)物在第4天被安樂死而其他兩個(gè)動(dòng)物用于分析直至第28天。非感染的貓(C，n＝2)和非感染的雪貂(D，n＝2)的SCV分泌物分別暴露于SCV感染的貓和雪貂。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示為相對(duì)于滴度測(cè)定的SCV標(biāo)準(zhǔn)并顯示為TCID50/ml(N.D.未進(jìn)行)。
圖8實(shí)驗(yàn)性SCV感染的貓和雪貂的死后組織中檢測(cè)SCV。
圖9聚乙二醇化的IFN-α對(duì)SARS冠狀病毒(SCV)在獼猴中復(fù)制的影響。在SCV感染后，用PBS(A)，PEG-Intron于第-3，-1，+1和+3天(B和C)和PEG-Intron于第+1和+3天(D)處理的短尾獼猴，在從猴中采集的咽部拭子(感染后第0，2和4天，實(shí)心條)和肺(第4天，空心條)中檢測(cè)SCV。顯示個(gè)體獼猴(每組n＝2)。病毒分離(VI)結(jié)果顯示在圖板的下部而實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示在圖板的上部(n.a.，不可得到)。
圖10Genbank登錄號(hào)nr.AY274119的SARS冠狀病毒核苷酸序列。
圖11聚乙二醇化的IFN-α體外抗SCV的抗病毒活性和在短尾獼猴中的生物活性。(a)聚乙二醇化的IFN-α體外抗SCV感染的作用。在3個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中得到相似的結(jié)果。(b)聚乙二醇化的IFN-α在用PBS處理的獼猴中(對(duì)照組；空心方塊，n＝4)或聚乙二醇化的IFN-a(預(yù)防組，實(shí)心方塊，n＝4)在第-3和-1天的藥物動(dòng)力學(xué)分析。(c)在用PBS處理的獼猴中(對(duì)照組；空心方塊，n＝4)或聚乙二醇化的IFN-a(預(yù)防組，實(shí)心方塊，n＝4)在第-3和-1天誘導(dǎo)新蝶呤。數(shù)據(jù)表示為平均值±s.d.；**，對(duì)比對(duì)照組P＜0.01。
圖12聚乙二醇化的IFN-α對(duì)短尾獼猴中SCV分泌的影響。在感染后第0，2，或4天從用PBS(對(duì)照組，n＝4)，聚乙二醇化的IFN-α預(yù)防性地(n＝6)或暴露后(n＝4)處理的獼猴采集的咽部拭子中檢測(cè)SCV。數(shù)據(jù)表示為平均值±s.d.；*，在感染后2天對(duì)比對(duì)照組P＜0.05，**，在感染后2天對(duì)比對(duì)照組P.＜0.01。
圖13聚乙二醇化的IFN-α對(duì)受SCV感染的獼猴macaques肺中SCV復(fù)制，病毒抗原表達(dá)和組織損傷的影響。(a)肺勻漿物的SCV滴度。(b)肺切片的SCV感染的細(xì)胞中的免疫組化檢測(cè)。(c)肺切片的組織病理得分。SCV感染的獼猴用聚乙二醇化的IFN-α預(yù)防性地(n＝4)或暴露后(n＝4)，或用PBS(對(duì)照組，n＝4)處理。數(shù)據(jù)表示為平均值±s.d.；*，對(duì)比對(duì)照組P＜0.05；**，對(duì)比對(duì)照組P＜0.01。
實(shí)施例實(shí)施例1.病毒分離和特征描述分離分離株HK39849分離自住院的SARS病人咽部拭子并接種到Vero-E6細(xì)胞的培養(yǎng)物中。由Dr.M.Peiris(Queeen Mary HospitalFaculty of Medicine，Hong Kong University，Honk Kong)提供的來自這些感染的細(xì)胞的上清液的樣品被用于接種VERO-118細(xì)胞，在一次傳代后來自這些細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液被等分成小份并冷凍。
我們從含病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清中分離出RNA并基本按照Welsh&McClelland(NAR 187213；PNAS USA 9010710，1993)的描述將其進(jìn)行RNA任意引發(fā)的PCR(RAP-PCR)。用連續(xù)20-60％蔗糖梯度純化培養(yǎng)上清中的病毒。通過EM檢查梯度級(jí)分中的病毒樣顆粒，從含顆粒的級(jí)分中分離RNA，其中觀察到最多為核殼體。等量的分離自病毒級(jí)分的RNA被用于RAP-PCR，其后樣品并列在3％NuSieve瓊脂糖凝膠上電泳。隨后從凝膠中純化到大小為200-1500堿基對(duì)對(duì)該未鑒定的病毒特異的差別展示條帶，克隆到質(zhì)粒pCR2.1(Invitrogen)中并用載體特異的引物測(cè)序。當(dāng)用這些序列在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中使用BLAST軟件(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)檢索同源性時(shí)，其產(chǎn)生圖1的系統(tǒng)發(fā)生樹顯示的冠狀病毒序列的相似性。
這些片段中有8個(gè)(EMC 1-6，13和14)定位于編碼病毒聚合酶的ORF(ORF lab)，一個(gè)(EMC-7)跨越ORFlab的3′端并達(dá)到刺突蛋白區(qū)域的5′端；EMC-10與EMC-7的3′端重疊因此也編碼S蛋白區(qū)域的部分，EMC9編碼EMC-10的下游區(qū)域；使用引物在EMC10和EMC9內(nèi)測(cè)序(參見下文)，這兩個(gè)序列之間的區(qū)域通過PCR擴(kuò)增并測(cè)序。全長(zhǎng)連續(xù)區(qū)已被整合到圖2的EMC7中；另一個(gè)序列(圖2中RDG1)編碼刺突蛋白3′端。另一個(gè)序列(EMC8)跨越部分核殼體編碼序列。剩下的三個(gè)序列(EMC9，11和12)同時(shí)被發(fā)現(xiàn)是orf lab/復(fù)制酶區(qū)域，其中EMC 9被整合到EMC11。這還沒有在圖3中反映出來。
系統(tǒng)發(fā)生學(xué)使用從未鑒定的病毒分離株獲得的序列進(jìn)行BLAST檢索，發(fā)現(xiàn)與冠狀病毒的成員基本具有同源性。作為新鑒定的病毒分離株和其他冠狀病毒之間關(guān)系的指示，根據(jù)獲得的序列信息構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(圖1)。
材料和方法標(biāo)本收集從SARS病人用咽部拭子和從實(shí)驗(yàn)性感染的猴(咽部和鼻腔拭子，血清，血漿和糞便)收集病毒。
病毒分離和培養(yǎng)咽部拭子浸入Vero-E6細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)1-4天。細(xì)胞培養(yǎng)上清通過離心澄清并通過0.45微米濾器過濾，然后冷凍儲(chǔ)存。病毒隨后在Vero-118細(xì)胞中增殖。
