專利名稱：干細胞的分化誘導(dǎo)及分化能力的控制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物細胞，尤其是多能干細胞的培養(yǎng)、維持、增殖、進而分化誘導(dǎo)，更具體而言，涉及能夠在再生醫(yī)療技術(shù)領(lǐng)域使用的技術(shù)方法。
背景技術(shù)：
因交通事故、受傷或者疾病而損傷心臟、肺、腎臟、血管、消化道、甚至神經(jīng)等組織或臟器時，不依賴他人的臟器，而利用本人細胞，通過使用仍保持分化為心臟、血管等受損組織等的功能的干細胞或功能細胞，使原來的臟器再生的再生醫(yī)療技術(shù)的開發(fā)為人們所期待。
在這種背景下，例如關(guān)于心臟，已經(jīng)分離出多個參與心臟的發(fā)育和分化的重要基因。此外，也使用胚胎干細胞(ES細胞)等具有多分化能力的細胞，對心肌細胞的發(fā)育和分化進行解析。進一步提示，包括骨髓細胞在內(nèi)的干細胞具有分化為各種細胞的多分化能力(或多能性)。而且，據(jù)報道，這種骨髓來源的細胞即使是在小鼠體內(nèi)，也促使受損心肌再生，并觀察到心臟功能的改善。
更具體而言，有關(guān)ES細胞的發(fā)生和分化，業(yè)已知道，未分化的兔ES細胞在細胞因子、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β超家族的構(gòu)成成員，即TGF-β以及BMP2)的引導(dǎo)下所形成的胚狀體促進向具有顯著增大的搏動區(qū)域的心肌的分化(例如，參考下述非專利文獻1)。細胞因子作為這種重要的增殖、分化控制因子，其對各種細胞的作用也已在被研究。因而，業(yè)已知道，細胞因子的功能具有多樣性，并且該功能是重復(fù)的。
另一方面，關(guān)于骨髓來源的細胞，也有報道指出，一些從溫度敏感性SV-40T抗原基因的轉(zhuǎn)基因小鼠得到的，顯示肌肉形成性、骨形成性及脂肪形成性分化的骨髓基質(zhì)細胞株(TBR細胞株)，分化為骨骼肌，且其分化被制瘤素(OSM)所刺激，而其他TBR細胞株向平滑肌的分化卻被OSM所抑制(例如，參考下述非專利文獻2)。此外，TBR細胞株的一般制備方法及具體的細胞株，也已經(jīng)詳細公開(例如，參考下述專利文獻1，以及非專利文獻3和4)。據(jù)非專利文獻3和4記載，TBR細胞株根據(jù)T抗原的失活、增殖條件而顯示表型變化，脂肪前體細胞被誘導(dǎo)為脂肪細胞以及成骨細胞，而有些脂肪前體細胞和內(nèi)皮細胞株被誘導(dǎo)為肌細胞和脂肪細胞。這些性質(zhì)提示，TBR細胞來源于多能性間充質(zhì)干細胞。而且，已經(jīng)知道，間充質(zhì)干細胞能夠被誘導(dǎo)為骨細胞、軟骨細胞、肌腱細胞、韌帶細胞、骨骼肌細胞、脂肪細胞、間質(zhì)細胞等(參考下述非專利文獻5)。
進而還公開了，對于具有向心肌細胞分化的分化能力的骨髓來源的細胞，通過施用5-氮胞苷等DNA脫甲基化試劑，會隨機(stochastic)分化為心肌細胞、脂肪細胞以及骨骼肌細胞系列(例如，參考下述專利文獻2)。
此外，據(jù)專利文獻2記載，通過將FGF-8、ET1、Midkine、骨形成因子-4(BMP4)這四類中的一種細胞因子和5-氮胞苷組合添加，能夠促進骨髓來源的細胞表達心肌特異性基因。此外專利文獻2還提示，將具有向心肌細胞分化的分化能力的小鼠骨髓細胞預(yù)先用5-氮胞苷處理后，移植到小鼠，在心肌細胞和血管細胞中發(fā)現(xiàn)來源于移植細胞的細胞。
專利文獻1特開平5-292958號公報專利文獻2第01/48151號小冊子、具體是第4頁2-11行、第53頁-55頁)非專利文獻1The FASEB J.2002；161558-1566，摘要部分非專利文獻2體外Cell.Dev.Biol.-Animal 37698-704(2001)非專利文獻3J.Cellular Physiology 16455-64(1995)非專利文獻4Experimental Cell Research 218.424-429(1995)非專利文獻5Science 284.143-147(1999)如同以上所述，在本技術(shù)領(lǐng)域，業(yè)已知道，不僅是ES細胞，而且一些特定的骨髓來源的細胞(不包括造血干細胞)也具有多分化能力，并表達特定的分化性狀，成為功能細胞，進而形成組織或器官；由此提示，特定性狀或者功能或分化方向性能夠改變。此外，專利文獻2中也記載，通過使用細胞因子，能夠改變分化的方向性(新的分化性狀的表達性)，但根據(jù)所記載的方法，原則上有必要與5-氮胞苷(在生物體內(nèi)被磷酸化而當(dāng)作核酸，具有阻礙DNA合成的作用)并用。如果能夠提供可進一步確切調(diào)節(jié)分化方向性的手段，則將有助于本技術(shù)領(lǐng)域的進步。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人，針對細胞因子對多能干細胞的分化方向性以及分化程度的影響，進行了細致嚴密的探討，發(fā)現(xiàn)如上面所述的細胞因子功能的多樣性，不僅在不同的細胞間，而且在同系細胞的不同特定發(fā)育階段也能觀察到。此外還發(fā)現(xiàn)，通過將兩種或兩種以上的細胞因子組合使用，能夠控制動物細胞分化的方向性。本發(fā)明是基于這樣的見解而完成的。
因而，根據(jù)本發(fā)明，提供一種細胞的分化誘導(dǎo)方法，其是在多能干細胞發(fā)育的過程中，通過該細胞和試劑的接觸介導(dǎo)的該細胞的分化誘導(dǎo)方法，其特征在于，該細胞和試劑的接觸是在該細胞的包括i)第一發(fā)育階段、ii)第二發(fā)育階段、iii)第三發(fā)育階段前期、iv)第三發(fā)育階段后期、v)第四發(fā)育階段前期以及vi)第四發(fā)育階段后期的發(fā)育階段中至多4個階段實施，而且該試劑是能夠促進和/或抑制該細胞向至少兩個方向分化的物質(zhì)。
此外，作為本發(fā)明其他實施方式，其提供一種評價方法，其是關(guān)于使用前述細胞分化誘導(dǎo)方法對候選試劑對細胞分化促進或抑制能力的評價方法，其特征在于，該候補試劑(或者被檢物質(zhì))是在多能干細胞的前述發(fā)育階段的至多4個階段中和該細胞接觸。這種評價方法，非限定性地可用于篩選與后述能夠調(diào)節(jié)多能干細胞增殖和/或分化的細胞因子具有相同或者更強的作用的物質(zhì)(肽性或非肽性)。
進而提供用于控制哺乳動物細胞的分化的細胞因子組，其特征在于，以兩種或兩種以上組合的細胞因子作為有效成分，能夠控制多能干細胞，例如骨髓基質(zhì)細胞的3個或3個以上的分化方向性的確定和方向性已確定的各細胞的分化程度。
此外，可以在選自體外、先體外后體內(nèi)以及體內(nèi)的環(huán)境下使用此種細胞因子組。作為這種使用的具體實施方式
，可以舉出，篩選能夠成為上述成分的細胞因子或其他具有同等作用的試劑的方法，還有，直接或間接再生醫(yī)療，例如在將具有多分化能力的細胞移植到生物體內(nèi)時，對這些細胞配合施用上述細胞因子組，或者是預(yù)先用前述細胞因子組對從接受者本人采集的細胞進行處理，使其表達所希望的分化性狀，進而，在分化為特定功能的細胞或組織后，移植到生物體的方法。該篩選方法的優(yōu)選實施方式是，提供具有使脊椎動物分化的能力的藥劑的篩選方法，其特征在于，(A)準備多能干細胞，尤其是攜帶有溫度敏感性SV-40T抗原基因的轉(zhuǎn)基因小鼠來源的多能性骨髓基質(zhì)細胞，(B)以在預(yù)期具有促使細胞分化的能力的試劑存在下，用能夠使該細胞增殖的培養(yǎng)基培養(yǎng)該細胞，(C)確定培養(yǎng)細胞的分化方向性或分化程度，以及(D)將有關(guān)這樣確定的分化的方向性或分化程度的結(jié)果和不存在該試劑時的該細胞的培養(yǎng)結(jié)果進行比較，以兩結(jié)果的差異作為該試劑對骨髓基質(zhì)細胞的分化能力的影響作用的指標(biāo)。
進而作為優(yōu)選實施方式，包含施用選自上述BMP-2、BMP-4、OSM、GDF-5以及TGF-β2的細胞因子作為比較試劑的階段。


圖1(a)是代替表示TBR32-2的分化誘導(dǎo)結(jié)果的圖的細胞照片，(b)是代替顯示TBR10-1的分化誘導(dǎo)結(jié)果的圖的細胞照片。
圖2是表示TBR32-2的增殖曲線和發(fā)育階段的圖表。
圖3是表示TBR10-1的增殖曲線和發(fā)育階段的圖表。
