專利名稱：粘蛋白合成抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一些鄰氨基苯甲酸的類似物和衍生物、2-氨基-煙酸的衍生物和類似物、和2-氨基-苯乙酸的類似物和衍生物。尤其是，本發(fā)明涉及它們的對(duì)映體形式、它們的制備方法、含有它們的藥用組合物和它們治療用途、尤其是，用于調(diào)節(jié)粘蛋白合成和化合物在控制與疾病相關(guān)的粘蛋白過(guò)量生成中的治療應(yīng)用，所述疾病例如包括哮喘、慢性支氣管炎、炎性肺病、囊性纖維化、急性或慢性呼吸感染疾病、慢性阻塞性肺病和慢性胃腸道疾病。
背景技術(shù)：
眾所周知?dú)獾郎掀ねㄟ^(guò)粘液纖毛系統(tǒng)和機(jī)械屏障組織在構(gòu)成氣道防御機(jī)制中起必需的作用。近來(lái)研究表明，氣道上皮細(xì)胞(AEC)可被激活以產(chǎn)生和釋放生物介質(zhì)，該介質(zhì)在多種氣道紊亂的發(fā)病機(jī)理是重要的(Polito和Proud，1998；Takizawa，1998)。有證據(jù)表明，在慢性氣道病癥如哮喘、慢性支氣管炎、肺氣腫、和囊性纖維化中上皮組織是根本性地失調(diào)。(Holgate等人，1999；Jeffery PK，1991；Salvato，1968；Glynn和Michaels，1960)。
這些氣道病癥的特點(diǎn)之一是由AEC的粘液的過(guò)量生成。粘液的主要大分子成分是被稱為粘蛋白的大糖蛋白。近來(lái)，至少7種人類粘蛋白的分子結(jié)構(gòu)得到測(cè)定。已知粘蛋白轉(zhuǎn)錄子是不同種類的，其基因間無(wú)序列同源性(Voynow和Rose，1994)，盡管它們?cè)谡w所有重復(fù)結(jié)構(gòu)上相似。
已知有毒的刺激物能活化AEC。這些刺激物從過(guò)敏疾病的抗原到藥物或環(huán)境污染物、煙草的煙、和與慢性阻塞肺病的形成相關(guān)的感染劑。AEC活化導(dǎo)致鐵運(yùn)輸?shù)母淖?、睫狀顫?dòng)的變化、和粘蛋白增加的產(chǎn)量和分泌導(dǎo)致增加的粘液。在對(duì)AEC活化的反應(yīng)中產(chǎn)生的介質(zhì)包括促進(jìn)炎癥細(xì)胞流入的趨化因子(Takizawa，1998)。這些炎癥細(xì)胞能依次產(chǎn)生可能損傷AEC的介質(zhì)。AEC的損傷刺激細(xì)胞內(nèi)增生(杯狀細(xì)胞和黏膜下層腺細(xì)胞增生)，其導(dǎo)致膨脹的和前-炎癥產(chǎn)物的連續(xù)源頭，包括蛋白酶和使得氣道壁重塑的生長(zhǎng)因子，這種重塑導(dǎo)致對(duì)肺的破壞和功能喪失(Holgate等人，1999)。
粘液的過(guò)量生成和其生理化學(xué)特性的改變能導(dǎo)致多種方面的肺部病癥。過(guò)量產(chǎn)生的粘蛋白對(duì)生理粘液纖毛清除的破壞，能導(dǎo)致粘液堵塞、空氣滯留、和肺膨脹不全，其通常由感染而更加惡化。
哮喘是一種慢性阻塞肺部病癥，表現(xiàn)為漸增的流行性和嚴(yán)重性(Gergen和Weiss，1992)。估計(jì)人群中30-40％患有特應(yīng)性過(guò)敏，而人群中15％的兒童和5％的成人患有哮喘(Gergen和Weiss，1992)。
哮喘中，由抗原活化免疫系統(tǒng)導(dǎo)致過(guò)敏性炎癥。當(dāng)這種類型的免疫活化發(fā)生時(shí)通常伴有肺部炎癥、支氣管高反應(yīng)性(hyperresponsiveness)、杯狀細(xì)胞和黏膜下層腺細(xì)胞增生、粘蛋白過(guò)量生成和分泌過(guò)多(Basle等人.，1989)(Paillasse，1989)(Bosque等人.，1990)。伴有杯狀細(xì)胞和黏膜下層腺細(xì)胞增生的粘液過(guò)量生成和堵塞是哮喘病癥的重要部分，并在對(duì)輕微哮喘和因哮喘而死的個(gè)體的氣道檢查中已有描述(Earle，1953)(Cardell和Pearson，1959)(Dunnill，1960)(Dunnill等人，1969)(Aikawa等人，1992)(Cutz等人，1978)。在這種反應(yīng)中某些炎癥細(xì)胞是重要的，包括T細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞、產(chǎn)生IgE的B細(xì)胞、結(jié)合IgE的嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。這些炎癥細(xì)胞在過(guò)敏炎癥位點(diǎn)累積，它們釋放的有毒產(chǎn)物導(dǎo)致對(duì)AEC和與這些紊亂相關(guān)的其它組織的破壞。
在上述提到的相關(guān)專利申請(qǐng)中，申請(qǐng)人已經(jīng)證明，白介素-9(IL9)、它的受體和受IL9影響的活性是對(duì)特應(yīng)性過(guò)敏、哮喘和相關(guān)紊亂中的合適介入治療目標(biāo)。過(guò)敏原導(dǎo)致介質(zhì)從肥大細(xì)胞的釋放一直認(rèn)為是過(guò)敏反應(yīng)中重要的起始事件。IL9起初鑒定為肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子，已經(jīng)證明IL9上調(diào)肥大細(xì)胞蛋白酶的表達(dá)，所述蛋白酶包括MCP-1、MCP-2、MCP-4(Eklund等人，1993)和粒酶B(Louahed等人，1995)。因此，IL9表現(xiàn)為在肥大細(xì)胞增生和分化中起作用。而且，IL9上調(diào)高親和性IgE受體α鏈的表達(dá)(Dugas等人，1993)。此外，體外研究和體內(nèi)研究都表明IL9加強(qiáng)IgE從原始B細(xì)胞的釋放(Petit-Frere等人，1993)。
近來(lái)，IL9表現(xiàn)為刺激粘蛋白合成并可能負(fù)責(zé)過(guò)敏氣道疾病中肺液的50-60％的粘蛋白-刺激活性(Longpre等人，1999)。與來(lái)自背景品系的鼠相比，在IL9轉(zhuǎn)基因鼠中粘蛋白合成和粘液過(guò)量生成得到顯著上調(diào)IL9在體外和體內(nèi)特異地上調(diào)MUC2和MUC5AC基因和蛋白(Louahed等人，2000)。而且，在哮喘的動(dòng)物模型中，IL9的中和抗體完全抑制抗原刺激的反應(yīng)中的粘蛋白的上調(diào)(Mclane等人，2000)。
當(dāng)前哮喘治療有許多缺點(diǎn)。主要的治療藥物，β-受體激動(dòng)劑，減輕癥狀從而短暫地提高肺功能，但即不能作用于潛在的炎癥也不能抑制粘蛋白生成。此外，持續(xù)地使用β-受體激動(dòng)劑導(dǎo)致脫敏作用，其能降低它們的效力和安全性(Molinoff等人，1995)。能減輕潛在的炎癥并從而減少粘蛋白生成的藥物，例如抗-炎癥類固醇，有其自身的從免疫抑制到骨質(zhì)流失(bone loss)一系列缺點(diǎn)(Molinoff等人，1995)。
慢性支氣管炎是另一種形式的慢性阻塞肺部病癥。近5％的成人患有這種肺部病癥。慢性支氣管炎定義為慢性的痰過(guò)量生成。粘液的過(guò)量生成通常伴有導(dǎo)氣道的炎癥。包括中型粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的炎癥細(xì)胞的介質(zhì)可能伴有在這種病癥中粘蛋白基因表達(dá)的增加(Voynow等人，1999；Borchers等人，1999)。粘液生成的增加伴有氣道阻塞，這是這種肺部病癥的主要特征之一。治療是主要對(duì)癥的并集中于控制感染和阻止肺功能的進(jìn)一步喪失。減充血?jiǎng)?、祛痰藥和這些藥劑的組合，這些通常用于治療支氣管炎癥狀，不認(rèn)為能改變粘蛋白生成。粘液溶解劑可促進(jìn)粘液纖毛清除并產(chǎn)生癥狀緩解，該緩解通過(guò)降低氣道分泌物的粘度和/或彈性但不能抑制粘蛋白合成或粘液過(guò)量生成(Takahashi等人，1998)。
囊性纖維化(CF)是另一種影響氣道和胃腸系統(tǒng)的疾病，伴有導(dǎo)致氣道阻塞和隨后吸入的致病微生物的移生和感染的粘稠分泌物(Eng等人，1996)。DNA水平在CF肺中顯著升高并能增加痰的粘度。盡管重組霧化脫氧核糖核酸酶(DNAse)是對(duì)這些病人有益處，然而對(duì)病理性粘液的過(guò)量生成沒(méi)有有效的治療。這樣，在本領(lǐng)域?qū)ψR(shí)別藥物有特定的未滿足的需要，所述藥劑能抑制CF中氣道上皮細(xì)胞的粘蛋白過(guò)量生成。除了粘蛋白分泌導(dǎo)致的氣道阻塞之外，CF病人也患有胰腺管的黏液堵塞，其阻止消化酶向GI道的輸送。結(jié)果是吸收障礙綜合癥、脂肪痢和腹瀉。
慢性非過(guò)敏性竇炎是通常伴有數(shù)量和質(zhì)量上的黏液生成的改變，其促進(jìn)所述疾病。這些改變包括形成粘蛋白的膠如MUC2、MUC5A/C和MUC5B的分泌過(guò)多。此外，患有慢性竇炎的病人時(shí)常主訴粘液狀的或粘液濃性的鼻溢。近來(lái)的研究表明，慢性竇炎中的分泌過(guò)多可能是此處粘蛋白合成增加的結(jié)果(Shinogi等人，Laryngoscope 111(2)240-245，2001)。
盡管粘液過(guò)量生成是多種慢性阻塞肺部病癥的特征之一，本領(lǐng)域缺少任何阻滯伴有這些肺部病癥的粘蛋白的合成或過(guò)量生成的方法。因此，在本領(lǐng)域?qū)σ种普车鞍椎倪^(guò)量生成和使這些病人的分泌物變少以促進(jìn)粘液纖毛清除和維持肺的功能有特定需要。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)方面是涉及選自對(duì)映體純的或光學(xué)富含的(+)-他尼氟酯(talniflumate)和(-)-他尼氟酯、其前藥(prodrug)、及所述化合物和前藥的藥物學(xué)可接受的鹽的化合物。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及治療患伴有粘蛋白合成或分泌的疾病的患者的方法，包括向患者施用有效量的藥用組合物，所述藥用組合物包括對(duì)映體純的或光學(xué)富含的(+)-他尼氟酯和(-)-他尼氟酯、其前藥、及所述化合物和前藥的藥物學(xué)上可接受的鹽。
在一個(gè)實(shí)施方案中，粘蛋白生成是氯通道依賴性的。優(yōu)選地，氯化物通道是鈣活化的并且是CLCA氯通道。
在一個(gè)實(shí)施方案中，藥用組合物是由吸入而施用的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物是可被霧化的液體的形式，或一種粉末。