通過間接IFA檢測(cè)抗原來自實(shí)驗(yàn)性感染的猴的樣品在含玻璃載玻片的24孔培養(yǎng)板內(nèi)的Vero-118細(xì)胞中培養(yǎng)。這些玻璃載玻片以PBS洗滌并在丙酮中室溫固定1分鐘。在用PBS洗滌后，載玻片在37℃用來自SARS病人的含有SARS抗體的血清溫育30分鐘。在PBS中洗去人血清后，載玻片在37℃用FITC標(biāo)記的抗人抗體溫育30分鐘。在PBS洗滌三次和自來水洗滌一次后，載玻片被包含在甘油/PBS溶液中(Citifluor，UKC，Canterbury，UK)并加蓋。載玻片使用Axioscop熒光顯微鏡(Carl ZeissB.V.，Weesp，荷蘭)分析。
使用間接IFA在人體中檢測(cè)抗體病毒在含玻璃載玻片的24孔培養(yǎng)板內(nèi)的Vero-118細(xì)胞中培養(yǎng)。這些玻璃載玻片用PBS洗滌并在丙酮中室溫固定1分鐘。在用PBS洗滌后，載玻片在37℃用來自SARS病人的含有SARS抗體的血清溫育30分鐘。在PBS中洗去人血清后，載玻片在37℃用FITC標(biāo)記的抗人抗體溫育30分鐘。在PBS洗滌三次和自來水洗滌一次后，載玻片被包含在甘油/PBS溶液中(Citifluor，UKC，Canterbury，UK)并加蓋。載玻片使用Axioscop熒光顯微鏡(Carl Zeiss B.V.，Weesp，荷蘭)分析。
通過ELISA檢測(cè)人體的抗體病人樣品4個(gè)SARS病人的樣品，8個(gè)常規(guī)血清病毒學(xué)病人的樣品，來自實(shí)驗(yàn)性感染的猴的樣品(前血清，感染后9和12天)。
結(jié)合物全病毒被用作結(jié)合物。來自感染的Vero細(xì)胞的組織培養(yǎng)上清使用20％蔗糖沉淀到60％蔗糖的墊層。然后病毒通過20％蔗糖沉淀并重懸于PBS/1％NP40中。在用PBS透析后，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將病毒結(jié)合到辣根過氧化物酶，并以3個(gè)濃度(在稀釋緩沖液9000-03中1∶100，1∶400和1∶1600稀釋)在多價(jià)抗-IgM編號(hào)MCB0201(與猴交叉反應(yīng))和單克隆抗IgM，編號(hào)9000-62(與猴不交叉反應(yīng))上測(cè)試。
血清在血清稀釋劑(編號(hào)9000-03)中1∶200稀釋，猴775被1∶100，1∶200和1∶400稀釋。
在37℃血清溫育1小時(shí)，37℃結(jié)合物溫育1小時(shí)，和TMB(新鮮配制)在室溫溫育30分鐘。反應(yīng)用硫酸(0.5M)終止。
病毒表征為進(jìn)行EM分析，從感染的細(xì)胞培養(yǎng)上清在微量離心機(jī)在4℃17000×g濃縮病毒，其后沉淀重懸于PBS，并通過陰性對(duì)照EM檢查。
RNA分離從感染的細(xì)胞培養(yǎng)物上清或蔗糖梯度級(jí)分使用高純度RNA分離試劑盒根據(jù)生產(chǎn)商(Roche Diagnostics，Almere，荷蘭)的說明書分離RNA。
RT-PCR在含50mM Tris.HCl pH8.5，50mM NaCl，4mM MgCl2，2mM二硫蘇糖醇，200μM各dNTP，10單位重組RNAsin(Promega，Leiden，荷蘭)，10單位AMV RT(Promega，Leiden，荷蘭)，5單位Amplitaq GoldDNA聚合酶(PE Biosystems，Nieuwerkerk aan de Ijssel，荷蘭)和5μlRNA的50ul反應(yīng)體系中進(jìn)行一步RT-PCR。循環(huán)條件為42℃45分鐘和95℃7分鐘一次，95℃1分鐘，42℃2分鐘，和72℃3分鐘重復(fù)40次，和72℃10分鐘一次。
用于診斷性PCR的引物SARS fwd2ggtggaacatcatccggtgatSARS rev2agcctgtgttgtagattgcgg這些引物擴(kuò)增聚合酶基因(orf1ab)的149bp片段RF 999TTTAAACACTTACGAGAGTTTGTGRF 997GGACACAACCCATGAAATCATCTGG這些引物擴(kuò)增刺突糖蛋白基因(S)的728bp區(qū)域RF 998AGACATATCTAATGTGCCTTTCTCCRF 1002AAGCTCGTCACCTAAGTCATAAGAC(來自EMC11序列)RF 998/RF1002引物的組合使我們能測(cè)序EMC7的3′端，-RF998是EMC7內(nèi)特異性的引物而EMC1002用作隨機(jī)引物。
按以上所述進(jìn)行RT-PCR，凝膠純化和直接測(cè)序。
RAP-PCRRAP-PCR基本按照Welsh&McClelland(Nuc.Acid Res.187213，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90107101993)的描述進(jìn)行。寡核苷酸序列描述于附件2。對(duì)RT反應(yīng)，在含10ng/ul寡核苷酸，10mM二硫蘇糖醇，500μM各dNTP，25mM Tris-HCl pH8.3，75mM KCl和3mM MgCl2的10ul反應(yīng)體系中加入2μl RNA。反應(yīng)混合物在70℃溫育5分鐘和37℃溫育5分鐘，隨后加入200單位Superscript RT酶(LifeTechnologies)。37℃溫育持續(xù)55分鐘。反應(yīng)通過在72℃溫育5分鐘而終止。RT混合物被稀釋產(chǎn)生含8ng/μl寡核苷酸，300μm各dNTP，15mM Tris-HCL pH8.3，65mM KCl，3.0mM MgCl2和5單位Taq DNA聚合酶(PE Biosystems)的50μl PCR反應(yīng)體系。循環(huán)條件為94℃5分鐘，40℃分鐘5分鐘和72℃1分鐘一次，然后94℃1分鐘，56℃2分鐘和72℃1分鐘，重復(fù)40次，和72℃5分鐘一次。RAP-PCR之后，在3％NuSieve 瓊脂糖凝膠(FMC BioProducts，Heerhugowaard，荷蘭)并列進(jìn)行15μl RT-PCR產(chǎn)物電泳。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，從凝膠中用Qiaquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Leusden，荷蘭)純化差別展示的片段并克隆到pCR2.1載體中(Invitrogen，Groningen，荷蘭)。
序列分析用M13-特異的寡核苷酸對(duì)克隆在載體pCR2.1(Invitrogen)中的RAP-PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。從瓊脂糖凝膠中使用Qiaquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Leusden，荷蘭)純化從RT-PCR獲得的DNA片段，并直接用相同的用于PCR的寡核苷酸測(cè)序。序列分析使用Dyenamic ET終止子測(cè)序試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech，Roosendaal，荷蘭)和ABI 373自動(dòng)DNA測(cè)序儀(PE Biosystem)進(jìn)行。所有的技術(shù)按照生產(chǎn)商的說明書進(jìn)行。
