專利名稱：用于治療1型糖尿病的治療性疫苗組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及包含適于用作治療和預防1型糖尿病的免疫原活性劑的經(jīng)修飾的胰島素B鏈組分的治療性疫苗組合物。
背景技術：
1型糖尿病是一種侵襲胰臟胰島細胞的自身免疫病。在1型糖尿病發(fā)展的早期階段，在患者的血清中發(fā)現(xiàn)了針對多種胰島細胞蛋白質(zhì)的抗體。所述抗體包括針對胰島素的抗體(Vardi，等.(1988)糖尿病護理11，736-739)；針對谷氨酸脫羧酶(GAD65)的抗體(Hagoplan，等.(1993)糖尿病42631-636)。證據(jù)顯示重復施用低劑量胰島素B鏈給患有或有危險患1型糖尿病的個體可以預防或減少患者的糖尿病或胰島素依賴性的癥狀，Keller，等.(1993)Lancet 341927-928。使用胰島素B鏈(參見美國專利號5,891,435及美國專利申請2003/0045467)或胰島素B鏈的片段，尤其是殘基9-23(參見美國專利號5,594,100，Daniel，等(1996)PNAS 93956-960)進行免疫接種已經(jīng)證明可以在NOD小鼠中保護其避免糖尿病的發(fā)作。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及包含胰島素B鏈類似物多肽的免疫原性組合物，其中在胰島素B鏈中兩個半胱氨酸殘基中的至少一個被絲氨酸、蘇氨酸或丙氨酸殘基替代，本發(fā)明還涉及此類胰島素B鏈類似物治療糖尿病或前驅(qū)糖尿病病癥的用途。本發(fā)明的一些具體實施方案涉及包含有綴合至免疫原性載體上的胰島素B鏈類似肽的免疫原性組合物，其中在胰島素B鏈中兩個半胱氨酸殘基中的至少一個被絲氨酸、蘇氨酸或丙氨酸殘基替代。本發(fā)明還提供了治療人類受試者中糖尿病或前驅(qū)糖尿病病癥的方法，其包括對受試者施用包含經(jīng)修飾的胰島素B鏈類似物的免疫原性組合物。
發(fā)明詳述胰島素A鏈及B鏈的氨基酸序列如下所示 胰島素B鏈在位置7和19上具有兩個半胱氨酰殘基。它們均涉及與胰島素A鏈中的位置7和20上的半胱氨酰殘基形成鏈間二硫化物。A鏈中的位置6和11上的半胱氨酰殘基涉及形成鏈內(nèi)二硫鍵。游離的胰島素B鏈肽或胰島素B鏈的肽片段9-23均含有巰基殘基，其易于氧化并可能形成二硫鍵，結(jié)果導致該肽的聚合。這使得這些具有半胱氨酰殘基的肽在或接近中性pH值時(該pH值最適宜醫(yī)藥用途)是較不希望的。
本發(fā)明涉及修飾的人胰島素B鏈多肽，其中該肽中的一個或兩個半胱氨酰殘基被絲氨酸、蘇氨酸或丙氨酸殘基在其位置上被替代。該修飾的胰島素B鏈肽類似物可用作天然的胰島素B鏈的免疫模擬等價物，但是其應該在儲存于中性pH值時不易于氧化聚合。不管是丙氨酸、絲氨酸或蘇氨酸替代均應保留其接近于天然B鏈的流體力學特性。本發(fā)明中修飾肽可用于組合物中免疫治療性治療人類受試者的糖尿病或前驅(qū)糖尿病病癥。
使用胰島素B鏈或胰島素B鏈的9-23肽片段對人類患者進行免疫治療性治療已公開在美國專利號5,891,435及5,594,100及公布的專利申請US2003/0045467，它們所公開的內(nèi)容均被整體引入作為參考。
包含一個半胱氨酸替代(例如，Cys7及Ser/Thr/Ala19或Ser/Thr/Ala7及Cys19)的肽類似物適于通過受控氧化制備B鏈二聚體例如同型二硫化物二聚體。該修飾的胰島素B鏈肽同型二硫化物二聚體類似物應該用作天然胰島素B鏈的免疫模擬等價物，但是不應易于在儲存在中性pH值的條件下發(fā)生進一步的氧化聚合(其對于形成一個穩(wěn)定的醫(yī)藥產(chǎn)品來說是有害的)。在半胱氨酸殘基位點的丙氨酸，絲氨酸或蘇氨酸替代應保留肽接近于天然B鏈的流體力學特性。本發(fā)明修飾的同型二硫化物二聚體肽可用于免疫治療性治療糖尿病或前驅(qū)糖尿病的人類患者的組合物中。