在一個(gè)實(shí)施方案中，治療患伴有粘蛋白合成或分泌的疾病的患者的方法，包括向患者施用有效量的藥用組合物，所述藥用組合物包括對(duì)映體純的或光學(xué)富含的(+)-他尼氟酯和(-)-他尼氟酯、其前藥、及所述化合物和前藥的藥物學(xué)上可接受的鹽，進(jìn)一步包括至少一種另外的治療劑。優(yōu)選的治療劑包括祛痰藥、粘液溶解劑、抗生素和減充血?jiǎng)Ｔ趦?yōu)選實(shí)施方案中，祛痰藥是愈創(chuàng)甘油醚。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述藥用組合物進(jìn)一步包括至少一種賦形劑，其選自表面活性劑、穩(wěn)定劑、吸收加強(qiáng)劑、芳香劑和藥物上可接受載體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，穩(wěn)定劑是環(huán)狀糊精，而吸收加強(qiáng)劑是殼聚糖。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，疾病狀況選自慢性阻塞肺部疾病(COPD)、炎癥肺病、囊性纖維化和感染性疾病。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，COPD是選自肺氣腫、慢性支氣管炎和哮喘。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述藥用組合物配制為由吸入方式輸送至肺部，其包括有效降低粘蛋白合成或分泌的量的對(duì)映體純的或光學(xué)富含的(+)-他尼氟酯和(-)-他尼氟酯、其前藥、及所述化合物和前藥的藥物學(xué)上可接受的鹽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述藥物組合物包括(+)-他尼氟酯、(+)-他尼氟酯衍生物、其鹽或其前藥。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述藥用組合物進(jìn)一步包括至少一種祛痰藥、粘液溶解劑、抗生素或減充血?jiǎng)?br> 本發(fā)明的另一個(gè)方面是涉及包括對(duì)映體純的或光學(xué)富含(+)-他尼氟酯和(-)-他尼氟酯、其前藥、及所述化合物和前藥的藥物學(xué)上可接受的鹽的藥用組合物的吸入裝置。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，配制包括對(duì)映體純的或光學(xué)富含(+)-他尼氟酯和(-)-他尼氟酯、其前藥、以及所述化合物的鹽和前藥的藥物學(xué)上可接受的鹽的所述藥用組合物以提高其生物利用度。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將所述組合物微粉化。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及慢性竇炎患者的治療方法，其包括向患者施用包括有效量的對(duì)映體純的或光學(xué)富含(+)-他尼氟酯和(-)-他尼氟酯、其前藥、以及所述化合物和前藥的藥物學(xué)上可接受的鹽的藥用組合物。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1表示NFA對(duì)粘蛋白生成的作用。NFA抑制劑在體外阻滯粘蛋白過(guò)量生成。
圖2表示NFA和多種化合物在活化的Caco2細(xì)胞中抑制粘蛋白過(guò)量生成的能力。此圖表示芬那酯(fenamate)在活化的Caco2細(xì)胞中抑制粘蛋白生成。
圖3表示用NFA治療活化的Caco2細(xì)胞系對(duì)它們的存活度無(wú)影響。此圖表示NFA不影響上皮細(xì)胞增生。
圖4表示對(duì)上皮細(xì)胞的趨化因子嗜酸性細(xì)胞趨化因子(eotaxin)生成的抑制。此圖表示NFA阻滯上皮細(xì)胞的活化包括趨化因子生成。
圖5表示與磷酸緩沖鹽(PBS)相比，氣管內(nèi)施用NFA抑制抗原-誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性(Af+NFA)。此圖表示NFA阻滯上皮細(xì)胞的抗原反應(yīng)包括氣道高反應(yīng)性。
圖6表示氣管內(nèi)施用NFA的結(jié)果。此圖表示NFA減少體內(nèi)的抗原-誘導(dǎo)的肺嗜酸性粒細(xì)胞。這可由比較在NFA(Af+NFA)存在時(shí)以曲霉菌(Aspergillus)活化后的嗜酸性粒細(xì)胞與在NFA磷酸緩沖鹽(Af+PBS)存在時(shí)活化后的嗜酸性粒細(xì)胞而看出。
圖7表示與磷酸緩沖鹽(PBS)相比氣管內(nèi)施用NFA對(duì)抗原-誘導(dǎo)的粘液(粘蛋白糖-配體)增加(Af+NFA)的結(jié)果。此圖表示由于暴露鼠肺的抗原，NFA阻滯增加粘蛋白表達(dá)。
圖8表示與對(duì)照FVB鼠相比，IL9轉(zhuǎn)基因鼠在氣道中組成型地過(guò)量生成粘蛋白。
圖9表示與背景品系(FVB/NJ)的鼠相比，IL9轉(zhuǎn)基因鼠肺里組成型地過(guò)量生成粘蛋白，該鼠伴有特異性上調(diào)的MUC2和MUC5AC穩(wěn)定態(tài)轉(zhuǎn)錄物。此圖表示在IL9轉(zhuǎn)基因鼠肺里特定粘蛋白基因是上調(diào)的。
圖10表示抗-IL-9抗體在暴露于抗原的鼠肺中對(duì)粘蛋白過(guò)量表達(dá)的作用。此圖表示中和的IL-9抗體在暴露于抗原的鼠中阻止粘蛋白過(guò)量表達(dá)。
圖11表示阻滯粘蛋白生成的通式I化合物，其中X1至X9是獨(dú)立地選自碳、硫、氧和氮；R1至R11是獨(dú)立地選自氫、烷基、芳基、三氟甲基、取代烷基、取代芳基、鹵素、鹵代烷基、鹵代芳基、環(huán)烷基、羥基、烷基醚、芳基醚、胺、烷基胺、芳基胺、烷基酯、芳基酯、烷基氨磺酰、芳基氨磺酰、硫羥、烷基硫醚、芳基硫醚、烷基砜、芳基砜、烷基亞砜、芳基亞砜或氨磺酰；R1和R2、或R2和R3、或R3和R4、或R4和R5、或R6和R7、或R7和R8、或R8和R9與它們相連的原子一起形成環(huán)烷基環(huán)、芳基環(huán)或雜芳基環(huán)；Y是一個(gè)取代基選自C(O)R(其中R是選自烷基、膦酸根、苯乙烯基、和3H-異苯并呋喃-1-酮-3-氧基和3H-異苯并呋喃-1-酮-3-基的取代基)、氫、羧基、烷基羧基、硫酸酯基、磺酸酯基、磷酸酯基、膦酸酯基、羧酸的酰胺、羧酸的酯、磷酸的酰胺、磷酸的酯、磺酸的酰胺、磺酸的酯、膦酸的酰胺、膦酸的酯、氨磺酰、膦酸酰胺(phosphonamide)、四唑和羥肟酸；R11和Y可以形成環(huán)狀氨磺酰；Z是選自氧、氮、硫、碳、亞砜和砜，需要理解的是當(dāng)所述原子是硫、亞砜或砜時(shí)，基團(tuán)R10和R11不存在，而當(dāng)所述原子是氮時(shí)，只有R10存在；m是0或1；而且n是1或2，其中所述的通式為I的化合物降低患者的粘蛋白合成或粘蛋白水平。
圖12表示hCLCA1在NCI-H292細(xì)胞中誘導(dǎo)的粘蛋白表達(dá)。
圖13表示在過(guò)量表達(dá)hCLCA1的NCI-H292細(xì)胞中粘液的過(guò)量生成。
圖14表示他尼氟酯對(duì)粘蛋白產(chǎn)生的抑制。
圖15A&B表示如果口服他尼氟酯對(duì)鼠粘蛋白過(guò)量產(chǎn)生的抑制。圖15A表示用煙色曲霉菌(Aspergillus fumigatus)敏化并允許接觸通常的鼠食(chow)的鼠肺(標(biāo)為H&E)的一部分。圖15B表示用煙色曲霉菌(Aspergillus fumigatus)敏化并允許接觸通常的含有他尼氟酯的鼠食的鼠肺(標(biāo)為H&E)的一部分。
圖16表示如果口服他尼氟酯對(duì)鼠肺中嗜酸性粒細(xì)胞的抑制。此圖表示為AHR373此圖表示他尼氟酯鼠食對(duì)煙色曲霉菌(Aspergillus fumigatus)敏化的BAL的B6D2F1/J雄性鼠的效果。
圖17表示尼美舒利抑制MUC5A/C分泌。
圖18表示MSI-2079抑制MUC5A/C分泌。
圖19表示MSI-2079的結(jié)構(gòu)。
圖20表示他尼氟酯對(duì)CF鼠的效果。
圖21表示MSI-2214-2217的結(jié)構(gòu)。
圖22表示他尼氟酯對(duì)脂磷壁酸依賴性(lipoteichoic acid)的MUC2誘導(dǎo)的效果。
圖23是氯化物電流在表達(dá)hCLCA1的細(xì)胞中作為電壓的功能圖。
圖24是他尼氟酯的兩種對(duì)映體的第一次色譜鑒定。
圖25表示他尼氟酯的對(duì)映體。
圖26表示他尼氟酯對(duì)映體在ELLA細(xì)胞中對(duì)MUC5AC的效果。
圖27表示他尼氟酯對(duì)映體在Alamar Blue Assay中的效果。
發(fā)明詳述本發(fā)明部分源于發(fā)現(xiàn)肺部非纖毛上皮細(xì)胞的活化所致粘液過(guò)量生成是由誘導(dǎo)包括MUC2和MUC5AC的粘蛋白基因造成的。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是抑制上皮細(xì)胞活化。對(duì)上皮細(xì)胞活化的抑制下調(diào)了趨化因子產(chǎn)生、支氣管反應(yīng)性和粘蛋白基因表達(dá)及從而作為結(jié)果提供化學(xué)保護(hù)(chemoprotection)。降低或抑制上皮細(xì)胞活化并從而下調(diào)炎癥的毒性刺激和粘蛋白合成或粘蛋白水平的分子，是本發(fā)明的一部分。
降低粘蛋白合成或水平的藥物如此處描述的，本發(fā)明的制劑和組合物包括能降低粘蛋白合成或水平、或在某些方式降低粘蛋白的過(guò)量生成的藥物。如在此處使用的，“降低”定義為粘蛋白水平、活化、功能、穩(wěn)定性、或合成的下調(diào)。優(yōu)選的藥物降低粘蛋白依賴的氯通道的水平、活化、功能、穩(wěn)定性、或合成。如在此處使用的，“氯化物通道”是指，但并不限于，ICACC氯通道和WO99/44620里所指的相關(guān)通道，其在這里以其全部引入作為參考。符合這些定義的藥物通過(guò)在實(shí)施例中描述的試驗(yàn)篩選可用來(lái)鑒定或證明它們的活性。例如，描述于實(shí)施例7和8的體外和體內(nèi)試驗(yàn)可用于篩選、鑒定或證明藥物的活性。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的能降低粘蛋白合成或粘蛋白水平的化合物是通式I的化合物 其中X1至X9是獨(dú)立地選自碳、硫、氧和氮；R1至R11是獨(dú)立地選自氫、烷基、芳基、三氟甲基、取代烷基、取代芳基、鹵素、鹵代烷基、鹵代芳基、環(huán)烷基、羥基、烷基醚、芳基醚、胺、烷基胺、芳基胺、烷基酯、芳基酯、烷基氨磺酰、芳基氨磺酰、硫羥、烷基硫醚、芳基硫醚、烷基砜、芳基砜、烷基亞砜、芳基亞砜和氨磺酰；R1和R2、或R2和R3、或R3和R4、或R4和R5、或R6和R7、或R7和R8、或R8和R9，與它們相連的原子一起形成環(huán)烷基環(huán)、芳基環(huán)或雜芳基環(huán)；Y是一個(gè)取代基，其選自C(O)R(其中R是選自芳基、膦酸酯基、苯乙烯基、和3H-異苯并呋喃-1-酮-3-氧基和3H-異苯并呋喃-1-酮-3-基的取代基)、氫、羧基、烷基羧基、硫酸酯基、磺酸酯基、磷酸酯基、膦酸酯基、羧酸的酰胺、羧酸的酯、磷酸的酰胺、磷酸的酯、磺酸的酰胺、磺酸的酯、膦酸的酰胺、膦酸的酯、氨磺酰、膦酸酰胺(phosphonamide)、四唑和羥肟酸(hydroxamic acid)；R11和Y可以形成環(huán)狀氨磺酰；Z是選自氧、氮、硫、碳、亞砜和砜的原子，可以理解的是當(dāng)所述原子是硫、亞砜或砜時(shí)，基團(tuán)R10和R11不存在，而當(dāng)所述原子是氮時(shí)，只有R10存在；m是0或1；而且n是1或2，其中所述的通式I化合物降低受患者的粘蛋白合成或粘蛋白水平。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，Y是C(O)R(其中R是選自芳基、膦酸酯基、苯乙烯基、和3H-異苯并呋喃-1-酮-3-氧基和3H-異苯并呋喃-1-酮-3-基的取代基)或羧基，R1至R11是三氟甲基或烷基，而X6是碳或氮。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，n＝2，一個(gè)Z是NR10，而另一個(gè)Z基團(tuán)是CR10R11，其中R10是氫、R11是氨基基團(tuán)，而Y是砜，這樣Y與R11形成環(huán)氨磺酰。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，能降低粘蛋白合成或水平的通式I化合物包括鄰氨基苯甲酸(2-氨基苯甲酸)的類似物和衍生物。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，該分子可以是N-衍生的鄰氨基苯甲酸。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，鄰氨基苯甲酸的所述氨基基團(tuán)可以用一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)修飾。在一些實(shí)施方案中，該基團(tuán)可以是一個(gè)芳族基團(tuán)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述基團(tuán)可以是三氟甲基-苯基基團(tuán)，優(yōu)選為3-三氟甲基-苯基基團(tuán)，而且所述降低粘蛋白合成或水平的分子是氟芬那酸。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述氨基基團(tuán)可以由2，3-二甲基-苯基衍生，而降低粘蛋白合成或水平的分子是甲芬那酸。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，鄰氨基苯甲酸的其它苯基衍生物可用于本發(fā)明。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，苯甲酸環(huán)可以包括一個(gè)或多個(gè)取代基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，苯甲酸環(huán)和氨基基團(tuán)都可以被修飾。其它優(yōu)選的實(shí)施方案，包括在苯甲酸環(huán)和連接于氨基基團(tuán)的芳族基團(tuán)上有取代基的分子。
