專利名稱：含有陽離子微粒和hcv e1e2 dna的組合物及其使用方法
技術領域：
本發(fā)明總體上涉及含有編碼HCV免疫原的DNA的免疫原性組合物。特別是，本發(fā)明涉及吸收到陽離子微粒上的含有編碼HCV E1E2多肽的DNA的組合物及其使用方法。
背景技術：
丙型肝炎病毒(HCV)在十多年前得到鑒定，現(xiàn)在已知該病毒是非甲型和非乙型肝炎的主要起因(Choo等.，Science(1989)244359-362；Armstrong等.，Hepatology(2000)31777)。HCV感染了世界約3％的人口，估計為兩億(Cohen，J.，Science(1999)28526)。每年美國有約30,000人發(fā)生獲得性HCV感染。此外，發(fā)展中國家的HCV感染發(fā)病率高。雖然免疫反應能清除HCV感染，但大多數(shù)感染變成慢性的。大多數(shù)急性感染維持無癥狀的并且通常僅在慢性感染幾年后發(fā)生肝病。
HCV的病毒基因組序列已知，獲得該序列的方法也是已知的。參見，例如國際公布號WO 89/04669、WO 90/11089和WO 90/14436。HCV具有9.5kb正義、單鏈RNA基因組并且是黃病毒家族的一員?；谙到y(tǒng)發(fā)育分析，至少6個不同但相關的HCV基因型(Simmonds等.，J.Gen.Virol.(1993)742391-2399)已經(jīng)鑒定。該病毒編碼具有多于3000個氨基酸殘基的單一多蛋白(Choo等.，Science(1989)244359-362；Choo等.，Proc.Natl.Acad.Sci.美國(1991)882451-2455；Han等.，Proc.Natl.Acad.Sci.美國(1991)881711-1715)。該多蛋白是在翻譯的同時或之后加工為結構性和非結構性(NS)蛋白質。兩個結構性蛋白質已知為E1和E2的包膜糖蛋白。HCV E1和糖蛋白E2在靈長類研究中表現(xiàn)出抗病毒攻擊的保護性作用。(Choo等.，Proc.Natl.Acad.Sci.美國(1994)911294-1298)。
目前HCV可用的治療藥物僅有IFN-α和利巴韋林。不幸的是，這些藥物僅對少于50％的治療患者有效(Poynard等.，Lancet(1998)3521426；McHutchison等.，Engl.J.Med.(1998)3391485)。因此，急需開發(fā)一種有效的疫苗以預防HCV感染，以及用作免疫治療的替代品或與現(xiàn)有的療法聯(lián)用。
T細胞對HCV的免疫性可決定HCV感染和疾病的結果(Missale等.，J.Clin.Invest.(1996)98706；Cooper等.，Immunity(1999)10439和Lechner等.，J Exp.Med.(2000)1911499)。一項研究得到的結論是主要表現(xiàn)出Th0/Th1CD4+T輔助應答的個體清除了其HCV感染，而具有Th2-應答的固體傾向于進展為慢性(Tsai等.，Hepatology(1997)25449-458)。此外，HCV-特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的頻率和病毒負荷之間表現(xiàn)出逆相關(Nelson等.，J.Immuon.(1997)1581473)。近來，在黑猩猩中對HCV的控制表現(xiàn)出與Th1 T細胞應答相關(Major等.，J.Virol.(2002)766586-6595)。因此，HCV-特異性T細胞應答似乎在控制HCV感染中起著重要作用?？贵w在保護中的作用也是以患者中慢性感染自發(fā)性消除的罕見病例為基礎提出的(Abrignani等.，J.Hepatol.(1999)31增刊1259-263)。此外，靈長類動物中的保護作用直接與抗-E1E2抗體的滴度相關，這證明了抗體在保護中可能的作用(Choo等.，Proc.Natl.Acad.Sci.美國(1994)911294-1298)。
在一系列動物模型中，DNA疫苗均能誘導強有力的長期CLT和Th1細胞應答(Gurunathan等.，Ann.Rev.Immunol.(2000)18927-974)。雖然，DNA疫苗在許多臨床實驗中施用于人志愿者并表現(xiàn)出是安全的，但其效力低于在較小的動物模型中得到的應答(Gurunathan等.，Ann.Rev.Immunol.(2000)18927-974)。例如，雖然在人志愿者中誘導了可檢測的CTL應答，但是即使高劑量(2.5mg)的DNA有時也未能誘導可檢測的抗體應答(Wang等.，Science(1998)282476-480)。即使當試圖使用無針頭噴射注射裝置來傳送DNA以改進效力時，在人志愿者中也未檢測到抗體應答(Epstein等.，Hum.Gen.Ther(2002)131551-1560)。因此，明顯需要改善DNA疫苗的效價和效率，特別是用于體液應答。
使用具有吸收或截留的抗原的顆粒載體來試圖引發(fā)充足的免疫應答。顆粒載體的例子包括那些衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物和衍生自聚(丙交酯)的微粒(參見，例如，美國專利號3,773,919)、已知為PLG的衍生自聚(丙交酯-共-乙交酯)的微粒(參見，例如，美國專利號4,767,628)和稱為PEG的衍生自聚乙二醇的微粒(參見，例如，美國專利號5,648,095)。聚甲基丙烯酸甲酯聚合物是非降解的，而PLG顆?？赏ㄟ^將酯鍵隨機非酶水解為乳酸和乙醇酸從而被生物降解，乳酸和乙醇酸可沿著正常的代謝途徑排出。
這種載體將多份選擇的大分子呈遞到免疫系統(tǒng)并促使該分子在局部淋巴節(jié)的俘獲和保留。顆?？杀痪奘燃毎淌刹⒛芡ㄟ^細胞因子釋放來提高抗原的呈遞。國際公布號WO 00/050006描述了具有吸附表面的陽離子微粒的生產(chǎn)。使用陽離子微粒作為DNA疫苗的傳遞系統(tǒng)表現(xiàn)出可極大地提高效力(Singh等.，Proc.Natl.Acad.Sci.美國(2000)97811-816)。例如，當與編碼HIV抗原的質粒結合傳遞時，在一系列動物模型中微粒表現(xiàn)出增加體液和T細胞應答(Singh等.，Proc.Natl.Acad.Sci.美國(2000)97811-816；Briones等.，Pharm.Res.(2001)18709-712；O′Hagan等.，J.Virol.(2000)59037-9043)。
已開展了大量研究來確定陽離子PLG微粒誘導提高了的針對吸附DNA的應答的作用機理。初步研究表明PLG/DNA，而非質粒DNA能介導樹狀細胞的體外轉染(Denis-Mize等.，Gene Ther.(2000)72105-2112)。此外，PLG/DNA保護DNA以防降解并增強肌肉和局部淋巴節(jié)中的基因表達(Singh等.，Proc.Natl.Acad.Sci.美國(2000)97811-816；Briones等.，Pharm.Res.(2001)18709-712；Denis-Mize等.，Gene Ther.(2000)7_2105-2112)。
經(jīng)管使用了這種顆粒傳遞系統(tǒng)，常規(guī)疫苗常不能提供充足的抗目標病原體的保護作用。因此，繼續(xù)需要含有安全且非毒性傳遞劑的抗HCV的有效免疫原性組合物。
發(fā)明概述本發(fā)明部分是基于以下的意外發(fā)現(xiàn)，即，使用吸附在陽離子微粒上的HCV E1E2809DNA比僅使用E1E2DNA產(chǎn)生了顯著較高的抗體滴度。陽離子微粒強烈吸附DNA、具有高載荷效率、保護吸附的DNA以防降解并增強了肌肉和局部淋巴節(jié)中的基因表達。此外，與僅單獨傳遞DNA相反，使用微粒傳遞的DNA在免疫接種后也能在注射部位募集顯著量的活化APC。所以，使用這種組合能提供安全且有效的方法來提高HCV E1E2抗原的免疫原性。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及基本上由藥學上可接受的賦型劑和吸附在陽離子微粒上的多核苷酸組成的組合物。該多核苷酸含有編碼丙型肝炎病毒(HCV)免疫原的編碼序列，該編碼序列操作性地連接于指導編碼序列在體內(nèi)轉錄和翻譯的控制元件。HCV免疫原是具有毗連氨基酸序列的免疫原性HCV E1E2復合物，該序列與圖2A-2C中192-809位所描述的毗連氨基酸序列具有至少80％的序列相同性，條件是該多核苷酸不編碼除HCV E1E2復合物以外的HCV免疫原。
在某些實施方案中，HCV E1E2復合物由圖2A-2C中192-809位所描述的氨基酸序列組成。
在其它的實施方案中，陽離子微粒由選自下組的聚合物形成聚(α-羥酸)、聚羥基丁酸、聚己內(nèi)酯、聚原酸酯和聚酐，例如選自聚(L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯)和聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)的聚(α-羥酸)。
在其它的實施方案中，本發(fā)明涉及基本上由以下物質組成的組合物(a)藥學上可接受的賦形劑，和(b)吸附到由聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)形成的陽離子微粒上的多核苷酸。該多核苷酸含有編碼丙型肝炎病毒(HCV)免疫原的編碼序列，該編碼序列操作性地連接于指導編碼序列的體內(nèi)轉錄和翻譯的控制元件，并且HCV免疫原是由圖2A-2C中192-809位所描述的氨基酸序列組成的HCV E1E2復合物，條件是該多核苷酸不編碼除HCV E1E2復合物以外的HCV免疫原。
在還有其它的實施方案中，本發(fā)明涉及刺激脊椎動物受試者的免疫應答的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的基本上由藥學上可接受的賦形劑和吸附到陽離子微粒上的多核苷酸組成的第一組合物。該多核苷酸含有編碼丙型肝炎病毒(HCV)免疫原的編碼序列，該免疫原操作性地連接于指導編碼序列的體內(nèi)轉錄和翻譯的控制元件。HCV免疫原是具有毗連氨基酸序列的免疫原性HCV E1E2復合物，而該序列與圖2A-2C中192-809位所描述的毗連氨基酸序列具有至少80％的序列相同性，條件是該多核苷酸不編碼除HCV E1E2復合物以外的HCV免疫原，其中HCV E1E2復合物在體內(nèi)表達來引發(fā)免疫應答。
在某些實施方案中，HCV E1E2復合物由圖2A-2C中192-809位所描述的氨基酸序列組成。
在其它實施方案中，陽離子微粒由選自下組的聚合物形成聚(α-羥酸)、聚羥基丁酸、聚己內(nèi)酯、聚原酸酯和聚酐，例如選自聚(L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯)和聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)的聚(α-羥酸)。
在另外的實施方案中，該方法還包括向受試者施用治療有效量的第二組合物，其中第二組合物含有免疫原性HCV多肽和藥學上可接受的賦形劑。
在某些實施方案中，第二組合物在第一組合物之后施用。此外，第二組合物中的免疫原性HCV多肽可是具有毗連氨基酸序列的免疫原性HCVE1E2復合物，而該序列與圖2A-2C中192-809位所描述的毗連氨基酸序列具有至少80％的序列相同性。在另一個實施方案中，HCV E1E2復合物由圖2A-2C中192-809位描述的氨基酸序列組成。
在另一個實施方案中，第二組合物還含有佐劑，例如能增強針對免疫原性HCV多肽的免疫應答的亞微米水包油乳劑。該亞微米水包油乳劑含有(i)可代謝的油，其中油的量占總體積的1％到12％，和(ii)乳化劑，其中乳化劑占0.01到1重量％(w/v)并含有聚氧乙烯失水山梨糖醇單酯、二酯或三酯和/或失水山梨糖醇單酯、二酯或三酯，其中油和乳化劑以具有油滴的水包油乳劑的形式存在，幾乎所有油滴的直徑約為100nm到小于1微米。
在某些實施方案中，亞微米水包油乳劑含有4-5％w/v角鯊烯、0.25-1.0％w/v聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯和/或0.25-1.0％失水山梨糖醇三油酸酯并任選含有N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷?；?-乙胺(MTP-PE)。
在其它的實施方案中，亞微米水包油乳劑基本上由約5體積％的角鯊烯，和一種或多種選自聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯和失水山梨糖醇三油酸酯的乳化劑組成，其中乳化劑的總量約為1重量％(w/v)。
在另外的實施方案中，一種或多種乳化劑是聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯和失水山梨糖醇三油酸酯并且聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯和失水山梨糖醇三油酸酯的總量約為1重量％(w/v)。
在還有另外的實施方案中，第二組合物還含有CpG寡核苷酸。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種刺激脊椎動物受試者的免疫應答的方法，該方法包括(a)向受試者施用基本上由吸附到陽離子微粒上的多核苷酸組成的治療有效量的第一組合物，該微粒由聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)形成，其中該多核苷酸含有編碼丙型肝炎病毒(HCV)免疫原的編碼序列，該編碼序列操作性地連接于指導編碼序列在體內(nèi)轉錄和翻譯的控制元件，并且HCV免疫原是由圖2A-2C中192-809位所描述的氨基酸序列組成的免疫原性HCV E1E2復合物，條件是該多核苷酸不編碼除HCV E1E2復合物以外的HCV免疫原，并且其中HCV E1E2復合物在體內(nèi)表達，和(b)向受試者施用治療有效量的第二組合物來引發(fā)受試者的免疫應答，其中該第二組合物含有(i)由圖2A-2C中192-809位所描述的氨基酸序列組成的免疫原性HCV E1E2復合物，(ii)一種佐劑，和(iii)藥學上可接受的賦形劑。
在某些實施方案中，佐劑是能增強針對第二組合物中的免疫原性HCVE1E2復合物的免疫應答的亞微米水包油乳劑。該亞微米水包油乳劑含有(i)可代謝的油，其中油的量占總體積的1％到12％，和(ii)一種乳化劑，其中乳化劑占0.01到1重量％(w/v)并含有聚氧乙烯失水山梨糖醇單酯、二酯或三酯和/或失水山梨糖醇單酯、二酯或三酯，其中油和乳化劑以具有油滴的水包油乳劑的形式存在，幾乎所有油滴的直徑約為100nm到小于1微米。
在其它實施方案中，亞微米水包油乳劑含有4-5％w/v角鯊烯、0.25-1.0％w/v聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯和/或0.25-1.0％失水山梨糖醇三油酸酯并任選含有N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷?；?-乙胺(MTP-PE)。
在其它實施方案中，亞微米水包油乳劑基本上由約5體積％的角鯊烯，和一種或多種選自聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯和失水山梨糖醇三油酸酯的乳化劑組成，其中乳化劑的總量約為1重量％(w/v)。
在另外的實施方案中，一種或多種乳化劑是聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯和失水山梨糖醇三油酸酯并且聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯和失水山梨糖醇三油酸酯的總量約為1重量％(w/v)。
在某些實施方案中，第二組合物還含有CpG寡核苷酸。
在還有另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種制備含有結合了藥學上可接受的賦形劑與吸附到陽離子微粒上的多核苷酸的組合物的方法。該多核苷酸含有編碼丙型肝炎病毒(HCV)免疫原的編碼序列，該編碼序列操作性地連接于指導編碼序列在體內(nèi)轉錄和翻譯的控制元件。HCV免疫原是具有毗連氨基酸序列的免疫原性HCV E1E2復合物，而該毗連氨基酸序列與圖2A-2C中192-809位所描述的毗連氨基酸序列具有至少80％的序列相同性，條件是該多核苷酸不編碼除HCV E1E2復合物以外的HCV免疫原。
鑒于本文的內(nèi)容，本發(fā)明主題的這些和其它實施方案對于本領域的技術人員是顯而易見的。
附圖簡述

圖1是描述HCV多蛋白的各種區(qū)域的HCV基因組的示意圖。
