專利名稱：制備α－1－抗胰蛋白酶溶液的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備含α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)的溶液的方法，并涉及A1AT。
A1AT是分子量約55,000道爾頓的糖蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族。A1AT可抑制多種蛋白酶如胰蛋白酶的活性，該抑制劑的名字基于胰蛋白酶是由于歷史原因。生理上，彈性蛋白酶是靶蛋白酶，參與尤其是組織與基質(zhì)重構(gòu)和降解過程，并由細(xì)胞如顆粒細(xì)胞釋放并因此參與炎癥過程。彈性蛋白酶活性的持續(xù)時間在時間和空間上受到抑制劑A1AT限制并基本受其調(diào)節(jié)。這種活性的失調(diào)導(dǎo)致組織迅速降解并可以有病理生理后果。此外，啟動和/或促進(jìn)炎癥過程。彈性蛋白酶控制減少或缺乏的已知實例是伴隨炎癥現(xiàn)象的肺中的進(jìn)行性局部組織降解，這進(jìn)行性地導(dǎo)致肺氣腫并因而伴隨部分顯著的肺功能限制。最后階段，這可以導(dǎo)致患者死亡，這只能最終通過肺移植來阻止。
這些患者受缺乏A1AT或A1AT功能受限的痛苦。正常情況下該抑制劑由肝較大量的生成并分泌，并在血漿中以較高濃度(典型濃度是1.3mg/ml)循環(huán)。此外，生理有效的并且足夠濃度的A1AT發(fā)現(xiàn)于健康人的一些器官，尤其是肺液(上皮層液)中。如果該A1AT濃度顯著降低或如果存在的A1AT的功能受限制或無活性(滅活)，則肺組織不受控制的變性并具有上述后果。
缺乏A1AT或A1AT抑制功能降低的原因主要是遺傳缺陷。所謂的“Z”突變，尤其是純合(PiZZ)個體中的“Z”突變導(dǎo)致已經(jīng)存在于合成A1AT分子的細(xì)胞中的這些分子聚合。因此，A1AT不再能進(jìn)入循環(huán)，或只有極少量進(jìn)入循環(huán)。一方面，這導(dǎo)致缺乏抑制活性，經(jīng)一段持續(xù)時間后在肺中尤其明顯；另一方面，導(dǎo)致肝細(xì)胞中富集其聚合物，從而導(dǎo)致相應(yīng)的功能性疾病。雜合PiZ個體的抑制能力相應(yīng)降低。已知還有具有相似缺陷的其它突變。
根據(jù)目前估計，PiZZ突變在美國的發(fā)生率為人群中1/1600的水平；因此，突變攜帶者的數(shù)目明顯更高，可能只驗明了其中的10％。
基于A1AT缺陷或A1AT功能減退的肺功能性疾病(進(jìn)行性肺氣腫)患者中，目前并非所有都能被治療，因為用于治療和/或預(yù)防的A1AT作為批準(zhǔn)藥物不能充分供給。既定的治療方法是基于靜脈施用由供體血漿制備的含A1AT的溶液。既定的且目前推薦的劑量是每周每kg體重60mg A1AT，這對應(yīng)每月每個患者平均消耗16-20克A1AT。這又對應(yīng)平均15升血漿中所含的量?？紤]到起始材料血漿中只有部分該抑制劑以純形式的制劑獲得，一個患者每月需要若干倍的15L正常血漿作為原材料。用于回收A1AT從而用于永久治療患者需要的作為原材料的血漿總體積相當(dāng)大。
生產(chǎn)A1AT制劑的既定制備方法使用所謂的Cohn IV1漿作為起始材料。所述Cohn IV1漿利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的Cohn-Oncley方法或其改進(jìn)方法制備，所述方法基于通過實質(zhì)性地改變所加入乙醇的濃度、所調(diào)節(jié)的pH值和溶液溫度而對血漿蛋白質(zhì)分級分離。除了A1AT以外，所謂的級分IV1通常還含有很多種其它血漿蛋白，經(jīng)之前的沉淀步驟其它血漿蛋白的數(shù)量已經(jīng)部分降低。這種方法的變換方式是Kistler-Nitschmann法。因此，與Cohn IV1級分相似的級分以及其它含A1AT的級分，如所謂的上清液I+II+III，也可用作起始材料。
