專利名稱：NF－kB的活化特異性抑制劑和治療心血管疾病中的炎性過程的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于NF-kB的活化特異性抑制的化合物、含有所述化合物作為活性劑的藥物組合物和所述化合物在制備用于治療或預(yù)防心血管疾病，特別是動脈粥樣硬化的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
已知某些噻唑并[2，3-a]嘧啶-6-羧酸類來自DATABASECHEMCATS[在線]Chemical Abstracts Service，Columbus，Ohio，US；XP002247262和INTERCHIM，Montlucon，Cedex，F(xiàn)rance，
公開日09.07.2002；目錄名稱INTERCHIM INTERMEDIATES。從該文件中未得知這些化合物的醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
已知某些呋喃-2-羧酸亞芐基酰肼衍生物在Beilstein注冊號13281-56-6、125274-01-3(現(xiàn)在的化合物68)、7640046、6805515和211942下。已知某些噻吩-2-羧酸亞芐基酰肼衍生物在Beilstein注冊號191435、5872866下。
Tozkoparan B.等在《藥物與藥物化學(xué)學(xué)報》(Arch.Pharm.Pharm.Med.Chem.)331，201-206，(1998)中披露了某些噻唑并[2，3-a]嘧啶類的合成和抗炎活性。然而，該文件沒有提及這些抗炎化合物的任何可能的作用機(jī)理。Ertan M.等在《藥物學(xué)報》(Arch.Pharm.)(Weinheim)324，135-139(1991)中披露了適用作噻唑并[2，3-a]嘧啶類合成中的中間體化合物的2-硫代-1，2，3，4-四氫嘧啶衍生物的合成。
WO 01/30774和Hehner，S.P.等《免疫學(xué)雜志》(Journal ofImmunology)163(10)，5617-5623涉及使用在結(jié)構(gòu)上與本發(fā)明化合物無關(guān)的化合物作為NF-kB活化的抑制劑。
不同的毒性過程在引起動脈粥樣硬化中起作用，其中膽固醇和其它類脂是最重要的因素。然而，這些過程發(fā)生在早期青春期年齡段且對動脈粥樣硬化并發(fā)癥而言僅具有有限的病理學(xué)相關(guān)。對該病預(yù)后和表現(xiàn)而言更重要的是中老年患者中動脈粥樣硬化改變的進(jìn)展。動脈粥樣化發(fā)展(atheroprogression)主要受內(nèi)皮中的炎癥過程驅(qū)動，這些過程依次受到動脈粥樣硬化的不同危害因素維持，諸如吸煙、高血壓、高脂血癥和糖尿病。動脈粥樣硬化中的慢性炎癥受到特異性細(xì)胞因子維持，該細(xì)胞將白細(xì)胞募集到損傷處，由此誘導(dǎo)動脈血管壁內(nèi)炎癥狀態(tài)的惡性循環(huán)[Ross，R，《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》(N.Engl.J.Med.)340115-126，1999]。
這種慢性炎癥過程發(fā)生的機(jī)理開始由血小板內(nèi)皮相互作用引起[Ross，R，《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》(N.Engl.J.Med.)340115.126，1999]。當(dāng)血小板被活化時，已知它們將細(xì)胞因子和生長因子釋放入其周圍環(huán)境[Gawaz M，《循環(huán)》(Circulation.)961809-1818；19971。在動脈粥樣化過程中的早期觀察到血小板與內(nèi)皮表面粘著且這與生物活性分子，例如IL-1B[Gawaz M，《動脈粥樣硬化》(Atherosclerosis.)14875-85；2000]或CD40配體[Henn V；《自然》(Nature.)391591-594；1998]的釋放有關(guān)。早期動脈粥樣硬化的特征還在于單核細(xì)胞與內(nèi)皮粘著并在內(nèi)膜層中累積，伴隨泡沫細(xì)胞形成。這些活化的血小板能夠誘導(dǎo)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子NF-kB活化[Gawaz，M《循環(huán)》(Circulation.)981164-1171；1998]。除血小板外，其它具有維持動脈粥樣硬化的決定性作用的突出的內(nèi)皮表面受體具有NF-kB系統(tǒng)作為共同的信號傳導(dǎo)途徑，例如LOX-1受體或toll-類受體[Metha JL& L；D，《美國心血管學(xué)院學(xué)報》(J.Am.Coll.Cardiol.)391429-1435；2002；Dunne；A & O′Neill LA；《科學(xué)》(Science)STKE 2003(171)re 37]。
NF-kB是介導(dǎo)早期炎癥反應(yīng)基因，諸如MCP-1中具有特別重要性的遍在轉(zhuǎn)錄因子[B uerle，P；《細(xì)胞》(Cell.)8713-20；1996]，為單核細(xì)胞的強(qiáng)化學(xué)引誘物且在動脈粥樣硬化組織中富含的C-C趨化因子[Neiken；《臨床研究雜志》(J.Clin.Invest.)881121-1127；1991]。在未受刺激的細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)NF-kB在細(xì)胞質(zhì)中為與抑制性IkB蛋白，例如IBα、-β和-ε結(jié)合的二聚體，最常見的是p50/p65，這可以防止NF-kB進(jìn)入細(xì)胞核。當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞因子、微生物產(chǎn)物或氧化應(yīng)激刺激時，特異性激酶使IkB磷酸化，導(dǎo)致其被蛋白酶體快速遍在蛋白質(zhì)依賴性蛋白水解降解。NF-kB從IkB中釋放導(dǎo)致NF-kB進(jìn)入細(xì)胞核，在那里它與啟動子或增強(qiáng)子區(qū)中的特異性kB序列結(jié)合，由此活化參與炎癥、免疫、生長和編程性細(xì)胞死亡過程中的靶基因的轉(zhuǎn)錄[B uerle，P；《細(xì)胞》(Cell.)8713-20；1996]。
導(dǎo)致IkB磷酸化的信號傳導(dǎo)事件的關(guān)鍵作用對已經(jīng)被鑒定的IkB激酶(IKK)復(fù)合物起作用[Karin；《免疫學(xué)綜述年鑒》(Annu.Rev.Immunol.)18621-663；1996]。典型地，這種復(fù)合物含有兩種激酶-活性成分，即IKK-α和IKK-β以及稱作IKK-γ的可能涉及復(fù)合物穩(wěn)定或有助于其調(diào)節(jié)的激酶-失活連接物。IKK-α的功能仍然不清楚，但已經(jīng)提示它在分化和增殖方面起作用，而IKK-β被視為主要的IkB磷酸化激酶且涉及促炎過程和編程性細(xì)胞死亡過程[Karin；《免疫學(xué)綜述年鑒》(Annu.Rev.Immunol.)18621-663；1996]。
活化的血小板誘導(dǎo)使IkB-α和-ε蛋白水解的內(nèi)皮I復(fù)合物的短暫活化，這與在IL-1β刺激后觀察到的作用類似。將IKK-β鑒定為來自IKK復(fù)合物的最重要的激酶且IKK-β的顯性負(fù)性突變體形式的過表達(dá)實(shí)質(zhì)上減少了內(nèi)皮細(xì)胞中血小板誘導(dǎo)的IkB-和MCP-1啟動子-依賴性轉(zhuǎn)錄以及MCP-1分泌[Gawaz，M；《血栓與淤血》(Thromb Haemost.)2002年8月；88(2.)307-14；2002]。這導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞中的粘著蛋白VCAM和ICAM顯著減少。這些粘著蛋白的表面表達(dá)在動脈粥樣硬化動物模型和人的內(nèi)皮上增加。此外，這些粘著蛋白在增加炎癥細(xì)胞與內(nèi)皮粘著且進(jìn)一步在單核細(xì)胞侵入內(nèi)皮方面起重要作用。這些單核細(xì)胞進(jìn)一步分化成巨噬細(xì)胞且進(jìn)一步維持動脈粥樣化發(fā)展中的炎癥。因此，通過抑制IKK-β抑制這種信號傳導(dǎo)破壞了動脈粥樣化發(fā)展中的炎癥途徑中的關(guān)鍵步驟。
已經(jīng)描述了抑制NF-kB活性的不同手段。一個實(shí)例為對IKK-γ/NEMO signalsome復(fù)合物結(jié)合的抑制[May，M.J；《科學(xué)》(Science)2891550-1554；2000]。Signalsome復(fù)合物的裝配對IkB的有效磷酸化和NF-kB的連續(xù)抑制而言是必不可少的。另一種手段為對NF-kB抑制的激酶的催化結(jié)構(gòu)域的抑制。當(dāng)NF-kB系統(tǒng)遍在并為各種細(xì)胞過程的原因時，理想的是特異性抑制炎癥過程中超射(overshooting)NF-kB活性，而不影響基本活性。
發(fā)明概述本發(fā)明解決的問題在于提供具有抑制NF-kB的活化型而不影響基本活性的特異性能力的化合物，該化合物用于治療動脈粥樣化發(fā)展中的炎癥過程。這類化合物在生產(chǎn)藥物，尤其是在控制或預(yù)防上述類型的急性和/或慢性心血管疾病中的應(yīng)用也是本發(fā)明的目的。
按照權(quán)利要求解決這一問題。本發(fā)明提供了通過一個總的發(fā)明概念聯(lián)系的化合物，所述的概念基于如下特定技術(shù)特征抑制動脈粥樣化發(fā)展中NF-kB介導(dǎo)的炎癥(特別是NF-kB系統(tǒng)的活化型)而沒有完全NF-kB抑制的有害不良作用。本發(fā)明解決了治療動脈粥樣硬化的重要問題。本發(fā)明的化合物抑制NF-kB途徑，由此治療或預(yù)防動脈粥樣硬化動脈中的慢性炎癥過程。這類化合物特異性抑制主要在動脈粥樣硬化中發(fā)現(xiàn)的NF-kB系統(tǒng)的活化型[Brand K等；《臨床研究雜志》(JClin Invest.)1996；97(7)1715-22]而不會影響基本的NF-kB活性。新原理并不以NF-kB調(diào)節(jié)激酶的活性結(jié)構(gòu)域?yàn)槟繕?biāo)，而目標(biāo)在于IKK-α和IKK-β與NEMO的signalsome復(fù)合物的穩(wěn)定性。這種復(fù)合物的完整性對充分IkB磷酸化和NF-kB的連續(xù)活化而言必不可少[May M.等；《科學(xué)》(Science)2891550-1553；2000]。此外，這些化合物對signalsome復(fù)合物具有特異性蛋白水解活性，對NEMO具有最高蛋白水解活性，而對IKK-α和IKK-β的活性更弱。其它不依賴于NF-kB signalsome復(fù)合物的蛋白質(zhì)不受這種蛋白水解活性影響。直接抑制激酶IKK-α或IKK-β具有嚴(yán)重的不利作用，諸如誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡，具有重度肝功能障礙[Li等；《科學(xué)》(Science)284321-325；1999]或免疫抑制副作用[Lavon I等；《自然藥物》(Nature Medicine)6(5)；573-577；2000]。因此，通過抑制NF-kB相關(guān)激酶的催化結(jié)構(gòu)域治療動脈粥樣硬化中的炎癥過程的概念因不允許在患者中全身應(yīng)用的有害副作用而存在缺陷。
本發(fā)明的第一個一般的方面涉及用作藥物的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽或酯，它由如下通式(A)表示 其中R表示任選取代的苯基或吡啶基；R4表示羥基，氨基，直鏈或支鏈烷氧基，直鏈或支鏈烷基，環(huán)烷氧基，烷氨基，環(huán)烷氨基，二烷氨基，R5表示氫原子，直鏈或支鏈烷基，R6和R7可以相同或不同，表示氫原子，鹵原子，直鏈或支鏈烷基，直鏈或支鏈烷氧基，直鏈或支鏈鏈烯基，環(huán)烷基，芳基，X、Y和Z可以相同或不同，表示氫原子，鹵原子，羧基，硝基，氰基，烷基，烷氧基，或酰基。
