專利名稱：含有產(chǎn)生雌馬酚的乳酸菌的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有雌馬酚(equol)產(chǎn)生能力的乳酸菌、含有該乳酸菌的組合物以及利用該乳酸菌制備雌馬酚的方法。
背景技術(shù)：
已知大豆中含有的異黃酮(大豆異黃酮)對乳腺癌、前列腺癌等具有預(yù)防作用(抗雌激素作用)，并且對更年期障礙、閉經(jīng)后的骨質(zhì)疏松癥·高血脂癥·高血壓等具有改善效果(雌激素樣作用)，以上內(nèi)容主要在歐美被報道(參見H.Adlercreutz，et al.，(1992)Lancet，339，1233；H.Adlercreutz，et al.，(1992)Lancet，342，1209-1210；D.D.Baird，et al.，(1995)J.Clin.Endocrinol.Metab.，80，1685-1690；A.L.Murkies，et al.，(1995)Maturitas.，21，198-195；D.Agnusdei，et al.，(1995)Boneand Mineral.，19(Supple)，S43-S48等)。
最近，大豆異黃酮的臨床效果遭到質(zhì)疑，已有報道指出并非大豆異黃酮，而是大豆異黃酮的活性代謝產(chǎn)物雌馬酚是臨床應(yīng)用有效性的關(guān)鍵。即，與大豆異黃酮比較，其代謝產(chǎn)物雌馬酚對乳腺癌、前列腺癌、更年期障礙及閉經(jīng)后的骨質(zhì)疏松癥更有效，對此公開了各種相關(guān)報道(參見D.Ingram，et al.，(1997)Lancet，350，990-994；A.M.Duncan，et al.，(2000)Cancer Epidemiology，Biomarkers&Prevention，9，581-586；C.Atkinson，et al.，(2002)J.Nutr.，32(3)，595S；H.Akaza，etal.，(2002)Jpn.J.Clin.Oncol.，32(8)，296-300；S.Uchiyama，.et al.，(2001)Ann.Nutr.Metab.，45，113(abs)等)。
在2001年召開的研討會(第4屆大豆預(yù)防和治療慢性疾病國際研討會(圣地亞哥，USA，2001))上已有多個關(guān)于雌馬酚的講演題目，2002年12月報道了關(guān)于雌馬酚的總論，目前，關(guān)于雌馬酚是大豆異黃酮有效性的真正原因已在學術(shù)上得到支持(K.D.R.Settchell，et al.，(2002)J.Nutr.，132，3577-3584)。
與大豆異黃酮比較，雌馬酚對乳房組織、前列腺組織等組織的轉(zhuǎn)移性非常高，由此證明了其生理意義(J.Maubach，et al.，(2003)J.Chromatography B.，784，137-144；T.E.Hedlund，et al.，(2003)TheProstate，154，68-78)。
另外，雌馬酚由腸腔內(nèi)細菌生成，并且其生成因人而異。據(jù)報道日本人中能生成雌馬酚的比例大約為50％(S.Uchiyama.，et al.，(2001)Ann.Nutr.Metab.，45，113(abs))。推測不能產(chǎn)生雌馬酚的人在腸腔中不存在雌馬酚產(chǎn)生菌。認為這些人即使攝取大豆加工食品也不能獲得所希望的抗雌激素作用、雌激素樣作用。為了在這些人中實現(xiàn)所希望的效果，認為只要使其攝取雌馬酚產(chǎn)生菌、或雌馬酚本身即可。
本發(fā)明人根據(jù)以上的構(gòu)思反復(fù)進行研究，結(jié)果首先作為用于發(fā)揮抗雌激素作用、雌激素樣作用等的雌馬酚產(chǎn)生菌，從人糞便中新分離并鑒定了擬桿菌E-23-15(FERM BP-6435號)、鏈球菌E-23-17(FERM BP-6436號)及鏈球菌A6G225(FERM BP-6437號)等3種新菌株，并申請了關(guān)于上述雌馬酚產(chǎn)生菌及其作用的發(fā)明專利(國際公開WO99/07392)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人繼續(xù)進行研究，結(jié)果成功分離并鑒定了本質(zhì)上不同于先前分離、鑒定的微生物的新菌種乳球菌屬的乳酸菌，該乳酸菌具有代謝黃豆苷元的苷、黃豆苷元或二氫黃豆苷元產(chǎn)生雌馬酚的能力。本發(fā)明是基于上述乳酸菌的分離鑒定經(jīng)進一步反復(fù)研究而完成的。
本發(fā)明提供下述1-13項所述要旨的發(fā)明。
第1項、一種含有產(chǎn)生雌馬酚的乳酸菌的組合物，其特征在于，該組合物含有乳球菌屬的乳酸菌作為必須成分，所述乳酸菌具有代謝選自黃豆苷元的苷、黃豆苷元及二氫黃豆苷元組成的組中的至少1種黃豆苷元類化合物產(chǎn)生雌馬酚的能力。
第2項、如第1項所述的組合物，其中，所述乳球菌屬的乳酸菌是格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)。
第3項、如第2項所述的組合物，其中，所述乳球菌屬的乳酸菌是以FERM BP-10036號保藏的乳球菌20-92。
第4項、如第1項所述的組合物，所述組合物進一步含有選自黃豆苷元類及含有黃豆苷元類的物質(zhì)組成的組中的至少1種物質(zhì)。
第5項、如第4項所述的組合物，所述含有黃豆苷元類的物質(zhì)是大豆粉或豆?jié){。
第6項、如第4項所述的組合物，所述組合物是飲料或乳制品形態(tài)。
第7項、如第4項所述的組合物，所述組合物進一步含有雌馬酚。
第8項、如第7項所述的組合物，所述組合物是豆?jié){發(fā)酵物形態(tài)。
第9項、雌馬酚的制備方法，其特征在于，該方法是通過使乳球菌屬的乳酸菌作用于選自黃豆苷元類及含有黃豆苷元類的物質(zhì)組成的組中的至少1種物質(zhì)進行制備，所述乳酸菌具有代謝黃豆苷元類化合物產(chǎn)生雌馬酚的能力。
第10項、如第9項所述的方法，其中，所述乳球菌屬的乳酸菌是格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)。
第11項、如第10項所述的方法，其中，所述乳球菌屬的乳酸菌是以FERM BP-10036號保藏的乳球菌20-92。
第12項、如第9項所述的方法，所述含有黃豆苷元類的物質(zhì)是大豆粉或豆?jié){。
第13項、一種乳球菌屬的乳酸菌，其作為FERM BP-10036號被保藏。
下面，詳細說明本發(fā)明的含有產(chǎn)生雌馬酚的乳酸菌的組合物。
(1)乳球菌屬的乳酸菌本發(fā)明的含有產(chǎn)生雌馬酚的乳酸菌的組合物含有乳球菌屬的乳酸菌作為必須成分，所述乳酸菌具有代謝選自黃豆苷元的苷、黃豆苷元及二氫黃豆苷元組成的組中的至少1種黃豆苷元類化合物產(chǎn)生雌馬酚的能力(代謝活性)。
該乳酸菌的具體例子包括本發(fā)明人從人糞便中新分離鑒定的乳球菌20-92(FERM BP-10036號)。
下面詳細說明該乳球菌的細菌學性質(zhì)。
I.在培養(yǎng)基上的生長狀況使用EG(Eggerth-Gagnon)瓊脂培養(yǎng)基、BL(Blood Liver)瓊脂培養(yǎng)基或GAM(Gifu Anaerobic Medium)培養(yǎng)基并利用加蓋鋼棉的厭氧罐將本菌株在37℃厭氧培養(yǎng)48小時，或在37℃需氧培養(yǎng)48小時，顯示良好的或普通的繁殖狀況。其菌落性狀呈正圓、凸圓狀隆起，表面及邊緣平滑，在EG瓊脂培養(yǎng)基上呈灰白色，在BL瓊脂培養(yǎng)基上呈茶褐色。細菌形態(tài)是革蘭氏陽性雙球菌。本菌株不形成芽孢。
II.生化學性質(zhì)(1)最適生長溫度37℃(2)最宜生長pH 7.0(3)明膠的液化 -(4)由丙酮酸生成乙偶姻 +(5)馬尿酸的水解-(6)七葉苷的水解+(7)吡咯烷基烯丙基酰胺酶+(8)α-半乳糖苷酶 -(9)β-半乳糖苷酶 -(10)β-葡糖苷酸酶 -(11)堿性磷酸酯酶 -(12)亮氨酸烯丙基酰胺酶 +(13)精氨酸二氫酶 +(14)各碳源的同化性D-核糖 +L-阿拉伯糖 -D-甘露醇 +D-山梨糖醇 -
乳糖-D-海藻糖+菊糖-D-棉子糖-淀粉+糖原-(15)胨或葡萄糖代謝后的有機酸組成使用作為糖代謝用培養(yǎng)基的PYF(胨·酵母膏培養(yǎng)基)培養(yǎng)液(約含有5％胨)以及向PYF培養(yǎng)液中添加葡萄糖使其終濃度為0.5％而配制的培養(yǎng)液，將本菌株在需氧條件下，37℃培養(yǎng)72小時，利用HPLC法測定所得培養(yǎng)物中的有機酸。結(jié)果(單位mM)如下表1所示。