已經(jīng)描述了制備純度不等的A1AT制劑的各種方法。已經(jīng)多次報道了使用離子交換層析尤其是陰離子交換劑富集A1AT(Gray et al.，1960；Crawford et al.，1973；Chan et al.，1973；etc.)。然而，該制備步驟單獨不產(chǎn)生具有與現(xiàn)有技術(shù)相當(dāng)純度的A1AT制劑。因此，部分地與離子交換劑組合而使用其它制備步驟。例如，使用吸附或沉淀方法，如與聚乙二醇(US-A-4,379,087)、鋅鰲合劑或肝素吸附劑(US-A-4,629,567)等一起孵育。這些方法用于(進(jìn)一步)純化A1AT，但其中的每種方法都必須付出或多或少地?fù)p失產(chǎn)物收率的代價。原則上，產(chǎn)物損失隨制備步驟數(shù)增加而增加。此外，這經(jīng)常伴隨制備時間的延長，這些都會降低A1AT的完整性和活性并增加生產(chǎn)成本。
除了蛋白質(zhì)制備步驟以外，所謂的病毒滅活步驟或去除(depletion)步驟是由血漿制備的蛋白質(zhì)產(chǎn)品制備方法中的必需部分。所謂的SD(溶劑/去污劑)方法通過破壞它們的保護(hù)性脂質(zhì)囊膜而滅活相應(yīng)病毒，除此以外，熱滅活方法，例如巴斯德消毒(60℃熱處理10小時)，用于增加病毒安全性。經(jīng)“納濾器”過濾通常根據(jù)病毒大小保留病毒，而無論它們是具有脂質(zhì)囊膜的或是沒有脂質(zhì)的。現(xiàn)有技術(shù)是在一種制備方法中整合兩個工序，其中每一工序本身都有效并且基于不同原理，以使病毒安全性最大化。
根據(jù)蛋白質(zhì)不同，在這些工序中加入穩(wěn)定劑如氨基酸或糖以使蛋白質(zhì)穩(wěn)定。因此，稍后必須將它們從含A1AT的溶液中除去。在SD方法中，加入去污劑作為病毒滅活的活性試劑，它必須在制備工藝的后續(xù)過程中用適當(dāng)方法除去。為此，建立了與疏水基質(zhì)的吸附，如使用固定化C18鏈的層析。這種層析也伴隨產(chǎn)物收率的損失并包括方法中每個(進(jìn)一步)層析步驟的上述缺點。此外，這些基質(zhì)通常重復(fù)使用，即需要高成本和耗時的基質(zhì)再生步驟。
因此，已經(jīng)描述了無需層析步驟的用于定性去除去污劑的可替代、有效而快速的方法(WO 94/26287，US-A-5,817,765)。因此，例如，使含去污劑的蛋白質(zhì)溶液達(dá)到鹽例如檸檬酸鈉的超生理濃度(≥0.5M)，以形成含去污劑的顆粒，例如僅通過過濾就可以將所述顆粒分離出來。以下，該方法將稱作“去污劑/鹽析”法。
在WO 94/26287的實施例中，“去污劑/鹽析”法應(yīng)用于三種溶解態(tài)分離蛋白，即轉(zhuǎn)鐵蛋白、抗凝血酶III和白蛋白。在實施例中，該方法分別導(dǎo)致恢復(fù)95％的蛋白質(zhì)活性，并導(dǎo)致去污劑濃度降低。如果在使得靶蛋白產(chǎn)率不太受影響的條件下應(yīng)用該方法，產(chǎn)物中的Triton濃度通常仍然是高的。在WO 94/26287的實施例4中，發(fā)明人能恢復(fù)95％的白蛋白活性，但得到含250ppm Triton X-100和35ppm TNBP的產(chǎn)物。尤其是當(dāng)生產(chǎn)藥用制劑時，應(yīng)該避免超過50ppm、優(yōu)選超過10ppm的TritonX-100濃度，并且一般來說，理想的是盡可能降低去污劑含量。
本發(fā)明的目的是提供制備A1AT制劑的方法，所述方法盡可能有效、快速地得到高純度和安全性的產(chǎn)品。優(yōu)選的，在制備過程中，不應(yīng)對A1AT的活性和/或質(zhì)量產(chǎn)生不利影響，并且去污劑應(yīng)該被除去到藥用制劑可接受的水平。