本發(fā)明的第二個一般的方面涉及用作藥物的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽或酯，它由如下通式(B)表示 其中虛線獨(dú)立地表示單鍵或雙鍵；
R表示任選取代的苯基或吡啶基；R4表示羥基，氨基，直鏈或支鏈烷氧基，直鏈或支鏈烷基，環(huán)烷氧基，烷氨基，環(huán)烷氨基，二烷氨基，R5表示氫原子，直鏈或支鏈烷基，X1表示O、S或NH；X、Y和Z可以相同或不同，表示氫原子，鹵原子，羧基，硝基，氰基，烷基，烷氧基，或?；?。
在第一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，通式(B)中的虛線都為雙鍵。
在特別按照第一個優(yōu)選的實(shí)施方案的第二個優(yōu)選的實(shí)施方案中，R表示取代的苯基。
在特別按照第一個或第二個優(yōu)選的實(shí)施方案的第三個優(yōu)選的實(shí)施方案中，R4表示直鏈或支鏈烷氧基。
在特別按照第一個至第三個優(yōu)選實(shí)施方案之一的第四個優(yōu)選的實(shí)施方案中，R5表示直鏈或支鏈烷基。
在特別按照第一個至第四個優(yōu)選實(shí)施方案之一的第五個優(yōu)選的實(shí)施方案中，X1表示O。
在特別按照第一個至第四個優(yōu)選實(shí)施方案之一的第六個優(yōu)選的實(shí)施方案中，X、Y和Z可以相同或不同，表示氫原子或羧基或其鹽。
在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，通式(B)的化合物為附圖7的COM 56，包括有關(guān)環(huán)外雙鍵的任意幾何異構(gòu)體和有關(guān)嘧啶環(huán)的手性中心的對映體。
在通式(A)和(B)(包括優(yōu)選的實(shí)施方案)中，R表示的苯基或吡啶基可以被1-3個取代基取代，所述的取代基選自由如下基團(tuán)組成的組鹵素，諸如氟、氯、溴和碘；氰基；羥基；硝基；羧基；氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基；直鏈或支鏈C1-7烷基羰基；直鏈或支鏈C1-7烷氧羰基；直鏈或支鏈C1-7烷氧羰基氧基；直鏈或支鏈C1-6烷氨基；直鏈或支鏈二-C1-6烷氨基；直鏈或支鏈C1-7烷基羰基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷氨基羰基；直鏈或支鏈C1-7烷氧羰基氨基；直鏈或支鏈C1-7烷氨基羰基氧基。苯基或吡啶基還可以被亞烷基二氧基取代，諸如亞甲基二氧基、乙撐二氧基或亞丙二氧基。在通式(A)和(B)中，環(huán)外雙鍵可以為E或Z構(gòu)型。本發(fā)明涉及這兩種異構(gòu)體形式及其混合物。在通式(A)和(B)中，嘧啶環(huán)可以含有手性中心。本發(fā)明涉及任意的對映體形式及其混合物。
在通式(B)中，虛線優(yōu)選都為雙鍵。
本發(fā)明的第三個一般方面涉及由如下通式(C)表示的用作藥物的化合物 其中
A和B可以相同或不同，為羥基、硝基、羧基、氨基、直鏈或支鏈C1-6烷基、直鏈或支鏈C1-6烷氧基、直鏈或支鏈C1-7烷基羰基、直鏈或支鏈C1-7烷氧羰基或直鏈或支鏈C1-6烷氨基或由如下通式(1-1)表示 其中虛線獨(dú)立地表示單鍵或雙鍵，R8和R9獨(dú)立地表示氫原子或C1-6烷基，X′和X″獨(dú)立為O或S，W為氫原子、硝基、氰基、羧基或通式-COZ′R10的基團(tuán)，其中Z′為O或S或NH，且R10為C1-6烷基；且L、L′和L″可以相同或不同，表示氫原子，羥基，烷基，烷氧基，鹵原子，羧基，烷基羰基，烷氧羰基，氨基，烷氨基，或二烷氨基，條件是A和B中至少一個由通式(1-1)表示。
在通式(C)化合物的另一個實(shí)施方案中，A或B還可以為選自氟、氯、溴或碘的鹵原子。
在通式(C)化合物的另一個實(shí)施方案中，A或B還可以為氫原子。
在優(yōu)選類的化合物中，A為氫或羥基。在優(yōu)選類型中，L、L′和L″相同或不同且表示氫原子、羥基、烷基、烷氧基或鹵原子。在另一類優(yōu)選的化合物中，A為氫且L、L′和L″中至少一個為羥基。X′和X″優(yōu)選為氧原子。此外，W優(yōu)選為硝基或氫原子。在優(yōu)選類的化合物中，虛線都表示雙鍵。
本發(fā)明的第一個方面涉及用作藥物的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽或酯，它由如下通式(I)表示 其中R1和R2可以相同或不同，表示直鏈或支鏈烷基，直鏈或支鏈鏈烯基，環(huán)烷基，芳基，或R1和R2一起可以形成亞烷基，R3表示氫原子，鹵原子，直鏈或支鏈烷基，R4表示直鏈或支鏈烷氧基，直鏈或支鏈烷基，環(huán)烷氧基，烷氨基，環(huán)烷氨基，R5表示氫原子，直鏈或支鏈烷基，R6和R7可以相同或不同，表示氫原子，鹵原子，直鏈或支鏈烷基，直鏈或支鏈烷氧基，直鏈或支鏈鏈烯基，環(huán)烷基，芳基，X、Y和Z可以相同或不同，表示氫原子，鹵原子，烷基，或?；?。
本發(fā)明的第二個方面涉及用作藥物的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽或酯，它由如下通式(II)表示
其中R1和R2可以相同或不同，表示直鏈或支鏈烷基，直鏈或支鏈鏈烯基，環(huán)烷基，芳基，或R1和R2一起可以形成亞烷基，R3表示氫原子，鹵原子，直鏈或支鏈烷基，R4表示直鏈或支鏈烷氧基，直鏈或支鏈烷基，環(huán)烷氧基，烷氨基，環(huán)烷氨基，R5表示氫原子，
直鏈或支鏈烷基，X、Y和Z可以相同或不同，表示氫原子，羧基，鹵原子，硝基，氰基，或?；?。
本發(fā)明的第三個方面涉及用作藥物的化合物或其鹽或酯，其中所述化合物由如下通式(III)表示 其中A和B可以相同或不同，由如下通式表示 其中R8和R9獨(dú)立地表示氫原子或C1-6烷基，X′為O或S，W為硝基、氰基、羧基或通式-COZ′R10的基團(tuán)，其中Z′為O或S或NH，且R10為C1-6烷基；且L表示氫原子，烷基，烷氧基，或鹵原子。
本發(fā)明另一個方面的化合物在不含細(xì)胞的用于鑒定IKK-β使IkB磷酸化的抑制劑的篩選方法中產(chǎn)生作為抑制劑的陽性結(jié)果，其中所述方法包括下列步驟(a)提供含有功能性IKK-復(fù)合物的組合物；(b)在預(yù)定條件下和有所述化合物存在下用步驟(a)的功能性IKK-復(fù)合物使包含IkB的IKK-β磷酸化結(jié)構(gòu)域的底物肽進(jìn)行磷酸化；(c)在預(yù)定條件下使步驟(b)的磷酸化底物肽與對該底物肽的IKK-β磷酸化結(jié)構(gòu)域特異的抗體反應(yīng)；(d)當(dāng)特異結(jié)合的抗體的量因存在所述化合物而低于該化合物不存在時的量時，將該化合物鑒定為抑制劑；在優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)在相同濃度和相同條件下測定時，在不含細(xì)胞的篩選方法中產(chǎn)生作為抑制劑的陽性結(jié)果的化合物與不存在化合物時相比在降低特異結(jié)合的抗體的量方面至少與COM56或COM68具有同樣活性。
本發(fā)明另一個方面的化合物在用于鑒定IKK-β使IkB磷酸化的抑制劑的細(xì)胞試驗(yàn)中產(chǎn)生作為抑制劑的陽性結(jié)果，所述試驗(yàn)包括下列步驟(a)提供細(xì)胞培養(yǎng)物；(b)使細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞在有測試化合物存在下與TNFα接觸；(c)通過使用抗-IKK-NEMO抗體的免疫沉淀法分離功能性IKK-復(fù)合物；(d)在預(yù)定條件下用步驟(c)的功能性IKK-復(fù)合物使包含IkB的IKK-β磷酸化結(jié)構(gòu)域的底物肽進(jìn)行磷酸化；(e)使步驟(d)的磷酸化底物肽與對該底物肽的磷酸化結(jié)構(gòu)域特異的抗體反應(yīng)；
(f)當(dāng)特異結(jié)合的抗體的量因存在所述測試化合物而低于該測試化合物不存在時的量時，將測試化合物鑒定為抑制劑。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)在相同濃度和相同條件下測定時，在細(xì)胞試驗(yàn)中產(chǎn)生作為抑制劑的陽性結(jié)果的化合物與不存在化合物時相比在降低特異結(jié)合的抗體的量方面至少與COM56或COM68具有同樣活性。
本發(fā)明還提供了包含用于降低NF-KB活性的化合物作為活性組分的藥物組合物。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述COM和com與數(shù)字一起表示具有本說明書中其化學(xué)結(jié)構(gòu)的所示化合物。
本發(fā)明的化合物由通式(A)、(B)、(C)、(I)、(II)和(III)表示。在所述通式中，烷基可以包括具有1-6個碳原子，優(yōu)選1-4個碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基和正己基。鏈烯基的實(shí)例可以包括具有2-6個碳原子，優(yōu)選2-4個碳原子和1-2個雙鍵的直鏈或支鏈鏈烯基，例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、異丁烯基和丁二烯基。環(huán)烷基的實(shí)例可以包括具有3-6個碳原子的那些環(huán)烷基，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基。烷氧基的實(shí)例可以包括具有1-6個碳原子，優(yōu)選1-4個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、異戊氧基和正己氧基。環(huán)烷氧基的實(shí)例可以包括那些具有3-6個碳原子的環(huán)烷氧基，例如環(huán)丙氧基、環(huán)丁氧基、環(huán)戊氧基和環(huán)己氧基。鹵原子的實(shí)例包括氟、氯、溴和碘。在所述通式中，芳基的實(shí)例可以為苯基、萘基和吡啶基，特別優(yōu)選苯基和吡啶基。亞烷基的實(shí)例可以為具有1-6個碳原子的直鏈或支鏈亞烷基，優(yōu)選含有1-4個碳原子的亞烷基。實(shí)例可以為亞甲基、亞乙基和1，3-亞丙基。烷氨基的實(shí)例可以包括具有1個或2個取代基的氨基，所述的取代基選自具有1-6個碳原子，優(yōu)選1-4個碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基和正己基。二烷氨基的實(shí)例可以包括具有2個取代基的氨基，所述的取代基選自具有1-6個碳原子，優(yōu)選1-4個碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基和正己基。環(huán)烷氨基的實(shí)例可以包括那些具有3-6個碳原子的環(huán)烷氨基，例如環(huán)丙氨基、環(huán)丁氨基、環(huán)戊氨基和環(huán)己氨基。?；膶?shí)例可以包括具有2-7個碳原子，優(yōu)選2-5個碳原子的酰基。羧基可以呈藥物上可接受的金屬鹽的形式，諸如堿金屬鹽或堿土金屬鹽。
上述基團(tuán)，特別是芳基可以含有1-3個取代基。這類取代基的實(shí)例可以包括鹵原子、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4烷硫基、C1-4烷基亞磺?；?、C1-4烷基磺?；?、羧基、C2-5烷氧羰基、硝基、氨基和C1-4烷氨基。此處，鹵原子的實(shí)例可以為氟、氯、溴和碘。C1-4烷基例如為甲基、乙基、正丙基、異丙基和正丁基。C1-4烷氧基的實(shí)例例如為甲氧基、乙氧基和丙氧基。C1-4烷硫基的實(shí)例例如為甲硫基、乙硫基和丙硫基。C1-4烷基亞磺酰基的實(shí)例例如為甲基亞磺?；?、乙基亞磺?；捅鶃喕酋；?。C1-4烷基磺酰基的實(shí)例例如為甲基磺?；⒁一酋；捅酋；?。C2-5烷氧羰基的實(shí)例可以為各自含有1-4個碳原子的具有烷氧基的那些烷氧羰基，例如甲氧羰基、乙氧羰基和丙氧羰基。C1-8烷氨基的實(shí)例可以為各自含有1-4個碳原子的具有1個或2個烷基的那些烷氨基，例如甲氨基、二甲氨基、乙氨基和丙氨基。這些取代基中的烷基部分可以為線性、支化或環(huán)狀的。