表1

nd表示未檢出。
根據(jù)以上的生長性狀及各種生化學性質(zhì)，本菌株被歸屬于作為革蘭氏陽性球菌的格氏乳球菌(Lacrococcus garvieae)，但與其模式菌株(Schleifer，K.H.，Kraus，J.，Dvorak，C.，Kilpper-Blz，R.，Collins，M.D.and Fischer，W.Transfer of Streptococcus lactis and relatedstreptococci to the genus Lactococcus gen.nov.Syst.Appl.Microbiol.，6，183-195，1985；ATCC 43921(JCM10343))和ATCC49156(JCM8735)的不同點在于淀粉的代謝性。
所以，本發(fā)明將本菌株命名為乳球菌20-92(Lactococcus 20-92)，在平成15年1月23日以FERM P-19189號保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利微生物保藏中心(日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號中央6(郵政編碼305-8566))。目前，該菌株被轉(zhuǎn)交至國際保藏單位，其保藏編號為FERM BP-10036。
另外，本菌株代謝葡萄糖后，生成乳酸(L型乳酸)，由此確認該菌株是同型發(fā)酵的乳酸菌。
解析本菌株的16SrRNA的序列后發(fā)現(xiàn)該序列與作為模式菌株的格氏乳球菌(JCM10343)具有99.189％的同源性，與殺魚腸球菌(Enterococcus seruikucuda，JCM8735)具有99.375％的同源性。
基于DNA-DNA同源的結(jié)果，上述殺魚腸球菌與格氏乳球菌相近，所以在1996年又將其歸屬于格氏乳球菌。所以，如上所述，格氏乳球菌中存在2種(JCM8753株和10343株)來源不同的模式菌株。殺魚腸球菌(JCM8735)來源于感染了的鰤腎臟，原來的格氏乳球菌(JCM10343株)來源于牛奶腺炎。
為了研究乳球菌20-92(Lactococcus 20-92)與哪一種模式菌株相近，比較了表現(xiàn)性狀。其結(jié)果如下表2所示。
表2

MK表示甲基萘醌類。
由表2可知，本菌株乳球菌20-92的表現(xiàn)性狀與格氏乳球菌的模式菌株(JMC10343)一致，而與殺魚腸球菌(JCM8735)比較，在40℃時的繁殖性與不產(chǎn)生醌兩方面不同。所以，判斷本菌株與格氏乳球菌(JMC10343株)相似。
本菌株乳球菌20-92被分類于GRAS(美國FDA(食品藥品管理局)的食品·食品添加劑的安全性認證；Generally Recognized As Safe)收載的乳性乳酸球菌，所以認為其作為食品等的安全性高。
而且，迄今為止，還沒有關(guān)于格氏乳球菌對人體的致病性的報道，也無毒素產(chǎn)生，所以認為是安全性高的菌種。
目前，在莫茲阿勒奶酪(mozzarella cheese)、生奶、低溫保存中的肉加工食品、原生質(zhì)(plasome)(真鯛的魚發(fā)酵食品)、TomaPiemontese奶酪(原產(chǎn)地保護的意大利熟練工奶酪(PDO))等中檢出可格氏乳球菌。特別是在原生質(zhì)中以105個/g、在Toma Piemontese奶酪中以108個/g的高含量檢出該菌，作為飲食經(jīng)驗·飲食經(jīng)歷都能確保充分的安全性(P-M.Christine，et al.，(2002)Int.J.Food Microbiol.，73，61-70；M.G.Fortina，et al.，(2003)，F(xiàn)ood Microbial.，20，379-404)。
另一方面，已知殺魚腸球菌對人工養(yǎng)殖的鰤魚等養(yǎng)殖魚具有致病性。考慮到因為乳球菌20-92也是格氏乳球菌，整體上類似于殺魚腸球菌，因此，推測乳球菌20-92也可能對養(yǎng)殖魚具有致病性，但根據(jù)本發(fā)明人的研究，將乳球菌20-92的電顯像與致病性菌株(殺魚腸球菌-KG株)比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株與致病性菌株不同，在菌體表面不存在莢膜。因此認為該菌株沒有致病性，也沒有污染環(huán)境的問題。以上所述的內(nèi)容也能夠得到下述文獻的支持。即，吉田等報道對于菌體對養(yǎng)殖魚的致病性，如果菌體表面存在莢膜則阻礙巨噬細胞的吞噬，結(jié)果導(dǎo)致該菌不能被殺死，被該菌污染的養(yǎng)殖魚會誘發(fā)全身性的敗血癥(T.Yoshida，et al.，(1996)Dis.Aquat.Org.，25，81-86)。
本菌株乳球菌20-92具有以下特征即使在直接發(fā)酵牛奶的情況下，也能維持所希望的雌馬酚產(chǎn)生能力(活性)，上述雌馬酚產(chǎn)生能力的維持不需要特殊的培養(yǎng)基，例如，可以通過直接發(fā)酵豆?jié){，代謝該豆?jié){中的黃豆苷元類，生成雌馬酚。
目前還沒有報道上述具有雌馬酚產(chǎn)生能力的乳球菌屬的乳酸菌的例子。所以，本發(fā)明提供具有所述雌馬酚產(chǎn)生能力的新型乳酸菌。
(2)黃豆苷元類及含有黃豆苷元類的物質(zhì)在本菌株乳球菌20-92代謝的黃豆苷元類中包括黃豆苷元的苷、黃豆苷元及二氫黃豆苷元。作為黃豆苷元的苷的具體例，可以舉出例如黃豆苷。該黃豆苷是以黃豆苷元為苷元的異黃酮苷(黃豆苷元的苷)。該黃豆苷被上述微生物代謝，游離出黃豆苷元，該黃豆苷元進一步代謝生成二氫黃豆苷元，然后最終生成雌馬酚。
本發(fā)明利用上述黃豆苷元類物質(zhì)作為基質(zhì)。該基質(zhì)并不限于黃豆苷元類，也可以利用含有黃豆苷元類的各種物質(zhì)。作為含有該黃豆苷元類的物質(zhì)(含黃豆苷元類的物質(zhì))的代表例，可以舉出大豆異黃酮。大豆異黃酮已經(jīng)在市場上出售，在本發(fā)明中可以利用上述市售品，例如，F(xiàn)UJICCO社制“FUJIFLABONE P10”(注冊商標)等。另外，并不限于大豆異黃酮，例如爬山虎、葛根、紅丁香(red clove)、苜蓿(alfalfa)等植物本身及來源于上述植物的異黃酮衍生物都屬于含有黃豆苷元類的物質(zhì)。
作為含有黃豆苷元類的物質(zhì)的其他具體例，除上述大豆、爬山虎、葛根、紅丁香、苜蓿等食物原料本身以外，還可以舉出上述原料的加工品，例如豆粉、煮大豆、豆腐、油炸豆腐、豆?jié){、大豆胚軸萃取物等，及上述物質(zhì)的發(fā)酵制品，例如豆豉、醬油、豆醬、豆餅(tempe)、發(fā)酵大豆飲料等。上述物質(zhì)中的任一種都含有黃豆苷元類。另外，上述物質(zhì)除含有黃豆苷元類以外，還含有具有雌激素樣作用的異黃酮類，例如染料木黃酮及其苷(染料木苷等)；黃豆黃素(glycitein)及其苷(黃豆黃苷等)；作為含有黃豆苷元及染料木黃酮的一部分被甲基化的前體的鷹嘴豆素甲(Biochanin A)及鷹嘴豆素乙(formononetin)等，也適用于本發(fā)明。
(3)本發(fā)明的組合物(3-1)含有產(chǎn)生雌馬酚的乳酸菌的組合物本發(fā)明的含有產(chǎn)生雌馬酚的乳酸菌的組合物含有以上述乳球菌20-92為代表的乳球菌屬的乳酸菌作為必須成分，所述乳酸菌具有作用于作為基質(zhì)的黃豆苷元類或含有黃豆苷元類的物質(zhì)生成雌馬酚的能力。作為該必須成分的乳酸菌通常是活菌，沒有特別限定，例如，培養(yǎng)液、從該培養(yǎng)液分離得到的含有菌體的培養(yǎng)物的粗品或純品、上述產(chǎn)品的冷凍干燥產(chǎn)品等。
上述微生物的培養(yǎng)液，可以通過例如使用適宜該微生物培養(yǎng)的培養(yǎng)基、例如MRS培養(yǎng)基等，將該微生物37℃培養(yǎng)約48小時而得到。另外，在上述培養(yǎng)后，通過例如在3000rpm、4℃、10分鐘的條件下離心分離并收集菌株而得到上述菌體。可以按照通常使用的方法對其進行精制。另外，也可以冷凍干燥上述菌體。也可以利用由此得到的冷凍干燥菌體作為本發(fā)明組合物的有效成分。
本發(fā)明組合物只要含有作為上述有效成分的微生物(菌體等)即可，沒有其他特別要求，根據(jù)需要還可以含有適宜維持(或增殖)作為上述有效成分的微生物的營養(yǎng)成分。作為該營養(yǎng)成分的具體例子，可以舉出用于培養(yǎng)上述各微生物的營養(yǎng)培養(yǎng)基，例如BHI、EG、BL、GAM培養(yǎng)基等。
