專利名稱：外用組成物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及皮膚外用劑，更詳細地說，涉及對皮膚具有顯著美白效果如可防止日曬后產(chǎn)生色素沉著等的化妝品、醫(yī)藥外用品等皮膚外用劑。
背景技術：
在醫(yī)藥品、醫(yī)藥外用品(如軟膏劑)及化妝品(如乳液、雪花膏、化妝水、面膜、凝膠、粉底)等皮膚外用劑中，為了賦予其特定的藥效，通常添加藥效成分。
例如，為了防止日曬等引起的皮膚變黑和黑色素沉積過多產(chǎn)生的褐斑、雀斑等現(xiàn)象，可添加諸如異極礦等或L-抗壞血酸類、對苯二酚糖苷、肉桂醛、胎盤素等美白成分。
其中，抗壞血酸類作為穩(wěn)定性高、可促進膠原蛋白合成、清除活性氧、抑制端粒基因縮短、誘生皮膚組織的極佳美白因子，被廣泛地應用于醫(yī)藥品、化妝品、食品、飼料等中。另一方面，由于一般的L-抗壞血酸衍生物易氧化分解，在制劑中不穩(wěn)定，因此不能直接使用。以其穩(wěn)定化為目的的提案有至少含有一種堿離子水中的抗壞血酸衍生物或其鹽的組成物(專利文獻1)、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽(專利文獻2)、α-糖基-L-抗壞血酸(專利文獻3、專利文獻4)。但其作用、效果并不另人滿意。
即存在這樣的問題雖然確保了其穩(wěn)定性，但尤其當僅使用這些抗壞血酸類及其衍生物的鹽類時，其吸收性不好。
還存在這樣的問題雖然采用諸如通過電排斥力使離子性物質(zhì)向皮膚深部滲透的離子導入法(離子導入儀)、空穴抑制型超聲波導入法(超聲波導入儀)、IPL(閃頻可見光)等使抗壞血酸衍生物易于滲透進入皮膚的方法，但需要特殊的儀器。
另一方面，外用劑組成物中含有的經(jīng)皮吸收促進劑已知有如專利文獻5中所示的二甲基亞砜、二甲基乙酰胺、甲基癸基亞砜等，其他還有如專利文獻6中所示的與低級烷基酰胺形成的組合物(如二甲基乙酰胺與乙醇、異丙醇、棕櫚酸異丙酯形成的組合物)、如專利文獻7中所示的2-吡咯烷酮與適當?shù)挠托晕镔|(zhì)形成的組合物，上述油性物質(zhì)如直鏈脂肪酸與碳原子數(shù)為2～6的醇形成的酯。但這些公知的經(jīng)皮吸收促進劑均對皮膚有刺激性，有可能引起皮膚發(fā)紅和水腫等。
專利文獻1日本特開2000-351905號公報專利文獻2日本特開2000-143485號公報專利文獻3日本特開2002-53450號公報專利文獻4日本特開2002-121115號公報專利文獻5美國專利第3551554號說明書專利文獻6美國專利第3472431號說明書專利文獻7美國專利第4017641號說明書發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供皮膚滲透性好的皮膚外用組成物，其含有穩(wěn)定性好、在生物體內(nèi)可被持續(xù)利用、抗氧化作用強、皮膚刺激性小的抗壞血酸衍生物。
本發(fā)明者們對上述以往的技術問題進行了種種研究后，成功研制出新型化合物2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸、其鹽及其酯(以下也簡稱為本發(fā)明的抗壞血酸衍生物)，發(fā)現(xiàn)其穩(wěn)定性好、在生物體內(nèi)可被持續(xù)利用、抗氧化作用強、皮膚刺激性小。本發(fā)明者們還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明抗壞血酸衍生物可用作化妝品或醫(yī)藥外用品等皮膚外用劑。此外，為了改善本發(fā)明抗壞血酸衍生物作為皮膚外用劑使用時的皮膚滲透性，本發(fā)明者們進行了種種研究，意外發(fā)現(xiàn)本發(fā)明抗壞血酸衍生物與曲霉或其處理物組合使用時，其皮膚滲透性得到顯著改善。即發(fā)現(xiàn)了曲霉或其處理物可提高本發(fā)明抗壞血酸的皮膚滲透性。皮膚由最外層約0.01mm的角質(zhì)層、角質(zhì)層下約0.1mm的表皮及表皮下約0.1mm～1.3mm的真皮構(gòu)成，即使將抗壞血酸或抗壞血酸衍生物用于皮膚，其向皮膚組織的滲透轉(zhuǎn)移也不一定好。但是，如果將本發(fā)明抗壞血酸衍生物與曲霉或其處理物的組合用于皮膚表面時，本發(fā)明抗壞血酸衍生物被迅速吸收至真皮層，在真皮層被緩慢分解成維生素C并長時間釋放出維生素C，生物體內(nèi)的利用率高。本發(fā)明者們還研究了本發(fā)明新型化合物2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與2-O-(α-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸相比其穩(wěn)定性提高了，且在生物體內(nèi)可被持續(xù)利用等，作為前體維生素C極為有用。
即，本發(fā)明涉及(1)一種外用組成物，其特征在于，它含有式(I)所示的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸或其對人體安全的鹽或酯和曲霉或其處理物；[化1] (2)上述(1)所述的組成物，其特征在于，其為化妝品或醫(yī)藥外用品；(3)上述(1)或(2)所述的組成物，其特征在于，上述(1)中式(I)所示的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸是從植物體提取出來的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸；(4)上述(3)所述的組成物，其特征在于，植物體為茄科植物；(5)上述(3)或(4)所述的組成物，其植物體為枸杞、枸杞的鮮果或干燥果實；(6)上述(1)～(5)中任意一項所述的組成物，其特征在于，曲霉屬于曲霉屬(Aspergillus)；(7)上述(1)～(6)中任意一項所述的組成物，其特征在于，曲霉屬于米曲霉(Aspergillus oryzae)、白曲霉(Aspergillus kawachii)或黑曲霉(Aspergillus awamori)；(8)一種配套組合物，其特征在于，含有上述(1)中式(I)所示的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸或其對人體安全的鹽或酯的組成物與含有曲霉或其處理物的組成物的配套組合物；(9)一種組成物，其特征在于，含有上述(8)所述配套組合物用的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸或其對人體安全的鹽或酯的組成物；(10)一種皮膚滲透增強劑，其特征在于，其為以含有曲霉或其處理物為特征的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸或其對人體安全的鹽或酯皮膚滲透增強劑。
本發(fā)明可提供皮膚滲透性好的皮膚外用組成物，其含有穩(wěn)定性好、在生物體內(nèi)可被持續(xù)利用、抗氧化作用強、皮膚刺激性小的抗壞血酸衍生物。


圖1顯示2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸對紫外線B波(UVB)照射引起的人皮膚表皮角質(zhì)形成細胞(HaCaT)死亡的保護作用。
圖2顯示2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸對人皮膚角質(zhì)形成細胞的細胞內(nèi)抗壞血酸濃度的影響。
圖3顯示2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸對人真皮成纖維細胞(NHDF)膠原蛋白合成的促進作用。
具體實施例方式
本發(fā)明中使用的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的制造方法有從植物或其處理物提取的方法、化學合成或酶法等。從植物提取的方法是從茄科植物或其處理物，特別是從枸杞、枸杞的鮮果或干燥果實提取。下面舉例說明本發(fā)明抗壞血酸衍生物及含有本發(fā)明抗壞血酸衍生物的組成物的優(yōu)選制造方法。