本發(fā)明的化合物還可以含有用于諸如羧基這類官能團(tuán)的常用保護(hù)基。此外，本發(fā)明的化合物還可以呈在生理條件下可以轉(zhuǎn)化成活性劑的前體藥物形式。
作為R1和R2優(yōu)選的是烷基，特別是甲基或乙基，或亞烷基，優(yōu)選亞甲基或亞乙基。作為R3優(yōu)選的是氫原子或鹵原子，特別是在芳族環(huán)的2位上。作為R4優(yōu)選的是烷氧基，特別是甲氧基、乙氧基或丙氧基。作為R5優(yōu)選的是烷基，特別是甲基、乙基或丙基。作為R6和R7優(yōu)選的是烷基，特別是甲氧基或乙氧基，或鹵原子，特別是碘。作為X、Y或Z優(yōu)選的是氫原子或鹵原子。
通式(I)的優(yōu)選類的化合物為這樣的化合物，其中R1和R2一起形成亞烷基，特別是亞甲基或亞乙基；R3為氫原子；R4為烷氧基，特別是甲氧基、乙氧基或丙氧基；R5為烷基，特別是甲基、乙基或丙基；R6和R7為烷基，特別是甲氧基或乙氧基；或鹵原子，特別是碘；X和Y為氫原子且Z為鹵原子。
通式(I)的最優(yōu)選化合物可以由如下通式表示 化合物序號41通式(B)的優(yōu)選類的化合物為其中R為取代的苯基那些化合物。取代基優(yōu)選鹵原子，特別是氯原子。通式(B)或(II)的另一類優(yōu)選化合物由其中X為間-位上的取代基，優(yōu)選羧基的化合物組成。
通式(II)的優(yōu)選類的化合物為那些化合物，其中R1和R2為烷基，特別是甲基或乙基，R3為鹵原子，特別是在芳族環(huán)的2位上，R4為烷氧基，特別是甲氧基、乙氧基或丙氧基，R5為烷基，特別是甲基、乙基或丙基，X、Y為氫原子且Z為羧基，優(yōu)選在芳族環(huán)的3或4位上。
通式(B)或(II)的最優(yōu)選化合物可由如下通式表示
化合物序號73 通式(B)的其它優(yōu)選實(shí)施方案如附圖7中所示。
通式(C)的優(yōu)選類的化合物，其中A為氫。在該組中，X′和X″優(yōu)選氧原子，L為羥基，且W為硝基。在另一組化合物中，B為烷基或烷氧基，優(yōu)選烷氧基，且L和W為氫。
通式(III)的優(yōu)選類的化合物為那些化合物，其中A和B為相同的基團(tuán)，R8和R9相同或不同且表示烷基，特別是甲基或乙基或氫原子，X′為氧原子，L為氫原子且W為硝基。
通式(C)和(III)的最優(yōu)選化合物可以由如下通式表示 化合物序號54通式(C)的其它優(yōu)選化合物如附

圖14中所示，其中特別優(yōu)選COM68。
在優(yōu)選程度最低的實(shí)施方案中，化合物的類型中不包括Beilstein注冊號13281-56-6、125274-01-3、7640046、6805515、211942、191435或5872866，對它們在制備用于治療或預(yù)防動脈粥樣硬化的藥物中的應(yīng)用不存在偏見。
對本發(fā)明化合物的鹽沒有特別的限制，只要它是藥理學(xué)上可接受的鹽，所述鹽也屬于本發(fā)明。實(shí)例可以為無機(jī)酸的酸加成鹽，諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽和磷酸鹽；和有機(jī)酸的酸加成鹽，諸如苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽和檸檬酸鹽。
此外，本發(fā)明的化合物可以以由水合物代表的溶劑合物的形式存在。另外，本發(fā)明的化合物還可以作為幾何異構(gòu)體存在。這類幾何異構(gòu)體也應(yīng)包括在本發(fā)明內(nèi)。另外，通式(I)和(II)的化合物為旋光活性的且以對映體形式存在?？梢园凑粘Ｒ?guī)的拆分方法獲得純形式的這類對映體且它們也應(yīng)包括在本發(fā)明內(nèi)。
本發(fā)明權(quán)利要求中包括的某些化合物可從不同來源商業(yè)獲得且具有諸如[305870-48-8]這類注冊號。
例如，可以通過下列方法制備本發(fā)明的化合物。
可以按照下列方案(A)制備通式(A)的化合物 其中R、R4-R7、X、Y和Z如上述所定義。
可以按照下列方案(B)制備通式(B)的化合物 其中R、R4、R5、X1、X、Y、Z和虛線如上述所定義。
可以按照下列方案1制備通式(A)和(I)的化合物
其中R1-R7、X、Y和Z如上述所定義。
可以按照下列方案2制備通式(B)和(II)的化合物 可以按照《物理科學(xué)超級科學(xué)家》(Ultra Scientist of PhysicalSciences)12(3)，277-280(2000)；《東方化學(xué)雜志》(Oriental Journalof Chemistry)，16(3)，427-430，(2000)進(jìn)行如反應(yīng)方案(A)、(B)、1和2中所示的將起始化合物(IV)轉(zhuǎn)化成通式(A)、(I)和(B)、(II)的本發(fā)明化合物。因此，在有堿，諸如乙酸鈉存在下的乙酐中用氯乙酰氯和適當(dāng)取代的醛(V)或(VI)在-30℃至該混合物的沸點(diǎn)的溫度下處理化合物(IV)。一般制備方法從Birsen Tozkoparan等《藥物與藥物化學(xué)學(xué)報》(Arch Pharm.Pharm.Med.Chem.)331，201-206(1998)中已知。
可以通過Biginelli型反應(yīng)，按照下列反應(yīng)方案制備起始化合物(IV-1) 可以通過Biginelli型反應(yīng)，按照下列反應(yīng)方案3制備起始化合物(IV)
其中R1-R5、X、Y和Z如上述所定義。
在制備起始化合物(IV-1)或(IV)的過程中，使適當(dāng)取代的醛化合物(VII-1)或(VII)與等摩爾量的適當(dāng)取代的β-酮酯(VIIIa)或1，3-二酮(VIIIb)和稍微過量的硫脲在合適的溶劑，諸如醇中在0℃至該反應(yīng)混合物的沸騰溫度的溫度下反應(yīng)。參照P.Biginelli，Ber.24，1317，2962(1896)；26 447(1893)；Martin Zaug《有機(jī)反應(yīng)》(Organic Reactions)，14，88，(1965)；D.J.Brown，《嘧啶類》(The Pyrimidines)，(Wiley，NewYork，1962)，p.440；文獻(xiàn)同上，增刊I，1970，p.326；F.Sweet，Y.Fissekis，《美國化學(xué)協(xié)會雜志》(J.Am.Chem Soc.)，95，8741(1973)，《四面體》(Tetrahedron)，58，4801-4807(2002)，J.Chem.Soc.PerkinTransactions，1，1845-1846，(2002)，和US-A 5,958,931。一般制備方法從Mevlt Ertan等《藥物學(xué)報》(Arch Pharm.)(Weinheim)324，135-139(1991)中已知。
可以按照下列反應(yīng)方案制備通式(C)的化合物 此處，L、L′、L″、X′、X″、R9、W和虛線如上述所定義。
可以按照下列反應(yīng)方案4制備通式(C)和(III)的化合物
且中L、X′、R9和W如上述所定義。
因此，按照例如《合成》(Synthesis)5，411-413，(1986)中公開的步驟使通式(IX)或(IX-1)的化合物分別與通式(X)或(X-1)的化合物縮合?？梢匀鏟aulsen，Stoy在《酰胺類化學(xué)》(The Chemistry of Amides)，Wiley，New York，1970，第515-600頁中所述，通過將5-硝基呋喃2-羧酸[645-12-5]轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的酰氯并使該酰氯與肼反應(yīng)制備原料(X)。
還可以按照下列反應(yīng)方案制備通式(C)的化合物 因此，將通式(XI)的化合物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的對稱酸酐(XII)，然后使其與通式(XIII)的化合物反應(yīng)而得到通式(C)的化合物(Wang，J.-X.(Wang，C.-H.)；Hu，Y.-L.；Cui，W.-F.(1990)“在固-液相轉(zhuǎn)移催化下由酰基氯合成酸酐”(Synthesis of Anhydrides from Acyl Chloridesunder Solid-Liquid Phase-transfer Catalysis.)-《化學(xué)研究雜志》(J.Chem.Research)(S)，84-85)。
可以將通式(A)、(B)、(C)、(I)、(II)和(III)的化合物及其藥物上可接受的鹽或酯類用作藥物，例如呈藥物制劑形式。可以優(yōu)選通過口服，例如以片劑、包衣片、糖衣丸、硬膠囊和軟膠囊、溶液、乳劑或混懸液形式給予這些藥物制劑。不過，還可以通過直腸，例如以栓劑形式，或胃腸道外，例如以注射溶液形式進(jìn)行給藥。
本發(fā)明提供了藥物組合物，它包含通式(A)、(B)、(C)、(I)、(II)或(III)的化合物，特別是如上所述的優(yōu)選化合物和藥物上可接受的載體?？梢杂盟幬锷峡山邮艿妮d體，例如用于生產(chǎn)藥物制劑的惰性無機(jī)或有機(jī)載體加工通式(A)、(B)、(C)、(I)、(II)或(III)的化合物及其藥物上可接受的鹽或酯類。例如，可以使用乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石粉、硬脂酸或其鹽等，作為用于片劑、包衣片、糖衣丸和硬膠囊這類載體。用于軟明膠膠囊的合適的載體例如為植物油、蠟、脂肪、半固體和液體多元醇類等；這取決于活性物質(zhì)的性質(zhì)，不過，就軟明膠膠囊而言，通常不需要載體。用于生產(chǎn)溶液和糖漿劑的合適的載體例如為水、多元醇類、蔗糖、轉(zhuǎn)化糖、葡萄糖等?？梢詫⒆魟?，諸如醇類、多元醇類、甘油、植物油等用于通式(A)、(B)、(C)、(I)、(II)或(III)化合物的水溶性鹽的注射水溶液，但通常不必要。用于栓劑的合適的載體例如為天然或硬化油、蠟、脂肪、半液體或液體多元醇類等。
此外，所述的藥物制劑可以含有防腐劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、甜味劑、著色劑、矯味劑、用于改變滲透壓的鹽、緩沖劑、掩蔽劑或抗氧化劑。它們還可以含有其它治療上有價值的物質(zhì)。
含有通式(A)、(B)、(C)、(I)、(II)或(III)的化合物或其藥物上可接受的鹽或酯類和治療惰性賦形劑的藥物也是本發(fā)明的目的，以及生產(chǎn)這類藥物的方法，它包括使通式(A)、(B)、(C)、(I)、(II)或(III)的一種或多種化合物或其藥物上可接受的鹽或酯類且如果需要還有一種或多種其它治療上有價值的物質(zhì)與一種或多種治療惰性載體混合成蓋侖劑型。
因此，治療心血管疾病，諸如動脈粥樣硬化的方法也是本發(fā)明的組成部分，其中該方法包括對患有任何上述疾病的患者給予有效治療或預(yù)防所述疾病的量的本發(fā)明藥物組合物。
劑量可以在寬限內(nèi)改變且當(dāng)然需符合每種特定情況中個體的需要。一般來說，用于口服或胃腸道外給藥的有效劑量在0.01-20mg/kg/天之間，對所有所述適應(yīng)征而言，優(yōu)選劑量為0.1-10mg/kg/天。因此用于體重為70kg的成年人的每日劑量在0.7-1400mg/天，優(yōu)選7-700mg/天。
本發(fā)明的化合物在細(xì)胞和不含細(xì)胞的試驗(yàn)中產(chǎn)生作為抑制劑的陽性結(jié)果，其中使用IKK-復(fù)合物，它是包括抗-IKK-NEMO抗體的免疫沉淀的IKK-復(fù)合物。在不含細(xì)胞的試驗(yàn)中，步驟(a)優(yōu)選包括使細(xì)胞接觸TNFα，隨后使用蛋白質(zhì)A和抗-IKK-NEMO抗體通過免疫沉淀分離IKK-復(fù)合物。在不含細(xì)胞的方法中，優(yōu)選在步驟(a)后加入測試化合物。在細(xì)胞試驗(yàn)中，在步驟(a)前加入測試化合物。在試驗(yàn)中，鑒定優(yōu)選基于放大的發(fā)光鄰近均勻試驗(yàn)且其中優(yōu)選使底物肽生物素化并固定在鏈霉抗生物素供體珠上。優(yōu)選將抗體固定在蛋白質(zhì)A-接受體珠上。試驗(yàn)的底物肽優(yōu)選為IkBα或Btn-Ahx-GLKKERLLDDRHDSGLDSMKDEE。優(yōu)選地，對底物肽的IKK-β磷酸化結(jié)構(gòu)域具有特異性的抗體為抗-磷酸-I κB α-抗體。本發(fā)明的化合物選自具有小于1500道爾頓，更優(yōu)選小于1000道爾頓分子量的小分子，優(yōu)選非肽類分子。這些化合物優(yōu)選為含有至少3個或4個任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)的非支化側(cè)鏈的化合物，所述任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)可以被具有不超過4個任選取代的碳或氮原子的長度的間隔基隔開。