本發(fā)明的另一個目的提供純化含A1AT的溶液的方法，在此過程中其它蛋白組分被去除。優(yōu)選的，所述A1AT溶液還應(yīng)該除去其它組分如脂質(zhì)或病毒。
通過從含A1AT的溶液制備A1AT的方法實現(xiàn)該目的，所述方法包括以下步驟(a)將含A1AT的溶液進(jìn)行離子交換層析；(b)加去污劑和任選的溶劑來滅活脂質(zhì)囊膜病毒；
(c)隨后增加鹽濃度使去污劑鹽析。
此外，通過如權(quán)利要求1-19限定的實施方案，解決本發(fā)明的問題。從含A1AT的溶液例如從復(fù)原的血漿級分IV1(Cohn)中制備A1AT的方法，大體上僅由兩個就富集A1AT而言非常高效的工序組成即利用陰離子交換劑的層析和用TritonX-100和TnBP的SD病毒滅活處理，隨后鹽析除去病毒滅活劑。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)最后提及的步驟也可非常有效地用于含A1AT的溶液。
當(dāng)含A1AT的溶液含有大量不同于A1AT的蛋白質(zhì)時，本發(fā)明方法尤其有用。令人驚奇的是，在所述工藝條件下，該工序不僅能用于去除用于病毒滅活的去污劑，而且在分離所存在的任何蛋白質(zhì)、脂蛋白和脂質(zhì)雜質(zhì)方面也具有顯著純化效果，而不會對A1AT產(chǎn)率產(chǎn)生不利影響。結(jié)合上述陰離子交換層析，基本獲得純度＞90％、優(yōu)選＞95％的A1AT產(chǎn)物，并且含有活性形式的A1AT。溶劑去污劑處理和鹽析步驟以≥80％的產(chǎn)率回收活性A1AT。例如如果復(fù)原的IV1漿用作起始材料，那么本發(fā)明方法使得可以通過從含A1AT的溶液中去除α-2-巨球蛋白、觸珠蛋白、α-1酸性糖蛋白、IgG、IgA和IgM來純化A1AT。在本發(fā)明的具體實施方案中，相對于溶劑/去污劑處理之前的A1AT溶液，例如先前的陰離子交換層析的洗脫液，鹽析步驟后的含A1AT溶液回收＜10％的α-2-巨球蛋白、＜40％的觸珠蛋白、＜10％的α-1酸性糖蛋白、＜10％的IgG、＜10％的IgA和/或＜10％的IgM。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，最初的含A1AT的溶液包含至多50％、至多20％或至多10％(w/w)的其它蛋白質(zhì)。初始溶液優(yōu)選包含至少1％、2％或5％(w/w)的其它蛋白質(zhì)。
更進(jìn)一步，還觀察到，本發(fā)明方法也可令人驚奇地用作病毒滅活和/或去除步驟。即使高產(chǎn)率回收A1AT，產(chǎn)物不僅去除或減少了其它蛋白組分，還去除或減少了病毒。這對于非脂質(zhì)包被的病毒尤其有用，因為脂質(zhì)包被的病毒將已經(jīng)通過去污劑處理被滅活。因此本發(fā)明方法也是含A1AT溶液中的病毒滅活方法，所述病毒尤其是非脂質(zhì)包被的病毒。
如WO 94/26287所述的“去污劑/鹽析”法可用于當(dāng)前情況，使得可以去除去污劑到藥用制劑可接受的水平，并導(dǎo)致高度特異性地富集A1AT，這種發(fā)現(xiàn)是令人驚奇的。人們將會認(rèn)為WO 94/26287的方法將導(dǎo)致產(chǎn)物中去污劑濃度降低，但對于藥品可能仍然太高，并且其中除去污劑以外的所有蛋白質(zhì)和其它成分以相似比率回收。因此人們將不會認(rèn)為WO 94/26287的方法可用于從其它蛋白質(zhì)中純化蛋白。
如果想獲得更高純度的A1AT產(chǎn)品，那么理想的是例如在Phenyl-Sepharose上使用疏水(相互作用)層析(HIC)。具體而言，在去污劑/鹽析處理之后顯示該步驟的效果，因為蛋白質(zhì)結(jié)合至疏水基質(zhì)或配體通常由超生理鹽濃度的存在而介導(dǎo)。然后，例如通過降低鹽濃度，洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。相應(yīng)的，直接去除“鹽析”的去污劑之后或合理降低鹽濃度(通過稀釋或超濾/滲濾；UF/DF)之后，含A1AT的溶液可與疏水基質(zhì)接觸，并如技術(shù)人員所熟悉的那樣進(jìn)行層析。
