專利名稱：利用抗－vegf抗體的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人疾病以及病理狀態(tài)的治療。更具體地，本發(fā)明涉及癌癥的抗血管生成療法，其單獨使用或與其它抗癌療法聯(lián)用。
背景技術(shù)：
癌癥仍然是導(dǎo)致人類死亡的頭號威脅之一。在美國，癌癥的每年新發(fā)患者為近1,300,000，并且是僅次于心臟病的第二號致死原因，在所有死亡中約占1/4。還預(yù)測，癌癥會在5年內(nèi)超過心血管疾病稱為頭號致死原因。實體瘤導(dǎo)致大部分死亡。盡管在具體癌癥的醫(yī)學(xué)治療中有明顯的進展，所有癌癥的總體5年生存率在過去的20年中僅僅提高了約10％。癌癥，或惡性腫瘤，以不受控制的方式轉(zhuǎn)移并快速生長，導(dǎo)致及時檢出和治療非常困難。此外，癌癥可通過自體內(nèi)的幾乎任何組織中一個或一些正常細胞的惡性轉(zhuǎn)化而在體內(nèi)的任何組織中形成，每種具有特定組織來源的癌癥都彼此不同。
目前治療癌癥的方法的選擇性相對較低。手術(shù)取出疾病組織；放療導(dǎo)致實體瘤體積減??；化療殺死快速分裂的細胞。具體地，化療導(dǎo)致多種副作用，一些情況下非常嚴重以至于限制了給予的劑量，并因此使得可能有效的藥物不能得以應(yīng)用。此外，癌癥通常對化療藥物產(chǎn)生抵抗。
因此，非常需要特異性且更為有效的癌癥療法。
血管生成是重要的細胞事件，其中血管內(nèi)皮細胞增殖，去除多余細胞，并重組而從現(xiàn)存血管網(wǎng)絡(luò)形成新血管。存在有力的證據(jù)表明血供的發(fā)展對于正常和病理增生過程是必不可少的(Folkman and Klagsbrun(1987)Science 235442-447)。氧氣和養(yǎng)料的遞送，以及分解產(chǎn)物的去除，代表多細胞有機體中出現(xiàn)的大多數(shù)生長過程中的限速步驟。因此，通常推定血管間隔(vascularcompartment)是必須的，其不僅對于胚胎形成中的器官發(fā)育和分化如此，對于成人傷口愈合以及生殖功能而言也是。
血管生成也見于多種疾病的發(fā)病機理，包括但不限于，腫瘤，增生性視網(wǎng)膜疾病，老年性黃斑退變，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，和銀屑病。血管生成對于大多數(shù)原發(fā)腫瘤以及其隨后的轉(zhuǎn)移而言是必不可少的。腫瘤可通過簡單擴散到1-2mm的大小而吸收足夠的養(yǎng)分和氧氣，在這樣的情況下，它們的進一步生長需要血供的建立。該過程被認為涉及鄰近宿主成熟脈管系統(tǒng)的募集以啟動新生血管毛細管的出芽，其向腫瘤基質(zhì)生長并隨后穿透到其中。此外，腫瘤血管生成涉及循環(huán)內(nèi)皮細胞前體細胞從骨髓的募集以促進新生血管化Kerbel(2000)Carcinogenesis 21505-515；Lynden et al.(2001)Nat.Med.71194-1201。
盡管新生血管的誘導(dǎo)被認為是腫瘤血管生成的主要方式，最近的數(shù)據(jù)表明一些腫瘤可通過共選擇(co-opt)現(xiàn)存宿主血管而生長。共選擇的脈管系統(tǒng)隨后退化，導(dǎo)致腫瘤退化，其最終可被低氧誘導(dǎo)的腫瘤邊緣血管生成逆轉(zhuǎn)。Holash et al.(1999)Science 2841994-1998。
考慮到血管生成的明顯生理和病理重要性，進行了許多工作以說明能調(diào)節(jié)該過程的因素。據(jù)提示血管生成過程由促血管生成分子和抗血管生成分子之間的平衡調(diào)節(jié)，并在多種疾病具體是癌癥中所述平衡可移動。Carmeliet andJain(2000)Nature 407249-257。
血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)(也稱為VEGF-A或血管通透性因子(vascular permeability factor)(VPF)，已經(jīng)被報道為正常和異常血管生成中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物。Ferrara and Davis-Smyth(1997)Endocrine Rev.184-25；Ferrara(1999)J.Mol.Med.77527-543。與其它導(dǎo)致血管形成過程的生長因子相比，VEGF的獨特性在于其對血管系統(tǒng)中內(nèi)皮細胞的高特異性。Carmelietet al.(1996)Nature 380435-439；Ferrara et al.(1996)Nature 380439-442。此外，VEGF是雌性生殖道中周期性(cyclical)血管增殖以及骨生長和軟骨形成中所需的。Ferrara et al.(1998)Nature Med.4336-340；Gerber etal.(1999)Nature Med.5623-628。
除了是血管生成和脈管形成中的血管生成因子，VEGF作為多效生長因子，顯示在其它生理過程中的多種生物效應(yīng)，諸如內(nèi)皮細胞存活，血管通透性和血管舒張，單核細胞趨化以及鈣內(nèi)流。Ferrara and Davis-Smyth(1997)，supra。此外，最近的研究報道VEGF對一些非內(nèi)皮細胞類型具有促有絲分裂效應(yīng)，諸如對視網(wǎng)膜色素細胞，胰腺導(dǎo)管細胞以及雪旺細胞(Schwann cell)。Guerrin et al.(1995)J.Cell Physiol.164385-394；Oberg-Welsh et al.(1997)Mol.Cell.Endocrinol.126125-132；Sondell et al.(1999)J.Neurosci.195731-5740。
實質(zhì)性證據(jù)還表明VEGF在涉及病理性血管增生的疾病或病癥的進展中的重要作用。VEGF mRNA由所檢測的大多數(shù)人腫瘤細胞過表達(Berkmanet al.J Clin Invest 91153-159(1993)；Brownet dl.Human Pathol..2686-91(1995)；Brownet al.Cancer Res.534727-4735(1993)；Mattern etal.Brit.J.Cancer.73931-934(1996)；和Dvorak et al.Am J.Pat101.1461029-1039(1995))。此外，眼液體中VEGF的濃度與糖尿病以及其它缺血相關(guān)性視網(wǎng)膜病患者中血管的活躍增殖的存在高度相關(guān)(Aiello etal.N.Engl.J.Med.3311480-1487(1994))。此外，最近的研究證實了AMD患者中脈絡(luò)膜新生血管膜中VEGF的定位(Lopez etal.Invest.Ophtalmo.Vis.Sci.37855-868(1996))。
由于其在促進腫瘤生長中的重要作用，VEGF提供了治療介入的有吸引力的靶。實際上，多種治療靶的目的在于阻斷VEGF或其受體信號系統(tǒng)，所述治療靶目前正被開發(fā)用于治療腫瘤疾病。Rosen(2000)Oncologist 520-27；Ellis et al.(2000)Oncologist 511-15；Kerbel(2001)J.Clin.Oncol.1945S-51S。目前，單克隆抗體的VEGF/VEGF受體阻斷作用以及酪氨酸激酶抑制劑對受體信號的抑制作用是最好的研究方法。VEGFR-1核酶，VEGF毒素偶聯(lián)物以及可溶性VEGF受體也正被研究。
抗-VEGF抗體″Bevacizumab(BV)″，也稱為″rhuMAb VEGF″或″AvastinTM″，是重組人源化抗-VEGF單克隆抗體，其根據(jù)Presta et al.(1997)Cancer Res.574593-4599所述制備。其包含突變的人IgGl框架區(qū)以及鼠抗-hVEGF單克隆抗體A.4.6.1的抗原結(jié)合互補決定區(qū)，后者可阻斷人VEGF與其受體的結(jié)合。Bevacizumab的大約93％的氨基酸序列，包括大部分框架區(qū)，源自人IgGl，該序列的大約7％源自鼠抗體A4.6.1。Bevacizumab的分子量約149,000道爾頓并且是糖基化的。Bevacizumab正在臨床研究用于治療各種癌癥，一些早期試驗已經(jīng)顯示有希望的結(jié)果。Kerbel(2001)J.Clin.Oncol.1945S-51S；De Vore et al.(2000)Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.19485a；Johnson et al.(2001)Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.20315a；Kabbinavar et al.(2003)J.Clin.Oncol.2160-65。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及利用抗-VEGF抗體治療疾病和病理狀態(tài)的方法。具體地，本發(fā)明提供了治療癌癥的有效方法，其部分基于將抗VEGF抗體加入標準化療導(dǎo)致癌癥患者的統(tǒng)計學(xué)顯著性以及臨床有意義的改善這一出人意料的結(jié)果。
因此，一方面，本發(fā)明提供治療人類患者中的癌癥的方法，包括給藥患者有效量的抗VEGF抗體以及抗腫瘤組合物，其中所述抗腫瘤組合物包含至少一種化療劑。
可通過本發(fā)明治療的癌癥包括，但不限于，癌癥，淋巴瘤，母細胞瘤，肉瘤，白血病或淋巴組織惡性疾病。癌癥的更具體的例子包括鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)，肺癌(包括小細胞肺癌，非小細胞肺癌，肺腺癌以及肺鱗癌)，腹膜癌，肝細胞癌，胃的或胃癌(包括胃腸癌)，胰腺癌，神經(jīng)母細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細胞瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜癌或子宮癌，唾液腺癌，腎或腎的癌，肝癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝的癌以及各種頭和頸的癌癥，以及B淋巴細胞瘤(包括低級/濾泡樣非何杰金氏淋巴瘤(low grade/follicular non-Hodgkin’slymphoma)(NHL)；小淋巴細胞性(SL)NHL；中級/濾泡樣NHL；中級彌漫性NHL；高級免疫母細胞NHL(high grade immunoblastic NHL)；高級淋巴母細胞NHL；高級小無裂細胞NHL(high grade small non-cleaved cell NHL)；bulky disease NHL；外套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)；AIDS-相關(guān)的淋巴瘤；和Waldenstrom′s巨球蛋白血癥)；慢性淋巴細胞白血病(CLL)；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；毛細胞白血病(Hairy cell leukemia)；慢性成髓細胞白血病(chronic myeloblastic leukemia)；和移植后淋巴組織增生疾病(PTLD)，以及母斑細胞病相關(guān)性異常血管增生(abnormal vascular proliferation associatedwith phakomatoses)，水腫(諸如與腦腫瘤相關(guān)的)，和Meigs綜合癥(Meigs′syndrome)。優(yōu)選，所述癌癥選自以下疾病乳腺癌，結(jié)腸直腸癌，直腸癌，非小細胞肺癌，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，腎細胞癌，前列腺癌，肝癌，胰腺癌，軟組織肉瘤，卡波奇肉瘤(kaposi’s sarcoma)，類癌樣癌(carcinoidcarcinoma)，頭和頸部癌，黑素瘤，卵巢癌，間皮瘤(mesothelioma)以及多發(fā)性骨髓瘤。更優(yōu)選，所述癌癥為結(jié)腸直腸癌?？捎杀景l(fā)明治療的癌性疾病包括轉(zhuǎn)移癌。本發(fā)明的方法具體適于治療血管化的腫瘤。
任何具有抗癌活性的化療劑可根據(jù)本發(fā)明使用。優(yōu)選，所述化療劑選自以下物質(zhì)組成的組烷化劑，抗代謝物，葉酸類似物，嘧啶類似物，嘌呤類似物以及相關(guān)抑制劑，長春花堿類，epipodopyyllotoxins，抗生素，L-天冬酰胺酶，拓撲異構(gòu)酶抑制劑，干擾素，鉑配位復(fù)合物(platinum cooridnationcomplexes)，大黃素(anthracenedione)取代的脲，甲基肼衍生物，腎上腺皮質(zhì)抑制劑，腎上腺皮質(zhì)類固醇，孕激素，雌激素，抗雌激素，雄激素，抗雄激素，和促性腺激素-釋放激素類似物。更優(yōu)選，所述化療劑選自以下物質(zhì)組成的組5-氟尿嘧啶(5-FU)，甲酰四氫葉酸(leucovorin)(LV)，伊立替康(irenotecan)，奧沙利鉑(oxaliplatin)，卡培他濱(capecitabine)，紫杉醇(paclitaxel)和多西紫杉醇(doxetaxel)。兩種或更多抗癌劑可以以雞尾酒方式同抗-VEGF抗體聯(lián)用給藥。一種優(yōu)選的聯(lián)合化療是基于5-氟尿嘧啶，包含5-FU和一或多種其它化療劑。適宜的聯(lián)用化療劑量方案是本領(lǐng)域已知的并在例如Saltz et al.(1999)Proc ASCO 18233a and Douillard et al.(2000)Lancet3551041-7中描述。
一方面，本發(fā)明提供了延長患有癌癥的人類患者的生存期的方法，包括給藥所述患者有效量的抗-VEGF抗體組合物和抗腫瘤組合物，其中所述抗腫瘤組合物包含至少一種化療劑，由此所述抗-VEGF抗體和所述抗腫瘤組合物的聯(lián)合給藥有效延長所述生存期。
另一方面，本發(fā)明提供延長人類癌癥患者的無進展生存期(progressionfree survival)的方法，包括給藥所述患者有效量的抗-VEGF抗體組合物和抗腫瘤組合物，其中所述抗腫瘤組合物包含至少一種化療劑，由此所述抗-VEGF抗體和所述抗腫瘤組合物的聯(lián)合給藥有效延長人類患者的無進展生存期。
此外，本發(fā)明提供治療一組人類癌癥患者的方法，包括給藥所述患者有效量的抗-VEGF抗體組合物和抗腫瘤組合物，其中所述抗腫瘤組合物包含至少一種化療劑，由此所述抗-VEGF抗體和所述抗腫瘤組合物的聯(lián)合給藥有效增加所述患者組中的反應(yīng)率。
另一方面，本發(fā)明提供延長人類癌癥患者的反應(yīng)時間(duration ofresponse)的方法，包括給藥所述患者有效量的抗-VEGF抗體組合物和抗腫瘤組合物，其中所述抗腫瘤組合物包含至少一種化療劑，由此所述抗-VEGF抗體和所述抗腫瘤組合物的聯(lián)合給藥有效延長反應(yīng)時間。
本發(fā)明還提供治療易患或診斷為患有結(jié)腸直腸癌的人類患者的方法，包括給藥所述患者有效量的抗-VEGF抗體。所述結(jié)腸直腸癌是轉(zhuǎn)移癌。所述抗-VEGF抗體可進一步與標準結(jié)腸直腸癌化療諸如Saltz et al.(1999)所述的Saltz(5-FU/LV/伊立替康(irinotecan))方案聯(lián)合。
一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供治療患有轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的人類患者或人類患者的組的方法，包括給藥所述患者有效量的抗-VEGF抗體組合物和抗腫瘤組合物，其中所述抗腫瘤組合物包含至少一種化療劑，由此所述抗-VEGF抗體和所述抗腫瘤組合物的聯(lián)合給藥導(dǎo)致被治療患者的統(tǒng)計學(xué)顯著且臨床有意義的改善，所述改善通過生存期，無進展生存期，反應(yīng)率(responserate)以及反應(yīng)時間來測定。優(yōu)選，所述抗腫瘤組合物是基于5-氟尿嘧啶的組合方案。更優(yōu)選，所述組合方案包含5-FU+甲酰四氫葉酸，5-FU+甲酰四氫葉酸+伊立替康(IFL)，或5-FU+甲酰四氫葉酸+奧沙利鉑(FOLFOX)。
本發(fā)明提供制品，其包含容器、組合物以及包裝插頁，所述組合物包含在容器內(nèi)，該組合物含有抗-VEGF抗體，所述包裝插頁指示該組合物的使用者將所述抗-VEGF抗體組合物和包含至少一種化療劑的抗腫瘤組合物給藥癌癥患者。
本發(fā)明還提供用于治療人類患者中的癌癥的試劑盒，其包含含有抗-VEGF抗體組合物的藥物包，以及利用所述抗-VEGF抗體組合物和包含至少一種化療劑的抗腫瘤組合物治療患者中的癌癥的說明。
附圖簡述

圖1顯示生存的Kaplan-Meier評估。存活時間中值(median duration ofsurvial)(由點狀虛線表示)在給予伊立替康，氟尿嘧啶，和甲酰四氫葉酸(IFL)加上bevacizumab的組中為20.3月，而給予IFL+安慰劑的組中為15.6月，相應(yīng)的死亡危險率為0.66(P＜0.001)。
圖2顯示無進展生存的Kaplan-Meier評估。無進展存活時間中值(由點狀虛線表示)在給予伊立替康，氟尿嘧啶，和甲酰四氫葉酸(IFL)加上bevacizumab的組中為10.6月，而給予IFL+安慰劑的組中為6.2月，相應(yīng)的死亡危險率為0.54(P＜0.001)。
圖3A-3C提供了利用基線特征對不同患者亞組存活時間的分析。
圖4顯示生存的Kaplan-Meier評估，其比較了給藥5-FU/LV+安慰劑的組相對于給藥5-FU/LV+bevacizumab(BV)的組。
圖5顯示無進展生存的Kaplan-Meier評估，其比較了給藥5-FU/LV+安慰劑的組相對于給藥5-FU/LV+bevacizumab(BV)的組。
具體實施方案1.定義術(shù)語″VEGF″和″VEGF-A″可互換使用，指165個氨基酸的血管內(nèi)皮生長因子，以及相關(guān)的121-，189-，和206-氨基酸的血管內(nèi)皮細胞生長因子(其由Leung et al.Science，2461306(1989)，和Houck et al.Mol.Endocrin.，51806(1991)描述)，以及其天然等位基因變體和加工的形式。術(shù)語″VEGF″也用于指含有165氨基酸的人血管內(nèi)皮細胞生長因子的氨基酸8-109或1-109的多肽的截短形式。對任何這樣形式的VEGF可在本文中鑒定，例如通過″VEGF(8-109)，″″VEGF(1-109)″或″VEGF165″?！敖囟痰摹碧烊籚EGF的氨基酸位置根據(jù)天然VEGF序列中所示編號。例如，截短的天然VEGF中的氨基酸位置17也是天然VEGF中的位置17(蛋氨酸)。截短的天然VEGF與天然VEGF相比具有對KDR以及Flt-1受體的結(jié)合親合力。
″抗-VEGF抗體″是與VEGF以足夠的親和力以及特異性結(jié)合的抗體。優(yōu)選，本發(fā)明的抗-VEGF抗體可用作治療劑靶向并干擾其中涉及VEGF活性的疾病或病癥?？?VEGF抗體通常不與其它VEGF同系物諸如VEGF-B或VEGF-C結(jié)合，也不與其它生長因子諸如P1GF，PDGF或bFGF結(jié)合。優(yōu)選的抗-VEGF抗體是單克隆抗體，其與雜交瘤ATCC HB 10709產(chǎn)生的單克隆抗-VEGF抗體A4.6.1結(jié)合相同的表位。更優(yōu)選，所述抗-VEGF抗體是重組人源化抗-VEGF單克隆抗體，其根據(jù)Presta et al.(1997)Cancer Res.574593-4599制備，包括但不限于已知為bevacizumab(BV；AvastinTM)的抗體。
術(shù)語“VEGF拮抗劑”是指任何能中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF活性包括其與一或多種VEGF受體的結(jié)合的分子。VEGF拮抗劑包括抗-VEGF抗體和其抗原結(jié)合片段，受體分子以及衍生物，該VEGF拮抗劑與VEGF特異性結(jié)合，由此隔離了(sequestering)其與一或多種受體、抗-VEGF受體抗體和VEGF受體拮抗劑諸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制劑的結(jié)合。
在本說明書以及權(quán)利要求中，免疫球蛋白重鏈中殘基的編號根據(jù)Kabatetal.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)所述的EU index進行，所述文獻包含在本文作為參考?！癒abat中的EU index”指人IgGl EU抗體的殘基編號。
“天然序列”包括具有與自然界衍生的多肽相同的氨基酸序列的多肽。所述天然序列多肽可以從自然界分離或者通過重組和/或合成手段制備。術(shù)語“天然序列”多肽具體包括所述多肽的天然截短形式或分泌形式(如，胞外區(qū)序列)，天然變體形式(如，旁路剪接形式)以及天然存在的等位變體。
多肽“變體”指生物活性分子，其與天然序列多肽具有至少約80％的氨基酸序列同一性。所述變體包括，例如在所述多肽N或C末端加入、缺失了一或多個氨基酸殘基的多肽。通常，變體與天然序列多肽具有至少約80％氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少約90％氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少約95％氨基酸序列同一性。
術(shù)語“抗體”是指最廣意義上的抗體，具體包括人、非-人(例如鼠)和人源化的單克隆抗體(包括全長或完整單克隆抗體)、多克隆抗體、多價抗體(multivalent antibody)多特異性抗體(如雙特異性抗體)和抗體片段(參照以下說明)，只要它們顯示所需的生物學(xué)活性。
除非另有說明，本文術(shù)語“多價抗體”表示含有三個或更多抗原結(jié)合位點的抗體。所述多價抗體優(yōu)選被改造成包含三個或更多抗原結(jié)合位點并通常不是天然序列IgM或IgA抗體。
″抗體片段″包括完整抗體的僅僅一部分，通常包括完整抗體的抗原結(jié)合位點并由此保持與抗原結(jié)合的能力。本發(fā)明抗體片段的實例包括(i)Fab片段，其具有VL，CL，VH和CH1區(qū)；(ii)Fab′片段，其為在CH1區(qū)C末端具有一或多個半胱氨酸殘基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CH1區(qū)；(iv)Fd′片段，其具有VH和CH1區(qū)以及位于CH1區(qū)C末端的一或多個半胱氨酸殘基；(v)Fv片段，其具有抗體單個臂的VL和VH區(qū)；(vi)dAb片段(Wardet al.，Nature 341，544-546(1989))，其由VH區(qū)組成；(vii)分離的CDR區(qū)；(viii)F(ab′)2片段，其為包含兩個由鉸鏈區(qū)二硫橋連接的兩個Fab′片段的二價片段(例如單鏈Fv；scFv)(Bird etal.，Science 242423-426(1988)；和Huston etal.，PNAS(USA)855879-5883(1988))；(x)具有兩個抗原結(jié)合位點的″二價抗體(diabodies)″，包括在相同多肽鏈中與輕鏈可變區(qū)(VL)連接的重鏈可變區(qū)(VH)(見，例如，EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger etal.，PYOC.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993))；(xi)″線性抗體″，其包含一對串聯(lián)的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，其與互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結(jié)合區(qū)(Zapata et al.Protein Eng.8(10)1057-1062(1995)；和US Patent No.5,641,870)。