圖2A-2C(SEQ ID NOS1和2)顯示了HCV-1E1/E2/p7區(qū)域的核苷酸和對應的氨基酸序列。圖中的數(shù)字與全長的HCV-1多蛋白有關。該圖顯示了E1、E2和p7區(qū)域。
圖3顯示了單獨使用E1E2809質粒DNA或PLG/CTAB/E1E2809DNA(圖中以PLG/DNA表示)以10μg和100μg(N＝10，+/-SEM)免疫接種小鼠后在0周和4周的血清IgG滴度。
圖4顯示了用10μg的E1E2809質粒DNA、1μg和10μg的PLG/CTAB/E1E2809DNA或用MF59佐劑配制的2μg的E1E2E1E2809重組蛋白質(N＝10，+/-SEM)免疫接種小鼠后在0周和4周的血清IgG滴度。
圖5顯示了用10μg的E1E2809質粒DNA或PLG/CTAB/E1E2809DNA，或用MF59佐劑配制的5μg E1E2809重組蛋白質免疫接種小鼠后在0周、4周和8周的血清IgG滴度。此外，兩組小鼠在0和4周10μg用E1E2809質粒DNA或PLG/CTAB/E1E2809DNA免疫接種兩次，并在8周用MF59配制的5μg E1E2809重組蛋白質激發(fā)(N＝10，+/-SEM)。D＝E1E2809DNA 10μg；P＝5μg用MF59配制的E1E2809蛋白質。
發(fā)明詳述除非另有說明，實踐本發(fā)明將使用本領域技術人員能力范圍內(nèi)的化學、生物化學、重組DNA技術和免疫學的常規(guī)方法。參考文獻中完整地解釋了這些技術。參見，例如《基礎病毒學》(Fundamental Virology)，第二版，卷I和II(B.N.Fields和D.M.Knipe編)；《實驗免疫學手冊》(Handbook ofExperimental Immunology)，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell編.，BlackwellScientific Publications)；T.E.Creighton，“蛋白質結構與分子特性”(ProteinsStructures and Molecular Properties)，(W.H.Freeman和Company，1993)；A.L.Lehninger，《生物化學》(Biochemistry)(Worth Publishers，Inc.，最新增補)；Sambrook等.，《分子克隆實驗室手冊》(MolecularCloningLaboratory Manual)，(第二版，1989)；《酶學方法》(Methods InEnzymology)，(S.Colowick和N.Kaplan編.，Academic Press，Inc.)。
以下的氨基酸縮寫用于全文丙氨酸Ala(A) 精氨酸Arg(R)天門冬酰胺Asn(N) 天冬氨酸Asp(D)半胱氨酸Cys(C)谷氨酰胺Gln(Q)谷氨酸Glu(E) 甘氨酸Gly(G)組氨酸His(H) 異亮氨酸Ile(I)亮氨酸Leu(L) 賴氨酸Lys(K)甲硫氨酸Met(M)苯丙氨酸Phe(F)脯氨酸Pro(P) 絲氨酸Ser(S)蘇氨酸Thr(T) 色氨酸Trp(W)酪氨酸Tyr(Y) 纈氨酸Val(V)1.定義在本發(fā)明的描述中，采用以下術語并按以下所示定義。
必須注意的是，除非文中另有明確規(guī)定，用于本說明書和附加的權利要求中的單數(shù)形式“一”和“該”包括復數(shù)形式。所以，例如提到“一個E1E2多肽”包括兩個或多個這種多肽的混合物等。
術語“多肽”和“蛋白質”指氨基酸殘基的聚合物并且不限于最小長度的產(chǎn)物。所以，肽、寡肽、二聚體、多聚體等包括在該定義內(nèi)。全長的蛋白質和其片段均包括在該定義中。該術語也包括多肽的表達后修飾，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。此外，出于本發(fā)明的目的，只要蛋白質保留所需的活性，“多肽”指含有修飾的蛋白質(例如缺失、添加和取代(一般性質上是保守的))以及天然序列。這些修飾可是故意的，例如通過定點誘變；或是隨機的，例如通過生產(chǎn)蛋白質的宿主的突變或由于PCR擴增的錯誤。
“E1多肽”指得自HCV E1區(qū)域的分子。HCV-1的成熟的E1區(qū)域約始于該多蛋白的氨基酸192處并約連續(xù)至氨基酸383處(相對于全長的HCV-1多蛋白編號)。(參見，圖1和2A-2C。圖2A-2C的氨基酸192-383對應于SEQ ID NO2的氨基酸20-211位)。約從173到191的氨基酸(SEQ IDNO2的氨基酸1-19)用作E1的信號序列。所以，“E1多肽”指包括信號序列的前體E1蛋白或缺乏這種序列的成熟的E1多肽，或甚至是具有異源信號序列的E1多肽。E1多肽包括約存在于氨基酸360-383位的C-末端膜錨定序列(參見，國際公布號WO 96/04301，1996年2月15日發(fā)表)。如文中所定義的，一個E1多肽可(或不)包括C-末端錨定序列或其部分。
“E2多肽”指得自HCV E2區(qū)域的分子。HCV-1的成熟的E2區(qū)域約始于氨基酸383-385處(相對于全長的HCV-1多蛋白編號)。(參見，圖1和2A-2C。圖2A-2C的氨基酸383-385對應于SEQ ID NO2的氨基酸211-213位)。信號肽約始于該多蛋白的氨基酸364。所以，“E1多肽”指包括信號序列的前體E2蛋白或缺乏這種序列的成熟的E2多肽，甚至是具有異源信號序列的E2多肽。E2多肽包括約存在于氨基酸715-730位的C-末端膜錨定序列并約延伸遠至氨基酸殘基746(參見，Lin等.，J Virol.(1994)685063-5073)。如文中所定義的，一個E2多肽可包括(或不包括)C-末端錨定序列或其部分。此外，E2多肽也可包括緊接著E2的C末端的全部p7區(qū)域或其一部分。如圖1和2A-2C所示，該p7區(qū)域在747-809位發(fā)現(xiàn)(相對于全長的HCV-1多蛋白編號(SEQ ID NO2的氨基酸575-637位))。另外，已知存在多種的HCV E2(Spaete等.，Virol.(1992)188819-830；Selby等.，J.Virol.(1996)705177-5182；Grakoui等.，J.Virol.(1993)71385-1395；Tomei等.，J.Virol.(1993)674017-4026)。因此，出于本發(fā)明的目的，術語“E2”包括任何種類的E2，包括(但不限于)從E2的N末端缺失1-20個或更多氨基酸的種類，例如缺失1、2、3、4、5....10...15、16、17、18、19個等氨基酸。這種E2包括那些始于氨基酸387、氨基酸402、氨基酸403的等。
HCV-1的代表性E1和E2區(qū)域示于圖2A-2C和SEQ ID NO2。出于本發(fā)明的目的，按照HCV-1的基因組編碼的多蛋白的氨基酸編號定義E1和E2區(qū)域，將起始子甲硫氨酸指定為位置1。參見，例如Choo等.，Proc.Natl.Acad.Sci.美國(1991)882451-2455。然而，應該注意的是，文中使用的術語“E1多肽”或“E2多肽”不限于HCV-1序列。在這方面，其它HCV分離物中相應的E1或E2區(qū)域可以使序列進行最大比對的方式通過比對分離物的序列來方便地確定。這可使用弗吉尼亞大學生物化學系(AttnWilliam R.Pearson博士)的大量計算機軟件包中的任何一種進行。參見，Pearson等.，Proc.Natl.Acad Sci.美國(1988)852444-2448。
此外，文中定義的“E1多肽”或“E2多肽”不限于具有附圖所述的確切序列的多肽。實際上，HCV基因組在體內(nèi)是處于恒流狀態(tài)并含有在分離物之間表現(xiàn)出相對高程度可變性的幾個可變區(qū)域。已知這些毒株之間有大量的保守區(qū)域和可變區(qū)域，總體上，得自這些區(qū)域的表位的氨基酸序列具有高度的序列同源性，例如當比對兩條序列時有大于30％的序列同源性、較好的是大于40％、大于60％、甚至大于80-90％的同源性。很明顯，術語包括來自各種HCV毒株和分離物以及新鑒定的分離物和這些分離物的亞型(例如HCV1a、HCV1b等)中任一種的E1和E2多肽，所述分離物包括具有如Simmonds等(J.Gen.Virol.(1993)742391-2399)所述的HCV的6種亞型中任一種的分離物(例如毒株2、3、4等)。
所以，例如術語“E1”或“E2”多肽指來自如下所述的各種HCV毒株、以及類似物、突變蛋白和免疫原性片段中任一種的天然E1或E2序列。已知許多這些毒株的完整的基因型。參見，例如美國專利號6,150,087和GenBank登錄號AJ238800和AJ238799。
此外，術語“E1多肽”和“E2多肽”包括對天然序列修飾，例如內(nèi)部缺失、添加和取代(一般性質上是保守的)的蛋白質，例如基本上與親本序列同源的。這些修飾可是故意的，例如通過定點誘變；或是隨機的，例如通過天然產(chǎn)生的突變現(xiàn)象。所有這些修飾物均包括于本發(fā)明中，條件是修飾的E1和E2多肽的功能可實現(xiàn)其原有的目的。所以，例如，如果E1和/或E2多肽要用于疫苗組合物，修飾物必須未喪失免疫活性(即，引發(fā)對該多肽的體液或細胞的免疫應答的能力)。
“E1E2”復合物指含有上述的一種E1多肽和至少一種E2多肽的蛋白質。這種復合物也可包括緊接著E2的C末端的全部p7區(qū)域或其一部分。如圖1和2A-2C所示，該p7區(qū)域位在747-809位發(fā)現(xiàn)，相對于全長的HCV-1多蛋白編號(SEQ ID NO2的氨基酸575-637位)。文中將包括p7蛋白質的代表性E1E2復合物命名為“E1E2809”。
E1和E2在E1E2復合物中的結合方式是不重要的。E1和E2多肽可通過非共價相互作用(例如通過靜電)或通過共價鍵結合。例如，本發(fā)明的E1E2多肽可以包括上述免疫原性E1多肽和免疫原性E2多肽的融合蛋白的形式。該融合蛋白可從編碼E1E2嵌合體的多核苷酸表達。或者，E1E2復合物可通過將分別生產(chǎn)的E1和E2蛋白質簡單混合來自發(fā)形成。類似地，當E1和E2蛋白質共表達并分泌進培養(yǎng)基時，二者可自發(fā)形成復合物。所以，該術語包括E1和/或E2純化時自發(fā)形成的E1E2復合物(也稱為聚集體)。這種聚集體可包括與一個或多個E2單體結合的一個或多個E1單體。E1和E2單體的數(shù)目無需相同，條件是至少存在一個E1單體和一個E2單體。使用標準蛋白質檢測技術，例如聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫學技術(例如免疫沉淀)可方便地確定E1E2復合物的存在。
術語“類似物”和“突變蛋白”指參考分子的生物活性衍生物(例如E1E2809)或保留所需活性(例如文中所述在測定中的免疫反應性)的這種衍生物的片段。大體上，相對于天然分子，術語“類似物”指具有天然多肽序列和結構的化合物，該化合物具有一個或多個氨基酸添加、取代(一般性質上是保守性的)和/或缺失，條件是這些形式不破壞免疫原性活性。術語“突變蛋白”指具有一個或多個肽模擬物(“類肽”)的肽，例如國際公布號WO91/04282描述的那些。類似物或突變蛋白優(yōu)選至少具有和天然分子相同的免疫反應性。制備多肽類似物和突變蛋白的方法是本領域已知的并將描述于下文。
尤其優(yōu)選的類似物包括性質上是保守性的取代，即那些發(fā)生在與側鏈相關的氨基酸家族內(nèi)的取代。具體地，氨基酸一般分為4個家族(1)酸性氨基酸—天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性氨基酸—賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性氨基酸—丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不帶電的極性氨基酸—甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時分類為芳香族氨基酸。例如，可合理地預計以下獨立替換對生物活性不會有主要的影響即用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用絲氨酸取代蘇氨酸或用結構相關的氨基酸進行類似的保守性取代。例如，感興趣的多肽(如E1E2多肽)可包括約5-10個保守性或非保守性氨基酸取代，或者甚至約達15-25或50個保守性或非保守性氨基酸取代，或是5-50中的任一整數(shù)，條件是該分子的所需功能保持完整。參考本領域熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle圖表，本領域的技術人員可方便地確定感興趣的分子能耐受改變的區(qū)域“片段”指僅由完整的全長多肽序列和結構的一部分組成的多肽。該片段可包括天然多肽的C-末端缺失、N-末端缺失和/或內(nèi)部缺失。具體HCV蛋白質的“免疫原性片段”一般包括確定表位的全長分子的至少約5-10個毗連的氨基酸殘基，優(yōu)選至少約15-25個毗連的氨基酸殘基，最優(yōu)選全長分子的至少20-50或更多個毗連的氨基酸殘基，或5個氨基酸和全長序列之間的任一整數(shù)，條件是討論的片段保留引發(fā)文中所述免疫應答的能力。對已知HCV E1和E2免疫原性片段的描述參見，例如Chien等.，國際公布號WO 93/00365。
文中使用的術語“表位”指含有確定一條序列的至少約3-5個、優(yōu)選約5-10或15個、和約不超過500個氨基酸(或其中任一整數(shù))的序列，該序列通過其自身或作為較大序列的部分在施用的受試者中引發(fā)免疫應答。表位通常與響應于這種序列而產(chǎn)生的抗體結合。片段的長度沒有臨界上限，它幾乎可含有蛋白質序列的全長，或甚至是含有兩個或多個來自HCV多蛋白的表位的融合蛋白。本發(fā)明使用的表位不限于具有從其中衍生的親本蛋白質部分的確切序列的多肽。實際上，病毒基因組處于恒流狀態(tài)并含有在分離物之間表現(xiàn)出相對高程度可變性的幾個可變區(qū)域。所以術語“表位”包括與天然序列相同的序列，以及天然序列的修飾物，例如缺失、添加和取代(一般性質上是保守性的)。
包括表位的給定多肽的區(qū)域可使用本領域熟知的任何種表位作圖技術來鑒定。參見，例如《分子生物學方法中的表位作圖方案》(Epitope MappingProtocols in Methods in Molecular Biology)，66卷(Glenn E.Morris編，1996)，Humana Press，Totowa，新澤西。例如，線形的表位可通過以下方式確定，如在固體支持物上同時合成大量對應于蛋白質分子各部分的肽，再將依舊連接在支持物上的肽與抗體反應。這些技術是本領域已知的并描述于，例如美國專利號4,708,871；Geysen等，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.美國813998-4002；Geysen等，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.美國82178-182；Geysen等，(1986)Molec.Inamunol.23709-715。使用這些技術已鑒定大量的HCV表位。參見，例如Chien等.，“病毒性肝炎和肝病”(Viral Hepatitisand Live Disease)，(1994)320-324頁和以下的其它文獻。類似地，可通過確定氨基酸的空間構象(例如通過X-射線晶體學和二維核磁共振)來方便地鑒定構象表位。參見，例如《表位作圖方案》(Epitope Mapping Protocols)，同上。使用標準的抗原性和親水性圖表也可鑒定蛋白質的抗原區(qū)域，例如可用得自Oxford Molecular Group的Omiga 1.0版軟件程序計算那些區(qū)域。該計算機程序使用Hopp/Woods方法(Hopp等.，Proc.Natl.Acad.Sci美國(1981)783824-3828)來確定抗原性分布以及Kyte-Doolittle技術(Kyte等.，J.Mol.Biol.(1982)157105-132)用于親水性圖表。
文中使用的術語“構象表位”指全長蛋白質的一部分，或其類似物或突變蛋白，該表位具有編碼全長天然蛋白質內(nèi)的表位的天然氨基酸序列的結構特征。天然結構特征包括(但不限于)糖基化和三維結構。表位確定序列的長度可有寬的變化，因為據(jù)信這些表位通過抗原的三維形狀(例如折疊)形成。所以，確定表位的氨基酸數(shù)量可相對較少，但沿著分子的長度(或者甚至在二聚體的情況中可以位于不同的分子上)廣泛分散，通過折疊產(chǎn)生正確的表位構象。確定表位的殘基之間的抗原的部分對于表位的構象結構不是關鍵的。例如，只要保留對表位構象關鍵的序列(例如涉及二硫鍵、糖基化位點的半胱氨酸等)，這些間插序列的缺失或取代可能不影響構象表位。