作為其他營養(yǎng)成分，例如包括牛乳寡糖、大豆寡糖、乳果糖、乳糖醇、果糖寡糖、半乳糖寡糖等各種寡糖。上述寡糖的配比量沒有特別限定，但通常優(yōu)選在本發(fā)明組合物中為1-3重量％的含量范圍。
上述本發(fā)明組合物經(jīng)攝取后，在攝取者的體內(nèi)發(fā)揮所希望的雌馬酚產(chǎn)生能力。通常日本人具有食用含有黃豆苷元類的食品、代表性食物是上述大豆等食品原料、其加工品、及其發(fā)酵制品等的習慣，所以，只要攝入本發(fā)明組合物，就能夠在體內(nèi)產(chǎn)生雌馬酚。
在本發(fā)明組合物中，根據(jù)需要，還可以適當添加各種維生素類、微量金屬元素等。作為上述維生素類，例如可以列舉維生素B、維生素D、維生素C、維生素E、維生素K(特別是來源于納豆菌的MK-7(甲基萘醌-7))等。作為微量金屬元素，例如可以列舉鋅、硒、鐵、錳等。
本發(fā)明組合物中配合的微生物的含量可以根據(jù)使用的乳酸菌的種類等適當決定。例如，乳球菌20-92的情況下，進行配制，使菌數(shù)(活菌數(shù))達到108～109個/100g組合物左右的含量。該菌數(shù)的測定是通過在細菌培養(yǎng)用瓊脂培養(yǎng)基上接種稀釋過的試樣，37℃下進行需氧培養(yǎng)，測定繁殖后的菌落數(shù)而計算的。上述微生物的配比量以上述含量為標準，可以根據(jù)本發(fā)明組合物的狀態(tài)等適當變化。
(3-2)含有黃豆苷元類的本發(fā)明組合物本發(fā)明組合物可以根據(jù)需要進一步含有選自上述黃豆苷元類及含有黃豆苷元類的物質(zhì)組成的組中的至少1種物質(zhì)。在上述黃豆苷元類及含有黃豆苷元類的物質(zhì)中，特別優(yōu)選大豆胚軸及以其作為原料調(diào)制的食品原料，其中進一步優(yōu)選水溶性或乳化食品原料。作為含有黃豆苷類的物質(zhì)的其他優(yōu)選例，可以列舉大豆粉或豆?jié){。
由于組合物中含有基質(zhì)，所以當沒有食用大豆等食品原料的習慣的人們攝入該組合物時，仍然能通過微生物在體內(nèi)代謝組合物中的基質(zhì)而生成所希望的雌馬酚。
對于黃豆苷元類和/或含有黃豆苷元的物質(zhì)在組合物中的配比量沒有特別限定，通常相當于日本人每日攝入的量，即，10-25mg左右。
(3-3)含有雌馬酚的本發(fā)明組合物本發(fā)明組合物可以進一步含有雌馬酚。
通常使食品原料例如進行乳酸發(fā)酵以改善食品的受歡迎性。作為本發(fā)明組合物中利用的微生物的代表例的乳球菌20-92具有優(yōu)異的雌馬酚產(chǎn)生能力(活性)。本發(fā)明還提供使上述微生物作用于例如豆?jié){等含有黃豆苷元類的物質(zhì)，代謝豆?jié){中的黃豆苷元類生成雌馬酚的豆?jié){發(fā)酵物等含有雌馬酚的組合物。
作為基質(zhì)，可以利用上述各種黃豆苷元類及含有黃豆苷元類的物質(zhì)。其中優(yōu)選由豆?jié){、大豆粉等配制的溶液或乳液。
作為含有雌馬酚的本發(fā)明組合物的一個具體優(yōu)選例，可以舉出向適當?shù)呐囵B(yǎng)基中添加大豆異黃酮或含有大豆異黃酮的食品原料，使本發(fā)明微生物、優(yōu)選乳球菌20-92在該培養(yǎng)基中發(fā)酵得到的發(fā)酵產(chǎn)物。更詳細而言，發(fā)酵是通過以下方法進行的，例如使基質(zhì)呈溶液狀態(tài)并進行滅菌后，向能繁殖本發(fā)明微生物的營養(yǎng)培養(yǎng)基，例如BHI、EG、BL、GAM培養(yǎng)基等，或可用作食品的牛奶、豆?jié){、蔬菜汁等中添加規(guī)定量的本發(fā)明微生物，在37℃、厭氧狀態(tài)或需氧靜置狀態(tài)下，發(fā)酵48-96小時左右(根據(jù)需要可以添加pH調(diào)節(jié)劑、還原物質(zhì)(例如酵母提取物、維生素K1等))。在上述發(fā)酵中，基質(zhì)含量為0.01-0.5mg/mL，微生物的接種量可以在1-5％的范圍中進行選擇。
由此制備含有雌馬酚的本發(fā)明組合物。該組合物可以以上述發(fā)酵產(chǎn)物的狀態(tài)制成食品、藥品等適當?shù)漠a(chǎn)品。另外，可以利用通常使用的方法由得到的培養(yǎng)物分離精制雌馬酚，還可以根據(jù)需要，向其中進一步適當配合其他食品原料等，調(diào)制成適當?shù)氖称沸螒B(tài)或藥品形態(tài)。
上述分離精制可以如下進行，例如使發(fā)酵培養(yǎng)物吸附到離子交換樹脂(DIAION HP20，三菱化成社制)上以后，用甲醇溶出，干燥固定。
本發(fā)明組合物中的雌馬酚含量根據(jù)調(diào)制的食品形態(tài)及藥品形態(tài)決定，沒有特別限定，但通常在總量為100g的組合物中雌馬酚含量優(yōu)選在2-5mg范圍內(nèi)。
可以通過例如下述試驗例1中所示的方法確認得到的本發(fā)明組合物中含有雌馬酚。
含有雌馬酚的本發(fā)明組合物具有以下優(yōu)點由于作為其有效成分的雌馬酚是天然物質(zhì)，所以安全性優(yōu)異，另外，由于本發(fā)明組合物是使用乳酸菌配制而成的，所以不會混入來源于制備工序的化學藥品等，而且高收率、低成本，作為食品味道佳等。
(3-4)食品形態(tài)含有產(chǎn)生雌馬酚的乳酸菌的本發(fā)明組合物，通常含有上述特定的乳酸菌作為必須成分，與適當?shù)目墒秤幂d體一同調(diào)制成食品形態(tài)。
作為食品形態(tài)的本發(fā)明組合物的具體例，可以舉出飲料形態(tài)、飲料形態(tài)以外的乳制品形態(tài)(包括發(fā)酵乳)、固體食品形態(tài)、含菌微囊形態(tài)等。飲料形態(tài)的本發(fā)明組合物包括乳酸菌飲料和加入乳酸菌的飲料。
上述“發(fā)酵乳”及“乳酸菌飲料”等用語是根據(jù)原厚生省“關(guān)于乳及乳制品的成分等的省令”第二條37“發(fā)酵乳”及38“乳酸菌飲料”的定義。即，所謂“發(fā)酵乳”是指利用乳酸菌或酵母使乳及乳制品發(fā)酵制成的糊狀或液體狀物質(zhì)。所以，該發(fā)酵乳中同時含有飲料形態(tài)和酸乳酪形態(tài)等?！叭樗峋嬃稀笔侵敢岳萌樗峋蚪湍甘谷榧叭橹破钒l(fā)酵制成的糊狀或液體狀物質(zhì)為主要原料，用水稀釋得到的飲料。
作為加入乳酸菌的飲料，可以列舉發(fā)酵蔬菜飲料、發(fā)酵果實飲料及發(fā)酵豆?jié){飲料等。在飲料形態(tài)以外的乳制品形態(tài)中還包括片狀形態(tài)，例如酸奶酪等。固體食品形態(tài)包括顆粒、粉末(包括發(fā)酵乳凍干粉等)、片劑、發(fā)泡制劑、口香糖、果凍、布丁等形態(tài)。
可以按照常規(guī)方法調(diào)整成上述各形態(tài)。在調(diào)制成上述各形態(tài)時使用的載體只要是可食用性載體中的任一個即可。特別優(yōu)選口感良好、且具有味覺改善效果的載體。作為口感良好、且具有味覺改善效果的載體的具體例，例如，可以列舉人造甜味劑、山梨糖醇、木糖醇等。作為其他優(yōu)選載體，可以列舉掩蔽劑，例如海藻糖(林原社制)、環(huán)糊精、Benecoat BMI(花王社制)等。
下面詳細說明作為食品形態(tài)優(yōu)選具體例子的加入乳酸菌的飲料，上述飲料形態(tài)的調(diào)制是利用以下方法進行的，在含有微生物營養(yǎng)源的適當發(fā)酵用原料物質(zhì)、例如蔬菜類、果實類、豆?jié){(大豆乳液)等的液體中，培養(yǎng)微生物，使上述原料物質(zhì)發(fā)酵。作為發(fā)酵用原料物質(zhì)的蔬菜類和果實類包括各種蔬菜及果實的切斷物、粉碎物、研磨物、榨汁、酶處理物、及其稀釋物和濃縮物。蔬菜類包括南瓜、大蒜、馬鈴薯、圓辣椒、芹、菠菜、有色甘薯、玉米、甜菜、羽衣甘藍、荷蘭芹、甘藍、椰菜等。果實類包括蘋果、桃子、香蕉、草莓、葡萄、西瓜、橙子、蜜桔等。
蔬菜和果實的切斷物、粉碎物及研磨物是通過例如洗凈上述蔬菜或果實類后，根據(jù)需要實施放入開水中等支化處理后，使用粉碎機、攪拌機、食品加工機、碎漿機、微?；瘷C等切斷、粉碎、研磨后即可得到。榨汁例如可以使用壓濾機、榨汁機等進行調(diào)制。另外，可以使用濾布等對上述研磨物進行過濾來調(diào)制榨汁。酶處理物是利用纖維素酶、果膠酶、原果膠分解酶等作用于上述切斷物、粉碎物、研磨物、榨汁等而進行調(diào)制的。稀釋物中包括用水稀釋1-50倍得到的物質(zhì)。濃縮物包括利用例如冷凍濃縮、減壓濃縮等方法濃縮1-100倍得到的物質(zhì)。