在一些實(shí)施方案中，能降低粘蛋白合成或水平的通式I化合物包括2-氨基-煙酸的類似物和衍生物。在一些實(shí)施方案中，環(huán)外氨基基團(tuán)可以被修飾以包括一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，環(huán)外胺基團(tuán)可用芳基基團(tuán)修飾。適合的芳基基團(tuán)包括，但不限于，苯基基團(tuán)、修飾的苯基基團(tuán)、芐基基團(tuán)、修飾的芐基基團(tuán)和類似物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，芳基基團(tuán)可是3-三氟甲基-苯基基團(tuán)，而2-氨基-煙酸的衍生物是尼氟酸。
在一些實(shí)施方案中，能降低粘蛋白合成或水平的通式I化合物可以是2-氨基-苯乙酸的類似物和衍生物。在一些實(shí)施例中，所述氨基基團(tuán)可以被修飾以包括一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，氨基基團(tuán)可用芳基基團(tuán)修飾。適合的芳基基團(tuán)包括，但不限于，苯基基團(tuán)、修飾的苯基基團(tuán)、芐基基團(tuán)、修飾的芐基基團(tuán)和類似物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，2-氨基-苯乙酸是由2，6-二氯苯基進(jìn)行N-修飾，而降低粘蛋白合成或水平的分子是他尼氟酯。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，他尼氟酯的兩種對(duì)映體形式用于調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞活性、上皮細(xì)胞炎癥和粘蛋白合成。
他尼氟酯及其對(duì)映體形式的鹽、溶劑化物、和懸浮液包括在這個(gè)實(shí)施方案中。在一些實(shí)施方案中，每種對(duì)映體基本上游離于另一種形式，或可以組合成混合物。優(yōu)選地，本發(fā)明的一特定對(duì)映體含有低于10％，例如，低于5％，且在某些期望特定效果的情況下，低于1％的其相對(duì)的對(duì)映體。在其它一些實(shí)施方案中，(+)和(-)對(duì)映體的等量組合的混合物用于上皮細(xì)胞抗炎癥和粘蛋白合成調(diào)節(jié)，其中混合物可含有等量的每種對(duì)映體，一種對(duì)映體低于50％的且相對(duì)的對(duì)映體比例上略高，這取決于每種對(duì)映體的期望效果。
他尼氟酯在所示的8號(hào)碳原子擁有一個(gè)手性中心，所以有分離兩種立體異構(gòu)體的可能。也可以理解的是，根據(jù)本發(fā)明的一種對(duì)映體，例如他尼 他尼氟酯氟酯的(+)-對(duì)映體，也可以一種基本上游離于其相應(yīng)的(-)-對(duì)映體的形式使用，并且反之亦然，或以一種混合物的形式使用，其中每種對(duì)映體提供對(duì)氣道或胃腸系統(tǒng)中活化的上皮細(xì)胞特定的的抗炎癥和/或粘蛋白調(diào)節(jié)活性。
在一些實(shí)施方案中，能降低粘蛋白合成或水平的通式I化合物可以是芐氟噻嗪。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及具有通式I I結(jié)構(gòu)的新化學(xué)實(shí)體其中 X是硫、氮、氧或CR；Y是CRR’、氧、NR6、CRR’-CRR’或CR＝CR；Z是NR6、氧、硫、CRR’或CRR’-CRR’；R1-R3是獨(dú)立地選自氫、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、氨基、羥基、鹵代烷基和鹵素；R4是氫、
或 Q是CR、NR6、或 R5是氫或芐基；R6是氫、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、OH或鹵；和R和R’是獨(dú)立地氫、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、OH或鹵素。
通式II化合物可用于治療特征為產(chǎn)生粘蛋白的疾病的方法中。包括通式II化合物的藥用組合物也如此。本發(fā)明也提供了治療患有選自慢性竇炎、哮喘、慢性支氣管炎、炎癥肺病、囊性纖維化和急性或慢性的呼吸感染疾病和慢性阻塞肺病疾病的病人的方法，所述方法包括向需要這種治療的患者施用有效量的通式II化合物。
本發(fā)明也可使用一種或多種降低粘蛋白合成或水平的上述分子的前藥。如在此處定義的，前藥是一種分子，其以不同于上述的一種形式施用并在患者的體內(nèi)轉(zhuǎn)化為所述的形式。優(yōu)選的前藥包括，但不限于，芬那酯的前藥。一些優(yōu)選的前藥是降低粘蛋白合成或水平的分子的酸形式的酯。優(yōu)選的酯類包括，但不限于，NFA的酯類，例如，β-嗎啉代乙酯、嗎尼氟酯、和2-苯并呋喃酮基酯、他尼氟酯。
定義“烷基”是指飽和的脂肪族烴類包括直鏈、支鏈或環(huán)基團(tuán)。優(yōu)選地，烷基基團(tuán)有1至20個(gè)碳原子(無(wú)論何時(shí)此處指出的數(shù)目范圍；例如，“1-20”，意味著該基團(tuán)，在這種情況下的烷基基團(tuán)，可含有1個(gè)碳原子、2個(gè)碳原子、3個(gè)碳原子等，直到并包括20個(gè)碳原子)。更優(yōu)選地，是一個(gè)中等大小的烷基有1至10個(gè)碳原子。更加優(yōu)選地，是一個(gè)低級(jí)烷基有1至4個(gè)碳原子。所述烷基基團(tuán)可以是取代的或未取代的。當(dāng)被取代時(shí)，每個(gè)取代基基團(tuán)優(yōu)選地是1個(gè)或多個(gè)單獨(dú)選自鹵素、羥基和膦酸酯基。
“苯乙烯基”基團(tuán)是指-CH＝CH-芳基基團(tuán)。
“三氟甲基”基團(tuán)是指-CF3基團(tuán)。
“芳基”基團(tuán)是指全-碳的單環(huán)或有一個(gè)完全共軛的π-電子系統(tǒng)的稠環(huán)聚環(huán)(即，共用相鄰碳原子的電子對(duì)的環(huán))基團(tuán)。芳基的例子是，不限于，苯基、萘基和蒽基。芳基基團(tuán)可被取代或未被取代。當(dāng)被取代時(shí)，每個(gè)取代基基團(tuán)優(yōu)選地是一個(gè)或多個(gè)選自鹵、羥基、烷氧基、芳氧基(aryloxy)和烷基酯。
“鹵素”基團(tuán)是指氟、氯、溴和碘。
“環(huán)烷基”基團(tuán)是指全-碳的單環(huán)或稠環(huán)的(即，共用相鄰碳原子的電子對(duì)的環(huán))基團(tuán)，其中一個(gè)或多個(gè)環(huán)沒(méi)有一個(gè)完全共軛的π-電子系統(tǒng)。環(huán)烷基的例子是，不限于，環(huán)丙烷、環(huán)丁烷、環(huán)戊烷、環(huán)戊烯、環(huán)己烷、金剛烷、環(huán)己二烯、環(huán)庚烷和環(huán)庚三烯(cycloheptatriene)。環(huán)烷基基團(tuán)可被取代或未被取代。當(dāng)被取代時(shí)，每個(gè)取代基基團(tuán)優(yōu)選地是一個(gè)或多個(gè)單獨(dú)選自鹵素和羥基。
如在此處使用的，“雜芳基”是指單環(huán)或在環(huán)中有一個(gè)或多個(gè)原子選自氮、氧和硫的稠合環(huán)(即，共用相鄰碳原子的電子對(duì)的環(huán))，而且此外有一個(gè)完全共軛的π-電子系統(tǒng)。雜芳基的例子是，不限于，吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶、喹啉、異喹啉、嘌呤和咔唑。所述的雜芳基基團(tuán)可被取代或未被取代。當(dāng)被取代時(shí)，每個(gè)取代基基團(tuán)優(yōu)選地是一個(gè)或多個(gè)選自鹵素和羥基。
“羥基”基團(tuán)是-OH。
“烷基醚”基團(tuán)是-O-烷基基團(tuán)，其中術(shù)語(yǔ)“烷基”如以上定義的。
“芳基醚”基團(tuán)或“芳氧基”基團(tuán)是-O-芳基基團(tuán)，其中術(shù)語(yǔ)“芳基”如以上定義的。
“胺”基團(tuán)是-NH2基團(tuán)或-NH-基團(tuán)。
“烷基胺”基團(tuán)是一個(gè)-NH烷基基團(tuán)，其中術(shù)語(yǔ)“烷基”如以上定義的。
“芳基胺”基團(tuán)是一個(gè)-NH芳基基團(tuán)，其中術(shù)語(yǔ)“芳基”如以上定義的。
“烷基酯”基團(tuán)是一個(gè)-C(O)O烷基，其中術(shù)語(yǔ)“烷基”如以上定義的。
“芳基酯”基團(tuán)是一個(gè)-C(O)O芳基，其中術(shù)語(yǔ)“芳基”如以上定義的。
“烷基氨磺?！被鶊F(tuán)是一個(gè)-SO2NH烷基，其中術(shù)語(yǔ)“烷基”如以上定義的。
“芳基氨磺?！被鶊F(tuán)是一個(gè)-SO2NH芳基，其中術(shù)語(yǔ)“芳基”如以上定義的。
“硫羥”基團(tuán)是-SH基團(tuán)。
“烷基硫醚”是-S-烷基基團(tuán)，其中術(shù)語(yǔ)“烷基”如以上定義的。
“芳基硫醚”是-S-芳基基團(tuán)，其中術(shù)語(yǔ)“芳基”如以上定義的。
“亞砜”基團(tuán)是-SO-基團(tuán)。
“砜”基團(tuán)是-SO2-基團(tuán)。
“烷基砜”是一個(gè)-SO2烷基，其中術(shù)語(yǔ)“烷基”如以上定義的。
“芳基砜”是一個(gè)-SO2芳基，其中術(shù)語(yǔ)“芳基”如以上定義的。
“烷基亞砜”是一個(gè)-S(O)烷基，其中術(shù)語(yǔ)“烷基”如以上定義的。
“芳基亞砜”是一個(gè)-S(O)芳基，其中術(shù)語(yǔ)“芳基”如以上定義的。
“羧基”基團(tuán)是-CO2H基團(tuán)。
“烷基羧基”基團(tuán)是-烷基-CO2H基團(tuán)。