除了SD處理含A1AT的溶液以外，本方法中可以包括至少一個用于病毒滅活、病毒去除和/或朊病毒去除的其它步驟，例如，含A1AT溶液的病毒熱滅活。具體而言，可以在鹽析步驟后直接在溶液中進(jìn)行這些步驟，因為溶液中所含鹽尤其是檸檬酸鈉的量在熱處理過程中用作穩(wěn)定劑。另一種可能性是進(jìn)行凍干產(chǎn)品的熱處理。作為替代方案或附加方案，可以包括任何合適的去除病毒或朊病毒的過濾方法。納濾是本領(lǐng)域技術(shù)人員尤其熟悉的并且可以結(jié)合到本方法中，優(yōu)選用孔徑范圍為15-20nm的市售過濾器或去除病毒和/或朊病毒的任何合適的過濾結(jié)構(gòu)。通過加入氨基酸，優(yōu)選每種氨基酸濃度0.1M，可以改進(jìn)病毒的去除。在優(yōu)選實施方案中，加入濃度超過0.2M的甘氨酸。優(yōu)選方法由Yokoyama等人(2004，Vox Sanguinis 86，225-229)描述。
原則上，可以通過特征為以下步驟組合的方法獲得根據(jù)本發(fā)明的含A1AT的制劑(a)將含A1AT的溶液進(jìn)行陰離子交換層析；(b)任選的肝素親合層析和/或疏水相互作用層析(HIC)；(c)加去污劑和任選的溶劑來滅活脂質(zhì)囊膜病毒；(d)隨后鹽析除去這些化學(xué)物質(zhì)和蛋白質(zhì)雜質(zhì)；(e)再進(jìn)行至少一次病毒滅活和/或去除步驟。
從血漿及其級分獲得的含A1AT的溶液或重組或轉(zhuǎn)基因表達(dá)的A1AT通常是適合的。
在本方法的優(yōu)選實施方案中，漿IV1(Cohn)用水或緩沖液復(fù)原，更優(yōu)選用20mM Tris緩沖液，達(dá)到溶液與漿之比≥3∶1(優(yōu)選＞10∶1)，隨后與離子交換凝膠接觸，優(yōu)選陰離子交換凝膠，在一個優(yōu)選實施方案中為DEAE Sepharose(Amersham)，更優(yōu)選為DEAE-SepharoseFast Flow，洗滌凝膠，并通過增加離子強度來洗脫A1AT。例如使用根據(jù)EP-A-0131740的方法實現(xiàn)病毒滅活。任選的加入穩(wěn)定劑，隨后加入病毒滅活劑，優(yōu)選Triton X-100、Polysorbate 80(Tween 80)、TnBP和/或辛酸/辛酸鹽，優(yōu)選最終濃度達(dá)到≥0.1％(w/w)的Triton和Tween 80、≥0.03％(w/w)的TnBP、≥0.1mM的辛酸/辛酸鹽。經(jīng)過優(yōu)選≥0.1小時、更優(yōu)選≥1小時的適當(dāng)孵育時間后，在≥4℃、更優(yōu)選≥15℃下，優(yōu)選用檸檬酸鹽增加鹽濃度，具體達(dá)到≥0.5M的濃度。除去由此形成的顆粒，具體通過過濾除去。再洗滌過濾器或分離出來的顆粒可導(dǎo)致A1AT產(chǎn)率增加。隨后可以再次進(jìn)行病毒滅活步驟，優(yōu)選在存在≥0.5M檸檬酸鈉、氨基酸、糖或這些物質(zhì)的混合物的情況下進(jìn)行巴斯德消毒。隨后優(yōu)選通過超/滲濾降低所加入物質(zhì)的濃度。更優(yōu)選的，隨后通過納濾器分離病毒顆粒，優(yōu)選孔徑為15-20nm的過濾器。由此獲得的A1AT可作為液體或冷凍制劑保存，或用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法凍干。
如權(quán)利要求12-17所限定的本發(fā)明的A1AT與現(xiàn)有技術(shù)的制劑不同。EP436086和DE4407837的制劑沒有本發(fā)明制劑的高純度和≤1mg/ml的IgA含量。