圖4中的(a)是代替表示實施例1-5及比較例1中的凝膠電泳后的Westernblot結(jié)果圖的照片、(b)是代替表示實施例6-12中的凝膠電泳后的Westernblot結(jié)果圖的照片。
圖5中的(a)是代替表示實施例13-17及比較例2中的凝膠電泳后的Westernblot結(jié)果圖的照片、(b)是代替表示實施例18-24及比較例3中的凝膠電泳后的Westernblot結(jié)果圖的照片。
圖6是代替表示實施例25中的WB法的結(jié)果(由SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，再將分離的凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上)的圖的照片。上部平滑肌、下部骨骼肌。
具體實施例方式
能夠用于本發(fā)明的多能干細胞，只要是滿足本發(fā)明目的即可，只要是通過試劑作用能夠由天然細胞，例如ES細胞表達兩種或兩種以上新的分化性狀，成為功能性細胞或組織或器官的細胞即可，可以是從骨髓、腦、肝臟、其他臟器分離得到的細胞，亦或是該細胞的原代培養(yǎng)細胞、傳代培養(yǎng)細胞、無限增殖的細胞，且優(yōu)選使用骨髓來源的間充質(zhì)細胞的干細胞。此外，可以是分離或建立的細胞株，也可以是被稱為預(yù)備性骨髓基質(zhì)細胞、間充質(zhì)干細胞的細胞，只要滿足本發(fā)明目的，就包含在本發(fā)明所謂的多能干細胞中。
因而，上述非專利文獻3-4中記載的顯示多能性的細胞是被作為更為具體的例子而舉出的。另外，只要是具有和這些文獻中記載的細胞同等的分化方向性、分化程度等特性，無論細胞起源為何都可以使用，例如可以是，小鼠、大鼠、豚鼠、兔、貓、狗、綿羊、山羊、馬、豬、牛、猴、人等哺乳動物來源的細胞。盡管并非是用來限定，但在確認本發(fā)明的作用、效果的基礎(chǔ)上，作為合適的多能干細胞，可以舉出如前述非專利文獻3或4中記載的由溫度敏感性SV-40T抗原基因的轉(zhuǎn)基因小鼠建立的被稱為TBR株(或系)的細胞。此外，非專利文獻3及4的共著者包括本發(fā)明人之一帶刀益夫博士。對于上述TBR株的特定株，例如TBR 31-2、10-1等，只要是在出于試驗、研究目的使用的前提下，均可從仙臺市青葉區(qū)星陵町4-1東北大學(xué)加齡醫(yī)學(xué)研究所不受限制獲得。
這種使多能干細胞發(fā)育的過程，可以是體外、先體外后體內(nèi)及體內(nèi)的任何發(fā)育過程，尤其是前兩者中的發(fā)育過程倍受關(guān)注。這種發(fā)育過程，包含細胞人工培養(yǎng)中的細胞各發(fā)育階段(或發(fā)育期)，具體包括以下階段。
(i)第一發(fā)育階段觀察到細胞突起旺盛伸長、還未進入增殖階段的幼小的未成熟細胞；(ii)第二發(fā)育階段處于細胞數(shù)目增多即將開始的階段，并且細胞突起旺盛伸長，鄰接細胞的突起之間的接觸即將開始到剛結(jié)束期間，觀察到細胞體積膨脹至多細胞；(iii)第三發(fā)育階段前期由處于對數(shù)增殖發(fā)育開始、鄰接細胞的突起之間的接觸達到90％或其以上的狀態(tài)的細胞開始，當(dāng)以因細胞個體之間完全接觸而不再有繼續(xù)增殖的面積的狀態(tài)為100時，觀察到處于細胞密度達到60％的狀態(tài)的細胞，即處于60％鋪滿狀態(tài)的細胞；(iv)第三發(fā)育階段后期觀察到由以對數(shù)增殖方式活躍增殖的處于60％鋪滿狀態(tài)的細胞開始，直至增殖漸漸停止的100％鋪滿狀態(tài)的細胞，是逐漸趨于成熟的細胞；
(v)第四發(fā)育階段前期處于100％鋪滿狀態(tài)的細胞仍在少量增殖，觀察到增殖即將停止的細胞；以及(vi)第四發(fā)育階段后期觀察到細胞增殖階段結(jié)束后的成熟細胞。請參照圖2及圖3。
根據(jù)以往的技術(shù)，在使用細胞因子的情況下，由于細胞培養(yǎng)是在培養(yǎng)的全部過程中都含有細胞因子的培養(yǎng)基中進行，因而細胞是從培養(yǎng)初期到培養(yǎng)結(jié)束連續(xù)與細胞因子接觸(或暴露)，但本發(fā)明中，在上述i)-vi)的發(fā)育階段之中的至多4個階段使細胞和能夠促進和/或抑制該細胞向至少2個方向分化的物質(zhì)(優(yōu)選是任意一種細胞因子)接觸至關(guān)重要。有關(guān)是否進行這樣的接觸，在細胞發(fā)育的過程，典型地講是在細胞培養(yǎng)中，例如每2-4天換一次培養(yǎng)基，通過使交換培養(yǎng)基含有或不含前述物質(zhì)，就可容易控制。至多4個階段，例如不僅可包括iii)第三發(fā)育階段前期iv)第三發(fā)育階段后期v)第四發(fā)育階段前期vi)第四發(fā)育階段后期等，也可以包括i)第一發(fā)育階段ii)第二發(fā)育階段和iii)第三發(fā)育階段前期等3個階段，或者包含i)第一發(fā)育階段和ii)第二發(fā)育階段、或iv)第三發(fā)育階段后期和v)第四發(fā)育階段等2個階段，進而也可以包含前述6個階段中的任意一個階段。
根據(jù)本發(fā)明，在處于這樣的任何階段的細胞的培養(yǎng)基中，優(yōu)選以能夠誘導(dǎo)發(fā)育細胞分化的濃度加入細胞因子。作為所述的細胞因子，包括但不限于，例如制瘤素M(OSM)、骨形成因子-2(BMP-2)、骨形成因子-4(BMP-4)、生長分化因子-5(GDF-5)及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β2)。
例如，根據(jù)非專利文獻2，在上述TBR31-2培養(yǎng)的全程期間(上述i)-vi)發(fā)育階段)使該細胞株和OSM連續(xù)接觸的情況下，如同上述，骨形成性分化也受到刺激(或者向成骨細胞的分化誘導(dǎo)被促進)。但是，脂肪生成性分化卻受到抑制(或者向脂肪細胞的分化誘導(dǎo)被抑制)。與此相反，根據(jù)本發(fā)明，不單是在上述i)-vi)的發(fā)育階段，即使只是在上述vi)發(fā)育階段，存在OSM都會抑制由TBR31-2向脂肪細胞的誘導(dǎo)分化。進一步重要的認識是，如同非專利文獻2中的記載，若在前述i)-vi)發(fā)育階段的全程中，都在OSM存在下培養(yǎng)TBR31-2，則向平滑肌的分化誘導(dǎo)會受到抑制，相反，若在i)-iii)發(fā)育階段、或iii)、iv)及v)發(fā)育階段中的任何一個發(fā)育階段中，在OSM存在下培養(yǎng)TBR31-2，則向平滑肌的分化誘導(dǎo)會被促進。
即，在多能干細胞的發(fā)育體系中，要評價細胞因子對該細胞的作用時，有時會因該細胞和細胞因子接觸的時間分化誘導(dǎo)的方向發(fā)生逆轉(zhuǎn)?？傊?，為了明確細胞因子等試劑對多能干細胞的作用，優(yōu)選在前述i)-vi)6個發(fā)育階段中的任何適當(dāng)?shù)?-4發(fā)育階段中，確認該試劑的作用。
由此，依據(jù)本發(fā)明，若將多能干細胞的分化誘導(dǎo)方法，應(yīng)用到各種候補試劑(或被檢物質(zhì))對該細胞的作用的評價中，則可以確切地評價所述試劑的分化誘導(dǎo)能力。在這樣的培養(yǎng)方法中，可方便地使用攜帶有溫度敏感性SV-40T抗原基因的轉(zhuǎn)基因小鼠來源的骨髓基質(zhì)細胞(TBR系細胞)，這是由于該細胞易于培養(yǎng)，并并便于對培養(yǎng)結(jié)果進行評價。這種評價方法更優(yōu)選、或者更具體的實施方式如下所述。
一種評價方法，其特征在于，A)在以特定的營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)TBR系細胞時，在適當(dāng)濃度的被檢物質(zhì)存在下，在生長發(fā)育或培養(yǎng)過程中至多4個階段中培養(yǎng)該細胞，所述階段包括i)第一發(fā)育階段ii)第二發(fā)育階段iii)第三發(fā)育階段前期iv)第三發(fā)育階段后期v)第四發(fā)育階段前期，及vi)第四發(fā)育階段后期，B)檢測培養(yǎng)細胞是否轉(zhuǎn)化為具有某種分化性狀的細胞(或者培養(yǎng)細胞是否發(fā)生分化誘導(dǎo))，C)依據(jù)檢測結(jié)果，判斷被檢物質(zhì)是否具有對多能干細胞的分化誘導(dǎo)能力，或者對細胞分化的促進或抑制作用。
在這種評價方法中，作為比較或者陽性對照，可以不含被檢物質(zhì)，而在選自骨形成因子-2(BMP-2)、骨形成因子-4(BMP-4)、制瘤素M(OSM)、生長分化因子(GDF-5)以及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β2)的細胞因子存在下，進行上述培養(yǎng)，再與所得結(jié)果進行比較，能夠更為具體地評價被檢物質(zhì)對多能干細胞的作用。