作為發(fā)酵用原料物質(zhì)的其他具體例子的豆?jié){是利用常規(guī)方法由大豆原料調(diào)制而成的。該豆?jié){中包括例如用水浸漬脫皮大豆后，用膠體磨等適當?shù)姆鬯闄C實施濕式粉碎處理后，根據(jù)常規(guī)方法進行均化處理得到的均質(zhì)化液體；將水溶性大豆蛋白質(zhì)溶解于水中得到的溶解液等。
利用微生物的發(fā)酵可以通過在發(fā)酵用原料物質(zhì)中接種本發(fā)明微生物，進行靜置培養(yǎng)來實施?？梢愿鶕?jù)需要向培養(yǎng)基中加入以下用于使本發(fā)明微生物的繁殖良好的物質(zhì)，所述物質(zhì)包括例如葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、糊精、山梨糖醇、果糖等碳源，酵母提取物、胨等氮源，維生素類、礦物質(zhì)等。
微生物的接種量通常從能夠使1cc含有發(fā)酵用原料物質(zhì)的溶液中菌體量大于或等于1×106個、優(yōu)選為1×107個左右的量中選擇。培養(yǎng)條件通常如下選擇發(fā)酵溫度20-40℃，優(yōu)選25-37℃，較優(yōu)選37℃，發(fā)酵時間為8-24小時。
為了進行穩(wěn)定的發(fā)酵，推薦下述方法預(yù)先準備發(fā)酵引子，并將其接種到發(fā)酵用原料物質(zhì)上，進行發(fā)酵。作為發(fā)酵引子，例如，可以代表性地列舉在添加有預(yù)先進行了90-121℃、5-20分鐘的普通殺菌處理的發(fā)酵用原料物質(zhì)、酵母提取物的10％脫脂奶粉等中接種本發(fā)明菌體，然后在相同的條件下培養(yǎng)所得到的物質(zhì)。由此得到的發(fā)酵引子中本發(fā)明微生物的含量通常為107-109個/g培養(yǎng)物。
如上所述得到的乳酸發(fā)酵物有時具有片狀形態(tài)(酸奶酪狀或布丁狀形態(tài))，可以將其直接作為食品攝取。將該片狀形態(tài)的乳酸發(fā)酵物進一步均質(zhì)化，能制成所希望的飲料形態(tài)(例如發(fā)酵豆?jié){飲料等)。上述均質(zhì)化可以使用通常的乳化機(均化機)實現(xiàn)。具體而言，該均質(zhì)化是使用例如GAULIN社制高壓均化機(LAB40)，在約200-1000kgf/cm2、優(yōu)選約300-800kgf/cm2的條件下，或使用三和機械工業(yè)社制均化機(產(chǎn)品型號HA×4571，H20-A2等)在大于或等于150kgf/cm2的條件下實施。利用上述均質(zhì)化，能得到口感優(yōu)異、特別是具有爽滑感的飲料制品，特別是能得到發(fā)酵豆?jié){飲料制品。另外，在上述均質(zhì)化中，根據(jù)需要適當進行稀釋，或添加用于調(diào)節(jié)pH的有機酸類，或添加糖類、果汁、增稠劑、表面活性劑、香料等在飲料的制備中通常使用的各種添加劑。作為優(yōu)選的添加劑與其添加量(相對片狀發(fā)酵物重量的重量％)的一個具體例子，例如可以舉出葡萄糖為8％(重量％，下同)，砂糖為8％，糊精為8％，檸檬酸為0.1％，甘油脂肪酸酯為0.2％及香料為0.1％。
可以利用常規(guī)方法將上述得到的發(fā)酵豆?jié){飲料等本發(fā)明乳酸菌飲料無菌罐裝到適當?shù)娜萜髦兄瞥僧a(chǎn)品。該產(chǎn)品具有爽滑的口感和味道。
其給與(攝取)量根據(jù)攝取上述產(chǎn)品的個體的年齡、性別、體重、疾病的程度等適當決定，沒有特別限定。通常每天服用100-300mL微生物含量為108-109個/mL的飲料產(chǎn)品。
作為本發(fā)明組合物的食品形態(tài)的其他具體例子，可以舉出發(fā)泡制劑形態(tài)的本發(fā)明組合物。其配制方法是在0.01-50％(重量％、下同)本發(fā)明微生物(菌體冷凍干燥物)中配合10-35％碳酸鈉和(或)碳酸氫鈉、以及20-70％中和劑作為發(fā)泡成分，進行調(diào)制。使用的中和劑是能使上述碳酸鈉和碳酸氫鈉中和生成二氧化碳的酸性化合物。該化合物例如包括具有代表性的L-酒石酸、檸檬酸、富馬酸、抗壞血酸等有機酸。
對于上述發(fā)泡成分在本發(fā)明發(fā)泡制劑中的配比，當使得到的本發(fā)明制劑溶于水時，其配比是能使溶液呈酸性、特別是pH約為3.5-4.6的酸性程度的比例。更具體而言，上述比例可以在碳酸鈉和(或)碳酸氫鈉為10-35％、中和劑為20-70％的范圍內(nèi)選擇。特別是碳酸鈉可以在11-31％的范圍、優(yōu)選22-26％的范圍內(nèi)選擇，碳酸氫鈉可以在10-35％的范圍、優(yōu)選20-30％的范圍內(nèi)選擇。其中最優(yōu)選單獨使用20-25％范圍內(nèi)的碳酸氫鈉。另外，中和劑在20-70％的范圍、優(yōu)選30-40％的范圍內(nèi)選擇，最優(yōu)選使用20-25％的L-酒石酸、8-15％的抗壞血酸。
本發(fā)泡制劑以本發(fā)明微生物及發(fā)泡成分作為必須成分，除此之外，可以根據(jù)需要適當添加通常已知的各種添加劑成分，例如賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、增稠劑、表面活性劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、電解質(zhì)、甜味劑、香料、色素、pH調(diào)節(jié)劑等。作為上述添加劑，例如可以適當選擇使用小麥淀粉、馬鈴薯淀粉、玉米淀粉、糊精等淀粉類；蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖、乳糖等糖類；山梨糖醇、甘露醇、麥芽糖醇、木糖醇等糖醇類；雙糖(coupling sugar)、帕拉金糖等糖轉(zhuǎn)移苷；磷酸鈣、硫酸鈣等賦形劑；淀粉、糖類、明膠、阿拉伯膠、糊精、甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、羥丙基纖維素、黃原膠、果膠、胺黃樹膠、明膠、海藻酸等粘合劑或增稠劑；亮氨酸、異亮氨酸、L-纈氨酸、糖酯、固化油、硬脂酸、硬脂酸鎂、滑石、聚乙二醇等潤滑劑；結(jié)晶纖維素(旭化成社制“avicel”)、羧甲基纖維素(CMC)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、羧甲基纖維素鈣(CMC-Ca)等崩解劑；聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯(polysorbate)、卵磷脂等表面活性劑；天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、阿力甜等二肽；甜菊、糖精等甜味劑等?？梢愿鶕?jù)上述成分與必須成分的關(guān)系或制劑的性質(zhì)、制備方法等，適當選擇其使用量。
在本發(fā)明發(fā)泡制劑中，可以適量添加維生素類、特別是維生素B12、抗壞血酸(維生素C)等。其配比沒有特別限定，但通常維生素C的用量從小于或等于30％、優(yōu)選5-25％的范圍內(nèi)選擇。
本發(fā)明發(fā)泡制劑的制備方法基本上與通常的該類發(fā)泡片劑的制備方法相同。即，發(fā)泡片劑形態(tài)的本發(fā)明制劑是通過稱量、混合規(guī)定量的各成分，經(jīng)直接粉末壓縮法、干式或濕式顆粒壓縮法等調(diào)制而成的。
只需將上述得到的本發(fā)明制劑投入水中，即可制成適合經(jīng)口給藥的飲料形態(tài)，然后將其經(jīng)口給藥。
其給藥(攝取)量可以依據(jù)應(yīng)該使用該制劑的患者的年齡、性別、體重、疾病的程度等適當選擇，沒有特別限定，通常每次可以將1-2片、每片1.5-6.0g的本發(fā)明發(fā)泡片劑溶解于100-300mL水中服用。
作為本發(fā)明組合物中的基質(zhì)的黃豆苷元類或含有黃豆苷元類的物質(zhì)、特定乳酸菌及根據(jù)需要添加的其他成分的特別優(yōu)選的混合比例，優(yōu)選相對100g本發(fā)明組合物，黃豆苷元類或含有黃豆苷元類的物質(zhì)以黃豆苷元計算約在10-50mg的范圍內(nèi)，乳酸菌在109-1010個(以活菌數(shù)計)的范圍內(nèi)，寡糖等約在1-5g的范圍內(nèi)。