本發(fā)明2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的合成中間體為2-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸。該中間體為2-O-(2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸可按下述步驟合成。即，按文獻已知的方法(J.Med.Chem.，31，793，1988)，將市售5，6-O-異亞丙基抗壞血酸的3位羥基選擇性芐醚化，得到3-O-芐基-5，6-O-異亞丙基抗壞血酸。將該3-O-芐基化合物作為配基，按一般的糖基化反應使其β-糖苷化，可得2-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)-3-O-芐基-5，6-O-異亞丙基抗壞血酸。例如，將(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)碳酸酯(小村啓，東京工業(yè)大學博士論文，1977年)與3-O-芐基化合物同時在非極性溶劑中或無溶劑存在下于100℃～200℃溫度下加熱制得。碳酸酯如烷基、鹵代烷基、或可取代的芳基碳酸酯?；蛘?，可通過(2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃型葡萄糖基)鹵化物在三氯甲烷、二氯甲烷等鹵代烷溶劑或苯、甲苯等芳香烴溶劑中，在汞鹽或銀鹽等存在下，加脫水劑反應制得。(Lodd’s Chemistry of CarbonCompounds IF，320，1967，Elsvier)2-O-(2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃型葡萄糖基)-3-O-芐基-5，6-O-異亞丙基抗壞血酸的異亞丙基可在酸催化劑下水解除去。例如，在30％～80％的乙酸水溶液中，于40℃～100℃下加熱?；蛟诒?、甲乙酮等中，在對甲苯磺酸的存在下，以室溫至回流溫度加熱?；蚱渲屑尤胨蛊溥M行同樣的反應。
2-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)-3-O-芐基抗壞血酸的芐基可通過一般的氫解作用除去。例如，在乙酸、乙醇等質(zhì)子性極性溶劑中，或在苯、甲苯、乙酸乙酯等非極性溶劑中，以載鈀炭或鈀黑、鉑炭、鉑黑等為催化劑，在氫存在下可進行脫芐基化。
上述脫保護基反應的順序也可以倒過來。即，可先將2-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)-3-O-芐基-5，6-O-異亞丙基抗壞血酸脫芐基后，再在酸催化劑的存在下將得到的2-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)-5，6-O-異亞丙基抗壞血酸脫異亞丙基。
這樣，就可制得上述中間體2-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸。
下面說明通過上述中間體來化學合成2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的方法。
將2-O-(2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的酰基進行堿水解，可得到2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸。堿可用苛性鈉、苛性鉀等的水溶液，或碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鉀、碳酸氫鈉等碳酸鹽水溶液，或甲醇鈉等金屬醇化物。上述這些溶液中，為了使原料2-O-(2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸溶解，也可采用甲醇、乙醇等醇類混合溶液。最適反應溫度為0℃至室溫。反應液用鹽酸、硫酸或陽離子交換樹脂等中和。用鹽酸或硫酸等中和時需要除去生成的鹽，用陽離子交換樹脂中和時為了吸附鈉離子和鉀離子等不需要進行脫鹽操作。中和后的反應液經(jīng)冷凍干燥或減壓濃縮，可制得目標化合物。還可以根據(jù)目的，用柱色譜精制。
下面說明從枸杞中提取含2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的提取物的制造方法。
將枸杞的鮮果或干燥果實(枸杞子)直接或粉碎后浸漬在熱水或有水乙醇中，經(jīng)固液分離得到的提取液通過減壓濃縮或冷凍干燥或噴霧干燥，可得到含有2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的提取物。作為優(yōu)選，浸漬時乙醇濃度為10％～95％，浸漬天數(shù)為3～7天。枸杞子提取物中2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的含量為0.86％～1.2％，若按下述方法制造，可得到含量更高的組成物。即，將枸杞子提取物溶于蒸餾水或，以原料的5～50倍量，優(yōu)選為原料的8～10倍量的蒸餾水將浸漬液稀釋后，使其通過Dow化學公司生產(chǎn)的商品名為Dowex 1-X8或Rhom&Hass公司生產(chǎn)的商品名為Amberlite IRA-400等強堿性陰離子交換樹脂后，將該物質(zhì)吸附。充分水洗后，用乙酸進行階段洗脫或濃度梯度洗脫，得到含該物質(zhì)的組分。該組分經(jīng)減壓濃縮或冷凍干燥除去乙酸，可制得2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的含量約為30％～50％的組成物。
下面說明通過酶法制造含有2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的組成物的方法。
對市售酶制劑的生成進行了努力研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)纖維素酶「小野塚」、泛纖維素酶BR(養(yǎng)樂多藥品工業(yè))、纖落新(阪急共榮物產(chǎn))、纖維素酶(Sigma)、β-葡萄糖苷酶(東洋紡)、β-葡萄糖苷酶(Nakalai tesc)酶制劑具有β-葡萄糖基轉(zhuǎn)移活性。本發(fā)明中使用的糖轉(zhuǎn)移酶只要是作用于含有β-葡萄糖基的化合物和含有抗壞血酸的溶液，通過糖轉(zhuǎn)移反應合成2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的糖轉(zhuǎn)移酶即可，其來源、種類不受限定，但從收率上看，優(yōu)選為來自Trichoderma屬的纖維素酶、來自杏仁的β-葡萄糖苷酶。
在轉(zhuǎn)移酶反應中，纖維素二糖及抗壞血酸的濃度盡量高，優(yōu)選為0.3M及0.2M。纖維素二糖作為酶基質(zhì)，也可將其他含有β-葡萄糖基的化合物如纖維素、羧甲基纖維素等高分子葡聚糖與適當?shù)乃饷附M合后作為酶基質(zhì)使用。若將各酶固定化形成酶反應器，可高效生產(chǎn)2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸。另一方面，作為轉(zhuǎn)移反應受體的抗壞血酸，從反應中的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)移收率上看，以游離的抗壞血酸作為優(yōu)選，但抗壞血酸的堿金屬鹽或堿土金屬鹽等抗壞血酸鹽或其混合物也可以。還發(fā)現(xiàn)游離異抗壞血酸及異抗壞血酸鹽也同樣可作為轉(zhuǎn)移反應的受體。因此，糖轉(zhuǎn)移反應中的抗壞血酸及抗壞血酸衍生物可根據(jù)目的來使用，但通常不僅使用游離抗壞血酸，根據(jù)需要可采用抗壞血酸鈉、抗壞血酸鈣等。