本文術(shù)語“單克隆抗體”是指自一群基本同質(zhì)的(homogeneous)抗體群獲得的抗體，即除了少量可能天然存在的突變以外，包含在該群中的各個抗體完全相同。單克隆抗體針對單個抗原高度特異。而且，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑相反，每種單克隆抗體針對抗原的單個決定簇。修飾詞“單克隆”不解釋為需通過任何特殊方法產(chǎn)生抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的單克隆抗體可通過Kohler等(Nature，256495(1975))首先描述的雜交瘤法，或者重組DNA法制備(例如見美國專利4816567)。還可用例如Clackson等(Nature，352624-628(1991))和Marks等(J.Mol.Biol.，222581-597(1991))所述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫中分離“單克隆抗體”。
本文中單克隆抗體具體包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其重鏈和/或輕鏈的一部分與源自具體物種或?qū)儆诰唧w抗體種類或亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，但所述鏈的剩余部分的序列與源自另一個物種或?qū)儆诹硪粋€抗體種類或亞類的抗體(以及此抗體的片段，只要它們顯示所需的生物學(xué)活性)的相應(yīng)序列相同或同源(美國專利4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855(1984))。
“人源化”非人(例如鼠)抗體是包含非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。大多數(shù)場合，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，但其中受體的超變區(qū)殘基被具有所需特異性、親和力和能力的小鼠、大鼠、家兔或非人靈長類等非人源物種抗體(供體抗體)的超變區(qū)殘基所取代。在一些實例中，人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基由相應(yīng)的非人類殘基所取代。而且，人源化抗體可包括在受體抗體或供體抗體中未發(fā)現(xiàn)的殘基。這些修飾旨在進一步改善抗體的性能。通常，人源化抗體基本上包括至少一個(通常包括兩個)可變區(qū)的全部，其中超變環(huán)的全部或基本上全部對應(yīng)于非人免疫球蛋白的相應(yīng)部分，而FR的全部或基本上全部是人免疫球蛋白的序列。人源化抗體還任選包括至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常為人的免疫球蛋白恒定區(qū)。詳見Jones等，Nature 321522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。
“人抗體”是具有相應(yīng)于人產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列的抗體和/或使用本文公開的任何一種制備人抗體的技術(shù)制備的抗體。人抗體的定義明確排除了包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。使用各種本領(lǐng)域已知的技術(shù)可產(chǎn)生人抗體。在一個實施方案中，人抗體選自噬菌體文庫，該噬菌體文庫表達人抗體(Vaughan等Nature Biotechnology 14309-314(1996)Sheets等PNAS(USA)956157-6162(1998))；Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222581(1991))。也可通過將人免疫球蛋白基因座引入轉(zhuǎn)基因動物制造人抗體，該轉(zhuǎn)基因動物可以是例如內(nèi)源性免疫球蛋白基因被部分或完全滅活的小鼠。攻擊后觀察人抗體的產(chǎn)生，其與在人中所見的情形在各方面均十分相似，包括基因重排，組裝，和抗體庫。該方法在例如美國專利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016和以下科學(xué)出版物中描述Marks等，Bio/Technology 10779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368856-859(1994)；Morrison，Nature 368812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology 14845-51(1996)；Neuberger，NatureBiotechnology 14826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)?？蛇x地，可通過將產(chǎn)生針對目的抗原的抗體的人B淋巴細胞(此種B淋巴細胞可自個體回收或在體外被免疫)永生化制備人抗體。見例如，Cole等，單克隆抗體和癌癥治療，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner等，J.Immunol.，147(1)86-95(1991)；和美國專利5,750,373。
“親和力成熟”的抗體是其中的一個或多個CDRs發(fā)生一種或多種改變并導(dǎo)致較不具有這些改變的親本抗體該抗體對抗原的親和力提高。優(yōu)選親和性成熟的抗體對目的抗原具有納摩爾甚至皮摩爾的親和力。親和力成熟抗體可由已知的方法產(chǎn)生。Marks等，Bio/Technology，10779-783(1992)通過VH和VL區(qū)域改組描述了親和力成熟。CDR和/或框架殘基的隨機突變的描述見Barbas等，Proc Nat.Acad.Sci，美國，913809-3813(1994)；Schier等，Gene，169147-155(1995)；Jackson等，J.Immunol.，154(7)3310-9(1995)；和Hawkins等，J.Mol.Biol.，226889-896(1992)。
“分離的”抗體是指從其天然環(huán)境成份中鑒定和分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染成份是可能干擾該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，且可能包括酶，激素，和其它蛋白類或非蛋白類溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，該多肽可純化成(1)按勞里(Lowry)方法測定的抗體重量超過95％，且最優(yōu)選重量超過99％，(2)其純化程度足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列，或(3)在還原型或非還原型條件下進行SDS-PAGE并使用考馬斯藍或者，優(yōu)選銀染測定具有同質(zhì)性。分離的抗體包括在重組細胞內(nèi)的原位多肽，因為該抗體天然環(huán)境中的至少一種成份不存在。然而，一般來說，分離的抗體由至少一個純化步驟制備。
抗體的″功能性抗原結(jié)合位點″是能夠結(jié)合靶抗原的位點。所速抗原結(jié)合位點的抗原結(jié)合親和力不必與所述抗原結(jié)合位點所來源的親代抗體一樣強，但結(jié)合抗原的能力必須可利用多種已知評價抗體與抗原的結(jié)合的方法中的任意一種來測定。此外，本文所述多價抗體的每個抗原結(jié)合位點的抗原結(jié)合親和力在量上不必相同。對于本文的多聚體抗體，功能性抗原結(jié)合位點的數(shù)目可利用以下實施例2所述的超速離心分析來評估。根據(jù)該分析法，靶抗原與多聚體抗體的以不同比例組合，并且所述復(fù)合體的平均分子量在推定存在不同數(shù)目的功能性結(jié)合位點存在的條件下測定。這些理論值與所得實際試驗值相比以評估功能性結(jié)合位點的數(shù)目。
具有指定抗體的“生物性質(zhì)”的抗體是具有使得所指定的抗體與結(jié)合相同抗原的其它抗體區(qū)別開來的一或多種生物性質(zhì)的抗體。
為篩選結(jié)合與位于目的抗體結(jié)合的抗原上的表位的抗體，可進行常規(guī)交叉-阻斷(cross-blocking)試驗，諸如Antibodies，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane(1988)中所述。
“激動劑抗體″是結(jié)合并活化受體的抗體。通常拮抗劑抗體的受體活化能力在質(zhì)上至少與所述受體的天然激動劑配體相似(并且可以在量上基本相似)。激動劑抗體的實例是與TNF受體超家族中的受體結(jié)合并誘導(dǎo)表達TNF受體的細胞的凋亡的激動劑抗體。測定凋亡的誘導(dǎo)的試驗的描述見W098/51793和W099/37684，均包含在此作為參考。
“疾病”是可從利用所述抗體的治療中受益的任何疾病。這包括慢性和急性疾病和病癥，包括使得哺乳動物易患所述疾病的病理性狀態(tài)。本發(fā)明治療的疾病的非限制性實例包括良性和惡性腫瘤；白血病和淋巴組織惡性疾病；神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)，星形細胞，下丘腦以及其它腺體，巨噬細胞，上皮細胞，基質(zhì)以及囊胚腔(blastocoelic)的疾??；以及炎性，血管生成性以及免疫性疾病。
術(shù)語“治療有效量”指可有效治療哺乳動物中的疾病或病癥的藥物量。對于癌癥，藥物有效量可減少癌細胞數(shù)量；減小腫瘤體積；抑制(即減慢到一定程度并優(yōu)選停止)癌細胞浸潤到周圍器官中；抑制(即減慢到一定程度并優(yōu)選停止)腫瘤轉(zhuǎn)移；在一定程度抑制腫瘤生長；和/或在一定程度上緩解一或多種與癌癥相關(guān)的癥狀。藥物可以阻止已存在的腫瘤細胞的生長或殺死這些腫瘤細胞，所述藥物可以是細胞抑制劑或細胞毒性劑。對于癌癥治療，體內(nèi)效力可例如通過評估存活期，疾病進展時間(TTP)，反應(yīng)率(RR)，反應(yīng)時間，和/或生活質(zhì)量來測定。
“治療”指治療性療法和防病或預(yù)防措施。需要治療的包括那些已患該病或那些需預(yù)防該病的人。
術(shù)語“癌癥”和“癌性”是指或者描述哺乳動物中一般特征在于細胞生長不受調(diào)控的生理學(xué)狀態(tài)。癌癥的例子包括，但不限于，癌，淋巴瘤，母細胞瘤，肉瘤，白血病或淋巴組織惡性疾病。癌癥的更具體的例子包括鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)，肺癌(包括小細胞肺癌，非小細胞肺癌，肺腺癌以及肺鱗癌)，腹膜癌，肝細胞癌，胃的或胃癌(包括胃腸癌)，胰腺癌，神經(jīng)母細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細胞瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜或子宮癌，唾液腺癌，腎或腎的癌，肝癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝的癌，各種類型的頭和頸癌，以及B-細胞淋巴瘤(包括低級/濾泡樣非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴細胞性(SL)NHL；中級/濾泡樣NHL；中級彌漫性NHL；高級免疫母細胞NHL；高級淋巴母細胞NHL；高級小無裂細胞NHL；bulky disease NHL；外套細胞淋巴瘤；AIDS-相關(guān)的淋巴瘤；和Waldenstrom′s巨球蛋白血癥)；慢性淋巴細胞白血病(CLL)；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；毛細胞白血?。宦猿伤杓毎籽?；移植后淋巴組織增生疾病(PTLD)，母斑細胞病相關(guān)性異常血管增生，水腫(諸如與腦腫瘤相關(guān)的)，以及Meigs綜合征。
本文術(shù)語“哺乳動物宿主”指任何相容的移植物的受體?！跋嗳荨笔侵笇⒔邮芄┏龅囊浦参锏牟溉閯游锼拗?。優(yōu)選，所述宿主是人。如果移植物供體和所述受體都是人，優(yōu)選他們的II型HLA抗原匹配以改善組織相容性。
本文所用術(shù)語“細胞毒作用制劑”是指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語意在包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、p32和Lu的放射性同位素)，化療劑和毒素例如小分子毒素或細菌，真菌，植物或動物來源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體。
術(shù)語″抗腫瘤組合物″指用于治療癌癥的組合物，其包含至少一種能夠抑制或預(yù)防腫瘤生長或功能，和/或?qū)е履[瘤細胞破壞的活性治療劑。適合包含在用來治療癌癥的抗腫瘤組合物中的治療劑包括，但不限于，化療劑、放射活性同位素，毒素，細胞因子諸如干擾素，以及靶向細胞因子的拮抗劑，與腫瘤細胞相關(guān)的細胞因子受體或抗原。例如，用于本發(fā)明的治療劑可以是諸如抗-HER2抗體和抗-CD20抗體，或小分子酪氨酸激酶抑制劑諸如VEGF受體抑制劑和EGF受體抑制劑。優(yōu)選所述治療劑是化療劑。
“化療劑”是在癌的治療中使用的化學(xué)化合物?；熤苿嵗ㄍ榛瘎?，如噻替哌(thiotepa)和CYTOXANTM環(huán)膦酰胺(cyclosphamide)；烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶如benaodopa，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)和尿烷亞胺(uredopa)；氮丙啶(ethylenimine)和methylamelamine包括六甲蜜胺(altretamine)，三亞乙基蜜胺(triethylenemelamine)，三亞乙基磷酰胺，三亞乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羥甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(acetogenins)(具體是bullatacin和bullatacinone)；喜樹堿(camptothecin)(包括合成類似物托泊替康(topotecan))；苔蘚抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)，卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；cryptophycins(具體是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin；pancratistatin；sarcodictyin；spongistatin；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥，膽磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，鹽酸氧氮芥；美法侖(melphalan)，新氮芥(novembichin)，膽甾醇苯乙酸氮芥(phenesterine)，松龍苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亞硝基脲(nitrosureas)如亞硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine)；抗生素諸如enediyne抗生素(例如calicheamicin，具體是calicheamicin gammalI和calicheamicin omegaIl(見，例如，Agnew，Chem Intl.Ed.Engl.，33183-186(1994))；dynemicin，包括dynemicin A；二膦酸鹽(bisphosphonates)，諸如氯膦酸鹽(clodronate)；esperamicin；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色團和相關(guān)色素蛋白enediyne抗生素生色團)，aclacinomysins，放射菌素(actinomycin)，authramycin，氮絲氨酸(azaserine)，博萊霉素(bleomycin)，放線菌素C(cactinomycin)，carabicin，去甲柔紅霉素(carminomycin)，嗜癌霉素(carzinophilin)，chromomycinis，更生霉素(dactinomycin)，柔紅霉素，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代-多柔比星，氰基嗎啉代-多柔比星，2-pyrrolino-多柔比星和去氧多柔比星)，表阿霉素(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊達比星(idarubicin)，發(fā)波霉素(marcellomycin)，絲裂霉素諸如絲裂霉素C，霉酚酸，諾加霉素(nogalamycin)，橄欖霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤霉素，三鐵阿霉素(quelamycin)，羅多比星(rodorubicin)，鏈黑菌素(streptonigrin)；鏈脲霉素(streptozocin)，殺結(jié)核菌素(tubercidin)，烏苯美司(ubenimex)，凈司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代謝藥如氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物如二甲葉酸(denopterin)，氨甲蝶呤，丁蝶翼素(pteropterin)，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物氟達拉濱(fludarabine)，6-巰基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鳥嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，雙脫氧尿苷，doxifluridine，依諾他濱(enocitabine)，氟尿苷；雄激素類如卡普睪酮(calusterone)，丙酸甲雄烷酮(dromostanolong propionate)，環(huán)硫雄醇(epitiostanol)，美雄氨(mepitiostane)，睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類如氨魯米特(aminoglutethimide)，鄰氯苯對氯苯二氯乙烷(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑如frolinic acid；醋葡內(nèi)酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(biasntrene)；依達曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；elfomithine；elliptinium acetate；epothilone；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；美登素類(maytansinoids)諸如美登素(maytansine)和柄型菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；nitracrine；噴司他丁(pintostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼樹酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；多糖復(fù)合體(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亞胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine)；單端孢霉烯(trichothecene)(具體是T-2毒素，verracurin A，桿孢菌素(roridin)A和anguidine)；烏拉坦(urethan)；長春堿酰胺；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；溴丙哌嗪(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；三胺硫磷(thiotepa)；紫杉烷(taxoid)，如TAXOL紫杉醇(Bristol-Myers SquibbOncology，Princeton，NJ)，ABRAXANETM無克列莫佛(Cremophor-free)，紫杉醇的白蛋白改造的納米顆粒配制劑(albumin-engineered nanoparticleformulation of paclitaxel)(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)，和TAXOTERE多西紫杉醇(Rhne-Poulenc Rorer，Antony，F(xiàn)rance)；chloranbucil；GEMZAR吉西他濱(gemcitabine)；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；鉑配位復(fù)合物(platinum coordination complexes)如順鉑、奧沙利鉑(oxaliplatin)和卡鉑(carboplatin)；長春花堿；鉑；鬼臼乙叉甙(etoposide)(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新堿；NAVELBINE長春瑞賓(vinorelbine)；novantrone；替尼泊甙(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；柔紅霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；xeloda；伊拜膦酸鹽(ibandronate)；irinotecan(例如CPT-11)；拓撲異構(gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；維甲酸類(retinoids)諸如維甲酸；capecitabine；以及上述任何物質(zhì)的可藥用鹽，酸或衍生物。
此定義還包括能調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素制劑，如抗雌激素制劑和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)物(SERM)，包括，例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)，雷洛昔芬(raloxifene)，屈洛昔芬(droloxifene)，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018，奧那司酮(onapristone)，和FARESTON·托瑞米芬(FARESTON·toremifene)；芳香酶抑制物(aromatase inhibitor)，其抑制芳香酶，該酶調(diào)節(jié)腎上腺中的雌激素生成，諸如，例如4(5)-咪唑，氨魯米特(aminoglutethimide)，MEGASE醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)，AROMASIN依西美坦(exemestane)，formestanie，法倔唑(fadrozole)，RIVISOR伏氯唑(vorozole)，F(xiàn)EMARA來曲唑(letrozole)，和ARIMIDEX阿那曲唑(anastrozole)；和抗雄激素制劑如氟他氨(flutamide)，尼魯米特(nilutamide)，比卡魯胺(bicalutamide)，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1，3-二氧戊烷核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，具體是抑制異常細胞增生所涉及的信號途徑中的基因表達的那些反義寡核苷酸，諸如，例如，PKC-α，Ralf和H-Ras；核糖酶諸如VEGF表達抑制劑(例如，ANGIOZYME核糖酶)和HER2表達抑制劑；疫苗諸如基因治療疫苗，例如，ALLOVECTIN疫苗，LEUVECTIN疫苗，和VAXID疫苗；PROLEUKINrIL-2；LURTOTECAN拓撲異構(gòu)酶1抑制物；ABARELIXrmRH；和上述任何物質(zhì)的可藥用鹽，酸或衍生物。