此外，包含一個半胱氨酸替代(例如，Cys7及Ser/Thr/Ala19或Ser/Thr/Ala7及Cys19)的肽類似物同樣適于交聯(lián)至免疫原性蛋白質(zhì)載體，例如白喉類毒素(DT)、鑰孔血藍蛋白(KLH)、破傷風類毒素(TT)或霍亂B類毒素。免疫原性蛋白例如DT及TT攜帶有非種系選擇性T細胞表位。使用適于通過類毒素分子上氨基及在各自的B鏈類似物的單獨的巰基偶聯(lián)的雙功能交聯(lián)試劑可以實現(xiàn)胰島素B鏈類似物與免疫原性載體例如DT或TT的交聯(lián)。預期這種綴合類毒素的胰島素B鏈表位與胰島素B鏈或胰島素B鏈類似物相比在初次免疫反應提供更佳免疫原性以及免疫反應的更加的保持。
B鏈類似物及其類毒素綴合的衍生物也可以與佐劑，例如明礬、不完全弗氏類乳劑配制以使它們用作免疫原的效用最大化。
已經(jīng)報導胰島素B鏈9-23的水性制劑當皮下施用于NOD小鼠時可以誘導針對胰島素的免疫反應且可以預防該動物模型中糖尿病的發(fā)作。此外，也已經(jīng)報道使用胰島素B鏈片段9-23鼻內(nèi)施用免疫后可以在NOD小鼠中得到針對糖尿病的部分保護。B鏈片段9-23含有一個半胱氨酰殘基，預期其在中性或接近中性pH值時水性制劑中經(jīng)歷氧化二聚化。盡管，理論上，二聚化可能并不負面影響9-23胰島素B鏈片段的免疫原性質(zhì)量，但是可能損害在或接近中性pH值制備的制劑中所述分子的藥學上的可接受性。絲氨酸、蘇氨酸或丙氨酸在胰島素B鏈片段9-23的單個半胱氨酰殘基的替代將提供一種免疫原性等同分子，其具有與“天然的”9-23片段基本相同的流體力學特性，但沒有藥學上有害的氧化二聚化傾向。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及胰島素肽類似物二聚體的免疫原性組合物。這些二聚體包括同型二聚體及異型二聚體，其中通過在每一條肽上的半胱氨酸殘基上二硫鍵將兩個相同的胰島素B鏈類似物分子偶聯(lián)形成同型二聚體，異型二聚體中兩個不同的胰島素B鏈類似物分子通過半胱氨酸-半胱氨酸二硫鍵偶聯(lián)。例如，人類胰島素B鏈片段9-23的同型二硫鍵二聚體可以通過控制氧化反應制得。該經(jīng)修飾的胰島素B鏈9-23片段同型二硫鍵二聚體類似物可以用作9-23B鏈片段單體的免疫模擬等價物，但儲存在中性pH值時不易氧化聚合作用。氧化聚合作用對于穩(wěn)定的藥物產(chǎn)品的制備來說是有害的。
按照本發(fā)明產(chǎn)生用作藥學上可接受的免疫原的胰島素B鏈類似物的方法包括如下實施例實施例1免疫原載體的選擇可以通過勻漿30∶70水/油預混液將天然B胰島素制成30∶70油包水(w/o)乳液?？梢詮慕酋徬⒔酋復榛蛘呤褂萌榛瘎?，例如二縮甘露醇單油酸酯(mannide monooleate)(MMO)、聚氧乙烯(40)氫化蓖麻油(POCO)，或類似的兩性試劑及其混合物適當配制的角鯊烯和角鯊烷的組合可以制備連續(xù)的油相。備選地，天然B-胰島素可以通過在基于乳化劑，例如，二縮甘露醇單油酸酯、聚氧乙烯(40)氫化蓖麻油(POCO)，或類似的兩性試劑及其混合物配制的礦物油的50∶50水/油預混液中勻漿制備為50∶50油包水(w/o)乳劑。適于用作油包水(w/o)乳劑的連續(xù)油相是可以以法國巴黎的SEPPIC的Montanide制劑獲得。
所得油包水乳液可以用于免疫NOD小鼠或前驅(qū)糖尿病大鼠，或用于前驅(qū)糖尿病、糖尿病患者中并比較它們的免疫反應。
不用勻漿，將通過混合在磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)中的水性天然胰島素B鏈與適宜配制的油性載體制備成30∶70水/油預混液可以制備在油包水乳劑。免疫NOD小鼠或前驅(qū)糖尿病大鼠模型或前驅(qū)糖尿病患者或糖尿病患者中之前手動或渦旋約30-120秒鐘劇烈搖動所述預混液。