另一方面，本發(fā)明是將2種或2種以上細胞因子組合作為有效成分使用，可以同時，也可以因時間、場所等而異，個別使用。而且，將細胞因子組合起來(或者組配)使用了一次后，只使用其中任何一種的情況，也包括在本發(fā)明的細胞因子的組合使用中。例如，使用2種或2種以上細胞因子確定多能干細胞的分化方向性，并控制方向性的程度之后，為實現(xiàn)最終目的以得到特定的分化細胞，使用一種細胞因子進行選擇性增殖分化，上述的全部階段也應(yīng)理解為相當(dāng)于使用依據(jù)本發(fā)明的細胞因子組合。3種或3種以上的分化方向性是指，多能干細胞發(fā)生增殖的情況下，表達3種或3種以上新的特性(分化性狀)，或者是指向功能性細胞或組織、器官的性質(zhì)，簡單說來，是指達到任何功能細胞，例如平滑肌細胞、骨骼肌細胞等的特性傾向。因而，各分化程度是指，例如，與對照，例如不添加經(jīng)分離的細胞因子，而在血清存在下的各分化細胞的出現(xiàn)率進行比較時，平滑肌細胞或骨骼肌細胞的出現(xiàn)率的多少。
這樣的分化方向性是指，具體而言，多能干細胞表達平滑肌細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、內(nèi)皮細胞或脂肪細胞等分化性狀，或是趨向于各種分化細胞的性質(zhì)，但并不局限于此。依據(jù)本發(fā)明，如果使用2種或2種以上的細胞因子組，則可以使多能干細胞指向至少3種上述各分化細胞，并能夠控制被指向的各分化細胞的分化性狀的表達程度或出現(xiàn)程度。這些程度是與下述情況相比能夠檢測到的促進(或者增加)或抑制(或者減少)，所述情況指在除了不添加上述細胞因子而以血清補足之外，其它培養(yǎng)組成基本上都一樣的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多功能性干細胞時，所觀察到的各分化性狀的表現(xiàn)程度或各分化細胞的出現(xiàn)程度。該程度，與前述在血清存在下產(chǎn)生的分化性狀的表達或分化細胞的出現(xiàn)比較，優(yōu)選至少促進或抑制10％。這樣根據(jù)本發(fā)明，能夠選擇性增高任意特定分化細胞的出現(xiàn)率或存在比例。檢測上述分化性狀的表達程度以及分化細胞的出現(xiàn)程度的例子，可以舉出后述的特定實施例，也可以應(yīng)用本技術(shù)領(lǐng)域公知的任何技術(shù)方法。
本發(fā)明中，構(gòu)成如上述能夠誘導(dǎo)多能干細胞的2種或2種以上細胞因子的組合(或組)的細胞因子，依據(jù)本發(fā)明目的，例如，如前述的，只要是能夠選擇性增高任意特定分化細胞的出現(xiàn)率或存在比例的細胞因子，都可以使用，也可以將其任意組合使用。但是，作為這種細胞因子的例子，非限定地可以舉出，骨形成因子-2(BMP-2)、骨形成因子-4(BMP-4)、制瘤素M(OSM)、生長分化因子(GDF-5)以及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β2)等。此外，作為這種細胞因子組合的例子，可以舉出，BMP-2和BMP-4、BMP-2和OSM、BMP-2和TGF-β2、BMP-2和BMP-4和OSM、OSM-BMP-4、OSM和TGF-β2、OSM和GDF-5、OSM和GDF-5和BMP-4、OSM和GDF-5和FGF-β2和BMP-4、BMP-2和OSM和GDF-5和BMP-4，以及BMP-2和OSM和GDF-5和TGF-β2和BMP-4。例如，某多能干細胞(參照后述實施例)，通過組合使用BMP-2和OSM，能夠確認具有以高出現(xiàn)率向自律搏動的心肌細胞分化的分化能力，以及以高出現(xiàn)率向內(nèi)皮細胞分化的分化能力，因而，根據(jù)所需目的，對于具有這樣的多能性的干細胞，能夠使用BMP-2或OSM，或者BMP-2和OSM。
對于上述分化誘導(dǎo)方法以及評價方法，或者是2種或2種以上細胞因子的組合使用的體系，可以直接使用任何已知能夠培養(yǎng)動物細胞，例如TBR系細胞株的培養(yǎng)條件，或者將其改良使用。例如，作為培養(yǎng)基，基本來說，添加有必須營養(yǎng)源的任何培養(yǎng)基均可使用，對于氨基酸，是在基質(zhì)中添加有動物(哺乳類)不能合成的必須氨基酸，即L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-纈氨酸、L-谷氨酸，根據(jù)情況也可以添加非必須氨基酸L-甘氨酸、L-絲氨酸以利于更好生長發(fā)育。對于培養(yǎng)溫度等其他條件，除溫度條件等之外，由于細胞需要碳酸氫離子，作為和CO2孵箱中的CO2氣相協(xié)同使培養(yǎng)基的pH穩(wěn)定化而添加的緩沖劑，一般是添加屬于碳酸氫類的碳酸氫鈉溶液，或進一步添加HEPES等，由此即使是從CO2孵箱取出來，pH也能保持穩(wěn)定。此外，為適當(dāng)防止雜菌污染，也可以添加抗生素。依據(jù)本發(fā)明，需要時可以將血清之外的試劑從培養(yǎng)基中去除，并添加細胞因子。另一方面，在體外條件下，可以使細胞因子包含于對生理的，或?qū)κ褂玫募毎蜃硬粫聿焕绊懙慕橘|(zhì)中的施用。作為這樣的介質(zhì)，非限定性地可以是無菌水、生理鹽水、磷酸緩沖的生理鹽水。
在體外及先體外后體內(nèi)使用的各細胞因子的使用量，參照后述實施例中的使用量，如果需要，可以進行小規(guī)模實驗來確定最適量。在體外使用時，通常其用量可以是0.1ng/ml-20ng/ml。另外，培養(yǎng)溫度可以是33℃-37℃。
此外，發(fā)生分化誘導(dǎo)的細胞的識別方法，可以依據(jù)已知的方法，作為具體例子，可以依據(jù)后述實施例中記載的方法。
作為本發(fā)明的其他實施方式，可以提供以由前述分化誘導(dǎo)方法得到的分化細胞作為主體的再生醫(yī)療用制品。這樣，依據(jù)本發(fā)明，可以提供能夠在心臟、毛細血管、動脈及靜脈等血管類臟器、胃、食道、結(jié)腸、直腸、小腸、大腸等消化器類臟器、手腳的肌肉、氣管、子宮、陰道、脂肪組織等的再生醫(yī)療中使用的手段。
此外，依據(jù)上述評價方法，可以構(gòu)筑篩選能夠控制各分化程度的試劑的體系。
另一方面，2種或2種以上的細胞因子的組，可以和上述無菌水、生理鹽水、磷酸緩沖的生理鹽水組合，或者是不進行組合，而使其存在于對生物體不會產(chǎn)生不利影響的物質(zhì)的基質(zhì)中，以緩慢釋放的方式使用。作為形成這樣的基質(zhì)的物質(zhì)，可以舉出，聚乳酸(多孔體)、膠原、膠原海綿、三磷酸酸鈣、多孔羥基磷灰石、聚乳酸微粒、聚乳酸包被明膠海綿、乳酸-乙二醇共聚物、瓊脂糖、聚乙烯醇、藻酸、瓊脂糖/肝素、支鏈淀粉、血纖維蛋白凝膠、膠原小顆粒、乙烯-醋酸乙烯共聚物、乳酸-乙醇酸共聚物、殼聚糖、乳酸/乙醇酸-乙二醇共聚物、鈦植入物等。
此外，體外組合使用2種或2種以上細胞因子，或者使用細胞因子組時，尤其是利用由本發(fā)明的部分發(fā)明人所提供的使用簡便、易于操作的上述TBR間質(zhì)細胞株，能夠確定多能干細胞的分化方向性，進而能夠構(gòu)筑篩選可控制已確定分化方向的各分化程度的試劑的體系。在這種篩選體系中，本發(fā)明的細胞因子組，可以作為比較樣品使用。例如，在1種或2種或其以上的上述細胞因子存在，而不是待篩選的試劑的候補物質(zhì)(例如，預(yù)期誘導(dǎo)TBR株的分化的候補試劑)存在下培養(yǎng)多能干細胞，并將培養(yǎng)結(jié)果作為評價該候補物質(zhì)的作用的標(biāo)準(或基準)，能夠高效率篩選有助于誘導(dǎo)多能干細胞向所希望的分化方向分化的試劑。此外，上述的培養(yǎng)條件可應(yīng)用于該篩選體系。
以下，進一步對本發(fā)明進行具體說明，但本發(fā)明并不限定于此。