酶反應在pH值為2～8下進行，考慮到酶的最適pH值，優(yōu)選為pH值保持在4～6。反應溫度為20℃～60℃，考慮到酶的穩(wěn)定性及最適溫度，優(yōu)選為溫度控制在30℃～40℃。酶添加量優(yōu)選為每克纖維素二糖20～400個酶單位(1個單位是指1分鐘內(nèi)使1μmol對硝基苯酚游離所需要的酶量)。酶可以一次性添加，也可用高效液相色譜法等一邊監(jiān)測反應，一邊分多次添加。還可通過合適的樹脂載體如離子交換樹脂、疏水樹脂等將酶固定化形成酶反應器。反應時間1～4天就足夠，但也可一邊監(jiān)測反應，一邊決定反應終止的時間。
反應終止后，生成的抗壞血酸衍生物可通過膜分離、離子交換柱色譜法、活性炭柱色譜法等一般的分離方法分離。例如可用鍵合了磺酸基的苯乙烯-二乙烯交聯(lián)共聚物樹脂的堿金屬鹽型、堿土金屬鹽型、H+型等強酸性陽離子交換樹脂。市售品有Dow化學公司生產(chǎn)的商品名為Dowex50W×8、Rhom&Hass公司生產(chǎn)的商品名為Amberlite CG-120、三菱化學公司生產(chǎn)的商品名為Diaion SK104等。此時分離出來的未反應抗壞血酸和含有β-葡萄糖基的化合物可再次作為酶反應的原料利用。
此外，為了得到高純度品，可用高效液相色譜法精制。即，通過組合使用糖·有機酸分析用色譜柱和乙酸、三氟乙酸等揮發(fā)性酸，或組合使用ODS色譜柱和升華性甲酸銨、酸性物質(zhì)分析用揮發(fā)性離子對試劑、Di-n-butylamine Acetate(二正丁胺乙酸酯)，可得到該物質(zhì)的純品。天然產(chǎn)物的該物質(zhì)鑒定通過與化學合成的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的質(zhì)量分析或核磁共振光譜等的比較分析來進行。
本發(fā)明抗壞血酸衍生物不僅包括游離的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸，還包括其對人體安全的鹽或酯。鹽的例子具體有鈉鹽、鉀鹽等，酯的例子有乙酸酯、丙酸酯等。鹽或酯可通過各自的游離酸與堿(如氫氧化鈉、氫氧化鉀)反應合成或酰化反應合成，上述均為同領域技術人員所熟知的化學反應。
下面說明本發(fā)明抗壞血酸衍生物的生理活性。
2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸抑制紫外線照射引起的損傷根據(jù)上述方法得到的或化學合成得到的純2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸，與抗壞血酸或2-O-(α-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸相比，在相同濃度下，可顯著抑制因紫外線B波(UVB)照射引起的人皮膚表皮角質(zhì)形成細胞的細胞死亡(HaCaT)。
給無毛小鼠皮膚的一部分照射接近太陽光波長光譜的光(290nm～400nm)，發(fā)現(xiàn)小鼠皮膚含有的各種抗氧化因子中，抗壞血酸(維生素C)減少最多。(Photodermatol Photoimmunol Photomed.，10(5)，183，1994)。而且，豚鼠背部剃毛后，通過涂布外用抗壞血酸或2-O-(α-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸等，可抑制由UVB照射引起的皮膚炎癥，其效果以2-O-(α-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸較好(香料雜志，第25卷，3月版，55頁，1997年)。此外，有報道指出給豬皮膚連日涂布10％抗壞血酸水溶液3天至1周，可減輕紫外線損害(Br.J.Dermatol.，121，247，1992)。
因此，明顯顯示2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸對紫外線照射引起的皮膚炎癥或其他由紫外線損害等的抑制效果比抗壞血酸及2-O-(α-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸等還要好。
此外，在人皮膚角質(zhì)形成細胞的細胞內(nèi)抗壞血酸濃度中，2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的濃度最高且維持時間最長。該2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸使細胞內(nèi)抗壞血酸的濃度維持在高水平，對UVB照射具有細胞保護作用。當然，2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為抗壞血酸，作為前體維生素C發(fā)揮作用。
2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸預防皮膚皺紋和松弛在人皮膚真皮成纖維細胞(NHDF)的膠原蛋白合成中，2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的活性比2-O-(α-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸或抗壞血酸等的活性高。這也可認為是因為細胞內(nèi)抗壞血酸濃度持續(xù)維持在高水平。即，可認為抗壞血酸促進膠原蛋白合成的作用也發(fā)生在皮膚成纖維細胞中，并促進皮膚的再生和修復等。實際上，有報道指出給燙傷患者涂布穩(wěn)定型抗壞血酸之一的抗壞血酸-2-磷酸，可治愈不留疤痕(日本香妝品學會演講摘要，第50頁，1998年)。另一方面，還發(fā)現(xiàn)抗壞血酸可抑制膠原蛋白分解酶或皮膚彈性所必須的彈性蛋白酶的分解酶等(生物抗氧化劑前體維生素C，第63頁，1999年，香料雜志出版社)。上述事實表明2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸具有預防皮膚皺紋和松弛等效果。
2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸活性的美白效果此外，抗壞血酸可阻礙酪氨酸酶來抑制黑色素合成，調(diào)配了2-O-(α-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的雪花膏涂布于人身上后，可抑制紫外線照射引起的色素沉著(香料雜志，第25卷，3月版，第55頁，1997年)，上述事實明顯顯示2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸也同樣具有美白效果，且比2-O-(α-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的美白效果更好。
2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸經(jīng)口攝取時的體內(nèi)動態(tài)使大鼠口服攝取2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸后，在血中檢測出2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸原型，說明其以原型在腸道吸收。另一方面，按上述方法使大鼠口服攝取2-O-(α-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸后，在血中未檢測出原型，說明其吸收時在腸道被完全分解，以抗壞血酸的形式存在于血中(J.Pharmacobio-Dyn.，13，688，1990)。即口服攝取后2-O-(α-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸以抗壞血酸的形式被吸收，在血中有可能被迅速分解。而2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸在血中以原型存在，且以原型向組織轉(zhuǎn)移，其在組織或細胞內(nèi)被活化成抗壞血酸的可能性很高。