用于診斷SARS病毒的RT-PCR為擴(kuò)增SARS病毒的遺傳物質(zhì)，我們使用引物SARS fwd2ggtggaacatcatccggtgatSARS rev2agcctgtgttgtagattgcgg這些引物擴(kuò)增聚合酶基因(orf lab)的149bp片段RF 999TTTAAACACTTACGAGAGTTTGTGRF 997GGACACAACCCATGAAATCATCTGG這些引物擴(kuò)增刺突糖蛋白基因(S)的728bp區(qū)域。
這些引物擴(kuò)增聚合酶基因(off lab)的149bp片段。
RT-PCR，凝膠純化和直接測(cè)序按以上所述進(jìn)行。
系統(tǒng)發(fā)生分析對(duì)所有的系統(tǒng)發(fā)生樹而言，使用ClustalW軟件包比對(duì)DNA序列，使用Phylip 3.5程序的DNA-ML軟件包以100bootstraps和3jumbles15產(chǎn)生最高相似性樹。被用于產(chǎn)生系統(tǒng)發(fā)生樹的以前公布的TGEV，PEDV，229E，AIBV，BoCo和MHV的序列可以從Genbank獲得。
實(shí)施例2鑒定SARS病毒的方法標(biāo)本收集為找到病毒分離株，應(yīng)當(dāng)檢查鼻咽吸出物，咽喉和鼻腔拭子，支氣管肺泡灌洗物，血清和血漿樣品，和糞便，優(yōu)選來自哺乳動(dòng)物，如人，食肉動(dòng)物(狗，貓，mustellits，海豹等)，馬，反芻動(dòng)物(牛，綿羊，山羊等)，豬，兔，鳥(家禽，鴕鳥等)。也可以檢查鳥泄殖腔拭子和滴落物。應(yīng)當(dāng)收集血清用于免疫分析，例如ELISA，基于分子的分析，例如RT-PCR和病毒中和分析。
收集的病毒標(biāo)本用5ml Dulbecco MEM培養(yǎng)基(BioWhittaker，Walkersville，MD)稀釋并在渦旋振蕩器上充分混合一分鐘。然后將該懸液以840×g離心10分鐘。沉積物涂布于多點(diǎn)載玻片上(Nutacon，Leimuiden，荷蘭)用于免疫熒光技術(shù)，上清用于病毒分離。
病毒分離為分離病毒，Vero-118細(xì)胞或tMK細(xì)胞(RIVM，Bilthoven，荷蘭)用下面描述的補(bǔ)充有10％胎牛血清(BioWhittaker，Vervier，比利時(shí))的培養(yǎng)基在含有玻璃載玻片的24孔培養(yǎng)板(Costar，Cambridge，UK)中培養(yǎng)。在接種前培養(yǎng)板用PBS洗滌并供給具有Hanks氏鹽(ICN，Costamesa，CA)的Eagle氏MEM，所述培養(yǎng)基添加有0.52/升克NaHCO3，0.025M Hepes(Biowhittaker)，2mM L-谷氨酰胺(Biowhittaker)，200單位/升青霉素，200μg/升鏈霉素(Biowhittaker)，l克/升乳清蛋白(Sigma-Aldrich，Zwijndrecht，荷蘭)，2.0克/升D-葡萄糖(Merck，Amsterdam，荷蘭)，10克/升蛋白胨(Oxoid，Haarlem，荷蘭)和0.02％胰蛋白酶(trypsine)(Life Technologies，Bethesda，MD)。培養(yǎng)板接種病人樣品上清，每孔0,2ml，一式三份，接著在840×g離心1小時(shí)。在接種后，培養(yǎng)板在37℃培養(yǎng)最長(zhǎng)為1-3天，培養(yǎng)物每天檢查CPE。在24小時(shí)內(nèi)觀察到大量CPE，并包括細(xì)胞從單層上脫離。
SARS病毒培養(yǎng)在上述培養(yǎng)基中的tMK細(xì)胞或Vero克隆118細(xì)胞的亞匯合單層用顯示CPE的樣品的上清或來自病人或人工感染的猴的樣品接種。
病毒表征為進(jìn)行EM分析，從感染的細(xì)胞培養(yǎng)物中用微量離心機(jī)在4℃以17000×g離心濃縮病毒，其后沉淀被重懸于PBS并通過陰性對(duì)照EM檢查。
通過間接IFA檢測(cè)抗原在含玻璃載玻片的24孔培養(yǎng)板內(nèi)的Vero-118細(xì)胞中培養(yǎng)病毒。這些玻璃載玻片以PBS洗滌并在丙酮中室溫固定1分鐘。在用PBS洗滌后，載玻片在37℃用SARS病人血清溫育30分鐘。我們使用病人血清但抗體可以在各種動(dòng)物中產(chǎn)生，例如雪貂，山羊和兔(產(chǎn)生多克隆抗體)和小鼠及豚鼠(產(chǎn)生單克隆抗體)，抗體的工作稀釋度對(duì)各免疫可以不同。在PBS洗滌三次和自來水洗滌一次后，載玻片在37℃用FITC標(biāo)記的山羊抗人抗體溫育30分鐘。在PBS洗滌三次和自來水洗滌一次后，載玻片被包含在甘油/PBS溶液中(Citifiuor，UKC，Canterbury，UK)并加蓋。載玻片使用Axioscop熒光顯微鏡(Carl Zeiss B.V.，Weesp，荷蘭)分析。
通過間接IFA檢測(cè)人抗體為檢測(cè)病毒特異的抗體，SARS病毒感染的Vero細(xì)胞用丙酮固定在蓋玻片上(如上述)，用PBS洗滌并在37℃用1比16稀釋的血清溫育30分鐘。在用PBS洗滌兩次和用自來水洗滌一次后，載玻片在37℃用FITC-標(biāo)記的針對(duì)人抗體的二抗(Dako)溫育30分鐘。載玻片按上述進(jìn)行處理。
抗體可以用熒光染料直接標(biāo)記，這產(chǎn)生直接免疫熒光分析。FITC可以用任何熒光染料替換。該技術(shù)還可以用于其他動(dòng)物的抗體，例如哺乳動(dòng)物，反芻動(dòng)物，鳥或其他種類，只要使用合適種類的第二抗體。
通過ELISA檢測(cè)人體抗體病人樣品4個(gè)樣品來自SARS病人；8個(gè)樣品來自常規(guī)血清病毒學(xué)病人；來自實(shí)驗(yàn)性感染的猴的樣品(前血清和感染后9天)。
結(jié)合物結(jié)合物以多個(gè)濃度在多價(jià)抗-IgM(與猴交叉反應(yīng))和單克隆抗-IgM(不與猴交叉反應(yīng))上進(jìn)行測(cè)試。
血清用血清稀釋劑1∶200稀釋，猴血清稀釋到1∶100，1∶200和1∶400。
血清在37℃溫育1小時(shí)，結(jié)合物在37℃溫育1小時(shí)，TMB(新鮮配制)在室溫溫育30分鐘。反應(yīng)用硫酸(0.5M)終止。
肉眼觀察結(jié)果。四個(gè)SARS-IgM陽(yáng)性血清中的三個(gè)(通過IF在感染的細(xì)胞中檢測(cè))具有比陰性對(duì)照血清更高的得分。一個(gè)血清具有也能被一些陰性對(duì)照達(dá)到的得分。9天齡的猴的血清不反應(yīng)，但12天齡的能反應(yīng)。因此，該研究表明用直接的核殼體結(jié)合，發(fā)展IgM捕獲方法是可行的。