“硫酸酯基”基團(tuán)是-OSO3基團(tuán)。
“磺酸酯基”基團(tuán)是-SO(OR)2基團(tuán)。
“磷酸酯基”基團(tuán)是-OPO3基團(tuán)。
“膦酸酯基”基團(tuán)是-P(O)(OR)2基團(tuán)，其中R是氫、烷基或芳基。
“羧酸的酰胺”基團(tuán)是-CO2NR’R”基團(tuán)，其中R’和R”是獨(dú)立地氫、烷基或芳基。
“羧酸的酯”基團(tuán)是-CO2R’基團(tuán)，其中R’是烷基或芳基。
“磷酸的酰胺”基團(tuán)是-OPO2NR’R”基團(tuán)，其中R’和R”是獨(dú)立地氫、烷基或芳基。
“磷酸的酯”基團(tuán)是-OPO2OR’基團(tuán)，其中R’是烷基或芳基。
“磺酸的酰胺”基團(tuán)是-OSO2NR’R”基團(tuán)，其中R’和R”是獨(dú)立地氫、烷基或芳基。
“磺酸的酯”基團(tuán)是-OSO2OR’基團(tuán)，其中R’是烷基或芳基。
“膦酸的酰胺”基團(tuán)是-PO2NR’R”基團(tuán)，其中R’和R”是獨(dú)立地氫、烷基或芳基。
“膦酸的酯”基團(tuán)是-PO2OR’基團(tuán)，其中R’是氫、烷基或芳基。
“氨磺酰”基團(tuán)是-SO2NR’R”基團(tuán)，其中R’和R”是獨(dú)立地氫、烷基或芳基。
“膦酸酰胺”基團(tuán)是-NR’-PO3H。
“羥肟酸(hydroxamic acid)”基團(tuán)是-C(O)NHOH基團(tuán)。
用作粘蛋白抑制劑的特定化合物如下化合物已經(jīng)制備出并已確定有粘蛋白合成抑制劑的活性。
如在實(shí)例中提供的，調(diào)節(jié)、降低或下調(diào)粘蛋白表達(dá)的藥物可用于調(diào)節(jié)伴隨粘蛋白產(chǎn)生的生物和病理學(xué)過(guò)程。
申請(qǐng)人已經(jīng)觀察到，IL9選擇性地誘導(dǎo)粘蛋白基因產(chǎn)物的表達(dá)。因此，對(duì)許多抗原-誘導(dǎo)反應(yīng)是重要的IL9多效作用部分地依賴于AEC中粘蛋白的上調(diào)。當(dāng)IL9的功能被中性抗體治療下調(diào)時(shí)，動(dòng)物肺中能完全地被保護(hù)免受抗原-誘導(dǎo)反應(yīng)。這些反應(yīng)包括伴隨著粘液的過(guò)量生成的支氣管高反應(yīng)性、嗜酸性粒細(xì)胞和支氣管灌洗中的細(xì)胞數(shù)目增加、血清IgE的增加、肺中伴隨炎癥的組織學(xué)變化、和杯狀細(xì)胞和黏膜下層腺細(xì)胞增生。IL9的下調(diào)和類似氣喘的反應(yīng)伴隨著粘蛋白表達(dá)的下調(diào)(圖10)。因此，通過(guò)下調(diào)粘蛋白生成來(lái)治療上述反應(yīng)的方法在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)，所述反應(yīng)是哮喘發(fā)病的基礎(chǔ)并以伴隨這種紊亂的過(guò)敏炎癥為特征。
對(duì)IL9轉(zhuǎn)基因鼠氣道的組織學(xué)分析表明粘蛋白在非纖毛的上皮細(xì)胞中過(guò)量生成(Temann等人，1998；Louahed等人，2000)。粘蛋白在IL9轉(zhuǎn)基因鼠肺中的誘導(dǎo)說(shuō)明IL9促進(jìn)這些細(xì)胞的粘液產(chǎn)生(見圖8)?；罨疌aco2細(xì)胞中表達(dá)MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5B和MUC5AC的mRNA，已經(jīng)生產(chǎn)并用于測(cè)試粘液生成的抑制劑。這些細(xì)胞能用過(guò)碘酸席夫染色反應(yīng)(PAS)染色。如圖1A所示，未處理的活化Caco2細(xì)胞明顯地染色為PAS陽(yáng)性粘蛋白糖配體。對(duì)照和活化的細(xì)胞在尼氟酸(NFA)或4，4’-二異硫氰-2，2’-二磺酸芪(DIDS)存在下培養(yǎng)。與未處理的細(xì)胞比較(圖1D與1B比較)，抑制劑處理的活化細(xì)胞經(jīng)PAS染色顯示陽(yáng)性染色糖配體顯著減少。
隨著證明了哮喘中對(duì)粘蛋白下調(diào)的治療可能性，申請(qǐng)人也認(rèn)識(shí)到在囊性纖維化中對(duì)粘蛋白下調(diào)的治療可能性?；加心倚岳w維化的病人特征為粘稠分泌物的肺病紊亂，其能導(dǎo)致氣道堵塞和吸入的致病微生物的隨后移生和感染(Eng等人，1996)。申請(qǐng)人因此提供由下調(diào)肺里粘蛋白產(chǎn)生而治療囊性纖維化的一種方法。
在囊性纖維化里粘蛋白的過(guò)量產(chǎn)生也存在于胰腺管的堵塞，其阻止消化酶向GI道的輸送而導(dǎo)致吸收障礙綜合癥、脂肪痢和腹瀉。因此申請(qǐng)人也提供通過(guò)下調(diào)胰腺里粘蛋白產(chǎn)生而治療囊性纖維化的方法。
申請(qǐng)人也證明在慢性支氣管炎和肺氣腫中對(duì)粘蛋白下調(diào)的治療可能性?；加新灾夤苎缀头螝饽[的病人特征為粘稠分泌物的肺病，其能導(dǎo)致氣道堵塞和吸入的致病微生物的隨后移生和感染(Eng等人，1996)。申請(qǐng)人因此提供通過(guò)下調(diào)肺里粘蛋白產(chǎn)生而治療慢性支氣管炎和肺氣腫的方法。
如在此處使用的，受試者可以是任何哺乳動(dòng)物，只要所述哺乳動(dòng)物需要調(diào)節(jié)由粘蛋白生成介導(dǎo)的病理學(xué)和生物學(xué)過(guò)程。術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”是指屬于哺乳類綱的個(gè)體。本發(fā)明對(duì)治療人類患者尤其有用。
病理學(xué)過(guò)程是指生物學(xué)過(guò)程的產(chǎn)生有害效果的一種類型。例如，本發(fā)明的粘蛋白過(guò)量產(chǎn)生可能伴隨著呼吸疾病，包括慢性阻塞肺部疾病(COPD)、炎癥肺病、囊性纖維化和一種急性或慢性的傳染病。COPD包括，但不限于支氣管炎、哮喘和肺氣腫。粘蛋白過(guò)量生成也可能伴隨著胃腸疾病例如歸因于膽汁郁積的肝臟衰竭、胃腸堵塞、存在于囊性纖維化的吸收障礙綜合癥、脂肪痢和腹瀉和其它紊亂。
如在此處使用的，當(dāng)所述藥劑降低所述過(guò)程的水平或其嚴(yán)重度時(shí)，藥物認(rèn)為是調(diào)節(jié)病理學(xué)過(guò)程的。例如，以某種方式施用藥物降低或調(diào)節(jié)粘蛋白的合成、水平和/或過(guò)量產(chǎn)生，氣道堵塞可預(yù)防或疾病的發(fā)展受到調(diào)節(jié)。
藥用組合物本發(fā)明的藥物能單獨(dú)地提供、或與其它調(diào)節(jié)特定病理過(guò)程的藥物組合提供。例如，本發(fā)明的藥物能與抗哮喘藥物組合施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物能與祛痰藥、粘液溶解劑、抗生素、抗組胺藥或減充血?jiǎng)┙M合施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物能與表面活性劑、穩(wěn)定劑、吸收強(qiáng)化劑、β-腎上腺受體或嘌呤受體拮抗劑或芳香劑或其它增加組合物適口性的藥物組合施用。作為例子，除了活性組分以外，本發(fā)明的組分可含有諸如愈創(chuàng)甘油醚等的祛痰藥、諸如環(huán)狀糊精等的穩(wěn)定劑和/或諸如殼聚糖等的吸收強(qiáng)化劑。任何這種藥劑可用在本發(fā)明的治療組合物中。
如在此處使用的，當(dāng)藥物同時(shí)施用或以藥物同時(shí)起效的方式獨(dú)立地施用，兩種或多種藥物稱為組合施用。
在本發(fā)明的治療方法中使用的化合物可以是全身施用或局部施用，這取決于要治療的病癥、特定位置治療的需要、將要施用藥物的量等考慮和類似的需要考慮的事項(xiàng)。例如，本發(fā)明的藥物能通過(guò)非腸道、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、透皮、局部、或口腔途徑施用。可選地，或同時(shí)地，由口部或鼻部途徑或直接向肺部施用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物可通過(guò)吸入而施用。對(duì)吸入治療的化合物可在用于以液體氣霧劑施用的溶液中、壓力定量氣霧劑中，或合適形式的干粉吸入器中。施用劑量取決于接受者的年紀(jì)、健康、和體重、同時(shí)治療的類型，如果有也取決于治療的頻率、和期望效果的性質(zhì)。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物可被制成氣霧劑。藥物氣霧劑制劑對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是常規(guī)的(例如參見，Sciarra，J.in雷氏藥學(xué)理論與實(shí)踐(RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy)，20thEdition，Mack Publishing Company，Easton，PA)。藥物可制備成溶液氣霧劑、分散或懸浮干粉氣霧劑、乳膠或半固體制劑。氣霧劑可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何推進(jìn)系統(tǒng)來(lái)運(yùn)輸。氣霧劑可以應(yīng)用于上呼吸道、例如由鼻部吸入，或應(yīng)用于下呼吸道或應(yīng)用于兩者。
在本發(fā)明的其它優(yōu)選實(shí)施方案中，治療藥劑可以制成顆粒或微粉化以提高生物利用度和消化吸收。特別是，他尼氟酯可以使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制成顆?；蛭⒎刍黾夹g(shù)包括討論于Chaumeil，J.C.等人，MethodsFind.Exp.Clin.Pharmacol.20(3)211-215(1998)的方法。在這個(gè)過(guò)程中，本發(fā)明的他尼氟酯或其它藥劑的磨碎可在常規(guī)類型的球磨機(jī)或錘磨機(jī)進(jìn)行。這些步驟也可由在氣態(tài)噴射微粉器的微粉化實(shí)現(xiàn)，其優(yōu)點(diǎn)是不對(duì)待微粉化的物質(zhì)加熱。
在其它實(shí)施方案中，可以采用任何常用的局部制劑例如溶液、懸浮液、凝膠、軟膏或油膏及類似物。這些局部制劑的制備詳盡描述于藥物制劑領(lǐng)域如舉例說(shuō)明于雷氏藥學(xué)大全(Remington’s Pharmaceutical Sciences)。對(duì)局部應(yīng)用，這些化合物也可以顆?；驀娡俊⒂绕涫且詺忪F劑形式施用。
活性成分可通過(guò)適合全身施用的藥用組合物來(lái)施用。如眾所周知的，如果藥物要被全身施用，它可以被配制為散劑、丸劑、片劑、膠囊、或類似物或口服的糖漿或酊劑。為了靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或損害部?jī)?nèi)的施用，化合物將制備為能由注射施用的溶液或懸浮液。在一些情況下，這些化合物制備成栓劑形式或作為以沉積在皮下或肌內(nèi)注射的緩釋制劑。