從上述的實驗結(jié)果及相關知識可知，2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸及含有2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的組成物是極好的前體維生素C，在皮膚的保護和維持健康的皮膚等方面很有用，可用作皮膚化妝品原料及皮膚保護劑等，還可作為食品，可用作使抗壞血酸高效地向體內(nèi)及組織轉(zhuǎn)移的前體維生素C。
本發(fā)明中使用的曲霉只要是屬于曲霉屬(Aspergillus)的菌就可以，這樣的菌有例如屬于米曲霉(Aspergillus oryzae)、白曲霉(Aspergillus kawachii)或黑曲霉(Aspergillus awamori)的菌、屬于上述菌屬的菌株及其變異株等。曲霉可以是活菌也可以是死菌，但優(yōu)選為活菌。任何曲霉只要是酶沒有失活的就可以。曲霉可以是其本身，也可以是使其營養(yǎng)繁殖的含有曲霉的培養(yǎng)液，還可以是利用曲霉的強淀粉糖化能力制成的曲子。這樣的曲子可以是釀造日本酒中使用的曲子。任何曲霉的處理物只要是曲霉中含有的酶沒失活的就可以。例如，可以是曲霉的干燥物。干燥可以是噴霧干燥也可以是冷凍干燥。將曲霉的液體培養(yǎng)液離心分離，其上清液冷凍干燥，加入水后得到曲霉處理物也可在本發(fā)明中使用。曲霉的處理物還可以是曲霉的提取物。提取物可以是將菌體例如經(jīng)浸漬、粉碎等熟知的方法處理后得到的菌體提取物。將曲霉的菌體用乙醇浸漬滅菌后，向離心分離得到的沉淀部分加入5倍量Mili-Q超純水，粉碎·提取，提取液經(jīng)濃縮可制得曲霉的提取物。上述曲霉或其處理物，可以是市售品，如來自米曲霉(Aspergillus oryzae)的酶制劑(天野酶制品株式會社生產(chǎn)，商品名為Biozyme A)、或由(株)Bioch生產(chǎn)的米曲用曲霉干燥粉末等。
下面說明本發(fā)明的組成物。可作為化妝品或醫(yī)藥外用品使用的本發(fā)明外用組成物用于皮膚時，其含有2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸或其對人體安全的鹽或酯(以下有時簡稱為成分(1))和曲霉或其處理物(以下有時簡稱為成分(2))。但是，上述成分(1)和成分(2)在混合狀態(tài)下長期保存時，成分(1)有時會發(fā)生分解反應，因此，含有成分(1)的組成物和含有成分(2)的組成物可以分開保存，用于皮膚時再將兩組成物抹在皮膚表面。因此，本發(fā)明不僅包括同時含有成分(1)和成分(2)的組成物，還包括含有成分(1)的組成物與含有成分(2)的組成物的配套組合物或組合物。本發(fā)明還包括促進成分(1)皮膚滲透的含有成分(2)的組成物。使用時，本發(fā)明的制劑可以是含有成分(1)和成分(2)的制劑，也可以是在含有成分(2)的組成物中調(diào)配成分(1)或含有成分(1)的組成物而制成的制劑。本發(fā)明的制劑即含有成分(1)和成分(2)的制劑，或含有成分(1)的組成物與含有成分(2)的組成物的配套組合物，或含有成分(1)的組成物，一般為外用組成物，可以是化妝品、醫(yī)藥外用品，也可以是醫(yī)藥品。作為化妝品的例子有化妝水、乳液、精華素等基礎化妝品、粉底等粉飾類化妝品、頭發(fā)用化妝品、清潔用化妝品、口唇用化妝品、口腔用化妝品、指甲用化妝品、眼線用化妝品、浴用化妝品、防曬化妝品等。作為醫(yī)藥品或醫(yī)藥外用品的例子有干眼用滴眼劑，其他還有藥用化妝品、育發(fā)劑等下面說明本發(fā)明的優(yōu)選方式。
本發(fā)明的組成物，即含有成分(1)和成分(2)的組成物或含有成分(1)的組成物和含有成分(2)的組成物在使用時混合得到的組成物中，對2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的含量無特別限定，范圍較廣，但一般為組成物總重量的0.1重量％～30重量％，優(yōu)選為0.5重量％～10重量％。組成物中曲霉或其處理物的含量不能一概而論，一般為0.2重量％～100重量％。
在本發(fā)明含有成分(1)的組成物中，除成分(1)外，還可以含有調(diào)配于一般化妝品原料中的各種著色劑、油質(zhì)原料、氟化物、樹脂、粘度調(diào)節(jié)劑、防腐殺菌劑、香料、其他保濕劑、鹽類、醇類、抗氧化劑、緩沖劑、中和劑、pH調(diào)節(jié)劑、驅(qū)蟲劑等成分。
作為著色劑，在一般化妝品原料中使用的著色劑均可使用，與其形狀(球狀、棒狀、針狀、板狀、不規(guī)則狀、鱗片狀、紡錘狀等)、粒徑(煙霧狀、微粒子、顏料級等)、粒子結(jié)構(gòu)(多孔性、無孔性等)等無關，著色劑的例子有無機粉體、有機粉體、表面活性劑金屬鹽粉體、有色顏料、珠光顏料、金屬粉末顏料、天然色素等，具體地說，無機粉體的例子有顏料級氧化鈦、氧化鋯、顏料級氧化鋅、氧化鈰、氧化鎂、硫酸鋇、硫酸鈣、硫酸鎂、碳酸鈣、碳酸鎂、滑石粉、云母、高嶺土、絹云母、白云母、合成云母、金云母、紅云母、黑云母、鋰云母、硅酸、硅酸酐、硅酸鋁、硅酸鎂、硅酸鋁鎂、硅酸鈣、硅酸鋇、硅酸鍶、鎢酸金屬鹽、羥基磷灰石、蛭石、氫氧化鋁(Higilite)、膨潤土、蒙脫石、鋰蒙脫石、沸石、陶瓷粉、磷酸氫鈣、氧化鋁、氫氧化鋁、氮化硼、氮化硼、二氧化硅、微粒子氧化鈦、微粒子氧化鋅、微粒子氧化鈰等，有機粉體的例子有聚酰胺粉、聚酯粉、聚乙烯粉、聚丙烯粉、聚苯乙烯粉、聚氨酯粉、苯代三聚氰二胺粉、聚甲基苯代三聚氰二胺粉、聚四氟乙烯粉、聚甲基丙烯酸甲酯粉、纖維素、絲粉、尼龍粉、尼龍-12、尼龍-6、聚硅氧烷粉、聚硅膠粉、硅膠橡膠球狀粉體、苯乙烯-丙烯酸共聚物、二乙烯苯-苯乙烯共聚物、乙烯樹脂、尿素樹脂、酚樹脂、氟樹脂、硅樹脂、丙烯酸樹脂、三聚氰胺樹脂、環(huán)氧樹脂、聚碳酸酯樹脂、微晶纖維粉體、淀粉粉末、月桂基離胺酸等，表面活性劑金屬鹽粉體(金屬皂)的例子有硬脂酸鋅、硬脂酸鋁、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、肉豆蔻酸鋅、肉豆蔻酸鎂、十六烷基磷酸鋅、十六烷基磷酸鈣、十六烷基磷酸鋅鈉等，有色顏料的例子有氧化鐵、氫氧化鐵、鈦酸鐵的無機紅色顏料、γ-氧化鐵等無機褐色顏料；黃氧化鐵、黃土等無機黃色顏料；黑氧化鐵、碳黑等無機黑色顏料；錳紫、鈷紫等無機紫色顏料；氫氧化鉻、氧化鉻、氧化鈷、鈦酸鈷等無機綠色顏料；普魯士藍、群青等無機藍色顏料，焦油色素色淀、天然色素色淀、及其粉體復合后制成的合成樹脂粉體等，珠光顏料的例子有氧化鈦被覆云母、氧化鈦被覆云母、氧氯化鉍、氧化鈦被覆氧氯化鉍、氧化鈦被覆滑石、魚鱗箔、氧化鈦被覆著色云母等，焦油色素的例子有紅色3號、紅色104號、紅色106號、紅色201號、紅色202號、紅色204號、紅色205號、紅色220號、紅色226號、紅色227號、紅色228號、紅色230號、紅色401號、紅色505號、黃色4號、黃色5號、黃色202號、黃色203號、黃色204號、黃色401號、藍色1號、藍色2號、藍色201號、藍色404號、綠色3號、綠色201號、綠色204號、綠色205號、橙色201號、橙色203號、橙色204號、橙色206號、橙色207號等，天然色素的例子有洋紅酸、蟲膠紅酸、番紅素、巴西木素、藏紅花原色素等粉體，在不影響本發(fā)明效果的范圍內(nèi)，上述粉體可復合或經(jīng)一般油劑、硅油、氟化物、表面活性劑等處理后使用。例如，可事先經(jīng)過或不經(jīng)過諸如氟化物處理、硅樹脂處理、接側(cè)鏈處理、硅烷偶合劑處理、鈦偶合劑處理、油劑處理、N-?；x胺酸處理、聚丙烯酸處理、金屬皂處理、氨基酸處理、無機化合物處理、等離子體處理、機械化學處理等表面處理，根據(jù)需要可使用一種或并用兩種、兩種以上表面處理方法。在本發(fā)明中，上述粉體可一種或一種以上組合使用。