(1)誘導(dǎo)分化的細胞或分化細胞的識別或檢測(1-1)關(guān)于平滑肌細胞，用顯微鏡觀察培養(yǎng)在60mm塑料平皿上的細胞集落中的紡錘形單核細胞，為了檢測從該培養(yǎng)細胞集落提取的蛋白質(zhì)混合物中在平滑肌細胞特異表達的肌球蛋白輕鏈激酶(sm-MLCK)或α-肌動蛋白(α-sm-Actin)，利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，再將經(jīng)凝膠分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印(WB法)到膜上，通過與膜上sm-MLCK特異性反應(yīng)的一抗(Sigma生產(chǎn)的MonoclonalAnti-Myosin Light Chain Kinase、mouse IgG2b、clone K36、Product No.M7905)或與α-sm-Actin特異性反應(yīng)的一抗(Sigma生產(chǎn)、MonoclonalAnti-α-Smooth Muscle Actin、mouse IgG2a isotype、clone 1A4、ProductNo.A2547)以及用于檢測一抗的辣根過氧化酶(horseradisperoxidase)(HRP)標(biāo)記的二抗(ICN生產(chǎn)、Goat anti-mouseIgGF(ab’)2、IgG、Catalog No.55553)，來識別。
(1-2)在除去培養(yǎng)液后，添加濃度調(diào)配為1μg/ml的染色液碘化丙啶(PI)，于室溫和染色液反應(yīng)5分鐘后，除去染色液，并用磷酸緩沖液(PBS)清洗干凈以觀察培養(yǎng)皿中的細胞核，PBS清洗處理為每次5分鐘，進行3次。對培養(yǎng)平皿中的細胞核進行觀察。
(1-3)關(guān)于骨化細胞，由于已知成骨細胞中存在較高濃度的堿性磷酸酶(以下ALP)，還沉淀有羥基磷灰鹽形式的鈣，因而，通過前者的ALP染色法，以及后者的Kossa反應(yīng)，來識別骨化細胞。該HRP標(biāo)記二抗的檢測是利用X射線膠片(Codak生產(chǎn)、XAR-5)通過產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的化學(xué)發(fā)光檢測試劑(amasham生產(chǎn)、ECL Plus westernblot檢測試劑盒)進行的。首先，關(guān)于ALP法，除去60mm塑料培養(yǎng)平皿中的培養(yǎng)液，用PBS清洗附著在平皿底部的細胞3次，每次3分鐘，然后用70％冷乙醇溶液在冰上靜置固定10分鐘，接著用蒸餾水清洗3次后，添加表-1所示的ALP反應(yīng)液，于37℃靜置4小時。
表-1 ALP反應(yīng)液

在此期間，適時用顯微鏡觀察細胞是否被染為粉紅色。用蒸餾水清洗3次后，添加Meyer’s蘇木精溶液(和光純藥工業(yè)株式會社生產(chǎn)病理研究用No.131-09665)，室溫放置5分鐘，進行細胞核染色。輕輕用水清洗，再浸入到溫水中顯色。最后用蒸餾水清洗3次。關(guān)于Kossa反應(yīng)，除去60mm塑料培養(yǎng)平皿中的培養(yǎng)液，并用PBS清洗附著于平皿底部的細胞3次，每次3分鐘，然后用10％冷甲醛溶液在冰上靜置固定10分鐘，接著用蒸餾水清洗2次。添加5％硝酸銀溶液，在房間的間接光下反應(yīng)，直至鈣沉淀部變?yōu)楹诤稚螅谜麴s水清洗3次。接著，加入5％硫代硫酸鈉溶液，靜置固定處理3分鐘后，再用蒸餾水清洗3次。進而，為了進行對比染色，添加表-2所示Kernechtrot溶液，靜置5分鐘后，用蒸餾水清洗3次。用顯微鏡進行觀察，評價骨化細胞。
表-2 Kossa反應(yīng)

(1-4)關(guān)于內(nèi)皮細胞，用顯微鏡觀察培養(yǎng)在35mm塑料平皿上的細胞集落中的鋪路石(cobblestone)狀細胞，通過確認1，1’-雙十二烷基-3，3，3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽(テトラメチルィンドカルボシァニンパ一クロレ一ト)標(biāo)記的乙酰低密度脂蛋白(DiI-Ac-LDL產(chǎn)品No.L-3484、Molecular Probes生產(chǎn)，USA)的攝取能力，來識別。具體來說，將培養(yǎng)平皿中的培養(yǎng)液吸取除去，注意不要損傷細胞，然后添加用無血清培養(yǎng)基配制的10μg/ml的DiI-Ac-LDL，于33℃培養(yǎng)4小時。用PBS清洗3次，5分鐘/次，除去未被攝取的DiI-Ac-LDL，再添加3％甲醛溶液，室溫放置固定20分鐘。用蒸餾水洗凈后，使用羅丹明濾器，用熒光顯微鏡觀察。
(1-5)關(guān)于脂肪細胞，用顯微鏡觀察培養(yǎng)的細胞集落中的帶有脂肪粒的細胞，通過油紅染色法識別。除去培養(yǎng)平皿中的培養(yǎng)液，用PBS清洗附著于平皿底部的細胞3次，3分鐘/次，然后用3％福爾馬林溶液，室溫靜置固定10分鐘，接著用80％異丙醇取代1分鐘后，于37℃以油紅染色10分鐘。進而，用60％異丙醇區(qū)分(分別)1分鐘后，清洗2次，3分鐘/次，最后為了使細胞核染色，用Meyer’s蘇木精溶液(和光生產(chǎn))處理10分鐘，再用流水清洗2分鐘后，用顯微鏡確認染為紅色的脂肪細胞。此外，由于該脂肪細胞成熟時，會發(fā)育成帶有明顯脂肪粒的細胞，因而，即使不進行染色，也能容易鑒定出脂肪細胞。
(1-6)關(guān)于細胞的測定，在除去培養(yǎng)液后，添加1ml的EDTA·胰蛋白酶溶液(0.02g EDTA·3Na/100ml的PBS溶液、0.002g胰蛋白酶/100ml的PBS溶液)，清洗細胞。該清洗操作是在細胞剝脫前快速進行2次，添加胰蛋白酶溶液，待其完全鋪展于細胞表面后，立刻用移液管快速將其吸取除去。接著，用顯微鏡確認細胞呈完全剝脫狀態(tài)后，將5mlRITC培養(yǎng)基添加到60mm塑料平皿中，用移液管反復(fù)吹打?qū)⒓毎疵撓聛砗?，將其移?0ml離心管，將該溶液中的細胞數(shù)換算為在60mm平皿中的數(shù)目。細胞數(shù)的測定是采用Elmer的Bürker-Türk血細胞計數(shù)板進行的。
關(guān)于細胞體積(packed cell volume；PCV)的測定，將如上配制的溶液中的細胞數(shù)換算成在4ml中的數(shù)目。之后，在血細胞比容離心管(1儲量(メモリ)＝1μl、總?cè)萘?0μl)中，添加該溶液4ml，1000rpm離心3分鐘，讀取沉淀下來的細胞體積，測定每105個細胞的體積。使用的離心機是日立工業(yè)(株)生產(chǎn)的CF7D。
(2)細胞培養(yǎng)(2-1)比較培養(yǎng)使用下表-3中所示的2％FBS的RITC80-7培養(yǎng)基(以下，RITC培養(yǎng)基)，在90mm塑料平皿中培養(yǎng)至細胞間緊密接觸前的亞鋪滿狀態(tài)(80％左右的鋪滿)。去除培養(yǎng)液后，添加1ml的EDTA·胰蛋白酶溶液(0.02g EDTA·3Na/100ml的PBS溶液、0.002g胰蛋白酶/100ml的PBS溶液)，清洗細胞。該清洗操作是在細胞剝脫前快速進行2次，再添加胰蛋白酶溶液，待其完全鋪展于細胞表面后，立刻用移液管快速將其吸取除去。接著，用顯微鏡確認細胞呈完全剝脫狀態(tài)后，再次添加表-3中所示的RITC培養(yǎng)基，調(diào)整細胞濃度為1.2×104/ml。將該細胞懸浮液4.0ml添加到60mm塑料平皿中，將細胞均勻分散后，于33℃培養(yǎng)。
表-3 RITC80-7培養(yǎng)基

有關(guān)細胞因子的添加對細胞分化能力的影響效果，使用表-3中所示的RITC培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)開始12小時后，換為新的RITC培養(yǎng)基。每三天或者四天換一次培養(yǎng)基。細胞因子的添加是在換培養(yǎng)基時進行，其量如表-4所示。
表-4 細胞因子的添加量

此外，依據(jù)以下所述標(biāo)準進行細胞分化的鑒定。即，關(guān)于平滑肌，用顯微鏡觀察紡錘形單核細胞，進而，用WB法判定由該培養(yǎng)細胞集落提取出的蛋白質(zhì)混合物中的平滑肌細胞特異表達的肌球蛋白輕鏈激酶蛋白質(zhì)或α-肌動蛋白的表達。關(guān)于脂肪細胞，測定每個形成脂肪粒的單位(3.8mm2)中的細胞數(shù)，求出平均值。