由此獲得的A1AT產(chǎn)物可作為溶液經(jīng)皮下、肌內(nèi)、局部或作為氣溶膠施用，優(yōu)選靜脈施用。作為干燥材料，它也可以用于以粉末形式吸入。也可以例如以與其它溶液的混合物形式靜脈施用?？赡艿膭┝渴抢缑恐?0mg/kg體重，或每月250mg/每kg體重。
另一個優(yōu)選方法除了上述步驟以外還包括優(yōu)選在如上所述的SD處理和鹽析除去殺病毒劑和其它雜質(zhì)之后進(jìn)行的HIC，優(yōu)選利用苯基基質(zhì)的HIC。優(yōu)選的，進(jìn)行負(fù)純化，即有價值的物質(zhì)A1AT穿過層析基質(zhì)而不結(jié)合，同時不希望的物質(zhì)被結(jié)合并因此從該溶液中去除。
在另一個優(yōu)選方法中可以包括上述HIC，在固定化肝素上的層析優(yōu)選利用肝素-瓊脂糖凝膠(sepharose)或肝素-fractogel進(jìn)行。因而，含A1AT的溶液在柱子中或分批與肝素凝膠接觸。富集的A1AT穿過柱子而不結(jié)合，或者凝膠分離后在出現(xiàn)在上清液中。該工序優(yōu)選在上述離子交換層析之前或之后進(jìn)行，或在鹽析除去去污劑并例如通過透析降低溶液離子強度之后進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明還要求保護(hù)的是包含根據(jù)本發(fā)明的A1AT的藥物，其中所述A1AT作為唯一活性成分或與優(yōu)選類固醇、NSAID的抗炎藥組合，以及根據(jù)本發(fā)明的A1AT用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療A1AT缺乏、肺變性現(xiàn)象如肺纖維化和肺氣腫。
含A1AT的藥物的合適的施用形式對本領(lǐng)域技術(shù)人員是本身所公知的。具體而言，所有的蛋白質(zhì)施用形式都是合適的，如胃腸道外施用、靜脈或吸入施用。
根據(jù)本發(fā)明的方法通過以下實施例進(jìn)一步加以說明實施例1為復(fù)原，以1∶9重量比在堿性pH下攪拌3小時將冷凍Cohn IV1漿溶于20mMTris溶液。
陰離子交換層析用于此工藝步驟的優(yōu)選層析材料是DEAE-Sepharose FF(Fast Flow)，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以根據(jù)每種陰離子交換材料來改變條件。裝好的DEAE-Sepharose FF層析柱用20mM Tris溶液(pH8.0)平衡。此后，在pH8.0處加入溶解的Cohn IV1漿。用平衡緩沖液洗滌，隨后用緩沖溶液洗滌。然后可用20mM Tris、0.075M NaCl、pH8.0洗柱子從而洗脫與基質(zhì)結(jié)合的A1AT。由此獲得的A1AT溶液的比活性是約0.5PEU/mg蛋白(PEU血漿等價單位；對應(yīng)于平均在1毫升人血漿中發(fā)現(xiàn)的A1AT的量或活性)。用高鹽緩沖液(如2M NaCl)洗脫柱子，隨后用本身已知的方法再生層析凝膠。
溶劑/去污劑處理經(jīng)超濾濃縮由此獲得的洗脫液。隨后，加入Triton X-100、TnBP和藥用水的預(yù)混溶液(WFI)，達(dá)到最終濃度為1％(w/w)Triton X-100和0.3％(w/w)TnBP。在適度攪拌下在20℃進(jìn)行SD處理4小時。
鹽析為除去SD試劑并沉淀不希望的伴隨蛋白質(zhì)，用含1.5M檸檬酸鈉和20mM TrispH7.0的溶液稀釋含A1AT的溶液。攪拌下在至少15分鐘期間加入檸檬酸鹽，達(dá)到1M的濃度。隨后，在適度攪拌下孵育該溶液至少1小時。所形成的發(fā)白沉淀隨后經(jīng)過濾分離。這樣將SD試劑濃度降低到低于10ppm，并且不希望的伴隨蛋白質(zhì)和變性的A1AT也被分離出去。