此外，這類分析還可以由本領(lǐng)域熟練人員以多種形式進(jìn)行。該分析可以擴(kuò)展到檢測(cè)人和動(dòng)物的IgA和IgG抗體，并可以利用不同的捕獲抗原，例如但不限于純化的重組N蛋白。
動(dòng)物免疫短尾獼猴(Cynomologous macaque)對(duì)新發(fā)現(xiàn)的病毒特異性的抗血清通過實(shí)驗(yàn)性支氣管內(nèi)放置短尾獼猴培養(yǎng)的病毒而產(chǎn)生。一到兩周后從動(dòng)物取血。通過間接IFA如上所述檢測(cè)血清對(duì)SARS病毒的反應(yīng)性；未感染的對(duì)照細(xì)胞被用于保證血清的特異性。其他動(dòng)物種類也適合用于產(chǎn)生特異性抗體制劑以及可以使用其他抗原制劑。
RNA分離RNA使用高純度RNA分離試劑盒根據(jù)生產(chǎn)商(Roche Diagnostics，Almere，荷蘭)的說明書分離自感染的細(xì)胞培養(yǎng)物上清或蔗糖梯度級(jí)分。RNA還可以按照本領(lǐng)域已知的其他方法(Current Protocols inMolecular Biology)分離。
RT-PCR在含50mM Tris.HCl pH 8.5，50mM NaCl，4mM MgCl2，2mM二硫蘇糖醇，200μM各dNTP，10單位重組RNAsin(Promega，Leiden，荷蘭)，10單位AMV RT(Promega，Leiden，荷蘭)，5單位Amplitaq GoldDNA聚合酶(PE Biosystems，Nieuwerkerk aan de Ijssel，荷蘭)和5μlRNA的50ul反應(yīng)體系中進(jìn)行一步RT-PCR。循環(huán)條件為42℃45分鐘和95℃7分鐘一次，95℃1分鐘，42℃2分鐘，和72℃3分鐘循環(huán)40次，和72℃10分鐘一次。
用于診斷性PCR的引物為擴(kuò)增SARS病毒的遺傳物質(zhì)，我們使用引物SARS fwd2ggtggaacatcatccggtgatSARS rev2agcctgtgttgtagattgcgg這些引物擴(kuò)增聚合酶基因(orf lab)的149bp片段。
RT-PCR，凝膠純化和直接測(cè)序按以上所述進(jìn)行。
序列分析序列分析使用Dyenamic ET終止子測(cè)序試劑盒(AmershamPharmacia Biotech，Roosendaal，荷蘭)和ABI373自動(dòng)DNA測(cè)序儀(PEBiosystem)進(jìn)行。所有的技術(shù)按照生產(chǎn)商的說明書進(jìn)行。PCR片段用用于PCR的相同寡核苷酸直接測(cè)序，或片段根據(jù)生產(chǎn)商的說明書用Qiaquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Leusden，荷蘭)純化并克隆到pCR2.1載體(Invitrogen，Groningen，荷蘭)，隨后用M13特異性的寡核苷酸測(cè)序。
通過ELISA檢測(cè)人，哺乳動(dòng)物，反芻動(dòng)物或其他動(dòng)物的抗體來自SARS病毒的重組蛋白優(yōu)選作為抗原。然而，純化的核殼體也可以使用。適合用于抗體檢測(cè)的抗原包括與暴露到或感染有SARS病毒的病人的任何SARS特異性抗體結(jié)合的任何SARS蛋白。本發(fā)明優(yōu)選的抗原包括那些在暴露到SARS的病人中主要產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原，因此，通常是那些最容易被病人的抗體識(shí)別的抗原。特別優(yōu)選的抗原包括SARS的N和S蛋白。
用于免疫學(xué)技術(shù)的抗原可以是天然抗原或其修飾的版本。公知的分子生物學(xué)技術(shù)可以用于改變SARS抗原的氨基酸序列以生產(chǎn)可以用于免疫學(xué)技術(shù)的該抗原的修飾版本。
克隆基因的方法，操作基因到表達(dá)載體中和從表達(dá)載體取出基因的方法，和在異源宿主中表達(dá)該基因編碼的蛋白的方法是公知的，這些技術(shù)可以用于提供表達(dá)載體，宿主細(xì)胞和在宿主中表達(dá)編碼抗原的克隆基因，以生產(chǎn)用于診斷分析的重組抗原。參見例如Molecularcloning，A laboratory manual and Current Protocols in MolecularBiology。
多種表達(dá)體系可以用于生產(chǎn)SARS抗原。例如，已經(jīng)描述多種適合在大腸桿菌(E.Coli)，枯草桿菌(B.subtilis)，酵母，昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)蛋白的表達(dá)載體，其中任何一種可以用于生產(chǎn)適合檢測(cè)被暴露病人的抗SARS抗體的SARS抗原。
桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有提供對(duì)蛋白必要的加工的優(yōu)點(diǎn)，因此其是優(yōu)選的。該系統(tǒng)利用多角體蛋白的啟動(dòng)子指導(dǎo)SARS抗原的表達(dá)(Matsuura等，1987，J.Gen.Virol.681233-1250)。
重組桿狀病毒產(chǎn)生的抗原可以用于多種免疫分析來檢測(cè)病人的抗SARS抗體?，F(xiàn)成的是重組抗原可以在實(shí)踐的任何免疫分析中代替天然病毒檢測(cè)病毒特異性的抗體。分析包括直接和間接分析，夾心分析，固相分析例如使用培養(yǎng)板或珠的分析等，和液相分析。合適的分析包括那些使用一級(jí)和二級(jí)抗體的分析，和使用抗體結(jié)合試劑例如蛋白A的分析。此外，多種檢測(cè)方法可以用于本發(fā)明，包括比色，熒光，磷光，化學(xué)發(fā)光，發(fā)光和放射方法。
實(shí)施例3動(dòng)物模型獼猴四只短尾獼猴通過支氣管內(nèi)放置來自Vero-118細(xì)胞的病毒而被感染SARS病毒。
猴子具有以下臨床癥狀?；杷?。四只猴子中的一只具有嚴(yán)重的肺炎。在腹股溝區(qū)域和腋窩區(qū)域具有輕微到嚴(yán)重的皮疹。水樣糞便10-16天后猴子被處以安樂死。組織檢查發(fā)現(xiàn)如下特征。肺泡充滿血清，其結(jié)構(gòu)被破壞，與支氣管小腸肺炎一致(參見圖5和b)。肺中多細(xì)胞合胞體(圖5c)
。腎中多細(xì)胞合胞體(圖5d)。小腸變寬使用RT-PCR對(duì)組織樣品和通過培養(yǎng)樣品，隨后進(jìn)行電子顯微鏡檢查以下組織而檢測(cè)病毒。肺。鼻腔拭子。咽部拭子。糞便。腎EM結(jié)果顯示從短尾獼猴獲得的病毒與用于感染其的病毒具有相同的形態(tài)。
這表明短尾獼猴可以用作動(dòng)物模型來檢測(cè)治療或預(yù)防目的的藥物制劑的效果。