油質(zhì)原料的例子有鱷梨油、亞麻籽油、杏仁油、白蠟、蘇子油、橄欖油、可可油、木棉蠟、香榧油、卡那巴蠟、魚肝油、小燭樹蠟、牛油、牛腳油、牛骨脂、硬化牛油、杏仁油、鯨蠟、硬化油、小麥胚芽油、芝麻油、大米胚芽油、米糠油、甘蔗蠟、山茶花油、紅花油、乳果木油、中國桐油、肉桂油、荷荷巴蠟、蟲膠蠟、龜油、大豆油、茶仔油、山茶油、月見草油、玉米油、豬油、菜籽油、日本桐油、米糠臘、胚芽油、馬脂、抗壞血酸四異棕櫚酸酯、棕櫚油、棕櫚核油、蓖麻子油、硬化蓖麻子油、蓖麻子油脂肪酸甲酯、向日葵油、葡萄油、月桂子蠟、荷荷巴油、澳洲胡桃油、蜂蠟、貂油、棉籽油、棉蠟、木蠟、日本木蠟、褐煤蠟、椰子油、硬化椰子油、椰子油脂肪酸甘油三酯、羊脂、花生油、羊毛脂、液體羊毛脂、還原羊毛脂、羊毛脂醇、硬質(zhì)羊毛脂、乙酸羊毛脂、羊毛脂脂肪酸異丙酯、月桂酸己酯、POE羊毛脂醇醚、POE羊毛脂醇乙酸酯、羊毛脂脂肪酸聚乙二醇酯、POE氫化羊毛脂醇醚、蛋黃油等；烴油的例子有地蠟、三十碳烷、三十碳六烯、白地蠟、石蠟(paraffin)、固體石蠟(paraffin wax)、液體石蠟、十八碳烷、聚異丁烯、微晶蠟、凡士林等；高級脂肪酸的例子有月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、山萮酸、十一碳烯酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、異硬脂酸、12-羥基硬脂酸等；高級醇的例子有月桂醇、肉豆蔻醇、棕櫚醇、硬脂醇、山萮醇、十六烷醇、油醇、異硬脂醇、己基十二烷醇、辛基十二烷醇、十八醇十六醇混合物、2-癸基十四烷醇、膽甾醇、植物甾醇、POE膽甾醇醚、單硬脂基甘油醚(鯊肝醇)、單油基甘油醚(鯊油醇)等；酯油的例子有己二酸二異丁酯、己二酸-2-十六烷酯、己二酸二-2-庚基十一烷酯、單異硬脂酸-N-烷基醇酯、異硬脂酸異十六烷酯、三異硬脂酸三羥甲基丙烷、二-2-乙基己酸乙二醇酯、2-乙基己酸十六烷酯、三-2-乙基己酸三羥甲基丙烷、四-2-乙基己酸季戊四醇酯、辛酸十六烷酯、辛基十二烷樹膠酯、油酸油酯、油酸辛基十二烷酯、油酸癸酯、二癸酸新戊二醇酯、枸櫞酸三乙酯、琥珀酸-2-乙基己酯、乙酸戊酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、硬脂酸異十六烷酯、硬脂酸丁酯、癸二酸二異丙酯、癸二酸二-2-乙基己酯、乳酸十六烷酯、乳酸肉豆蔻酯、棕櫚酸異丙酯、棕櫚酸-2-乙基己酯、棕櫚酸-2-己基癸酯、棕櫚酸-2-庚基十一烷酯、12-羥基硬脂酸膽甾醇酯、二季戊四醇脂肪酸酯、肉豆蔻酸異丙酯、肉豆蔻酸辛基十二烷酯、肉豆蔻酸-2-己基癸酯、肉豆蔻酸肉豆蔻酯、二甲基辛酸己基癸酯、月桂酸乙酯、月桂酸己酯、N-月桂?；?L-谷氨酸-2-辛基十二烷酯、蘋果酸二異硬脂酸酯等；甘油酯油如乙酰甘油酯、三異辛酸甘油酯、三異硬脂酸甘油酯、三異棕櫚酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯、二-2-庚基十一烷酸甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯、肉豆蔻酸異硬脂酸二甘油酯等。
防腐劑的例子有對羥基苯甲酸烷酯、苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸、山梨酸鉀、苯氧基乙醇等；殺菌劑的例子有苯甲酸、水楊酸、石炭酸、山梨酸、對羥基苯甲酸烷酯、對氯間甲酚、六氯雙酚基甲烷、潔而滅、氯己啶、三氯均二苯脲、三氯羥基二苯醚、感光素、苯氧基乙醇等。
保濕劑的例子有乙二醇、丙二醇、丁二醇、二乙二醇、二丙二醇、甘油、雙甘油、山梨糖醇、麥芽糖醇、海藻糖、棉子糖、木糖醇、甘露糖醇、聚乙二醇、聚甘油等甘醇類等的多元醇類以及多糖類等。在本發(fā)明中，上述物質(zhì)最好單獨使用或2種、2種以上混合后使用。
粘度調(diào)節(jié)劑的例子有阿拉伯膠、西黃蓍膠、阿拉伯半乳糖膠、刺槐豆膠(角豆膠)、瓜爾膠、刺槐樹膠、角叉菜膠、果膠、瓊脂、榅桲種子(木瓜)、淀粉(大米、玉米、馬鈴薯、小麥)、藻膠、西黃蓍膠、刺槐豆膠等植物高分子；黃原膠、葡聚糖、琥珀酸葡聚糖、支鏈淀粉等微生物高分子；膠原蛋白、酪蛋白、白蛋白、明膠等動物高分子；羧甲基淀粉、甲基羥丙基淀粉等淀粉類高分子；甲基纖維素、乙基纖維素、甲基羥丙基纖維素、羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、羥丙基纖維素、硝酸纖維素、纖維素硫酸鈉、羧甲基纖維素納、結(jié)晶纖維素、纖維素粉等纖維素類高分子；藻酸鈉、藻酸丙二醇酯等藻酸類高分子；聚乙烯甲醚、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯聚合物等乙烯類高分子；聚乙二醇等聚氧乙烯類高分子；聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物類高分子；聚丙烯酸鈉、聚乙基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺等丙烯類高分子；聚乙烯亞胺、陽離子聚合物、膨潤土、硅酸鋁鎂、人造硅酸鎂鋰(Laponite)、蒙脫石、皂石、鋰蒙脫石、硅酸酐等無機增粘劑等。其他增粘劑還有油溶性膠凝劑，如硬脂酸鋁、硬脂酸鎂、肉豆蔻酸鋅等金屬皂；N-月桂?；?L-谷氨酸、α，γ-二正丁胺等氨基酸衍生物；糊精棕櫚酸酯、糊精硬脂酸酯、糊精-2-乙基己酸棕櫚酸酯等糊精脂肪酸酯；蔗糖棕櫚酸酯、蔗糖硬脂酸酯等蔗糖脂肪酸酯；單亞芐基山梨糖醇、二亞芐基山梨糖醇等山梨糖醇的亞芐基衍生物；二甲基苯甲基十二烷銨蒙脫石土、二甲基二-十八烷銨蒙脫石、十八烷基二甲基苯甲基銨蒙脫石等有機變性粘土礦物等。
上述含成分(1)組成物不僅可單獨作為外用組成物使用，還可以與上述成分混合，作為化妝水、乳液、雪花膏、面膜、肥皂等化妝品和醫(yī)藥外用品的藥用化妝原料，或作為化妝水、乳液、雪花膏、軟膏等醫(yī)藥品的皮膚外用劑。
含成分(2)的組成物，可以只是曲霉或其處理物，也可用水、醇等液體稀釋劑、或石蠟等固體稀釋劑、液體石蠟等半固體稀釋劑稀釋。還可以用成分(2)取代上述含有成分(1)的組成物中的成分(1)，制成含成分(2)的組成物來使用。
含有成分(1)和成分(2)的組成物通過混合成分(1)和成分(2)以及上述含有成分(1)的組成物中所述的各種成分制得，也可通過混合上述含有成分(1)的組成物和含有成分(2)的組成物制得。
作為皮膚外用劑用于皮膚表面時，將含有成分(1)的組成物和含有成分(2)的組成物混合?；旌虾?，將混合物用于皮膚表面。兩組成物混合時，成分(1)和成分(2)的使用比例一般約是重量比1∶0.001～0.1，優(yōu)選約為1∶0.005～0.05。
可通過熟知的方法將含有成分(1)的組成物與含有成分(2)的組成物混合。
下面說明本發(fā)明組成物為化妝品時的優(yōu)選方式。上述化妝品為化妝水時，其通過將含有成分(1)的組成物和含有成分(2)的組成物溶解或分散于溶劑中制得。
上述化妝品為乳液時，例如通過勻質(zhì)機等將含有成分(1)的組成物和含有成分(2)的組成物調(diào)配于不含上述成分(1)及成分(2)的原料經(jīng)乳化后的混合液中制得。
按上述那樣制成使用時本發(fā)明的組成物，可用于如化妝水、乳液、精華素等基礎化妝品、粉底等粉飾用化妝品、頭發(fā)用化妝品、清潔用化妝品、口唇用化妝品、口腔用化妝品、指甲用化妝品、眼線用化妝品、浴用化妝品、日曬·防曬化妝品等。在醫(yī)藥品或醫(yī)藥外用品中使用的例子有干眼用滴眼劑，其他還有藥用化妝品、育發(fā)劑等。
實施例下面，通過實施例進一步具體說明本發(fā)明，當然，本發(fā)明的范圍并不限于這些實施例。