此外，“活性”油包水乳劑可以通過使用適當配制以30∶70水∶油(w/o)的比例的油性載體預混液與PBS中的天然胰島素B鏈勻漿而獲得，然后通過使用類似制備的“安慰劑”乳劑稀釋該“活性”乳劑將“活性”乳劑調(diào)整至所希望的強度。因此，可以改變抗原“劑量”及“佐劑”劑量比例以提供免疫原性組合物，其可以經(jīng)優(yōu)化使得最大化免疫原反應最大化和最小化注射部位的炎癥反應。制劑成分比例以及分散(水相)及連續(xù)(油)相的水∶油比例可進一步調(diào)整用于優(yōu)化用以加工的制劑的穩(wěn)定性和最大化該乳劑的貨架壽命?？赏ㄟ^水珠大小分布、粘度，以及在零度以下、制冷溫度(2-8℃)、室溫(25℃)及較高應激溫度(≥40℃)下隨時間保持乳劑而無相分離的能力測量多種乳劑的穩(wěn)定性及藥學可接受性。
實施例2備選胰島素抗原制劑通過使用絲氨酸、蘇氨酸或丙氨酸任一種替代半胱氨酸除去與天然胰島素B鏈相關的內(nèi)在氧化聚合潛力的適宜修飾的胰島素B鏈類似物可以制成如上所提供的乳劑。適合的胰島素B鏈類似物可以通過本領域已知的方法制備且包括胰島素-絲氨酸(蘇氨酸/丙氨酸)7，絲氨酸(蘇氨酸/丙氨酸)19B鏈類似物FVNQHLSGSHLVEALYLVSGERGFFYTPKA(SEQ ID No.3)FVNQHLSGSHLVEALYLVTGERGFFYTPKA(SEQ ID No.4)FVNQHLSGSHLVEALYLVAGERGFFYTPKA(SEQ ID No.5)FVNQHLTGSHLVEALYLVSGERGFFYTPKA(SEQ ID No.6)FVNQHLTGSHLVEALYLVTGERGFFYTPKA(SEQ ID No.7)FVNQHLTGSHLVEALYLVAGERGFFYTPKA(SEQ ID No.8)FVNQHLAGSHLVEALYLVSGERGFFYTPKA(SEQ ID No.9)FVNQHLAGSHLVEALYLVTGERGFFYTPKA(SEQ ID No.10)FVNQHLAGSHLVEALYLVAGERGFFYTPKA(SEQ ID No.11)胰島素-絲氨酸(蘇氨酸/丙氨酸)7，CySH19B鏈類似物
FVNQHLSGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA(SEQ ID No.12)FVNQHLTGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA(SEQ ID No.13)FVNQHLAGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA(SEQ ID No.14)胰島素-CySH7，絲氨酸(蘇氨酸/丙氨酸)19B鏈類似物FVNQHLCGSHLVEALYLVSGERGFFYTPKA(SEQ ID No.15)FVNQHLCGSHLVEALYLVTGERGFFYTPKA(SEQ ID No.16)FVNQHLCGSHLVEALYLVAGERGFFYTPKA(SEQ ID No.17)胰島素9-23，絲氨酸(蘇氨酸/丙氨酸)19B鏈類似物SHLVEALYLVSGERG(SEQ ID No.18)SHLVEALYLVTGERG(SEQ ID No.19)SHLVEALYLVAGERG(SEQ ID No.20)這些胰島素B鏈類似物可用藥學上可接受的載體配制以用作治療1型糖尿病的治療性的疫苗或耐受原。胰島素B鏈類似物可與免疫原性載體例如明礬或類毒素一起施用或直接綴合至免疫原性載體例如類毒素上且用含有可接受的佐劑的藥學上可接受的載體配制。使用本領域描述的治療方法可以施用治療性疫苗及耐受原。在某些實施方案中，油包水乳劑可用于配制治療人類患者糖尿病或前驅(qū)糖尿病病癥的藥學上可接受的免疫原。