貓和雪貂家貓(n＝6)和雪貂(n＝6)被氣管內(nèi)接種106中值組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)SCV，其來自死于SARS的病人5688并在Vero 118細(xì)胞中體外傳代4次。在不同感染后天數(shù)(d.p.i.)采集鼻、咽和直腸拭子。每組四個(gè)動(dòng)物在4d.p.i.被安樂死并按照標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行尸檢。在SCV接種的貓中沒有觀察到臨床癥狀，而六只雪貂中的三只在2到4d.p.i.變得昏睡，以及一只雪貂在4d.p.i.死亡。所有的貓和雪貂(圖7)在2d.p.i.從咽部開始傳播SCV分別直至第10和14天，由RT-PCR測(cè)定。病毒分離自在2-8d.p.i.采集的所有咽部拭子和兩只貓?jiān)?和6d.p.i.的鼻腔拭子。在雪貂的鼻腔拭子和貓或雪貂的直腸拭子均沒有檢測(cè)到SCV。在所有檢測(cè)的動(dòng)物中呼吸道感染是明顯的；SCV可以從它們的氣管和肺分離得到(圖8)。每毫升肺勻漿物病毒滴度的幾何平均值的定量顯示在SCV接種的貓(1×103±0.51 TCID50)與雪貂(1×106±0.70TCID50)相比SCV滴度相對(duì)較低。組織學(xué)上，SCV感染與肺部損傷相關(guān)，所述損傷類似于SCV感染的獼猴中的肺部損傷，除了這里的損傷比較輕微，尤其是在SCV感染的貓，以及沒有發(fā)現(xiàn)合胞體。在胃腸和尿道中通過RT-PCR檢測(cè)到SCV(圖8)。對(duì)剩下的SCV接種的動(dòng)物(每組n＝2)的隨訪顯示它們都在28d.p.i具有血清轉(zhuǎn)化(中和抗體滴度40-320)。兩次通過大腦內(nèi)接種感染乳鼠的嘗試都失敗了。
分別與接種的貓和雪貂共同飼養(yǎng)的未接種的貓(圖7c，n＝2)和雪貂(圖7d，n＝2)皆感染有SCV；病毒滴度在第二天逐漸增加并在6到8d.p.i.達(dá)到峰值。兩只貓都沒有顯示臨床癥狀，但在第28天血清轉(zhuǎn)化(病毒中和抗體滴度40和160)。兩只雪貂表現(xiàn)為昏睡和結(jié)膜炎并在16和21d.p.I死亡。根據(jù)病理學(xué)檢查，兩只動(dòng)物主要的損傷在于顯著的肝脂肪貯積和衰弱。沒有證據(jù)表明這兩只動(dòng)物之一死于SCV相關(guān)的肺炎，盡管從一只動(dòng)物的尸檢肺標(biāo)本中分離到SCV。
結(jié)論是，家貓和雪貂易受實(shí)驗(yàn)性SCV感染的影響并且有效發(fā)生SCV向未接種動(dòng)物的傳播。兩個(gè)物種潛在地都能用作動(dòng)物模型來檢測(cè)針對(duì)SARS的抗病毒藥物或疫苗的候選物。
實(shí)施例4SARS-干擾素實(shí)驗(yàn)在第一次實(shí)驗(yàn)中，每組兩只猴子，共四組被注射。
1.PEG-干擾素治療劑量根據(jù)以下方案肌內(nèi)注射3ug/kg或PBS猴M001 PBS第-3，-1，+1和+3天M002 PBS第-3，-1，+1和+3天M003 IFN第-3，-1，+1和+3天M004 IFN第-3，-1，+1和+3天M005 PBS第-3和-1天和IFN第+1和+3天M006 PBS第-3和-1和IFN第+1和+3天
M007 IFN第-3，-1，+1和+3天M008 IFN第-3，-1，+1和+3天2.感染在第0天用SARS冠狀病毒感染所有猴劑量5ml PBS中106TCID 50。4ml氣管內(nèi)。1ml鼻內(nèi)。0.5ml各眼內(nèi)3.取樣a.在第0，2和4天采集鼻咽喉和直腸拭子，并放入1ml轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中。
b.在第4天猴被安樂死，采集肺、支氣管淋巴結(jié)和氣管樣品。
在Vero-118細(xì)胞中培養(yǎng)病毒并測(cè)定滴度，并評(píng)價(jià)這些病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)。
利用在感染后第0，2和4天采集的三個(gè)不同的拭子(鼻，咽喉和直腸)并從肺，支氣管淋巴結(jié)和氣管在感染后第4天分離病毒，病毒滴度顯示兩個(gè)對(duì)照猴子(M001和M002)被成功地感染(表1)。
表1用聚乙二醇化的干擾素治療的短尾獼猴分泌SARS-相關(guān)的冠狀病毒
●感染后天數(shù)1.對(duì)照動(dòng)物(M001，002)。第2和4天的咽部拭子都是陽(yáng)性的。動(dòng)物M001從鼻拭子分離SARS冠狀病毒也被發(fā)現(xiàn)是陽(yáng)性的(第2和4天)。沒有直腸拭子為陽(yáng)性。來自兩個(gè)對(duì)照動(dòng)物(M001和M002)的肺、氣管和支氣管淋巴結(jié)的組織標(biāo)本在第4天都是陽(yáng)性的，這時(shí)動(dòng)物被處死。肺組織勻漿物含有高滴度病毒，這是因?yàn)閂ero培養(yǎng)物在接種后很快被發(fā)現(xiàn)是陽(yáng)性的。
2.預(yù)防性處理的動(dòng)物(M003，004，007&008)。對(duì)感染后0，2和4天采集的咽部拭子的病毒分離檢測(cè)是陰性的(表1)。
。在這些動(dòng)物中沒有發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性的鼻拭子。
。只有動(dòng)物M004的一個(gè)直腸拭子在第4天被評(píng)價(jià)為陽(yáng)性(其已被PCR分析證實(shí)，因?yàn)檫@些培養(yǎng)物顯示更多的細(xì)菌污染(直腸拭子培養(yǎng)物)。
。沒有從M003和004的氣管分離到病毒。從M004的支氣管淋巴結(jié)分離到病毒，但M003沒有。
。從M003和M004的肺分離到病毒，但滴度低于對(duì)照，因?yàn)槠湫枰L(zhǎng)的時(shí)間才能在接種了來自肺的樣品的Vero-118細(xì)胞中觀察到CPE(通過PCR證實(shí)，下面圖A)。
3.治療性處理的動(dòng)物(M005和006)SARS冠狀病毒。分離自感染后第2天采集的咽部拭子。不能從感染后第4天采集的咽部拭子中分離到。從動(dòng)物M005和M006以比動(dòng)物M003和M004更多組織和更高滴度分離到(通過PCR定量證實(shí))。
HE染色的肺切片的病理學(xué)檢查證實(shí)動(dòng)物M003的肺中低水平感染。
另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在短尾獼猴接受處理之前對(duì)Vero細(xì)胞中預(yù)先進(jìn)行體外劑量確定實(shí)驗(yàn)。
體外研究含Vero細(xì)胞的孔用聚乙二醇化的重組IFN-α(PEG-Intron，SheringCorp)處理16小時(shí)，一式三份，并每孔用獲自死于SARS的病人5688的100 TCID50SCV感染。16小時(shí)猴，除去上清，細(xì)胞用10％中性緩沖的福爾馬林和70％乙醇固定(RT 10分鐘)。SCV抗原陽(yáng)性的細(xì)胞通過免疫組化而觀察到，如組織學(xué)的描述。每孔SCV感染的細(xì)胞被記為平均值±s.d.。