實施例12-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的合成將5，6-O-異亞丙基抗壞血酸(2g，9.3mmol)溶于DMSO(20mL)中，加入碳酸鉀(1.3g，9.4mmol)及芐基溴(1.1mL，9.3mmol)，50℃下攪拌4小時。在反應液中加水，用1N-HCL調(diào)至酸性，經(jīng)乙酸乙酯萃取、水洗、飽和食鹽水洗后，用無水MgSO4干燥，再減壓濃縮，用硅膠柱(AcOEt/n-Hexane＝3∶1)精制，制得3-O-芐基-5，6-O-異亞丙基抗壞血酸1.1g(收率為39％)。
將上述芐基衍生物(0.6g，2.0mmol)與2，3，4，6-四-O-乙?；?1-O-(2，2，2-三氯乙氧基羰基)-β-D-吡喃葡萄糖(2.1g，4.0mmol)的混合物在120℃～130℃下加熱熔融。反應3小時后，反應液用柱色譜(25％AcOEt/n-Hexane至50％梯度)精制，制得2-O-(2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃型葡萄糖基)-3-O-芐基-5，6-O-異亞丙基抗壞血酸850mg(收率為67％)。
將上述糖苷(850mg，1.3mmol)溶于乙酸乙酯(40mL)，加入10％Pd-C(200mg)進行氫解。2小時后，濾去催化劑，濃縮，制得2-O-(2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃型葡萄糖基)-5，6-O-異亞丙基抗壞血酸約750mg。
將上述脫芐基后的化合物(500mg，0.9mmol)溶于乙酸(5mL)，加水(5mL)，在50℃～60℃下加熱攪拌1.5小時。將反應液濃縮，經(jīng)水洗、飽和食鹽水洗后，用無水MgSO4干燥，再減壓濃縮，得到的殘渣用乙酸乙酯-己烷結(jié)晶，得2-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸320mg(收率為48％)。
PMR(δppm，DMSO-d6)；1.94-2.01(12H)，3.42(3H，m)，3.7-4.3(4H，m)，4.7-5.1(4H，m)，5.3-5.4(2H，m)，12.00(1H，br)。FABMS(+)m/z507。
實施例22-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的合成將2-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸(300mg，0.6mmol)溶于甲醇(10mL)，加入由碳酸鉀(600mg)溶于水(9ml)配成的溶液，攪拌30分鐘。反應液用IR-120(H+)中和，濾去樹脂，再用甲醇及50％甲醇水溶液洗凈。合并濾液和洗液，濃縮，加水，冷凍干燥，制得2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的無定形結(jié)晶(190mg，收率為100％)。
PMR(δppm，D2O)3.1-3.3(4H，m)，3.4-3.5(3H，m)，3.58(1H，d)，3.80(1H，t)，4.61(1H，d)，4.66(1H，d)。FABMS(-)m/z337。
實施例3枸杞中2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的含量測定以2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的化學合成品在高效液相色譜中的保留時間2.63分鐘為對照(島津制作所(株)制造的LC-10Ai體系，色譜柱Inertsil ODS-3(GLScience(株)制造)，4.6×150mm，5μm)，流動相20％MeOH-20mM磷酸-5mM溴化四正戊銨，流速1.0mL/min，柱溫35℃，檢測波長254nm)，將3g干燥植物浸漬在其10倍量的70％乙醇中，室溫下浸漬7天，得到的提取液用1.5％偏磷酸/5M KOH(pH3.5)稀釋10倍，作為被測樣品，檢測天然存在的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸。結(jié)果在寧夏產(chǎn)及河北產(chǎn)枸杞子的提取液中檢測出與2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的峰相當?shù)姆?。另外，?00g寧夏產(chǎn)枸杞鮮果中加入其2倍量的70％乙醇，在相同處理后的樣品中也檢測出與2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的峰相當?shù)姆?。此外，取上述提取?mL，減壓濃縮后經(jīng)冷凍干燥重量測定求得固體成分的含量。綜合考慮提取物固體成分、化學合成品的校正曲線、提取液中的濃度以及稀釋倍數(shù)后，求得固體成分在提取物中的含量為0.86％～1.2％。
實施例4枸杞子中含有的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的精制將100g寧夏產(chǎn)枸杞子在(株)東正制造的片劑粉碎機TS-10M中粉碎，加入30％乙醇800mL，室溫下浸漬6天，過濾后減壓濃縮并冷凍干燥，制得65.7g提取物。取1.94g該提取物(2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的含量為0.86％)溶于蒸餾水，制成40mL樣品(pH4.5，電導率為1.7mS/cm)。將該樣品以SV＝1通過Dowex 1-X8柱(乙酸型，1.5×12cm)。通過后，用約10倍于柱體積(200mL)的蒸餾水洗凈，以0-0.1M乙酸線性濃度梯度洗脫(100mL×2)，接著以0.1-1.0M乙酸線性濃度梯度洗脫(100mL×2)，再以1.0M乙酸洗脫。在280nm下測定吸光度，并參照化學合成品的保留時間，通過高效液相色譜觀測2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的洗脫情況。裝置、柱溫與實施例1相同，其他條件變?yōu)樯V柱Inertsil ODS-3(GLScience(株)制造，3.0×150mm，5μm)，流速0.3mL/min，檢測波長245nm，流動相2％MeOH-0.2M KH2PO4/H3PO4(pH3.0)-0.2mM EDTA-0.5mM十二烷基三甲基氯化銨，2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的化學合成品的保留時間為6.5分鐘。高效液相色譜法的檢測結(jié)果顯示，吸附在柱子上的該物質(zhì)在0.1-1.0M乙酸線性濃度梯度洗脫中，在組分19～25中洗脫出來(26mg，組分19～25的總回收率為78％，純度為50％)。
實施例52-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的酶法合成以2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的化學合成品在GILSON公司制造的LC體系(305 Master Pump，116型UV檢測器)，色譜柱Inertsil ODS-3(GLScience(株)制造，4.6×150mm，5μm)，流動相20％MeOH-20mM磷酸-5mM溴化四正戊銨，流速0.5mL/min，檢測波長254nm的保留時間5.2分鐘為對照，檢測市售纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖酶。將纖維二糖與抗壞血酸溶于10mM乙酸緩沖液(pH5.0)，制成纖維二糖0.3M及抗壞血酸0.2M的1mL酶反應體系。在該酶反應體系中加入50μL酶液，37℃下開始反應。于100℃下加熱5分鐘終止反應，再高效液相色譜分析生成的β-D-吡喃型葡萄糖基-抗壞血酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，纖維素酶(Sigma公司生產(chǎn))、β-葡萄糖苷酶(東洋紡，nakalaitesc)、纖落辛T2(阪急共榮物產(chǎn))、纖維素酶「小野塚」RS、「小野塚」FA及泛纖維素酶BR(養(yǎng)樂多藥品工業(yè))具有β-葡萄糖基轉(zhuǎn)移活性。游離抗壞血酸在4.0分鐘時出峰，其前后的3.6分鐘和5.2分鐘處也有峰，分別作為物質(zhì)X、物質(zhì)Y。物質(zhì)X的轉(zhuǎn)移率為15.7％，物質(zhì)Y的轉(zhuǎn)移率為0.8％。該物質(zhì)X與物質(zhì)Y通過與化學合成品的混合色譜分析，得知物質(zhì)X的保留時間與6-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的保留時間一致，物質(zhì)Y的保留時間與2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸相的保留一致。