本文中“生長抑制劑”是指在體內(nèi)或體外抑制細胞(例如癌癥細胞)生長的化合物或組合物。因此，生長抑制劑可以是顯著降低S期惡性細胞百分比的藥物。生長抑制劑的實例包括阻斷細胞周期(在除S期以外的階段)進展的藥物，例如誘導(dǎo)G1停滯和M期停滯的藥物。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長春花類(長春新堿和長春花堿)，TAXOL，美登木素生物堿和topo II抑制劑如阿霉素、柔紅菌素、依托泊甙和博來霉素等。那些使G1期停滯的藥物還連帶使S期停滯，例如DNA烷化劑象他莫昔芬、強的松、達卡巴嗪、氮芥(mechlorethamine)、順鉑、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷等。詳見“癌癥的分子基礎(chǔ)”Mendelsohn和Israel編，第一章，Murakami等的題為“細胞周期調(diào)節(jié)，腫瘤和抗腫瘤藥物”的文章(WB SaundersPhiladephia，1995)，尤其見第13頁。
術(shù)語“細胞因子”是一般性術(shù)語，指由一個細胞群釋放的對另一個細胞群起細胞間介質(zhì)作用的蛋白。此種細胞因子的實例是淋巴細胞因子，單核細胞因子和傳統(tǒng)的多肽激素。這些細胞因子包括生長激素，如人生長激素，N-甲二磺酰人生長激素，和牛生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；前胰島素；松馳素；前松馳素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)，甲狀腺刺激素(TSH)，促黃體(生成)激素(LH)；上皮生長因子，肝細胞生長因子；成纖維細胞生長因子；催乳激素；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子-α和β；苗勒氏管抑制物質(zhì)(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；苯丙酸諾龍；血管內(nèi)皮細胞生長因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長因子如NGF-β；血小板生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因子-I和-II；促紅細胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子(osteoinductivefactors)；干擾素如干擾素-α，-β，-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬細胞-CSF(M-CSF)；粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)；粒細胞-CSF(G-CSF)；白細胞介素(IL)如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12；腫瘤壞死因子如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子包括LIF和kit配體(KL)。本文中術(shù)語細胞因子包括天然蛋白或來自重組細胞培養(yǎng)物的蛋白以及天然序列細胞因子的生物活性等效物。
本文所用術(shù)語“前體藥物”指藥物學(xué)活性物質(zhì)的前體或衍生物形式，其較親本藥物對癌細胞的細胞毒作用小并能被酶活化或轉(zhuǎn)化成更具活性的親本形式。見例如Wilman“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”Biochemical SocietyTransanctions，14，pp.357-382，615thMeeting Belfast(1986)和Stella等，“ProdrugsA Chemical Approach to Targeted Drug Delivery，”Directed DrugDelivery，Borchardt等，(ed.)，pp.247-267，人a Press(1985)。本發(fā)明的前體藥物包括但不限于，含磷酸鹽前體藥物，含硫代磷酸脂前體藥物，含硫酸鹽前體藥物，含肽前體藥物，D氨基酸修飾的前體藥物，糖基化前體藥物，含β內(nèi)酰胺的前體藥物，任選取代的含苯氧基乙酰胺的前體藥物或任選取代的含苯基乙酰胺的前體藥物，可被轉(zhuǎn)化成更具活性的細胞毒性游離藥物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前體藥物?？杀谎苌鸀楸景l(fā)明所用前提藥物形式的細胞毒作用藥物的實例包括，但不限于，上述那些化療劑。
術(shù)語“靜脈內(nèi)輸注”指將在長于大約5分鐘的時間，優(yōu)選大約30-90分鐘內(nèi)將藥物導(dǎo)入動物或人類患者的靜脈，但根據(jù)本發(fā)明，靜脈內(nèi)輸注給藥可選持續(xù)10小時或10小時以下。
“靜脈內(nèi)藥團(intravenous bolus)”或“靜脈內(nèi)推注(intravenous push)”指給藥到動物或人類的靜脈，使得機體在大約15分鐘或以下，優(yōu)選5分鐘或以下的時間內(nèi)接受到所述藥物。
“皮下給藥”指通過自藥物容器的相對緩慢、持續(xù)的釋放，將藥物導(dǎo)入動物或人類患者的皮膚下，優(yōu)選在皮膚和皮下組織之間的囊袋(pocket)中。所述囊袋可通過將皮膚捏起或拉開使其離開皮下組織而產(chǎn)生。
術(shù)語“皮下輸注”指通過自藥物容器的相對緩慢、持續(xù)的釋放，將藥物導(dǎo)入動物或人類患者的皮膚下，優(yōu)選在皮膚和皮下組織之間的囊袋(pocket)中，所述釋放持續(xù)一段時間，包括但不限于30分鐘或以下，或90分鐘或以下?？蛇x，所述輸注可通過將藥物遞送泵植入所述動物或人類患者的皮下來進行，其中所述泵遞送預(yù)定量的藥物一段預(yù)定的時間，諸如30分鐘，90分鐘，或治療方案長度所跨越的時間。
術(shù)語“皮下藥團(subcutaneous bolus)”指在動物或人類患者的皮膚下給藥，其中所述藥團遞送優(yōu)選小于約15分鐘，更優(yōu)選小于5分鐘，最優(yōu)選小于60秒。給藥優(yōu)選在皮膚和皮下組織之間的囊袋中，所述囊袋可通過將皮膚捏起或拉開使其離開皮下組織而產(chǎn)生。
“血管生成因子“是刺激血管發(fā)育的生長因子。本文優(yōu)選的血管生成因子是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。
本文術(shù)語“標記”指可檢測的化合物或組合物，其與所述多肽直接或間接偶聯(lián)。所述標記自身是可檢測的(例如放射同位素標記或熒光標記)或，對于酶標記，可催化可檢測底物化合物或組合物的化學(xué)改變。
“分離的”核酸分子是一種從通常與該多肽核酸天然來源相關(guān)的至少一種混合核酸分子中鑒定并分離的核酸分子。分離的核酸分子不同于其天然發(fā)現(xiàn)的形式。因此分離的核酸分子可從天然細胞中的該核酸分子區(qū)別出來。然而，分離的核酸分子包括包含于通常表達該多肽的細胞中的核酸分子，在該細胞中核酸分子位于與天然細胞不同的染色體位置。
術(shù)語“調(diào)控序列”指特定宿主有機體中可操作地連接的編碼序列的表達所需的DNA序列。適合原核生物的調(diào)控序列，例如，包括啟動子，可選地包括操縱子序列，和核糖體結(jié)合位點。已知真核細胞利用啟動子，多腺苷化信號和增強子。
當與另一核酸序列發(fā)生功能關(guān)聯(lián)時，核酸是“可操作地連接的”。例如，前序列或分泌性前導(dǎo)序列如果被表達為參與多肽分泌的前蛋白，其可操作地連接該多肽的DNA；如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，其可操作地連接于該序列；或如果核糖體結(jié)合位點位于可促進翻譯的位置，其可操作地連接編碼序列。通常，“可操作地連接于”的意思是被連接的DNA序列是相鄰的，并且如果是分泌性前導(dǎo)序列，應(yīng)是相鄰的并且處于閱讀框中。然而，增強子則不一定是相鄰的。通過在方便的限制位點接合而實現(xiàn)連接。如果此種位點不存在，合成的寡核苷酸連接物或連頭的使用符合常規(guī)的作法。
本文術(shù)語“細胞”，“細胞系”，和“細胞培養(yǎng)”可互換使用并且所有此種名稱包括其子代。因此，術(shù)語“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化后細胞”包括原代處理細胞及其衍生的培養(yǎng)物，而不考慮傳代的次數(shù)。由于有意和無意的突變，也可理解所有子代的DNA含量均不是恰好相同的。具有與原始轉(zhuǎn)化后細胞中篩選到的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突變體子代也包括在內(nèi)。盡管命名截然不同，從上下文來看這一點是清楚的。
II.抗-VEGF抗體的制備抗體制備(i)VEGF抗原制備并鑒定抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。下文描述了制備本發(fā)明所用抗-VEGF抗體的示例性技術(shù)。用于制備抗體的VEGF抗原可以是，例如VEGF165分子以及VEGF的其它同種型或者其含有所需表位的片段。用于生成本發(fā)明抗-VEGF抗體的其它VEGF的形式對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
人VEGF通過首先利用牛VEGF cDNA作為雜交探針篩選自人細胞制備的cDNA文庫來獲得。Leung et al.(1989)Science，2461306。由此鑒定的一種cDNA編碼與牛VEGF具有超過95％同源性的165個氨基酸的蛋白質(zhì)；該165個氨基酸的蛋白質(zhì)通常稱為人VEGF(hVEGF)或VEGF165。人VEGF的有絲分裂原活性通過在哺乳動物宿主細胞中表達人VEGF cDNA得以證實。通過由人VEGF cDNA轉(zhuǎn)染的細胞調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基促進毛細血管內(nèi)皮細胞的增殖，而對照細胞不能。Leung et al.(1989)Science，supra。
盡管血管內(nèi)皮細胞生長因子可以從自然界分離并純化用于進一步的治療用途，濾泡細胞中相對低的蛋白濃度以及回收VEGF的高成本(就人力以及花費而言)在商業(yè)上沒有應(yīng)用價值。因此，需要進行其它努力以通過重組DNA技術(shù)克隆并表達VEGF。(見例如，F(xiàn)errara(1995)LaboratoryInvestigation 72615-618，所述參考文獻包含在此作為參考)。
VEGF在多種組織中作為多元同二聚體形式表達(每單體121，145，165，189，和206個氨基酸)，其是可選RNA剪接的結(jié)果。VEGF121是可溶有絲分裂原，并不結(jié)合肝素；較長形式的VEGF而漸離的親合力結(jié)合肝素。較長形式的VEGF可通過纖溶酶裂解其羧基末端以釋放VEGF的可擴散形式。纖溶酶裂解后鑒定的羧基末端肽的氨基酸序列是Arg110-Ala111。氨基末端“核心”蛋白VEGF(1-110)作為同源二聚體分離，與完整VEGF165同源二聚體相比，其與中和型單克隆抗體(諸如稱為4.6.1和3.2E3.1.1的抗體)以及VEGF受體的可溶形式以相似的親和力結(jié)合。
數(shù)種在結(jié)構(gòu)上與VEGF相關(guān)的分子最近已經(jīng)被鑒定，包括胎盤生長因子(PIGF)，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D和VEGF-E。Ferrara and Davis-Smyth(1987)Endocr.Rev.，supra；Ogawa et al.(1998)J.Biological Chem.27331273-31281；Meyer etal.(1999)EMBO J.，18363-374。受體酪氨酸激酶，F(xiàn)lt-4(VEGFR-3)，已經(jīng)被鑒定為VEGF-C和VEGF-D的受體。Joukov et al.(1996)EMBO.J.151751；Lee et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA931988-1992；Achen et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95548-553。最近顯示VEGF-C參與淋巴血管生成的調(diào)節(jié)。Jeltsch et al.(1997)Science 2761423-1425。
已經(jīng)鑒定了兩種VEGF受體，F(xiàn)lt-1(也稱為VEGFR-1)和KDR(也稱為VEGFR-2)。Shibuya et al.(1990)Oncogene 8519-527；de Vries et al.(1992)Science 255989-991；Terman et al.(1992)Biochem.Biophys.Res.Commun.1871579-1586。Neuropilin-1為選擇性VEGF受體，其能夠結(jié)合肝素結(jié)合型VEGF同種型(Soker et al.(1998)Cell 92735-45)。Flt-I和KDR都屬于受體酪氨酸激酶(RTK)家族。RTK包括跨膜受體大家族，具有多種生物活性。目前，至少19種不同的PTK亞家族已經(jīng)得以鑒定。酪氨酸激酶(RTK)家族包括對于多種細胞類型的生長以及分化而言重要的受體(Yarden and Ullrich(1988)Ann.Rev.Biochem.57433-478；Ullrich and Schlessinger(1990)Cell 61243-254)。RTK的內(nèi)在功能在與配體結(jié)合時被活化，其導(dǎo)致受體以及多種細胞基質(zhì)的磷酸化，由此產(chǎn)生多種細胞反應(yīng)(Ullrich & Schlessinger(1990)Cell61203-212)。因此，受體酪氨酸激酶介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)由與特定生長因子(配體)的細胞外相互作用而啟動，通常隨后導(dǎo)致受體二聚體化，刺激內(nèi)在蛋白酪氨酸激酶活性以及受體的反式磷酸化。細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的結(jié)合位點由此產(chǎn)生，并導(dǎo)致形成具有胞漿信號分子譜的復(fù)合體，其可促進適當?shù)募毎磻?yīng)(例如細胞分裂，分化，代謝效應(yīng)，細胞外微環(huán)境中的改變)。見Schlessingerand Ullrich(1992)Neuron 91-20。結(jié)構(gòu)上，F(xiàn)lt-1和KDR在細胞外結(jié)構(gòu)域中有7個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，一個跨膜結(jié)構(gòu)域，被激酶插入?yún)^(qū)中斷的共有酪氨酸激酶序列。Matthews et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA889026-9030；Terman et al.(1991)Oncogene 61677-1683。
(ii)多克隆抗體多克隆抗體優(yōu)選通過多次給動物皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑而產(chǎn)生。將所述相關(guān)抗原與針對所免疫的物種具有免疫原性的蛋白(如匙孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)用雙功能試劑或衍生試劑，如馬來酰亞氨苯甲?；虼牾啺孵?通過半胱氨酸殘基結(jié)合)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(R和R1是不同烷基)，進行偶聯(lián)是有效的。
用所述抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物免疫動物，方法是，將100μg或5μg蛋白或偶聯(lián)物(分別針對兔或鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混合，在多位點皮內(nèi)注射該溶液。1個月后，多位點皮內(nèi)注射起始量的1/5-1/10的肽或偶聯(lián)物與弗氏完全佐劑來加強免疫。7-14天后，對動物采血，測定血清中的抗體效價。對動物的加強免疫直到效價達到平臺期為止。優(yōu)選給動物加強注射相同抗原的偶聯(lián)物，但也可以是偶聯(lián)至不同蛋白和/或通過不同的交聯(lián)劑偶聯(lián)的偶聯(lián)物。偶聯(lián)物還可以是重組細胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的融合蛋白。此外，可用明礬等聚集劑(aggregating agent)增強免疫反應(yīng)。
(iii)單克隆抗體單克隆抗體可用Kohler和Milstein，Nature，256495(1975)首先描述的雜交瘤法制備或通過重組DNA法(美國專利4,816,567)制備。
在雜交瘤方法中，如上述免疫小鼠或其它適宜的宿主動物，例如倉鼠，來激發(fā)產(chǎn)生或能產(chǎn)生特異結(jié)合免疫所用蛋白的抗體的淋巴細胞?？蛇x地，所述淋巴細胞可被體外免疫。免疫后，淋巴細胞可被分離并隨后使用適宜的融合劑例如聚乙二醇與骨髓瘤細胞系融合，以形成雜交瘤細胞(Goding，單克隆抗體Principles and Practice，59-103頁(Academic Press，1986))。
由此制備的雜交瘤細胞被接種于適宜的培養(yǎng)基并在其中生長，該培養(yǎng)基優(yōu)選包含一種或多種抑制未融合親代骨髓瘤細胞的生長或存活的物質(zhì)。例如，如果親代骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤的選擇培養(yǎng)基通常包括次黃嘌呤，氨基蝶呤，和胸腺嘧啶(HAT培養(yǎng)基)這些抑制HGPRT-缺陷細胞生長的物質(zhì)。
優(yōu)選骨髓瘤細胞為那些能有效融合、支持所選抗體生成細胞以穩(wěn)定的高水平產(chǎn)生抗體、并對如HAT培養(yǎng)基敏感的骨髓瘤細胞系。在眾多這樣的細胞系中，優(yōu)選的骨髓瘤細胞系是小鼠骨髓瘤系，如由Salk Institute CellDistreibution Center，San Diego，California USA提供的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤，和由美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland USA提供的SP-2或其衍生物，如X63-Ag8-653細胞。也描述了人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系可用于產(chǎn)生人單克隆抗體[Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；和Brodeur等，單克隆抗體的制備技術(shù)和應(yīng)用(Marcel Dekker，Inc.，New York紐約，(1987))51-63頁]。
可在含有生長的雜交瘤細胞的培養(yǎng)基中分析抗所述抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生。優(yōu)選地，雜交瘤細胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合試驗，如放射免疫分析(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)來分析。
一旦鑒定出產(chǎn)生具有所需特異性、親合力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞，這些細胞克隆可通過有限稀釋進行亞克隆，并通過標準方法(Goding，單克隆 抗體Principles and Practice，59-103頁(Academic Press，1986))使其生長。適合此目的的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，通過例如將細胞注射入小鼠中，可以使雜交瘤細胞以動物腹水腫瘤的形式在體內(nèi)生長。
上述亞克隆所分泌的單克隆抗體可用經(jīng)典抗體純化方法如，例如蛋白A-Sepharose，羥基磷灰石層析，凝膠電泳，透析或親和層析等從培養(yǎng)基，腹水或血清中分離。
使用傳統(tǒng)方法(例如通過使用能與編碼小鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異結(jié)合的寡核苷酸探針)可輕易分離并測序編碼單克隆抗體的DNA。雜交瘤細胞是此DNA的優(yōu)選來源。一旦分離出該DNA，可以將它置入表達載體中，該載體隨后被轉(zhuǎn)染至宿主細胞中例如大腸桿菌細胞，猴COS細胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，或不另外生成抗體蛋白的骨髓瘤細胞，從而在重組宿主細胞中合成單克隆抗體。抗體的重組生產(chǎn)將在下文詳述。
在進一步的實施方案中，可從使用McCafferty等，Nature，348552-554(1990)描述的技術(shù)產(chǎn)生的抗體噬菌體文庫中分離單克隆抗體或抗體片段。Clackson等，Nature，352624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)分別描述了使用噬菌體文庫分離小鼠和人抗體。隨后的文章描述了通過鏈改組產(chǎn)生高親和性(納米級)人抗體(Marks等，Bio/Technology，10779-783(1992))，以及將組合感染(combinational infection)和體內(nèi)重組作為策略構(gòu)建非常大的噬菌體文庫(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，212265-2266(1993))。因此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行選擇。
也可采用以下方法對DNA進行修飾例如，以人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列代替同源小鼠序列(美國專利4,816,567；Morrison等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，816851(1984))，或?qū)⒚庖咔虻鞍拙幋a序列與非免疫球蛋白多肽(異源多肽)的完整或部分編碼序列共價結(jié)合。
通常，上述非免疫球蛋白多肽序列可取代抗體的恒定區(qū)，或它們可取代抗體的一個抗原結(jié)合位點的可變區(qū)以產(chǎn)生嵌合二價抗體，該抗體包含兩個特異于不同抗原的抗原結(jié)合位點。
(iv)人源化抗體和人抗體人源化抗體具有一個或多個從非人來源引入它的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常稱為“引進的”殘基，它們通常來自“引進的”可變區(qū)。人源化過程基本是按照Winter及其同事(Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534-1536(1988))的方法，通過用嚙齒類CDRs或CDR序列替換人抗體的對應(yīng)序列來進行。因此，這樣的“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利4,816,567)，其中完整人類可變區(qū)的很少一部分被非人物種的相應(yīng)序列取代。實踐中，人源化抗體通常是人的抗體，其中一些CDR殘基且可能有部分FR殘基被嚙齒動物抗體中類似位點的殘基取代。
選擇人源化抗體制備所用的人輕鏈和重鏈可變區(qū)，對于降低抗原性非常重要。根據(jù)所謂的“最適”方法，針對已知人可變區(qū)序列的整個文庫篩選嚙齒類抗體的可變區(qū)序列。隨后將與嚙齒類最接近的人序列作為人框架區(qū)(FR)用于人源化抗體(Sims等，J.Immunol.，1512296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.，196901(1987))。另一種方法是使用從輕鏈或重鏈特定亞群的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架區(qū)。同樣的框架區(qū)可被用于幾種不同的人源化抗體(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta等，J.Immunol.，1512623(1993))。