(2-2)實施例1-12(實施例1-5是參考例)、以及比較例1-2中使用的間充質(zhì)干細胞株TBR31-2，如同上述非專利文獻3或4中所記載的那樣，建立于1995年，并具有向脂肪以及骨細胞分化的分化能力。本發(fā)明人使用該細胞株以及下述表-5中所示的α-MEM培養(yǎng)基和高血清濃度的胎牛血清(10％FBS)，對培養(yǎng)條件進行了詳細研究，弄清楚了，該細胞株是具有分化為下述4種表型的能力的干細胞，即除脂肪和骨細胞外，還包括平滑肌和內(nèi)皮細胞(參照圖1a和表-6)，進而開發(fā)出依據(jù)無血清或低濃度血清0.7％FBS的培養(yǎng)基和細胞因子而能夠自由改變這些分化的比率的技術(shù)(實施例1-5)。即，如平滑肌細胞的分化標(biāo)識α-肌動蛋白的表達(參照表-6以及圖4(a))和向脂肪細胞分化的結(jié)果所示(實施例1-5)，實施例1的OSM共同抑制向平滑肌和脂肪細胞的分化，實施例2的BMP-2和實施例3的BMP-4則共同促進向平滑肌和脂肪肌的分化。另一方面，實施例4的GDF-5抑制向平滑肌的分化，但促進向脂肪的分化，相反，實施例5的TGF-β2促進向平滑肌的分化，但抑制向脂肪細胞的分化。
表-5 α-MEM培養(yǎng)基

表-6細胞因子對間充質(zhì)干細胞TBR 31-2向平滑肌、骨及脂肪細胞分化的影響(RITC 80-7、37℃、25天)

*()內(nèi)的數(shù)值表示的是添加到培養(yǎng)基中的最終濃度。
**普遍測定5處3.8mm2內(nèi)的脂肪細胞數(shù)，表示的是其平均值。
記號表示的是依據(jù)圖(4)的用化學(xué)發(fā)光檢測平滑肌的分化標(biāo)識(α-sm-Actin)的表達時的表達量的多少。++++非常大量表達，+++大量表達，++較大量表達，+明顯表達，±雖然少但表達明顯，-完全不表達。
這樣，通過將細胞因子組合，就能夠自由控制分化方向。換句話說，不讓處于未分化狀態(tài)的細胞分化，或者是維持已功能性分化的細胞的功能，就可以實現(xiàn)維持·擴增。
(2-3)上述分化控制是通過連續(xù)施用細胞因子實現(xiàn)的，但并不一定總要連續(xù)施用細胞因子，通過選擇施用時間，也可以實現(xiàn)分化控制。關(guān)于這方面，以TBR 31-2和TBR 10-1株為例具體講述。
(2-3-1)以下依據(jù)圖2對TBR 31-2的發(fā)育階段進行說明。
第1發(fā)育階段細胞突起旺盛伸長，尚未進入增殖階段的幼小的未成熟細胞。
第2發(fā)育階段處于細胞數(shù)目增多即將開始的階段，并且細胞突起旺盛伸長，鄰接細胞的突起之間的接觸即將開始到剛結(jié)束期間，細胞體積膨脹至多細胞。
第3發(fā)育階段前期由處于對數(shù)增殖發(fā)育開始、鄰接細胞的突起之間的接觸達到90％或其以上的狀態(tài)的細胞開始，當(dāng)以因細胞個體之間完全接觸而不再有繼續(xù)增殖的面積的狀態(tài)為100時，處于細胞密度達到60％的細胞，即處于60％鋪滿狀態(tài)的細胞。
第3發(fā)育階段后期由以對數(shù)增殖方式活躍增殖的處于60％鋪滿狀態(tài)的細胞開始，趨于增殖漸漸停止的100％鋪滿狀態(tài)的細胞，并且是逐漸趨于成熟的細胞。
第4發(fā)育階段前期處于100％鋪滿狀態(tài)的細胞仍在少量增殖，增殖即將停止的細胞。
第4發(fā)育階段后期細胞增殖階段結(jié)束的成熟細胞。
首先，針對在該株的4個發(fā)育階段，OSM對其向平滑肌和脂肪細胞分化的影響，展開敘述。向平滑肌和脂肪細胞的分化會因OSM的作用而受到抑制，這和前述實施例1中所示一樣，但平滑肌細胞和脂肪細胞的分化抑制，在發(fā)育階段有所不同。即，關(guān)于平滑肌細胞的分化，若連續(xù)24天施用OSM，則向平滑肌細胞的分化會受到抑制(實施例6、實施例1的重復(fù))，該抑制效果，是在第3發(fā)育階段后期以后，尤其是只在第4發(fā)育階段后期施用的情況下得到(實施例8和12)。但是，若在從第1到第3發(fā)育階段前期期間連續(xù)施用OSM，平滑肌分化反而受到促進(實施例7)。另一方面，關(guān)于脂肪細胞的分化，若連續(xù)24天施用OSM，則向脂肪細胞的分化會受到抑制(實施例6)，但該抑制效果是，在除第3發(fā)育階段和第4發(fā)育階段前期之外的所有發(fā)育階段受到抑制(實施例7、8、9及12)。
但是，若在第3發(fā)育階段后期到第4發(fā)育階段前期期間施用OSM，則向脂肪細胞的分化會受到促進(實施例10、11)。
如這樣，在干細胞的發(fā)育階段，向平滑肌細胞的分化抑制是在完成增殖階段的成熟細胞上發(fā)生(第4發(fā)育階段)、向脂肪細胞的分化抑制是在增殖結(jié)束的成熟細胞上發(fā)生(第4發(fā)育階段后期)。此外，向平滑肌細胞的分化促進是在從處于尚未成熟狀態(tài)的細胞到活躍增殖的處于對數(shù)增殖期的細胞上發(fā)生(第1-3發(fā)育階段)，向脂肪細胞的分化促進是在增殖即將停止逐漸趨于成熟細胞的細胞上發(fā)生(第3發(fā)育階段后期到第4發(fā)育階段后期)。結(jié)果請參考表-7(或圖4(b))。
表-7 OSM對間充質(zhì)干細胞TBR 31-2向平滑肌及脂肪細胞分化的影響效果(RITC 80-7、37℃、24天) *普遍測定5處3.8mm2內(nèi)的脂肪細胞數(shù)，以其平均值表示。
記號表示的是依據(jù)圖4(b)的用化學(xué)發(fā)光檢測平滑肌的分化標(biāo)識(α-sm-Actin)的表達時的表達量的多少。+++大量表達，++較大量表達，+明顯表達，-完全不表達。
如這些結(jié)果顯示，對應(yīng)于干細胞的發(fā)育過程的各階段，細胞因子的效果不同，通過選擇施用時間，能夠自由控制向平滑肌細胞和脂肪細胞的分化比率。
(2-3-2)另外以細胞株TBR10-1為例，展開敘述。實施例13-24(實施例13-17是參考例)，以及比較例2中使用的間充質(zhì)干細胞株TBR10-1是如前述非專利文獻3或4中所記載的，已顯示其向平滑肌細胞分化(FEBS Letters 481193-196，2000)。本發(fā)明人使用該株和表-5所示的α-MEM培養(yǎng)基和高血清濃度的胎牛血清(10％FBS)，詳細研究了培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)除平滑肌細胞之外還分化為骨化細胞和內(nèi)皮細胞，弄清楚了其是具有分化為3種表型的能力的多能干細胞(參照圖1-b及表-8)。進而開發(fā)出通過無血清或低濃度血清0.7％FBS的RITC培養(yǎng)基和細胞因子，能夠自由改變這些分化比率的技術(shù)。
表-8 細胞因子對間充質(zhì)干細胞TBR 10-1向平滑肌、骨分化的影響(RITC 80-7、37℃、14天)

*()內(nèi)的數(shù)值表示的是添加到培養(yǎng)基中的最終濃度。
記號表示的是依據(jù)圖5(a)的用化學(xué)發(fā)光檢測平滑肌的分化標(biāo)識sm-MLCK的表達時的表達量的多少。++較大量表達，±雖然少但表達明顯，-完全不表達。
即，如平滑肌細胞的分化標(biāo)識肌球蛋白輕鏈肌酶蛋白的表達和向骨細胞分化的結(jié)果顯示(參照實施例13-17；表-8及圖5(a))，該細胞株向平滑肌的分化被OSM和TGF-β2抑制。但在BMP-2、BMP-4及GDF-5存在下，則被促進。另一方面，向骨細胞的分化在OSM和GDF的存在下得到促進。尤其是，鑒于向平滑肌和骨化細胞的分化受到OSM的反向誘導(dǎo)，意味著骨分化和平滑肌分化是以密切關(guān)系被控制的，有可能存在多個骨化和平滑化分化能力不同的干細胞分化階段。
TBR10-1株的例子中，該干細胞的發(fā)育過程如圖3所示，可大體分為4個階段。以下，關(guān)于各發(fā)育階段的詳細情況，請參照有關(guān)TBR32-1的發(fā)育階段的說明。
如實施例18-24(參照下述表-9及圖5(b))所示，若對應(yīng)于TBR10-1株的發(fā)育過程的各階段，施用細胞因子，則顯示和連續(xù)施用時完全不同的分化方向。即，若連續(xù)施用BMP-2，則平滑肌分化優(yōu)先進行。此外，BMP-2所產(chǎn)生的對平滑肌分化的促進效果，不一定需要連續(xù)施用，在從細胞增殖旺盛的第3發(fā)育階段到成熟細胞所處的第4發(fā)育階段均可觀察到BMP-2促進細胞向平滑肌分化的優(yōu)勢效果。在未成熟細胞所處的第1-2發(fā)育階段，未觀察到BMP-2所產(chǎn)生的對平滑肌的分化促進效果(實施例19)。
表-9 BMP-2對間充質(zhì)干細胞TBR10-1向平滑肌分化的影響效果(RITC 80-7、33℃、15天) 記號表示的是依據(jù)圖5(b)的用化學(xué)發(fā)光檢測的作為向平滑肌分化的標(biāo)識的α-sm-Actin的表達量的多少。+++大量表達，++較大量表達，+明顯表達，±雖然少但表達明顯，-完全不表達。