附圖簡述附圖1a.化合物73對TNFα刺激后IKK-復(fù)合物活性的作用。顯示了化合物73抑制IκB肽磷酸化的劑量反應(yīng)曲線。用TNFα(20ng/ml)刺激海拉細(xì)胞并在α篩選試驗(yàn)(Perkin Elmer)中測定免疫沉淀的IKK-復(fù)合物的活性。以最大熒光計數(shù)％測定活性的相對下降。將n＝3次實(shí)驗(yàn)的總結(jié)表示為平均值+/-SEM附圖1b.化合物41、48和73對IKK-復(fù)合物的差別抑制。在TNFα(20ng/ml)刺激后用不同濃度抑制劑(#41、#48和#73)處理海拉細(xì)胞后進(jìn)行雙重IKK-活性測定。用抗NEMO-抗體或在對照組中用非特異性IgG免疫沉淀IKK-復(fù)合物。測定IκB肽磷酸化的激酶活性的下降并通過α篩選系統(tǒng)(Perkin Elmer)測定熒光計數(shù)。
附圖2a.不同化合物對NF-κB活化的作用。用100μM的不同化合物將THP-1細(xì)胞處理1小時，隨后用LPS(1μg/ml)刺激。對NF-κB進(jìn)行電泳遷移率移動試驗(yàn)(EMSA)。將核提取物與帶有對NFκB的特異性結(jié)合序列的放射標(biāo)記的DNA探針一起孵育。通過光密度法分析經(jīng)X光片曝光檢測的標(biāo)記NF-κB的信號強(qiáng)度。通過與100％的LPS對照品相比的SP-1結(jié)合校準(zhǔn)而證實(shí)了10種測試化合物對NF-κB活性的抑制作用。未進(jìn)行LPS刺激的細(xì)胞沒有表現(xiàn)出顯著的NF-κB活性。
附圖2b.化合物54對NF-κB釋放的劑量依賴性抑制。將不同濃度的化合物54加入到THP-1細(xì)胞中1小時。在用LPS(1μg/ml)刺激1小時后，制備核提取物用于在EMSA試驗(yàn)中分析NF-κB活性。在上部框中顯示暴露給EMSA凝膠后有代表性的X光片。該圖概括了與100％的LPS對照品相比的SP-1結(jié)合校準(zhǔn)的NF-κB活性的劑量依賴性抑制。在下部框中，與SP1結(jié)合的寡核苷酸作為對照被顯示。
附圖3a.化合物73激發(fā)IKK-復(fù)合物降解。將海拉細(xì)胞與不同濃度的化合物73一起孵育，隨后進(jìn)行TNFα刺激(20ng/ml)。分析另外兩個使用或不使用TNFα刺激的對照組。通過蛋白印跡分析，使用特異性抗-NEMO抗體(Santa Cruz)測定細(xì)胞裂解物中NEMO的量。在相同提取物中，用特異性抗-IKKα/β-抗體(Santa Cruz)研究IKKα/β水平。有代表性的蛋白印跡顯示出NEMO的劑量依賴性蛋白水解和在更高的化合物73濃度下IKK-α和IKK-β的劑量依賴性蛋白水解。
附圖3b.化合物73破壞IKKα/β復(fù)合物與NEMO結(jié)合。用10M和100μM的化合物73處理海拉細(xì)胞，隨后進(jìn)行TNFα刺激(20ng/ml)。用抗-NEMO-抗體(Santa Cruz)和蛋白質(zhì)A-瓊脂糖凝膠使IKK-復(fù)合物從胞質(zhì)提取物中共沉淀。使用特異性抗-IKKα/β-抗體在蛋白印跡中分析沉淀物的IKKα/β蛋白。在使用非特異性家兔-IgG抗體進(jìn)行免疫沉淀的對照組中，沒有檢測到與IKKα/β的共沉淀?；衔?3劑量依賴性地抑制活化的海拉細(xì)胞中IKKα/β與NEMO的結(jié)合。
附圖4.化合物73的細(xì)胞滲透性。制備胞質(zhì)提取物并通過Elisa分析?；衔?3在ELISA讀出器中在450nm波長處產(chǎn)生了特征信號。用100μM的化合物73將完整的海拉細(xì)胞處理1小時。該圖顯示與在緩沖液中的100μM樣品相比與化合物73保溫后來自胞質(zhì)提取物的特征信號。對照中顯示了來自未處理細(xì)胞的胞質(zhì)提取物。
附圖5.化合物73和54在細(xì)胞生存力中的影響。將海拉細(xì)胞與化合物73(100μM)或化合物54(100μM)一起孵育3小時。為了細(xì)胞的完整性和活性代謝，加入WST-1試劑。使用Elisa讀出器在特征波長處測定吸收度。
附圖6是通過提供作為抑制劑的陽性結(jié)果表征本發(fā)明化合物的細(xì)胞和非細(xì)胞試驗(yàn)的示意圖。
附圖7.通式(B)IKK-抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)(COM 73家族)。在比較中證實(shí)與化合物COM 73具有結(jié)構(gòu)相似性的IKK-抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)。將這8種化合物的IKK-活性抑制的功效定為通過如方法中所述NEMO降解測定的IKK活性抑制百分比。
附圖8a.COM56對細(xì)胞IKK-活性的抑制作用。在細(xì)胞試驗(yàn)中驗(yàn)證了化合物56抑制IKK活性的劑量反應(yīng)曲線。在增加濃度的COM 56存在下，用TNFα(20ng/ml)刺激海拉細(xì)胞。免疫沉淀IKK-復(fù)合物并在如方法中所述的α篩選試驗(yàn)(Perkin Elmer)中測定IKK的活性。以最大熒光計數(shù)的百分比測定活性的相對下降。將n＝4次實(shí)驗(yàn)的總結(jié)表示為平均值+/-SEM。
附圖8b.COM 73和56對不含細(xì)胞的IKK-活性的抑制作用。在不含細(xì)胞的試驗(yàn)中通過直接比較驗(yàn)證了化合物73和56抑制IKK活性的劑量反應(yīng)曲線。用TNFα(20ng/ml)刺激海拉細(xì)胞并對IKK-復(fù)合物連續(xù)進(jìn)行免疫沉淀。在增加濃度的COM 73和56存在下，在不含細(xì)胞的條件下使用α篩選試驗(yàn)(Perkins Elmer)如方法中所述測定IKK活性。以最大熒光計數(shù)的百分比測定活性的相對下降。將n＝2次實(shí)驗(yàn)的總結(jié)表示為平均值+/-SEM。
附圖9.COM 73對IκBα磷酸化的抑制作用。增加濃度的COM 73確實(shí)依賴性地抑制IκBα的磷酸化。在增加濃度的COM 73存在下用TNFα預(yù)刺激海拉細(xì)胞。使用特異性抗-磷酸化-抗體和蛋白質(zhì)印跡分析細(xì)胞裂解物的IκBα磷酸化。顯示了有代表性的蛋白質(zhì)印跡。
附圖10.化合物73對IKK-復(fù)合物降解的作用。顯示化合物73對IKK-復(fù)合物降解的劑量反應(yīng)曲線。將海拉細(xì)胞與不同濃度的化合物73一起孵育，隨后進(jìn)行TNFα刺激(20ng/ml)。在細(xì)胞裂解后，通過蛋白質(zhì)印跡分析，使用特異性抗-NEMO-抗體(Santa Cruz)測定NEMO蛋白的量。使用特異性抗-IKKα/β-抗體(Santa Cruz)和蛋白質(zhì)印跡研究IKKα/β的量。對蛋白質(zhì)的量進(jìn)行定量并以對照的百分比測定增加濃度的COM 73引起的蛋白質(zhì)量的相對減少。將n＝2次實(shí)驗(yàn)的總結(jié)表示為平均值+/-SEM。
附圖11.COM 56破壞了體外IKKα/β與NEMO結(jié)合。用TNFα刺激(20ng/ml)處理海拉細(xì)胞。使IKK-復(fù)合物從用抗-NEMO-抗體(Santa Cruz)和蛋白質(zhì)A-瓊脂糖凝膠提取的胞質(zhì)中共沉淀。將沉淀與化合物56一起孵育并在蛋白質(zhì)印跡中使用特異性抗體分析IKKα/β蛋白的復(fù)合物整體性?；衔?6劑量依賴性地破壞了體外IKKα/β與NEMO結(jié)合。將IKKα/β蛋白的量表示為未處理海拉細(xì)胞的百分比。
附圖12.IV施用后COM 56的血清濃度。通過質(zhì)譜法分析單劑量IV施用后COM 56的血清水平。可以在使用27.5和55μg COM 56IV注射2分鐘和20分鐘后測定到可觀的血清水平。給出了2次實(shí)驗(yàn)的單一值。
附圖13.COM 56對全身炎癥的抑制。使用特異性ELISA試驗(yàn)在大鼠中測定LPS刺激之前和之后的全身TNFα釋放。用COM 56預(yù)處理大鼠抑制了全身TNFα釋放。顯示了n＝4次實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。
附圖14.COM 54家族IKK抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在比較中顯示了與化合物COM 54具有高結(jié)構(gòu)相似性的IKK抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
附圖15.對IκBα-磷酸化抑制活性的測定。在比較中顯示了不同IKK抑制劑對IκBα磷酸化的作用。在有10和100μM的不同IKK抑制劑存在下用TNFα預(yù)刺激海拉細(xì)胞。使用特異性抗-磷酸化-抗體和蛋白質(zhì)印跡分析細(xì)胞裂解物的IκBα磷酸化。證示了有代表性的蛋白質(zhì)印跡。
附圖16.用COM 54和類似物處理后的細(xì)胞存活力。將海拉細(xì)胞與具有增加濃度的化合物54及其結(jié)構(gòu)類似物一起孵育1天。為了細(xì)胞的完整性和活性代謝，加入WST-1試劑。使用Elisa讀出器在特征波長處測定吸收度并以對照的百分比測定。顯示了n＝4次實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。
附圖17.COM 68對人內(nèi)皮細(xì)胞中動脈粥樣硬化的抑制。在IL-1和TNFα刺激都顯示COM 68在HUVEC細(xì)胞中抑制ICAM表達(dá)。通過HUVEC細(xì)胞的FACS量度測定ICAM表達(dá)。顯示了n＝3次實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。
以舉例說明的方式提供如下實(shí)施例，這些實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例制備實(shí)施例12-[5-(3-羧基苯基)-呋喃-2-基亞甲基]-5-(4-氯苯基)-7-甲基-3-氧代-2，3-二氫-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-羧酸乙酯(COM 56) (1)3.426g(45mmol)(2)3.82ml(30mmol)(3)4.217g(30mmol)PPEa 4.5gTHF45ml
(aPPE＝按照《合成通訊》(Synlett)1988，718-720制備的多磷酸乙酯)在100ml RB燒瓶中將試劑溶于THF并在氮?dú)庀禄亓?小時。通過TLC監(jiān)測進(jìn)展(平板Merck 5554，洗脫劑氯仿-甲醇 10∶1，產(chǎn)物Rf＝0.7)。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去一半溶劑并將殘余物傾倒在水上以產(chǎn)生產(chǎn)物的沉淀，為白色結(jié)晶。將其過濾出來并用蒸餾水和乙醚連續(xù)洗滌。
產(chǎn)率6.3g(67，5％)NMR與結(jié)構(gòu)相符 量(4)1.274g(4，1mmol)(5)0.397g(4.2mmol)(6)0.884g(4，1mmol)無水乙酸鈉0.336g(4，1mmol)乙酐6ml乙酸8ml混合上述物質(zhì)的混合物并回流5小時。通過TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)展(平板Merck 5554，洗脫劑氯仿-甲醇 10∶1，產(chǎn)物Rf＝0.4)。在冷卻后，將該混合物傾倒在水上，用二氯甲烷提取沉淀的產(chǎn)物。用10％ Na2CO3溶液將有機(jī)相洗滌兩次，用無水MgSO4干燥并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)。使用乙醚-正己烷混合物使獲得的殘余物結(jié)晶。