使用上述方法可方便地鑒定構象表位。此外，可通過使用抗體篩選感興趣的抗原(對構象表位的多克隆血清或單克隆)以及比較其對僅保留線形表位(如果有的話)的變性抗原的表位的反應性來方便地確定給定多肽中構象抗原的存在或不存在。在這種使用多克隆抗體的篩選中，首先用變性抗原吸收多克隆血清并觀察其是否保留對感興趣抗原的抗體是有利的。得自E1和E2區(qū)域的構象表位描述于，例如國際公布號WO 94/01778。
對HCV抗原或組合物的“免疫應答”是受試者中產(chǎn)生對存在于感興趣的組合物中分子的體液和/或細胞免疫應答。出于本發(fā)明的目的，“體液免疫應答”指由抗體分子介導的免疫應答，而“細胞免疫應答”指由T淋巴細胞和/或其它白細胞介導的免疫應答。細胞免疫的一個重要的方面包括溶細胞性T-細胞(“CLT”)介導的抗原特異性應答。CTL具有肽抗原特異性，該肽抗原與由主要的組織相容性復合物(MHC)編碼并表達在細胞表面的蛋白質結合存在。CTL輔助誘導和促使胞內(nèi)微生物的胞內(nèi)破壞或者被這種微生物感染的細胞裂解。細胞免疫的另一方面包括輔助T細胞介導的抗原特異性應答。輔助T-細胞起到幫助刺激功能的作用并將非特異性效應細胞的活性集中于針對在其表面展示與MHC分子結合的肽抗原的細胞?！凹毎庖邞稹币仓府a(chǎn)生了由激活的T-細胞和/或其它白細胞(包括那些衍生自CD4+和CD8+T-細胞)產(chǎn)生的細胞因子、趨化因子和其它這種分子。引發(fā)細胞免疫應答的組合物或疫苗可通過與細胞表面的MHC分子結合的抗原呈遞來使脊椎動物受試者致敏。細胞介導的免疫應答定向于或接近在其表面呈遞抗原的細胞。此外，可產(chǎn)生抗原特異性的T-淋巴細胞來允許進一步保護免疫的宿主。具體抗原刺激細胞介導的免疫應答的能力可通過各種實驗來確定，例如通過淋巴組織增殖(淋巴細胞激活)實驗、CTL細胞毒性細胞測定或通過測定對致敏受試者中的抗原特異性淋巴細胞來確定。這些測定是本領域熟知的。參見，例如Erickson等.，J.Immunol.(1993)1514189-4199；Doe等.，Eur.J.Immuriol.(1994)242369-2376。
所以，文中使用的免疫應答可是能刺激CTL產(chǎn)生，和/或輔助T-細胞產(chǎn)生或激活的免疫應答。感興趣的抗原也可引發(fā)抗體介導的免疫應答，包括，例如結合中和(NOB)抗體。NOB抗體應答的存在可通過，例如Rosa等(Proc.Natl.Acad.Sci.美國(1996)931759)描述的技術方便地確定。因此，免疫應答可包括一個或多個以下作用通過B-細胞產(chǎn)生抗體；和/或激活抑制性T-細胞和/或特異性定向于組合物中存在的一種抗原或多種抗原或感興趣疫苗的γδT-細胞。這些應答可用于中和感染性，和/或介導抗體-補體，或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)來為免疫的宿主提供保護或緩解癥狀。這種應答可用本領域熟知的標準免疫測定與中和測定來確定。
當組合物能引發(fā)大于不用陽離子微粒傳遞的等量E1E2 DNA引發(fā)的免疫應答時，HCV E1E2 DNA組合物的一種成分(例如陽離子微粒)增強了對由組合物中DNA產(chǎn)生的HCV E1E2多肽的免疫應答。這種增強的免疫原性可通過將E1E2 DNA與或不與額外的成分一起施用，并使用本領域熟知的標準測定來比較兩種情況產(chǎn)生的抗體滴度或細胞免疫應答，例如放射免疫測定、ELISA、淋巴組織增殖測定等。
當用于指一條多肽時，“分離的”意味著所指的分子是獨立的且脫離于具有天然發(fā)現(xiàn)的分子的整個生物體，或者該分子是存在于基本上無其它相同類型生物大分子的環(huán)境中。關于多核苷酸的術語“分離的”指一種缺乏天然與其結合的整個或部分序列的核酸分子，或天然存在但具有與其結合的異源序列的序列，或從染色體分離的分子。
“等價抗原決定簇”指來自HCV不同亞種或毒株(例如來自毒株1、2、3等)，由于序列變異抗原決定簇無需相同的HCV毒株的抗原決定簇，但哪種發(fā)生在HCV序列的等價位置尚未知。大體上，等價抗原決定簇的氨基酸序列具有高度的序列同源性，例如當兩條序列比對時，大于30％的氨基酸序列同源性，通常大于40％，例如大于60％、甚至大于80-90％的同源性。
“同源性”指兩條多核苷酸或兩條多肽部分之間的相同性百分比。當兩條DNA或兩條多肽序列在確定的分子長度上表現(xiàn)出至少約50％、優(yōu)選至少約75％、更優(yōu)選至少約80％-85％、再優(yōu)選至少約90％、最優(yōu)選約95％-98％的序列相同性，則這些序列互相是“基本上同源的”。
總體上，“相同性”指兩條多核苷酸或多肽序列各自的精確的核苷酸-對-核苷酸或氨基酸-對-氨基酸的對應性。相同性百分比可通過直接比較兩個分子之間的序列信息來確定比對序列，記下兩條比對序列之間的確切匹配數(shù)目，除以較短序列的長度并將結果乘以100?？墒褂梅奖憧捎玫挠嬎銠C程序來幫助分析，例如Dayhoff，M.O.的《蛋白質序列和結構圖集》(M.O.Dayhoff編.，5增刊3353-358，National biomedical ResearchFoundation，華盛頓，哥倫比亞特區(qū))中的ALIGN，該程序采用了Smith和Waterman(Advances in Appl.Math.2482-489，1981)的用于肽分析的局部同源性算法。確定核苷酸序列相同性的程序可用威斯康星序列分析包(Wisconsin Sequence Analysis Package)，第八版(得自Genetics ComputerGroup，Madison，WI)，例如BESTFIT、FASTA和GAP程序，這些程序也依賴于Smith和Waterman算法。這些程序可方便地使用生產(chǎn)商推薦的和以上威斯康星序列分析包中描述的默認參數(shù)。例如，具體核苷酸序列與參考序列的相同性百分比可使用默認計分表和6個核苷酸位置的間隔罰分的Smith和Waterman同源性算法來確定。
本發(fā)明中建立相同性百分比的另一個方法是使用John F.Collins和Shane S.Sturrok開發(fā)的、愛丁堡大學版權所有、IntelliGenetics，Inc.(MountainView，CA)經(jīng)銷的MPSRCH程序包。這套程序包可使用Smith-Waterman算法，其中計分表使用默認參數(shù)(例如，間隔開放罰12分、間隔延伸罰1分、一個間隔罰6分)。產(chǎn)生“匹配值”的數(shù)據(jù)反映了“序列相同性”。其它計算相同性或類似性百分比的使用默認參數(shù)的合適程序一般是本領域公知的，例如另一個比對程序是BLAST。例如，使用以下默認參數(shù)的BLASTN和BLASTP是可用的遺傳密碼＝標準；過濾器＝無；鏈＝兩條；截斷值＝60；預期值＝10；矩陣＝BLOSUM62；描述＝50條序列；分類標準＝高分；數(shù)據(jù)庫＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻譯+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。這些程序的細節(jié)參見以下因特網(wǎng)的網(wǎng)址http//www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。
此外，可通過在同源區(qū)域之間形成穩(wěn)定雙螺旋的條件下使多核苷酸雜交，然后用單鏈特異性核酶消化并確定消化片段的大小來確定同源性。如該具體系統(tǒng)確定的，基本上同源的DNA序列可在，例如嚴謹條件下進行的Southern雜交實驗中鑒定。確定合適的雜交條件在本領域技術人員的能力范圍內(nèi)。參見，例如Sambrook等.，同上；《DNA克隆》(DNA Cloning)，同上；《核酸雜交》(Nucleic Acid Hybridization)，同上。
術語“簡并變體”指在其核酸序列中含有變化的多核苷酸，該多核苷酸編碼和由簡并變體衍生的多核苷酸編碼的多肽具有相同氨基酸序列的多肽。所以，EIE2809DNA的一種簡并變體是具有一個或多個堿基異于其衍生自的DNA序列的分子，但該變體編碼相同的E1E2809氨基酸序列。
“編碼序列”或“編碼”選擇的多肽的序列是指當將其置于合適的調(diào)控序列控制下時，可在體外或體內(nèi)轉錄(在DNA的情況中)并翻譯(在mRNA的情況中)為多肽的核酸分子。編碼序列的界限由位于5’(氨基)末端的起始密碼子和位于3’(羧基)末端的翻譯終止密碼子來確定。轉錄終止序列可位于編碼序列的3’端。
“核酸”分子或“多核苷酸”包括雙鏈和單鏈序列并指(但不限于)病毒的cDNA、原核或真核mRNA、病毒或原核DNA的基因組DNA序列(例如，DNA病毒和逆轉錄病毒)和合成的DNA序列。該術語也包括含有DNA和RNA的已知堿基類似物的序列。
“HCV多核苷酸”是編碼上述HCV多肽的多核苷酸。
“操作性連接”指元件的排列方式，其中描述的成分配置成可行使其所需的功能的方式。所以，當存在合適的轉錄因子等時，操作性連接于編碼序列的給定的啟動子能有效地表達編碼序列。啟動子無需和編碼序列相連，只要它能指導其表達。所以，例如與轉錄的內(nèi)含子一樣，啟動子序列和編碼序列之間可存在不翻譯卻轉錄的間插序列，并且該啟動子序列仍可認為是“操作性連接”于編碼序列。
文中用來描述核酸分子的術語“重組”指一種基因組、cDNA、病毒、半合成或合成來源的多核苷酸，由于其起點或操縱序列不與其天然結合的多核苷酸的全部或一部分結合。用在關于蛋白質或多肽的術語“重組”指通過重組多核苷酸表達產(chǎn)生的多肽?？傮w上如下所述，感興趣的基因被克隆，然后在轉化的生物體中表達。宿主生物體在表達條件下表達外源基因來生產(chǎn)蛋白質。
“控制元件”指有助于和其相連的編碼序列表達的多核苷酸序列。該術語包括啟動子、轉錄終止序列、上游調(diào)節(jié)區(qū)域、聚腺苷酸化信號、非翻譯區(qū)(包括5′-UTR和3′-UTR并且當合適時也包括前導序列和增強子)，這些元件共同地提供宿主細胞中編碼序列的轉錄和翻譯。
文中使用的“啟動子”是能結合宿主細胞中的RNA聚合酶的DNA調(diào)節(jié)區(qū)域并且能啟動與其操作性相連的下游(3’方向)編碼序列的轉錄。出于本發(fā)明的目的，啟動子序列包括啟動感興趣基因在背景之上可檢測水平的轉錄必需的最低數(shù)量的堿基或元件。啟動子序列中是轉錄起始位點以及負責RNA聚合酶結合的蛋白質結合區(qū)域(共有序列)。真核啟動子經(jīng)常(但不總是)含有“TATA”盒與“CAT”盒。
當RNA聚合酶與啟動子序列結合并將編碼序列轉錄為mRNA，然后該mRNA翻譯為編碼序列所編碼的多肽時，控制序列“指導”細胞中編碼序列的轉錄。
“表達盒”或“表達構建物”指能指導感興趣的序列或基因表達的組件。表達盒包括上述的控制元件，例如操作性連接于感興趣的序列或基因的啟動子(以便指導轉錄)并經(jīng)常包括聚腺苷酸化序列。在本發(fā)明的某些實施方案中，文中所述的表達盒可包含于質粒構建物中。除了表達盒的成分，該質粒構建物也包括一個或多個可選擇標記、使得質粒構建物可以單鏈DNA存在的信號(例如，復制的M13起點)、至少一個多克隆位點和一個哺乳動物復制起點(例如，SV40或腺病毒復制起點)。
文中使用的術語“轉化”指將外源多核苷酸插入宿主細胞，而不管插入使用的方法例如，直接攝取轉化、轉染、感染等。以下是具體的轉染方法。外源多核苷酸可維持為非整合性載體(例如一種附加體)，或者可整合進宿主基因組。
術語“核酸免疫接種”指為了在體內(nèi)表達免疫原而將編碼一種或多種免疫原(例如E1E2)的核酸分子引入宿主細胞。該核酸分子可直接引入受試對象，例如通過注射、吸入、口服、鼻內(nèi)和粘膜施用等，或者可通過先體外后體內(nèi)的方式引入從宿主中取出的細胞。在后一種情況中，轉化的細胞重新引入受試者，這樣可增加針對核酸分子編碼的免疫原的免疫應答。
文中使用的免疫原性組合物的術語“有效量”或“藥學有效量”指無毒但足夠量的組合物來提供所需的應答(例如免疫應答)和任選的相應療效。確切需要的量在受試者之間不等，這取決于種類、年齡和受試者的總體情況、有待治療的病癥的嚴重性、具體的感興趣的大分子、施用方式等。在任何個體情況中的合適的“有效”量可由本領域的普通技術人員使用常規(guī)實驗來確定。
術語“脊椎動物受試者”指脊索動物亞門中的任一員，包括(但不限于)人和其它靈長類動物，包括非人靈長類動物，例如黑猩猩和其它猿和猴類；農(nóng)畜，例如牛、綿羊、豬、山羊和馬；家養(yǎng)哺乳動物，例如狗和貓；實驗室動物，包括嚙齒類動物，例如小鼠、大鼠和豚鼠；鳥類，包括家養(yǎng)、野生和狩獵野禽，例如小雞、火雞和其它家禽的鳥類、鴨、鵝等。該術語不指明具體的年齡。所以，包括了成年的和新生的個體。既然所有這些脊椎動物的免疫系統(tǒng)以相似的方式起作用，文中描述的本發(fā)明可用于上述任一種脊椎動物。
文中使用的術語“治療”指(1)防止感染或再感染(預防)，或(2)感興趣疾病癥狀的減少或消除(治療)。
2.實施本發(fā)明的方式在詳細描述本發(fā)明之前，要理解的是，本發(fā)明不受具體制劑或方法參數(shù)的限制，因為這些當然是能變化的。也要理解的是，文中使用術語的目的僅是描述本發(fā)明具體的實施方案，而非限制。
雖然有許多與文中描述的相似或等價的方法或材料可用于實踐本發(fā)明，優(yōu)選的材料和方法仍是文中所描述的。
本發(fā)明的核心是發(fā)現(xiàn)與使用非吸附的質粒E1E2 DNA相比，吸附到陽離子微粒上的編碼HCV E1E2包膜蛋白質的質粒DNA能引發(fā)顯著提高的抗體應答。此外，與使用非吸附的DNA來產(chǎn)生可檢測抗體需要的劑量相比，吸附的DNA以較低數(shù)量級的劑量來誘導可檢測應答。另外，由吸附的DNA誘導的抗體應答與施用E1E2蛋白質達到的應答相當，而傳遞非吸附的E1E2DNA僅誘導可檢測的應答。使用重組蛋白質的加強免疫后用吸附到陽離子微粒上的E1E2 DNA比單獨使用質粒DNA更有效地引發(fā)強有力的應答。此外，以下實施例證實了吸附的E1E2 DNA產(chǎn)生細胞免疫應答的能力。
所以，如以下更詳細描述的，最初向受試者施用吸附到陽離子微粒的編碼E1E2809復合物的DNA。然后可用含有編碼E1E2復合物的DNA的DNA組合物和/或含有E1E2蛋白質復合物的蛋白質組合物來激發(fā)受試者。如下所述，只要產(chǎn)生免疫應答，用于激發(fā)的E1E2復合物可是E1E2809或其它E1E2蛋白質。
此外，以上組合物可單獨使用或與其它組合物聯(lián)合使用，例如含有其它HCV蛋白質的組合物、含有編碼其它HCV蛋白質的DNA的組合物以及含有輔助物質的組合物。如果與其它組合物聯(lián)合使用，這種組合物能在E1E2組合物之前施用、同時施用或在其后施用。
為進一步理解本發(fā)明，以下將提供關于在受試者方法中使用的E1E2DNA和蛋白質組合物、陽離子微粒和其它組合物的更詳細討論。
E1E2多肽和多核苷酸E1E2復合物含有通過非共價或共價相互作用連接的E1和E2多肽。如上所解釋，HCV E1多肽是糖蛋白并從約氨基酸192延伸至氨基酸383(相對于HCV的多蛋白編號)。參見Choo等.，Proc.Natl.Acad.Sci.美國(1991)882451-2455。約173到約191的氨基酸代表了E1的信號序列。HCVE2多肽也是糖蛋白并從約氨基酸383或384延伸至氨基酸746。E2的信號肽始于該多蛋白的約氨基酸364。所以，文中使用的術語“全長”E1或“非截短”E1指至少包括HCV多蛋白的氨基酸192-383的多肽(相對于HCV-1編號)。文中使用的關于E2的術語“全長”或“非截短”指至少包括HCV多蛋白的氨基酸383或384至氨基酸746的多肽(相對于HCV-1編號)。如從本文中會明白，本發(fā)明使用的E2多肽可包括來自P7區(qū)域的其它氨基酸，例如氨基酸747-809。
E2以多種類存在(Spaete等.，Virol.(1992)188819-830；Selby等.，J.Virol.(1996)705177-5182；Grakoui等.，J.Virol.(1993)671385-1395；Tomei等.，J.Virol.(1993).4017-4026)并且剪切和蛋白水解發(fā)生在E1和E2多肽的N-末端和C-末端。所以，本發(fā)明使用的E2多肽可至少含有HCV多蛋白的氨基酸405-661，例如，400、401、402...到661，如383或384-661、383或384-715、383或384-746、383或384-749、383或384-809、或383或384到661-809之間的任一C-末端(相對于全長HCV-1多蛋白編號)。類似的，本發(fā)明使用的優(yōu)選的E1多肽可含有HCV多蛋白的氨基酸192-326、192-330、192-333、192-360、192-363、192-383或192至326-383之間的任一C-末端。