如上所述，本發(fā)明含有產(chǎn)生雌馬酚的乳酸菌的組合物由于含有微生物(主要是活菌)，因此在用該組合物調(diào)制產(chǎn)品時，基本不優(yōu)選采用加熱、加壓等條件。所以，在將本發(fā)明組合物調(diào)制成例如棒狀、顆粒、粉末、片劑等產(chǎn)品形態(tài)時，優(yōu)選將微生物制成冷凍干燥菌體直接用于處方，或利用適當?shù)陌聞┘庸だ鋬龈稍锞w進行使用。
但是，本發(fā)明的含有產(chǎn)生雌馬酚的乳酸菌的組合物不必特別含有活菌。配合活菌和該活菌能代謝的黃豆苷元類等的本發(fā)明組合物在已經(jīng)產(chǎn)生所希望的雌馬酚的情況下，可以利用常規(guī)方法對該組合物進行加熱滅菌處理，殺滅該組合物中存在的菌體。如果采用上述加熱滅菌處理，則在配合活菌和該活菌能代謝的黃豆苷元類等的本發(fā)明組合物的情況下，可以避免該組合物中存在的活菌在該組合物的保存過程中或流通過程中過度發(fā)酵，使味道、氣味等惡化。
(3-5)藥品形態(tài)本發(fā)明的含有產(chǎn)生雌馬酚的乳酸菌的組合物通常以上述特定的乳酸菌作為必須成分，并與適當?shù)乃帉W上可接受的制劑載體調(diào)制成藥物制劑形態(tài)。
作為制劑載體，通常可以列舉已知在該領(lǐng)域使用的填充劑、增量劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑等稀釋劑或賦形劑?？梢愿鶕?jù)得到的制劑的給藥單位形態(tài)適當選擇使用上述制劑載體。
作為藥物制劑的給藥單位形態(tài)可以選擇各種形態(tài)。作為其代表例可以列舉片劑、丸劑、散劑、液體制劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、膠囊劑、栓劑等。
制成片劑形態(tài)時，作為上述制劑載體，例如可以使用乳糖、白糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸鈣、高嶺土、結(jié)晶纖維素、硅酸、磷酸鉀等賦形劑；水、乙醇、丙醇、單糖漿、葡萄糖液、淀粉液、明膠溶液、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮等粘合劑；羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鈣、低取代羥丙基纖維素、干燥淀粉、海藻酸鈉、瓊脂粉末、海帶淀粉粉末、碳酸氫鈉、碳酸鈣等崩解劑；聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯類、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸單甘油酯等表面活性劑；白糖、硬脂精、可可黃油、加氫油等崩解抑制劑；季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等吸收促進劑；甘油、淀粉等保濕劑；淀粉、乳糖、高嶺土、膨潤土、膠狀硅酸等吸附劑；精制滑石、硬脂酸鹽、硼酸粉末、聚乙二醇等潤滑劑等。
片劑可以根據(jù)需要制成進行了普通包衣的片劑，例如糖衣片、明膠包衣片、腸溶包衣片、包膜片或雙層片、多層片。
制成丸劑形態(tài)時，作為制劑載體，例如可以使用葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、固化植物油、高嶺土、滑石等賦形劑；阿拉伯膠粉末、胺黃樹膠粉末、明膠、乙醇等粘合劑；海帶淀粉、瓊脂等崩解劑等。
制成栓劑形態(tài)時，作為制劑載體，例如可以使用聚乙二醇、可可脂、高級醇、高級醇酯類、明膠、半合成甘油酯等。膠劑可以利用常規(guī)方法將本發(fā)明微生物與上述列舉的各種制劑載體混合，填充到硬膠、軟膠等中調(diào)制而成。
另外，根據(jù)需要，本發(fā)明制劑中還可以含有著色劑、保存劑、香料、調(diào)味劑、甜味劑等或其他藥品。
本發(fā)明中應(yīng)該含有的本發(fā)明微生物的量沒有特別限定，可以在大范圍內(nèi)進行選擇。通常，可以使其在藥品制劑中含有108-1010個/g。
對于上述藥物制劑的給藥方法沒有特別限定，根據(jù)各種制劑形態(tài)、患者的年齡、性別等其他條件、疾病的程度等決定。例如，片劑、丸劑、液體制劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑及膠劑選擇經(jīng)口給藥，栓劑選擇直腸內(nèi)給藥。
上述藥物制劑的給藥量依據(jù)其用法、患者的年齡、性別等其他條件、疾病的程度等適當選擇，但通常每日每1kg體重給與約0.5-20mg作為有效成分的本發(fā)明微生物，該制劑可以每日分1-4次進行給藥。
通過攝取(給予)本發(fā)明組合物，本發(fā)明組合物中的微生物可以以活菌的狀態(tài)到達消化道下部，或作為常駐菌寄居下來，從而發(fā)揮所期待的效果。特別優(yōu)選的制劑是腸溶性片劑形態(tài)，由此能不受胃酸破壞地使微生物到達腸腔。
如上所述地得到的本發(fā)明的含有產(chǎn)生雌馬酚的乳酸菌的組合物對中老年女性的情緒起伏或伴隨閉經(jīng)出現(xiàn)的例如骨質(zhì)疏松、更年期障礙等癥狀的預(yù)防及治療是有用的。所述預(yù)防及治療是通過對需要服藥的中老年女性給予有效量的上述本發(fā)明組合物或使其攝取有效量的上述本發(fā)明組合物而進行的。該有效量只要通過給予本發(fā)明組合物能預(yù)防和治療中老年女性的情緒起伏或伴隨閉經(jīng)出現(xiàn)的例如骨質(zhì)疏松、更年期障礙等癥狀即可，沒有特別限定，通常，以能使在攝取本發(fā)明組合物的人的尿液中的雌馬酚排泄量大于或等于5μmole(約1.2mg)/日的量為目標。


圖1是表示利用試驗例1中所示的方法求得的培養(yǎng)時間與活菌數(shù)的關(guān)系的曲線圖。
圖2是表示利用試驗例1中所示的方法求得的培養(yǎng)時間與雌馬酚產(chǎn)生能力(得分)的關(guān)系的曲線圖。
圖3是表示利用試驗例1中所示的方法求得的培養(yǎng)時間與雌馬酚產(chǎn)生量的關(guān)系的曲線圖。
圖4是表示利用試驗例2中所示的方法求得的培養(yǎng)物中的黃豆苷元類及雌馬酚的經(jīng)時變化的曲線圖。
圖5是表示利用試驗例3中所示的方法求得的保存時間與雌馬酚產(chǎn)生能力(得分)的關(guān)系的曲線圖。
圖6是表示由試驗例1-3所示的試驗求得的雌馬酚產(chǎn)生菌隨培養(yǎng)時間的變化狀態(tài)(增殖性、雌馬酚產(chǎn)生能力及雌馬酚產(chǎn)生量的變化)的曲線圖。
圖7是表示利用試驗例4中所示的方法求得的培養(yǎng)時間與活菌數(shù)的關(guān)系的曲線圖。
具體實施例方式
下面為了更詳細地說明本發(fā)明，列舉本發(fā)明的含有產(chǎn)生雌馬酚的乳酸菌的組合物的調(diào)制例作為實施例，但本發(fā)明并不限定于這些實施例。
實施例1(1)發(fā)酵豆?jié){飲料的調(diào)制稱量、混合下列處方的各成分，調(diào)制發(fā)酵豆?jié){飲料形態(tài)的本發(fā)明組合物。
水溶性大豆蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)物100mL維生素·礦物質(zhì)適量香料 適量水適量總量 150mL上述水溶性大豆蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)物通過下述方法調(diào)制，將13g水溶性大豆蛋白溶解在100mL水中，向其中添加108-109個乳球菌20-92(FERM BP-10036)，在37℃使其發(fā)酵24-48小時即得。另外，在1g所使用的水溶性大豆蛋白中含有以黃豆苷元換算為1-2mg的黃豆苷元類物質(zhì)。
(2)發(fā)酵乳的調(diào)制稱量、混合下列處方的各成分，調(diào)制發(fā)酵乳形態(tài)的本發(fā)明組合物。
乳球菌20-92發(fā)酵乳100mL維生素·礦物質(zhì) 適量香料 適量水 適量總量 150mL乳球菌20-92發(fā)酵乳通過下述方法調(diào)制，向1L牛奶(脫脂奶固體成分大于或等于8.5％、奶脂成分大于或等于3.8％)中加入108-109個乳球菌20-92(FERM BP-10036)，在37℃使其發(fā)酵24-48小時即得。