更重要的是，將抗體人源化后保留了對抗原的高親合力和其它有利的生物特性。為達到此目的，根據(jù)優(yōu)選方法，通過用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性(conceptual)人源化產(chǎn)物來制備人源化抗體。免疫球蛋白三維模型已有商品，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。還有用于描述和展示所選免疫球蛋白序列可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機程序。通過觀察這些展示結(jié)果可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能發(fā)揮的作用，即分析能影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基。通過這種方法，可從受體序列和引進序列中選出FR殘基并組合，從而得到所需抗體性質(zhì)，如對靶抗原的親合力增加?？傊?，超變區(qū)殘基直接并且最主要涉及對抗原結(jié)合的影響。
可選的，可以制備轉(zhuǎn)基因動物(如小鼠)，它經(jīng)過免疫能在缺乏內(nèi)源性免疫球蛋白生成的情況下產(chǎn)生全套人抗體。例如，已指出在嵌合和胚系(germ-line)突變小鼠中，抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失導(dǎo)致內(nèi)源性抗體生成的完全抑制。將人胚系免疫球蛋白基因陣列(array)轉(zhuǎn)移到此胚系突變小鼠中，將導(dǎo)致在抗原攻擊的情況下產(chǎn)生人抗體。見例如，Jakobovits等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551(1993)；Jakobovits等，Nature，362255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immuno.，733(1993)；和Duchosal等，Nature355258(1992)。人抗體也可來自噬菌體展示文庫(Hoogenboom等，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)；Vaughan等，Nature Biotech 14309(1996))。
(v)抗體片段已開發(fā)了生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，這些片段通過對完整抗體的蛋白水解性消化獲得(見Morimoto等，生物化學(xué)和生物物理學(xué)方法雜志(Journal of Biochemical and Biophysical Methods)24107-117(1992))和Brennan等，科學(xué)，22981(1985))。但現(xiàn)在可直接通過重組宿主細胞產(chǎn)生這些片段。例如，可從上述抗體噬菌體庫分離抗體片段。另外，可從大腸桿菌直接回收Fab’-SH片段，并經(jīng)化學(xué)連接形成F(ab’)2片段(Carter等，生物/技術(shù)10163-167(1992))。依據(jù)另一種方法，可直接從重組宿主細胞培養(yǎng)中分離F(ab’)2片段。其它產(chǎn)生抗體片段的技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。在其它實施方案中，所選抗體是單鏈Fv片段(scFv)。見WO 93/16185。
(v)多特異抗體多特異抗體對至少兩種不同的抗原具有結(jié)合特異性。盡管此種分子通常只結(jié)合兩種抗原(即雙特異抗體，BsAbs)，具有附加特異性的抗體例如三特異抗體也包含在文中所用的術(shù)語中。BsAbs的實例包括具有針對腫瘤抗原的一條臂和針對細胞毒作用觸發(fā)分子(cytotoxic trigger molecule)的另一條臂的那些抗體，例如抗-FcγRI/抗-CD15，抗-p185HER2/FcγRIII(CD16)，抗-CD3/抗-惡性B-細胞(1D10)，抗-CD3/抗-p185HER2，抗-CD3/抗-p97，抗-CD3/抗-腎細胞癌，抗-CD3/抗-OVCAR-3，抗-CD3/L-D1(抗-結(jié)腸癌)，抗-CD3/抗-黑色素細胞刺激激素類似物，抗-EGF受體/抗-CD3，抗-CD3/抗-CAMA1，抗-CD3/抗-CD19，抗-CD3/MoV18，抗-神經(jīng)細胞粘附分子(NCAM)/抗-CD3，抗-葉酸結(jié)合蛋白(FBP)/抗-CD3，抗-泛癌相關(guān)抗原(AMOC-31)/抗-CD3；一條臂特異地結(jié)合腫瘤抗原而另一條臂結(jié)合毒素的BsAbs例如抗-皂草素(saporin)/抗-Id-1，抗-CD22/抗-皂草素，抗-CD7/抗-皂草素，抗-CD38/抗-皂草素，抗-CEA/抗-蓖麻毒素A鏈，抗-干擾素-α(IFN-α)/抗-雜交瘤獨特型，抗-CEA/抗-長春花堿；轉(zhuǎn)化酶活化的前體藥物的BsAbs例如抗-CD30/抗-堿性磷酸酶(催化磷酸絲裂霉素前藥物向絲裂霉素醇的轉(zhuǎn)化)；可用作纖維蛋白溶解劑的例如抗-纖維蛋白/抗-組織纖溶酶原激活物(tPA)，抗-纖維蛋白/抗-尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)；將免疫復(fù)合物靶向細胞表面受體的BsAbs例如抗-低密度脂蛋白(LDL)/抗-Fc受體(例如FcγRI，F(xiàn)cγRII或FcγRIII)；用于治療感染性疾病的BsAbs例如抗-CD3/抗-單純皰疹病毒(HSV)，抗-T-cell受體CD3復(fù)合物/抗-流感病毒，抗-FcγR/抗-HIV；體外或體內(nèi)檢測腫瘤的BsAbs例如抗-CEA/抗-EOTUBE，抗-CEA/抗-DPTA，抗-p185HER2/抗-hapten；作為疫苗佐劑的BsAbs；和作為診斷工具的BsAbs例如抗-兔IgG/抗-鐵蛋白，抗-辣根過氧化物酶(HRP)/抗-激素，抗-生長抑素/抗-物質(zhì)P，抗-HRP/抗-FITC，抗-CEA/抗-β-半乳糖苷酶。三特異抗體的實例包括抗-CD3/抗-CD4/抗-CD37，抗-CD3/抗-CD5/抗-CD37和抗-CD3/抗-CD8/抗-CD37。雙特異抗體可被制備為全長抗體或抗體片段(例如F(ab’)2雙特異性抗體)。雙特異性抗體的綜述見Segal等J.Immunol.Methods 2481-6(2001)。
制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。傳統(tǒng)上，全長雙特異性抗體的重組制備是基于兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，其中這兩條鏈具有不同特異性(Millstein and Cuello，Nature，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈輕鏈隨機搭配，這些雜交瘤(quadroma)產(chǎn)生10種不同抗體分子的潛在的混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。對正確分子的純化(通常通過親和層析步驟來進行)非常復(fù)雜，且產(chǎn)量很低。類似的方法見WO93/08829(1993年5月13日公開)和Traunecker等，EMBO J，103655-3659(1991)。
依據(jù)不同的方法，可將具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點)的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。該融合優(yōu)選與至少包含鉸鏈區(qū)、CH2及CH3區(qū)部分的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選使含有輕鏈結(jié)合所需位點的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)出現(xiàn)在至少在一種融合中。可將編碼免疫球蛋白重鏈融合體，以及必要時，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同表達載體，共轉(zhuǎn)染至適當宿主生物。這使得在使用非等比的三種多肽鏈進行構(gòu)建的實施方案中，能夠較靈活地調(diào)整三種多肽片段的相互比例，以獲得最佳產(chǎn)量。但也可在至少兩種多肽鏈以等比例表達而獲得高產(chǎn)時或所述比例無特別意義時，將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一表達載體。
在該方法的一個優(yōu)選實施方案中，所述雙特異性抗體由一條臂上的具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一條臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。已發(fā)現(xiàn)這種不對稱結(jié)構(gòu)有利于從非必要免疫球蛋白鏈的組合中分離出所需雙特異性化合物，因為只在該雙特異性分子的一半中存在免疫球蛋白輕鏈，這使得分離更加容易。此方法公開于1994年3月3日公開的WO94/04690中。制備雙特異性抗體的進一步細節(jié)可以參見，例如Suresh等，Methods in Enzymology，121210(1986)。根據(jù)W096/27011所述的另一種方法，可改造一對抗體分子之間的界面，使得從重組細胞培養(yǎng)中獲得的異二聚體的百分比最大。優(yōu)選的界面包括抗體恒定區(qū)CH3結(jié)構(gòu)域的至少一部分。在該方法中，源于第一抗體分子界面上的一條或多條小的氨基酸側(cè)鏈被較大側(cè)鏈(如酪氨酸或色氨酸)取代。與所述大側(cè)鏈大小相同或相近的互補“溝”可通過將氨基酸大側(cè)鏈用小側(cè)鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)取代而在第二抗體分子的界面上形成。這提供了一種機制，其使異二聚體的產(chǎn)量比不想要的終產(chǎn)物如同二聚體高。
雙特異性抗體包括交聯(lián)抗體或“異源偶聯(lián)的”抗體。例如，可使異源偶聯(lián)物中的抗體之一與抗生物素蛋白偶聯(lián)，使另一抗體與生物素偶聯(lián)。有觀點認為，這類抗體可用于將免疫細胞導(dǎo)向不想要的細胞(美國專利4676980)，也可用于治療HIV感染(WO91/00360，WO92/200373和EP03089)。異源偶聯(lián)抗體可通過任何適當?shù)慕宦?lián)方法制備。適當?shù)慕宦?lián)制劑和多種交聯(lián)技術(shù)為本領(lǐng)域已知，可在美國專利4676980號中獲得。
從抗體片段制備雙特異性抗體的技術(shù)已有文獻。例如，雙特異性抗體可利用化學(xué)連接制備。Brennan等，科學(xué)22981(1985)中描述了將完整抗體經(jīng)蛋白水解制備F(ab′)2片段的方法。這些片段在二巰基復(fù)合劑亞砷酸鈉存在時被還原，從而穩(wěn)定相鄰的巰基，并阻止分子間二硫鍵的形成。生成的Fab′片段被轉(zhuǎn)化為硫硝基苯甲酸鹽(TNB)衍生物。其中一種Fab′-TNB衍生物經(jīng)巰基乙胺還原成Fab′-硫醇，再與等分子量的其它Fab′-TNB衍生物混合形成雙特異性抗體。如此產(chǎn)生的雙特異性抗體可作為酶的選擇性固相化中所用的試劑。
近期的進展促進了Fab′-SH片段從大腸桿菌的直接回收，該片段可經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體。Shalaby等，實驗醫(yī)學(xué)雜志，175217-225(1992)中描述了完全人源化雙特異性抗體F(ab′)2分子的產(chǎn)生。每一Fab′片段分別從大腸桿菌中分泌出來，體外直接化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體。如此制備的雙特異性抗體能與過表達VEGF受體的細胞和正常人T細胞結(jié)合，還能引發(fā)人類細胞毒淋巴細胞對人乳腺腫瘤細胞的裂解活性。
直接從重組細胞培養(yǎng)中制備并分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)也已有描述。例如，可用亮氨酸拉鏈制備雙特異性抗體。Kostelny等，免疫學(xué)雜志，148(5)1547-1553(1992))。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩種不同抗體的Fab′部分通過基因融合而連接。使抗體的同型二聚體在鉸鏈區(qū)被還原成單體，然后被再氧化形成抗體的異二聚體。該方法也可用于制備抗體同型二聚體。由Hollinger等，美國國家科學(xué)院學(xué)報，906444-6448(1993))描述的“二價抗體”技術(shù)提供了另一種制備雙特異性抗體片段的方法。所述片段中含有重鏈可變區(qū)(VH)，其通過接頭與輕鏈可變區(qū)(VL)相連，該接頭非常短，使得同一鏈的兩個結(jié)構(gòu)域之間無法配對。因此，同一片段上的VH和VL結(jié)構(gòu)域被迫與另一片段上的互補VL和VH結(jié)構(gòu)域配對，從而形成兩個抗原結(jié)合位點。此外還報道了另一種用單鏈Fv(sFv)二聚體來制備雙特異性抗體的策略。見Gruber等，免疫學(xué)雜志，1525368(1994)。
還考慮了二價以上的抗體。如可制備三特異性抗體。Tutt等，免疫學(xué)雜志，14760(1991)。
(vii)效應(yīng)物功能改造也可預(yù)期修飾拮抗劑的效應(yīng)物功能(effector function)，如以此增強拮抗劑的抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用(ADCC)和/或補體依賴的細胞毒作用(CDC)。這可以通過在抗體拮抗劑FC區(qū)引入一或多個氨基酸取代而獲得。此外，可在FC區(qū)引入半胱氨酸殘基，使得在此區(qū)形成鏈間二硫鍵。由此產(chǎn)生的同型二聚體抗體可提高內(nèi)在化能力和/或增強補體介導(dǎo)的細胞殺傷作用和ADCC。見Caron等，實驗醫(yī)學(xué)雜志1761191-1195(1992)和Shopes，B.免疫學(xué)雜志1482918-2922(1992)。具有增強的抗腫瘤活性的同型二聚體抗體也可用Wolffe等，癌癥研究532560-2565(1993)所述異源雙功能交聯(lián)劑制備?；蛘?，可通過工程改造產(chǎn)生具有雙FC區(qū)并因此具有增強的補體裂解效應(yīng)及ADCC能力的抗體。見Stevenson等，抗癌藥物的設(shè)計(抗-Cancer drug design)3219-230(1989)。
(viii)免疫偶聯(lián)物本發(fā)明還涉及包含偶聯(lián)于細胞毒藥劑的本文所述抗體的免疫偶聯(lián)物，所述細胞毒藥劑諸如化療劑，毒素(例如細菌，真菌，植物或動物來源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射偶聯(lián)物)。
可用于產(chǎn)生所述免疫偶聯(lián)物的化療劑已經(jīng)在上文描述?？梢詰?yīng)用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI，PAPII，PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑，白樹毒素，米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素和單端孢菌毒素(tricothecenes)。多種放射性核素可用于制備放射偶聯(lián)物抗體。實例包括212Bi，131I，131In，90y和186Re。
抗體和細胞毒作用制劑的偶聯(lián)物可通過多種雙功能蛋白偶聯(lián)劑來連接，所述雙功能蛋白偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯，亞胺基硫烷(IT)，亞胺酸酯的雙功能衍生物(如鹽酸二甲基己二酸亞氨酯)，活性酯類(如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)，醛類(如戊二醛)，雙-疊氮化合物(如雙(對-疊氮基苯甲?；?己二胺)，雙-重氮衍生物(如雙-(對-重氮苯甲?；?-乙二胺)，二異氰酸酯(如亞甲代苯基2，6-二異氰酸酯)，和雙-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，Science 2381098(1987)所述制備。C14標記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二乙烯三氨五乙酸(MX-DTPA)是將放射性核苷酸偶聯(lián)至抗體的偶聯(lián)劑之一。見WO94/11026。
在另一實施方案中，抗體可與腫瘤預(yù)靶向中應(yīng)用的“受體”(如鏈霉親和素)偶聯(lián)，將該抗體-受體偶聯(lián)物給予患者，之后用清除劑(clearing agent)除去循環(huán)中未結(jié)合的偶聯(lián)物，再給予已偶聯(lián)了細胞毒作用制劑(如放射性核苷酸)的“配體”(如抗生物素蛋白)。
(ix)免疫脂質(zhì)體本發(fā)明公開的抗體也被配制成免疫脂質(zhì)體。含有所述抗體的脂質(zhì)體通過本領(lǐng)域已知方法制備，諸如Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，823688(1985)；Hwang etal.，Proc.Natl Acad.Sci.USA，774030(1980)；以及美國專利4,485,045和4,544,545中所述。具有延長的循環(huán)時間的脂質(zhì)體在美國專利5,013,556中公開。
特別有用的脂質(zhì)體可利用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物經(jīng)反相蒸發(fā)法產(chǎn)生。通過使脂質(zhì)體在擠壓之下穿過指定孔徑大小的濾膜，可獲得具有所需直徑的脂質(zhì)體。本發(fā)明抗體的Fab’片段可如Martin等，J.Biol.Chem.，257286-288(1982)所述，經(jīng)二硫鍵交換反應(yīng)與脂質(zhì)體偶聯(lián)?？扇芜x在所述脂質(zhì)體中包含一種化療藥物。見Gabizon等，J.National Cancer Inst，81(19)1484(1989)。
(x)抗體依賴酶介導(dǎo)的前體藥物的治療(ADEPT)通過將抗體偶聯(lián)于前體藥物活化酶，本發(fā)明的抗體也可用于ADEPT，該酶將前體藥物(例如肽基化療劑，見WO81/01145)轉(zhuǎn)化成活性抗癌藥物。參見，例如，WO 88/和美國專利4,975,278。
用于ADEPT的免疫結(jié)合物的酶組分包括任何能夠?qū)η绑w藥物起作用，將它轉(zhuǎn)化成更加有活性的細胞毒作用形式的酶。
可用于本發(fā)明的方法的酶包括，但不限于，堿性磷酸酶，用于將含有磷酸鹽的前體藥物轉(zhuǎn)化成游離藥物；芳香硫酸酯酶，用于將含有硫酸鹽的前體藥物轉(zhuǎn)化成游離藥物；胞嘧啶脫氨酶，用于將含有無毒的5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化成抗癌藥物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，例如沙雷氏菌屬蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶，羧肽酶和組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B和L)，用于將含肽的前體藥物轉(zhuǎn)化成游離藥物；D-丙酰胺羧肽酶，用于轉(zhuǎn)化含有D-氨基酸取代物的前體藥物；碳水化合物-切割酶，例如β-半乳糖苷酶和神經(jīng)酰氨酶，用于將糖基化的前體藥物轉(zhuǎn)化成游離藥物；β-內(nèi)酰胺酶，用于將β-內(nèi)酰胺衍生的藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物；和青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，用于將由苯氧乙?；虮揭阴；云浒钡苌乃幬锓謩e轉(zhuǎn)化成游離藥物。可選地，具有酶活性的抗體(本領(lǐng)域也稱“抗體酶(abzyme)”)可用將本發(fā)明的前體藥物轉(zhuǎn)化成游離活性藥物(參見，例如，Massey，Nature 328457-458(1987))?？扇绫疚乃龇椒ㄖ苽淇贵w-抗體酶偶聯(lián)物，從而將抗體酶遞送到腫瘤細胞群。
通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)，本發(fā)明的酶可與抗體共價偶聯(lián)，例如使用上述的異雙功能交聯(lián)劑?？蛇x地，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的重組DNA技術(shù)構(gòu)建融合蛋白，該融合蛋白至少包含本文抗體的抗原結(jié)合區(qū)，并連接于本發(fā)明的酶的至少一個功能活化部分。(見，例如，Neuberger等，Nature，312604-608(1984))。
(xi)抗體-拯救受體結(jié)合表位融合物在本發(fā)明具體實施方案中，例如需要利用抗體片段而不是完整抗體來促進腫瘤穿透。在這種情況下，需要修飾所述抗體片段以增加其血清半壽期。這可通過例如將拯救受體結(jié)合表位摻入所述抗體片段(例如通過突變抗體片段中的適宜區(qū)域或?qū)⑺霰砦粨饺雽⑷诤嫌谒隹贵w任意末端或中間的肽標記中，例如通過DNA或肽合成)來實現(xiàn)拯救受體結(jié)合表位優(yōu)選構(gòu)成這樣的區(qū)域，其中任何來自Fc區(qū)的一或兩個環(huán)的一個或多個殘基被轉(zhuǎn)移到抗體片段的類似的位置。甚至更優(yōu)選，來自Fc區(qū)的一或兩個環(huán)的3個或多個殘基被轉(zhuǎn)移。更優(yōu)選，所述表位從Fc區(qū)(例如IgG的Fc區(qū))的CH2區(qū)取出，并轉(zhuǎn)移到CH1，CH3，或VH區(qū)，或超過一個所述的抗體的所述區(qū)。可選，所述表位從Fc區(qū)的CH2區(qū)取出，并轉(zhuǎn)移到所述抗體片段的CL區(qū)和/或VL區(qū)。
(xii)抗體的其它共價修飾抗體的共價修飾包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。如果可能，它們可通過化學(xué)合成或?qū)λ隹贵w的酶促或化學(xué)裂解來制備。對所述抗體的其它類型的共價修飾通過使被靶向的抗體氨基酸殘基與有機衍生反應(yīng)劑反應(yīng)來導(dǎo)入分子，所述有機衍生化劑可與選定的側(cè)鏈或N或C末端殘基反應(yīng)。
半胱氨酰殘基最經(jīng)常與α-鹵代乙酸鹽(酯)(以及相應(yīng)的胺)諸如氯代乙酸或氯代乙酰胺反應(yīng)，以產(chǎn)生羧甲基或羧基氨基甲基衍生物。半胱氨酰殘基也通過與溴三氟丙酮，α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸，氯乙?；姿狨?，N-烷基馬來酰亞胺，3-硝基-2-吡啶基二硫化物，甲基2-吡啶基二硫化物，對氯汞基苯甲酸，2-氯汞基-4-硝基酚，或氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1，3-二唑反應(yīng)衍生化。
組氨酰殘基經(jīng)過與焦碳酸二乙酯在pH 5.5-7.0下反應(yīng)衍生化，因為該試劑對組氨酸側(cè)鏈具有相對特異性。對溴苯甲酰甲基溴化物也是有用的；反應(yīng)優(yōu)選在0.1M二甲胂酸鈉中在pH 6.0進行。