產(chǎn)率2.0g(88％)NMR(DMSO-d6，ppm)8.37bs，1H；8.06d，1H；7.96d，1H和7.66t，1H(Ph/COOH/)；7.64s，1H(Ph-CH＝呋喃)；7.41d，2H和7.33d，2H(Ph/Cl/)；7.40d，1H和7.26d，1H(呋喃)；6.01s，1H(嘧啶-4)；4.1q，2H和1.14t，3H(OCH2CH3)；2.49s，3H(CH3)。
制備實(shí)施例25-硝基-呋喃-2-羧酸(2-羥基-亞芐基)-酰肼(COM68) 反應(yīng)條件a)KHCO3，n-Bu4Nl催化劑，甲苯，0℃→室溫，2小時；b)CH2Cl2，0℃→室溫，2.5小時。
一般步驟在使用前將所有使用的溶劑干燥或蒸餾。5-硝基-2-糠酰氯(1)購自Lancaster且水楊醛腙(3)購自Sigma-Aldrich。
5-硝基-呋喃-2-羧酸酐(2)在0℃下向750mg(4.27mmol)5-硝基-2-糠酰氯(1)在120ml甲苯中的溶液中加入471mg(4.70mmol)KHCO3和158mg(0.427mmol)碘化四丁基銨。在該溫度下5分鐘后，將該混合物在環(huán)境溫度下劇烈攪拌2小時。然后過濾出少量沉淀并將該混合物傾入120ml冰冷的水。在分離各相后，用60ml二氯甲烷將水相提取兩次。用硫酸鈉干燥合并的有機(jī)相并在減壓下除去溶劑。使粗產(chǎn)物從二氯甲烷中重結(jié)晶而得到117mg(0.395mmol，19％)5-硝基-呋喃-2-羧酸酐(2)的灰色粉末。5-硝基-呋喃-2-羧酸(2-羥基-亞芐基)-酰肼(4)將35.0mg(0.118mmol)的5-硝基-呋喃-2-羧酸酐(2)大部分溶于10ml二氯甲烷。在0℃下向該混合物中加入16.9mg(0.124mmol)水楊醛腙(3)在3.5ml二氯甲烷中的溶液。該溶液的顏色緩慢改變成亮黃色。在0℃下30分鐘后，除去冷卻并將該混合物在環(huán)境溫度下攪拌另外2小時。然后用10ml飽和NaHCO3溶液將反應(yīng)混合物提取兩次并用10ml飽和NaCl溶液提取兩次。用5ml二氯甲烷將合并的水層提取兩次。用硫酸鈉干燥有機(jī)相并在減壓下除去溶劑。使粗產(chǎn)物從二氯甲烷中重結(jié)晶而得到12.0mg(0.0436mmol，37％)5-硝基-呋喃-2-羧酸(2-羥基-亞芐基)-酰肼(4)的亮黃色粉末。
表15-硝基-呋喃-2-羧酸(2-羥基-亞芐基)-酰肼(4)在丙酮-d6中的NMR數(shù)據(jù)
表25-硝基-呋喃-2-羧酸(2-羥基-亞芐基)-酰肼(4)在二甲亞砜-d6中的NMR數(shù)據(jù)
5-硝基-呋喃-2-羧酸(2-羥基-亞芐基)-酰肼(4)的特性溶解度使用等分的化合物4(1.2mg)和500μl各溶劑進(jìn)行溶解度試驗(yàn)。
表35-硝基-呋喃-2-羧酸(2-羥基-亞芐基)-酰肼(4)的溶解度
-0％溶解；++++100％溶解；+++80％溶解；+20％溶解異構(gòu)化當(dāng)將化合物4溶于二甲亞砜-d6時，在室溫下數(shù)分鐘內(nèi)觀察到了第二組NMR信號。這些信號暫定歸因于化合物4的順式/反式異構(gòu)體。這種異構(gòu)體的信號強(qiáng)度占主要產(chǎn)物引起的信號的約10％。在丙酮-d6中，這種異構(gòu)化更緩慢且在數(shù)天內(nèi)發(fā)生。
實(shí)施例1NF-kB依賴性IκB肽磷酸化的抑制(A)方法激酶試驗(yàn)方案將海拉細(xì)胞維持在補(bǔ)充了10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、青霉素(50個單位/ml)和鏈霉素(50μg/ml)的Dulbecco的改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(Invitrogen)中。在用不同化合物處理前24小時，將海拉細(xì)胞以5×106/孔的密度平板固定在100-mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中至90％匯合。
將細(xì)胞與所示濃度的不同藥物一起孵育1小時，用PBS洗滌兩次并用20ng/ml TNFα(Roche)刺激。7分鐘后，用冰冷PBS將細(xì)胞洗滌兩次，隨后刮取并轉(zhuǎn)入1,5ml微量離心管。在接近4℃下以2000rpm離心2分鐘后，除去PBS上清液并向沉淀中加入200μl裂解-緩沖液(10mM Hepes，pH 7.9、0，1％ NP40、10mM，300mM蔗糖、10mM KCl、15mM MgCl2、1mM DTT、0，5mM PMSF和抗蛋白酶、抑肽酶、亮抑蛋白酶肽各0，75μg/ml(Sigma)。將重新懸浮的沉淀在冰上孵育5分鐘并以13000g離心30秒。將上清液，胞質(zhì)提取物加到200μl TNT-緩沖液(200mM NaCl、20mM Tris/HCl pH 7，5、1％ Triton X-100)中。阻斷非特異性結(jié)合，步驟如下在接近4℃下與3μg正常家兔IgG(Sigma)和6mg重新懸浮和預(yù)洗滌的蛋白質(zhì)A瓊脂糖凝膠CI-4B(Pharmacia Biotech)一起孵育30分鐘隨后在4℃下使用2μg抗-NEMO-抗體(Santa Cruz Biotechnology)和6mg重新懸浮和預(yù)洗滌的蛋白質(zhì)A瓊脂糖凝膠CI-4B(Parmacia Biotech)免疫沉淀1，5小時。在用TNT緩沖液洗滌三次和用激酶緩沖液(20mM HEPES，pH 8.0、10mM MgCl2、100μM Na3VO4、20mM-磷酸甘油、50mM NaCl、2mM二硫蘇糖醇、0.5μM苯甲基磺酰氟、抗蛋白酶、抑肽酶、亮抑蛋白酶肽各0.75μg/ml(Sigma))洗滌三次后，使激酶反應(yīng)在30℃和有1mM ATP(Sigma)和1μM底物肽Btn-Ahx-GLKKERLLDDRHDSGLDSMKDEE-amid(Biosyntan)存在下的25μl激酶緩沖液中進(jìn)行60分鐘。以16000g離心1分鐘后，將10μl上清液加入到白色384 proxi-平板(Packard)。將6，6μl檢測-緩沖液(20mM Hepes pH 7，5、100mM NaCl、1％ Tween、0，1mM BSA、50μg/ml蛋白質(zhì)A-接受體珠、250μg/ml鏈霉抗生物素-供體珠(均來自Perkin-Elmer)、4nM抗-磷酸-IKB抗體(Santa Cruz Biotechnology)分配至各孔。在孵育1，5小時后，通過α篩選讀出器(Perkin Elmer)測定平板。
結(jié)果通過Ser-32和Ser-36上的細(xì)胞因子-誘導(dǎo)的磷酸化調(diào)節(jié)IκB蛋白。為了確定幾種化合物是否抑制TNFα誘導(dǎo)的IkB蛋白磷酸化，用這些化合物處理TNFα-刺激的海拉細(xì)胞。使用抗-NEMO-抗體免疫沉淀特異性IkB-激酶-復(fù)合物(IKK)并與相當(dāng)于IKB特異性磷酸化側(cè)面(side)的肽一起孵育。通過α篩選(Perkin Elmer)分析磷酸化肽的產(chǎn)率。三種不同化合物，即41、48和73對IKK-活性具有作用。更具體地測試化合物73?；衔?3劑量依賴性地抑制IKK-活性，IC50約為8μM(附圖1a)?；衔?1和48抑制IKK-活性，IC50值在10μM-100μM范圍內(nèi)。(附圖1b)?；衔?1僅部分溶于PBS且實(shí)際處理濃度未知。
在細(xì)胞試驗(yàn)中使用海拉細(xì)胞，通過α篩選讀出器(Perkin Elmer)如上所述進(jìn)一步測試為化合物73家族結(jié)構(gòu)類似物的化合物56對IκB磷酸化的作用。加入到海拉細(xì)胞中的增加濃度的化合物56劑量依賴性地抑制IκB Btn-AhxGLKKERLLDDRHDSGLDSMKDEE-amid的底物肽的磷酸化。化合物56抑制IKK活性的效價高于其它73家族成員10倍并被計算IC50為～850nmol/L(附圖8a)。
(R)方法體外/不含細(xì)胞的激酶試驗(yàn)方案將海拉細(xì)胞維持在補(bǔ)充了10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、青霉素(50個單位/ml)和鏈霉素(50μg/ml)的Dulbecco的改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(Invitrogen)中。在用TNFα處理前24小時，將海拉細(xì)胞以5×107/孔的密度平板固定在175-mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中至90％匯合。
用不含藥物的20ng/ml TNFα(Roche)刺激細(xì)胞。7分鐘后，用冰冷PBS將細(xì)胞洗滌兩次，隨后刮取并轉(zhuǎn)入1，5ml微量離心管。在接近4℃以2000rpm離心2分鐘后，除去PBS上清液并向沉淀中加入400μl裂解-緩沖液(10mM Hepes，pH 7.9、0，1％ NP40、10mM，300mM蔗糖、10mM KCl、15mM MgCl2、1mM DTT、0，5mM PMSF和抗蛋白酶、抑肽酶、亮抑蛋白酶肽各0，75μg/ml(Sigma)。將重新懸浮的沉淀在冰上孵育5分鐘并以13000g離心30秒。將上清液，胞質(zhì)提取物加入到400μl TNT-緩沖液(200mM NaCl、20mM Tris/HCl pH 7，5、1％ TritonX-100)中。阻斷非特異性結(jié)合，步驟如下在接近4℃與3μg正常家兔IgG(Sigma)和6mg重新懸浮和預(yù)洗滌的蛋白質(zhì)A瓊脂糖凝膠CI-4B(Pharmacia Biotech)一起孵育30分鐘，隨后在4℃下使用4μg抗-NEMO-抗體(Santa Cruz Biotechnology)和12mg重新懸浮和預(yù)洗滌的蛋白質(zhì)A瓊脂糖凝膠CI-4B(Parmacia Biotech)免疫沉淀1，5小時。在用TNT緩沖液洗滌三次和用激酶緩沖液(20mM HEPES，pH 8.0、10mM MgCl2、100μM Na3VO4、20mM-磷酸甘油、50mM NaCl、2mM二硫蘇糖醇、0.5μM苯甲基磺酰氟、抗蛋白酶、抑肽酶、亮抑蛋白酶肽各0.75μg/ml(Sigma))洗滌三次后，將蛋白質(zhì)A瓊脂糖凝膠沉淀分成4個相同的等分部分。除去上清液并使激酶反應(yīng)在30℃和有1mM ATP(Sigma)、1μM底物肽Btn-Ahx-GLKKERLLDDRHDSGLDSMKDEE-amid(Biosyntan)存在下的25μl激酶緩沖液中進(jìn)行60分鐘。然后將不同濃度的藥物加入到對IκB磷酸化必不可少的分離成分中的不含細(xì)胞的成分中。以16000g離心1分鐘后，將10μl上清液加入到白色384 proxi-平板(Packard)。將6，6μl檢測-緩沖液(20mM Hepes pH 7，5、100mM NaCl、1％Tween、0，1mM BSA、50μg/ml蛋白質(zhì)A-接受體珠、250μg/ml鏈霉抗生物素-供體珠(均來自Perkin-Elmer)、4nM抗-磷酸-IKBα-抗體(Santa Cruz Biotechnology)配入各孔。在孵育1，5小時后，通過α篩選讀出器(Perkin Elmer)測定平板。
結(jié)果在不含細(xì)胞的試驗(yàn)中比較COM 73和COM 56對IKK活性的抑制作用。在TNFα刺激海拉細(xì)胞和IKK復(fù)合物免疫沉淀后，將增加濃度的藥物與分離的IKK復(fù)合物一起孵育。COM 73和56在這種不含細(xì)胞的試驗(yàn)中劑量依賴性地抑制IKK活性。COM 56的在抑制IKK活性方面的效價顯著高于COM 73。這些結(jié)果證實(shí)IKK抑制性藥物在激酶復(fù)合物形成后破壞IKK復(fù)合物的能力因TNFα刺激而結(jié)束。因此，COM 73和56是適合于治療炎性疾病，諸如動脈硬化的療法且不僅是作為預(yù)防IKK復(fù)合物形成的預(yù)防藥(附圖8b)。