E1E2復合物也可由含有表位的E1和E2的免疫原性片段組成。例如，E1多肽的片段可含有從約5到幾乎該分子全長的氨基酸，例如6、10、25、50、75、100、125、150、175、185或多個E1多肽的氨基酸，或是所述數(shù)字之間的任一整數(shù)。類似地，E2多肽的片段可含有E2多肽的6、10、25、50、75、100、150、200、250、300或350個氨基酸，或是所述數(shù)字之間的任一整數(shù)。E1和E2多肽可來自相同或不同的HCV毒株。
例如，E2多肽中可包括得自E2高變區(qū)(如跨越氨基酸384-410或390-410的區(qū)域)的表位?？梢隕2序列的尤其有效的E2表位是包括衍生自該區(qū)域的共有序列的表位，例如共有序列Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn，該序列代表了1型HCV基因組的氨基酸390-410的共有序列。其它的E1和E2表位是己知的并描述于，例如Chien等.，國際公布號WO 93/00365。
此外，復合物的E1和E2多肽可缺少全部或一部分跨膜結構域。膜錨定序列的功能是將多肽與內(nèi)質網(wǎng)相連。這種多肽一般能分泌進培養(yǎng)表達蛋白質的生物體的生長培養(yǎng)基。然而，如國際公布號WO 98/50556所述，這種多肽也可在胞內(nèi)獲得。分泌進生長培養(yǎng)基的多肽可用多種檢測技術方便地測定，這些技術包括，例如聚丙烯酰胺凝膠電泳等和免疫學技術，如1996年2月15日公布的國際公布號WO 96/04301描述的免疫沉淀測定。就E1而言，約終止于氨基酸370位和更高(基于HCV-1E1的編號)的多肽一般被ER保留，因此不分泌進生長培養(yǎng)基。就E2而言，約終止于氨基酸位置731和更高(也基于HCV E2的編號)的多肽一般被ER保留而不分泌(參見，例如國際公布號WO 96/04301，1996年2月15日公布)。應該注意的是，這些氨基酸位置不是絕對的并在一定程度上可變。所以，本發(fā)明考慮了保留跨膜結合區(qū)域的E1和E2多肽的用途，并且本發(fā)明包括缺乏全部或一部分跨膜結合區(qū)域的多肽，包括約終止于氨基酸369和更低的E1多肽以及約終止于氨基酸730和更低的E2多肽。此外，C-末端截短可超出跨膜區(qū)域向N-末端延伸。所以，本發(fā)明也包括例如，發(fā)生在低于如360位的E1截短和發(fā)生在低于如715位的E2截短。所有這些需截短的E1和E2多肽保留實現(xiàn)其所需目的的功能。然而，尤其優(yōu)選的截短E1構建物是未延伸出約氨基酸300的那些構建物。最優(yōu)選的是終止于360位的那些構建物。優(yōu)選的截短E2構建物是C-末端截短未延伸出約氨基酸715位的那些構建物。尤其優(yōu)選的E2截短物是在任何氨基酸715-730(例如725)之后截短的那些分子。如果使用截短分子，優(yōu)選使用均截短的E1和E2分子。
E1和E2多肽及其復合物也可作為脫唾液酸糖蛋白存在。這種脫唾液酸糖蛋白可用本領域已知的方法生產(chǎn)，例如使用末端糖基化位點被封閉的細胞。當在這種細胞中表達這些蛋白質并通過GNA凝集素親和層析分離時，E1和E2蛋白自發(fā)地聚集。生產(chǎn)這些E1E2聚集體的詳細方法描述于，例如美國專利號6,074,852。
此外，由于上述的剪切和蛋白酶解切割作用，E1E2復合物可含有異源的分子混合物。所以，包括E1E2復合物的組合物可含有多種E1E2，例如終止于氨基酸746的E1E2(E1E2746)、終止于氨基酸809的E1E2(E1E2809)或上述的任何其它各種E1和E2分子，如具有1-20個氨基酸的N-末端截短的E2分子(如始于氨基酸387、氨基酸402、氨基酸403等的E2種類)。
應該注意的是，為了方便起見，E1和E2區(qū)域一般按照相對于HCV-1a基因組編碼的多蛋白的所述氨基酸編號來定義如Choo等((1991)Proc.Natl.Acad.Sci.美國882451)，起始子甲硫氨酸指定為位置1。然而，本發(fā)明使用的多肽不限于衍生自HCV-1a序列的那些。任何HCV毒株或分離物可作為提供本發(fā)明使用的免疫原性序列的基礎。在這一方面，另一個HCV分離物的對應區(qū)域可通過對比兩個分離物的序列來方便地確定，該對比以使序列進行最大排序的方式進行。
各種HCV毒株和分離物是本領域已知的，這些毒株和分離物通過核苷酸和氨基酸序列的改變而互相區(qū)別。例如，描述于Kubo等，(1989)Japan.Nucl.Acids Res.1710367-10372；Takeuchi等，(1990)Gene91287-291；Takeuchi等，(1990)J.Gen.Virol.713027-3033和Takeuchi等，(1990)Nucl.Acids Res.184626的分離物HCV J1.1。兩個獨立分離物，HCV-J和BK的完全編碼序列分別描述于Kato等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.美國879524-9528和Takamizawa等，(1991)J.Virol.651105-1113。HCV-1分離物描述于Choo等，(1990)Brit.Med.Bull.46423-441；Choo等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.美國882451-2455和Han等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.美國881711-1715。HCV分離物HC-J1和HC-J4描述于Okamoto等，(1991)Japan J.Exp.Med.60167-177。HCV分離物HCT 18、HCT 23、Th、HCT 27、EC1和EC10描述于Weiner等，(1991)Virol.180842-848。HCV分離物Pt-1、HCV-K1和HCV-K2描述于Enomoto等，(1990)Biochem.Biophys.Res.Commun.1701021-1025。HCV分離物A、C、D和E描述于Tsukiyama-Kohara等，(1991)Virus Genes5243-254。用于本發(fā)明的組合物和方法中的HCV E1E2多核苷酸和多肽可得自任何上述的HCV毒株或分離自感染患者的組織或體液的新發(fā)現(xiàn)分離物。
如果需要作為蛋白質傳遞E1E2復合物(例如，激發(fā)免疫應答)，這種E1E2復合物可作為融合蛋白或通過用例如編碼感興趣的E1和E2多肽的構建物共轉染宿主細胞來方便地重組制備。共轉染可以反式或順式的方式完成，即通過使用獨立的載體或通過使用攜帶E1和E2基因的單一載體進行。如果使用單一載體進行共轉染，兩種基因可被一套控制元件驅動，或者基因可存在于獨立的表達盒內(nèi)的載體上，由獨立的控制元件驅動。表達后，E1和E2蛋白會自發(fā)地結合?；蛘呖赏ㄟ^將獨立的蛋白質混合到一起以形成復合物，這些蛋白質可獨立產(chǎn)生、處于純化或半純化的形式，或者如果蛋白質是分泌的，甚至可混合宿主細胞在其中表達蛋白質的培養(yǎng)基。最后，本發(fā)明的E1E2復合物可作為融合蛋白表達，其中E1的所需部分與E2的所需部分融合。
從分泌進培養(yǎng)基的全長、截短的E1和E2蛋白質以及胞內(nèi)產(chǎn)生的截短的蛋白質制備E1E2復合物的方法是本領域已知的。例如，如美國專利號6,121,020；Ralston等，J Virol.(1993)676753-6761，Grakoui等，J.Virol.(1993)671385-1395和Lanford等，Virology(1993)197225-235所述，這種復合物可重組制備。
所以，可使用標準的分子生物學技術來制備編碼本發(fā)明使用的HCV E1和E2多肽的多核苷酸。例如，編碼上述分子的多核苷酸序列可使用重組方法得到，如通過從表達該基因的細胞中篩選cDNA和基因組文庫或從已知含有相同基因的載體中獲得該基因。此外，可使用本領域所述的技術直接從病毒核酸分子分離所需的基因，例如Houghton等，美國專利號5,350,671所述的。感興趣的基因也可通過合成而非克隆來制備?？捎煤线m的用于特定序列的密碼子來設計分子。然后從通過標準方法制備的重疊寡核苷酸裝配完整序列并裝配成完整的編碼序列。參見，例如Edge(1981)Nature292756；Nambair等，(1984)Science2231299和Jay等，(1984)J.Biol.Chem.2596311。
所以，具體的核苷酸序列可從含有所需序列的載體獲得或可使用本領域已知的各種寡核苷酸合成技術全合成或部分合成來獲得，例如在合適的地方使用定點誘變和聚合酶鏈式反應(PCR)技術。參見，例如Sambrook，同上。尤其是，一種獲得編碼所需序列的核苷酸序列的方法是將互補的多套重疊的合成寡核苷酸退火，這些寡核苷酸在常規(guī)的自動多核苷酸合成儀中制備，然后用合適的DNA連接酶連接并通過PCR擴增連接的核苷酸序列。參見，例如Jayaraman等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.美國884084-4088。此外，寡核苷酸定向合成(Jones等，(1986)Nature5475-82)、預存在的核苷酸區(qū)域的寡核苷酸定向誘變(Riechmam等，(1988)Nature332323-327和Verhoeyen等，(1988)Science2391534-1536)和使用T4 DNA聚合酶的缺口寡核苷酸的酶補平(Queen等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.美國8610029-10033)可用于提供具有抗原結合能力和免疫原性改變或增強的分子。
一旦制備或分離了編碼序列，這種序列可克隆進任何合適的載體或復制子中。本領域的技術人員已知許多克隆載體，并且選擇合適的克隆載體僅是個選擇的問題。合適的載體包括(但不限于)質粒、噬菌體、轉座子、粘粒、染色體或病毒，當這些載體與合適的控制元件結合時能復制。
然后將編碼序列置于取決于用來表達的系統(tǒng)的合適控制元件的控制下。所以，編碼序列可受啟動子、核糖體結合位點(用于細菌表達)和任選的操縱子的控制，從而使感興趣的DNA序列被合適的轉化子轉錄為RNA。編碼序列可含有或不含有信號肽或前導序列，這些可在翻譯后加工過程中被宿主除去。參見，例如美國專利號4,431,739；4,425,437；4,338,397。
除了控制序列，可能需要加入用于調(diào)節(jié)與宿主細胞生長有關的序列表達的調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列是本領域的技術人員已知的，其例子包括響應于化學或物理刺激(包括調(diào)節(jié)化合物的存在)來開啟或關閉基因表達的那些序列。其它類型的調(diào)節(jié)元件也可存在于載體中。例如，本發(fā)明可使用增強子元件來增加構建物的表達水平。其例子包括SV40早期基因增強子(Dijkema等，(1985)EMBO J.4761)、衍生自Rous肉瘤病毒的長末端重復序列(LTR)的增強子/啟動子(Gorman等，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.美國796777)和衍生自人CMV的元件(Boshart等，(1985)Cell41521)，例如包括在CMV內(nèi)含子A序列的元件(美國專利號5,688,688)。表達盒還可包括在合適的宿主細胞中自主復制的復制起點、一個或多個選擇性標記、一個或多個限制性位點、潛在的高拷貝數(shù)和一個強的啟動子。
構建病毒載體以便將特定編碼序列與合適的調(diào)節(jié)序列放置于載體中，編碼序列相對控制序列的定位和定向要使編碼序列在控制序列的“控制”下轉錄(即，在控制序列上的結合到DNA分子的RNA聚合酶轉錄編碼序列)。可能需要對編碼感興趣分子的序列進行修飾來實現(xiàn)此目的。例如，在一些情況中，需要修飾序列使之在合適的方向與控制序列結合；即維持讀框?？刂菩蛄泻推渌{(diào)節(jié)序列在插入載體之前可與編碼序列相連。編碼序列可直接克隆插入已經(jīng)含有控制序列和合適的限制性位點的表達載體中。
如上所解釋的，也需要制備感興趣多肽的突變體或類似物。用于主題組合物中的HCV多肽的突變體或類似物通過以下方式制備刪除編碼感興趣多肽的序列的一部分、插入一條序列、和/或取代序列中的一個或多個核苷酸。修飾核苷酸序列的技術為本領域的技術人員所熟知，例如定點誘變等。參見，例如Sambrook等，同上；Kunkel，T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.美國(1985)82448；Geisselsoder等，(1987)BioTechniques5786；Zoller和Smith(1983)Methods Enzymol.100468；Dalbie-McFarland等，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.美國796409。
該分子可在各種系統(tǒng)中表達，包括昆蟲、哺乳動物、細菌、病毒和酵母表達系統(tǒng)，所有這些均是本領域熟知的。例如，昆蟲細胞表達系統(tǒng)(例如桿狀病毒系統(tǒng))是本領域的技術人員熟知的并描述于，如Summers和Smith，Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)。其中，用于桿狀病毒/昆蟲表達系統(tǒng)的材料與方法以來自Invitrogen(San Diego CA)的試劑盒(“MaxBac”試劑盒)的形式市售可得。類似地，細菌和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)是本領域熟知的并描述于，例如Sambrook等，同上。酵母表達系統(tǒng)也是本領域已知的并描述于，例如《酵母遺傳工程》(Yeast GeneticEngineering)(Barr等編，1989)Butterworths，London。
與上述系統(tǒng)一起使用的大量合適宿主細胞也是已知的。例如，哺乳動物細胞系是本領域已知的并且包括來自美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)的無限增殖細胞系，例如(但不限于)中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人胚胎腎細胞、人肝細胞癌細胞(例如，HeP G2)、Madin-Darby牛腎(“MDBK”)細胞、以及其它細胞。類似地，發(fā)現(xiàn)細菌宿主可與這些表達構建物一起使用，例如大腸桿菌、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)和鏈球菌(Streptococcus spp)。其中，本發(fā)明中有用的酵母宿主包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、季也蒙畢赤酵母(Pichia guillerimondii)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶羅威亞酵母(Yarrowia lipolytica)。其中，與桿狀病毒表達載體一起使用的昆蟲細胞包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、加州苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalfiornica)、家蠶(Bombyx mori)、黑腹果蠅(Dosophila melanogaster)、草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)。
使用本領域熟知的各種基因傳遞技術可將含有感興趣核苷酸序列的核酸分子穩(wěn)定地整合進宿主細胞基因組或維持于合適的宿主細胞的穩(wěn)定的附加型元件。參見，例如美國專利號5,399,346。
在蛋白質得以表達的條件下，這些分子依賴于選擇的表達系統(tǒng)和宿主通過所述表達載體由生長中的轉化宿主細胞生產(chǎn)。然后從宿主細胞分離表達的蛋白質并純化。如果表達系統(tǒng)將蛋白質分泌入生長培養(yǎng)基，該產(chǎn)物可從培養(yǎng)基直接純化。如果未分泌，可從細胞裂解物中分離產(chǎn)物。選擇合適的生長條件和純化方法是本領域的技術人員能力范圍內(nèi)的。