賴氨酰和氨基末端殘基與琥珀酸或其他羧酸酐反應(yīng)。與這些試劑的衍生化具有使賴氨酰殘基的電荷逆轉(zhuǎn)的效應(yīng)。衍生含α-氨基的殘基的其他合適試劑包括亞氨酸酯(imidoesters)，例如甲基吡啶亞酰胺(methyl picolinimidate)；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯代硼氫化物(chloroborohydride)；三硝基苯磺酸；O-甲基異脲；2，4-戊二酮；和轉(zhuǎn)氨酶催化的與乙醛酸的反應(yīng)。
精氨酰殘基通過與苯基乙二醛，2，3-丁二酮，1，2-環(huán)己二酮和茚三酮的一種或幾種常規(guī)試劑反應(yīng)進行修飾。精氨酸殘基的衍生化需要在堿性條件下進行反應(yīng)，因為胍官能團具有高pKa。另外，這些試劑可與賴氨酸以及精氨酸ε-氨基反應(yīng)。
酪氨酰殘基的具體修飾可通過通過與芳香重氮基化合物或四硝基甲烷反應(yīng)而將光譜標記導(dǎo)入酪氨酰殘基來進行。最常見，N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分別用于形成O-乙?；野滨７N類以及3-硝基衍生物。酪氨酰殘基利用125I或131I來碘化，從而制備標記的蛋白質(zhì)用于放射免疫分析。
通過與碳二亞胺(R-N＝C＝N-R′)反應(yīng)可選擇性修飾羧基側(cè)鏈基團(天冬氨酰或谷氨酰)，其中R和R′是不同的烷基基團，例如1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮-4，4-二甲基戊基)碳二亞胺。另外，天冬氨酰和谷氨酰殘基通過與銨離子反應(yīng)轉(zhuǎn)變成天冬酰胺?；凸劝滨０孵；?。
谷氨酰胺酰基以及天冬酰胺?；ǔ１幻撊ヵ０坊謩e形成相應(yīng)的谷氨酰殘基以及天冬胺酰殘基。這些殘基在中性或堿性條件下脫去酰胺基。這些殘基脫去酰胺基后的形式在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
其它修飾包括脯氨酸以及賴氨酸的羥化，絲氨酰或蘇氨酰殘基的羥基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸以及組氨酸側(cè)鏈的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，ProteinsStructure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，SanFrancisco，pp.79-86(1983))，N末端胺的?；约叭魏蜟末端羧基的酰胺化。
其它共價修飾類型包括將配糖以化學(xué)或酶促方式偶聯(lián)于抗體。這些方法的優(yōu)勢在于它們不需要在宿主細胞中產(chǎn)生抗體，所述宿主細胞具有對N-或O-連接的糖基化的糖基化能力。根據(jù)所用的偶聯(lián)模式，所述糖可連接于(a)精氨酸和組氨酸，(b)游離羧基，(c)游離巰基諸如半胱氨酸的游離巰基，(d)游離羥基，諸如絲氨酸、蘇氨酸和羥脯氨酸的游離羥基，(e)芳香殘基，諸如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的芳香殘基，和(f)谷氨酰胺的酰胺基。這些方法在1987年9月11日公開的WO 87/05330，以及Aplin and Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，pp.259-306(1981)中描述。
去除任何存在于抗體上的碳水化合物部分可通過化學(xué)和酶方法實現(xiàn)?；瘜W(xué)去糖基化需要將所述抗體暴露于化合物三氟甲磺酸或等價化合物。該處理導(dǎo)致除連接糖(N-乙酰葡糖胺和N-乙酰半乳糖胺)之外的大多數(shù)或所有糖的裂解，而保持所述抗體完整?；瘜W(xué)去糖化由Hakimuddin，etal.Arch.Biochem.Biopliys.25952(1987)和Edge et al.Anal.Biochem.，118131(1981)描述?？贵w上碳水化合物部分的酶促裂解可通過利用多種內(nèi)糖苷酶以及外糖苷酶進行，如Thotakuraet al.Metla.Enzymol.138350(1987)所述。
另一種抗體共價修飾類型包括將所述抗體連接于多種非蛋白質(zhì)聚合物之一，例如聚乙二醇，聚丙二醇或聚氧化烯，如美國專利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337所述。
B.載體，宿主細胞和重組方法本發(fā)明所述抗-VEGF抗體可利用輕易可得的技術(shù)和材料重組制備。
為進行糖蛋白的重組生產(chǎn)，分離編碼它的核酸并把核酸插入可復(fù)制的載體中進一步克隆(DNA擴增)或表達。編碼糖蛋白的DNA易于利用傳統(tǒng)方法分離和測序(例如，通過使用能夠與編碼糖蛋白的基因特異結(jié)合的寡核苷酸探針)?？衫迷S多載體。載體的組分通常包括，但不限于，以下物質(zhì)中的一種或多種信號序列，復(fù)制起點，一個或多個標記基因，增強子，啟動子，和轉(zhuǎn)錄終止序列。
(i)信號序列成分本發(fā)明的糖蛋白不僅可直接被重組生產(chǎn)，也可以作為與異源多肽的融合蛋白被生產(chǎn)，該異源多肽優(yōu)選是信號序列或在成熟蛋白或多肽的N末端具有特定切割位點的其它多肽。選定的異源信號序列優(yōu)選是可由宿主細胞識別和加工(即，由信號肽酶切割)的序列。對于不識別和加工天然多肽信號序列的原核細胞，信號序列由以下原核信號序列取代，例如選自堿性磷酸酶，青霉素酶，1pp，或熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)序列。對于酵母分泌物，天然信號序列可由例如酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列，α因子前導(dǎo)序列(包括糖酵母(Saccharomyces)和克魯維酵母(Kluyveromyces)α-因子前導(dǎo)序列)，或酸性磷酸酶前導(dǎo)序列，白色念珠菌(C.albicans)葡糖淀粉酶前導(dǎo)序列，或WO 90/13646中所述的信號序列。在哺乳動物細胞表達中，可利用哺乳動物信號序列以及病毒分泌性前導(dǎo)序列，例如，單純皰疹gD信號。
在閱讀框架中，此種前體區(qū)的DNA連接于編碼所述抗體的DNA。
(ii)復(fù)制成分的起點表達載體和克隆載體都包含能使該載體在一或多種選定的宿主細胞中復(fù)制的核酸序列。一般情況下，在克隆載體中，這種序列是能使該載體獨立于宿主染色體DNA而復(fù)制的序列，包括復(fù)制起點或自我復(fù)制序列。這樣的序列在各種細菌、酵母和病毒中都是眾所周知的。質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點適合大多數(shù)革蘭氏陰性細菌，2μ質(zhì)粒起點適合酵母菌，多種病毒起點(SV40，多瘤病毒(Polyoma)，腺病毒，VSV或BPV)可用于哺乳動物細胞中的克隆載體。復(fù)制組分的起點一般不是哺乳動物表達載體所必需的(SV40起點的使用通常僅僅是由于其包含早期啟動子)。
(iii)選擇基因成分表達載體和克隆載體應(yīng)該包含選擇基因，也稱選擇標記。該基因編碼使經(jīng)過轉(zhuǎn)化的宿主細胞在選擇性培養(yǎng)基中存活或生長所必需的蛋白。沒有被包含該選擇基因的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞在所述選擇性培養(yǎng)基中不能存活。典型的選擇基因編碼具有以下性質(zhì)的蛋白(a)賦予對抗生素或其它毒素(如氨芐青霉素，新霉素，氨甲蝶呤或四環(huán)素)的抗性，(b)彌補營養(yǎng)缺陷，或(c)提供復(fù)合培養(yǎng)基不能供給的關(guān)鍵營養(yǎng)物，例如編碼芽孢桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
選擇方案的一個實例是利用藥物限制宿主細胞的生長。那些被異源基因成功轉(zhuǎn)化的細胞產(chǎn)生一種賦予藥物抗性的蛋白，從而在該選擇環(huán)境中存活。這種顯性選擇可以采用的藥物有新霉素，霉酚酸和潮霉素。
適合于哺乳動物細胞的另一例選擇標記是允許鑒定能攝取多肽核酸的細胞的那些標記，如DHFR或胸苷激酶，金屬硫蛋白-I和-II，優(yōu)選靈長類金屬硫蛋白基因，腺苷脫氨酶，鳥氨酸脫羧酶等。
例如，用DHFR選擇基因轉(zhuǎn)化的細胞首先通過將所有轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在包含氨甲蝶呤(Mtx，為DHFR的一種競爭型拮抗劑)的培養(yǎng)基中來進行鑒定。當采用野生型DHFR時，合適的宿主細胞包括DHFR活性有缺陷的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系。
或者，宿主細胞(尤其包含內(nèi)源DHFR的野生型宿主)被編碼Bv8的DNA序列，野生型DHFR蛋白，以及另一種選擇標記如氨基糖苷3’-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化以后，可以通過在含有針對該選擇標記的選擇試劑如氨基糖苷類抗生素(如卡那霉素，新霉素或G418)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞來進行選擇。參見美國專利4,965,199。
適用于酵母的合適選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等，Nature，28239(1979))。Trp1基因為不能在色氨酸中生長的酵母突變株(例如ATCC 44076或PEP4-1)提供了選擇標記(Jones，Genetics，8512(1977))。此后，酵母宿主細胞基因組中trp1損傷的存在提供了通過在缺乏色氨酸的條件中生長而檢測轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。類似地，Leu2-缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)可以由攜帶Leu2基因的已知質(zhì)粒來補充。
此外，源自1.6μm環(huán)狀質(zhì)粒pKD1的載體可以用于轉(zhuǎn)化克魯維酵母(Kluyveromyces)。Bianchi等，Curr.Genet.，12185(1987)?？蛇x地，Van den Berg，Bio/Technology，8135(1990)報道了一種用于在乳克魯維酵母(K.lactis)中大規(guī)模制備重組小牛凝乳酶的表達系統(tǒng)。已公開由克魯維酵母的工業(yè)生產(chǎn)菌株產(chǎn)生分泌重組人血清白蛋白的穩(wěn)定的多拷貝表達載體。Fleer等，Bio/Technology，9968-975(1991)。
(iv)啟動子成分表達載體和克隆載體通常包含能被宿主生物識別的啟動子，它與多肽核酸可操作相連。適用于原核宿主的啟動子，包括phoA啟動子，β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)，堿性磷酸酶，色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)，和雜化啟動子如tac啟動子。然而，也可以使用其它已知的細菌啟動子。適用于細菌系統(tǒng)的啟動子還包含與編碼多肽的DNA可操作相連的Shine-Dalgamo(S.D.)序列。
真核生物的啟動子序列也是已知的。幾乎所有的真核基因在轉(zhuǎn)錄起始點上游約25-30個堿基處具有AT-富集區(qū)。很多基因在其轉(zhuǎn)錄起始點上游70-80個堿基處有另一種序列CNCAAT，其中x可以是任何核苷酸。大多數(shù)真核基因的3’端是AATAAA序列，它可以作為一種信號用于將poly-A尾添加到編碼序列3’端。所有這些序列都適合于插入真核表達載體中。
適用于酵母宿主的啟動序列的實例包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，J.Biol.Chem.，2552073(1980))或其它糖酵解酶(Hess等，J.Adv.EnzymeReg.，7149(1968)；Holland，Biochemistry，174900(1978))的啟動子，所述其它糖酵解酶如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6磷酸異構(gòu)酶，3-磷酸甘油變位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖異構(gòu)酶，磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖激酶。
其它的酵母啟動子，即那些還具有由生長條件控制轉(zhuǎn)錄的優(yōu)點的誘導(dǎo)型啟動子，是下述基因的啟動子區(qū)醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和負責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶。在EP 73,657中進一步描述了適用于酵母表達系統(tǒng)的載體和啟動子。酵母增強子與酵母啟動子聯(lián)合使用也是有利的。
在哺乳動物宿主細胞中，從載體轉(zhuǎn)錄抗體可以受啟動子調(diào)控，所述啟動子例如來自病毒基因組，如多形瘤病毒、雞痘病毒(1989年7月5日公布的UK 2211504)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)的啟動子，或者來自異源哺乳動物的啟動子，如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子等，來自熱休克蛋白的啟動子，前提是這些啟動子與宿主細胞系統(tǒng)相容。
SV40病毒的早期和晚期啟動子可以作為還包含SV40病毒復(fù)制起點的SV40限制性片段而方便地獲得。人巨細胞病毒的立即早期啟動子可以作為Hind III E限制性片段方便地獲得。美國專利4,419,446中公開了在哺乳動物宿主中用牛乳頭瘤病毒作為載體來表達DNA的系統(tǒng)。美國專利4,601,978中敘述了對這個系統(tǒng)的改進。另見Reyes等，Nature，297598-601(1982)中關(guān)于在單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子控制下在小鼠細胞中表達人β干擾素cDNA?？蛇x地，可將勞氏肉瘤病毒長末端重復(fù)序列作為啟動子。
(v)增強子成分編碼本發(fā)明多肽的DNA在高等真核生物中的轉(zhuǎn)錄常常通過將增強子序列插入載體中來增加。目前已知很多哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰島素)的增強子序列。但通常使用真核細胞病毒的增強子。實例包括在其復(fù)制起始點晚期側(cè)(late side)的SV40增強子(bp100-270)，巨細胞病毒早期啟動子增強子，在其復(fù)制起始點晚期側(cè)的多形瘤增強子，和腺病毒增強子。也可參見Yaniv，Nature，29717-18(1982)所述用于活化真核啟動子的增強元件。所述增強子可以剪接插入載體中抗體編碼序列的5’或3’位置，但優(yōu)選位于啟動子的5’位置。
(vi)轉(zhuǎn)錄終止成分用于真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細胞生物的有核細胞)的表達載體，還包括對轉(zhuǎn)錄終止和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。這些序列通常來自真核或病毒DNA或cDNA的5’(偶爾為3’)非翻譯區(qū)。這些區(qū)域包含轉(zhuǎn)錄為編碼抗體的mRNA的非翻譯區(qū)中聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。一種有用的轉(zhuǎn)錄終止元件是牛生長激素多腺苷化區(qū)。見WO94/11026和其中公開的表達載體。
(vii)宿主細胞的選擇和轉(zhuǎn)化克隆或表達本文所述載體中DNA的適宜宿主細胞，包括原核生物、酵母或高等真核細胞。適于此目的的原核生物包括真細菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌屬(Escherichia)，例如，大腸桿菌(E.coli)，腸桿菌屬(Enterobacter)，歐文菌屬(Erwinia)，克雷白菌屬(Klebsiella)，變形菌桿屬(Proteus)，沙門菌屬(Salmonella)(如鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium))，沙雷菌屬(Serratia)(如粘質(zhì)沙雷菌(Serratia marcescans))和志賀菌屬(Shigella)等，以及芽孢桿菌屬(Bacilli)如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日出版的DD 266,710中所述地衣芽孢桿菌41P)等，假單胞菌屬(Pseudomonas)如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)，及鏈霉菌(Streptomyces)。優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC 31,446)，但其它菌株，如大腸桿菌B，大腸桿菌x1776(ATCC 31,537)和大腸桿菌W3110(ATCC 27,325)也是合適的。這些實例是用于說明，并非限制。
除了原核生物，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是適合于抗體編碼載體的克隆或表達的宿主。釀酒酵母或常見的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。還有多個其它屬、種和株已有商品供應(yīng)，并且可以用于本發(fā)明，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主，例如乳克魯維酵母(K.lactis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克曼氏克魯維酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)和馬克斯克魯維氏酵母(K.marxianus)等；yarrowia(EP 402,226)；巴斯德畢赤酵母(pichia pastoris)(EP 183,070；Sreekrishna 等，J.Basic Microbiol.，28265-278(1988))；念珠菌屬；Trichoderma reesia(EP 244,234)；粗糙鏈孢霉；許旺氏酵母屬(schwanniomyces)如西方許旺氏酵母(schwanniomycesoccidentalis)等；和絲狀真菌，例如鏈孢霉屬、青霉屬、Tolypocladium以及曲霉屬宿主如構(gòu)巢曲霉和黑曲霉。
適合于表達糖基化多肽的宿主細胞來自多細胞生物。無脊椎動物細胞的實例包括植物和昆蟲細胞。目前已經(jīng)從下述宿主中鑒定了大量的桿狀病毒株和變體以及相應(yīng)的許可型昆蟲宿主細胞草地夜蛾(Spodoptera Frugiperda，毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti，蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus，蚊子)、Drosophila melanogaster(果蠅)和家蠶蛾(Bombyx mori)等。用于轉(zhuǎn)染的各種病毒株公眾可以獲得，例如加利福尼亞Y級夜蛾(Autographa california)NPV的L-1變體和家蠶蛾NPV的Bm-5株，并且這些病毒可以在此用作本發(fā)明的病毒，尤其是用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牽牛、西紅柿和煙草等的植物細胞培養(yǎng)物也可以用作宿主。
然而，關(guān)注最多的是脊椎動物細胞，而且在培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中繁殖脊椎動物細胞已經(jīng)成為常規(guī)方法。有效哺乳動物宿主細胞系的實例是用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1細胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎細胞系(293細胞或經(jīng)過再克隆以便能在懸浮培養(yǎng)物中生長的293細胞，Graham等，J.Gen Virol.3659(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.774216(1980))；小鼠足細胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23243-251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCCCCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK ATCC CCL 34)；布法羅(buffalo)大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI細胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.38344-68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；小鼠骨髓瘤細胞，例如NSO(如RCB0213，Bebbington等，Bio/Technology 10169(1992))和SP2/0細胞(例如SP2/0-Ag 14細胞，ATCCCRL 1581)；大鼠骨髓瘤細胞，例如YB2/0細胞(例如YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞，ATCC CRL 1662)；和人肝癌細胞系(HepG2)。
利用上述表達或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細胞以進行抗體制備并培養(yǎng)在經(jīng)改進的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基適于誘導(dǎo)啟動子，選擇轉(zhuǎn)化體，或擴增編碼所需序列的基因。
(viii)培養(yǎng)宿主細胞可在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生產(chǎn)本發(fā)明多肽的宿主細胞。作為商品提供的培養(yǎng)基例如Ham’s F10(Sigma)，Minimal Essential Medium((MEM)，(Sigma)，RPMI-1640(Sigma)，和Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium((DMEM)，Sigma)適宜培養(yǎng)宿主細胞。此外，Ham等，Meth.Enzym.5844(1979)，Barnes等，Anal.Biochem.102255(1980)，美國專利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利Re.30,985中所述的任何培養(yǎng)基可用作宿主細胞的培養(yǎng)基。在需要時均可向這些培養(yǎng)基的任何一種補充激素和/或其它生長因子(例如胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白，或表皮生長因子)，鹽(例如氯化鈉，鈣，鎂，和磷酸鹽)，緩沖液(例如HEPES)，核苷酸(例如腺苷酸和胸腺嘧啶)，抗生素(例如GENTAMYCINTM藥物)，微量元素(定義為無機化合物，通常終濃度在微摩爾范圍內(nèi))，和葡萄糖或?qū)Φ鹊哪茉?。也可包括本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所知的適當濃度的任何其它必需添加劑。培養(yǎng)條件，例如溫度，pH，等是此前選擇用于表達的宿主細胞的條件，并且是本領(lǐng)域普通熟練技術(shù)人員顯而易見的。培養(yǎng)條件諸如溫度，pH等，是被選用于表達的宿主細胞的那些條件，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的。