(C)方法蛋白質(zhì)印跡方案中的P-IkBα檢測(Detektion)將海拉細(xì)胞維持在補(bǔ)充了10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、青霉素(50個單位/ml)和鏈霉素(50μg/ml)的Dulbecco的改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(Invitrogen)中。在用不同化合物處理前24小時，將海拉細(xì)胞以5×106/孔的密度平板固定在100-mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中至90％匯合。
將細(xì)胞與所示濃度的不同藥物一起孵育1小時，用PBS洗滌兩次并用20ng/ml TNFα(Roche)刺激。7分鐘后，用冰冷PBS將細(xì)胞洗滌兩次，隨后刮取并轉(zhuǎn)入1，5ml微量離心管。在接近4℃以2000rpm離心2分鐘后，除去PBS上清液并向沉淀中加入200μl裂解-緩沖液(10mM Hepes，pH 7.9、0，1％ NP40、10mM，300mM蔗糖、10mM KCl、15mM MgCl2、1mM DTT、0，5mM PMSF和抗蛋白酶、抑肽酶、亮抑蛋白酶肽各0，75ug/ml(Sigma)。將重新懸浮的沉淀在冰上孵育5分鐘并以13000g離心30秒。用Laemmli-緩沖液(2％ SDS、2％ 2-巰基乙醇、0，01％溴酚藍(lán)、8％甘油)稀釋30μl上清液，胞質(zhì)提取物，在接近60℃加熱10分鐘并上4-20％聚丙烯酰胺(BioRad)。在電泳后，使用濕印跡技術(shù)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至硝化纖維素膜上。首先用Roti-Block(Roth)封閉膜且此后與對P-IkBα(Santa Cruz Biotechnology，按1∶200稀釋使用)的單克隆抗體一起孵育。這種孵育后與按1∶10000稀釋的合適的辣根過氧化物酶-綴合的二抗(Dianova)孵育。使用蛋白質(zhì)印跡化學(xué)發(fā)光試劑檢測試劑盒(Santa Cruz)使抗體結(jié)合在X光片上顯影。
結(jié)果通過對P-IκBα特異的抗磷酸化抗體和蛋白質(zhì)印跡直接測定化合物73抑制IκB磷酸化的能力。增加濃度的COM 73劑量依賴性地抑制IκB磷酸化(附圖9)。
結(jié)果比較COM 73和COM 54家族中的不同化合物抑制IκB磷酸化的能力。用抗磷酸化抗體和蛋白質(zhì)印跡直接測定IκB磷酸化。COM 73和COM 56濃度依賴性地抑制IκB磷酸化，而COM 54、COM 68和69對IκB磷酸化沒有作用。因此，這類NF KκB-抑制劑的抑制作用與IκB磷酸化無關(guān)(附圖15)。
實(shí)施例2NF-κB核苷酸結(jié)合活性的抑制方法電泳遷移率移動試驗(yàn)(EMSA)將THP-1單核細(xì)胞(DSM，Braunschweig，Germany)維持在含有7％胎牛血清(FCS)(Myoclonesuper plus，低內(nèi)毒素)、100個單位/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素(Life Technologies，Inc.，Eggenstein，Germany)的RPMI1640(Glutamax-1，低內(nèi)毒素)中的混懸液中。為了進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞以3×106/孔的密度平板固定在6-孔培養(yǎng)皿中。通過經(jīng)在4℃下以1200rpm離心7分鐘收集細(xì)胞制備核提取物。通過添加1ml冰冷PBS重新懸浮細(xì)胞并轉(zhuǎn)入微量離心管。在接近4℃以2000g離心2分鐘后，將沉淀溶解在50μl緩沖液A(10mM Hepes，pH 7.9、0，1％ NP40、10mM，300mM蔗糖、10mM KCl、15mM MgCl2、1mM DTT、0，5mMPMSF和抗蛋白酶、抑肽酶、亮抑蛋白酶肽各0，75μg/ml(Sigma))中。在冰上孵育5分鐘并以16000g離心5秒后，用100μl緩沖液A洗滌沉淀。將核沉淀重新懸浮于100μl緩沖液B(20mM Hepes，pH7，9、100mM KCl、100mM NaCl、1mM DTT、20％甘油、0，5mMPMSF和抗蛋白酶、抑肽酶、亮抑蛋白酶肽各0，75μg/ml(Sigma))中并超聲處理10秒。將探針以16000g脈沖離心5秒。等分核提取物并速凍在液體N2中。將核提取物(5mg蛋白質(zhì))與放射標(biāo)記的DNA探針(10ng；105cpm)一起在室溫下在20ml結(jié)合緩沖液(20mM HEPES，pH7.9、50mM KCl、1mM二硫蘇糖醇、0.5mM EDTA、10％甘油、1mg/ml牛血清清蛋白、0.2％ Nonidet P-40、50ng聚(d1-dC)/ml)中孵育30分鐘。將原型免疫球蛋白k-鏈寡核苷酸用作探針并通過互補(bǔ)引物退火進(jìn)行標(biāo)記，隨后在有[γ-32P]dCTP(＞3,000Ci/mmol；NEN Life ScienceProducts，Brussels，Belgium)和脫氧核苷三磷酸(BoehringerMannheim)存在下使用DNA聚合酶I(Boehringer Mannheim)的克列諾片段進(jìn)行引物延伸。使樣品在非變性4％聚丙烯酰胺凝膠上在0.253TBE緩沖液(10 x TBE如下890mM Tris、890mM硼酸、20mMEDTA，pH 8.0)中跑膠。還通過EMSA，使用[γ-32P]ATP(＞5,000Ci/mmol，NEN Life Science Products)標(biāo)記的特異性共有寡核苷酸(Promega，Heidelberg，Germany)和T4多核苷酸激酶(Boehringer Mannheim)分析Sp-1和AP-1的結(jié)合。干燥凝膠并通過放射自顯影分析。
結(jié)果進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)以檢驗(yàn)多達(dá)40種化合物是否影響NF-κB活化。將THP-1單核細(xì)胞與不同物質(zhì)預(yù)孵育且然后用LPS刺激。通過EMSA測定NF-的活化和釋放。在相同核提取物中，檢驗(yàn)另一種轉(zhuǎn)錄激活劑因子SP-1與包括SP-1共有序列的寡核苷酸結(jié)合的蛋白質(zhì)(加載對照)。在沒有這些化合物存在下，可以觀察到預(yù)計的NF-κB的顯著活化。通過用100μM的這些化合物處理，兩種物質(zhì)表現(xiàn)出顯著減少的NF-κB-釋放，具體地說，就化合物54而言，為95％，而就化合物73而言，為80％(附圖2a)。另外，我們測試了12，5μM-100μM范圍內(nèi)不同濃度的化合物54。通過用12，5μM和25μM的化合物54處理顯著影響NF-κB活化且用50μM和100μM幾乎完全消除這種活化(參見附圖2b)。用作對照的另一種轉(zhuǎn)錄激活劑因子SP-1與特異性寡核苷酸的結(jié)合在相同核提取物中沒有改變。
實(shí)施例3NEMO與IKK-β結(jié)合的抑制(A)方法將3×106個海拉細(xì)胞與增加濃度的不同藥物一起孵育1小時，用PBS洗滌兩次并用20ng/ml TNFα(Roche)刺激。7分鐘后，用冰冷PBS將細(xì)胞洗滌兩次，隨后刮取并轉(zhuǎn)入1，5ml微量離心管。(在接近4℃以2000rpm離心2分鐘后，除去PBS上清液并向沉淀中加入200μl裂解-緩沖液(10mM Hepes，pH 7.9、0，1％ NP40、300mM蔗糖、10mMKCl、15mM MgCl2、1mM DTT、0，5mM PMSF和抗蛋白酶、抑肽酶、亮抑蛋白酶肽各0，75μg/ml(Sigma)。將重新懸浮的沉淀在冰上孵育5分鐘并以13000g離心30秒)。如上所述分離胞質(zhì)提取物。
將30μl的胞質(zhì)提取物，約提取自4×105個細(xì)胞加載到4-20％聚丙烯酰胺凝膠(BioRad)。在電泳后，使用濕印跡技術(shù)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至硝化纖維素膜上。首先用Roti-Block(Roth)封閉膜且此后與抗IKKα/β或NEMO(均來自Santa Cruz Biotechnology，按1∶200稀釋使用)的多克隆抗體一起孵育。這種孵育后與按1∶10000稀釋的合適的辣根過氧化物酶-綴合的二抗(Dianova)孵育。使用蛋白質(zhì)印跡化學(xué)發(fā)光試劑檢測試劑盒(Santa Cruz)使抗體結(jié)合在X光片上顯影。
結(jié)果為了檢驗(yàn)化合物73是否選擇性抑制NEMO與IKKα/β結(jié)合而導(dǎo)致復(fù)合物不穩(wěn)定和降解，用不同濃度的化合物73處理海拉細(xì)胞并測定蛋白質(zhì)穩(wěn)定性(參見附圖3a)。通過蛋白質(zhì)印跡分析來分析胞質(zhì)提取物。在這些實(shí)驗(yàn)條件下NEMO和IKKα/β水平劑量依賴性地降低(附圖3a)。就NEMO蛋白而言，可以觀察到化合物73對蛋白質(zhì)降解的更高的敏感性。在3，3μM下可以觀察到NEMO蛋白的量減少，到20μM時明顯降解且在達(dá)33μM和100μM時幾乎完全消除。相反，IKKα/β降解僅在更高濃度33μM和100μM的化合物73下明顯。甚至在使用的最高濃度下也沒有檢測到完全分解。沒有觀察到TNFα刺激對復(fù)合物組成或復(fù)合物降解的作用。
為了特別地檢驗(yàn)IKK復(fù)合物的破壞，我們分析了使用抗-NEMO-抗體(Santa Cruz Biotechnology)免疫沉淀后IKK-α/β的蛋白質(zhì)表達(dá)(附圖3b.)。發(fā)現(xiàn)了免疫沉淀之前和之后IKK-α/β的量上明確的相關(guān)性。由于未改變的NEMO蛋白的檢測，所以化合物73以劑量依賴性方式降低了IKK-α/β蛋白水平。與不使用化合物73的對照相比，在與NEMO共沉淀的復(fù)合物中，IKK-α/IKK-β在10μM下降至27％，而在100μM下降至91％。
結(jié)果使用蛋白質(zhì)印跡和對IKK-α/β和NEMO的特異性抗體評價TNFα刺激后IKK復(fù)合物的降解。COM 73在與完整細(xì)胞孵育后以濃度依賴性地使IKKα/β和NEMO降解。與IKKα/β復(fù)合物相比，NEMO對COM 73導(dǎo)致的蛋白質(zhì)降解更為敏感(附圖10)。
(B)方法體外藥物處理后IKK-復(fù)合物的降解在如上所述使用抗-NEMO抗體(Santa Cruz)進(jìn)行免疫沉淀后，將沉淀和洗滌的IKK-復(fù)合物與不同濃度的IKK抑制劑在20mMHEPES，pH 8.0、10mM MgCl2、100μM Na3VO4、20mM-磷酸甘油、50mM NaCl、2mM二硫蘇糖醇、0.5μM苯甲基磺酰氟、抗蛋白酶、抑肽酶、亮抑蛋白酶肽各0.75μg/ml(Sigma)中一起孵育。在處理1小時后，將探針以16000g離心1分鐘，完全除去上清液并將蛋白質(zhì)A沉淀重新懸浮于1 x Laemmli-緩沖液(2％ SDS、2％ 2-巰基乙醇、0，01％溴酚藍(lán)、8％甘油)中，在接受60℃加熱10分鐘并加載到4-20％聚丙烯酰胺凝膠(BioRad)。在電泳后，使用濕印跡技術(shù)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至硝化纖維素膜上。首先用Roti-Block(Roth)封閉膜且此后與抗IKKα(Santa Cruz Biotechnology，按1∶200稀釋使用)的單克隆抗體一起孵育。這種孵育后與按1∶10000稀釋的合適的辣根過氧化物酶-綴合的二抗(Dianova)孵育。使用蛋白質(zhì)印跡化學(xué)發(fā)光試劑檢測試劑盒(SantaCruz)使抗體結(jié)合在X光片上顯影。掃描該X光片并通過光密度法，使用軟件AIDA分析結(jié)果。
結(jié)果在IKK復(fù)合物免疫沉淀后評價化合物56對NEMO與IKK-α/β結(jié)合的抑制。在這一體外試驗(yàn)中COM 56劑量依賴性地破壞了該復(fù)合物(附圖11)。
實(shí)施例4NF-κB抑制劑的細(xì)胞滲透性方法將3×106個海拉細(xì)胞與100μM的化合物73一起孵育1小時。在用PBS洗滌三次后，向細(xì)胞沉淀中加入120μl低滲緩沖液(10mMNaCl、10mM Hepes ph 7，5)并冷凍在液體N2中用于細(xì)胞裂解。在以16000g離心5分鐘后，在Elisa中450nm處測定上清液并將化合物73的量與該物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)濃度進(jìn)行比較。