(3)發(fā)酵豆?jié){凍干粉末的調(diào)制使用大約109個乳球菌20-92(FERM BP-10036)，使100g豆?jié){(大豆固體成分含量為10％，黃豆苷元含量換算成黃豆苷元為10-15mg)在37℃乳酸發(fā)酵72-96小時，生成雌馬酚。將其冷凍干燥得到粉末。利用HPLC測定粉末中的雌馬酚含量，結(jié)果為0.1-0.3重量％。
使用上述粉末，稱量、混合下列處方的各成分，調(diào)制粉末形態(tài)的本發(fā)明組合物(食品形態(tài)及藥品形態(tài))。
發(fā)酵豆?jié){凍干粉末2.2g
(雌馬酚含量0.005g)賦形劑(玉米淀粉) 17g維生素·礦物質(zhì) 適量香料 適量總量 20g(4)粉末的調(diào)制稱量、混合下列處方的各成分，調(diào)制粉末形態(tài)(食品形態(tài)及藥品形態(tài))的本發(fā)明組合物。
乳球菌20-92凍干粉末4.1g賦形劑(乳糖) 1.0g維生素·礦物質(zhì) 適量香料 適量總量 20g乳球菌20-92凍干粉末通過下述方法調(diào)制，使用能增殖的適當液體培養(yǎng)基(MRS)培養(yǎng)(37℃、24-48小時)乳球菌20-92(FERM BP-10036)后，將收集的細菌混懸在10％脫脂奶中后，經(jīng)冷凍干燥后即得，其中菌體含量為109-1010個/g。
也可以在上述粉末中進一步配合4.1g粗制大豆異黃酮粉末，制成含有黃豆苷元的粉末。
攝取上述得到的含有黃豆苷元的粉末，可以觀察到雌馬酚每日在尿中的排泄量約有5μmole(約1.2mg)，所以，能確定與該排泄量相對應(yīng)的體內(nèi)產(chǎn)生的雌馬酚。
(5)顆粒的調(diào)制稱量、混合下列處方的各成分，調(diào)制顆粒形態(tài)(食品形態(tài)及藥品形態(tài))的本發(fā)明組合物。
粗制大豆異黃酮粉末4.1g乳球菌20-92凍干粉末 1.0g蔗糖酸酯 適量維生素·礦物質(zhì)適量香料適量總量20g作為乳球菌20-92凍干粉末使用與上述(1)相同的物質(zhì)。
通過攝取該制劑，能使黃豆苷元與產(chǎn)生雌馬酚的菌一起到達大腸內(nèi)，由此在大腸內(nèi)產(chǎn)生雌馬酚。
下面列舉對本發(fā)明的產(chǎn)生雌馬酚的乳酸菌進行的試驗例。
試驗例1增殖性與雌馬酚產(chǎn)生能力(活性)及生成量試驗(1)試驗方法將乳球菌20-92菌株(107-109個/g)在5mL BHI培養(yǎng)液(增殖用液體培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基))中，37℃厭氧培養(yǎng)24小時，然后用基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋至102及104，調(diào)制稀釋液。
分別取0.2mL培養(yǎng)結(jié)束后的培養(yǎng)液及各種稀釋液，與含有黃豆苷元的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(向BHI培養(yǎng)液中添加黃豆苷元至其含量達到10μg/mL)、牛奶及豆?jié){各5mL分別混合，在37℃厭氧培養(yǎng)。在含有10μg/mL黃豆苷元的基礎(chǔ)培養(yǎng)基及豆?jié){中培養(yǎng)時的培養(yǎng)時間為8小時、24小時、48小時、72小時和96小時，在牛奶中培養(yǎng)時的培養(yǎng)時間為24小時和48小時。
在培養(yǎng)開始前和各次培養(yǎng)結(jié)束后，取0.1mL及0.2mL培養(yǎng)液作為樣品，分別用于菌數(shù)測定和雌馬酚產(chǎn)生能力(活性)的測定。另外，對于含有10μg/mL黃豆苷元的基礎(chǔ)培養(yǎng)基及豆?jié){，在培養(yǎng)開始前和各次培養(yǎng)結(jié)束時，取0.5mL培養(yǎng)液作為樣品，測定該培養(yǎng)液中的雌馬酚產(chǎn)生量。
菌數(shù)的測定如下進行。即，將0.1mL的各樣品用PBS(-)溶液(NISSUI社制)稀釋，制成104、105、106及107稀釋液，將0.1mL的上述各稀釋液接種在GAM瓊脂培養(yǎng)基上，37℃下需氧培養(yǎng)24小時，測定培養(yǎng)基上生成的菌落數(shù)，將其作為菌數(shù)。
雌馬酚產(chǎn)生能力(活性)的測定如下進行。即，取0.2mL各樣品與5mL含有黃豆苷元的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(各3管)混合，37℃厭氧培養(yǎng)96小時，培養(yǎng)結(jié)束后，取各培養(yǎng)液0.5mL作為樣品，用5mL乙酸乙酯萃取2次，利用HPLC測定萃取液中的黃豆苷元、二氫黃豆苷元(中間體)及雌馬酚的含量，并計算雌馬酚在上述化合物總量中所占的比例。將得到的結(jié)果以下面5個階段進行評分，以3個樣品的平均分數(shù)作為雌馬酚產(chǎn)生能力(活性)的指標。
4雌馬酚比例大于或等于90％、3產(chǎn)生雌馬酚，黃豆苷元減少至小于50％(有中間體)、2產(chǎn)生雌馬酚，黃豆苷元殘留量大于或等于50％(有中間體)、1產(chǎn)生中間體，未產(chǎn)生雌馬酚、0未產(chǎn)生中間體和雌馬酚，黃豆苷元未減少。
雌馬酚含量的測定如下進行。即，取各樣品0.5mL，用5mL乙酸乙酯萃取2次，利用HPLC測定萃取液中的黃豆苷元、二氫黃豆苷元(中間體)及雌馬酚。計算各濃度作為雌馬酚產(chǎn)生量。
(2)試驗結(jié)果(2-1)測定菌數(shù)(增殖性)的結(jié)果如圖1所示。
圖中，(1)是利用含有黃豆苷元的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的結(jié)果，(2)是利用豆?jié){培養(yǎng)的結(jié)果，(3)是利用牛奶培養(yǎng)的結(jié)果。在各圖中，橫軸表示培養(yǎng)時間(hr)，縱軸表示活菌數(shù)(Log cfu/ml)。
由各圖所示的結(jié)果可知，本菌株的增殖性良好，在含有黃豆苷元的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、豆?jié){及牛奶的任一種中，不管接種量如何，培養(yǎng)8小時后都達到穩(wěn)定狀態(tài)。關(guān)于菌數(shù)，在含有黃豆苷元的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中維持109.1-9.4個/mL，在豆?jié){中維持108.5-8.7個/mL，在牛奶中維持108.0-8.4個/mL。
(2-2)雌馬酚產(chǎn)生能力(活性)的計算結(jié)果如圖2所示。
圖2中，(1)是利用含有黃豆苷元的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的結(jié)果，(2)是利用豆?jié){培養(yǎng)的結(jié)果，(3)是利用牛奶培養(yǎng)的結(jié)果。在各圖中，橫軸表示培養(yǎng)時間(hr)，縱軸表示分數(shù)。
由該圖所示的結(jié)果可知，在含有黃豆苷元的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、豆?jié){及牛奶任一種中，雌馬酚產(chǎn)生能力(活性)具有經(jīng)時增加的傾向。而且即使在利用牛奶和豆?jié){培養(yǎng)時，也能保持該菌株的雌馬酚產(chǎn)生能力(活性)。
(2-3)雌馬酚產(chǎn)生量測定結(jié)果測定含有黃豆苷元的培養(yǎng)基及豆?jié){(換算成黃豆苷元約為80μg/mL)中產(chǎn)生的雌馬酚量，其結(jié)果如圖3所示。
圖3中，(1)是利用含有黃豆苷元的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的結(jié)果，(2)是利用豆?jié){培養(yǎng)的結(jié)果。在各圖中，橫軸表示培養(yǎng)時間(hr)，縱軸表示雌馬酚濃度(μg/mL)。
兩種培養(yǎng)基中，都發(fā)現(xiàn)從培養(yǎng)開始48小時后產(chǎn)生雌馬酚。利用豆?jié){培養(yǎng)時，可觀察到接種量不同導(dǎo)致的雌馬酚的生成量差異，特別是接種4.00％時，培養(yǎng)96小時后，雌馬酚生成量達到57.0μg/mL的顯著量。