(ix)抗體的純化使用重組技術(shù)時，抗體可在細胞內(nèi)，壁膜間隙產(chǎn)生，或直接分泌到培養(yǎng)基中。如果抗體在細胞內(nèi)產(chǎn)生，第一步需要去除宿主細胞或裂解片段的粒狀殘骸，例如，通過離心或超濾作用。Carter等，Bio/Technology 10163-167(1992)描述了分離抗體的方法，該抗體被分泌到大腸桿菌的壁膜間隙。簡言之，細胞懸濁液(paste)在乙酸鈉(pH 3.5)，EDTA，和苯基甲基磺酰氟化物(phenylmethylsulfonylfluoride)(PMSF)存在下，經(jīng)過約30分鐘解凍。通過離心可去除細胞碎片。如果抗體被分泌到培養(yǎng)基中，通常首先使用作為商品提供的蛋白濃縮濾紙(例如，Amicon或Millipore Pellicon ultrafiltration unit)濃縮來自該表達系統(tǒng)的上清液。在此前的任何步驟中，可使用蛋白酶抑制物例如PMSF抑制蛋白溶解，以及使用抗生素防止外來污染物的生長。
由細胞制備的糖蛋白組合物可使用如下方法純化例如，羥磷灰石層析，凝膠電泳，透析和親和層析，優(yōu)選親和層析。蛋白A作為親和配體的適宜性有賴于存在于糖蛋白中的任何免疫球蛋白Fc區(qū)的種類和同種型。蛋白A可用于純化基于人(γ1，γ2，或γ4重鏈的糖蛋白(Lindmark等，J.Immunol.Meth.621-13(1983))。蛋白G用于所有小鼠同種型和人γ3(Guss等，EMBO J.515671575(1986))。親和配體附著的基質(zhì)通常是瓊脂糖，但也可用其它基質(zhì)。物理穩(wěn)定的基質(zhì)例如孔徑被控制的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯(poly(styrenedivinyl)benzene)比使用瓊脂糖獲得更快的流率而且加工時間更短。對于含有CH3區(qū)的抗體，Bakerbond ABXTM樹脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)可用于純化。根據(jù)待回收的抗體，也可利用其它蛋白純化技術(shù)例如；在離子-交換柱上分級分離；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅石(silica)上層析，在肝素SEPHAROSETM上層析，在陽離子或陰離子-交換樹脂(例如聚天冬氨酸柱)上層析；聚焦層析；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀。
任何初步純化步驟后，包含抗-VEGF抗體以及污染物的混合物可接受利用洗脫緩沖液在pH約2.5-4.5的條件下的低pH疏水反應(yīng)層析，其優(yōu)選在低鹽濃度(例如約0-0.25M鹽)條件下進行。
III.藥物配制劑可以通過將具有所需純度的抗體與可選的藥用載體，賦形劑，或穩(wěn)定劑(Remington′s Pharmaceutical Sciences，16版，Osol，A.ed.(1980))混合形成凍干制劑或水溶液制備治療配制劑?？山邮艿妮d體、賦形劑、穩(wěn)定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性，并包括緩沖劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化芐烷銨(benzalkonium chloride)，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少于約10個殘基)；蛋白質(zhì)如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、巖藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬復(fù)合物(例如鋅-蛋白復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。優(yōu)選凍干的抗-VEGF抗體配制劑在WO 97/04801中描述，其包含在本文中作為參考。
本發(fā)明的配制劑也可含有被治療具體指征所需的一種以上的活性化合物，優(yōu)選活性互補并且相互之間沒有副作用的那些。例如，合意地進一步在一種配制劑中包含與EGFR，VEGF(例如，與VEGF上不同表位結(jié)合的抗體)，BEGFR或ErbB2結(jié)合的抗體(例如Herceptin)。可選或此外，所述組合物包含細胞毒劑，細胞因子，生長抑制劑和/或小分子VEGFR拮抗劑。所述分子是與以有效用于目的意圖的量組合存在。
該活性成分也可包裹在通過諸如凝聚技術(shù)或界面聚合而制備的微膠囊中，例如，分別在膠質(zhì)藥物傳送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體，白蛋白微球，微乳劑，納米顆粒和納米膠囊)中或在粗滴乳狀液中的羥甲基纖維素或凝膠-微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊。這些技術(shù)公開于Remington′s PharmaceuticalSciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980)。
用于體內(nèi)給藥的本發(fā)明化合物必需是無菌的。這可以通過在冷凍干燥和重新配制之前或之后通過除菌濾膜過濾而輕易實現(xiàn)。
可制備緩釋制劑。緩釋制劑的適當實例包括具有一定形狀且含有糖蛋白的固體疏水聚合物半通透基質(zhì)，例如膜或微膠囊。緩釋基質(zhì)實例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.，15167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.，1298-105(1982))或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國專利3773919，EP 58,481)，L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22547(1983))，不可降解的乙烯-乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出處同上)，或可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能持續(xù)釋放分子100天以上，而一些水凝膠釋放蛋白的時間卻較短。當膠囊化抗體長時間停留在體內(nèi)時，它們可能由于暴露在37℃潮濕環(huán)境中而變性或凝聚，導(dǎo)致?lián)p失生物活性，且免疫原性可能會改變?？梢愿鶕?jù)相關(guān)機理來設(shè)計使蛋白穩(wěn)定的合理策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)凝聚的機理是通過硫代二硫鍵互換而形成分子間S-S鍵，則可通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍干、控制濕度、采用合適的添加劑、和開發(fā)特定的聚合物基質(zhì)組合物來實現(xiàn)穩(wěn)定。
IV.抗-VEGF抗體的治療用途根據(jù)本發(fā)明，抗-VEGF抗體可用于治療各種以病理性血管生成為特征的腫瘤和非腫瘤疾病?？山邮苤委煹姆悄[瘤疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，銀屑病，動脈粥樣硬化，糖尿病以及其它增生性視網(wǎng)膜病，包括早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病，晶狀體后纖維組織形成，新生血管性青光眼，與年齡相關(guān)的黃斑退行性改變，甲狀腺增生(包括Grave病)，角膜以及其它組織移植，慢性炎癥，肺炎癥，腎病綜合征，先兆子癇，腹水，心包積液(諸如與心包炎相關(guān)的心包積液)，以及胸膜積液。
本發(fā)明的抗體優(yōu)選用于治療其中血管生成在腫瘤生長中起重要作用的腫瘤，包括癌癥和良性腫瘤。將被治療的癌癥的實例包括，但不限于，癌，淋巴瘤，母細胞瘤，肉瘤和白血病。癌癥的更具體的例子包括鱗狀細胞癌，肺癌(包括小細胞肺癌，非小細胞肺癌，肺腺癌以及肺鱗癌)，腹膜癌，肝細胞癌，胃的或胃癌(包括胃腸癌)，胰腺癌，神經(jīng)母細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細胞瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜癌或子宮癌，唾液腺癌，腎或腎的癌，肝癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝的癌以及各種頭和頸的癌癥，以及B淋巴細胞瘤(包括低級/濾泡樣非何杰金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴細胞性(SL)NHL；中級/濾泡樣NHL；中級彌漫性NHL；高級免疫母細胞NHL；高級淋巴母細胞NHL；高級小無裂細胞NHL；bulkydisease NHL；外套細胞淋巴瘤；AIDS-相關(guān)的淋巴瘤；和Waldenstrom′s巨球蛋白血癥)；慢性淋巴細胞白血病(CLL)；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；毛細胞白血病；慢性成髓細胞白血??；和移植后淋巴組織增生疾病(PTLD)以及母斑細胞病相關(guān)性異常血管增生，水腫(諸如與腦腫瘤相關(guān)的水腫)，和Meigs綜合癥。優(yōu)選，可用本發(fā)明抗體治療的癌癥選自以下疾病組成的組乳腺癌，結(jié)腸直腸癌，直腸癌，非小細胞肺癌，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，腎細胞癌，前列腺癌，肝癌，胰腺癌，軟組織肉瘤，卡波奇肉瘤，類癌樣癌，頭和頸部癌，黑素瘤，卵巢癌，間皮瘤以及多發(fā)性骨髓瘤。更優(yōu)選，本發(fā)明的方法用于治療人類患者的結(jié)腸直腸癌。
本發(fā)明包括抗血管生成治療，新癌癥治療策略，其目標在于抑制提供養(yǎng)料支持腫瘤生長的腫瘤血管的發(fā)育。因為血管生成參與原發(fā)性腫瘤生長以及轉(zhuǎn)移，本發(fā)明提供的抗血管生成療法能夠抑制原發(fā)位點的腫瘤生長以及防止腫瘤向繼發(fā)位點的轉(zhuǎn)移，由此允許通過其它療法攻擊腫瘤。
聯(lián)合療法當用于治療諸如腫瘤的各種疾病時，本發(fā)明的抗體可與其它適于相同或類似疾病的治療劑聯(lián)用。當用于治療癌癥時，本發(fā)明的抗體可與常規(guī)癌癥療法諸如手術(shù)、放療、化療或其組合聯(lián)用。
在一些方面中，用于與本發(fā)明抗體聯(lián)用的癌癥治療的其它治療劑包括其它抗血管生成藥劑。許多抗血管生成藥劑已經(jīng)被鑒定并且是本領(lǐng)域已知的，包括Carmeliet和Jain(2000)所述的。優(yōu)選，本發(fā)明的抗-VEGF抗體與其它VEGF拮抗劑或VEGF受體拮抗劑聯(lián)用，諸如VEGF變體，可溶性VEGF受體片段，能夠阻斷VEGF或VEGFR的適體(aptamer)，中和型抗-VEGFR抗體，VEGFR酪氨酸激酶的低分子量抑制劑以及其任意組合?？蛇x或此外，兩或多種抗-VEGF抗體可共同給藥患者。
一些其它方面中，用于與本發(fā)明抗體聯(lián)用的腫瘤療法的其它治療劑包括其它參與腫瘤生長的因子的拮抗劑，所述因子諸如EGFR，ErbB2(也已知為Her2)ErbB3，ErbB4，或TNF。有時，將一或多種細胞因子給藥所述患者也是有益的。在優(yōu)選實施方案中，VEGF抗體與生長抑制劑聯(lián)合給藥。例如，所述生長抑制劑可先給藥，然后給藥VEGF抗體。然而，也考慮同時給藥或首先給藥VEGF抗體。生長抑制劑的適宜劑量是目前所用的那些，并且可由于生長抑制劑與抗VEGF抗體的聯(lián)合作用(協(xié)同作用)而用量減少。
化療劑在具體的方面，本發(fā)明提供通過將有效量的抗VEGF抗體以及一或多種化療劑給藥易患或被診斷患有癌癥的患者來治療癌癥的方法。多種化療劑可與本發(fā)明的方法聯(lián)用。所涉及化療劑的示例性以及非限制性列表在本發(fā)明的“定義”這一標題下提供。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，化療劑的適宜劑量通常大致為臨床治療中所用的劑量，其中所述化療劑單獨給藥或與其它化療劑聯(lián)用給藥。劑量的變化很可能根據(jù)被治療的疾病而出現(xiàn)。給予所述治療的醫(yī)師將能夠確定個體患者的適宜劑量。
僅作為舉例，本發(fā)明給出了用于轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的標準化療。
一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法用于治療結(jié)腸直腸癌包括轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌。結(jié)腸直腸癌是美國癌癥死亡率中的第三位的常見原因。估計在美國，1999年診斷大約129,000的新發(fā)結(jié)腸直腸癌病例，并且結(jié)腸直腸癌導(dǎo)致56,000人死亡，Landis et al.，Cancer J Clin.498-31(1999)。大約70％的結(jié)腸直腸癌患者顯示可通過手術(shù)切除治愈的疾病，August et al.，Cancer MetastasisRev 3303-24(1984)。然而，占30％的進展期或轉(zhuǎn)移癌癥的患者以及占20％的切除后復(fù)發(fā)患者的預(yù)后較差。轉(zhuǎn)移疾病患者的中值存活期為12-14個月，Advanced Colorectal Cancer Meta-Analysis Project，J Clin Oncol 10896-903(1992)。
美國的轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌標準療法目前是利用5-氟尿嘧啶(5-FU)加5-FU的生化調(diào)節(jié)物甲酰四氫葉酸，Advanced Colorectal Cancer Meta-AnalysisProject，J Clin Oncol 10896-903(1992)；Moertel N Engl J Med 3301136-42(1994)。5-FU/甲酰四氫葉酸的組合使得結(jié)腸直腸腫瘤偶然的暫時縮小，但與單獨的5-FU相比沒有顯示延長生存期(Advanced Colorectal CancerMeta-Analysis Project，J Clin Oncol 10896-903(1992))，而且5-FU與無效治療加上最佳的支持性看護相比沒有顯示延長生存期，Ansfield et al.Cancer3934-40(1977)。5-FU/甲酰四氫葉酸對于生存期益處的缺乏可能部分由于不適當?shù)呐R床試驗范圍。在大型隨機化試驗中，患者接受輔助化療來治療可切除的結(jié)腸直腸癌，5-FU/甲酰四氫葉酸與lomustine(MeCCNU)，長春新堿，和5-FU相比顯示可延長生存期(MOF；Wolmark et al.J Clin Oncol 111879-87(1993)。
在美國，5-FU/甲酰四氫葉酸化療通常根據(jù)兩種方案之一給藥MayoClinic和Roswell Park方案。Mayo Clinic方案由長期(intensive course)5-FU加低劑量甲酰四氫葉酸(425mg/m25-FU加20mg/m2甲酰四氫葉酸，每天經(jīng)靜脈[IV]推注給藥持續(xù)5天，每隔4到5周重復(fù)所述治療)組成，Buroker et al.J Clin Oncol 1214-20(1994)。Roswell Park方案每周5-FU加高劑量甲酰四氫葉酸(500-600mg/m 25-FU通過IV推注給藥加上500mg/m2甲酰四氫葉酸，后者每周一次輸液2小時給藥并持續(xù)6周，上述治療每8周重復(fù)一次)，Petrelli et al.，J Clin Oncol 71419-26(1989)。臨床試驗比較了Mayo Clinic和Roswell Park方案，沒有顯示其效力有差異，但是效力不足，Buroker et al.，JClin Oncol 1214-20(1994)；Poon et al.，J Clin Oncol 71407-18(1989)。兩種方案的毒性圖譜不同，Mayo Clinic方案導(dǎo)致更多的白細胞減少而Roswell Park方案導(dǎo)致更頻繁的腹瀉。接受任意方案的新近被診斷為轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的患者可預(yù)期4-5個月的疾病進展中值時間以及12-14個月的中值生存期，Petrelli et al.，J Clin Oncol 71419-26(1989)；Advanced Colorectal CancerMeta-Analysis Project，J Clin Oncol 10896-903(1992)；Buroker et al.，J ClinOncol 1214-20(1994)；Cocconi et al.，J Clin Oncol 162943-52(1998)。
最近，轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的新第一線療法出現(xiàn)。兩個隨機化臨床療法，每個均使用近400名患者，評估了伊立替康與5-FU/甲酰四氫葉酸的聯(lián)用，Saltz et al.，Proc ASCO 18233a(1999)；Douillard et al.，Lancet 3551041-7(2000)。在兩項研究中都顯示，與單獨的5-FU或甲酰四氫葉酸相比，伊立替康/5-FU/甲酰四氫葉酸的聯(lián)用導(dǎo)致統(tǒng)計學(xué)顯著的生存期延長(分別為2.2和3.3月)，疾病進展時間延長以及反應(yīng)率增加。伊立替康的益處的代價在于毒性增加將伊立替康加入5-FU/甲酰四氫葉酸與單獨的5-FU或甲酰四氫葉酸相比，National Cancer Institute Common Toxicity Criteria(NCI-CTC)3級/4腹瀉，3級/4嘔吐，4級白細胞減少，以及無力的發(fā)病率增加。還有證據(jù)顯示單劑伊立替康在二線背景中延長存活期，Cunningham et al.，Lancet3521413-18(1998)；Rougier et al.，Lancet 3521407-12(1998)。兩項隨機研究證實伊立替康延長在5-FU治療后進展的患者的生存期。一項研究將伊立替康與最佳支持性護理比較，并顯示存活期延長2.8-月；另一項研究將伊立替康與輸注的5-FU比較，并顯示生存期延長2.2-月。伊立替康在一線和二線背景中對生存期是否有更多影響沒有以良好控制的方式研究。
劑量和給藥本發(fā)明的抗體和化療劑可根據(jù)已知方法給藥人類患者，諸如作為藥團(bolus)經(jīng)靜脈內(nèi)給藥，或通過一段時間內(nèi)的連續(xù)輸注給藥，經(jīng)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊液內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、局部或吸入途徑。靜脈內(nèi)或皮下給藥所述抗體是優(yōu)選的。
一個實施方案中，本發(fā)明的治療涉及聯(lián)合給藥抗VEGF抗體以及一或多種化療劑。本發(fā)明涉及給藥不同化療劑的組合。聯(lián)合給藥包括利用不同配制劑或單一藥物配制劑的聯(lián)合給藥，以及以任何順序的連續(xù)給藥，其中優(yōu)選存在兩種(或所有)活性藥劑同時顯示它們的生物活性的一段時間。所述化療劑的制備和配制方案可根據(jù)生產(chǎn)商說明進行或由有經(jīng)驗的醫(yī)師根據(jù)經(jīng)驗確定?；煹闹苽浜蛣┝糠桨敢苍贑hemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams& Wilkins，Baltimore，MD(1992)中描述。所述化療劑可在所述抗體給藥之前或以后，或可同時給藥。
為預(yù)防或治療疾病，抗體的適宜劑量將有賴于將要治療的疾病類型，如上所述，疾病的嚴重度以及病程，所述抗體是否為預(yù)防或治療目的給藥，以前的治療，患者的臨床病史以及對抗體的反應(yīng)，以及主治醫(yī)師的判斷。所述抗體一次性或在一系列治療中適宜地給藥患者。在聯(lián)合治療方案中，本發(fā)明的組合物以治療有效量或協(xié)同作用量給藥。如本文所用，治療有效量使得抗VEGF抗體以及一或多種其它治療劑的聯(lián)合給藥或本發(fā)明的組合物的給藥導(dǎo)致靶疾病或病癥的緩解或抑制。治療協(xié)同作用量為抗VEGF抗體與一或多種其它治療劑協(xié)同作用或顯著降低或消除與具體疾病相關(guān)的病癥或癥狀所必須的量。
根據(jù)疾病的類型以及嚴重度，約1μg/kg到50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)抗體是給藥患者的初始候選劑量，其可例如通過一或多次分開的給藥或連續(xù)輸注來給予。常規(guī)日劑量范圍為約1μg/kg到約100mg/kg或更高，依上述因素而不同。對于在數(shù)天或更長時間內(nèi)的重復(fù)給藥，根據(jù)病情，所述治療持續(xù)直到出現(xiàn)對疾病癥狀的所需的抑制。然而，其它劑量方案也可使用。在一個優(yōu)選方面，本發(fā)明的抗體每2-3周給藥，劑量范圍為約5mg/kg到約15mg/kg。更優(yōu)選，所述劑量方案與化療方案聯(lián)用作為轉(zhuǎn)移的結(jié)腸直腸癌的一線療法。在一些方面，所述化療方案涉及常規(guī)高劑量間歇給藥。在一些其它方面，所述化療劑以較小且更為頻繁的劑量而沒有預(yù)定的間隔來給藥(“節(jié)拍化療(metronomic chemotherapy)”)。本發(fā)明治療的進展容易通過常規(guī)技術(shù)和實驗來監(jiān)測。
適宜劑量的其它信息在以下實施例中提供。
治療效力本發(fā)明治療的主要優(yōu)勢是在人患者中產(chǎn)生明顯的抗癌效果但不導(dǎo)致明顯的毒性或副作用的能力，使得所述患者從整體治療獲益。本發(fā)明治療的效力可通過通常用于評估癌癥治療的各個終點(endpoint)來測定，包括但不限于，腫瘤退化，腫瘤重量或大小減小，進展時間，生存期，無進展生存期，總體反應(yīng)率，反應(yīng)時間以及生活質(zhì)量。由于本發(fā)明的抗血管生成劑靶向腫瘤血管系統(tǒng)而不必要是腫瘤細胞本身，它們代表抗癌藥物的獨特類型，并因此可需要獨特的方法以及對藥物的臨床反應(yīng)的定義。例如，2維分析中超過50％的腫瘤縮小是宣布反應(yīng)的標準分離點(cut-off)。然而，測定抗血管生成療法的效力的新方法應(yīng)采用，包括例如，測定血管生成的血漿或尿標志物以及通過放射顯像測定反應(yīng)。
一個實施方案中，本發(fā)明可用于延長易患或被診斷患有癌癥的人類患者的生存期。生存期定義為首次給予藥物到死亡的時間。一個優(yōu)選方面，本發(fā)明的抗VEGF抗體與一或多種化療劑聯(lián)合給藥人類患者，由此該患者的生存期與單獨給藥化療相比得以有效延長。例如，用抗VEGF抗體聯(lián)合至少兩種，優(yōu)選三種化療劑的化療劑組合治療的患者組的中值生存期為至少約2個月，優(yōu)選約2-5個月，超過單獨用相同的化療劑組合治療的患者組，所述延長在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性。生存期可通過治療組相對于對照組的分層危險率(stratified hazard ratio)(HR)來測定，其代表治療過程中患者死亡的危險性。優(yōu)選，當與單獨的化療劑相比時，抗VEGF抗體與一或多種化療劑的聯(lián)用治療明顯降低死亡率至少約30％(即分層HR(stratified HR)約0.70)，優(yōu)選至少約35％(即分層HR約0.65)。
一個實施方案中，本發(fā)明提供增加易患或被診斷患有癌癥的人類患者的無進展生存期的方法。疾病進展的時間定義為給予藥物到疾病進展的時間。一個優(yōu)選實施方案中，與單獨的化療治療相比，本發(fā)明利用抗VEGF抗體以及一或多種化療劑的聯(lián)合治療明顯增加無進展存活期至少約2個月，優(yōu)選至少約2-約5個月。