結(jié)果通過測定在細(xì)胞質(zhì)中化合物濃度，根據(jù)其在Elisa讀出器中的特征信號監(jiān)測化合物73的細(xì)胞滲透性。在與100μM的化合物73一起孵育1小時后，可以檢測到高水平的化合物。與100mM化合物的信號相比，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)約90μM的濃度(附圖4.)。這一結(jié)果表明化合物73的細(xì)胞滲透性極佳。
實(shí)施例5用NF-κB抑制劑處理后的細(xì)胞存活力方法將96孔平板中的3×104個海拉細(xì)胞與100μM的化合物54和73一起孵育3小時。改變培養(yǎng)基并向各孔中加入10μL WST-1試劑。2小時后，用Elisa-讀出器測定450nm的吸收。
結(jié)果通過WST-1存活力檢測試驗(yàn)(Boehringer Mannheim)監(jiān)測化合物73和54可能的毒性。在所述試驗(yàn)中在應(yīng)用的濃度和條件下未發(fā)現(xiàn)化合物54和73對海拉細(xì)胞具有毒性。在與30μM各化合物孵育3小時后，與未處理的對照相比，未監(jiān)測到代謝活性的顯著下降。
結(jié)果在海拉細(xì)胞中測試COM 54家族化合物的細(xì)胞存活力。將海拉細(xì)胞與增加濃度的COM 54和69(0.3-100μmol/L)一起孵育1天，對細(xì)胞存活力沒有負(fù)面影響(通過WST染色評價)。濃度為33和100μmol/L的COM 68在1天孵育期后降低了細(xì)胞存活力(附圖16)。
實(shí)施例6激酶試驗(yàn)方案將海拉細(xì)胞維持在補(bǔ)充了10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、青霉素(50個單位/ml)和鏈霉素(50μg/ml)的Dulbecco的改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(Invitrogen)中。在用不同化合物處理前24小時，將海拉細(xì)胞以5×106/孔的密度平板固定在100-mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中至90％匯合。
將細(xì)胞與所示濃度的不同藥物一起孵育1小時，用PBS洗滌兩次并用20ng/ml TNFα(Roche)刺激。7分鐘后，用冰冷PBS將細(xì)胞洗滌兩次，隨后刮取并轉(zhuǎn)入1，5ml微量離心管。在接近4℃以2000rpm離心2分鐘后，除去PBS上清液并向沉淀中加入200μl裂解-緩沖液(10mM Hepes，pH 7.9、0，1％ NP40、10mM，300mM蔗糖、10mM KCl、15mM MgCl2、1mM DTT、0，5mM PMSF和抗蛋白酶、抑肽酶、亮抑蛋白酶肽各0，75μg/ml(Sigma)。將重新懸浮的沉淀在冰上孵育5分鐘并以13000g離心30秒。將上清液，胞質(zhì)提取物加入到200μl TNT-緩沖液(200mM NaCl、20mM Tris/HCl pH 7，5、1％ Triton X-100)中。阻斷非特異性結(jié)合，步驟如下通過在接近4℃與3μg正常家兔IgG(Sigma)和6mg重新懸浮和預(yù)洗滌的蛋白質(zhì)A瓊脂糖凝膠CI-4B(Pharmacia Biotech)一起孵育30分鐘隨后在4℃下使用2μg抗-NEMO-抗體(Santa Cruz Biotechnology)和6mg重新懸浮和預(yù)洗滌的蛋白質(zhì)A瓊脂糖凝膠CI-4B(Parmacia Biotech)免疫沉淀1，5小時。在用TNT緩沖液洗滌三次和用激酶緩沖液(20mM HEPES，pH 8.0、10mM MgCl2、100μM Na3VO4、20mM-磷酸甘油、50mM NaCl、2mM二硫蘇糖醇、0.5μM苯甲基磺酰氟、抗蛋白酶、抑肽酶、亮抑蛋白酶肽各0.75μg/ml(Sigma))洗滌三次后，使激酶反應(yīng)在30℃和有1mM ATP(Sigma)和1μM底物肽Btn-Ahx-GLKKERLLDDRHDSGLDSMKDEE-amid(Biosyntan)存在下的25μl激酶緩沖液中進(jìn)行60分鐘。以16000g離心1分鐘后，將10μl上清液加入到白色384 proxi-平板(Packard)。將6，6μl檢測-緩沖液(20mM Hepes pH 7，5、100mM NaCl、1％ Tween、0，1mM BSA、50μg/ml蛋白質(zhì)A-接受體珠、250μg/ml鏈霉抗生物素-供體珠(均來自Perkin-Elmer)、4nM抗-磷酸-IKB抗體(Santa Cruz Biotechnology)配入各孔。在孵育1，5小時后，通過α篩選讀出器(Perkin Elmer)測定平板。
實(shí)施例7電泳遷移率移動試驗(yàn)(EMSA)將THP-1單核細(xì)胞(DSM，Braunschweig，Germany)維持在如(41)所述的含有7％胎牛血清(FCS)(Myoclone super plus，低內(nèi)毒素)、100個單位/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素(Life Technologies，Inc.，Eggenstein，Germany)的RPMI 1640(Glutamax-1，低內(nèi)毒素)中的混懸液中。為了進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞以3×106/孔的密度平板固定在6-孔培養(yǎng)皿中。通過經(jīng)在4℃下以1200rpm離心7分鐘收集細(xì)胞制備核提取物。通過添加1ml冰冷PBS重新懸浮細(xì)胞并轉(zhuǎn)入微量離心管。在接近4℃以2000g離心2分鐘后，使沉淀在50μl緩沖液A(10mM Hepes，pH 7.9、0，1％ NP40、10mM，300mM蔗糖、10mM KCl、15mMMgCl2、1mM DTT、0，5mM PMSF和抗蛋白酶、抑肽酶、亮抑蛋白酶肽各0，75μg/ml(Sigma))中裂解。在冰上孵育5分鐘并以16000g離心5秒后，用100μl緩沖液A洗滌沉淀。將核沉淀重新懸浮于100μl緩沖液B(20mM Hepes，pH 7，9、100mM KCl、100mM NaCl、1mMDTT、20％甘油、0，5mM PMSF和抗蛋白酶、抑肽酶、亮抑蛋白酶肽各0，75μg/ml(Sigma))中并超聲處理10秒。將探針以16000g脈沖離心5秒。等分核提取物并速凍在液體N2中。將核提取物(5mg蛋白質(zhì))與放射標(biāo)記的DNA探針(10ng；105cpm)一起在室溫下在20ml結(jié)合緩沖液(20mM HEPES，pH 7.9、50mM KCl、1mM二硫蘇糖醇、0.5mMEDTA、10％甘油、1mg/ml牛血清清蛋白、0.2％ Nonidet P-40、50ng聚(dl-dC)/ml)中孵育30分鐘。將原型免疫球蛋白k-鏈寡核苷酸用作探針并通過對互補(bǔ)引物退火進(jìn)行標(biāo)記，隨后在有[α-32P]dCTP(3,000Ci/mmol；NEN Life Science Products，Brussels，Belgium)和脫氧核苷三磷酸(Boehringer Mannheim)存在下使用DNA聚合酶I(Boehringer Mannheim)的克列諾片段進(jìn)行引物延伸。使樣品在非變性4％聚丙烯酰胺凝膠上在TBE緩沖液(10 x TBE如下890mM Tris、890mM硼酸、20mM EDTA，pH 8.0)中跑膠。還通過EMSA，使用[γ-32P]ATP(5,000Ci/mmol，NEN Life Science Products)標(biāo)記的特異性共有寡核苷酸(Promega，Heidelberg，Germany)和T4多核苷酸激酶(Boehringer Mannheim)分析Sp-1和AP-1的結(jié)合。干燥凝膠并通過放射自顯影分析。
實(shí)施例8單劑量IV給藥后IKK抑制性藥物的藥物動力學(xué)方法大鼠體內(nèi)的IV應(yīng)用將COM 56在鹽水-緩沖液中稀釋至在200μL體積中100μM和200μM。通過靜脈內(nèi)將探針給予大鼠。2分鐘和20分鐘后，從右頸動脈取血液探針。將該血液探針以2500g離心3分鐘并通過質(zhì)譜法分析上清液，血清成分。
結(jié)果在大鼠中單一IV應(yīng)用55和27.5μg化合物56后，給藥后2分鐘和20分鐘時測定了陽性血清探針(附圖12)。
實(shí)施例9全身炎癥的抑制方法通過脂多糖(LPS)休克(IV給予LPS 0.33μg/g)誘發(fā)大鼠全身炎癥反應(yīng)。通過在小鼠血清中進(jìn)行TNFα定量測定炎癥和對大鼠IV給予化合物56(1μg/g)對炎癥的抑制。使用ELISA試劑盒(Pierce)，按照制造商的說明檢測TNFα。
結(jié)果化合物56抑制大鼠體內(nèi)由LPS誘發(fā)的全身炎癥。在用化合物56預(yù)處理后，大鼠血清中的TNFα濃度得到顯著抑制(附圖13)。
實(shí)施例10藥物處理對人內(nèi)皮細(xì)胞中動脈粥樣硬化的抑制方法通過熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)分析測定ICAM表述將HUVEC細(xì)胞以1×106個細(xì)胞/孔接種在6-孔平板中。24小時后，用不同濃度的化合物68處理細(xì)胞。1小時后，除去培養(yǎng)基并將細(xì)胞與IL-1(100pg/ml)或TNFα(1ng/ml)一起孵育總計4小時。此后，用胰蛋白酶收集細(xì)胞，用PBS洗滌并以1000rpm離心5分鐘。將沉淀重新懸浮于50μl PBS和5μl CD54-PE抗體(來自Beckman/Coulter/Immunotech的抗-ICAM抗體)中。在PBS中洗滌兩次后，通過FACScan(Becton Dickinson)分析ICAM細(xì)胞表面表達(dá)。
結(jié)果COM 68濃度依賴性地抑制人內(nèi)皮細(xì)胞中的動脈粥樣硬化標(biāo)記。將COM 68與HUVEC細(xì)胞一起孵育顯著抑制了ICAM表達(dá)。在IL-1刺激后，COM 68用于抑制ICAM表達(dá)的IC50為7.8μmol/L，而在TNFα刺激后，用于抑制ICAM表達(dá)的IC50為4.5μmol/L(附圖17)。
制劑實(shí)施例A按照常規(guī)方式生產(chǎn)下列組成的片劑mg/片活性組分 100粉末狀乳糖95白玉米淀粉35
聚乙烯吡咯烷酮 8羧甲基淀粉鈉 10硬脂酸鎂 2片重 250制劑實(shí)施例B按照常規(guī)方式生產(chǎn)下列組成的片劑mg/片活性組分 200粉末狀乳糖 100白玉米淀粉 64聚乙烯吡咯烷酮 12羧甲基淀粉鈉 20硬脂酸鎂 4片重 400制劑實(shí)施例C生產(chǎn)下列組成的膠囊mg/粒膠囊活性組分 50結(jié)晶乳糖 60微晶纖維素 34滑石粉 5硬脂酸鎂 1膠囊填料重量 150將具有合適顆粒大小的活性組分、結(jié)晶乳糖和微晶纖維素彼此均勻混合，過篩且此后混合滑石粉和硬脂酸鎂。將最終混合物填充入合適大小的硬明膠膠囊。
權(quán)利要求
1.用作藥物的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽，它由如下通式(A)表示 其中R表示任選取代的苯基或吡啶基；R4表示羥基，氨基，直鏈或支鏈烷氧基，直鏈或支鏈烷基，環(huán)烷氧基，烷氨基，環(huán)烷氨基，二烷氨基，R5表示氫原子，直鏈或支鏈烷基，R6和R7可以相同或不同，表示氫原子，鹵原子，直鏈或支鏈烷基，直鏈或支鏈烷氧基，直鏈或支鏈鏈烯基，環(huán)烷基，芳基，X、Y和Z可以相同或不同，表示氫原子，鹵原子，羧基，硝基，氰基，烷基，烷氧基，或酰基。