如上所述，依據(jù)本發(fā)明，例如，如同OSM對向脂肪細胞分化的影響效果的實施例(實施例6-12)所示，使用微孔板等干細胞培養(yǎng)體系開發(fā)分化誘導(dǎo)物質(zhì)、分化抑制物質(zhì)等新藥時，選擇在干細胞的哪個發(fā)育階段評價新藥非常重要，對所篩選的被檢測體的評價結(jié)果會因選擇的發(fā)育階段不同而完全相反。此外，在再生醫(yī)療領(lǐng)域，提供細胞用于細胞移植時，通過選擇細胞因子的種類和濃度、控制添加時間進行培養(yǎng)，使得提供處于最佳分化階段的細胞成為可能。例如，可提供兼具向構(gòu)成血管的內(nèi)皮細胞和平滑肌適度分化的細胞，或兼具向內(nèi)皮細胞、平滑肌及心肌適度分化的細胞。
實施例25細胞株TBR 52具有多能性的確認(1)本實施例使用細胞株TBR 52(參照上述非專利文獻3及4)，培養(yǎng)基使用具有下面表-10所示組成的α-MEM培養(yǎng)基。
表-10 α-MEM培養(yǎng)基

(2)TBR 52的分化能力通過組合使用下述Westernblott法(WB)、免疫染色法及逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈式反應(yīng)(PCR)法等識別方法進行識別。
(2-1)關(guān)于平滑肌細胞，用顯微鏡觀察培養(yǎng)在35mm塑料平皿上的細胞集落中的紡錘形單核細胞，為了檢測從該培養(yǎng)細胞集落提取的蛋白質(zhì)混合物中，平滑肌細胞特異表達的肌球蛋白輕鏈激酶(sm-MLCK)，利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，再將凝膠上分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到膜上(WB法)，通過使用與膜上sm-MLCK特異性反應(yīng)的一抗(Sigma生產(chǎn)，Monoclonal Anti-Myosin Light ChainKinase、mouse IgG2b、clone K36、Product No.M7905)以及用于檢測一抗的辣根過氧化酶(horseradis peroxidase)(HRP)標(biāo)記的二抗(ICN生產(chǎn)、Goat anti-mouse IgGF(ab’)2、IgG、Catalog No.55553)，來識別。
(2-2)關(guān)于骨骼肌細胞，用顯微鏡觀察確認培養(yǎng)在35mm塑料平皿上的細胞集落中的具有橫紋肌構(gòu)造的肌管狀多核細胞，采用和上述相同的方法，由SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳從培養(yǎng)細胞集落提取的蛋白質(zhì)混合物分離出骨骼肌細胞特異表達的快骨骼肌(速筋型)肌球蛋白重鏈II(skeletal Myosin Heavy Chain II，fast)，再使用和此肌球蛋白重鏈II特異性反應(yīng)的一抗Monoclonal Anti-Skeletal Myosin(fast)(Sigma生產(chǎn)、mouse IgG、clone MY32，M4276)以及用于檢測該一抗的辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的抗小鼠二抗(ICN生產(chǎn)、Goat、anti-mouse IgG F(ab)2、IgG、No.55553)，來識別。在除去培養(yǎng)液后，添加濃度調(diào)配為1g/mL的染色液碘化丙啶(PI)，于室溫和染色液反應(yīng)5分鐘后，除去染色液，并用磷酸緩沖液(PBS)清洗干凈，PBS清洗處理為每次5分鐘，進行3次。對培養(yǎng)平皿中的細胞核進行觀察。
此外，快骨骼肌肌球蛋白重鏈II蛋白的表達確認是依照常規(guī)方法通過免疫染色進行的。具體來說，使用磷酸緩沖液(PBS)清洗35mm塑料平皿內(nèi)的25mm的多聚L-賴氨酸包被的玻璃(4925-040、旭technoglass、東京)上培養(yǎng)的細胞集落，再用1.5ml的2.5％多聚甲醛，于4℃固定15分鐘。用PBS清洗3次，5分鐘/次，然后用1.5ml含有0.1％Triton X-100的PMS，于室溫破膜處理3分鐘。再用PBS清洗3次，5分鐘/次，然后添加1.5ml含有5％脫脂牛奶的PBS(以下記為5％脫脂牛奶-PBS)，于4℃處理30分鐘。用5％脫脂牛奶-PBS以1∶50比例稀釋上述與快骨骼肌肌球蛋白重鏈II特異反應(yīng)的抗體MonoclonalAnti-Skeletal Myosin(fast)(Sigma生產(chǎn)、mouse IgG、clone MY32，M4276)，將其作為一抗使用。將前面在30分鐘處理時使用的5％脫脂牛奶-PBS 1.5ml替換為該一抗1.5ml，于4℃約反應(yīng)14小時。此后，用PBS清洗3次，5分鐘/次。用5％脫脂牛奶-PBS以1∶200比例稀釋異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗小鼠抗體(Sigma生產(chǎn)、Goat、Anti-mouse IgG-Fab、F8711)作為二抗。使用1.5ml該二抗，于4℃反應(yīng)30分鐘，接著用PBS清洗3次(5分鐘/次)后，翻轉(zhuǎn)，夾隔著VECTASHIELD(H-1000、Vector Laboratorises、Burlingame、USA)置于載玻片上。使用倒立熒光顯微鏡確認快骨骼肌肌球蛋白重鏈II蛋白的表達。
(2-3)關(guān)于心肌細胞，用顯微鏡觀察培養(yǎng)于35mm塑料平皿中的細胞集落中的具有棍棒狀形態(tài)、并進行自律性周期收縮(搏動)的細胞，用WB法按照和上述同樣的順序，確認心肌特異性連接蛋白43的表達。但是，使用抗連接蛋白43(Chemicon生產(chǎn)、產(chǎn)品No.MAB3068)作為一抗，使用抗小鼠二抗(ICN生產(chǎn)、Goat、anti-mouse IgG F(ab’)2、IgG No.55553)作為二抗。進而，采用RT-PCR法，通過確認Nk×2.5基因、α肌球蛋白重鏈基因的表達來識別。
其順序是依照RT-PCR試劑盒(GibcoBRL生產(chǎn)、商品No.11904-018)所附的說明進行。除去培養(yǎng)平皿中的培養(yǎng)液，用PBS清洗平皿底部附著的細胞3次。使用RNA提取試劑Isogen(日本人生產(chǎn))，利用硫氰酸胍·酚·氯仿法，回收該清洗的細胞中的總RNA。接著，依據(jù)RT-PCR試劑盒所附的說明，利用Oligo(dT)法，將回收得到的2.5μg總RNA轉(zhuǎn)化成cDNA，再用DEPC水調(diào)整到10倍。以該cDNA 1μl為模板，配制含有10倍PCR緩沖液1μl、25mM MgCl21μl、8mM dNTP0.5μl、正向引物(Forward Primer)(10pmol/μl)0.5μl、反向引物(ReversePrimer)(10pmol/μl)0.5μl、AmpliTaq Gold DNA Polymerase(應(yīng)用生物系統(tǒng)日本、東京)0.1μl、以及DEPC水5.4μl的總量為10μl的反應(yīng)液，進行基因擴增反應(yīng)(PCR)。PCR使用的是GenAmp 9700熱循環(huán)儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)日本、東京)，95℃5分鐘后，以各種條件循環(huán)30次進行。此后，在2％瓊脂糖凝膠上與標(biāo)準分子量標(biāo)記一起電泳，在UV光下，確認PCR產(chǎn)物?；驍U增反應(yīng)中使用的各種引物的堿基序列如下。

1)序列號1，2)序列號2，3)序列號3，4)序列號4(2-4)關(guān)于內(nèi)皮細胞，用顯微鏡觀察培養(yǎng)在35mm塑料平皿上的細胞集落中的鋪路石狀細胞，通過確認雙十二烷基-3，3，3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽標(biāo)記的乙酰低密度脂蛋白(DiI-Ac-LDL產(chǎn)品No.L-3484、Molecular Probes生產(chǎn)，USA)的攝取能力，來識別。具體來說，將培養(yǎng)平皿中的培養(yǎng)液吸取除去，注意不要損傷細胞，然后添加用無血清培養(yǎng)基配制的10μg/ml的DiI-Ac-LDL，于33℃培養(yǎng)4小時。用PBS清洗3次，5分鐘/次，除去未被攝取的DiI-Ac-LDL，添加3％甲醛溶液，室溫放置固定20分鐘。用蒸餾水洗凈后，使用羅丹明濾器，用熒光顯微鏡觀察。