在豆?jié){中，作為雌馬酚的基質(zhì)的黃豆苷元90％或90％以上以苷(與葡萄糖結(jié)合的狀態(tài))的形式存在，由于在測定的色譜中，該苷的峰消失，所以認為該菌株是在分解苷(β-糖苷酶活性)生成黃豆苷元后，將該黃豆苷元代謝成雌馬酚。
試驗例2乳球菌20-92菌株的雌馬酚生成路徑(1)試驗方法將乳球菌20-92菌株(107個/g)在5mL BHI培養(yǎng)液(增殖用液體培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基))中，37℃厭氧培養(yǎng)24小時后，取0.2mL培養(yǎng)液，與5mL含有黃豆苷元的基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合，在37℃厭氧培養(yǎng)。培養(yǎng)時間為8小時、24小時、30小時、36小時、48小時、51小時、54小時、60小時、84小時和96小時。
在培養(yǎng)開始前和各次培養(yǎng)結(jié)束時，取0.5mL培養(yǎng)液作為樣品，測定樣品中的黃豆苷元、二氫黃豆苷元(中間體)及雌馬酚的濃度。
(2)結(jié)果結(jié)果如圖4所示。
圖4表示黃豆苷元(左圖)、二氫黃豆苷元(中間圖)及雌馬酚(右圖)各自的經(jīng)時濃度變化。圖中，橫軸表示培養(yǎng)時間(hr)，縱軸表示各物質(zhì)的濃度(μg/mL)。
由圖4所示的結(jié)果可知，培養(yǎng)后，在第48小時，黃豆苷元濃度開始減少，作為中間體的二氫黃豆苷元在第48-60小時出現(xiàn)，從第48小時開始生成雌馬酚。另外，在第60小時由黃豆苷元向雌馬酚的代謝基本結(jié)束。
可以確定由黃豆苷元向雌馬酚的代謝是以經(jīng)過中間體二氫黃豆苷元的形式進行的，但推測二氫黃豆苷元的生成和由其向雌馬酚的代謝是一同進行的。
試驗例3含有乳球菌20-92菌株的發(fā)酵乳的低溫穩(wěn)定性(1)試驗方法將乳球菌20-92菌株在5mL增殖用液體培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)中，37℃厭氧培養(yǎng)24小時后，分別在1L、2L牛奶及市售的脫脂奶(固體成分為10％)中接種4％，然后在需氧條件下，37℃靜置培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)后，于4℃下保存。
在牛奶中培養(yǎng)時，測定培養(yǎng)結(jié)束時及4℃低溫保存后每周測定雌馬酚產(chǎn)生能力(活性)，直至第4周。而且，只將其中2管分別保存至第42天、51天，測定活性。
在脫脂奶中培養(yǎng)時，測定培養(yǎng)結(jié)束時及4℃低溫保存后第1周和第34天的活性。
培養(yǎng)開始前和各保存時的活性如下判斷，基于上述方法，分別在3管5mL含有10μg/mL黃豆苷元的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別接種4％(0.2mL)，在37℃厭氧培養(yǎng)96小時，然后測定培養(yǎng)基中的黃豆苷元、二氫黃豆苷元(中間體)及雌馬酚的濃度，由此進行判斷。
(2)結(jié)果結(jié)果如圖5所示。圖5中，橫軸表示保存時間(日)，縱軸表示分數(shù)。
由圖中所示結(jié)果可知，在牛奶培養(yǎng)中，1L和2L兩者在培養(yǎng)結(jié)束后4℃下低溫保存直至第4周都能保持雌馬酚產(chǎn)生能力(活性)。另外，在2L牛奶中培養(yǎng)時，在研究4℃保存穩(wěn)定性時發(fā)現(xiàn)至第51天活性仍然保持。在1L市售的脫脂奶中培養(yǎng)時，培養(yǎng)結(jié)束后在4℃低溫保存時，發(fā)現(xiàn)直至第34天雌馬酚產(chǎn)生能力(活性)仍然保持。
由以上結(jié)果可知，使用乳球菌20-92菌株調(diào)制的發(fā)酵乳即使在低溫保存時也能保持活性，所以從流通面方面考慮，作為食品也是可能的。
由上述試驗例1-3的結(jié)果可知，如果歸納乳球菌20-92菌株的增殖與雌馬酚產(chǎn)生能力(活性)及雌馬酚產(chǎn)生量的關(guān)系，則如圖6所示。
即，雖然使用的培養(yǎng)基不同，培養(yǎng)條件不同，但是雌馬酚產(chǎn)生能力(活性)在增殖期和穩(wěn)定期都能保持。關(guān)于產(chǎn)生雌馬酚，認為是在穩(wěn)定狀態(tài)以后經(jīng)過一定時間，表達或激活酶，生成雌馬酚。
試驗例4使用乳球菌20-92菌株調(diào)制的發(fā)酵乳的胃液耐受性試驗(1)試驗方法將乳球菌20-92菌株在5mL厭氧菌增殖用液體培養(yǎng)基(BHI培養(yǎng)液、基礎(chǔ)培養(yǎng)基)中，37℃厭氧培養(yǎng)24小時后，在1L牛奶中接種混合4％培養(yǎng)物(109個/g)，然后在需氧條件下，37℃靜置培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)后，于4℃下保存，即得發(fā)酵乳，供以下試驗所用。
調(diào)制含有0.045％胃蛋白酶的50mM甘氨酸鹽酸緩沖液(pH2.5及pH3.0)作為人工胃液。調(diào)制50mM甘氨酸鹽酸緩沖液(pH6.0)作為對照。
向9mL調(diào)制的人工胃液中添加低溫保存的發(fā)酵乳，在37℃的恒溫槽中，在需氧條件下，以靜置狀態(tài)培養(yǎng)(incubation)該混合物。
培養(yǎng)時間分別為1小時、2小時和3小時，在培養(yǎng)開始前和各培養(yǎng)結(jié)束時，分別取0.1mL及0.2mL培養(yǎng)液作為樣品，供給各樣品的菌數(shù)測定(0.1mL的情形)及雌馬酚產(chǎn)生能力(活性)的測定(0.2mL的情形)。
菌數(shù)測定如下進行，基于上述試驗例1-(1)所述的方法，分別取0.1mL培養(yǎng)后的培養(yǎng)物，用NISSUI社制的PBS(-)溶液稀釋104、105、106及107倍后，將0.1mL各稀釋液接種到GAM瓊脂培養(yǎng)基上，37℃需氧培養(yǎng)24小時，測定該GAM瓊脂培養(yǎng)基上生成的菌落數(shù)，求得菌數(shù)。
雌馬酚產(chǎn)生能力(活性)的測定如下進行，基于上述試驗例1-(1)中所述的方法，將0.2mL(0.4％)樣品接種到5mL含有黃豆苷元的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(3管)中，37℃厭氧培養(yǎng)96小時后，測定培養(yǎng)基中的黃豆苷元、二氫黃豆苷元(中間體)及雌馬酚的濃度，由此判斷活性(評分)。
(2)結(jié)果結(jié)果如圖7的A(活菌數(shù)測定結(jié)果)及B(雌馬酚濃度)。
圖7-A中，橫軸表示培養(yǎng)時間(hr)，縱軸表示活菌數(shù)(Log cfu/mlin milk)。
圖7-B中，橫軸表示培養(yǎng)時間(hr)，縱軸表示雌馬酚活性(分數(shù))。
由圖7-A和7-B所示的結(jié)果可得到以下的判斷。即，在pH6.0的緩沖液中，直至3小時，活菌數(shù)能保持108個/mL，此種情況下，雌馬酚產(chǎn)生能力(活性)也得以保持。pH3.0的人工胃液中，培養(yǎng)3小時后，能保持活菌數(shù)，此種情況下，活性也被保持。在pH2.5的人工胃液中，從培養(yǎng)第2小時開始，觀察到活菌數(shù)顯著下降，活性消失。
將通常市售的益生菌(probiotics)(以活菌狀態(tài)到達腸腔內(nèi)發(fā)揮生理作用的微生物)以相同的試驗進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)活菌數(shù)在pH3.0時沒有變化，但在pH2.5時顯著降低。由此認為，只要對pH3.0的胃液具有耐受性，就能以活菌狀態(tài)通過，所以使用乳球菌20-92菌株調(diào)制的發(fā)酵乳能以活菌狀態(tài)到達腸腔內(nèi)，在小腸下部或大腸腔內(nèi)保持活性。
試驗例5乳球菌20-92菌株的膽汁耐受性試驗?zāi)懼褪苄栽囼炇鞘褂肰ITEK GPI試卡(日本BIOMERIEUX株式會社)、以在10％和40％膽汁中的本菌株的繁殖性為指標進行判斷。
(1)試驗方法將乳球菌20-92菌株(108-109個)接種到添加了5％羊血的胰酶大豆瓊脂培養(yǎng)基上，37℃需氧培養(yǎng)24小時。挑取在培養(yǎng)后的培養(yǎng)基上生長的菌落，用0.5％無菌食鹽水調(diào)制成均質(zhì)混懸液。將該混懸液放入VITEKGPI試卡中，35℃培養(yǎng)15分鐘，然后使用色素(pH指示劑)判斷該菌株在膽汁存在下的繁殖性。膽汁是通過將規(guī)定量的膽汁粉末溶解于無菌蒸餾水中后注入試卡中。