以上重組生產(chǎn)的方法可用于獲得其它與E1E2組合物一起施用的多肽(例如下述的其它HCV多肽)。
微粒如上所解釋的，E1E2809DNA在傳遞之前要吸附到陽離子微粒上。此外，微?？捎糜趥鬟f其它HCV蛋白免疫原以及編碼這些物質的DNA。例如，陽離子、陰離子或不帶電的微粒也可用于組合物中來激發(fā)免疫應答，例如用于連續(xù)傳遞E1E2 DNA、E1E2蛋白質或用于傳遞其它的免疫原。如果用于傳遞蛋白免疫原，該免疫原可截留在微粒內(nèi)或吸附到微粒上。
文中使用的術語“微?！敝钢睆郊s100nm到約150μm的顆粒，更優(yōu)選直徑約200nm到約30μm，最優(yōu)選直徑約500nm到約10μm。優(yōu)選微粒的直徑是無需咬合針頭和毛細管就可胃腸外施用的。微粒的大小可方便地通過本領域熟知的技術測量，例如光子相關光譜、激光衍射術和/或掃描電子顯微鏡。
本發(fā)明使用的微?？蓮哪軠缇?、無毒和生物可降解的材料制得。這些材料包括(不限于)聚(α-羥酸)、聚羥基丁酸、聚己內(nèi)酯、聚原酸酯、聚酐、聚乙烯醇和乙烯乙酸乙烯酯。本發(fā)明使用的微粒優(yōu)選衍生自聚(α-羥酸)，尤其是聚(丙交酯)(“PLA”)(參見，例如美國專利號3,773,919)或D，L-丙交酯和乙交酯或乙醇酸的共聚物，例如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(“PLG”或“PLGA”)(參見，例如美國專利號4,767,628)，或D，L-丙交酯和己內(nèi)酯的共聚物。微?？裳苌跃哂胁煌肿恿康母鞣N聚合的起始物質，并且在使用共聚物，例如PLG的情況中，丙交酯∶乙交酯各種比例的選擇很大程度上取決于多肽的所需劑量和有待治療的疾病。這些參數(shù)將在下文全面討論。用于生產(chǎn)本發(fā)明有用的微粒的生物可降解聚合物可方便地通過市售從，例如從Boehringer Ingelheim，德國和Birmingham Polymers，Inc.，Birmingham，AL購得。
尤其優(yōu)選的本發(fā)明使用的聚合物是PLA和PLG聚合物。各種分子量的這些聚合物均可用，并且本領域的技術人員可方便地測定合適的分子量來提供討論中的多核苷酸或多肽的所需釋放速率。所以，例如就PLA而言，合適的分子量是約2000到250,000。就PLG而言，合適的分子量的范圍一般約從10,000到約200,000,優(yōu)選約15,000到約150,000,最優(yōu)選約50,000到約100,000。
如果使用一種共聚物(例如PLG)來制備微粒，丙交酯∶乙交酯的各種比例均是可用的，并且該比例的選擇在很大程度上部分取決于所需的降解速率。例如，含有50％D，L-丙交酯和50％乙交酯的50∶50 PLG聚合物可提供快速的吸附共聚物，而由于增加了丙交酯成分，75∶25 PLG降解的比較慢，85∶15和90∶10降解得更慢。很明顯，基于有待治療疾病的性質，本領域的技術人員可容易地決定丙交酯∶乙交酯的合適比例。此外，為達到所需的釋放動力學，制劑中可使用具有各種丙交酯∶乙交酯比例的微粒的混合物。具有各種丙交酯∶乙交酯比例和分子量的PLG共聚物可方便地得自各種來源，包括Boehringer Ingelheim，德國和Birmingham Polymers，Inc.，Birmingham，AL。這些聚合物也可使用本領域熟知的技術通過簡單的乳酸成分縮聚來合成，例如描述于Tabata等.，J.Biomed.Mater.Res.(1988)22837-858。
當使用微粒傳遞E1E2 DNA(或編碼其它HCV免疫原等的其它DNA)時，通常將微粒制備成能使DNA吸附在其表面。為了傳遞蛋白質，抗原可截留在或吸附在微粒上。制備這種微粒的幾種技術是本領域已知的。例如，本發(fā)明可使用如美國專利號3,523,907和Ogawa等，Chem.Pharm.Bull.(1988)361095-1103所述的雙重乳劑/溶劑蒸發(fā)技術來制備微粒。這些技術包括形成由聚合物溶液的液滴組成的初級乳劑，然后將其與含有顆粒穩(wěn)定劑/表面活性劑的連續(xù)水相混合。
更具體地，如O′Hagan等，Vaccine(1993)11965-969和Jeffery等，PharmRes.(1993)10362所述，水包(油包水)(w/o/w)溶劑蒸發(fā)系統(tǒng)可用于形成微粒。在該技術中，特定的聚合物與有機溶劑結合，例如乙酸乙酯、二甲基氯(也稱為亞甲基氯或二氯甲烷)、乙腈、丙酮、氯仿等。聚合物以有機溶劑中約2-15％，更優(yōu)選4-10％，最優(yōu)選6％的溶液提供。使用，例如勻漿器使聚合物溶液乳化。然后乳劑與較大體積的乳劑穩(wěn)定劑的水溶液合并，例如聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮。乳劑穩(wěn)定劑通常以約2-15％溶液提供，更常見是以約4-10％溶液提供。然后使混合物均勻化來生產(chǎn)穩(wěn)定的w/o/w雙重乳劑。然后蒸發(fā)有機溶劑。
制劑參數(shù)應可操作來制備小(＜5μm)和大(＞30μm)的微粒。參見，例如Jeffery等.，Pharm.Res.(1993)10362-368；McGee等.，J Microencap.(1996)。例如，降低攪拌速率得到較大的微粒，使得內(nèi)相體積增加。通過少的水相體積和高濃度的PVA產(chǎn)生了小微粒。微粒也可使用以下技術形成例如Thomasin等，J.Controlled Release(1996)41131；美國專利號2,800,457；Masters，K.(1976)《噴霧干燥》，第二版.Wiley，紐約所述的噴霧-干燥和凝聚技術；空氣懸浮包衣技術，例如Hall等.，(1980)《受控釋放技術方法、原理及其應用》中的“Wurster方法”(The″Wurster Process″in ControlledRelease TechnologiesMethods，Theory，and Applications)(A.F.Kydonieus編)，第2卷，133-154頁，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)lorida和Deasy，P.B.，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.(1988)S(2)99-139所述的鍋包衣法(pancoating)和Wurster包衣法；以及如Lim等.，Science(1980)210908-910所述的離子膠凝作用。
顆粒大小可使用如摻有氦-氖激光的分光儀通過例如激光散射測定。顆粒大小一般在室溫下測定并涉及對所測樣品的多次分析(例如，5-10次)來得到顆粒直徑的平均值。顆粒大小也可使用掃描電子顯微術(SEM)來方便地測定。
為引發(fā)合適的免疫應答，在使用微粒之前，可測定DNA或蛋白質含量(例如，吸附到微粒上或截留于其中的DNA或蛋白質的量)，使得可向受試者傳遞合適量的微粒。微粒的DNA和蛋白質的含量可按照本領域已知的方法測定，例如通過破壞微粒并提取截留或吸附的分子。例如，如Cohen等.，Pharm.Res.(1991)8713；Eldridge等.，Infect Immun.(1991)592978和Eldridge等.，J.Controlled Release(1990)11205所述可將微粒溶解于二氯甲烷并將藥物萃取進蒸餾水?；蛘撸⒘Ｒ部煞稚⒃诤?％(w/v)SDS的0.1M NaOH中。樣品經(jīng)攪拌、離心并使用合適的測定方法分析上清液中具體的藥物。參見，例如O′Hagan等，Int.J.Pharm.(1994)10337-45。
顆粒優(yōu)選含有約0.5％到約40％(w/w)的DNA或多肽，例如1％到30％，如0.5％...1％...1.5％...2％等到25％(w/v)，更優(yōu)選約0.5％-4％到約18％-20％(w/v)。微粒的DNA和多肽的載荷取決于所需劑量和治療的病癥，以下將更詳細討論。
制備后，微粒可保存或冷凍干燥待用。為將DNA和/或蛋白質吸附到微粒上，微粒制劑與感興趣的分子簡單混合并且得到的制劑在使用前可再次凍干。出于本發(fā)明的目的，文中所述的微粒一般可吸附約1μg到100mgDNA，例如10μg到5mg、或100μg到500μg，如1...5...10...20...30...40...50...60...100μg等到500μg DNA。
將大分子吸附到制備的微粒上的一種優(yōu)選方法描述于國際公布號WO00/050006。簡言之，微粒再水化并使用可透析的陰離子或陽離子洗滌劑使微粒分散為基本上是單體的懸浮液。有用的洗滌劑包括(但不限于)各種N-甲基葡糖酰胺(稱為MEGA)中的任一種，例如庚酰基-N-甲基葡糖酰胺(MEGA-7)、辛酰基-N-甲基葡糖酰胺(MEGA-8)、壬酰基-N-甲基葡糖酰胺(MEGA-9)和癸?；?N-甲基葡糖酰胺(MEGA-10)；膽酸；膽酸鈉；脫氧膽酸；脫氧膽酸鈉；?；悄懰幔慌；悄懰徕c；牛磺脫氧膽酸；?；敲撗跄懰徕c；3-[(3-膽氨酰丙基)二甲基胺基]-1-丙烷-磺酸酯(CHAPS)；3-[(3-膽氨酰丙基)二甲基胺基]-2-羥基-1-丙烷-磺酸酯(CHAPSO)；B十二烷基-N，N-二甲基-3-胺基-1-丙烷-磺酸酯(兩性洗滌劑3-12)；N，N-雙-(3-D-葡糖酰胺丙基)-脫氧膽酰胺(DEOXY-BIGCHAP)；B辛基葡糖苷；蔗糖單月桂酸酯；葡糖膽酸/葡糖膽酸鈉；月桂肌氨酸(鈉鹽)；葡糖脫氧膽酸/葡糖脫氧膽酸鈉；十二烷基硫酸鈉(SDS)；3-(三甲硅烷基)-1-丙烷磺酸(DSS)；西曲溴銨(CTAB，其主要成分是溴化三甲基十六烷基銨)；溴化三甲基十六烷基銨；溴化三甲基十二烷基銨；溴化三甲基十六烷基銨；溴化三甲基十四烷基銨；溴化卞基二甲基十二烷基銨；氯化卞基二甲基十六烷基銨和溴化卞基二甲基十四烷基銨。上述洗滌劑可市售得自，例如Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO。本領域已知的各種陽離子脂質體也可用作洗滌劑。參見Balasubramaniam等.，1996，Gene Ther.，3163-72和Gao，X.和L.Huang.1995，Gene Ther.，27110-722。
然后使用，例如陶瓷研缽和杵物理研碎微粒/洗滌劑混合物直至形成光滑的漿狀物。然后加入合適的水性緩沖液，例如磷酸緩沖鹽水(PBS)或Tris緩沖鹽水，得到的混合物超聲處理或勻漿化直至微粒全部懸浮。然后將感興趣的大分子，例如E1E2 DNA或多肽加入微粒懸浮液并透析該系統(tǒng)以除去洗滌劑。最好選擇聚合物微粒和洗滌劑系統(tǒng)使得感興趣的大分子吸附到微粒表面而仍能維持大分子的活性。如下所述，得到的含有表面吸附大分子的微?？上慈ノ唇Y合的大分子并作為懸浮液保存于合適的緩沖制劑中，或與合適的賦形劑一起凍干。
在有帶電洗滌劑(例如陰離子或陽離子洗滌劑)的情況中生產(chǎn)的微粒具有帶凈負電或凈正電的帶電表面。這些微?？晌礁罅康姆肿印＠?，用陰離子洗滌劑(例如十二烷基硫酸鈉(SDS)或3-(三甲硅烷基)-1-丙烷磺酸(DSS)，即PLG/SDS或PLG/DSS)微粒生產(chǎn)的微粒吸附帶正電的免疫原(例如蛋白質)并在文中命名為“陰離子的”。類似地，用陽離子洗滌劑(例如CTAB，即PLG/CTAB微粒)生產(chǎn)的微粒吸附帶負電的大分子(例如DNA)并在文中命名為“陽離子的”。
其它HCV多肽和多核苷酸如上所解釋的，本發(fā)明的方法可使用含有HCV抗原或編碼這種抗原的DNA的其它組合物。這種組合物可在傳遞E1E2809DNA組合物之前、之后或同時傳遞，如果使用激發(fā)免疫應答的組合物，這種組合物也可在此之前、之后或同時傳遞。
丙型肝炎病毒的基因組一般含有轉錄為多蛋白的、單一的、約9,600個核苷酸的開放讀框。該多蛋白的全長序列披露于歐洲公布號388,232和美國專利號6,150,087。如表1和圖1所示，HCV多蛋白在切割時產(chǎn)生了10個不同的產(chǎn)物，其順序為NH2Core-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH。核心多肽位于相對于HCV-1編號的1-191位(參見，關于HCV-1基因組的Choo等.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.美國882451-2455)。該多肽進一步加工來產(chǎn)生具有約1-173個氨基酸的HCV多肽。包膜蛋白，E1和E2分別位于192-383位和384-746位。P7結構域發(fā)現(xiàn)約位于747-809位。NS2是一種具有蛋白水解活性的膜內(nèi)在蛋白質并發(fā)現(xiàn)約位于多蛋白的810-1026位。單獨的NS2或與NS3(發(fā)現(xiàn)約位于1027-1657位)結合的NS2切斷NS2-NS3sissle鍵，依次產(chǎn)生NS3N-末端并釋放出包括絲氨酸蛋白酶和RNA解旋酶活性的大的多蛋白。發(fā)現(xiàn)約位于1027-1207位的NS3蛋白酶用于加工剩余的多蛋白。解旋酶活性發(fā)現(xiàn)約位于1193-1657位。多蛋白成熟的完成由NS3絲氨酸蛋白酶催化通過在NS3-NS4a接頭處自催化切割來啟動。接下來HCV多蛋白的NS3-介導切割表現(xiàn)出包括通過另一個多肽的NS3分子來識別多蛋白切割接頭。在這些反應中，NS3釋放一種NS3輔助因子(發(fā)現(xiàn)約位于1658-1711位的NS4a)、兩種蛋白質(發(fā)現(xiàn)約位于1712-1972位的NS4b和發(fā)現(xiàn)約位于1973-2420位的NS5a)和一種RNA-依賴性RNA聚合酶(發(fā)現(xiàn)約位于2421-3011位的NS5b)。

*相對于HCV-1編號。參見，例如Choo等.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.美國882451-2455。
以上HCV多蛋白產(chǎn)物、編碼這些產(chǎn)物的DNA和從中衍生的免疫原性多肽是的序列已知(參見，例如美國專利號5,350,671)。例如，許多常規(guī)和特殊的衍生自HCV多蛋白的免疫原性多肽已得到描述。參見，例如Houghton等.，歐洲公布號318,216和388,232；Choo等.，Science(1989)244359-362；Kuo等.，Science(1989)244362-364；Houghton等.，Hepatology(1991)14381-388；Chien等.，Proc.Natl.Acad.Sci.美國(1992)8910011-10015；Chien等，J.Gastroent.Hepatol.(1993)8S33-39；Chien等.，國際公布號WO 93/00365；Chien，D.Y.，國際公布號WO 94/01778。這些出版物一般提供了有關HCV的廣泛背景以及HCV多肽免疫試劑的制備和用途。
本發(fā)明可使用任何所需的免疫原性HCV多肽或編碼該多肽的DNA。例如，衍生自Core區(qū)域的HCV多肽發(fā)現(xiàn)可用于主題組合物和方法，如衍生自以下所發(fā)現(xiàn)區(qū)域的多肽氨基酸1-191、氨基酸10-53、氨基酸10-45、氨基酸67-88、氨基酸86-100、氨基酸81-130、氨基酸121-135、氨基酸120-130、氨基酸121-170；和任何在以下文獻中鑒定的Core表位，例如Houghton等.，美國專利號5,350,671；Chien等.，Proc.Natl.Acad.Sci.美國(1992)8910011-10015；Chien等.，J.Gastroent.Hepatol.(1993)8S33-39；Chien等.，國際公布號WO 93/00365；Chien，D.Y.，國際公布號WO 94/01778和美國專利號6,150,087。
此外，本發(fā)明也可用衍生自該病毒的非結構區(qū)域的多肽。HCV多蛋白的NS3/4a區(qū)域已得到描述并且該蛋白質的氨基酸序列和全部結構披露于Yao等.，Structure(1999年11月)71353-1363。也參見，Dasmahapatra等.，美國專利號5,843,752。如上所解釋的，天然序列或免疫原性類似物可用于主題制劑中。Dasmahapatra等.，美國專利號5,843,752和Zhang等.，美國專利號5,990,276均描述了NS3/4a的類似物及其制備方法。