獼猴研究三組短尾獼猴用懸浮在5ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中的1×106TCID50SCV氣管內(nèi)感染。一組(對(duì)照組，n＝4)被肌內(nèi)注射PBS，兩組(預(yù)防組，n＝6；暴露后組，n＝4)被肌內(nèi)注射劑量為3μg/kg聚乙二醇化的IFN-α。預(yù)防組在SCV感染后-3，-1，1和3天注射聚乙二醇化的IFN-α，而暴露后組在SCV感染后1和3天注射。各組的四只獼猴在感染后4天被安樂死。從動(dòng)物福利委員會(huì)(Institutional AnimalWelfare Committee)獲得批準(zhǔn)對(duì)這些動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在-3，-2，-1，0，+2和+4天，我們用氯胺酮麻醉獼猴并從腹股溝靜脈收集10ml血液，以及采集咽部拭子，其被放置于1ml轉(zhuǎn)移介質(zhì)中(Fouchier，R.A.等，J.Clin.Microbiol.38，4096-5001)。咽部拭子在-70℃冷凍直到用于RT-PCR分析。聚乙二醇化的IFN-α水平使用PEG-Intron作為標(biāo)準(zhǔn)通過ELISA (Bender MedSystems Diagnostics)測(cè)定，而新蝶呤水平根據(jù)vanGool等(Psychiatry Res.119，125-132，2003)的描述確定。尸檢根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行，各猴子的一只肺用10％中性緩沖的福爾馬林通過支氣管內(nèi)插管充滿，并懸浮在10％中性緩沖的福爾馬林中過夜。樣品以標(biāo)準(zhǔn)方法收集(一個(gè)來自肺的近頭部分，一個(gè)來自中間和兩個(gè)來自近尾端)，包埋在石蠟中，以5μm切割并用于免疫組化(見下文)或用蘇木精和曙紅(HE)染色。對(duì)半定量評(píng)估肺的SCV感染相關(guān)的炎癥而言，各HE染色的切片在光學(xué)顯微鏡下使用10×物鏡檢查炎癥灶。各病灶根據(jù)大小評(píng)分(1小于或等于10×物鏡區(qū)域，2大于10×物鏡區(qū)域和小于或等于2.5×物鏡區(qū)域，3大于2.5×物鏡區(qū)域)和炎癥嚴(yán)重程度(1輕微，2中等，3顯著)。炎癥病灶評(píng)分的積累提供每只動(dòng)物總的得分。在不知道獼猴身份的情況下檢查切片。暴露后組的一只猴子的肺切片沒有評(píng)價(jià)，因?yàn)榇嬖谒狼拔胧澄餁埩舻难装Y。對(duì)照組的肺樣品被用于Kuiken，T.等(Lancet 362，263-270，2003)描述的透射電子顯微鏡。
從其他的肺提取的三個(gè)肺組織樣品(一個(gè)來自肺的近頭部，一個(gè)來自中部，和一個(gè)來自近尾部)在2ml轉(zhuǎn)移介質(zhì)中使用Polytron PT2100組織研磨器(Kinematica)勻漿。經(jīng)低速離心后，勻漿物在-70℃冷凍直至以10倍連續(xù)稀釋接種到Vero118細(xì)胞。分離的病毒作為SCV的同一性通過上清的RT-PCR證實(shí)。
免疫組化與用于組織學(xué)相同的福爾馬林固定的石蠟包埋的肺樣品-一個(gè)來自肺的近頭部，一個(gè)來自中間部分，和兩個(gè)來自近尾部-以5μm切割，并使用來自康復(fù)期SARS病人的純化的生物素化的人IgG染色SCV抗原，陰性對(duì)照生物素化的純化的人IgG，或稀釋緩沖液，如Kuiken等(同上)的描述。各肺切片中25個(gè)隨機(jī)選擇的20×物鏡視野的肺實(shí)質(zhì)組織用光學(xué)顯微鏡檢查SCV抗原表達(dá)的存在，在不知道獼猴的身份的情況下進(jìn)行。各動(dòng)物累計(jì)的評(píng)分表示為每100個(gè)視野中陽(yáng)性視野的數(shù)量(％)。對(duì)照組中選擇的獼猴肺切片根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)免疫組化方法用抗細(xì)胞角蛋白單克隆抗體AE1/AE3(Neomarkers)染色以鑒定上皮細(xì)胞。
SCV RT-PCR用對(duì)SCV的核蛋白(NP)基因特異性的引物和探針的RT-PCR被用于按照Kuiken等(同上)所述定量拭子中的SCV。SCV原液的系列稀釋被用作標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果表示為SCV eq/ml拭子介質(zhì)。
結(jié)果在Vero細(xì)胞上進(jìn)行的劑量研究(3個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn))顯示對(duì)每孔SCV感染的細(xì)胞數(shù)量的劑量依賴效應(yīng)。觀察到在劑量為1ng/ml藥物時(shí)有顯著的效果，而在劑量高于1ng/ml時(shí)觀察到感染的細(xì)胞的數(shù)量急劇降低(圖11a)。
對(duì)照獼猴顯示多病灶急性DAD(彌散性肺泡損傷)，特征為混合嗜中性粒細(xì)胞和罕見合胞體的富含蛋白的水腫液的肺泡溢流，廣泛?jiǎn)适У姆闻莺蜌夤苌掀ず团既坏?型肺細(xì)胞增生。如免疫組化所示，襯在肺泡壁的鱗狀細(xì)胞廣泛表達(dá)SCV抗原。根據(jù)它們的位置，形態(tài)和在連續(xù)切片中表達(dá)角蛋白，它們被顯示為I型肺細(xì)胞。通過透射電鏡，測(cè)量為直徑大約70nm具有典型的內(nèi)部核殼體樣結(jié)構(gòu)的冠狀病毒樣顆粒在肺泡細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。這些細(xì)胞被鑒定為1型肺細(xì)胞，因?yàn)樗鼈円r在肺泡腔內(nèi)，緊靠基底膜，是鱗片狀的，包含大量胞飲小泡，和與2型肺細(xì)胞相反沒有片層體也沒有微絨毛。如以前在實(shí)驗(yàn)性感染的獼猴中在6d.p.i.發(fā)現(xiàn)，不太廣泛的SCV抗原表達(dá)也在炎癥病灶的增生的2型肺細(xì)胞中檢測(cè)到。這些組織病理學(xué)和免疫組化發(fā)現(xiàn)的組合顯示1型肺細(xì)胞是SCV早期感染主要的靶，并且與DAD相關(guān)。
注射后一天在一組(預(yù)防組)六只獼猴獲得肌內(nèi)注射后血漿高水平聚乙二醇化的IFN-α(圖11b)，類似于用3μg/kg聚乙二醇化的IFN-α皮下注射后病人中發(fā)現(xiàn)的峰值(Bukowski，R.M.等，Cancer 95，389-396，2002)。因?yàn)橐阎狪FN-α激活巨噬細(xì)胞(van Gool等，同上)，聚乙二醇化的IFN-α處理后的血漿新蝶呤水平被測(cè)量作為巨噬細(xì)胞活化的量度。所有動(dòng)物中新蝶呤水平增加(圖11c)，證實(shí)聚乙二醇化的IFN-α在治療獼猴中的生物學(xué)實(shí)用性。