這個生產(chǎn)步驟以后，A1AT的比活性是至少0.8PEU/mg(PEU血漿等價單位；對應(yīng)于平均在1毫升人血漿中發(fā)現(xiàn)的A1AT的量或活性)。
納濾經(jīng)UF/DF除去低分子物質(zhì)以后，由此獲得的溶液用標(biāo)稱排阻尺寸為15-20nm的過濾器如Pall公司的DV20過濾器過濾，以進(jìn)一步增加A1AT產(chǎn)物的病毒安全性。
結(jié)果過濾后產(chǎn)物中Triton X-100和TNBP的濃度低于5ppm。測定產(chǎn)物中A1AT和其它蛋白質(zhì)組分的量并與溶劑/去污劑處理之前測定的量比較。計算得到以下回收率A1AT ＞80％α-2-巨球蛋白 ＜10％觸珠蛋白 ＜40％α-1酸性糖蛋白＜10％IgG ＜10％IgA ＜10％IgM ＜10％結(jié)果表明在產(chǎn)物中A1AT特異性地以高量回收。而產(chǎn)物中明顯除去了其它蛋白組分。這進(jìn)一步由

圖1說明，圖中示出溶劑/去污劑處理之前(泳道2)和鹽析步驟之后(泳道3)的溶液的SDS-PAGE結(jié)果。A1AT對應(yīng)于稍大于50kD(與泳道1中的分子量標(biāo)記物相比)的寬帶。起始溶液中可清楚檢測到的各種其它蛋白組分顯著減少。
實施例2修改如實施例1所述的方法，將離子交換層析得到的含A1AT的洗脫液與肝素-sephaorse接觸。A1AT穿過肝素-sepharose柱子而不結(jié)合。如果采用分批操作，A1AT保留在上清液中。如實施例1中所述進(jìn)一步加工柱洗脫液或得自分批進(jìn)行的變化方案的上清液。由此獲得的產(chǎn)品的特征是純度增加。
圖1表示還原條件下的SDS-PAGE結(jié)果，4-20％梯度，考馬斯藍(lán)染色，5μg蛋白/泳道。泳道1分子量標(biāo)記物；泳道2溶劑/去污劑處理之前的根據(jù)實施例1的溶液的探測；泳道3鹽析步驟之后的根據(jù)實施例1的溶液的探測。
權(quán)利要求
1.從含A1AT的溶液中制備A1AT的方法，包括以下步驟(a)將含A1AT的溶液進(jìn)行離子交換層析；(b)加去污劑和任選的溶劑來滅活脂質(zhì)囊膜病毒；(c)隨后增加鹽濃度使去污劑鹽析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述含A1AT的溶液已經(jīng)從血漿或其級分中獲得，優(yōu)選從復(fù)原的血漿級分IV1(Cohn)中獲得，或來源于重組或轉(zhuǎn)基因表達(dá)的A1AT制劑或發(fā)酵上清液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和/或2的方法，其中離子交換層析在陰離子交換凝膠、優(yōu)選DEAE-Sepharose或DEAE-SepharoseFast Flow上進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項的方法，其中所述根據(jù)步驟(b)的病毒滅活用TritonX-100、Polysorbate 80(Tween 80)、TnBP和/或辛酸或辛酸鹽進(jìn)行，優(yōu)選終濃度≥0.1％(w/w)的Triton和Tween 80、≥0.03％(w/w)的TnBP、≥0.1mM的辛酸或辛酸鹽，保溫時間≥0.1小時、優(yōu)選≥1小時，在≥4℃、尤其是≥15℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項的方法，其中步驟(c)中溶液的鹽濃度為≥0.5M并且由此形成的顆粒優(yōu)選經(jīng)過濾被除去。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項的方法，其中在疏水層析材料上進(jìn)行層析。