此外，用于主題組合物和方法的多肽可衍生自HCV多蛋白的NS3區(qū)域。許多這種多肽是已知的，包括(但不限于)衍生自c33c和c100區(qū)域的多肽以及含有一種NS3表位(例如c25)的融合蛋白。這些和其它NS3多肽在本發(fā)明中有用且是本領域已知的并描述于，例如Houghton等.，美國專利號5,350,671；Chien等.，Proc.Natl.Acad.Sci.美國(1992)910011-10015；Chien等.，J.Gastroenf.Hepatol.(1993)8S33-39；Chien等.，國際公布號WO93/00365；Chien，D.Y.，國際公布號WO 94/01778和美國專利號6,150,087。
另外，如美國專利號6,514,731和6,428,792所述，多表位融合抗原(命名為“MEFA”)可用于主題組合物中。這種MEFA包括衍生自兩個或多個各種的病毒區(qū)域的多表位。這些表位優(yōu)選來自多于一種HCV毒株，從而可在單一的疫苗中增加對多種HCV毒株的保護能力。
如以上所解釋，為了方便起見，各種HCV區(qū)域按照相對于HCV-1a基因組編碼的多蛋白的氨基酸編號來定義如Choo等((1991)Proc.Natl.Acad.Sci.美國882451)所述，起始子甲硫氨酸指定為位置1。然而，如以上所詳細解釋的，本發(fā)明使用HCV多肽和多核苷酸不限于那些衍生自HCV-1a序列的并且任何HCV毒株或分離物可用作提供本發(fā)明使用的抗原性序列的基礎。
以上多核苷酸和多肽可使用上述用于E1E2多肽和多核苷酸的重組生產(chǎn)的方法獲得。
免疫原性組合物及施用A.組合物一旦生產(chǎn)后，E1E2多核苷酸、多肽或其它免疫原就可在免疫原性組合物中提供，例如在預防性(即防止感染)或治療性(即在感染后治療HCV)疫苗組合物中。組合物一般可包括一種或多種“藥學上可接受的賦形劑或載體”，例如水、鹽水、甘油、乙醇等。此外，這種載體中可存在輔助物質，例如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖物質等。
運載體可任選存在于，例如用于激發(fā)對E1E2809DNA的免疫應答的蛋白質組合物中。運載體是其自身不誘導產(chǎn)生有害于接受組合物的個體的抗體的分子。合適的運載體一般是大的、代謝緩慢的大分子，例如蛋白質、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂質聚集體(例如油滴或脂質體)和惰性病毒顆粒。這種運載體是本領域的那些普通技術人員所熟知的。此外，免疫原性多肽可與細菌類毒素偶聯(lián)，例如來自白喉、破傷風、霍亂等的類毒素。
組合物中也可含有佐劑來增加免疫應答，例如(但不限于)(1)鋁鹽(礬)，例如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)水包油乳劑試劑(具有或不具有其它特異性免疫刺激劑，例如胞壁酰肽(見下文)或細菌細胞壁成分)，例如(a)含有5％角鯊烯、0.5％吐溫80和0.5％司盤85，使用，例如110Y型微流化器(Microfluidics，Newton，MA)配制成亞微米顆粒的MF59(PCT公布號WO90/14837；美國專利號6,299,884和6,451,325)，(b)含有10％角鯊烯、0.4％吐溫80、5％聚氧丙烯-封閉的聚合物L121與thr-MDP(見下文)，并且微流化為亞微米乳劑或旋轉產(chǎn)生較大粒徑的乳劑的SAF，和(c)含有2％角鯊烯、0.2％吐溫80和一種或多種由以下組成的細菌細胞壁成分的RibiTM佐劑系統(tǒng)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)單磷酰脂質A(MPL)、海藻糖二霉菌酸(TDM)和細胞壁骨架(CWS)，優(yōu)選MPL+CWS(DetoxTM)；(3)皂苷佐劑，例如可使用QS21或StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)或從中產(chǎn)生的顆粒，如ISCOM(免疫刺激復合物)，其中ISCOM可除去其它的洗滌劑(參見，例如國際公布號WO 00/07621)；(4)完全氟氏佐劑(CFA)和非完全氟氏佐劑(IFA)；(5)細胞因子，例如白介素，如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等(參見，例如國際公布號WO 99/44636)；干擾素，如γ干擾素；巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)；腫瘤壞死因子(TNF)等；(6)細菌ADP-核糖基化毒素的解毒突變體，例如霍亂毒素(CT)、百日咳毒素(pT)或大腸桿菌不耐熱毒素(LT)，特別是LT-K63(其中位置63處的野生型氨基酸被賴氨酸取代)、LT-R72(其中72位的野生型氨基酸被精氨酸取代)、CT-S109(其中109位的野生型氨基酸被絲氨酸取代)和PT-K9/G129(其中9和129位的野生型氨基酸被賴氨酸和甘氨酸取代)(參見，例如國際公布號WO93/13202和WO92/19265)；(7)單磷酰脂質A(MPL)或3-O-脫?；疢PL(3dMPL)(參見，例如GB 2220221；EPA 0689454)，任選在基本上無明礬的情況中(參見，例如國際公布號WO 00/56358)；(8)3dMPL與，例如QS21和/水包油乳劑的組合(參見，例如EPA 0835318；EPA 0735898；EPA0761231)；(9)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯(見，例如國際公布號WO99/52549)；(10)一種皂苷和免疫刺激寡核苷酸，例如CpG寡核苷酸(參見，例如國際公布號WO 00/62800)；(11)一種免疫刺激劑和一種金屬鹽顆粒(參見，例如國際公布號WO 00/23105)；(12)一種皂苷和一種水包油乳劑(參見，例如國際公布號WO99/11241)；(13)一種皂苷(例如，QS21)+3dMPL+IL-12(任選+一種甾醇)(參見，例如國際公布號WO 98/57659)；和(14)其它作為免疫刺激制劑來提高組合物效力的物質。
胞壁酰肽包括(但不限于)N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰1-D-異谷氨酰胺(去甲-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷?；?-乙胺(MTP-PE)等。
特別優(yōu)選的用于組合物中的佐劑是亞微米水包油乳劑。本發(fā)明使用的亞微米水包油乳劑是任選含有各種量的MTP-PE的角鯊烯/水乳劑，例如含有4-5％w/v角鯊烯、0.25-1.0％w/v吐溫80TM(單油酸聚氧乙烯失水山梨糖醇酯)和/或0.25-1.0％司盤85TM(三油酸失水山梨糖醇酯)和任選含有的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰基氧)-乙胺(MTP-PE)的亞微米水包油乳劑，例如，稱為“MF59”的亞微米水包油乳劑(國際公布號WO90/14837；美國專利號6,299,884和6,451,325；和Ott等.，《疫苗設計亞單位和佐劑方法》中的“MF59-安全而強有力的用于人疫苗佐劑的設計與評估”(“MF59-Design and Evaluationof a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines″in Vaccirae DesignTheSubunit and Adjuvant Approach)(Powell，M.F.和Newman，M.J.編)，PlenumPress，紐約，1995，277-296頁)。MF59含有4-5％w/v角鯊烯(例如，4.3％)、0.25-0.5％w/v吐溫80TM和0.5％w/v司盤85TM并且可任選含有各種量的MTP-PE，使用，例如110Y型微流化器(Microfluidics，Newton，MA)配制成亞微米顆粒。例如，MTP-PE存在的量可是約0-500μg/劑量，更優(yōu)選0-250μg/劑量并且最優(yōu)選0-100μg/劑量。如文中所用的，術語“MF59-0”指缺乏MTP-PE的上述亞微米水包油乳劑，而術語MF59-MTP指含有MTP-PE的制劑。例如，“MF59-100”每劑量含有100μg MTP-PE等。另一種本發(fā)明使用的水包油乳劑MF69含有4.3％w/v角鯊烯、0.25％w/v吐溫80TM和0.75％w/v司盤85TM并任選含有MTP-PE。還有另一種亞微米水包油乳劑MF75(也是稱為SAF)含有10％角鯊烯、0.4％吐溫80TM、5％聚氧丙烯-封閉聚合物L121和thr-MDP，該乳劑也微流化成亞微米乳劑。MF75-MTP指包括MTP的MF75制劑，例如每劑量100-400μg MTP-PE。
用于組合物中的亞微米水包油乳劑、其制備方法和免疫刺激劑(例如胞壁酰肽)詳述于國際公布號WO 90/14837和美國專利號6,299,884和6,451,325。
主題組合物中包括的其它優(yōu)選試劑是免疫刺激分子，例如免疫刺激核酸(ISS)，包括(但不限于)未甲基化的CpG基序，如CpG寡核苷酸。
含有未甲基化的CpG基序的寡核苷酸表現(xiàn)出能誘導B細胞、NK細胞和抗原呈遞細胞(APC)的激活，例如單核細胞和巨嗜細胞。參見，例如美國專利號6,207,646。所以，衍生自CpG家族分子、CpG二核苷酸的佐劑和含有CpG基序的合成寡核苷酸(參見，例如Krieg等.，Nature(1995)374546和Davis等.，J.Immunol.(1998)160870-876)，例如任何披露于美國專利號6,207,646的各種免疫刺激CpG寡核苷酸均可用于主題方法和組合物。這種CpG寡核苷酸通常含有至少8到約100個堿基對，優(yōu)選8到40個堿基對，更優(yōu)選15-35個堿基對，優(yōu)選15-25個堿基對，和在這些數(shù)值之間的任何數(shù)目的堿基對。例如，以式5′-X1CGX23′表示的含有共有CpG基序的寡核苷酸發(fā)現(xiàn)可用作免疫刺激CpG分子，其中X1和X2是核苷酸并且C是未甲基化的。通常，X1是A、G或T，而X2是C或T。其它有用的CpG分子包括那些式5′-XiX2CGX3X4所代表的分子，其中X1和X2是序列，例如GpT、GpG、GpA、ApA、ApT、ApG、CpT、CpA、CpG、TpA、TpT或TpG，而X3和X4是TpT、CpT、ApT、ApG、CpG、TpC、ApC、CpC、TpA、ApA、GpT、CpA或TpG，其中“p”代表磷酸鍵。寡核苷酸在或接近5’和/或3’末端優(yōu)選不包括GCG序列。此外，CpG在其5′-端側翼優(yōu)選具有兩個嘌呤(優(yōu)選是GpA二核苷酸)或是一個嘌呤一個嘧啶(優(yōu)選是GpT)，并且在其3′-端的側翼具有兩個嘧啶，優(yōu)選是TpT或TpC二核苷酸。所以，優(yōu)選的分子含有序列GACGTT、GACGTC、GTCGTT或GTCGCT，并且這些序列的側翼是幾個其它的核苷酸。該中心核心區(qū)域外的核苷酸似乎極其易變。
此外，本發(fā)明使用的CpG寡核苷酸可是雙鏈或單鏈。雙鏈分子在體內(nèi)更穩(wěn)定而單鏈分子表現(xiàn)出提高了的免疫活性。此外，為了提高CpG分子的免疫刺激活性，可修飾磷酸骨架，例如二硫代磷酸鹽修飾。如美國專利號6,207,646所述，具有二硫代磷酸鹽骨架的CpG分子優(yōu)選激活B-細胞，而那些具有磷酸二酯骨架的優(yōu)選激活單核細胞的(巨嗜細胞、樹突細胞和單核細胞)和NK細胞。
使用本領域熟知的標準技術可方便地測試CpG分子的刺激免疫應答的能力。例如，使用上述的免疫測定可方便地測定該分子的刺激體液和/或細胞免疫應答的能力。此外，免疫原性組合物可與或不與CpG分子一起施用來測定免疫應答是否得到提高。
本發(fā)明使用的組合物含有治療有效量的編碼E1E2復合物的DNA(或治療有效量的蛋白質)并且如果需要可含有任何其它上述的成分。“治療有效量”指蛋白質或編碼該蛋白的DNA的量，該量可在施用的個體中誘導免疫應答，優(yōu)選保護性的免疫應答。這種應答通常可導致受試者產(chǎn)生針對組合物的抗體介導的和/或分泌的或細胞的免疫應答。一般這種應答包括(但不限于)一種或多種以下作用產(chǎn)生任何免疫類型的抗體，例如免疫球蛋白A、D、E、G或M；B和T淋巴細胞的增殖；提供免疫細胞的激活、生長和分化信號；輔助T細胞、抑制性T細胞和/或細胞毒性T細胞和/或γδT細胞的擴增。
E1E2蛋白質組合物(例如在施用E1E2809DNA后用于激發(fā)免疫應答)可含有一種或多種E1E2復合物的混合物(例如得自多于一種病毒分離物的E1E2復合物)以及其它的HCV抗原。此外，如上所解釋的，由于剪切和蛋白酶切割，E1E2復合物可以異源分子的混合物存在。所以，包括E1E2復合物的組合物可含有多種E1E2，例如終止于氨基酸746的E1E2(E1E2746)、終止于氨基酸809的E1E2(E1E2809)或任何其它上述的各種E1和E2分子，如具有1-20個氨基酸N-末端截短的E2分子、始于氨基酸387、氨基酸402、氨基酸403等的E2種類。
組合物(DNA和蛋白質)可與其它抗原和免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)合施用，例如免疫球蛋白、細胞因子、淋巴因子和趨化因子，包括(但不限于)如IL-2、修飾的IL-2(半胱氨酸125換為絲氨酸125)、GM-CSF、IL-12、γ-干擾素、IP-10、MIP1β、FLP-3、利巴韋林和RANTES的細胞因子。
B.施用免疫原性組合物(DNA或蛋白質)一般制備為液體溶液或懸浮液的注射劑；也可制備為在注射前適于溶解在或懸浮在液體載體中的固體形式。所以，組合物一旦配制好，可常規(guī)地通過胃腸外施用，例如通過皮下或肌肉內(nèi)注射。適于其它施用方式的其它制劑包括口服和肺部制劑，栓劑和透皮應用。劑量治療可是單劑量方案或多劑量方案。有效量優(yōu)選足以導致對疾病癥狀的治療或預防。確切的需要量取決于以下因素而變接受治療的對象；有待治療的個體的年齡和總體狀況；個體的免疫系統(tǒng)合成抗體的能力；所需保護的程度；所治療病癥的嚴重性；所選的特定大分子及其施用方式。本領域的技術人員可方便地確定合適的有效量?！爸委熡行Я俊钡姆秶鄬^寬，該范圍可使用本領域已知的體內(nèi)和體外模型通過常規(guī)實驗確定。用于以下實施例的E1E2 DNA和多肽的量提供了可用來最優(yōu)化地引發(fā)抗-E1、抗-E2和/或抗-E1E2的抗體的常規(guī)指導。
例如，免疫原優(yōu)選肌肉內(nèi)注射入大型哺乳動物，例如靈長類動物，如狒狒、黑猩猩或人。吸附到陽離子微粒上的E1E2 DNA的量通常約為1μg到100mg DNA，例如5μg到100mg DNA，如10μg到50mg或100μg到5mg，如20...30...40...50...60...100...200μg等到500μg DNA和所述范圍內(nèi)的任一整數(shù)。本發(fā)明的E1E2表達構建物使用標準的基因傳遞方案施用?；騻鬟f的方法是本領域已知的。參見，例如美國專利號5,399,346；5,580,859；5,589,466。EIE2809DNA可直接傳遞至脊椎動物受試者或可先體外后體內(nèi)地傳遞至得自受試者的細胞再將細胞重新植入受試者。
施用編碼E1E2多肽的DNA可在哺乳動物中引發(fā)持續(xù)至少1周、2周、1月、2月、3月、4月、6月、1年或更長時間的細胞免疫應答和/或抗-E1、抗-E2和/或抗-E1E2抗體滴度。也可施用E1E2 DNA來提供記憶應答。如果實現(xiàn)了這種應答，抗體滴度會隨時間而降低，但暴露于HCV病毒或免疫原導致快速誘導抗體，例如僅在幾天內(nèi)。任選地，如上所解釋的，通過提供一種或多種E1E2多肽的激發(fā)注射，抗體滴度可在初始注射后在哺乳動物中維持2周、1月、2月、3月、4月、5月、6月、1年或更長時間。
優(yōu)選引發(fā)至少10、100、150、175、200、300、400、500、750、1,000、1,500、2,000、3,000、5,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,00(幾何平均滴度)或更高的滴度，或所述滴度之間的任何數(shù)量，該滴度使用標準免疫測定來測量，例如以下實施例中所述的免疫測定。參見，例如，Chien等.，Lancet(1993)342933和Chien等.，Proc.Natl.Acad.Sci.美國(1992)8910011。
就E1E2蛋白質激發(fā)而言，一般每劑量傳遞約0.1μg到約0.5mg免疫原，或所述范圍內(nèi)任何量，例如0.5μg到約10mg、1μg到約2mg、2.5μg到約250μg、4μg到約200μg，如每劑量4、5、6、7、8、9、10...20...30...40...50...60...70...80...90...100等μg。免疫原可施用于未感染HCV的哺乳動物或可施用于感染HCV的哺乳動物。