為評(píng)價(jià)聚乙二醇化的IFN-α的預(yù)防性應(yīng)用，我們?cè)诰垡叶蓟腎FN-α治療開始后3天在預(yù)防組中用SCV實(shí)驗(yàn)性感染獼猴，并與用PBS代替治療的對(duì)照組四只獼猴比較病毒學(xué)和病理學(xué)參數(shù)。我們將研究限制為咽部拭子和肺，因?yàn)樵缙谘芯繘]有提供在其他器官中廣泛的病毒復(fù)制的癥據(jù)(Kuiper等，同上)。我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比所有參數(shù)在預(yù)防組中都顯著降低。通過病毒學(xué)，咽部的病毒分泌被阻止(圖12)，并且在4d.p.i.肺中病毒滴度顯著降低(圖13a)。通過免疫組化，1型肺細(xì)胞中SCV的表達(dá)被降低90％(圖13b)。通過病理學(xué)，DAD的程度和嚴(yán)重性被降低80％(圖13c)。這些數(shù)據(jù)顯示聚乙二醇化的IFN-α的預(yù)防性使用基本上，盡管不是完全，通過阻止病毒分泌和降低肺部損傷的嚴(yán)重性來保護(hù)實(shí)驗(yàn)性感染的獼猴的1型肺細(xì)胞免受SCV感染。
為檢驗(yàn)聚乙二醇化的IFN-α作為暴露后抗病毒試劑的效果，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)性SCV感染后1和3天向暴露后的組四只獼猴肌內(nèi)注射聚乙二醇化的IFN-α，并用與預(yù)防組相同的方法評(píng)價(jià)它們。只在2d.p.發(fā)現(xiàn)SCV從咽部以與對(duì)照組相比顯著降低的水平分泌(圖12)。此外，在肺中病毒滴度在4d.p.i.顯著下降，而其余的參數(shù)降低較少(圖13a-c)。這些結(jié)果顯示在暴露后一天使用聚乙二醇化的IFN-α保護(hù)實(shí)驗(yàn)性感染的獼猴的1型肺細(xì)胞免受SCV感染但比預(yù)防性使用的效果稍弱。
在本研究中，我們已經(jīng)顯示1型肺細(xì)胞是在疾病早期短尾獼猴SCV感染的主要靶，而聚乙二醇化的IFN-α保護(hù)1型肺細(xì)胞免受SCV感染。第一點(diǎn)-1型肺細(xì)胞是主要的靶細(xì)胞-在4d.p.i.從1型肺細(xì)胞中廣泛出現(xiàn)SCV可以明顯得出。當(dāng)在人和獼猴的病理研究一起觀察時(shí)，肺損傷出現(xiàn)的時(shí)間順序是病毒感染和隨后1型肺細(xì)胞損失；急性DAD，特征為具有高蛋白質(zhì)水腫液的肺泡腔浸潤(rùn)；慢性DAD，特征為2型肺細(xì)胞增生；和在嚴(yán)重的情況下，廣泛的肺部纖維化。事件的順序?qū)?yīng)于對(duì)各種原因?qū)е碌募毙苑螕p傷的老式肺泡反應(yīng)(Ware，L. B.和Matthay，M.A.，N.Eng.J.Med.342，1334-1349，2000)。
第二點(diǎn)-聚乙二醇化的IFN-α保護(hù)1型肺細(xì)胞免受SCV感染-是基于獼猴接種SCV之前三天開始的聚乙二醇化的IFN-α療法的有益效果。在這些獼猴中，1型肺細(xì)胞的SCV感染和肺損傷的嚴(yán)重程度被顯著降低(圖13)，而且病毒分泌被阻止(圖12)。因此聚乙二醇化的IFN-α治療對(duì)SARS的結(jié)果具有重要的影響。因此，在SCV感染的早期通過聚乙二醇化的IFN-α療法降低病毒負(fù)載有助于防止嚴(yán)重的或致命的與肺纖維化相關(guān)的SARS后果。通過聚乙二醇化的IFN-α療法，除了潛在減緩疾病，降低病毒分泌，還通過降低SCV在人群中的散布而具有流行病學(xué)作用。聚乙二醇化的IFN-α的保護(hù)機(jī)制是否是直接的抗病毒活性或免疫刺激作用還有待確定。
用聚乙二醇化的IFN-α引發(fā)有效的暴露后治療的時(shí)間間隔在人中比在實(shí)驗(yàn)性感染的獼猴中可能更長(zhǎng)。這是因?yàn)樵谌朔沃蠸CV感染的峰值為大約16d.p.i.-基于平均溫育時(shí)間6天(Booth，C.M.等，JAMA289，2801-2809，2003)和在癥狀發(fā)作后10天病毒分泌的峰值(peiris，J.S.M.等，Lancet361，1767-1772，2003)-與在這些獼猴中2d.p.i.比較(圖12)。
總的來說，這些研究顯示1型肺細(xì)胞是獼猴中SCV感染疾病早期主要的靶細(xì)胞，而可商購(gòu)的抗病毒藥聚乙二醇化的IFN-α保護(hù)這些細(xì)胞免受SCV感染。用聚乙二醇化的IFN-α進(jìn)行預(yù)防性的或早期暴露后治療幫助降低SCV感染對(duì)保健工作者和其他可能暴露于SCV的人的影響，并限制該病毒在人群中的傳播。
權(quán)利要求
1.分離的實(shí)質(zhì)為哺乳動(dòng)物的正義單鏈RNA病毒(SARS)，含有圖2的一個(gè)或多個(gè)序列。
2.分離的正義單鏈RNA病毒(SARS)，其屬于冠狀病毒并鑒定為在系統(tǒng)發(fā)生上對(duì)應(yīng)于冠狀病毒，鑒定方法是測(cè)定所述病毒的核酸序列，以及在系統(tǒng)發(fā)生樹分析中對(duì)其測(cè)試，其中用100 bootstraps和3jumbles產(chǎn)生最大可能性樹，并發(fā)現(xiàn)其與對(duì)應(yīng)于BoCo(牛冠狀病毒)，MHV(鼠肝炎病毒)，AIBV(禽傳染性支氣管炎病毒)，PEDV(豬流行性腹瀉病毒)，TGEV(傳染性胃腸炎病毒)或229E(人冠狀病毒229E)的病毒分離株相比，在系統(tǒng)發(fā)生上更接近對(duì)應(yīng)于具有與圖2所示序列的病毒分離株。
3.權(quán)利要求1或2的病毒，其中所述核酸序列包含編碼所述病毒的病毒蛋白的開放閱讀框(ORF)。
4.權(quán)利要求3的病毒，其中所述開放閱讀框選自編碼病毒復(fù)制酶，核殼蛋白和刺突蛋白的ORFs。
5.權(quán)利要求1-4的病毒，其可以從患有非典型肺炎的人中分離到。
6.分離的或重組的核酸或其SARS病毒特異的功能性片段，可以從權(quán)利要求1-5之一的病毒獲得。
7.包含權(quán)利要求6的核酸的載體。
8.包含權(quán)利要求6的核酸或權(quán)利要求7的載體的宿主細(xì)胞。
9.權(quán)利要求6的核酸編碼的分離的或重組的蛋白類分子或其SARS病毒特異的功能性片段。
10.包含權(quán)利要求9的蛋白類分子或其SARS病毒特異的功能性片段的抗原。
11.特異性針對(duì)權(quán)利要求10的抗原的抗體。
12.將病毒分離株鑒定為SARS病毒的方法，包括將所述病毒分離株或其組分與權(quán)利要求11的抗體反應(yīng)。
13.將病毒分離株鑒定為SARS病毒的方法，包括將所述病毒分離株或其組分與權(quán)利要求6的核酸反應(yīng)。
14.病毒學(xué)診斷哺乳動(dòng)物SARS感染的方法，包括通過將所述哺乳動(dòng)物的樣品與權(quán)利要求6的核酸或權(quán)利要求11的抗體反應(yīng)測(cè)定所述樣品中病毒分離株或其組分的存在。