實施例3胰島素B鏈類似物-類毒素綴合物的制備可以通過將合適的胰島素B鏈類似物綴合至具有非種系選擇性T細胞表位的適宜的免疫原性載體蛋白可以得到在最初的免疫原性及持續(xù)的免疫反應中高效價的抗體。在本發(fā)明具體的實施方案中，使用了在人類患者中主要引起Th2型IgG或混合Th1/Th2型免疫反應的免疫原性載體。合適的蛋白質(zhì)載體包括白喉類毒素(DT)及破傷風類毒素(TT)。
下列胰島素B鏈類似物可適于綴合類毒素胰島素-絲氨酸(蘇氨酸/丙氨酸)7，CySH19B鏈類似物FVNQHLSGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA(SEQ ID No.12)FVNQHLTGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA(SEQ ID No.13)FVNQHLAGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA(SEQ ID No.14)胰島素-CySH7，絲氨酸(蘇氨酸/丙氨酸)19B鏈類似物
FVNQHLCGSHLVEALYLVSGERGFFYTPKA(SEQ ID No.15)FVNQHLCGSHLVEALYLVTGERGFFYTPKA(SEQ ID No.16)FVNQHLCGSHLVEALYLVAGERGFFYTPKA(SEQ ID No.17)胰島素9-23CySH，絲氨酸(蘇氨酸/丙氨酸)19B鏈類似物SHLVEALYLVSGERC(SEQ ID No.21)SHLVEALYLVTGERC(SEQ ID No.22)SHLVEALYLVAGERC(SEQ ID No.23)A.胰島素Cys7-23，絲氨酸(蘇氨酸/丙氨酸)19B鏈類似物CGSHLVEALYLVSGERG(SEQ ID No.24)CGSHLVEALYLVTGERG(SEQ ID No.25)CGSHLVEALYLVAGERG(SEQ ID No.26)此外，胰島素B鏈類似物SEQ ID Nos.3-11也適于偶聯(lián)至載體蛋白質(zhì)。具體地，在氨基末端或者羧基末端具有半胱氨酸殘基、有或者沒有2-6個中性氨基酸殘基的間插間隔序列的胰島素B鏈類似物SEQ ID Nos.3-11適于偶聯(lián)至載體蛋白。
免疫原性載體例如DT或TT可以通過使用0.1M磷酸鈉緩沖液，1mMEDTA，pH 6.6±0.2(PA緩沖液，pH6.6)的滲濾以除去低分子量雜質(zhì)及降解產(chǎn)物而純化除去外來非特異性蛋白質(zhì)片段。例如，以DT為例，純化后的DT使用PA緩沖液調(diào)整至大約20mg/ml，pH6.6，然后在室溫下與0.1M磷酸鈉緩沖液，1mM EDTA，pH6.6±0.2中的過量雙功能交聯(lián)劑N-琥珀酰亞胺基-6-馬來酰亞胺基己酸酯(EMCS)反應1-3小時。為此，將EMCS溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，且在10分鐘內(nèi)逐滴加入至類毒素水溶液中。EMCS通過其活性酯部分與蛋白質(zhì)毒素的游離氨基反應，從而導入可以與游離巰基反應的馬來酰亞胺基。與EMCS反應后，將“活化的”類毒素通過使用0.1M檸檬酸鈉緩沖液，1mM EDTA，pH6.6±0.2(CC緩沖液，pH6.0)的滲濾純化以除去過量的反應劑。將溶于CC緩沖液，pH6.0的各自的含有巰基的胰島素B鏈類似物加入至馬來酰亞胺類毒素中并允許在室溫下過夜反應。使用磷酸緩沖鹽水，pH7.2±0.2(PBS，pH7.2)的滲濾純化類似物-DT綴合物以除去過量的反應劑。在備選實施方案中，可以通過本領域已知的方法通過含有半胱氨酸殘基的間隔肽將肽類似物綴合至類毒素。
在每一種情況下，偶聯(lián)至類毒素的肽類似物的比例將在每摩爾類毒素5-25摩爾類似物的范圍改變。在NOD小鼠或前驅(qū)糖尿病大鼠模型中免疫后，可以選擇最佳類似物-類毒素替代比例，其提供藥學上可接受的綴合物(在PBS，pH7.2中的溶解性及穩(wěn)定性)及用乳劑配制后引起可接受的免疫反應。