另一實施方案中，本發(fā)明的治療顯著增加易患或被診斷患有癌癥的人類患者組中的反應(yīng)率，所述患者用多種療法治療。反應(yīng)率定義為對所述治療有反應(yīng)的被治療患者的百分比。一方面，與單獨的化療治療相比，本發(fā)明利用抗VEGF抗體以及一或多種化療劑的聯(lián)合治療顯著增加被治療患者組中的反應(yīng)率，所述增加具有低于0.005的Chi-square p-值。
一方面，本發(fā)明提供增加易患或被診斷患有癌癥的人類患者或人類患者組中的反應(yīng)時間(duration of response)。反應(yīng)時間定義為初次反應(yīng)到疾病進展的時間。在本發(fā)明利用抗VEGF抗體以及一或多種化療劑的聯(lián)合治療中，獲得并優(yōu)選反應(yīng)時間增加至少2個月，所述增加具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。
治療安全性本發(fā)明提供有效治療癌癥而對被治療人類受試者沒有明顯副作用的方法。本發(fā)明治療的臨床效果在一定程度上是出人意料的，被認為與抗血管生成療法相關(guān)的數(shù)個不利事件在根據(jù)本發(fā)明的治療過程中沒有觀察到。例如，以前的臨床研究提示利用抗VEGF抗體的治療可導(dǎo)致血栓(一些情況中會致死)，高血壓，蛋白尿和鼻衄(出血)。然而，與單獨的化療相比，本發(fā)明利用抗VEGF抗體以及包含至少兩種優(yōu)選三種化療劑的化療劑組合的聯(lián)合治療不顯著增加這些不利事件的發(fā)生率。因此，本發(fā)明的治療出人意料地包含可接受水平的副反應(yīng)，同時具有明顯提高的抗癌效力。
V.制品本發(fā)明另一實施方案涉及一種制品，其包含可用于治療上述疾病的材料。所述制品優(yōu)選包括一個容器，標簽或包裝插頁。適當?shù)娜萜饔衅孔?，小瓶，注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑料制成。所述容器含有組合物，所述組合物可有效治療所述疾病并具有無菌入口(例如所述容器可為靜脈內(nèi)溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射針穿透的塞子的)。所述組合物中至少一種活性劑是抗VEGF抗體。所述容器上或所附的標簽說明所述組合物用于治療所選的疾病。所述制品可進一步包含含有可藥用緩沖液的第二容器，諸如磷酸鹽緩沖的鹽水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可進一步包含從商業(yè)和使用者角度來看所需的其它物質(zhì)，包括其它緩沖液，稀釋劑，過濾物，針和注射器。此外，所述制品包含帶有使用說明的包裝插頁，包括例如警告所述組合物不與蒽環(huán)類抗生素類型的化療劑例如阿霉素，或表柔比星聯(lián)用，或指示所述組合物的使用者將抗VEGF抗體組合物以及抗腫瘤組合物給藥患者。
保藏材料以下雜交瘤細胞系已經(jīng)根據(jù)布達佩斯條約保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)，Manassas，VA，USA抗體名稱 ATCC No. 保藏日期A4.6.1ATCC HB-107091991-3-29
以下實施例僅僅意在舉例說明本發(fā)明的實踐而不是限制。本發(fā)明所引用的所有專利以及科學(xué)文獻的全文都包含在本文作為參考。
VI.實施例實施例1.在一線轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌中將抗-VEGF抗體加入藥團伊立替康/氟尿嘧啶/甲酰四氫葉酸(IFL)進行多中心、III期、隨機化、主動控制的試驗(multicenter，Phase III，randomized，active-controlled trial)以評估將bevacizumab加入轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的標準一線化學(xué)療法的情況下，bevacizumab的有效性和安全性。該試驗收入900多名組織學(xué)確定的、之前沒有進行治療的、二維可檢測的轉(zhuǎn)移結(jié)腸直腸癌患者。
方法和材料抗-VEGF抗體bevacizumab抗-VEGF抗體“Bevacizumab (BV)”也已知為“rhuMAb VEGF”或“AvastinTM”，是重組人源化抗-VEGF單克隆抗體，其根據(jù)Presta et al.(1997)Cancer Res.574593-4599制備。它包含突變的人IgG1框架區(qū)以及小鼠抗-hVEGF單克隆抗體A.4.6.1的抗原結(jié)合性互補決定區(qū)，所述抗體阻斷人VEGF與其受體的結(jié)合。美國專利6,582,959；WO 98/45331。bevacizumab大約93％的氨基酸序列(包括大部分框架區(qū))來自人IgG1，并且該序列的約7％來自鼠抗體A4.6.1。Bevacizumab的分子量約為149,000道爾頓并且是糖基化的。
多肽的特性以及糖基化位點可從氨基酸組成以及肽圖譜推定。所述分子的大小以及電荷特性和臨床所用批次(lot)的純度通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳或毛細管電泳非凝膠篩選(capillary electrophoresis non-gelsieving)，等電聚焦，以及離子交換和大小排阻層析證明。bevacizumab的活性通過結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附測定或重組人VEGF的激酶受體實驗來定量。
Bevacizumab利用遺傳改造的中國倉鼠卵巢細胞系通過重組DNA技術(shù)制備。所述蛋白通過常規(guī)柱層析和過濾方法從細胞培養(yǎng)基純化。根據(jù)美國藥品和食品監(jiān)督條例，檢測最終產(chǎn)物的質(zhì)量，特性，安全性，純度，效力，強度以及賦形劑/化學(xué)組成。Bevacizumab的純度＞95％。Bevacizumab呈清至輕度乳白色，無菌液體，可用于胃腸外給藥。
患者選擇符合條件的患者患有組織學(xué)上證實的轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌，以及二維可測定的疾病。其它包含標準包括至少18歲，美國東部腫瘤協(xié)作組EasternCooperative Oncology Group(ECOG)體力狀態(tài)(performance status)為0或1(Oken et al.(1982)Am.J.Clin.Oncol.5649-55)，預(yù)期壽命超過3個月，以及書面告知的同意。適當?shù)难?、肝以及腎功能(包括不超過500mg蛋白每天的尿排除率)也是所需的。
排除標準包括以前對轉(zhuǎn)移疾病的化療或生物治療(在進入研究前輔助使用或使對放射敏感而使用氟代嘧啶(fluoropyrimidine)加或不加甲酰四氫葉酸或左旋咪唑(levamizole)12個月以上是允許的)，研究治療開始前14天內(nèi)接受放療，研究治療開始前28天內(nèi)的進行大手術(shù)，臨床明顯的心血管疾病，臨床可檢測的腹水，妊娠或泌乳，阿司匹林的規(guī)律使用(超過每天325mg)或其它非類固醇抗炎藥的規(guī)律使用，先前存在的出血因素或凝血病(coagulopathy)或需要全劑抗凝，以及已知的中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移。
研究設(shè)計符合條件的患者接受治療，所述治療利用被涉及用于實現(xiàn)組間總體平衡的動態(tài)隨機化算法；隨機化根據(jù)研究中心、基線ECOG體力狀態(tài)(0 vs.1)，原發(fā)疾病位點(結(jié)腸vs.直腸)，以及轉(zhuǎn)移病灶數(shù)目(一個vs.一個以上)進行分層(stratify)。開始，患者以1∶1∶1的比例隨機分配來接受IFL加安慰劑，IFL加bevacizumab，或氟尿嘧啶和甲酰四氫葉酸加bevacizumab(表1)，每種治療持續(xù)直到疾病進展或不可接受的副作用出現(xiàn)或持續(xù)最長96周。
表1.一線治療方案*


*在bevacizumab加入伊立替康，氟尿嘧啶和甲酰四氫葉酸的方案的安全性得到證實后，利用氟尿嘧啶，甲酰四氫葉酸和bevacizumab的治療停止。313名患者隨機化之后進行證實。所有藥物經(jīng)靜脈內(nèi)給藥。
300名患者隨機化后，進行中期分析(interim analysis)，此時非盲性、獨立數(shù)據(jù)監(jiān)測委員會來評價IFL加bevacizumab的安全性，所述評價基于所有可得的安全性信息，包括每組的死亡數(shù)，但缺乏與腫瘤反應(yīng)相關(guān)的信息。如果數(shù)據(jù)監(jiān)測委員會發(fā)現(xiàn)沒有由于將bevacizumab加入IFL導(dǎo)致的不適當?shù)牟焕录?，停止將患者加入將接受氟尿嘧啶以及甲酰四氫葉酸加bevacizumab的組，其它患者以1∶1隨機分組以接受IFL加安慰劑或IFL加bevacizumab。然而，如果數(shù)據(jù)監(jiān)測委員會的結(jié)論是IFL加bevacizumab的安全性狀況不能被接受，該治療停止，患者以1∶1隨機分組來接受氟尿嘧啶和甲酰四氫葉酸加bevacizumab的組合或IFL加安慰劑。
腫瘤反應(yīng)和進展利用Response Evaluation Criteria in Solid Tumors.Therasse et al.(2000)J.Natl.Cancer Inst.92205-16確定。在疾病進展時間，所述治療分組公開并對患者提供二線治療。接受含bevacizumab的治療的組中的患者可選擇在該二線治療中繼續(xù)接受bevacizumab。在給予IFL加安慰劑的組中不允許交叉。接受含bevacizumab治療并且在96周的研究期末沒有進展性疾病的征兆的患者可繼續(xù)在分開的延期研究中接受bevacizumab。接受bevacizumab的組中，具有證實的完全反應(yīng)或不可接受的化療副反應(yīng)的患者將停止化療并接受單獨的bevacizumab。
Bevacizumab(或安慰劑)與化療同時給藥。如果患者體重在研究過程中改變至少10％，Bevacizumab以及化療的劑量可重新計算。伊立替康和氟尿嘧啶(根據(jù)包裝插頁)′°的標準循環(huán)內(nèi)和循環(huán)間劑量改變在具有治療相關(guān)不利事件的患者中是允許的。甲酰四氫葉酸和bevacizumab的劑量沒有改變。
在生存和隨后的治療的分析中，所有患者均被隨診直至死亡，失去隨診或研究終止。
評估在基線評估以后，腫瘤狀況在研究的前24周每6周評估一次，然后在治療余下的時間內(nèi)每12周評估一次。所有完全和部分反應(yīng)(complete andpartial responses)需要在它們首次被注意后的至少4周得到證實。
安全性基于不利事件的報告、實驗室檢測結(jié)果，以及生命體征測定來評估。不利事件根據(jù)Common Toxicity Criteria of the National Cancer Institute，version 2分類，其中1級表示輕微不利事件，2級為中度不利事件，3級為嚴重不利事件，4級為威脅生命的不利事件。預(yù)先規(guī)定的安全性衡量標準包括以下事件的發(fā)生率所有不利事件，所有嚴重不利事件，以及與bevacizumab相關(guān)的不利事件-高血壓，血栓形成，3級或4級的出血，以及蛋白尿-以及3級或4級的腹瀉，以及不同實驗值與生命體征自基線的改變。
為監(jiān)測IFL加安慰劑以及IFL加bevacizumab方案的安全性，監(jiān)測研究過程中的死亡、嚴重副反應(yīng)、3級或4級的腹瀉、自任何來源的3級或4級的出血，以及血栓形成的發(fā)生率，所述監(jiān)測通過非盲性方式由數(shù)據(jù)安全性監(jiān)測委員會進行，持續(xù)到募集完成或效力的中期分析時間(time of the interimanalysis of efficacy)，以先到的那個為準。
統(tǒng)計學(xué)分析主要結(jié)果檢測指標(primary outcome measure)是總體生存期；生存的測定不涉及隨后的治療。然而，組間沒有交叉。采用生存分析技術(shù)諸如Kaplan-Meier方法，對數(shù)-秩檢驗，以及Cox正比危害模型(Cox proportionalhazards model)。次要結(jié)果檢測指標(secondary autcome measure)是無進展生存期，目標反應(yīng)率(objective response rate)(完全和部分反應(yīng))，反應(yīng)時間以及生活質(zhì)量。
對于在分析時存活的患者，生存時的數(shù)據(jù)在最后的接觸時間得以檢查。無進展生存期(progression-free survival)定義為在研究過程中，從隨機化到進展或死亡的時間，在研究中死亡定義為最后劑量的bevacizumab或化療之后30天之內(nèi)出現(xiàn)的任何死亡。對于在最后分析時沒有疾病進展的患者，無進展生存的數(shù)據(jù)在腫瘤狀況的最后評估或如果在基線以后沒有進行其它評估的情況下于第0天接受審查。沒有適當隨診數(shù)據(jù)的患者被分類為沒有反應(yīng)。
為檢測到與對照相比，給予IFL加bevacizumab的組中的死亡危險率為0.75，需要大約385例死亡。所有計算利用對數(shù)秩檢驗進行并涉及對效力的雙側(cè)P值，α值0.05，統(tǒng)計強度(statistical power)為80％，以及一次效力中期分析(interim analysis of efficacy)。
中期分析可以以非盲性方式進行。安全性的中期分析在將大約100名患者隨機分配到各組之后進行。安全性和效力的第二中期分析在出現(xiàn)193例死亡(所需事件一半的數(shù)目)之后進行。
效力分析根據(jù)意圖-治療(intention-to-treat)原則進行。安全性分析包括所有接受至少一個劑量的研究藥物的患者。
結(jié)果患者的特征在約20個月的時間中，923名患者在美國、澳大利亞和新西蘭的164個位置接受隨機化。在313名患者被隨機分配到三個組之一中(100名分配到IFL加安慰劑組，103名分配到IFL加bevacizumab組，110名分配到氟尿嘧啶，甲酰四氫葉酸，和bevacizumab)之后，停止向給予氟尿嘧啶，甲酰四氫葉酸和bevacizumab的組的分配(該組中的結(jié)果沒有報道)。該步驟是對安全性的首次正式中期分析之后，所述方案所需的，所述分析的結(jié)果是IFL加bevacizumab的方案具有可接受的安全性以及向該組的分配可以繼續(xù)。
總體生存的主要終點的意圖-治療分析在給予IFL加安慰劑的組中包括411名患者，在IFL加bevacizumab的組中包括402名患者。表2顯示所選的人口統(tǒng)計學(xué)以及基線特征，其在組間很好地平衡。每個組中相似數(shù)目的患者以前經(jīng)過結(jié)腸直腸癌的手術(shù)或接受放療或輔助化療。
治療治療的中值時程(median duration)在IFL加安慰劑的組中為27.6周，在給予IFL加bevacizumab的組中為40.4周。計劃的給予伊立替康劑量的百分比在兩組中類似(在給予IFL加安慰劑的組中為78％，在給予IFL加bevacizumab的組中為73％)。
在數(shù)據(jù)停止的當天，IFL加安慰劑組中的33名患者以及IFL加bevacizumab組中的71名患者仍然接受分配給他們的初始治療?？捎绊懮娴亩€療法諸如奧沙利鉑或轉(zhuǎn)移切除術(shù)的利用比率在兩個組之間很好地平衡。在兩個組中，大約50％的患者接受一些二線療法形式；所有患者的25％接受奧沙利鉑以及少于2％的患者接受轉(zhuǎn)移切除術(shù)。
表2.所選人口統(tǒng)計學(xué)以及基線特征*特征IFL加安慰劑 IFL加Bevacizumab性別(％)(N＝411) (N＝402)男性60 59女性40 41平均年齡(YR)59.2 59.5種族(％)白人80 79黑人11 12其它99中心位置(％)美國99 99澳大利亞或新西蘭＜1 ＜1ECOG體力狀態(tài)(％)0 55 581 44 412 ＜1 ＜1中心類型(％)結(jié)腸81 77直腸19 23轉(zhuǎn)移位點數(shù)目(％)1 39 37＞1 61 63
以前的癌癥治療(％)輔助化療 2824放療 1415轉(zhuǎn)移性疾病的中值持續(xù)時間(mo) 4 4*組間沒有明顯差異。IFL表示伊立替康，氟尿嘧啶，和甲酰四氫葉酸，ECOG表示美國東部腫瘤協(xié)作組。
效力給予IFL加bevacizumab的組的總體生存持續(xù)時間中值(median durationof everall duration)以及主要終點(primary endpoint)明顯長于IFL加安慰劑組(20.3月vs.15.6月)，其對應(yīng)死亡風(fēng)險率為0.66(P＜0.001)(表3和圖1)，或在bevacizumab組死亡風(fēng)險降低34％。IFL加bevacizumab組的一年生存率為74.3％，IFL加安慰劑組中為63.4％(P＜0.001)。接受奧沙利鉑二線治療的患者亞組中，IFL加bevacizumab組的總體生存中值持續(xù)時間為25.1個月而IFL加安慰劑組的為22.2個月。
將bevacizumab加入IFL與無進展生存持續(xù)時間中值的增加相關(guān)(10.6月vs.6.2月；與IFL加安慰劑組相比，進展危險率0.54；P＜0.001)；反應(yīng)率(44.8％vs.34.8％；P＝0.004)；反應(yīng)持續(xù)時間中值(10.4月vs.7.1月；進展危險率，0.62；P＝0.001)(表3)。圖2顯示無進展生存的Kaplan-Meier估計值。治療效果在預(yù)先規(guī)定的亞組之間是一致的，包括根據(jù)以下因素定義的那些年齡，性別，種族，ECOG體力狀態(tài)，原發(fā)腫瘤位置，以前有或無的輔助治療，轉(zhuǎn)移性疾病持續(xù)時間，轉(zhuǎn)移病灶數(shù)目，自診斷結(jié)腸直腸癌起的年數(shù)，以前有或無放療，基線腫瘤負荷，血清白蛋白濃度，堿性磷酸酶以及乳酸脫氫酶。
表3.效力分析*

*IFL表示伊立替康，氟尿嘧啶和甲酰四氫葉酸。
安全性表4表示所規(guī)定治療過程中所選3或4級的不利事件的發(fā)生率，而沒有對中值治療持續(xù)時間的調(diào)整(IFL加安慰劑組中為27.6周，IFL加bevacizumab組中為40.4周)。任何3或4級不利事件的發(fā)生率在接受IFL加bevacizumab的患者中比接受IFL加安慰劑的患者中高大約10個百分點，主要是由于3級高血壓(需要治療)的發(fā)生率增加，以及4級腹瀉和白細胞減少的發(fā)生率少量增加。然而，導(dǎo)致住院或研究治療停止或60天中任何原因?qū)е碌乃劳雎实牟焕录陌l(fā)生率沒有明顯變化。
表4.所選不利事件*

*沒有為伊立替康，氟尿嘧啶，和甲酰四氫葉酸(IFL)加安慰劑組與IFL加bevacizumab組的治療中值持續(xù)時間的差異(27.6周vs.40.4周)而校準數(shù)據(jù)。
**P＜0.01。僅僅接受至少一次研究-藥物治療的患者包含在內(nèi)。
階段1和2的試驗鑒定了出血，血栓栓塞，蛋白尿以及高血壓作為可能的bevacizumab相關(guān)的副作用。然而，在本研究中，與IFL加安慰劑組相比，IFL加bevacizumab組中僅有高血壓的發(fā)病率明確增加。所有高血壓發(fā)作都可利用標準口服抗高血壓藥劑(例如鈣通道阻斷劑，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑以及利尿劑)控制。在bevacizumab組中，沒有與高血壓相關(guān)的bevacizumab療法中止、高血壓危象或死亡。
在兩組中，2級或3蛋白尿(沒有4級蛋白尿的發(fā)作或腎炎綜合征)以及任何原因?qū)е碌?級或4級出血發(fā)生率是相似的，盡管所有3例4級出血都在IFL加bevacizumab組中。所有靜脈以及動脈血栓形成事件的發(fā)生率在IFL加bevacizumab組中為19.4％，在IFL加安慰劑中為16.2％(P＝0.26)。
胃腸穿孔出現(xiàn)在6例接受IFL加bevacizumab的患者中(1.5％)。一名患者直接死于該事件，而其它5名恢復(fù)(其中3名能夠重新開始治療而沒有隨后的并發(fā)癥)?；加写┛椎?名患者中，3名被證實對IFL加bevacizumab有完全或部分反應(yīng)。除外研究治療以外可能與胃腸穿孔相關(guān)的因素是在兩名患者中前兩個月當中的結(jié)腸手術(shù)以及一名患者中的消化性潰瘍疾病。
該階段III研究的結(jié)果直接支持抗血管生成藥可廣泛適用于癌癥治療的結(jié)論。將bevacizumab這種抗-VEGF抗體加入IFL化療顯示有臨床意義以及統(tǒng)計學(xué)顯著的癌癥患者中的改善，所述改善通過例如總體生存率，無進展生存，反應(yīng)率以及反應(yīng)持續(xù)時間來測定。bevacizumab導(dǎo)致的生存中值持續(xù)時間4.7月的延長與在結(jié)腸直腸癌治療的其它任何3階段試驗中觀察到的一樣多或更多。Goldberg et al.(2004)J.Clin.Oncol.2223-30。盡管該試驗過程中，奧沙利鉑二線療法的可用性(availability)有限，Bevacizumab治療的人群中20.3月的中值生存期還是出現(xiàn)了。
與單獨的IFL相比，IFL加bevacizumab的方案使得無進展生存時間從中值6.2月增加到10.6月，總體反應(yīng)率從34.8％增加到44.8％，反應(yīng)中值持續(xù)時間從7.1月增加到10.4月。這些改善在臨床上有意義。不能預(yù)測利用IFL加bevacizumab導(dǎo)致的反應(yīng)率絕對增加10％與該數(shù)量級的存活的增長相關(guān)。該觀察提示，bevacizumab的主要機制是抑制腫瘤生長，而不是細胞減少。
該臨床益處伴隨治療副反應(yīng)的相對適度的增加，其可輕易控制。在3級和4級不利效應(yīng)的總體發(fā)生率中大約10％的絕對增加，主要由于需要治療的高血壓，腹瀉以及白細胞減少所致。將bevacizumab加入IFL沒有明顯增加任何原因所致的60天死亡率，住院以及治療的中止。
以前的階段1和2臨床實驗提示，利用單獨的bevacizumab或聯(lián)用化療導(dǎo)致血栓形成、出血、蛋白尿以及高血壓發(fā)病率增加。Kabbinavar et al.(2003)J.Clin.Oncol.2160-65；Yang et al.(2003)New Engl.J.Med.349427-34。除了高血壓以外，與IFL加安慰劑組中這些副反應(yīng)的發(fā)生率相比，沒有發(fā)現(xiàn)所述副反應(yīng)的增加，因此，顯示了隨機化的、安慰劑對照研究對安全性以及效力評估的重要性。一種新出現(xiàn)的潛在副反應(yīng)是胃腸穿孔。該并發(fā)癥并不常見并且有各種臨床表現(xiàn)。嚴重腸道并發(fā)癥，具體是在患有中性粒細胞減少的患者中的嚴重腸道并發(fā)癥，在IFL以及其它結(jié)腸直腸癌化療方案中有報道，并且在一個系列中，在超過2％用基于氟尿嘧啶的方案治療的患者中有瘺的報道。Saltz et al.(2000)New Engl.J.Med.343905-914；Rothenberg et al.(2001)J.Clin.Oncol.193801-7；Tebbutt et al.(2003)Gut 52568-73。在給予IFL加安慰劑的組中沒有所述事件出現(xiàn)，而在IFL加bevacizumab組中觀察到6個病例(1.5％)，有時在整體腫瘤反應(yīng)的背景中。盡管這6名患者中有3名能夠重新開始治療而沒有隨后的并發(fā)癥，一名患者死亡，兩名由于該并發(fā)癥而永遠停止所述治療。
雖然以前的動物研究和早期階段的臨床試驗提示利用抗血管生成治療來治療癌癥，本研究首次顯示利用抗血管生成抑制劑，諸如抗-VEGF抗體，確實能產(chǎn)生對癌癥患者統(tǒng)計學(xué)顯著且臨床有意義的益處。
實施例2.在一線轉(zhuǎn)移結(jié)腸直腸癌中將Bevacizumab加入藥團5-FU/甲酰四氫葉酸該隨機的，階段II試驗比較了bevacizumab加5-氟尿嘧啶與甲酰四氫葉酸(5-FU/LV)相對于安慰劑加5-FU/LV在患者中作為一線治療的情況，所述患者被認為是一線伊立替康的非最佳候選者。
患者和方法患者合格條件組織學(xué)上被確認的、以前未被治療的、可測定轉(zhuǎn)移結(jié)腸直腸癌患者是合格的，條件是，如果研究人員判斷他們不是一線含伊立替康療法的最佳候選人并具有以下特征中至少一個年齡超過65，ECOG PS 1或2，血清白蛋白等于或低于3.5g/dL，或之前對腹部或骨盆的放療。如果患者經(jīng)過大手術(shù)(major surgical procedures)或開放性活檢，或在研究開始前28天之內(nèi)經(jīng)歷過明顯的外傷性損傷；研究過程中預(yù)期需要大手術(shù)；目前正使用或最近使用過治療性抗凝劑(除非導(dǎo)管開放所需)，溶栓治療或利用阿司匹林的長期每日治療(≥325mg/天)或非類固醇抗-炎藥物治療；具有嚴重的，非愈合傷口，潰瘍，或骨折；具有CNS轉(zhuǎn)移病史或證據(jù)；懷孕或哺乳；或在基線時具有蛋白尿或臨床明顯的腎功能障礙，則該患者被排除。所有患者提供其參與的書面同意書。