15.血清學(xué)診斷哺乳動(dòng)物SARS感染的方法，包括通過將所述哺乳動(dòng)物的樣品與權(quán)利要求9的蛋白類分子或其片段或權(quán)利要求10的抗原反應(yīng)，測(cè)定所述樣品中特異性針對(duì)SARS病毒或其組分的抗體的存在。
16.診斷SARS感染的診斷試劑盒，包含權(quán)利要求1-5之一的病毒，權(quán)利要求6的核酸，權(quán)利要求9的蛋白類分子或其片段，權(quán)利要求10的抗原和/或權(quán)利要求11的抗體。
17.權(quán)利要求1-5之一的病毒，權(quán)利要求6的核酸，權(quán)利要求7的載體，權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞，權(quán)利要求9的蛋白類分子或其片段，權(quán)利要求10的抗原，或權(quán)利要求11的抗體在制備藥物組合物中的應(yīng)用。
18.權(quán)利要求17的應(yīng)用，用于生產(chǎn)治療或預(yù)防SARS病毒感染的藥物組合物。
19.權(quán)利要求17或18的應(yīng)用，用于生產(chǎn)治療或預(yù)防非典型肺炎的藥物組合物。
20.藥物組合物，包含權(quán)利要求1-5之一的病毒，權(quán)利要求6的核酸，權(quán)利要求7的載體，權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞，權(quán)利要求9的蛋白類分子或其片段，權(quán)利要求10的抗原，或權(quán)利要求11的抗體。
21.治療或預(yù)防SARS病毒感染的方法，包括給個(gè)體提供權(quán)利要求20的藥物組合物。
22.治療或預(yù)防非典型肺炎的方法，包括給個(gè)體提供權(quán)利要求20的藥物組合物。
23.由RNA序列編碼的病毒復(fù)制酶，所述RNA序列包含圖2所示的EMC-1，EMC-2，EMC-3，EMC-4，EMC-5，EMC-6，EMC-7，EMC-13和/或EMC-14序列，或其同源物。
24.病毒刺突蛋白，包含圖2所示的EMC-7序列的翻譯2和RDG1翻譯1的氨基酸，或其同源物。
25.由RNA序列編碼的病毒核殼蛋白，所述RNA序列包括圖2所示的EMC-8序列或其同源物。
26.由RNA序列編碼的病毒蛋白，所述RNA序列包括圖2所示的EMC-9，EMC-11和/或EMC-12序列。
27.核酸序列，包含圖13所示的EMC-1到EMC-13的一個(gè)或多個(gè)序列或在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與上述序列之一雜交的核酸序列。
28.干擾素在制備用于治療或預(yù)防冠狀病毒相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
29.權(quán)利要求28的應(yīng)用，其中干擾素是干擾素α。
30.權(quán)利要求29的應(yīng)用，其中干擾素是干擾素α2a。
31.權(quán)利要求29的應(yīng)用，其中干擾素是干擾素α2b。
32.權(quán)利要求28-31之一的應(yīng)用，其中干擾素是聚乙二醇化的。
33.權(quán)利要求28-32之一的應(yīng)用，其中所述冠狀病毒相關(guān)疾病是動(dòng)物疾病，優(yōu)選脊椎動(dòng)物，更優(yōu)選鳥或哺乳動(dòng)物，尤其是人，猿或嚙齒動(dòng)物的疾病。
34.權(quán)利要求33的應(yīng)用，其中所述疾病是呼吸疾病和/或胃腸炎。
35.權(quán)利要求33或34的應(yīng)用，其中所述動(dòng)物是人。
36.權(quán)利要求28-35之一的應(yīng)用，其中所述冠狀病毒相關(guān)疾病是由HcoV-NL，貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)或豬凝血腦脊髓炎病毒(HEV)或禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)或鼠肝炎病毒(MHV)導(dǎo)致的疾病。
37.權(quán)利要求28-35之一的應(yīng)用，其中所述冠狀病毒相關(guān)疾病是由SARS冠狀病毒(SARS-CoV)導(dǎo)致的疾病。
38.權(quán)利要求37的應(yīng)用，其中所述SARS病毒是包含圖2一個(gè)或多個(gè)序列的正義單鏈RNA病毒(SARS冠狀病毒)。
39.權(quán)利要求28的應(yīng)用，其中所述SARS病毒是對(duì)應(yīng)于GenBank登錄號(hào)AY274119或AY278741或AY338175或AY338174或AY322199或AY322198或AY322197或AH013000或AY322208或AY322207或AY322206或AY322205或AH012999的正義單鏈RNA病毒(SARS冠狀病毒)。
40.治療或預(yù)防動(dòng)物冠狀病毒相關(guān)疾病的方法，所述動(dòng)物優(yōu)選感染冠狀病毒的脊椎動(dòng)物，更優(yōu)選鳥或哺乳動(dòng)物，尤其是人，猿或嚙齒動(dòng)物，所述方法包括對(duì)所述動(dòng)物優(yōu)選脊椎動(dòng)物，更優(yōu)選鳥或哺乳動(dòng)物，尤其是人，猿或嚙齒動(dòng)物與藥物可接受的載體一起給藥干擾素。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述干擾素與疫苗，抗體和/或抗病毒劑一起給藥。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述疫苗，抗體和/或抗病毒劑選自滅活的全病毒疫苗，減毒疫苗，亞單位疫苗，重組疫苗，被動(dòng)免疫的抗體，核苷類似物例如三氮唑核苷，RNA依賴的RNA聚合酶抑制劑，蛋白酶抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及病毒學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供分離的屬于冠狀病毒的實(shí)質(zhì)為哺乳動(dòng)物的正義單鏈RNA病毒(SARS)及其組分。分析了PEG化的干擾素－α對(duì)SARS感染的影響。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1784422SQ200480012469
公開日2006年6月7日 申請(qǐng)日期2004年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月8日
發(fā)明者巴托洛梅烏斯·萊昂納德斯·哈格曼斯, 泰斯·庫(kù)伊肯, 羅納爾杜斯·阿德里亞努斯·馬里亞·富希耶, 艾伯塔斯·多米尼克斯·馬爾切利納斯·葉拉斯穆斯·奧斯特豪斯 申請(qǐng)人:科羅諾瓦蒂夫股份有限公司