用于實踐本發(fā)明的毒株的保存以下毒株的生物純培養(yǎng)物由美國模式培養(yǎng)物保藏所(10801 Boulevard大學，Manassas，VA)保存。按照國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約(International Recognition of the Deposit of Microorganisms for thePurpose ofPatent Procedure)的條款及其(布達佩斯條約)細則規(guī)定，在生存力實驗成功并支付了所需費用后分配了指明的登錄號。這保證了從保存之日起該培養(yǎng)物維持30年可用。按照布達佩斯條約的條款，生物體為ATCC使用，該條約保證了按照35U.S.C.§122授權的美國專利和商標局長和按照該局長的法令(包括參照886 OG 638的37C.F.R.§1.12)確定的個人可永久且不受限制地使用其后代。一旦專利授權，公眾對保存的培養(yǎng)物的可用性的所有限制條件均永久取消。
提供這些保存物僅是為了方便本領域的技術人員，而非承認保存是35U.S.C.§112規(guī)定所需的。如果與說明書發(fā)生沖突，這些基因的核酸序列以及其編碼的分子的氨基酸序列是受控制的。制備、使用或出售保存的物質需要許可，并且本文未授予這種許可。
質粒 保存日期 ATCC號E1E2-809 2001年8月16日PTA-36432.實驗以下是實踐本發(fā)明的特定實施方案的實施例。提供這些實施例僅是為了說明，而決非為了限制本發(fā)明的范圍。
我們努力保證有關使用的數(shù)字(例如，數(shù)量、溫度等)的精確性，但一些實驗差錯和偏差當然是應該考慮到的。
材料與方法酶是購自市售來源并按照生產(chǎn)商的指導使用。
除非另有注明，在分離DNA片段中，所有的DNA操作均按照標準方法進行。參見，Sambrook等.，同上。限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、大腸桿菌、DNA聚合酶1I、Klenow片段和其它生物試劑購自市售來源并按照生產(chǎn)商的指導使用。在瓊脂糖凝膠上分離雙鏈DNA片段。
化學試劑的來源一般包括Sigma Chemical Company，St.Louis，MO；Alrich，Milwaukee，WI；Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN。
質粒設計通過將編碼氨基酸192到809的HCV-1和上游組織纖溶酶原激活物(tpa)信號序列克隆進pnewCMV-II表達載體來構建質粒pCMVtpaE1E2p7(6275bp)。pnewCMV載體是基于pUC19的克隆載體，該載體含有以下元件SV40復制起點、人CMV增強子/啟動子、人CMV內(nèi)含子、人纖溶酶原激活物(tPA)前導序列、牛生長激素poly A終止子和氨芐青霉素抗性基因。
E1E2809從前述的重組CHO細胞表達(Spaete等.，Virology(1992)188819-830)。用Triton X-100洗滌劑從CHO細胞中提取E1E2抗原。使用雪白蓮Galanthusnivalis凝集素瓊脂糖(Vector Laboratories，Burlingame，Calif.)色譜和快速流動S-Sepharose陽離子交換色譜(Pharmacia)純化E1E2抗原。水包油佐劑MF59生產(chǎn)于Chiron Vaccines，Marburg并詳細描述于前文中(Ott等.，《疫苗設計亞單位和佐劑方法》中的“MF59-安全而強有力的用于人疫苗佐劑的設計與評估”(“MF59--Design and Evaluation of aSafe and Potent Adjuvant for Human Vaccines″in Vaccirae DesignTheSubunit and Adjuvant Approach)(Powell，M.F.和Newman，M.J.編)，PlenumPress，紐約，1995，277-296頁)。
由Chiron Mimotopes Pty.Ltd(Clayton，Australia)使用游離的胺N-末端和游離的酸C-末端合成了跨越HCV-1a的E1和E2蛋白質(氨基酸192-809)的54種肽(每種長度為20個氨基酸，重疊10個氨基酸)來進行CTL測定。凍干的肽重懸于含水的10％DMSO中，然后每種肽稀釋至2mg/ml。使用等體積的每種肽合并成兩組，每組27種肽合并組l(氨基酸192-470)和合并組2(氨基酸461-740)。通過前述方法(Choo等.，Proc.Natl.Acad.Sci.美國(1994)911294-1298)制備表達HCV-1a氨基酸134-966(Sc59 E12C/B)的重組牛痘病毒(vv)。U96-Nunc Maxisorp板(Nalgene Nunc International，Rochester，NY)、山羊抗-小鼠IgG-HRP偶聯(lián)物(Caltag Laboratories，Burlingame，CA)和TMB Microwell過氧化物酶底物系統(tǒng)(Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)用于進行ELISA。
聚丙交酯-共-乙交酯(RG 504，50∶50的丙交酯∶乙交酯單體比例)得自Boehringer Ingelheim，美國。CTAB得自Sigma Chemical Co.，St.Louis，美國并用于運送。使用基本上如前所述的溶劑蒸發(fā)技術(Singh等.，Proc.Natl.Acad.Sci.美國(2000)97811-816；Briones等.，Pharm.Res.(2001)18709-712)制備PLG/CTAB微粒。將100mg微粒與1×TE緩沖液配制的200g/ml DNA溶液于4℃輕柔攪拌12小時來使HCV E1E2質粒吸附到微粒上。然后離心分離微粒，接著凍干。通過水解PLG微粒確定吸附的DNA量。使用粒徑分析儀(Malvern Instruments，Malvern，英國)確定微粒的大小分布。使用DELSA 440 SX Zeta分選機sizer(Coulter Corp.Miami，F(xiàn)L)測量zeta電勢。
實施例1使用吸附到陽離子微粒上的E1E2 DNA免疫接種小鼠對小鼠進行了三項研究來確定吸附到陽離子微粒上的E1E2809質粒DNA的免疫原性。在第一項研究中，10只6-8周齡、體重約20-25g的雌性CB6F1小鼠在0天和28天用E1E2809質粒DNA或PLG/CTAB/E1E2809DNA(10和100μg)免疫接種。鹽水配制的制劑通過TA途徑注射入每只動物的兩條后腿(每個位點50μl)。在42天從眼框后叢(retro-orbital plexus)取血并分離血清。通過ELISA定量HCV E1E2-特異性血清IgG滴度。
在第二項研究中，比較了每組10只小鼠的各組在0和28天用MF59制備的1和10μg PLG/CTAB/E1E2809DNA和2μg重組EIE2809蛋白質的免疫接種。另一組小鼠用10μg E1E2809質粒DNA免疫接種進行比較并在42天分離血清用于測定。
在第三項研究中，比較了E1E2809質粒DNA、PLG/CTAB/EIE2809DNA和DNA致敏/蛋白質激發(fā)引發(fā)的免疫應答。用MF59制備的E1E2809質粒DNA(10μg)、PLG/CTAB/E1E2809DNA(10μg)或5μg E1E2809蛋白質進行初次免疫接種。三組小鼠(每組10只)用MF59制備的PLG/CTAB/E1E2809DNA、E1E2809質粒DNA或EIE2809蛋白質獨立地免疫接種三次。此外，另兩組小鼠接受兩劑量PLG/CTAB/E1E2809DNA或E1E2809質粒DNA(10μg)，并且兩組均用由MF59制備的E1E2809蛋白質(5μg)的單劑量組成的第三次免疫接種激發(fā)。所有動物組免疫接種3次、分開4周并在70天收集血清。
通過ELISA在每種免疫接種后兩周收集的血清中測量小鼠中對HCVE1E2的抗體應答。用200μl 0.625g/ml純化的HCV E1E2809于4℃涂布微滴定板過夜。涂布的孔用300μl以磷酸緩沖鹽水(PBS)配制的1％BSA于37℃封閉1小時。用洗滌緩沖液(PBS，0.3％吐溫-20)洗滌板5次、輕扣并干燥。首先將血清樣品和標準血清稀釋進封閉緩沖液，然后轉移進涂布、封閉板中，板中的樣品用相同的緩沖液連續(xù)稀釋3倍。板于37℃孵育1小時后洗滌。使用特異性辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗-小鼠IgIγ鏈(CaltagLaboratories，Inc.)測定總的IgI滴度。于37℃孵育1小時后，洗滌板以除去未結合的抗體。使用OPD底物來展開板，30分鐘后加入4N HCl來阻斷顯色反應。IgG抗體的滴度表示為樣品稀釋度的倒數(shù)，其中492和620nm處稀釋樣品的光密度等于0.5。
在第一項研究中，相比于在兩種劑量(10和100μgDNA)單用E1E2809質粒DNA免疫接種，用吸附到PLG/CTAB微粒上的E1E2809質粒DNA誘導了顯著提高的對E1E2的血清IgG抗體應答。此外，10μg E1E2809質粒DNA明顯低于誘導可檢測到的應答所需的閾值劑量。相反，PLG/CTAB/E1E2809DNA在10μg誘導了強有力的應答(圖3)。
第二項研究證實了在10μg PLG/CTAB/E1E2809DNA能誘導明顯高于單用E1E2809質粒DNA的應答，但同時也表明PLG/CTAB/E1E2809DNA在1μg未誘導強有力的應答。此外，該項研究也表明PLG/CTAB/E1E2809DNA(10μg)誘導的應答與MF59輔助的2μg E1E2809蛋白質誘導的應答相當(圖4)。
第三項研究證實并拓展了早先研究的觀察結果。在10μg，兩或三劑量之后，PLG/CTAB/E1E2809DNA明顯比單用E1E2809質粒DNA更強有力，并與用MF59配制的5μg E1E2809蛋白質免疫接種相當。此外，雖然三劑量的10μg E1E2809質粒DNA未誘導可檢測的應答，兩劑量PLG/CTAB/E1E2809DNA(10μg)誘導了強有力的應答(圖5)。另外，用MF59配制的E1E2809蛋白質激發(fā)后的兩劑量PLG/CTAB/E1E2809DNA(10μg)引發(fā)了強有力的應答，而單用E1E2809質粒DNA(10μg)作為引發(fā)方案效率較低。此外，在用MF59配制的5μg E1E2809蛋白質單劑量激發(fā)后，三劑量PLG/CTAB/E1E2809DNA(10μg)與兩劑量PLG/CTAB/E1E2809DNA(10μg)的能力相當(圖5)。
如文中所示，100μg劑量的E1E2809質粒能在小鼠中誘導了可檢測的滴度。然而，吸附有E1E2809DNA的陽離子PLG微粒明顯更強有力并且與MF59輔助的重組E1E2809蛋白質免疫接種誘導的應答相當。這與在小鼠中使用HCV E2質粒的早先研究相反(Song等.，J.Virol.(2000)742020-2025)。在那項研究中，質粒DNA即使在高劑量(100μg)也未能誘導可檢測的抗體應答并且需要蛋白質加強劑量來誘導血清轉變。雖然本結果與早先吸附在PLG微粒上的HIV質粒的數(shù)據(jù)一致(O′Hagan等.，J.viral.(2001)759037-9043)，本發(fā)明使用的表達自質粒的E1E2809抗原與早先評價的與PLG結合的抗原極為不同。早先評價的env質粒(Briones等.，Pharm.Res.(2001)8709-712；O′Hagan等.，J.Virol.(2001)59037-9043)為在哺乳動物細胞中高水平表達和最優(yōu)化地分泌抗原而最優(yōu)化的密碼子(Widera等.，J.Immunol.(2000)1644635-4640)，而早先評價的gag質粒(Singh等.，Proc.Natl.Acad.Sci.美國(2000)97811-816；O′Hagan等.，J.Immunol.(2001)759037-9043)也使密碼子最優(yōu)化并可有效地從細胞分泌抗原(ZurMegede等.，J.Virol.(2000)742628-2635)。相反，現(xiàn)在的研究中使用的E1E2809質粒設計為在胞內(nèi)產(chǎn)生抗原(參見，例如國際公布號98/50556)。因此，現(xiàn)在的研究中意外地觀察到PLG微粒能誘導對抗原增強的抗體應答，而該抗原未設計為從細胞中分泌。
在第三項小鼠研究中，研究了在用MF59佐劑的重組E1E2809蛋白質激發(fā)后E1E2809質粒DNA對PLG/CTAB/E1E2809DNA引發(fā)強有力的抗體應答的能力。雖然E1E2809質粒DNA能通過蛋白質引發(fā)激發(fā)應答，但是即使單用三劑量E1E2809質粒DNA(10μg)不能引起初始應答。相反，兩劑量PLG/CTAB/E1E2809DNA(10μg)誘導了強有力的血清抗體應答。此外，PLG/CTAB/E1E2809DNA也比單用E1E2809質粒DNA更有效地引發(fā)對蛋白質的激發(fā)應答。另外，出乎意料地觀察到了蛋白質激發(fā)之后三劑量PLG/CTAB/E1E2809DNA與兩劑量是相當?shù)?。在早先的幾種情況中，DNA表現(xiàn)出不能有效地誘導強有力的抗體應答，但是通過蛋白質激發(fā)顯著增強了應答。
實施例2使用吸附到陽離子微粒上的E1E2 DNA免疫接種恒河猴基于以上積極的結果，進行了以下靈長類研究。每組3只恒河猴用PLG/CTAB/E1E2809DNA(1mg)或MF59配制的50μg E1E2809蛋白質于0、4、8和24周免疫接種。此外，所有的動物在64周用MF59配制的40μg E1E2809蛋白質激發(fā)(參見，表2)。

表2.用PLG/CTAB/E1E2809DNA或MF59配制的E1E2809重組蛋白質免疫接種兩組(每組3只恒河猴)的免疫接種方案。
在上述方案之后，測量恒河猴中針對HCV E1E2的抗體應答。唯一的區(qū)別在于山羊抗-恒河猴(Southern Biotech Association，Inc.)用作二抗。
在麻醉動物的條件下從股靜脈抽取外周血。在Ficoll-Hypaque梯度離心后得到PBMC并以5×106細胞/孔培養(yǎng)在24-孔平皿中。這些細胞中，1×106個細胞于37℃用10μM肽合并物(由單個肽組成)敏化1小時，洗滌并加入補加了10ng/ml IL-7(R&D Systems，Minneapolis，MN)的2ml培養(yǎng)基(RPMI 1640，10％熱滅活FBS和1％抗生素)中剩余未處理的4×106個PBMC中。48小時后，向培養(yǎng)物中加入含有5％(終濃度)IL2的上清液(無PHA的T-STIM，Becton Dickinson Biosciences-Discovery Labware，San Jose，CA)和50U/ml(終濃度)rIL-2。每3-4天向培養(yǎng)物中加料。培養(yǎng)10天后，按照生產(chǎn)商的建議用結合到磁性珠上的抗-CD8 Abs(Dynal，Oslo，挪威)分離CD8+T細胞。純化的CD8+細胞(流式細胞術測定的＞93％純)在測定細胞毒性活性之前再培養(yǎng)2-3天。使用皰疹病毒papio生產(chǎn)細胞系S394的上清液從每只動物中得到B-LCL。
在標準51Cr釋放測定中評價細胞毒性活性。自身B-LCL與9.25mg/ml肽和50mCi51Cr孵育1.5小時，洗滌三次并以5×103個細胞/孔涂布于96-孔板上。CD8+T細胞以三份效應物對靶(E∶T)細胞的比例一式兩份涂布。效應物和靶細胞在每孔有3.75×105個未標記靶細胞的條件下一起孵育4小時，存在未標記的靶細胞是為使B-LCL被皰疹病毒papio和/或外源性泡沫病毒特異性CTL裂解最小。上清液(50ml)轉移至Lumaplates(PackardBioscience，Meriden，CT)并用Wallac Microbeta 1450閃爍儀(Perkin Elmer，Boston，MA)測量放射性。特異性裂解的百分率以100×[(實驗釋放的平均值-自發(fā)釋放的平均值)/(最大釋放的平均值-自發(fā)釋放的平均值)]計算。當兩個最高的E∶T細胞比例的特異性裂解百分率大于或等于對照靶細胞的裂解百分率加上10個百分率時，CTL應答給予正分。