組合物或藥物含有的有效量是將減少、降低或下調(diào)粘蛋白活化、通道的粘蛋白活化、功能、穩(wěn)定或合成，包括依賴ICACC氯通道的粘蛋白活化、功能、穩(wěn)定或合成。所給的有效量將因情況而改變，在一定范圍內(nèi)可以隨著被治療病情的嚴(yán)重度和所治療病人對(duì)治療的敏感性而變動(dòng)。因此，所給有效的量將最好通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)而在當(dāng)時(shí)當(dāng)?shù)卮_定。然而，預(yù)期在根據(jù)本發(fā)明對(duì)慢性阻塞肺部障礙的治療中，含有重量百分比0.001至5，優(yōu)選大約0.01至1％的制劑，通常將構(gòu)成治療有效量。當(dāng)全身施用時(shí)，每千克體重每天0.01至100毫克，但優(yōu)選地大約0.1至10mg/kg/天的量將在多數(shù)情況下有治療效果。
當(dāng)由吸入施用時(shí)，每千克體重每天0.01至100毫克，但優(yōu)選大約0.1至10mg/kg/天的量將在多數(shù)情況下有治療效果。在一些情況下，一個(gè)定量氣霧劑單位含有大約0.8毫克的本發(fā)明化合物，如他尼氟酯。在這種制劑中，對(duì)成年人的維持劑量是大約每次2個(gè)吸入劑量單位(大約1.6毫克)，每天兩次(大約3.2毫克)。
本發(fā)明也包括含有本發(fā)明的所述化合物及藥物上可接受的載體的藥用組合物。藥物上可接受的載體可以是無(wú)菌液體，例如水和油，油包括石油、動(dòng)物或合成來(lái)源的，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油和類似物。當(dāng)藥用組合物靜脈內(nèi)或由吸入施用時(shí)水是優(yōu)選的載體。鹽或磷酸緩沖鹽也可以采用作為載體，尤其是由氣霧劑吸入。乳酸鹽溶液和含水的葡萄糖以及甘油溶液也能可用作液體載體，尤其是為注射液。適合的藥物載體描述于書雷氏藥學(xué)理論與實(shí)踐(Remington，The Science and Practice ofPharmacy)，20thEdition，Mack Publishing Company，Easton，PA中。
除了藥物學(xué)活性的藥物，本發(fā)明的組合物可以含有適合的藥物上可接受的載體，所述載體包括能促進(jìn)活性化合物進(jìn)入制劑的過(guò)程的賦形劑和輔助物，所述制劑能用于藥物上向作用位點(diǎn)傳輸。適合非腸道施用的制劑包括活性化合物在水溶形式的含水溶液，例如水溶鹽。此外，作為合適的含油的注射懸浮液的活性化合物的懸浮液可被施用。適合的親脂溶劑或媒介包括油脂例如芝麻油、或合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯。含水的注射懸浮液可以含能提高懸浮液的粘度的物質(zhì)，所述懸浮液包括例如羥甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。任意地，所述懸浮液也可以含有如上所述的穩(wěn)定劑。脂質(zhì)體也能被用于包裹所述藥劑以運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞。
如以上討論的，根據(jù)本發(fā)明的用于全身施用的藥物制劑可配制成以腸道、非腸道或局部施用。事實(shí)上，所有三種類型的制劑可以同時(shí)使用以達(dá)到活性成分的全身施用。
用于口服的合適制劑包括硬或軟明膠膠囊、劑丸、片劑、包括包衣片、酊劑、懸浮液、糖漿或吸入物和其控釋形式。用于口部吸入或鼻部吸入的適合的制劑包括帶有或不帶有本領(lǐng)域中熟知賦形劑的水性溶液。
本發(fā)明的治療或藥用的組合物或制劑可與說(shuō)明書和標(biāo)簽包裝在容器、藥瓶、吸入裝置等中，該說(shuō)明書或標(biāo)簽指出所述組合物或制劑能通過(guò)減輕支氣管分泌、經(jīng)增加黏液流動(dòng)來(lái)潤(rùn)滑受刺激的呼吸道膜和/或促進(jìn)粘性的、濃厚的粘液的減少產(chǎn)生和移除來(lái)促進(jìn)下部呼吸道的排除。所述標(biāo)簽或指示也指出適應(yīng)癥或用法如維持此處描述的多種病癥的癥狀緩解，所述病癥包括但不限于，調(diào)節(jié)嚴(yán)重哮喘、慢性支氣管炎、囊性纖維化、上下呼吸道感染、粘蛋白相關(guān)的胃腸道病癥、和其它由呼吸道、胃腸系統(tǒng)或體內(nèi)其它地方存在的粘性粘液的持續(xù)而并發(fā)的癥狀。
本發(fā)明的裝置可以是任何適用于將一種或多種治療組合物引入上部和/或下部呼吸道的裝置。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的裝置可以是定量吸入器。該裝置可以適用于本發(fā)明的治療組合物，以均勻分散的液體、泡沫或粉末的霧形式的的運(yùn)輸。該裝置可以使用任何本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的推進(jìn)系統(tǒng)包括但不限于泵、液化氣、壓縮氣和類似系統(tǒng)。本發(fā)明的裝置典型地包括帶有一個(gè)或多個(gè)閥們的容器和控制流動(dòng)的調(diào)節(jié)器，藥用組合物流動(dòng)通過(guò)閥們。適合用在本發(fā)明的裝置可見于，例如書雷氏藥學(xué)理論與實(shí)踐(RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy)，19thEdition，Chapter 95，pp.1676-1692，Mack Publishing Co.，Easton，PA 1995中。
本發(fā)明的操作可采用分子生物學(xué)、藥物學(xué)、免疫和生物化學(xué)的常規(guī)方式和技術(shù)，這些屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的普通技能。例如，見于書Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(Molecular CloningA Laboratory Manual)，3ndEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001中。
不需要進(jìn)一步的描述，相信一個(gè)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員使用上述的描述和下面的說(shuō)明性實(shí)例，能制造和使用本發(fā)明的所述化合物和操作要求的方法。因此下述的操作例子特定地指出本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，而并不應(yīng)理解為以任何方式限制所述公開的范圍。
合成實(shí)施例實(shí)施例1從鄰氨基苯甲酸或2-氨基煙酸合成粘蛋白合成抑制劑這類粘蛋白合成抑制劑的制備通過(guò)以下方案完成 這類粘蛋白合成抑制劑的制備由以下通用方案實(shí)現(xiàn)。主要不同在于制備β-酮膦酸酯。制備環(huán)酐以得到含二芳基胺的類似物。從甲基酯直接制備膦酸酯的嘗試結(jié)果相當(dāng)差。收率不穩(wěn)定且低。從靛紅酸酐制備膦酸酯的結(jié)果有改進(jìn)。對(duì)其它二芳基醚和硫醚類似物，甲基酯得到滿意的結(jié)果。
這些化合物的通用合成方案如下
實(shí)施例3 制備β-酮膦酸酯-78℃時(shí)在TNF中制備二甲基甲基膦酸根的陰離子。丁基鋰加入膦酸酯的溶液中，其中添加痕量三苯甲烷作為指示劑。用注射器緩慢加入丁基鋰直到出現(xiàn)微弱的紅-粉紅色。保持反應(yīng)溫度在-78℃下甲基酯或酐逐滴地由添加漏斗添加到反應(yīng)中。反應(yīng)在-78℃下攪拌直到用薄層色譜分析法(TLC)測(cè)試不再顯現(xiàn)酐酯。通過(guò)反復(fù)萃取膦酸酯分離到多種有機(jī)物中。由于這些化合物的極性通常需要從含水層鹽析它們以獲得滿意的回收。有機(jī)物層用Na2SO4干燥，且真空除去溶劑。以這種方式分離的粗產(chǎn)物在多數(shù)情況下的純度足以繼續(xù)而不必進(jìn)一步的純化。
實(shí)施例4制備α，β-不飽和酮在THF中從酮膦酸酯里制備膦酸酯負(fù)碳離子，通常使用NaOtBu作為堿。在0℃至室溫下在THF里預(yù)混合膦酸酯和堿。在堿溶解之后，添加醛之前，反應(yīng)在室溫?cái)嚢璐蠹s5分鐘。反應(yīng)通常在室溫下持續(xù)24小時(shí)至完成。
實(shí)施例5內(nèi)酯和游離酸的制備內(nèi)酯優(yōu)選地從苯甲酸2-甲醛(carboxaldehyde)的4-甲氧芐基酯制備。內(nèi)酯溶解在少量的CH2Cl2/TFA 50/50中。溶液隨著反應(yīng)進(jìn)行，迅速呈現(xiàn)紅-紫色。在多數(shù)例子中裂解在最初15分鐘內(nèi)完成。環(huán)的閉合在反應(yīng)和操作(workup)中自發(fā)地進(jìn)行。所述操作包括把反應(yīng)內(nèi)容物倒入含有H2O和適當(dāng)有機(jī)物的分液漏斗中。用水反復(fù)洗滌有機(jī)物以除去大量的TFA。Na2SO4干燥有機(jī)物并過(guò)濾。真空除去溶劑。殘余物通常能從任何量的溶劑中重結(jié)晶，以分離得到滿意產(chǎn)量純度的內(nèi)酯。
如實(shí)施例1從芐基酯產(chǎn)生游離酸。與芐基酯的氫化作用相比，由于相對(duì)比例的烯烴氫化作用的功能，這種途徑既提供內(nèi)酯又提供游離酸。該反應(yīng)通常在乙醇乙酸乙酯混合物回流中進(jìn)行。如果甲酸用作還原劑，且碳上的鈀作為催化劑，內(nèi)酯只有緩慢地還原為飽和游離酸。如果在類似條件下用甲酸銨作還原劑，反應(yīng)會(huì)更猛烈，而且內(nèi)酯會(huì)被進(jìn)一步還原為飽和游離酸，但如果煙酸酯系統(tǒng)存在不應(yīng)該被還原。
實(shí)施例6氨磺酰類似物的制備氨磺酰類似物由實(shí)施例1和5中使用的化學(xué)類似物來(lái)制備。主要區(qū)別是氨磺酰取代2-苯甲酸甲醛的羧酸酯官能團(tuán)。從鄰磺酰苯甲酰亞胺通過(guò)如下表示的途徑制備類似物構(gòu)建單元(building block)
實(shí)施例7他尼氟酯對(duì)映體的分離這個(gè)研究的目標(biāo)是通過(guò)使用普通相的手性色譜法分離，第一次鑒定他尼氟酯的立體異構(gòu)體(圖25)。使用多種市售的柱子，測(cè)試不同的流動(dòng)相，這些流動(dòng)相含有不同比例的一種或多種流動(dòng)相包括己烷、氯仿、和異丙醇。
實(shí)驗(yàn)用材料和方法試劑己烷(Burdick和Jackson Lot BP804)、異丙醇(Burdick和Jackson，Lot BQ125)、氯仿(G.J Chemical Company，Lot 2883)、他尼氟酯參考標(biāo)準(zhǔn)(Batch E001)材料使用了下述的Phenomenex的Chirex柱。柱的尺寸是50mm×4.6mm。
流動(dòng)相使用己烷、氯仿、和異丙醇以不同比例制備多種流動(dòng)相。
測(cè)試樣品的制備以1.1mg/ml的濃度制備他尼氟酯母液。稀釋溶劑是己烷和氯仿1∶1的混合物。從這種母液制備兩種不同測(cè)試濃度。一種是0.11mg/ml，另一種是0.055mg/ml。
結(jié)果他尼氟酯的分離取決于可變相組分、流動(dòng)率和柱的類型。對(duì)測(cè)試的5種柱，只有OOB-3020-EO柱((S)-亮氨酸和(R)-萘基甘氨酸)得到了對(duì)(+)(-)他尼氟酯對(duì)映體的適合的分離。色譜分析圖樣品顯示在圖24。流動(dòng)相由己烷∶氯仿∶異丙醇(37.5∶37.5∶24)組成。流動(dòng)率是0.2mL/min。在287nM檢測(cè)。注射體積是5微升。他尼氟酯的濃度是0.055mg/mL。每個(gè)峰相應(yīng)的峰面積和峰高度是等強(qiáng)度的與注射的他尼氟酯是外消旋混合物一致。測(cè)試了其它的柱和條件，包括不同流動(dòng)相條件，在每種情況下觀察到單獨(dú)的他尼氟酯色譜峰。