實施例4胰島素B鏈同型二硫化物二聚體類似物的制備通過半胱氨酸單替代的胰島素B鏈類似物的受控制氧化可以得到穩(wěn)定的免疫原性藥物組合物。適于制備胰島素B鏈同型二硫化物二聚體類似物的半胱氨酸單替代的胰島素B鏈類似物包括本申請中表示為SEQ IDNos.12、13、14、15、16、17、21、22、23、24、25及26的肽。在每一種情況，所選擇的肽在室溫下溶于pH7.2±0.2的磷酸緩沖鹽水。向肽溶液中通入純的過濾氧氣以促進半胱氨酸殘基的氧化二聚化形成它們各自的同型二硫化物二聚體。通過從反應混合物中取樣并使用反相高壓液相層析對單體二聚體定量分析，或用與5，5’-二硫代-二-(2-硝基苯甲酸)(Ellman試劑)反應分析殘留的自由巰基殘基來定期監(jiān)視反應。
使用本領域描述的治療方法，這些胰島素B鏈同型二硫化物二聚體類似物(任選含有可接受的佐劑)可以用作治療性疫苗或耐受原。在某些實施方案中，最好的油包水乳劑用于配制藥學上可接受的免疫原用于治療糖尿病或前驅(qū)糖尿病病癥。
實施例5胰島素B鏈類似物異型二硫化物二聚體的制備通過單半胱氨酸B鏈類似物與5，5’-二硫代-二-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)反應可以產(chǎn)生胰島素B鏈類似物的異型二硫化物二聚體。將通過與5-硫代-2-硝基苯甲酸的混合二硫化物而活化半胱氨酸殘基巰基。純化該DTNB活化的B鏈類似物以除去過量的DTNB及游離5-硫代-2-硝基-苯甲酸酯，然后與第二種不同的單半胱氨酸B鏈類似物反應以形成除去了5-硫代-2-硝基苯甲酸的異型二硫化物胰島素B鏈類似物。通過分光光度法測量412nm處的吸收監(jiān)視5-硫代-2-硝基-苯甲酸酯的除去可以跟蹤活化反應及二硫化物形成反應。異型二硫化物胰島素B鏈類似物在1型糖尿病群體可以賦予更寬的免疫反應。該異型二硫化物二聚體的特異性形成過程可用于在每個各自B鏈類似物的任意可利用的位點導入氨基酸殘基的額外的替代以便產(chǎn)生胰島素B鏈類似物的多種異型二硫化物二聚體，其可以用作在1型糖尿病中耐受(tolerization)的免疫治療劑。
序列表Organization Applicant----------------------Street111 Brewster Rd.
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權利要求
1.包含胰島素B鏈類似物肽的免疫原性組合物，其中胰島素B鏈中兩個半胱氨酸殘基中的至少一個經(jīng)絲氨酸、蘇氨酸或丙氨酸替代。
2.胰島素B鏈類似物肽二聚體，其包含第一條胰島素B鏈肽類似物，其中第一條胰島素B鏈肽類似物中兩個半胱氨酸殘基中的至少一個經(jīng)絲氨酸、蘇氨酸或丙氨酸殘基替代，并且剩余的半胱氨酸通過二硫鍵結(jié)合另一條胰島素B鏈分子的半胱氨酸。
3.權利要求1的免疫原性組合物，其中胰島素B鏈類似物是選自SEQID Nos.3-26的肽。
4.胰島素B鏈類似物肽二聚體，其中第一條胰島素B鏈肽類似物選自SEQ ID Nos.12-16和21-26構(gòu)成的組。
5.權利要求1或3的免疫原性組合物，其中所述胰島素B鏈類似物肽綴合至免疫原性載體。
6.免疫原性組合物，其包含權利要求2或4的二聚體和免疫原性載體。
7.治療人類受試者中糖尿病或前驅(qū)糖尿病病癥的方法，其包括對所述受試者施用權利要求1、2、3或4的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療性疫苗組合物，其包含適于用作治療和預防1型糖尿病的免疫原性活性劑的經(jīng)修飾的胰島素B鏈組分。
文檔編號A61K39/00GK1798569SQ200480015262
公開日2006年7月5日 申請日期2004年6月1日 優(yōu)先權日2003年6月2日
發(fā)明者P·布萊克本 申請人:莫西亞藥物公司