用分子量為1萬Kd的UF膜將共存的蛋白質(zhì)除去，為了除去游離抗壞血酸，用高效液相色譜法分取{GILSON公司制造的LC體系(305 MasterPump，116型UV檢測器)，色譜柱SUGAR SH1011(昭和電工(株)制造)，流動相0.1M乙酸，流速0.5mL/min，柱溫30℃，檢測示差折射計，0.25mL分畫}。含有物質(zhì)X與物質(zhì)Y的組分在29～31中洗脫出來，得24.7μg樣品，收率為96％。
再經(jīng)高效液相色譜法制得高純度品。條件為GILSON公司生產(chǎn)的LC體系(305Master Pump，116型UV檢測器)，色譜柱ODS-UG-5(野村化學(株)制造，4.6×250mm，5μm)，流動相5％甲醇-20mM甲酸銨-5mM二正丁銨乙酸酯(Di-n-butylamine Acetate)，流速0.5mL/min，檢測波長254nm，每隔0.5分鐘用FC-203B型(GILSON公司生產(chǎn))餾分收集器分取。相當于物質(zhì)X與物質(zhì)Y的組分經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后，溶于重水，用核磁共振光譜測定，與化學合成品2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸比較。在HSQC譜中，化學合成品抗壞血酸結(jié)構(gòu)中4位、5位、6位碳原子的化學位移分別為73ppm、73ppm、66ppm，而物質(zhì)X中4位、5位、6位碳原子的化學位移均為73ppm，且只有6位碳原子為低磁場位移，從中可知物質(zhì)X為6-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸。
物質(zhì)Y與化學合成品2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的一維PMR譜一致，從中可知物質(zhì)Y為2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸。
實施例6(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的精制將20mg纖維素酶制劑(Sigma)溶于20mM乙酸緩沖溶液(pH5.0)1mL中，再使其通過經(jīng)上述緩沖溶液平衡后的Marathon WBA(樹脂0.5mL，Dow化學公司生產(chǎn))，得到組分-酶液。將該酶液添加到溶有0.35g抗壞血酸和1g纖維二糖的20mM乙酸緩沖溶液(pH5.0)10mL中，37℃下反應2天，制得含6-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸11.8％和2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸0.8％的反應液。該溶液經(jīng)UF膜過濾，將回收除去酶后的溶液(pH4.3，電導率1.6mS/cm)以SV＝2.5通過Dowex 1-X8柱(乙酸型，1.5×12cm)。通過后，以約10倍于柱體積(200mL)的蒸餾水洗凈，以0-0.1M乙酸線性濃度梯度洗脫(80mL×2)，接著以0.1-1.0M乙酸線性濃度梯度洗脫(80mL×2)。依次分離出6-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的高含量組分(餾分65～68)、未反應抗壞血酸的高含量組分、2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的高含量組分(餾分101～108)。收集上述餾分101～108，以其作為2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸的高含量組分(2.4mg，回收率為45％)。
實施例72-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸對由紫外線B波(UVB)照射引起的人皮膚表皮角質(zhì)形成細胞(HaCaT)的細胞死亡的保護作用將人皮膚角質(zhì)形成細胞HaCaT(來自海得堡大學Fusenig博士所提供的細胞株)以10000細胞/孔置于含有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco’s改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)的24孔板中，18小時后，照射35微焦耳/平方厘米(mJ/cm2)的UVB(最大波長312nm)。在照射前2小時，預先添加20μM～100μM的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸，在照射時除去并淋洗。照射在無藥劑存在PBS中進行，照射后在含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，照射24小時后，通過使用了2-(4-碘化苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸基苯基)-2H-四唑、-鈉鹽(WST-1)的線粒體脫氫酶活性測定法，測定細胞存活率。結(jié)果在圖1中顯示。同樣地，作為比較例，還測定了2-O-(α-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸和抗壞血酸，其結(jié)果也在圖1中顯示。
實施例82-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸對人皮膚角質(zhì)形成細胞的細胞內(nèi)抗壞血酸濃度的影響將370000個人皮膚角質(zhì)形成細胞HaCaT置于直徑100mm的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)16小時后，在添加了40％HaCaT 24小時無血清培養(yǎng)液的含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中，加入2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸100μM。在添加3～24小時后，除去培養(yǎng)基，用冰冷卻后的PBS淋洗2次，用胰蛋白酶處理使細胞層剝脫，分散成單個細胞。將其懸浮于含有50μM二硫蘇糖醇(DTT)的PBS，以離心處理淋洗3次。細胞懸浮液經(jīng)柱塞式鐵夫龍(注冊商標)勻質(zhì)機粉碎后，接著在液氮中冷凍、解凍2次。其上清液經(jīng)Molcut(日本密理博(株)生產(chǎn)，加壓式限外過濾器，截留分子量為10000，聚醚砜膜)處理，用高效液相色譜法(東曹(株)制造的AS-8020體系，色譜柱Shodex ODSpak(昭和電工(株)制造，4.6×150mm)，流動相0.1M KH2PO4-H3PO4(pH2.35)-0.1mM EDTA-2Na，流速1.5mL/min)，通過庫侖電化學檢測器(ESA Co.，Bedford，MA，200mV)分析細胞內(nèi)抗壞血酸含量。其結(jié)果在圖2中顯示。同樣地，作為比較例，還檢測了2-O-(α-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸和抗壞血酸，其結(jié)果也在圖2中顯示。