研究設(shè)計和治療相互作用性聲音反應(yīng)系統(tǒng)用于隨機將合格的患者分配到2個治療組中1個中5-FU/LV加安慰劑或5-FU/LV加bevacizumab。利用動態(tài)隨機算法實現(xiàn)總體以及以下類別中每個組內(nèi)的平衡研究中心，基線ECOG體力狀態(tài)(baseline ECOG performance status)(0vs.≥1)，原發(fā)疾病位點(結(jié)腸vs.直腸)，以及轉(zhuǎn)移病灶數(shù)目(1vs.＞1)。5-FU/LV療法，包括LV 500mg/m2、超過2小時以及5-FU 500mg/m2作為藥團(bolus)中途通過LV輸注(Roswell Parkregimen；Petrelli et al.(1989)J.Clin.Oncol.71419-1426)，在每個8周的循環(huán)中在前6周每周給藥一次?；煶掷m(xù)到研究結(jié)束(96周)或疾病進展。Bevacizumab 5mg/kg或安慰劑每2周給藥。Bevacizumab組中被證實完全反應(yīng)或經(jīng)歷不可接受的化療毒性的患者被允許停止5-FU/LV并持續(xù)接受單獨的bevacizumab作為一線療法。疾病進展時，患者對其接受的治療并非盲性，并可接受研究人員慎重決定的任何二線治療。只有被隨機分配到bevacizumab組的患者可接受bevacizumab作為二線治療的成分。結(jié)束該研究后，每4個月隨診患者任何隨后的治療以及存活情況，直到死亡，失隨診，或研究終止。
研究評估在基線以及每個8周的循環(huán)完成時，利用適宜的放射顯像技術(shù)(通常為螺旋CT掃描)評估患者的腫瘤狀態(tài)。腫瘤反應(yīng)或進展通過研究人員以及獨立放射設(shè)備(independent radiology facility)(IRF)測定，利用實體瘤反應(yīng)評估標準(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)。Therasse et al.(2000)。IRF評估在不了解治療方案或研究人員的評估的情況下進行。此外，患者完成結(jié)腸直腸癌患者中的結(jié)腸直腸癌癥治療的功能評估(Functional Assessment ofCancer Therapy-Colorectal)(FACT-C)，4版，一種評估生活質(zhì)量(quality oflife)(QOL)的可信方案，在基線以及每次治療循環(huán)以前直到疾病進展。Wardet al.(1999)Qual.LifeRes.8181-195。
安全性從不利事件，實驗室檢驗結(jié)果，以及生命體征測定的報告評估。不利事件以及異常實驗室結(jié)果利用National Cancer Institute Common ToxicityCriteria(NCI-CTC)，Version 2分類。預(yù)先規(guī)定的安全性測定包括四項特別感興趣的不利事件(高血壓，蛋白尿，血栓形成以及出血)，其基于對bevacizumab的以前的臨床試驗的發(fā)現(xiàn)。
統(tǒng)計學(xué)分析主要結(jié)果指標(primary outcome measure)是總體生存期。次要結(jié)果指標包括無進展生存，目標反應(yīng)率(完全和部分)，反應(yīng)持續(xù)時間，以及FACT-C QOL評分的變化。生存期定義為從隨機化開始到死亡的時間。對于在分析時存活的患者，生存期在最后接觸那一天接受審查。無進展生存定義為從隨機化到疾病進展較早期或在研究中死亡的時間，所謂研究中的死亡定義為在最后劑量的研究藥物或化療的30天內(nèi)任何原因所致的死亡。對于在分析時沒有疾病進展的存活患者，無進展生存在其最后的腫瘤評估中檢查，或如果沒有進行基線后評估(postbaseline assessment)，在第1天(研究治療的第一天)接受檢查。在目的反應(yīng)分析中，沒有腫瘤評估的患者分類為無反應(yīng)者。疾病進展和反應(yīng)分析基于IRF評估。生活質(zhì)量改變作為QOL達到惡化的時間(TDQ)來分析，定義為從隨機(randomization)化到結(jié)腸癌特異性FACT-C輔助(subscale)得分(colon-cancer specific FACT-C subscale score)(CCS)最早出現(xiàn)自基線降低≥3個點，疾病進展或研究中的死亡的時間。也測定TOI-C(CCS總和，身體和功能健康)以及總FACT-C的TDQ，其分別為相對于基線下降7和9個點。
為檢測到5-FU/LV/bevacizumab組相對于5-FU/LV/安慰劑組的死亡危險率為0.61，需要大約133例死亡。雙尾對數(shù)秩和檢驗的0.05顯著性水平80％置信區(qū)間以及兩次中期分析(interim analyses)在計算中推定。中期分析通過非盲性獨立Data Monitoring Committee(DMC)進行。安全性中期分析在44例死亡之后進行，并在89例死亡之后進行第二次安全和效力中期分析。所述中間效力分析由正式組順序停止規(guī)則(formal group sequential stoppingrule)基于O’Brien-Fleming耗費函數(shù)(spending function)來控制。Kaplan-Meier法用于估計每個治療組的中值生存，無進展生存，以及反應(yīng)持續(xù)時間。Bevacizumab組相對于安慰劑組的危險率利用分層Cox成比例危險模型(stratified Cox proportional hazards model)測定。雙側(cè)分層對數(shù)秩和檢驗(stratified log rank test)用于比較這兩組。分層分析(Stratified analyses)包括基線ECOG體力狀態(tài)(base line ECOG performance status)，原發(fā)疾病位點，以及轉(zhuǎn)移位點數(shù)目。目的反應(yīng)率通過Chi-squared檢驗來檢驗。作為解釋性分析，Cox正比危險模型用于估計危險因素對治療效果在生存與無進展生存期的影響。效力分析對于意欲-治療人群(intent-to-treat population)進行，該人群定義為所有被隨機化的患者。安全性分析包括所有接受至少一劑研究藥物的患者。
結(jié)果患者特征在23月中，209名患者在美國和澳大利亞/新西蘭的60個位置隨機化。為對主要終點(primary endpoint)(總體生存)的意圖-治療分析，在5-FU/LV/安慰劑組有105名患者，在5-FU/LV/bevacizumab組有104名患者。所選人口統(tǒng)計學(xué)以及基線特征類似于實施例1中所述，并在治療組間合理平衡?；€低血清白蛋白(≤3.5g/dL)在bevacizumab組中比在安慰劑組中少見。
治療治療的中值持續(xù)時間在5-FU/LV/安慰劑組為23周，在5-FU/LV/bevacizumab組為31周，在治療過程中5-FU劑量強度(計劃5-FU劑量與實際接受量的百分比)在兩組中相似(92％vs.84％)。至截止日(the dateof date cut-off)，5-FU/LV/安慰劑組中的1名患者以及5-FU/LV/bevacizumab組中的7名患者保持所給予的初始治療。隨后的治療(其影響生存)用于兩組中大約50％的患者，但5-FU/LV/安慰劑組中更多患者用活性劑伊立替康和奧沙利鉑。
效力總體生存，主要終點，在5-FU/LV/bevacizumab組(中值，16.6月)中長于5-FU/LV/安慰劑組(中值，12.9月)，表明顯著性的趨勢。死亡危險率估計為0.79(95％CI，0.56至1.10；P＝0.16；表5和圖4)。將bevacizumab加入5-FU/LV與中值無進展生存(9.2vs.5.5月；危險率＝0.50；95％CI，0.34至0.73；P＝0.0002，表5和圖4)，反應(yīng)率(26.0％vs.15.2％，P＝0.055)，和反應(yīng)期中值(9.2月vs.6.8月；危險率＝0.42；95％CI，0.15至1.17；P＝0.088)的增加相關(guān)。對于對治療的總體生存效果的進一步分析通過基線特征顯示具有低基線血清白蛋白(≤3.5g/dL)的患者顯示產(chǎn)生明顯的生存益處(危險率＝0.46；95％CI，0.29至0.74；P＝0.001)。
表5.效力分析總結(jié)

5-FU/LV＝5-氟尿嘧啶/甲酰四氫葉酸Bevacizumab治療對生活質(zhì)量沒有有害影響，TDQ結(jié)果提示可能的有益效果。CCS得分測定的中值TDQ在5-FU/LV/安慰劑組中為3.0月，在5-FU/LV/bevacizumab組中為3.1月(危險率＝0.79，P＝0.188)。安慰劑治療和bevacizumab治療的患者的中值TDQ如第二(secondary)TDQ所測定的為2.3和3.2個月(TOI-C；危險率＝0.71，P＝0.048)以及2.6和3.6個月(總FACT-C；危險率＝0.66，P＝0.016)。
安全性共204名接受至少一種研究藥物劑量的患者(104名患者5-FU/LV/安慰劑和100名患者5-FU/LV/bevacizumab)包含安全性人群。觀察到接受bevacizumab的患者的總體3級和4級毒性的16％增加(71％相對于87％)。導(dǎo)致死亡或研究中止的不利事件在兩組中相似，所述不利事件已知與5-FU/LV相關(guān)(具體地，腹瀉和白細胞減少)。兩名患者，都在5-FU/LV/bevacizumab組，經(jīng)歷的腸穿孔事件。這些事件在治療110天以及338天出現(xiàn)，均被認為與手術(shù)探查的結(jié)腸憩室相關(guān)。一名患者死于該并發(fā)癥。以前的臨床試驗提示出血，血栓性拴塞，蛋白尿，以及高血壓作為可能的bevacizumab相關(guān)的毒性；然而，在該研究中，在靜脈血栓形成，大于或等于3級的出血，或臨床顯著的(大于或等于3級)的蛋白尿沒有增加。動脈血栓形成事件(心肌梗塞，卒中，或外周動脈血栓形成事件)在5-FU/LV/bevacizumab組中出現(xiàn)在10名患者中，而在5-FU/LV/安慰劑組中出現(xiàn)在5名患者中。
5-FU/LV/安慰劑組的60天所有原因?qū)е碌乃劳雎时?-FU/LV/bevacizumab組高(13.5％vs.5.0％)。兩組中由于疾病進展導(dǎo)致的死亡在第一個60天之內(nèi)是相似的(5.8％vs.4.0％)。在5-FU/LV/安慰劑組，第一個60天內(nèi)不是由于疾病進展導(dǎo)致的死亡是由于以下原因心力衰竭(1)，膿毒癥(3)，腹瀉(2)，呼吸衰竭(1)，以及肺栓塞(1)。在5-FU/LV/bevacizumab組，不歸因于疾病進展的單個早期死亡歸因于心肌梗塞。
該臨床研究的結(jié)果進一步證實，人源化抗VEGF單克隆抗體bevacizumab，在加入轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的一線化療時提供重要的臨床益處。當于單獨的5-FU/LV比較時，加入bevacizumab延長中值生存期3.7個月，延長無進展生存3.7個月，延長反應(yīng)持續(xù)時間2.4個月，增加反應(yīng)率11％。
這些結(jié)果應(yīng)當在研究人群的背景下來看。具體選出的是對一線含伊立替康療法反應(yīng)不良的候選患者，其反應(yīng)不良可能是低獲益或高治療相關(guān)毒性可能性的結(jié)果。對關(guān)鍵性(pivotal)伊立替康試驗的仔細分析顯示，該試劑的臨床益處限于這樣的患者，其具有正常ECOG體力狀態(tài)(PS＝0).21，22。高齡，以前接受過骨盆放療，體力狀態(tài)受損，以及低血清白蛋白均被報道增加伊立替康相關(guān)毒性。23-27名具有這些特征的患者需要其它治療選擇。以前進行了對較小的隨機化II期試驗的回顧性子集分析，在CRC中評估bevacizumab和5-FU/LV，并發(fā)現(xiàn)bevacizumab對具有基線PS 1或2(中值生存，6.3個月vs.15.2個月)的患者亞組，年齡≥65的亞組(11.2個月vs.17.7個月)，以及血清白蛋白＜3.5的亞組(8.1個月對14.1個月)提供了實質(zhì)上的治療效果。這些結(jié)果鼓勵我們設(shè)計目前的試驗，具體包括預(yù)后不良研究人群以及利用所述試驗來檢測對生存的顯著治療效果。我們非常成功地錄入了與同時進行的關(guān)鍵性IFL/安慰劑相對于IFL/bevacizumab試驗的人群不同的人群。與該關(guān)鍵性試驗相比，目前的試驗中的患者具有更高的中值年齡(72vs.61歲)并且基本上更多的患者具有＞0的體力狀態(tài)(72％vs.43％)和≤3.5mg/dL的白蛋白(46％vs.33％)。
盡管是這樣的高危險研究人群，卻顯示對5-FU/LV/bevacizumab方案的很好的耐受。所述bevacizumab相關(guān)的不利事件3級高血壓在5-FU/LV/bevacizumab組占16％，在5-FU/LV/安慰劑組中占3％。沒有出現(xiàn)4級高血壓。任何級的蛋白尿在5-FU/LV/bevacizumab組38％相對于5-FU/LV/安慰劑組的19％；然而，bevacizumab組中僅有一名患者出現(xiàn)3級蛋白尿，而沒有4級蛋白尿的病例。在bevacizumab治療的患者中，沒有3和4級出血或靜脈血栓事件增加。動脈血栓事件發(fā)病率不平衡10％見于5-FU/LV/bevacizumab組，而4.8％見于5-FU-/LV安慰劑組。類似的不平衡見于關(guān)鍵性(pivotal)bevacizumab試驗中(1.0％見于IFL/安慰劑組，3.3％見于IFL/bevacizumab組)。本研究中所包含人群的年齡越大，導(dǎo)致該不利事件總體發(fā)生率越高，然而兩項研究中的不平衡值得注意。需要大的、觀察性安全試驗進一步確定這些以及與bevacizumab治療相關(guān)的其它不常出現(xiàn)的不利事件的發(fā)生率以及潛在危險因素。
總之，這些數(shù)據(jù)證實，bevacizumab與藥團5-FU/LV聯(lián)用為患有以前未經(jīng)治療的轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的患者提供了實質(zhì)性臨床益處，所述患者是含伊立替康療法的不佳候選者。與關(guān)鍵性試驗(pivotal trial)結(jié)果相結(jié)合，這些數(shù)據(jù)加強了基于bevacizumab的，含5-FU/LV-療法應(yīng)當被認為是轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌初始治療的標準選擇的證據(jù)。
權(quán)利要求
1.治療人患者中的癌癥的方法，包括將有效量的抗-VEGF抗體以及抗腫瘤組合物給予患者，所述抗腫瘤組合物包含至少一種化療劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述癌癥選自乳腺癌，結(jié)腸直腸癌，直腸癌，非小細胞肺癌，非何杰金淋巴瘤(NHL)，腎細胞癌，前列腺癌，肝癌，胰腺癌，軟組織肉瘤，卡波奇肉瘤，類癌樣癌，頭和頸部癌癥，黑素瘤，卵巢癌，間皮瘤以及多發(fā)性骨髓瘤組成的組。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述癌癥是轉(zhuǎn)移的。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述患者以前未接受治療。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述化療劑選自以下物質(zhì)組成的組烷化劑，抗代謝物，葉酸類似物，嘧啶類似物，嘌呤類似物以及相關(guān)抑制劑，長春花堿類，epipodopyyllotoxins，抗生素，L-天冬酰胺酶，拓撲異構(gòu)酶抑制劑，干擾素，鉑配位復(fù)合物，大黃素取代的脲，甲基肼衍生物，腎上腺皮質(zhì)抑制劑，腎上腺皮質(zhì)類固醇，孕激素，雌激素，抗雌激素，雄激素，抗雄激素，以及促性腺激素-釋放激素類似物。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述化療劑選自以下物質(zhì)組成的組；5-氟尿嘧啶(5-FU)，甲酰四氫葉酸，伊立替康，奧沙利鉑，卡培他濱，紫杉醇和多西紫杉醇。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗腫瘤組合物包含至少兩種化療劑的組合。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述抗腫瘤組合物包含5-FU和甲酰四氫葉酸.
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述抗腫瘤組合物包含5-FU，甲酰四氫葉酸和伊立替康。
10.權(quán)利要求1的方法，其中一旦完成利用抗-VEGF抗體和所述抗腫瘤組合物的治療，所述患者接受利用至少一種化療劑的進一步化療。
11.權(quán)利要求10的方法，其中用于進一步化療的化療劑選自5-FU，甲酰四氫葉酸，伊立替康，奧沙利鉑，卡培他濱，紫杉醇和多西紫杉醇組成的組。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述化療劑是奧沙利鉑。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗-VEGF抗體與單克隆抗-VEGF抗體A4.6.1結(jié)合同一表位，所述A4.6.1由雜交瘤ATCC HB 10709產(chǎn)生。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗-VEGF抗體是人抗體。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗-VEGF抗體是人源化抗體。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述抗-VEGF抗體是人源化A4.6.1抗體或其片段。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗-VEGF抗體經(jīng)靜脈輸注給藥。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗-VEGF抗體以大約5mg/kg每2-3周給藥患者。
19.權(quán)利要求1的方法，由此所述抗-VEGF抗體和所述抗腫瘤組合物的聯(lián)合給藥有效延長人類患者的生存期。
20.權(quán)利要求19的方法，其中與單用所述抗腫瘤組合物治療的患者相比，所述人類患者的生存期增加至少約2個月。
21.權(quán)利要求1的方法，由此所述抗-VEGF抗體和所述抗腫瘤組合物的聯(lián)合給藥有效延長人類患者的無進展生存期。
22.權(quán)利要求21的方法，其中與單用所述抗腫瘤組合物治療的患者相比，所述患者的無進展生存期增加至少約2個月。
23.權(quán)利要求1的方法，由此所述抗-VEGF抗體和所述抗腫瘤組合物的聯(lián)合給藥有效提高人類患者組中的反應(yīng)率。
24.權(quán)利要求23的方法，其中與單用所述抗腫瘤組合物治療的患者相比，所述人類患者組中的反應(yīng)率明顯增加，其Chi-square p-值小于0.005。
25.權(quán)利要求1的方法，由此所述抗-VEGF抗體和所述抗腫瘤組合物的聯(lián)合給藥有效延長所述人類患者的反應(yīng)時間。
26.權(quán)利要求25的方法，其中與單用所述抗腫瘤組合物治療的患者相比，所述患者的反應(yīng)時間增加至少約2個月。
27.治療易患或診斷為患有結(jié)腸直腸癌的人類患者的方法，包括給藥所述患者治療有效量的抗-VEGF抗體。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述結(jié)腸直腸癌是轉(zhuǎn)移癌。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述抗-VEGF抗體與單克隆抗-VEGF抗體A4.6.1結(jié)合同一表位，所述A4.6.1由雜交瘤ATCC HB 10709產(chǎn)生。
30.權(quán)利要求27的方法，其中所述抗-VEGF抗體是人抗體。
31.權(quán)利要求27的方法，其中所述抗-VEGF抗體是人源化抗體。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述抗-VEGF抗體是人源化A4.6.1抗體或其片段。
33.權(quán)利要求27的方法，其中所述抗-VEGF抗體經(jīng)靜脈輸注給藥。
34.權(quán)利要求27的方法，其中所述抗-VEGF抗體以大約5mg/kg每2-3周給藥患者。
35.權(quán)利要求27的方法，還包括給藥所述患者一或多種化療劑。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述化療劑選自以下物質(zhì)組成的組烷化劑，抗代謝物，葉酸類似物，嘧啶類似物，嘌呤類似物以及相關(guān)抑制劑，長春花堿類，epipodopyyllotoxins，抗生素，L-天冬酰胺酶，拓撲異構(gòu)酶抑制劑，干擾素，鉑配位復(fù)合體，大黃素取代的脲，甲基肼衍生物，腎上腺皮質(zhì)抑制劑，腎上腺皮質(zhì)類固醇，孕激素，雌激素，抗雌激素，雄激素，抗雄激素，和促性腺激素-釋放激素類似物.
37.權(quán)利要求35的方法，其中所述化療劑選自以下物質(zhì)組成的組5-氟尿嘧啶，甲酰四氫葉酸，伊立替康，奧沙利鉑，卡培他濱，紫杉醇和多西紫杉醇。
38.治療患有轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的人類患者或人類患者的組的方法，包括給藥所述患者有效量的抗-VEGF抗體組合物和抗腫瘤組合物，其中所述抗腫瘤組合物包含基于氟尿嘧啶的化療劑組合，由此聯(lián)合給藥所述抗-VEGF抗體和所述抗腫瘤組合物導(dǎo)致被治療患者中統(tǒng)計學(xué)顯著性以及臨床有意義的改善，所述改善通過存活時間，無進展存活，反應(yīng)率以及反應(yīng)時間測定。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述抗腫瘤組合物包含5-FU，甲酰四氫葉酸和伊立替康。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述抗腫瘤組合物包含具有500mg/m25-FU，20mg/m2甲酰四氫葉酸和125mg/m2伊立替康的方案，并以每周給藥持續(xù)4周然后停止給藥2周的為期6周的反復(fù)性循環(huán)來給藥患者，并且其中所述抗-VEGF抗體以5mg/kg每隔一周給藥患者。
41.權(quán)利要求38的方法，其中所述抗腫瘤組合物包含5-FU和甲酰四氫葉酸。
42.權(quán)利要求41的方法，其中5-FU和甲酰四氫葉酸以為期8周的反復(fù)循環(huán)、每個循環(huán)500mg/m2給藥患者，所述循環(huán)包括每周給藥持續(xù)4周然后停止給藥2周，并且其中所述抗-VEGF抗體以5mg/kg每隔一周給藥患者。
43.權(quán)利要求41的方法，其用于被認為不是一線伊立替康治療的最佳候選患者的人類患者。
44.權(quán)利要求38的方法，其中所述抗腫瘤組合物包含5-FU，甲酰四氫葉酸和奧沙利鉑。
45.制品，其包含容器，所述容器內(nèi)包含含有抗-VEGF抗體的組合物以及包裝插頁，所述包裝插頁指示該組合物的使用者將所述抗-VEGF抗體組合物和包含至少一種化療劑的抗腫瘤組合物給藥癌癥患者。
46.治療人類患者中的癌癥的試劑盒，其包含含有抗-VEGF抗體組合物的藥物包，以及利用所述抗-VEGF抗體組合物和包含至少一種化療劑的抗腫瘤組合物治療患者中的癌癥的說明。
全文摘要
本發(fā)明總體涉及利用抗－VEGF抗體治療疾病以及病理狀況。更具體地，本發(fā)明涉及治療利用抗－VEGF抗體易患或診斷為患有癌癥的患者，優(yōu)選與一或多種其它抗腫瘤治療劑聯(lián)用。
文檔編號A61K31/7072GK1829741SQ200480021966
公開日2006年9月6日 申請日期2004年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月30日
發(fā)明者格溫德林·法伊夫, 埃里克·霍姆格倫, 羅伯特·D·馬斯, 威廉·諾沃特尼 申請人:健泰科生物技術(shù)公司