2.用作藥物的權(quán)利要求1所述的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽或酯，它由如下通式(I)表示 其中R1和R2可以相同或不同，表示直鏈或支鏈烷基，直鏈或支鏈鏈烯基，環(huán)烷基，芳基，或R1和R2一起可以形成亞烷基，R3表示氫原子，鹵原子，直鏈或支鏈烷基，R4表示直鏈或支鏈烷氧基，直鏈或支鏈烷基，環(huán)烷氧基，烷氨基，環(huán)烷氨基，R5表示氫原子，直鏈或支鏈烷基，R6和R7可以相同或不同，表示氫原子，鹵原子，直鏈或支鏈烷基，直鏈或支鏈烷氧基，直鏈或支鏈鏈烯基，環(huán)烷基，芳基，X、Y和Z可以相同或不同，表示氫原子，鹵原子，烷基，或?；?br> 3.權(quán)利要求2所述的用作藥物的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽或酯，其中R1和R2一起可以形成亞烷基。
4.權(quán)利要求2或3所述的用作藥物的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽或酯，其中R3表示氫原子。
5.權(quán)利要求2至4中任意一項所述的用作藥物的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽或酯，其中R4表示直鏈或支鏈烷氧基。
6.權(quán)利要求2至5中任意一項所述的用作藥物的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽或酯，其中R5表示直鏈或支鏈烷基。
7.權(quán)利要求2至6中任意一項所述的用作藥物的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽或酯，其中R6和R7可以相同或不同，表示鹵原子或直鏈或支鏈烷基。
8.權(quán)利要求2至7中任意一項所述的用作藥物的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽或酯，其中X為鹵原子且Y和Z表示氫原子。
9.權(quán)利要求2至7中任意一項所述的用作藥物的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽或酯，其中X為鹵素。
10.權(quán)利要求1所述的用作藥物的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽或酯，其中R表示的苯基或吡啶基被1至3個取代基取代，所述的取代基選自由如下基團(tuán)組成的組鹵素，諸如氟、氯、溴和碘；氰基；羥基；硝基；羧基；氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基；直鏈或支鏈C1-7烷基羰基；直鏈或支鏈C1-7烷氧羰基；直鏈或支鏈C1-7烷氧羰基氧基；直鏈或支鏈C1-6烷氨基；直鏈或支鏈二-C1-6烷氨基；直鏈或支鏈C1-7烷基羰基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷氨基羰基；直鏈或支鏈C1-7烷氧羰基氨基；直鏈或支鏈C1-7烷氨基羰基氧基。
11.權(quán)利要求10所述的用作藥物的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽或酯，其中R為苯基。
12.權(quán)利要求10或11所述的用作藥物的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽或酯，其中存在1至3個選自鹵原子或烷氧基的取代基。
13.用作藥物的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽，它由如下通式(B)表示 其中虛線獨(dú)立地表示單鍵或雙鍵，R表示任選取代的苯基或吡啶基，R4表示羥基，氨基，直鏈或支鏈烷氧基，直鏈或支鏈烷基，環(huán)烷氧基，烷氨基，環(huán)烷氨基，二烷氨基；R5表示氫原子，直鏈或支鏈烷基，X1表示O、S或NH，X、Y和Z可以相同或不同，表示氫原子，鹵原子，羧基，硝基，氰基，烷基，烷氧基，或酰基。
14.權(quán)利要求13所述的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽，其中通式(B)中的虛線都為雙鍵。
15.權(quán)利要求13或14所述的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽，其中R表示取代的苯基。
16.權(quán)利要求13至15中任意一項所述的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽，其中R4表示直鏈或支鏈烷氧基。
17.權(quán)利要求13至16中任意一項所述的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽，其中R5表示直鏈或支鏈烷基。
18.權(quán)利要求13至17中任意一項所述的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽，其中X1表示O。
19.權(quán)利要求13至18中任意一項所述的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽，其中X、Y和Z可以相同或不同，表示氫原子或羧基，或其鹽。
20.附圖7的COM56，包括有關(guān)環(huán)外雙鍵的任意幾何異構(gòu)體。
21.用作藥物的權(quán)利要求13所述的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽或酯，它由如下通式(II)表示 其中R1和R2可以相同或不同，表示直鏈或支鏈烷基，直鏈或支鏈鏈烯基，環(huán)烷基，芳基，或R1和R2一起可以形成亞烷基，R3表示氫原子，鹵原子，直鏈或支鏈烷基，R4表示直鏈或支鏈烷氧基，直鏈或支鏈烷基，環(huán)烷氧基，烷氨基，環(huán)烷氨基，R5表示氫原子，直鏈或支鏈烷基，X、Y和Z可以相同或不同，表示氫原子，羧基，鹵原子，硝基，氰基，或?；?。
22.權(quán)利要求21所述的用作藥物的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽或酯，其中R1和R2可以相同或不同，并且表示烷基或一起形成亞烷基。
23.權(quán)利要求21或22所述的用作藥物的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽或酯，其中R3表示鹵原子。
24.權(quán)利要求21至23中任意一項所述的用作藥物的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽或酯，其中R4表示直鏈或支鏈烷氧基。
25.權(quán)利要求21至24中任意一項所述的用作藥物的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽或酯，其中R5表示直鏈或支鏈烷基。
26.權(quán)利要求21至25中任意一項所述的用作藥物的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽或酯，其中X為羧基且Y和Z表示氫原子。
27.權(quán)利要求13所述的用作藥物的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽或酯，其中由R表示的苯基或吡啶基被1至3個取代基取代，所述的取代基選自由如下基團(tuán)組成的組鹵素，諸如氟、氯、溴和碘；氰基；羥基；硝基；羧基；氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基；直鏈或支鏈C1-7烷基羰基；直鏈或支鏈C1-7烷氧羰基；直鏈或支鏈C1-7烷氧羰基氧基；直鏈或支鏈C1-6烷氨基；直鏈或支鏈二-C1-6烷氨基；直鏈或支鏈C1-7烷基羰基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷氨基羰基；直鏈或支鏈C1-7烷氧羰基氨基；直鏈或支鏈C1-7烷氨基羰基氧基。
28.權(quán)利要求27所述的用作藥物的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽或酯，其中R為苯基。
29.權(quán)利要求27或28所述的用作藥物的5H-噻唑并[3，2]嘧啶衍生物或其鹽或酯，其中存在1至3個選自鹵原子或烷氧基的取代基。
30.用作藥物的由如下通式(C)表示的化合物或其鹽 其中A和B相同或不同，為鹵原子、羥基、硝基、羧基、氨基、直鏈或支鏈C1-6烷基、直鏈或支鏈C1-6烷氧基、直鏈或支鏈C1-7烷基羰基、直鏈或支鏈C1-7烷氧羰基或直鏈或支鏈C1-6烷氨基，或由如下通式(1-1)表示 其中虛線獨(dú)立地表示單鍵或雙鍵，R8和R9獨(dú)立地表示氫原子或C1-6烷基，X′和X″獨(dú)立為O或S，W為氫原子、硝基、氰基、羧基或通式-COZ′R10的基團(tuán)，其中Z′為O或S或NH，且R10為C1-6烷基，且L、L′和L″相同或不同，表示氫原子，羥基，烷基，烷氧基，鹵原子，羧基，烷基羰基，烷氧基羰基，氨基，烷氨基，或二烷氨基，條件是A和B中至少一個由通式(1-1)表示。
31.用作藥物的權(quán)利要求30的化合物或其鹽或酯，其中該化合物由如下通式(III)表示 其中A和B相同或不同，由如下通式表示 其中R8和R9獨(dú)立地表示氫原子或C1-6烷基；X′為O或S；W為硝基、氰基、羧基或通式-COZ′R10的基團(tuán)，其中Z′為O或S或NH，且R10為C1-6烷基，且L表示氫原子，烷基，烷氧基，或鹵原子。
32.權(quán)利要求31所述的化合物，其中A和B相同。
33.權(quán)利要求30或31中任意一項所述的化合物，其中R8為氫原子。
34.權(quán)利要求30至33中任意一項所述的化合物，其中R9為氫原子。
35.權(quán)利要求30至34中任意一項所述的化合物，其中X′為O。
36.權(quán)利要求30至35中任意一項所述的化合物，其W為硝基。
37.權(quán)利要求30所述的化合物，其中A為氫或羥基。
38.權(quán)利要求或30所述的化合物，其中X′和X″為氧原子。
39.權(quán)利要求30、37或38所述的化合物，其中L為羥基。
40.權(quán)利要求30或37至39中任意一項所述的化合物，其中W為硝基。
41.用作藥物的上述權(quán)利要求中任意一項的具有小于1500道爾頓分子量的雜環(huán)化合物或其鹽，由此該化合物在不含細(xì)胞的用于鑒定IKK-β使IkB磷酸化的抑制劑的篩選方法中產(chǎn)生作為抑制劑的陽性結(jié)果，其中所述方法包括下列步驟(a)提供含有功能性IKK-復(fù)合物的組合物；(b)在預(yù)定條件下在所述化合物存在下用步驟(a)的功能性IKK-復(fù)合物使包含IkB的IKK-β磷酸化結(jié)構(gòu)域的底物肽進(jìn)行磷酸化；(c)在預(yù)定條件下使步驟(b)的磷酸化底物肽與對該底物肽的IKK-β磷酸化結(jié)構(gòu)域特異的抗體反應(yīng)；(d)當(dāng)特異性結(jié)合的抗體的量因存在所述化合物而低于該化合物不存在時的量時，將該化合物鑒定為抑制劑；特別是選自化合物002、02、30、31、54、56、68、69、73、70和82的組中的化合物。
42.藥物組合物，它包含權(quán)利要求1至41中任意一項所述的化合物作為活性組分。
43.用于減少NF-κB釋放的權(quán)利要求42所述的藥物組合物。
44.權(quán)利要求42或43任意一項所述的藥物組合物，它有效用于預(yù)防或治療炎性疾病。
45.權(quán)利要求42至44中任意一項所述的藥物組合物，它有效用于預(yù)防或治療動脈粥樣硬化。
46.權(quán)利要求1至41中任意一項的化合物在制備藥物中的應(yīng)用。
47.權(quán)利要求39所述的應(yīng)用，其中所述的藥物用于治療或預(yù)防動脈粥樣硬化。
全文摘要
本申請涉及化合物(A)、(B)和(C)的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，其中取代基如說明書中所定義，并且涉及這些化合物的某些化合物本身。
文檔編號A61K31/345GK1791411SQ200480013441
公開日2006年6月21日 申請日期2004年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月28日
發(fā)明者G·明希, H-P·霍爾特霍夫, M·昂格雷爾, B·克拉莫, M·多邁爾 申請人:特里根有限公司