(2)結(jié)果上述試驗的結(jié)果顯示了乳球菌20-92菌株在10％和40％膽汁中的繁殖性。由該結(jié)果可確認該菌株對達到40％膽汁的耐受性。
試驗例6乳球菌20-92菌株的溶血性試驗(1)試驗方法將乳球菌20-92菌株(108-109個)接種到加入了5％羊血的胰酶大豆瓊脂培養(yǎng)基上，37℃厭氧條件下(N2∶CO2∶H2＝8∶1∶1)培養(yǎng)24-48小時。觀察培養(yǎng)后培養(yǎng)基上繁殖的菌落的周圍，通過血液成分的分解(脫色或變色)判斷溶血性。
(2)結(jié)果由于上述試驗結(jié)果未觀察到繁殖菌落周圍的血液成分的脫色(出現(xiàn)透明無色區(qū)域)，所以認為乳球菌20-92菌株沒有β溶血性，在此方面是安全的。
試驗例7乳球菌20-92菌株的細胞浸潤性酶的活性試驗對于攝取的乳酸菌入侵人體內(nèi)部的情形，從宿主方面考慮，主要原因是腸管膜的防御功能下降或膜自身的損傷。從菌株方面考慮，主要原因是結(jié)合脂質(zhì)、蛋白后具有分解構(gòu)成腸管膜的蛋白多糖的酶活性(細胞浸潤性酶)。
該試驗討論乳球菌20-92菌株是否具有作為細胞浸潤性酶的膠原酶(明膠酶)、透明質(zhì)酸酶及唾液酸酶(唾液酸苷酶)活性，并如下所示進行試驗。
(1)試驗方法將乳球菌20-92菌株接種到添加了血液的瓊脂培養(yǎng)基上(接種量108-9個)，37℃厭氧條件下(N2∶CO2∶H2＝8∶1∶1)培養(yǎng)24-48小時。
挑取在培養(yǎng)后的培養(yǎng)基上生長的菌落，用無菌蒸餾水使其懸浮，調(diào)制均質(zhì)混懸液。對于得到的混懸液，使用API厭氧鑒定試劑盒(日本BIOMERIEUX株式會社)，以明膠的分解為指標，判斷有無膠原酶(明膠酶)活性。
乳球菌20-92菌株是否具有透明質(zhì)酸酶及唾液酸酶(唾液酸苷酶)活性的試驗如下進行，在分別以透明質(zhì)酸和唾液酸為基質(zhì)的tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)中培養(yǎng)乳球菌20-92菌株(對于唾液酸酶活性的判斷，37℃需氧條件下培養(yǎng)15分鐘；對于透明質(zhì)酸酶活性的判斷，37℃需氧條件下培養(yǎng)24小時)，檢測各基質(zhì)濃度是否降低，從而判斷菌株的酶活性。
(2)結(jié)果乳球菌20-92菌株沒有顯示膠原酶(明膠酶)、透明質(zhì)酸酶及唾液酸酶(唾液酸苷酶)中任一種酶的活性。
所以，由于該菌株不具備作為感染性的一個主要原因的細胞浸潤性酶，從而確認其在感染性方面安全性很高。
試驗例8萬古霉素耐藥性試驗近年來出現(xiàn)細菌對抗生素藥物產(chǎn)生耐藥性(變異)的問題。被對抗生素藥物產(chǎn)生耐藥性的細菌感染的患者往往出現(xiàn)由于抗生素不能發(fā)揮抗菌效果而導(dǎo)致死亡的情形。目前，特別是針對抗生素萬古霉素的耐藥性(VRE)的出現(xiàn)給醫(yī)學界帶來深刻的問題。另外，攝入體內(nèi)的微生物具有萬古霉素耐藥性遺傳因子的情況下，該微生物到達并寄居在腸腔內(nèi)，如果接觸到毒性或感染性菌(病原菌)，則可能造成萬古霉素耐藥性遺傳因子轉(zhuǎn)移到該病原菌，病原菌由此獲得萬古霉素耐藥性的后果。因此，可作為益生菌使用的活菌至少要求該菌株本身不是萬古霉素耐藥性菌。
該試驗是研究乳球菌20-92菌株對萬古霉素的敏感性，如下所述地進行操作。
(1)試驗方法對萬古霉素的敏感性試驗是使用藥敏盤(sensi disc)(日本BD(BECTON DICKINSON)株式會社制)進行的。即，將乳球菌20-92菌株接種到GAM瓊脂培養(yǎng)基上(接種量108-9個)，并將含有30μg萬古霉素的盤放置在培養(yǎng)基上，37℃需氧培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)后，測定盤周圍形成的抑制圈直徑，并依據(jù)判斷表進行判定。
(2)結(jié)果乳球菌20-92菌株的抑制圈直徑為11.9±0.2mm，依據(jù)判斷表判定為敏感性(大于或等于10mm為敏感)。由該結(jié)果可知，該菌株不是萬古霉素耐藥性菌株，所以，在該方面安全性高。
下面作為實施例2列舉利用本發(fā)明乳酸菌將黃豆苷元代謝成雌馬酚的制造例。
實施例2雌馬酚的制備調(diào)制1ml以厭氧菌培養(yǎng)用GAM培養(yǎng)基混懸107-109個乳球菌20-92菌株(FERM BP-10036)得到的液體，將該液體加入到100g(固體成分濃度約為2.2％)豆?jié){中，37℃厭氧培養(yǎng)72-96小時，利用HPLC法測定培養(yǎng)液中產(chǎn)生的雌馬酚量。上述豆?jié){中的黃豆苷元類含量換算成黃豆苷元為95μg/mL。
由該結(jié)果確認得到的豆?jié){培養(yǎng)物中生成10.7±6.3μg/mL(3次的平均值±標準偏差)。
由此可知，利用本發(fā)明微生物能有效并且廉價地由食品原料中的黃豆苷元類物質(zhì)制備雌馬酚。
權(quán)利要求
1.一種含有產(chǎn)生雌馬酚的乳酸菌的組合物，其特征在于，該組合物含有乳球菌屬的乳酸菌作為必須成分，所述乳酸菌具有代謝選自黃豆苷元的苷、黃豆苷元及二氫黃豆苷元組成的組中的至少1種黃豆苷元類而產(chǎn)生雌馬酚的能力。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，乳球菌屬的乳酸菌是格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)。
3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中，所述乳球菌屬的乳酸菌是以FERM BP-10036號保藏的乳球菌20-92。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物進一步含有選自黃豆苷元類及含有黃豆苷元類的物質(zhì)組成的組中的至少1種物質(zhì)。
5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其中，所述含有黃豆苷元類的物質(zhì)是大豆粉或豆?jié){。
6.如權(quán)利要求4所述的組合物，其中，所述組合物是飲料或乳制品形態(tài)。
7.如權(quán)利要求4所述的組合物，其中，所述組合物進一步含有雌馬酚。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其中，所述組合物是豆?jié){發(fā)酵物形態(tài)。
9.雌馬酚的制備方法，其特征在于，該方法是通過使乳球菌屬的乳酸菌作用于選自黃豆苷元類及含有黃豆苷元類的物質(zhì)組成的組中的至少1種物質(zhì)制備雌馬酚，所述乳酸菌具有代謝黃豆苷元類產(chǎn)生雌馬酚的能力。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述乳球菌屬的乳酸菌是格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述乳球菌屬的乳酸菌是以FERM BP-10036號保藏的乳球菌20-92。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述含有黃豆苷元類的物質(zhì)是大豆粉或豆?jié){。
13.一種乳球菌屬的乳酸菌，其以FERM BP-10036號被保藏。
全文摘要
本發(fā)明提供一種含有產(chǎn)生雌馬酚的乳酸菌的組合物，其特征在于，該組合物含有乳球菌屬的乳酸菌作為必須成分，所述乳酸菌具有代謝選自黃豆苷元的苷、黃豆苷元及二氫黃豆苷元組成的組中的至少1種黃豆苷元類產(chǎn)生雌馬酚的能力，該組合物對于包括目前沒有有效的預(yù)防方法或緩解手段的更年期障礙的中老年女性情緒起伏的預(yù)防或緩解是有效的。
文檔編號A61P35/00GK1826059SQ20048002095
公開日2006年8月30日 申請日期2004年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月30日
發(fā)明者內(nèi)山成人, 上野友美, 鈴木淑水 申請人:大塚制藥株式會社