結(jié)論我們已經(jīng)成功地分離了他尼氟酯的對(duì)映體。
生物學(xué)實(shí)例實(shí)施例1在為過(guò)量產(chǎn)生粘蛋白活化的Caco2細(xì)胞中NFA抑制粘蛋白生成表達(dá)MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5B和MUC5AC的mRNA的活化的Caco2細(xì)胞已經(jīng)產(chǎn)生，并用于測(cè)試粘蛋白生成抑制劑。這些細(xì)胞能夠用過(guò)碘酸席夫染色反應(yīng)(PAS)對(duì)粘蛋白染色。如圖1所示，盡管Caco2對(duì)照細(xì)胞系表現(xiàn)出基本的PAS染色帶有分散的少量配糖體小泡(板A)，Caco2細(xì)胞的活化顯著地增加PAS陽(yáng)性粘蛋白配糖體的數(shù)目和強(qiáng)度(板B)?；罨腃aco2對(duì)照細(xì)胞在尼氟酸(NFA)或4，4’-二異硫氰-2，2’-二磺酸芪(DIDS)存在下培養(yǎng)。在指示濃度(NFA100μm和DIDS300μm)，抑制劑處理的活化Caco2細(xì)胞的PAS染色顯示與未處理的細(xì)胞比較，陽(yáng)性染色粘蛋白配糖體顯著減少(圖1D與1B比較)。此外，在對(duì)照細(xì)胞中看到微弱染色也被抑制了(圖1C與1A比較)。活化Caco2細(xì)胞的粘蛋白產(chǎn)生也被其它芬那酯如氟芬那酸酯(Flufenamate)(FFA)、托芬那酸酯(Tolfenamate)(TFLA)抑制和部分地被美芬那酸酯(Mefenamate)(MFA)和甲氯芬那酸酯(Meclofenamate)(MLFA)抑制(圖2)。相關(guān)的化合物萘普生(Naproxen)和舒林酸(Sulindac)無(wú)效。在NFA處理的細(xì)胞中粘蛋白生成的減少不歸因于細(xì)胞生理狀態(tài)的顯著改變，因?yàn)樗鼈兊拇婊疃炔⒉皇苡绊?，即使在更高的NFA濃度下(圖3)?？傊?，結(jié)果是與這些藥物抑制上皮細(xì)胞活性是一致的。而且，結(jié)果清楚地證明NFA和其類似物(圖11表示的苯基鄰氨基苯甲酸衍生物)、DIDS、和SIDS對(duì)粘液過(guò)量生成的直接效果，粘液過(guò)量生成是多種慢性阻塞肺部病癥的特征。
實(shí)施例2通過(guò)為過(guò)量產(chǎn)生粘蛋白活化的Caco2細(xì)胞，NFA抑制嗜酸細(xì)胞活化趨化因子(eotaxin)產(chǎn)生表達(dá)并分泌嗜酸細(xì)胞活化趨化因子的活化LHL4細(xì)胞已經(jīng)產(chǎn)生并用于測(cè)試嗜酸細(xì)胞活化趨化因子生成的抑制劑。這些細(xì)胞在體外用本領(lǐng)域熟知的ELISA技術(shù)(R&D Systems)對(duì)嗜酸細(xì)胞活化趨化因子測(cè)定。如圖4所示，活化的LHL4細(xì)胞在缺乏(對(duì)照)或存在濃度增加的尼氟酸(NFA)中培養(yǎng)。注意到嗜酸細(xì)胞活化趨化因子伴隨著NFA濃度的增加產(chǎn)生的顯著抑制。在對(duì)DIDS和SIDS相同實(shí)驗(yàn)中，可觀察到同樣的抑制。Mad/C3細(xì)胞表現(xiàn)出NFA、DIDS和SIDS的對(duì)嗜酸性細(xì)胞趨化因子產(chǎn)生的抑制?？傊?，這些結(jié)果清楚證明NFA對(duì)嗜酸細(xì)胞活化趨化因子產(chǎn)生的直接效果。
實(shí)施例3在鼠哮喘模型中由NFA抑制粘蛋白過(guò)量生成證明為無(wú)病毒的雄性和雌性以下株系DBA、C57B6和B6D2F1的鼠購(gòu)自國(guó)家癌癥研究院(National Cancer Institute)或JacksonLaboratories(Bar Harbor ME)。IL-9轉(zhuǎn)基因鼠(Tg5)和它們的親本株系(FVB)，從Ludwig Institute(Brussels，Belgium)得到。動(dòng)物被圈養(yǎng)在高密度的、充滿顆粒的空氣場(chǎng)所，并在實(shí)驗(yàn)操作前允許自由地接觸食物和水3至7天。動(dòng)物場(chǎng)所保持在22℃并且光黑暗周期被自動(dòng)控制(10∶14小時(shí)光∶黑暗)。
表現(xiàn)型和預(yù)處理的功效動(dòng)物或不預(yù)處理或者鼻部吸入煙色曲霉菌(Aspergillus fumigatus)抗原而致敏以評(píng)價(jià)對(duì)支氣管高反應(yīng)性的預(yù)處理、支氣管肺泡灌洗(Bronchoalveolar Lavage)液的組合物、粘蛋白產(chǎn)生和血清IgE的效果。鼠以曲霉菌或鹽，鼻內(nèi)激發(fā)(在第0、7、14、21和22天)并在最后給藥24小時(shí)后觀察表現(xiàn)型。致敏鼠在0-21天以PBS或100μgNFA氣管內(nèi)滴注(IT)治療。在肺中粘液產(chǎn)生和粘蛋白表達(dá)的抑制被用來(lái)評(píng)價(jià)NFA治療效果，或能用于評(píng)價(jià)其它待選藥物的治療效果。為了確定支氣管收縮(bronchoconstrictor)反應(yīng)，在使用藥物之前和過(guò)程中，在氣管測(cè)定并記錄呼吸系統(tǒng)壓。鼠被麻醉并如前所述的操作。(Levitt等人，1988；Levitt和Mitzner，1989；Kleeberger等人，1990；Levitt，1991；Levitt和Ewart，1995；Ewart等人，1995)。氣道的反應(yīng)性由以下的一種或多種測(cè)量5-羥基色胺、乙酰膽堿、阿曲庫(kù)銨(atracurium)或P物質(zhì)類似物。在支氣管收縮刺激之后對(duì)峰值呼吸壓改變的簡(jiǎn)單可重復(fù)的測(cè)量得到使用，這種方法已經(jīng)被定義為氣道壓力時(shí)間指數(shù)(APTI)(Levitt等人，1988；Levitt和Mitzner，1989)。APTI通過(guò)峰值呼吸壓從注射時(shí)間到峰值壓力回到基線或穩(wěn)定水平的變化來(lái)評(píng)價(jià)。APTI可與氣道阻力相比較，然而，APTI包括涉及從支氣管收縮復(fù)原的額外組分。
在處死之前，在麻醉動(dòng)物的下方腔靜脈針刺收集全血以測(cè)量血清IgE。樣品離心以分離細(xì)胞，收集血清并用于測(cè)量總IgE水平。未測(cè)量的樣品立即凍于-20℃。
所有IgE血清樣品使用一種ELISA抗體-三明治試驗(yàn)測(cè)量。微孔板由在碳酸鈉-碳酸氫鈉以及疊氮化鈉包被緩沖液中的濃度為2.5μg/ml的鼠抗鼠IgE抗體(Southern Biotechnolo)來(lái)包被，每孔50μl。板被保鮮膜覆蓋并在4℃培養(yǎng)16小時(shí)。板用磷酸緩沖鹽中的0.05％Tween-20清洗緩沖液沖洗3次，每次沖洗培養(yǎng)5分鐘。非特異結(jié)合位點(diǎn)的固定由添加200μl每孔5％磷酸緩沖鹽中的牛血清白蛋白、保鮮膜覆蓋并在37℃下培養(yǎng)2小時(shí)實(shí)現(xiàn)。在用清洗緩沖液洗了3次之后，重復(fù)的50μl測(cè)試樣品添加到每個(gè)孔。測(cè)試樣品用清洗緩沖液中的5％牛血清白蛋白稀釋1∶10、1∶50和1∶100之后測(cè)定。除了測(cè)試樣品之外，清洗緩沖液中的5％牛血清白蛋白中濃度從0.8ng/ml到200ng/ml的一套IgE標(biāo)準(zhǔn)(PharMingen)，也被測(cè)定以得到一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。無(wú)樣品或標(biāo)準(zhǔn)的空白被用來(lái)對(duì)讀板器(背景)調(diào)零。在添加樣品和標(biāo)準(zhǔn)品后，板用保鮮膜覆蓋并在室溫下培養(yǎng)2小時(shí)。在用清洗緩沖液洗3次之后，50μl二抗鼠抗鼠IgE-辣根(horseradish)過(guò)氧化物酶配體以250ng/ml的濃度添加到5％牛血清白蛋白的清洗緩沖液中。板用保鮮膜覆蓋并在室溫下培養(yǎng)2小時(shí)。在用清洗緩沖液洗3次之后，100μl底物0.1M檸檬酸鹽中的0.5mg/ml o-苯二胺添加到每個(gè)孔。在反應(yīng)5-10分鐘后用50μl 12.5％硫酸終止，用MR5000讀板器(Dynatech)測(cè)量490nm的吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)IgE濃度和抗原濃度在x軸(尺度取對(duì)數(shù))而吸光度在y軸(尺度為線性)來(lái)構(gòu)建。樣品中IgE的濃度從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到。
如前所述的支氣管肺泡灌洗(Bronchoalveolar Lavage)(BAL)和細(xì)胞內(nèi)分析已經(jīng)預(yù)先形成(Kleeberger等人，1990)。肺部組織學(xué)的研究或者在肺部在原位充滿固定液和置于福爾馬林中后，或者在取出并立即凍在液氮里之后。因?yàn)橹暗牟僮骺梢詭?lái)人為影響，對(duì)這些研究使用不同的動(dòng)物。因此，一小組動(dòng)物與接受不同預(yù)處理的群體受到完全平行的對(duì)待，除了這些動(dòng)物不用于支氣管反應(yīng)性試驗(yàn)之外的其它試驗(yàn)。在支氣管反應(yīng)性試驗(yàn)后，取出肺部并如上所述的沉入液氮中。以對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的方式進(jìn)行凍干切片、染色和組織學(xué)檢查。
NFA，能在體外阻滯上皮細(xì)胞活化和下調(diào)粘蛋白和嗜酸性細(xì)胞趨化因子的生成，治療上用于由BAL評(píng)估上皮細(xì)胞在體內(nèi)活化的重要性，對(duì)鼠的抗原-誘導(dǎo)的粘蛋白產(chǎn)生、支氣管反應(yīng)性、血清IgE、和氣道發(fā)炎。NFA治療的效果，對(duì)氣道反應(yīng)性、BAL、粘液產(chǎn)生、和血清IgE水平，相對(duì)于介質(zhì)治療的對(duì)應(yīng)對(duì)照得到確定。圖5和6表示NFA能夠分別抑制氣道高反應(yīng)性和BAL肺部嗜酸性粒細(xì)胞，然而，對(duì)血清IgE水平?jīng)]有效果。此外NFA也能抑制由暴露于抗原導(dǎo)致的肺中粘液過(guò)量產(chǎn)生(圖7)。
實(shí)施例4由IL9在轉(zhuǎn)基因鼠的上皮活化產(chǎn)生粘液過(guò)量產(chǎn)生和粘蛋白基因上調(diào)藥物篩選模型證明為無(wú)病毒的雄性和雌性5-6周齡IL9轉(zhuǎn)基因鼠(IL9TG5-FVB/N)由本實(shí)驗(yàn)室繁殖。5-6周齡雄性和雌性FVB/N鼠購(gòu)自JacksonLaboratories(Bar Harbor ME)。動(dòng)物被圈養(yǎng)在高密度的、充滿顆粒的空氣場(chǎng)所，并在實(shí)驗(yàn)操作前允許自由地接觸食物和水3至7天。動(dòng)物場(chǎng)所保持在22℃并且光黑暗周期被自動(dòng)控制(10∶14小時(shí)光∶黑暗)。
表現(xiàn)型和治療功效動(dòng)物是顯型的、無(wú)處理的、或經(jīng)過(guò)接受氣道內(nèi)(IT)shame(介質(zhì))治療之后24小時(shí)或與同樣治療的對(duì)照中使用同樣介質(zhì)的藥物后24小時(shí)。鼠每天一次IT治療，治療3天。NFA(100μg)或IL-9的抗體施用于PBSIT。治療反應(yīng)用組織學(xué)檢查(多于10個(gè)部分的PAS染色穿過(guò)治療的和對(duì)照肺部或來(lái)自同一肺部的表達(dá)MUC1、MUC2和MUC3的Western blot)測(cè)量粘蛋白抑制來(lái)計(jì)算。