所有3只用MF59配制的E1E2809蛋白質免疫的恒河猴在第二次免疫接種兩周后表現(xiàn)出血清IgG應答，該應答用第三次免疫接種激發(fā)。用PLG/CTAB/E1E2809DNA免疫的3只恒河猴中的兩只在第二次免疫接種兩周后表現(xiàn)出應答，在第三次免疫接種后所有3只動物均表現(xiàn)出應答。因此，在接受第三劑量后，用PLG/CTAB/E1E2809DNA免疫的所有3只恒河猴均實現(xiàn)了血清轉化。雖然第四劑量PLG/CTAB/E1E2809DNA之后在所有的動物中均觀察到激發(fā)，沒有證據(jù)表明第三劑量激發(fā)了應答的兩只動物(表3)。這說明，第三劑量DNA間隔第二劑量太近以至于未能獲得有效的激發(fā)。第三劑量和第四劑量之間有較長的間隔，并且在第四劑量之后實現(xiàn)激發(fā)。但是，在每次免疫接種后，PLG/CTAB/E1E2809DNA誘導的IgG水平低于MF59配制的E1E2809蛋白質誘導的應答。然而，單劑量E1E2809蛋白質在先用PLG/CTAB/E1E2809DNA免疫過的恒河猴中誘導了極好的激發(fā)，而在先用蛋白質免疫四次的動物中使用一劑量蛋白質未誘導類似的激發(fā)水平。因此，用單劑量MF59配制的E1E2809蛋白質激發(fā)物后，單用MF59配制的蛋白質或用PLG/CTAB/E1E2809DNA免疫的各組在五次免疫接種后，均獲得了相當?shù)难蹇贵w應答。
用PLG/CTAB/E1E2809DNA第四次免疫接種兩周后，在所有動物中評價來自PBMC的CTL應答。3只用PLG/CTAB/E1E2809DNA免疫的動物中的1只(BB227)表現(xiàn)出肽特異性CTL應答(表4)。該動物(BB227)是抗體應答最弱的并在第三劑量PLG/CTAB/E1E2809DNA之后僅有微弱的血清轉化。
總而言之，PLG/CTAB/E1E2809DNA微粒在三次免疫接種后在3/3只動物中誘導了血清轉化，并在第四劑量后激發(fā)了應答。雖然在第三次免疫接種后對DNA的應答激發(fā)小，第三劑量確實在1只剩余的未應答動物中誘導了血清轉化。雖然用PLG/CTAB/E1E2809DNA誘導的血清IgG應答明顯低于用MF59配制的重組E1E2809蛋白質誘導的應答，考慮到早先DNA疫苗即使大劑量多次施用后在靈長類中誘導抗體應答的低效率(Gurunathan等.，Ann.Rev.Immunol.(2000)18927-974)，PLG/CTAB/E1E2809DNA能在恒河猴中誘導血清轉化是令人震驚且鼓舞的。
雖然單用PLG/CTAB/E1E2809DNA不能誘導與用MF59配制的E1E2809蛋白質免疫接種相當?shù)难錓gG應答，但是單劑量E1E2蛋白質激發(fā)在PLG/CTAB/E1E2809DNA-免疫的恒河猴中顯著提高了抗體應答。使用單劑量MF59配制的重組E1E2809蛋白質激發(fā)后，使用PLG/CTAB/E1E2809DNA的組具有與僅使用5次MF59配制的E1E2809蛋白質免疫的恒河猴相當?shù)难錓gG滴度。既然E1E2809作為胞內(nèi)抗原性復合物產(chǎn)生(Heile等.，J.Virol.(2000)746885)，這就難于在一般HCV疫苗所需的水平生產(chǎn)為重組蛋白質。所以，PLG/CTAB/E1E2809DNA引發(fā)可用單劑量MF59配制的E1E2蛋白質激發(fā)的抗-E1E2應答的能力為疫苗開發(fā)提供了蛋白質節(jié)省劑量(dose-sparing)蛋白質選擇。此外，DNA疫苗可引發(fā)在針對HCV的保護性免疫應答中重要的CTL應答?？傮w上，基于蛋白質的疫苗在非人靈長類和人中不能有效地誘導CTL應答(Singh和O′Hagan，Nat.Biotechnol.(1999)171075-1081)。3只用PLG/CTAB/E1E2809DNA免疫的恒河猴中的1只在第四次免疫接種后檢測到CTL應答。雖然CTL未在E1E2809/MF59免疫的動物中進行評價，本發(fā)明人對該佐劑具有足夠的經(jīng)驗確信不會誘導CTL應答。

表3.用PLG/CTAB/E1E2809DNA或MF59配制的E1E2809蛋白質免疫的恒河猴中血清IgG抗體應答。

表4.第四次免疫接種后，用PLG/CTAB/E1E2809DNA免疫的恒河猴中的細胞毒性T淋巴細胞應答。不同效應物/靶細胞比例的特異性裂解百分率。
實施例3使用吸附到陽離子微粒上的E1E2 DNA免疫黑猩猩如表5和6所示，用3mg(每股)的以下所示質?；旌衔镌诿抗缮厦庖吒鹘M黑猩猩，PLG/CTAB/E1E2809DNA、PLG/CTAB/HCV NS34a、PLG/CTAB/HCV NS4aNS4b和PLG/CTAB/HCV NS5。對照動物不給予疫苗。在第六個月，用100CID的HCV-H毒株靜脈內(nèi)激發(fā)黑猩猩。
如表中所示，PLG DNA引發(fā)了抗-E1E2抗體。此外，激發(fā)后，接種疫苗的動物得了病毒血癥，但施用PLG/CTAB/E1E2809DNA的4/5動物最終恢復了并且未發(fā)展為攜帶狀態(tài)，這在人中伴隨有主要HCV病原作用。相反，用HCV-H激發(fā)的總共14只對照動物中僅有6只能清除病毒感染。這些數(shù)據(jù)表明吸附到陽離子微粒上的E1E2DNA表現(xiàn)出預防作用。
此外，有證據(jù)表明激發(fā)后HCV-特異性T細胞比對照組更快地流入施用PLG/CTAB/E1E2809DNA的動物的肝臟，這進一步證實了吸附到陽離子微粒上的E1E2DNA的效力。
因此，本發(fā)明描述了E1E2809DNA組合物及其使用方法。雖然描述了主題發(fā)明的優(yōu)選實施方案的一些細節(jié)，應該理解的是，在不脫離權利要求限定的本發(fā)明精神和范圍的情況下可做出明顯的變動。
表5針對CHO E1/E2的抗體滴度的Elisa


表6對CHO E1/E2的抗體滴度的Elisa


權利要求
1.一種基本上由藥學上可接受的賦形劑和吸附于陽離子微粒上的多核苷酸組成的組合物，其中，所述多核苷酸含有編碼丙型肝炎病毒(HCV)免疫原的編碼序列，該編碼序列操作性地連接于指導所述編碼序列在體內(nèi)轉錄和翻譯的控制元件，并且其中所述HCV免疫原是具有毗連氨基酸序列的免疫原性HCV E1E2復合物，該毗連氨基酸序列與圖2A-2C中192-809位所描述的毗連氨基酸序列具有至少80％的序列相同性，條件是所述多核苷酸不編碼除HCV E1E2復合物以外的HCV免疫原。
2.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述HCV E1E2復合物由圖2A-2C中192-809位所描述的氨基酸序列組成。
3.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述陽離子微粒由選自下組的聚合物形成聚(α-羥酸)、聚羥基丁酸、聚己內(nèi)酯、聚原酸酯和聚酐。
4.如權利要求3所述的組合物，其特征在于，所述陽離子微粒由選自下組的聚(α-羥酸)形成聚(L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯)和聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)。
5.如權利要求4所述的組合物，其特征在于，所述陽離子微粒由聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)形成。
6.一種基本上由以下物質組成的組合物(a)藥學上可接受的賦形劑；和(b)吸附于由聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)所形成的陽離子微粒上的多核苷酸，其中所述多核苷酸含有編碼丙型肝炎病毒(HCV)免疫原的編碼序列，該編碼序列操作性地連接于指導所述編碼序列在體內(nèi)轉錄和翻譯的控制元件，并且其中所述HCV免疫原是由圖2A-2C中192-809位所描述的氨基酸序列組成的HCV E1E2復合物，條件是所述多核苷酸不編碼除HCV E1E2復合物以外的HCV免疫原。
7.一種在脊椎動物受試者中刺激免疫應答的方法，該方法包括給予受試者治療有效量的基本上由藥學上可接受的賦形劑和吸附于陽離子微粒上的多核苷酸組成的第一組合物，其中，所述多核苷酸含有編碼丙型肝炎病毒(HCV)免疫原的編碼序列，該編碼序列操作性地連接于指導所述編碼序列在體內(nèi)轉錄和翻譯的控制元件，并且其中所述HCV免疫原是具有毗連氨基酸序列的免疫原性HCV E1E2復合物，該毗連氨基酸序列與圖2A-2C中192-809位所描述的毗連氨基酸序列具有至少80％的序列相同性，條件是所述多核苷酸不編碼除HCV E1E2復合物以外的HCV免疫原，其中所述HCVE1E2復合物在體內(nèi)表達以引發(fā)免疫應答。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述HCV E1E2復合物由圖2A-2C中192-809位所描述的氨基酸序列組成。
9.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述陽離子微粒由選自下組的聚合物形成聚(α-羥酸)、聚羥基丁酸、聚己內(nèi)酯、聚原酸酯和聚酐。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述陽離子微粒由選自下組的聚(α-羥酸)形成聚(L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯)和聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述陽離子微粒由聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)形成。
12.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法還包括給予受試者治療有效量的第二組合物，其中第二組合物含有免疫原性HCV多肽和藥學上可接受的賦形劑。
13.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述第二組合物在第一組合物之后施用。
14.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述第二組合物中的所述免疫原性HCV多肽是具有毗連氨基酸序列的免疫原性HCV E1E2復合物，該毗連氨基酸序列與圖2A-2C中192-809位所描述的毗連氨基酸序列具有至少80％的序列相同性。
15.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述HCV E1E2復合物由圖2A-2C中192-809位所描述的氨基酸序列組成。
16.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述第二組合物還含有佐劑。
17.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述佐劑是能增強對免疫原性HCV多肽的免疫應答的亞微米水包油乳劑，其中該亞微米水包油乳劑含有(i)可代謝的油，其中油的量占總體積的1％到12％；和(ii)乳化劑，其中乳化劑占0.01到1重量％(w/v)并含有聚氧乙烯失水山梨糖醇單酯、二酯或三酯和/或失水山梨糖醇單酯、二酯或三酯，其中油和乳化劑以具有油滴的水包油乳劑形式存在，幾乎所有油滴的直徑約為100nm到小于1微米。
18.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述亞微米水包油乳劑含有4-5％w/v的角鯊烯、0.25-1.0％w/v的聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯和/或0.25-1.0％失水山梨糖醇三油酸酯，并任選含有N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-羥基磷?；?-乙胺(MTP-PE)。
19.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述亞微米水包油乳劑基本上由約5體積％的角鯊烯、和一種或多種選自聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯和失水山梨糖醇三油酸酯的乳化劑組成，其中乳化劑的總量約為1重量％(w/v)。
20.如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述一種或多種乳化劑是聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯和失水山梨糖醇三油酸酯，且聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯和失水山梨糖醇三油酸酯的總量約為1重量％(w/v)。
21.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述第二組合物還含有CpG寡核苷酸。
22.一種在脊椎動物受試者中刺激免疫應答的方法，該方法包括(a)給予受試者治療有效量的基本上由吸附于陽離子微粒上的多核苷酸組成的第一組合物，該微粒由聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)形成，其中所述多核苷酸含有編碼丙型肝炎病毒(HCV)免疫原的編碼序列，該編碼序列操作性地連接于指導所述編碼序列在體內(nèi)轉錄和翻譯的控制元件，并且其中所述HCV免疫原是由圖2A-2C中192-809位所描述的氨基酸序列組成的免疫原性HCV E1E2復合物，條件是所述多核苷酸不編碼除HCV E1E2復合物以外的HCV免疫原，且其中所述HCV E1E2復合物在體內(nèi)表達；和(b)給予受試者治療有效量的第二組合物以引發(fā)受試者的免疫應答，其中所述第二組合物含有(i)由圖2A-2C中192-809位所描述的氨基酸序列組成的免疫原性HCV E1E2復合物，(ii)佐劑，和(iii)藥學上可接受的賦形劑。
23.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述佐劑是能增強對第二組合物中的免疫原性HCV E1E2復合物的免疫應答的亞微米水包油乳劑，其中該亞微米水包油乳劑含有(i)可代謝的油，其中油的量占總體積的1％到12％，和(ii)乳化劑，其中乳化劑占0.01到1重量％(w/v)并含有聚氧乙烯失水山梨糖醇單酯、二酯或三酯和/或失水山梨糖醇單酯、二酯或三酯，其中油和乳化劑以具有油滴的水包油乳劑形式存在，幾乎所有油滴的直徑約為100nm到小于1微米。
24.如權利要求23所述方法，其特征在于，所述亞微米水包油乳劑含有4-5％w/v的角鯊烯、0.25-1.0％w/v聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯和/或0.25-1.0％失水山梨糖醇三油酸酯，并任選含有N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-羥基磷?；?-乙胺(MTP-PE)。
25.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述亞微米水包油乳劑基本上由約5體積％角鯊烯和一種或多種選自聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯和失水山梨糖醇三油酸酯的乳化劑組成，其中乳化劑的總量約為1重量％(w/v)。
26.如權利要求25所述的方法，其特征在于，所述一種或多種乳化劑是聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯和失水山梨糖醇三油酸酯，且聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯和失水山梨糖醇三油酸酯的總量約為1重量％(w/v)。
27.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述第二組合物還含有CpG寡核苷酸。
28.一種制備組合物的方法，所述方法包含混合藥學上可接受的賦形劑和吸附于陽離子微粒上的多核苷酸，其中所述多核苷酸含有編碼丙型肝炎病毒(HCV)免疫原的編碼序列，該編碼序列操作性地連接于指導所述編碼序列在體內(nèi)轉錄和翻譯的控制元件，并且其中所述HCV免疫原是具有毗連氨基酸序列的免疫原性HCV E1E2復合物，而該毗連氨基酸序列與圖2A-2C中192-809位所描述的毗連氨基酸序列具有至少80％的序列相同性，條件是所述多核苷酸不編碼除HCV E1E2復合物以外的HCV免疫原。
29.如權利要求1-6中任一項所述的組合物在在脊椎動物受試者中刺激免疫應答的方法中的用途。
全文摘要
本發(fā)明描述了免疫原性HCVE1E文檔編號A61K47/48GK1809584SQ200480017176
公開日2006年7月26日 申請日期2004年4月23日 優(yōu)先權日2003年4月25日
發(fā)明者D·歐哈根, M·霍頓, M·辛格 申請人:希龍公司