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項的方法，其中用含固定化形式肝素的材料(肝素凝膠)處理含A1AT的級分。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任意一項的方法，其中隨后進(jìn)行進(jìn)一步的病毒滅活步驟，優(yōu)選在存在≥0.5M檸檬酸鈉、氨基酸、糖或其混合物條件下的巴斯德消毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項的方法，其中溶液的離子強度優(yōu)選經(jīng)超/滲濾降低。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任意一項的方法，其中優(yōu)選經(jīng)納濾、優(yōu)選用孔徑15-20nm的濾器進(jìn)行病毒顆粒的分離。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任意一項的方法，其中所得A1AT級分作為液體、冷凍或凍干制劑保存。
12.A1AT，其純度＞90％，活性形式的活性≥0.8PEU/mg，IgA含量≤1mg/ml，剩余去污劑含量＜50ppm、尤其是＜10ppm，單體含量＞90％，基于A1AT的總量。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的A1AT，由包括以下步驟的方法獲得-復(fù)原血漿級分IV1(Cohn)；-在DEAE--SepharoseFast Flow上進(jìn)行陰離子交換層析；-任選的在含固定化形式肝素的固相上進(jìn)行層析(肝素親合層析)；-任選的疏水相互作用層析(HIC)；-用≥0.1(w/w)Triton/≥0.03％(w/w)TnBP在保溫時間≥1小時在≥15℃下進(jìn)行病毒滅活；-加入鹽增加溶液離子強度；和-過濾除去由此形成的顆粒。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的A1AT，其中隨后進(jìn)行進(jìn)一步的病毒滅活步驟，優(yōu)選在存在≥0.5M檸檬酸鈉、氨基酸、糖或其混合物條件下的巴斯德消毒。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的A1AT，其中溶液的離子強度優(yōu)選經(jīng)超/滲濾降低。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的A1AT，其中包括病毒和/或朊病毒去除或滅活步驟，優(yōu)選經(jīng)納濾、優(yōu)選用孔徑15-20nm的濾器分離病毒顆粒。
17.根據(jù)權(quán)利要求13的A1AT，其中所得A1AT級分作為液體、冷凍或凍干制劑保存。
18.藥物，含有根據(jù)權(quán)利要求12-17中任意一項的A1AT作為唯一活性成分或與優(yōu)選為類固醇、NSAID的抗炎藥組合。
19.根據(jù)權(quán)利要求12-17中任意一項的A1AT用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療A1AT缺乏、肺變性現(xiàn)象如肺纖維化和肺氣腫。
全文摘要
從含A1AT的溶液中制備A1AT的方法，包括以下步驟(a)將含A1AT的溶液進(jìn)行離子交換層析；(b)加去污劑和任選的溶劑來滅活脂質(zhì)囊膜病毒；(c)隨后增加鹽濃度使去污劑鹽析。A1AT純度＞90％，活性形式的活性≥0.8PEU/mg。
文檔編號A61L2/00GK1867582SQ200480020891
公開日2006年11月22日 申請日期2004年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月12日
發(fā)明者彼得拉·舒爾茨, 于爾根·勒米施 申請人:奧克塔法馬股份有限公司