圖8表示與對(duì)照FVB鼠比較IL-9轉(zhuǎn)基因鼠組成型地過(guò)量表達(dá)粘蛋白。從發(fā)生在哮喘的IL-9轉(zhuǎn)基因(圖8)(無(wú)處理和介質(zhì)對(duì)照)中組成型粘蛋白產(chǎn)生的高水平向FVB/N肺部(普通陽(yáng)性對(duì)照)中相比而言較低的基線粘蛋白產(chǎn)生的降低，認(rèn)為對(duì)任何藥物都是顯著的。在IL9轉(zhuǎn)基因中粘液生成的上調(diào)是特定地伴隨著MUC2和MUC5AC增加的穩(wěn)定態(tài)mRNA水平，如RT-PCR所示(圖9)。
中性的IL-9抗體表現(xiàn)為在IL9轉(zhuǎn)基因肺部的粘蛋白生成上造成的明顯的降低(圖10)。NFA也在這個(gè)模型中降低粘蛋白生成。
實(shí)施例5他尼氟酯在鼠哮喘模型中對(duì)粘蛋白過(guò)量生成的抑制證明為無(wú)病毒的雄5-6周齡性B6D2F1鼠購(gòu)自Jackson Laboratories(Bar Harbor ME)。動(dòng)物被圈養(yǎng)在高密度的、充滿顆粒的空氣場(chǎng)所，并在實(shí)驗(yàn)操作前允許自由地接觸食物和水5至7天。動(dòng)物場(chǎng)所保持在22℃并且光∶黑暗周期被自動(dòng)控制(12∶12小時(shí)光∶黑暗)。
表現(xiàn)型和治療功效動(dòng)物被任意地喂含有他尼氟酯的鼠食或常規(guī)的鼠食。動(dòng)物或不致敏或者鼻部吸入煙色曲霉菌(Aspergillus fumigatus)抗原而致敏來(lái)評(píng)價(jià)對(duì)支氣管高反應(yīng)性的預(yù)處理、支氣管肺泡灌洗(Bronchoalveolar Lavage)液組合物、粘蛋白產(chǎn)生和血清IgE的效果。鼠以曲霉菌或鹽，鼻內(nèi)激發(fā)(在第0、7、16和17天)并在最后給藥24小時(shí)后觀察表現(xiàn)型。在肺中粘液生成的抑制用來(lái)評(píng)價(jià)他尼氟酯治療效果，或用于評(píng)價(jià)其它待選藥物的治療效果。為了確定支氣管收縮反應(yīng)，在使用藥物之前和過(guò)程中，在氣管測(cè)定并記錄呼吸系統(tǒng)壓。鼠被麻醉并如前所述的操作。(Levitt等人，1988；Levitt and Mitzner，1989；Kleeberger等人，1990；Levitt，1991；Levitt和Ewart，1995；Ewart等人.，1995)。
氣道的反應(yīng)性由以下的一種或多種測(cè)量5-羥基色胺、乙酰膽堿、阿曲庫(kù)銨或P物質(zhì)類似物。簡(jiǎn)單可重復(fù)的在支氣管收縮刺激之后對(duì)峰值呼吸壓改變的測(cè)量得到使用，這種方法已經(jīng)被定義為氣道壓力時(shí)間指數(shù)(APTI)(Levitt等人，1988；Levitt and Mitzner，1989)。APTI通過(guò)峰值呼吸壓從注射時(shí)間直到峰值壓力回到基礎(chǔ)線或穩(wěn)定水平的變化評(píng)價(jià)。APTI可與氣道阻力相比較，然而，APTI包括涉及從支氣管收縮復(fù)原額外的組分。如前所述的支氣管肺泡灌洗(Bronchoalveolar Lavage)(BAL)和細(xì)胞內(nèi)分析已經(jīng)預(yù)先形成(Kleeberger等人，1990)。肺部組織學(xué)的研究或者在肺部在原位充滿固定液和置于福爾馬林中后，或者在取出并立即凍在液氮里之后。在支氣管反應(yīng)性試驗(yàn)后，取出肺部并如上所述的沉入液氮中。以本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的方式進(jìn)行凍干切片、染色和組織學(xué)檢查。治療反應(yīng)由測(cè)定組織學(xué)試驗(yàn)(對(duì)治療和對(duì)照肺部的PAS染色)的粘蛋白抑制而測(cè)量。
他尼氟酯的口部治療減少粘蛋白染色。圖15A顯示從喂食常規(guī)鼠食的致敏(Asp-sens)鼠得到的鼠肺PAS染色。圖15B顯示從喂食含有他尼氟酯的鼠食的致敏(Asp-sens)鼠得到的結(jié)果。圖16表示由支氣管肺泡灌洗(Bronchoalveolar Lavage)得到的喂食包被他尼氟酯的鼠食對(duì)肺部嗜酸性粒細(xì)胞的結(jié)果。與喂標(biāo)準(zhǔn)鼠食的致敏鼠相比，他尼氟酯減少由煙色曲霉菌(Aspergillus fumigatus)致敏的鼠中嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)目。
實(shí)施例6CLCA1在上皮細(xì)胞系中的過(guò)量表達(dá)增強(qiáng)粘蛋白生成NCI-H292細(xì)胞系，人類肺部粘液表皮樣癌(mucoepidermoidcarcinoma)細(xì)胞系，購(gòu)自American Type Culture Collection(ManassasVA)并培養(yǎng)在補(bǔ)充10％FBS和1％青霉素/鏈霉素(Gibco/BRL)的RPMI1640培養(yǎng)基上。細(xì)胞生長(zhǎng)于潮濕的、含有空氣的培養(yǎng)箱中，并在37℃補(bǔ)充5％CO2。過(guò)量表達(dá)hCLCA1的穩(wěn)定NCI-H292細(xì)胞系由根據(jù)Fujin轉(zhuǎn)染試劑盒(FujinTransfection Kit)制造商(Boehringer-Mannheim)的說(shuō)明書的轉(zhuǎn)染pcDNA3-hCLCA1而建立。對(duì)照細(xì)胞系NCI-H292/ctl由使用同樣步驟轉(zhuǎn)染pcDNA3(ctl)到NCI-H292細(xì)胞系而產(chǎn)生。hCLCA1基因的表達(dá)通過(guò)對(duì)pcDNA3-hCLCA1轉(zhuǎn)染子的Northern分析而確定。
為了s-ELLA(特定酶聯(lián)凝集素測(cè)定)，細(xì)胞被置于24-孔的組織培養(yǎng)板上并培養(yǎng)72小時(shí)以聚集。上清液被轉(zhuǎn)到96-孔的板上，所述板預(yù)先包被以1μg/ml抗-MUC5A/C抗體(New marker，F(xiàn)remont CA)并以1％BSA阻塞。結(jié)合MUC5A/C的抗體隨后以HRP-凝集素(Sigma)檢測(cè)。
為了RT-PCR從細(xì)胞系提取總RNA，根據(jù)制造商的步驟使用Trizol試劑(Gibco/BRL)。RT-PCR由反轉(zhuǎn)錄1μg總RNA和以PCR用適當(dāng)?shù)囊飶?fù)制cDNA而實(shí)現(xiàn)。產(chǎn)物由2％瓊脂糖膠電泳分離并用溴化乙錠染色觀察。用于產(chǎn)生人類CLCA1信息的引物對(duì)為有義鏈5’-GGCACAGATCTTTTCATTGCTA-3’、反義鏈5’-GTGAATGCCAGGAATGGTGCT-3’，其產(chǎn)生182bp的產(chǎn)物。用于產(chǎn)生粘蛋白信息的引物在表1列出。
表1(括號(hào)中的數(shù)字是指包含在已公開的cDNA中的寡核苷酸位點(diǎn))
NCI-H292細(xì)胞組成型地表達(dá)MUC1，而MUC2和MUC5A/C mRNA的表達(dá)低于基線可檢測(cè)的水平。圖12A表示pcDNA3-hCLCA1轉(zhuǎn)染細(xì)胞Northernblot的結(jié)果，顯示ICACC mRNA增加的表達(dá)水平。對(duì)來(lái)自CLCA1過(guò)量表達(dá)克隆系的完整細(xì)胞的Western blot分析表明MUC2蛋白的生成增加(圖12B)。在CLCA1過(guò)量表達(dá)細(xì)胞中MUC5A/C表達(dá)顯著增加，而MUC1在RT-PCR分析中無(wú)變化(圖12C)。特定ELLA分析也表明MUC5A/C蛋白在CLCA1表達(dá)的克隆系中比未轉(zhuǎn)染的NCI-H292細(xì)胞或以空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞過(guò)量生成(圖12D)。
實(shí)施例7在過(guò)量表達(dá)hCLCA1的NCI-H292細(xì)胞中抑制粘液過(guò)量生成和MUC5A/C表達(dá)為了測(cè)定粘液配糖體的生成，NCI-H292/ctl和NCI-H292/hCLCA1(AAF15)細(xì)胞在24-孔的板中培養(yǎng)3天。細(xì)胞隨后用福爾馬林固定而粘液配糖體以AB/PAS染色(Sigma)顯現(xiàn)。盡管NCI-H292對(duì)照細(xì)胞以一些分散的顆粒表現(xiàn)基本的PAS染色(圖13A)，CLCA1的過(guò)量表達(dá)顯著地增加PAS陽(yáng)性的粘液配糖體的數(shù)目和密度(圖13B)。為了氯通道阻礙研究，細(xì)胞被培養(yǎng)在存在100μM濃度的尼氟酸(NFA)(Sigma)、125或250μM濃度的美芬那酸(MFA)或12.5、25或50μM濃度的他尼氟酯、或僅有培養(yǎng)基的條件下。與未處理的細(xì)胞比較(圖13C&D和圖14的插頁(yè))，用NFA、MFA或他尼氟酯處理的細(xì)胞的PAS染色表明陽(yáng)性染色粘液配糖體的顯著減少。抑制劑處理的對(duì)照細(xì)胞的PAS染色表示與未處理的細(xì)胞事實(shí)上無(wú)區(qū)別(圖13A&C)。
他尼氟酯(圖14)、尼美舒利(圖17)和MSI-2079(圖18、MSI-2079的結(jié)構(gòu)示于圖19)的IC50值基于在表達(dá)hCLCA1的H292細(xì)胞中對(duì)MUC5A/C的抑制而確定。抑制劑以在OPTI MEM中從0到250μM的濃度處理融合細(xì)胞。分泌的MUC5A/C在添加抑制劑48小時(shí)后以實(shí)施例5中描述的ELLA檢測(cè)方法來(lái)測(cè)量。IC50值用數(shù)據(jù)分析軟件GraphPad Prism確定。圖14的內(nèi)圖表示他尼氟酯處理作出反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)粘蛋白水平，通過(guò)PAS染色測(cè)定。
實(shí)施例8他尼氟酯和類似物在CF檢測(cè)的效果CF鼠(CF敲除鼠和CFΔF508鼠)，不表達(dá)功能性CFTR蛋白，被斷奶并靠施用滲透劑以存活。在斷奶的兩周內(nèi)，滲透劑治療中斷，鼠或者被置于含有他尼氟酯的食物或?qū)φ帐澄铩７脤?duì)照食物的CF鼠體重減輕10-15％并死亡(CF敲除的)或被處死(CFΔF508)因?yàn)閯?dòng)物在滲透劑后7天內(nèi)的垂死狀態(tài)。相比之下，服用他尼氟酯(大約100mg/kg每os的劑量)的CF鼠體重增加8-12％并存活至少26天，在此時(shí)他們被麻醉以分析組織病理學(xué)(見圖20)。
他尼氟酯衍生物對(duì)粘蛋白產(chǎn)生的效果也用上面描述的方法以ELLA和IC50的變化來(lái)測(cè)定(表2)。
表2
說(shuō)明(+)＝抑制(-)＝無(wú)抑制他尼氟酯的期望的類似物(見圖21)通過(guò)以下表示的反應(yīng)過(guò)程合成。甲基膦酸二甲基酯的陰離子由添加丁基鋰向在-78℃的四氫呋喃中的膦酸酯而產(chǎn)生。尼氟酸甲基酯(1，MSI 2213)加入到膦酸酯陰碳離子的這種溶液中以產(chǎn)生β-酮膦酸酯(2，MSI 2215)。在下一個(gè)反應(yīng)步驟中，(2，MSI 2215)的膦酸酯陰碳離子由添加堿叔丁醇鈉到(2，MSI 2215)四氫呋喃溶液中產(chǎn)生。苯甲酸2-甲醛(carboxaldehyde)的芐基酯添加到含有膦酸酯負(fù)碳離子的反應(yīng)容器中以產(chǎn)生α，β不飽和酮(3，MSI 2214)。使用甲酸和C載Pd催化劑的(3，MSI 2214)交換氫化作用得到兩種產(chǎn)物，主要產(chǎn)物是期望的內(nèi)酯(4，MSI 2216)和更少量的還原產(chǎn)物(5，MSI 2217)。