實施例92-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸對人真皮成纖維細胞(NHDF)膠原蛋白合成的促進作用將370000個人真皮成纖維細胞NHDF置于直徑100mm的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)16小時后，在添加了40％NHDF 24小時無血清培養(yǎng)液的含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中，加入2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸100μM。1小時后，再加入L-[2，3-3H]脯氨酸0.12m L(120μCi)，培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)后，除去培養(yǎng)基，用PBS淋洗細胞層4次。然后用胰蛋白酶處理使細胞剝離，用堿溶解細胞，中和，即得細胞內(nèi)蛋白質(zhì)組分。將其經(jīng)Clostridium的膠原蛋白酶分解得到的蛋白質(zhì)組分，通過使用了Scintisol EX-H的液體閃爍計數(shù)器測定放射活性。未經(jīng)膠原蛋白酶處理的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)組分也同樣通過液體閃爍計數(shù)器來測定放射活性。求出各放射活性的差值，作為膠原蛋白合成活性。結(jié)果在圖3中顯示。同樣地，作為比較例，還測定了2-O-(α-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸和抗壞血酸，其結(jié)果也在圖3中顯示。
實施例10將經(jīng)知情同意后從人皮膚所摘取的皮膚片(51歲女性耳后下皮膚)沿垂直方向分割成短片型小片，將上述小片嵌入改良式卜諾夫擴散細胞池中。使皮下側(cè)浸于DMEM培養(yǎng)基(2mL)中并持續(xù)供給營養(yǎng)，向角質(zhì)層側(cè)通以5％CO2使培養(yǎng)基的pH值維持在7.25。在角質(zhì)層上覆上邊長約5mm的四方形雙層紗布，該雙層紗布吸有1mL 100m M的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸(以下也簡稱為AβG){3.38％w/w，PBS(-)溶液(不含金屬鹽類氯化鈣和氯化鎂的磷酸緩沖生理鹽水(PhosphateBuffered Saline))}，同時將來自米曲霉(Aspergillus oryzae)酶制劑(天野酶制品株式會社，商品名為Biozyme A)的25％w/wPBS(-)溶液過濾滅菌后，以每片1/200(5μL)、1/500(2μL)、1/1000(1μL)的液體量將其添加于紗布上(以下也簡稱Bz)。
在上述方法中，在1g(株)Bioch生產(chǎn)的米曲用曲霉干燥粉末中加入5mL的Mili-Q超純水制成懸浮液，該懸浮液經(jīng)冷凍解凍和柱塞式鐵夫龍(注冊商標)勻質(zhì)機進行粉碎，離心分離，得到的上清液過濾滅菌后，將其以每片1/20(50μL)、1/50(20μL)的液體量取代Bz添加于紗布上(以下也簡稱Kj)。另外，在上述方法中，不使用Bz和Kj的添加物，只投與AβG。
投與5小時后，從改良式卜諾夫擴散細胞池中切下皮膚小片，加入10倍量0.1％胰蛋白酶PBS(-)溶液，37℃下處理3小時后，溫和地攪拌使表皮與真皮分離。在無氣泡下分別通過柱塞式鐵夫龍(注冊商標)勻質(zhì)機粉碎和在液氮中的冷凍解凍，使細胞破碎。將破碎液離心分離得到的上清液限外過濾后，用UV法測定AβG，且用電化學檢測法測定總維生素C(還原型和氧化型的總和)以及還原型維生素C量，測定方法與實施例8相同。求出在總維生素C中所占比例。表1顯示給人皮膚片單獨投與AβG或同時投與添加物5小時后表皮以及真皮中含有的總維生素C量。表2顯示給人皮膚片單獨投與AβG或同時投與添加物5小時后表皮以及真皮中還原型維生素C在總維生素C中所占比例。表3顯示給人皮膚片單獨投與AβG或同時投與添加物5小時后表皮以及真皮的AβG吸收量。




如表1和表2所示，通過添加Kj或Bz，使皮膚組織中特別是維生素C難以滲透到的皮膚表面下0.1mm至1.3mm處真皮中的維生素C量增加。維生素C量增加又可促進真皮成纖維細胞的膠原蛋白合成從而達到預防皺紋的雙重效果。另外，如表3所示，通過添加Bz或Kj，使前體維生素C的AβG從皮膚表面向深部的滲透轉(zhuǎn)移性增加。
從上述結(jié)果可知，本發(fā)明2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸在霉菌或其處理物的存在下可顯著改善皮膚滲透性，且向維生素C的轉(zhuǎn)換也很好。
本發(fā)明提供皮膚滲透性好的皮膚外用組成物，其含有穩(wěn)定性好、在生物體內(nèi)可被持續(xù)利用、抗氧化作用強、皮膚刺激性小的抗壞血酸衍生物。
權利要求
1.一種外用組成物，其特征在于，它含有式(I)所示的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸或其對人體安全的鹽或酯和曲霉或其處理物。[化1]
2.根據(jù)權利要求1所述的組成物，其特征在于，其為化妝品或醫(yī)藥外用品。
3.根據(jù)權利要求1或權利要求2所述的組成物，其特征在于，權利要求1中式(I)所示的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸是從植物體中提取出來的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸。
4.根據(jù)權利要求3所述的組成物，其特征在于，其植物體為茄科植物。
5.根據(jù)權利要求3或權利要求4所述的組成物，其植物體為枸杞、枸杞的鮮果或干燥果實。
6.根據(jù)權利要求1～5中任意一項所述的組成物，其特征在于，曲霉屬于曲霉屬(Aspergillus)。
7.根據(jù)權利要求1～6中任意一項所述的組成物，其特征在于，曲霉屬于米曲霉(Aspergillus oryzae)、白曲霉(Aspergillus kawachii)或黑曲霉(Aspergillus awamori)。
8.一種配套組合物，其特征在于，其為含有權利要求1中式(I)所示的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸或其對人體安全的鹽或酯的組成物與含有曲霉或其處理物的組成物的配套組合物。
9.一種組成物，其特征在于，其為含有權利要求8所述配套組合物用的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸或其對人體安全的鹽或酯的組成物。
10.一種皮膚滲透增強劑，其特征在于，其為以含有曲霉或其處理物為特征的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸或其對人體安全的鹽或酯皮膚滲透增強劑。
全文摘要
本發(fā)明目的為提供皮膚滲透性好的皮膚外用組成物，其含有穩(wěn)定性好、在生物體內(nèi)被持續(xù)利用、抗氧化作用強、皮膚刺激性小的抗壞血酸衍生物。其特征在于，它含有式(I)所示的2－O－(β－D－吡喃型葡萄糖基)抗壞血酸或其對人體安全的鹽或酯和曲霉或其處理物。
文檔編號A61K36/81GK1812795SQ20048001769
公開日2006年8月2日 申請日期2004年6月25日 優(yōu)先權日2003年6月26日
發(fā)明者前田滿, 中尾正宏, 深見治一 申請人:三得利株式會社