(2-5)關(guān)于脂肪細胞，用顯微鏡觀察培養(yǎng)的細胞集落中的帶有脂肪粒的細胞，通過油紅染色法識別。除去培養(yǎng)平皿中的培養(yǎng)液，用PBS清洗附著于平皿底部的細胞8次，8分鐘/次，然后用3％福爾馬林溶液室溫靜置固定10分鐘，接著用80％異丙醇取代1分鐘后，于37℃以油紅染色10分鐘。進而，用60％異丙醇區(qū)分1分鐘后，清洗2次，3分鐘/次，最后為了使細胞核染色，用Meyer’s蘇木精溶液(和光生產(chǎn))處理10分鐘，再用流水清洗2分鐘后，用顯微鏡確認染為紅色的脂肪細胞。此外，由于該脂肪細胞成熟時，會發(fā)育成帶有明顯脂肪粒的細胞，因而，即使是不進行染色，也能容易判定出脂肪細胞。
實施例26-30細胞因子產(chǎn)生的分化抑制將待測試的細胞因子添加入具有下面表-11所示的組成的RITC80-7培養(yǎng)基中，確認各細胞因子的添加效果。
表-11 RITC 80-7培養(yǎng)基

使用RITC 80-7培養(yǎng)基，在90mm塑料平皿中培養(yǎng)至TBR 52細胞間緊密接觸前的亞鋪滿狀態(tài)(80％左右的鋪滿)。去除培養(yǎng)液后，添加1ml的EDTA·胰蛋白酶溶液(0.02g EDTA·3Na/100ml的PBS溶液、0.002g胰蛋白酶/100ml的PBS溶液)，清洗細胞。該清洗操作是在細胞剝脫前，快速進行2次，再添加胰蛋白酶溶液，待其完全鋪展于細胞表面后，立刻用移液管快速將其吸取除去。接著，用顯微鏡確認細胞呈完全剝脫狀態(tài)后，添加表-10中所示的α-MEM培養(yǎng)基，調(diào)整細胞濃度為3×105/ml。添加1.5ml該細胞懸浮液于35mm塑料平皿中。此時，35mm塑料平皿預(yù)先已鋪有25mm多聚L-賴氨酸包被的玻璃(4925-040、Asahi Techno Glass、東京)。添加α-MEM培養(yǎng)基的24小時后，換成新的α-MEM培養(yǎng)基。每2天或3天換一次培養(yǎng)基，共進行30天。
關(guān)于細胞因子的添加對細胞分化能力的作用效果，使用α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，添加α-MEM培養(yǎng)基的24小時后，換成新的α-MEM培養(yǎng)基。每2天或3天換一次培養(yǎng)基，共進行30天。細胞因子是在換培養(yǎng)基時添加，其量如下面表-12所示。
表-12 細胞因子的添加量

此外，依照下面所述基準進行細胞分化的鑒定。即，關(guān)于平滑肌，用顯微鏡觀察顯示紡錘形的單核細胞，目測每單位面積上平滑肌細胞所占的面積，其平均值以％表示。進而，用上述WB法判定從其培養(yǎng)細胞集落抽提出的蛋白質(zhì)混合物中的平滑肌細胞特異表達的肌球蛋白輕鏈激酶蛋白的表達。關(guān)于骨骼肌，用顯微鏡觀察顯示橫紋肌型構(gòu)造的肌管(myotube)狀多核細胞，目測每每單位面積上骨骼肌細胞所占的面積，其平均值以％表示。進而，用上述WB法判定從其培養(yǎng)細胞集落抽提出的蛋白質(zhì)混合物中的骨骼肌細胞特異表達的快骨骼肌肌球蛋白重鏈II(skeletal Myosin Heavy Chain II，fast)蛋白的表達。圖6顯示的是代替顯示這些WB法結(jié)果的圖的照片。關(guān)于心肌細胞，用顯微鏡觀察具有棍棒狀(rod shape)形狀的、進行自律性周期收縮(搏動)的單核細胞，計算每單位面積自律性周期搏動的細長混紡狀細胞的數(shù)目，求其平均值。關(guān)于內(nèi)皮細胞，用顯微鏡觀察呈鋪路石狀形狀的細胞，目測每單位面積上的上皮細胞所占的面積，其平均值以％表示。關(guān)于脂肪細胞，測定每個形成有脂肪粒的單位中的細胞數(shù)，求其平均值。結(jié)果在表-13和表-14總結(jié)顯示。
表-13 多能干細胞的分化能力

單位面積3.8mm2、**未成熟表-14 WB結(jié)果(圖-1的轉(zhuǎn)記)

正如表-13及表-14所表明的那樣，實施例26中在培養(yǎng)基中加入BMP-2后，促進了向心肌細胞的分化，大約是未添加BMP-2的比較例的10倍。此外，在用顯微鏡進行形態(tài)觀察時，由于向骨骼肌細胞的分化被心肌細胞所覆蓋，因而不能明確判定，但由WB法的分析結(jié)果看，確實促進了向骨骼肌細胞的分化。向平滑肌及內(nèi)皮細胞的分化，即使是添加BMP-2，也未受到很大影響。向脂肪細胞的分化在細胞數(shù)上和比較例幾乎沒有差別，但通過添加BMP-2，觀察到具有小脂肪粒的未成熟細胞，說明向脂肪細胞的分化受到抑制。
實施例27中，培養(yǎng)基中添加OSM后，向心肌細胞的分化被抑制到比較例的1/2。此外，向骨骼肌和脂肪細胞的分化幾乎完全被抑制，并且以顯微鏡進行形態(tài)觀察時，也未確認到多核肌管狀骨骼肌以及含有脂肪粒的脂肪細胞。對骨骼肌細胞分化的抑制效果，在用WB法對快骨骼肌肌球蛋白重鏈II蛋白的表達分析中，也得到確認。添加OSM也抑制向脂肪細胞的分化，但對于向平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞的分化幾乎不產(chǎn)生影響。
實施例28中，培養(yǎng)基中添加GDF-5后，向心肌細胞和脂肪細胞的分化得到略微促進。但是，GDF-5的添加卻抑制了骨骼肌細胞特異性快骨骼肌肌球蛋白重鏈II蛋白的表達。平滑肌以及內(nèi)皮細胞的分化，并未受到GDF-5的添加的影響。
實施例29中，培養(yǎng)基中添加TGF-β2后，向平滑肌、心肌以及脂肪細胞的分化受到抑制，但向內(nèi)皮細胞的分化未受到影響。向骨骼肌細胞的分化，盡管由顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察不能觀察到表現(xiàn)骨骼肌細胞形態(tài)的細胞，但采用WB法時，骨骼肌細胞特異性快骨骼肌肌球蛋白重鏈II蛋白的表達是受到促進的。盡管對該蛋白表達，目前還無法明確解釋，但這對于明確在向骨骼肌細胞分化的過程中發(fā)生的形態(tài)學(xué)上的細胞融合和骨骼肌分化的初期誘導(dǎo)期之間的關(guān)系來說，可能是很重要的。
進而在實施例30中，與未添加的比較例相比，將BMP-4添加到培養(yǎng)基后，向脂肪細胞的分化得到10倍或10倍以上的促進，但在采用WB法進行分析時發(fā)現(xiàn)向平滑肌和骨骼肌細胞的分化受到抑制。此外，作為心肌細胞的特征地自律性搏動細胞的數(shù)目也少，向心肌細胞的分化受到抑制。BMP-4的添加幾乎不影響向內(nèi)皮細胞的分化。
這些結(jié)果顯示，通過施用向具有多分化能力的干細胞各種細胞因子，可使某特定細胞和分化方向優(yōu)先擴增，也可減弱向某個方向的分化，進一步還顯示，通過將細胞因子組合添加，可以抑制不需要的細胞，僅使目的細胞優(yōu)先擴增。
序列表<110>Japan Science and Technology Agency<120>細胞的分化誘導(dǎo)及分化能力的控制<130>K-1JST-OS<150>JP2003/83106<151>2003-03-25<150>JP2003/95242<151>2003-03-31<160>4<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>參考小鼠Nkx 2.5基因的1108位至1521位的堿基序列合成<223>NCBI登錄號NM008700<400>1ccgccgcctc cgccaacagc aact 24<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>參考小鼠Nkx 2.5基因的1108位至1521位的堿基序列合成<223>NCBI登錄號NM008700<400>2gggtgggtgg gcgacggcaa gaca 24<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>參考編碼小鼠的α-肌球蛋白重鏈基因的5630位至5931位的序列合成<223>NCBI登錄號M76601<400>3
ggaagagtga gcggcgcatc aagg 24<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>參考編碼小鼠的的α肌球蛋白重鏈基因的5630位至5931位的序列合成<223>NCBI登錄號M76601<400>4ctgctggaga ggttattcct cg 2權(quán)利要求
1.一種細胞的分化誘導(dǎo)方法，其是在多能干細胞發(fā)育的過程中，通過該細胞和試劑的接觸介導(dǎo)的細胞分化誘導(dǎo)方法，其特征在于，該細胞和試劑的接觸是在該細胞的包括i)第一發(fā)育階段、ii)第二發(fā)育階段、iii)第三發(fā)育階段前期、iv)第三發(fā)育階段后期、v)第四發(fā)育階段前期以及vi)第四發(fā)育階段后期的發(fā)育階段中至多4個階段實施，而且該試劑是能夠促進和/或抑制該細胞向至少兩個方向進行細胞分化的物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞的分化誘導(dǎo)方法，其中多能干細胞是骨髓基質(zhì)細胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞的分化誘導(dǎo)方法，其中骨髓基質(zhì)細胞來自于攜帶有溫度敏感性SV-40T抗原基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細胞的誘導(dǎo)方法，其中細胞分化是朝向平滑肌細胞、成骨細胞以及脂肪細胞中的至少任意兩種的分化細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的細胞的誘導(dǎo)方法，其中試劑是能夠促進或抑制細胞分化的細胞因子。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細胞的誘導(dǎo)方法，其中細胞因子選自制瘤素M(OSM)、骨形成因子-2(BMP-2)、骨形成因子-4(BMP-4)、生長分化因子-5(GDF-5)以及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β2)。
7.一種對試劑的細胞分化的促進或抑制能力的評價方法，其利用在使多能干細胞發(fā)育的過程中，通過該細胞和試劑的接觸介導(dǎo)的該細胞的分化誘導(dǎo)方法，其特征在于，該細胞和試劑的接觸是在該細胞的包括i)第一發(fā)育階段、ii)第二發(fā)育階段、iii)第三發(fā)育階段前期、iv)第三發(fā)育階段后期、v)第四發(fā)育階段前期以及vi)第四發(fā)育階段后期發(fā)育階段中至多4個階段實施，而且預(yù)期該試劑是促進和/或抑制該細胞向至少兩個方向進行細胞分化的候補作用物質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的評價方法，其中多能干細胞來自于攜帶有溫度敏感性SV-40T抗原基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的評價方法，其中將基于候補試劑的該細胞的分化程度，和在多能干細胞發(fā)育的過程中，使該細胞與能夠促進或抑制該細胞的分化的細胞因子接觸所致的分化程度相比較。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的評價方法，其中細胞因子選自制瘤素M(OSM)、骨形成因子-2(BMP-2)、骨形成因子-4(BMP-4)、生長分化因子-5(GDF-5)以及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β2)。
11.一種再生醫(yī)療用制品，其以根據(jù)權(quán)利要求1、2及4-6任一項所記載的細胞的誘導(dǎo)方法所誘導(dǎo)的細胞為主體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的制品，其中細胞來源于哺乳動物。
13.一種用于控制哺乳動物細胞分化的細胞因子組，其特征在于，以2種或2種以上組合的細胞因子作為有效成分，并且能夠控制包含骨髓基質(zhì)細胞的多能干細胞的3個或3個以上的分化方向性的確定，和方向性已確定的各細胞的分化程度。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的細胞因子組，其中多能干細胞是骨髓基質(zhì)細胞，分化方向性是3個或3個以上。
15.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的細胞因子組，其中所述細胞向平滑肌細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、內(nèi)皮細胞或脂肪細胞分化。
16.根據(jù)權(quán)利要求13-15任一項所述的細胞因子組，其中前述各分化程度是與血清存在下產(chǎn)生的任意一種分化進行比較，至少促進或抑制10％。
17.根據(jù)權(quán)利要求13-16任一項所述的細胞因子組，其中2種或2種以上組合的細胞因子選自骨形成因子-2(BMP-2)、骨形成因子-4(BMP-4)、制瘤素M(OSM)、生長分化因子-5(GDF-5)以及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β2)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的細胞因子組，其中細胞因子組合選自BMP-2和BMP-4、BMP-2和OSM、BMP-2和TGF-β2、BMP-2和BMP-4和OSM、OSM-BMP-4、OSM和TGF-β2、OSM和GDF-5、OSM和GDF-5和BMP-4、OSM和GDF-5和TGF-β2和BMP-4、BMP-2和OSM和GDF-5和BMP-4，以及BMP-2和OSM和GDF-5和TGF-β2和BMP-4。
19.根據(jù)權(quán)利要求13-17任一項所述的細胞因子組，其中骨髓基質(zhì)細胞細胞是在BMP-2的刺激下，所述能夠至少分化為平滑肌細胞、搏動的心肌細胞和內(nèi)皮細胞的多能性成人干細胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的細胞因子組，其中骨髓基質(zhì)細胞來自于攜帶有溫度敏感性SV-40T抗原基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的細胞因子組，其中骨髓基質(zhì)細胞的分化是在選自體外、先體外后體內(nèi)、體內(nèi)的環(huán)境下誘導(dǎo)的。
22.根據(jù)權(quán)利要求13-19任一項所述的細胞因子組，其中骨髓基質(zhì)細胞先體外后體內(nèi)或在體內(nèi)的分化應(yīng)用于再生醫(yī)療中的細胞移植中。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的細胞因子組，其中在體外的骨髓基質(zhì)細胞的分化應(yīng)用于對具有能夠分化該細胞的能力的試劑的篩選中。
24.篩選具有脊椎動物細胞的分化能力的藥劑的方法，其特征在于，(A)準備攜帶有溫度敏感性SV-40T抗原基因的轉(zhuǎn)基因小鼠來源的多能性骨髓基質(zhì)細胞，(B)在預(yù)期具有分化能力的候補試劑存在下，用能夠使該細胞增殖的培養(yǎng)基培養(yǎng)該細胞，(C)確定培養(yǎng)細胞的分化方向性或分化程度，以及(D)將有關(guān)這樣確定的分化方向性或分化程度的結(jié)果和該試劑不存在時的該細胞的培養(yǎng)結(jié)果進行比較，以兩結(jié)果的差異作為該試劑對骨髓基質(zhì)細胞的分化能力的影響作用的指標(biāo)。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述的比較試劑選自BMP-2、BMP-4、OSM、GDF-5、TGF-β2中的至少2種。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的篩選方法，其中培養(yǎng)用無血清培養(yǎng)基進行。
全文摘要
本發(fā)明提供用于控制動物細胞的分化能力的體系，其中僅在在動物細胞培養(yǎng)或增殖過程中動物細胞的適當(dāng)?shù)陌l(fā)育階段，使該細胞與細胞因子2種或2種以上細胞因子的組合接觸的細胞的分化誘導(dǎo)。
文檔編號A61P43/00GK1795265SQ20048001432
公開日2006年6月28日 申請日期2004年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月25日
發(fā)明者帶刀益夫, 鈴木義久 申請人:獨立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機構(gòu)