實(shí)施例9他尼氟酯在COPD檢測(cè)的效果按照描述于Li等人(1998)Proc.Nat1.Acad. Sci.，USA，Vol.95，pp.5718-5723的方法對(duì)MUC2轉(zhuǎn)錄進(jìn)行檢測(cè)。簡(jiǎn)略地說(shuō)，上皮細(xì)胞系轉(zhuǎn)染含有來(lái)自克隆于熒光素酶(luciferase)報(bào)告基因上游的MUC2基因的啟動(dòng)子區(qū)域的報(bào)告構(gòu)建體。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以單獨(dú)的無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM)處理或，如指出的，含有來(lái)自金黃色葡萄球菌(S.aureus)的脂磷壁酸的(LTA)、腺苷(aden)、或他尼氟酯的(MSI)處理。細(xì)胞隨后被裂解，裂解物中熒光素酶活性被測(cè)量(RLU)。他尼氟酯調(diào)節(jié)脂磷壁酸對(duì)MUC2的誘導(dǎo)(見圖22)。這也是對(duì)CF的適合模型。
實(shí)施例10他尼氟酯對(duì)氯通道活性的作用圖23表示對(duì)轉(zhuǎn)染了表達(dá)氯化物通道的質(zhì)粒的細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果。轉(zhuǎn)染了表達(dá)人類氯化物通道hCLCA1的質(zhì)粒的NCI-H292細(xì)胞被膜片鉗住而氯電流(I)由電壓(V)范圍內(nèi)測(cè)量。與基線(方塊)相比基本氯化物電流由添加2μM離子霉素(ionomycin)和2mM鈣(圓圈)引起，表示hCLCA1的活化。添加5微摩爾的他尼氟酯(三角)產(chǎn)生在陽(yáng)性電壓氯化物電流的降低，表示通道活性的抑制。
與他尼氟酯觀察到的結(jié)果相比，雙氯芬酸(diclofenac)不抑制氯化物通道活性。轉(zhuǎn)染了表達(dá)鼠氯化物通道m(xù)CLCA1的HEK293細(xì)胞，被膜片鉗住而氯電流由電壓(V，左柱狀)范圍內(nèi)測(cè)量，結(jié)果展示于下面的表3。每一列列出在特定陽(yáng)性電壓并存在一種指定濃度的雙氯芬酸(μM)時(shí)不存在(-)或存在(+)離子霉素和鈣引起的電流。基本電流由添加2μM離子霉素和2mM鈣引起一比較前2個(gè)柱一表明離子霉素/鈣處理導(dǎo)致mCLCA1的活化。例如，在陽(yáng)極電壓100mV時(shí)，氯化物電流從39nA/pF增加到105nA/pF。雙氯芬酸在濃度5μM到50μM之間沒(méi)有觀察到對(duì)通道活性的抑制。相比于不存在雙氯芬酸時(shí)105nA/pF的電流，在100mV的陽(yáng)極電壓下5μM雙氯芬酸導(dǎo)致115nA/pF的電流，20μM雙氯芬酸導(dǎo)致109nA/pF的電流，50μM雙氯芬酸導(dǎo)致106nA/pF的電流。
表3.雙氯芬酸對(duì)氯化物通道活性的效果
實(shí)施例11他尼氟酯、化合物2216和化合物1-15的IC50和LD50值ELLA(酶聯(lián)凝集素測(cè)定)用來(lái)確定化合物對(duì)H292克隆系15個(gè)細(xì)胞的粘液產(chǎn)生的抑制效果。H292克隆系15個(gè)細(xì)胞，是過(guò)量表達(dá)hCLCA1的人類肺部粘液表皮樣癌(mucoepidermoid carcinoma)細(xì)胞系，培養(yǎng)至聚集，隨后與增加濃度的化合物培養(yǎng)48小時(shí)。條件培養(yǎng)基被收集，MUC5AC(肺中主要的分泌粘蛋白)含量由以下所述的ELLA試驗(yàn)測(cè)定。96孔的微孔板由抗人MUC5AC的鼠單克隆抗體(1-13M1，NeoMarkers)包被，隨后以測(cè)試條件培養(yǎng)基培養(yǎng)。結(jié)合的MUC5AC由辣根過(guò)氧化物酶-配體的大豆凝集素測(cè)定，其對(duì)高度糖苷化的蛋白如MUC5AC有高親和力。過(guò)氧化物酶底物TMB(四甲基聯(lián)苯胺堿)的變化由在450nm讀數(shù)而定量。O.D.(分光度)讀數(shù)對(duì)化合物濃度做圖。使用線性回歸(regression)推導(dǎo)出與載體處理的細(xì)胞相比，O.D.減少50％對(duì)應(yīng)的濃度(IC50)。
為了確定化合物的細(xì)胞毒性，重要的染料Alamar Blue，其能被存活細(xì)胞中的呼吸酶如NAPDH、FADH和細(xì)胞色素還原，將其以1％的終濃度2小時(shí)添加到化合物處理的細(xì)胞中(見上述)。氧化的Alamar Blue的還原導(dǎo)致熒光發(fā)射，其數(shù)值(cab)能在530nm(激發(fā)波長(zhǎng))和590nm(發(fā)射波長(zhǎng))測(cè)量。LD50定義為熒光讀數(shù)與載體處理的細(xì)胞相比減少50％的濃度。理想的化合物應(yīng)該有低的IC50和高的LD50。
為了確定化合物對(duì)細(xì)胞內(nèi)(儲(chǔ)存的)粘蛋白的抑制效果，化合物處理的細(xì)胞以PAS染色，其是對(duì)糖蛋白染色的。因?yàn)檎车鞍资呛粑?xì)胞中主要的糖蛋白，這種染色給出了對(duì)細(xì)胞內(nèi)粘蛋白的非直接定量評(píng)估。
*3次實(shí)驗(yàn)的平均值實(shí)施例12他尼氟酯對(duì)映體在NCI-292/hCLCA1細(xì)胞中對(duì)粘液過(guò)量產(chǎn)生和MUC5A/C表達(dá)的效果為了確定粘液糖配體的產(chǎn)生，NCI-292/hCLCA1細(xì)胞在24-孔板上培養(yǎng)3天，板帶有0-150μM的他尼氟酯對(duì)映體或僅有培養(yǎng)基(對(duì)照)。細(xì)胞隨后用福爾馬林固定而粘液糖配體以AB/PAS染色(Sigma)呈現(xiàn)。與未處理的細(xì)胞比較，在他尼氟酯對(duì)映體處理的細(xì)胞的PAS染色觀察到粘液糖配體。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中兩種對(duì)映體的濃度大于40μM時(shí)，可觀察到對(duì)粘液糖配體產(chǎn)生的抑制。
他尼氟酯的對(duì)映體的IC50數(shù)值基于它們?cè)贜CI-292/hCLCA1細(xì)胞中對(duì)MUC5A/C分泌的抑制并與他尼氟酯外消旋體數(shù)值的比較。以在OPTI MEM中濃度為0-150μM的抑制劑處理融合細(xì)胞。分泌的MUC5A/C在添加抑制劑48小時(shí)后以實(shí)施例5中描述的ELLA檢測(cè)來(lái)測(cè)量。IC50值用數(shù)據(jù)分析軟件GraphPad Prism確定。如圖26所示，相對(duì)于外消旋體IC50為36μM，對(duì)映體1不是抑制性的而對(duì)映體2IC50為40μM。對(duì)映體1定義為在分離外消旋混合物時(shí)第一個(gè)從HPLC柱中洗脫的對(duì)映體，而對(duì)映體2為較遲的洗脫化合物，如在合成實(shí)施例7中描述的。
為了確定化合物的細(xì)胞毒性，重要的染料Alamar Blue，其能被存活細(xì)胞中的呼吸酶如NAPDH、FADH和細(xì)胞色素還原，將其以1％的終濃度添加到化合物處理的細(xì)胞中2小時(shí)(見上述)。氧化的Alamar Blue的還原導(dǎo)致熒光發(fā)射，其數(shù)值(cab)能在530nm(激發(fā)波長(zhǎng))和590nm(發(fā)射波長(zhǎng))測(cè)量。LD50定義為熒光讀數(shù)與載體處理的細(xì)胞相比減少50％的濃度。對(duì)每種對(duì)映體或外消旋體直到150μM沒(méi)有LD50能被計(jì)算，因?yàn)闊晒庾x數(shù)沒(méi)有減少50％(圖27)。
實(shí)施例13他尼氟酯對(duì)映體和類似物在CF檢測(cè)的效果CF鼠(CF敲除鼠和CFΔF508鼠)，不表達(dá)功能性CFTR蛋白，被斷奶并靠施用滲透劑以存活。在斷奶的兩周內(nèi)，滲透藥劑治療中斷，鼠或者被置于含有基本上純的(+)或(-)他尼氟酯對(duì)映體的混合物的食物或?qū)φ帐澄?。服用?duì)照食物的CF鼠檢查體重并當(dāng)體重下降10％或更多時(shí)處死。相比之下，服用他尼氟酯異構(gòu)體的CF鼠也檢查體重并存活。在28天后，所有動(dòng)物被處死以評(píng)估組織病理學(xué)。
本發(fā)明已經(jīng)在此處用多種特定材料、步驟和實(shí)施例引作參考來(lái)描述和說(shuō)明，可以理解的是本發(fā)明并不限于為此目的的材料和步驟的特定組合。這些細(xì)節(jié)的多種改變能被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的方式暗示。在本申請(qǐng)中引用的所有專利、專利申請(qǐng)和其它參考文件以其全部在此引入作為參考。
參考文獻(xiàn)下列參考文件在此全部引入作為參考，如本申請(qǐng)中提到的所有參考文件、專利或?qū)＠暾?qǐng)
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權(quán)利要求
1.一種化合物，選自由對(duì)映體純的或光學(xué)富含(+)-他尼氟酯和(-)-他尼氟酯、其前藥、和所述化合物和前藥的藥物學(xué)上可接受的鹽組成的組。
2.權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的化合物是(+)-他尼氟酯。
3.權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的化合物是(-)-他尼氟酯。
4.患有與粘蛋白合成或分泌相關(guān)的疾病的患者的治療方法，包括向患者施用有效量的藥用組合物，該藥用組合物包括根據(jù)權(quán)利要求1的化合物。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中粘蛋白生成是氯通道依賴性的。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述氯通道是CLCA氯通道。
7.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述組合物是由吸入施用。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述組合物是液體形式。
9.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述組合物是粉末形式。
10.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述液體為煙霧化的。
11.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述組合物進(jìn)一步包括至少一種另外的治療劑。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述至少一種另外的治療劑選自祛痰藥、粘液溶解劑、抗生素和減充血?jiǎng)?br> 13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述祛痰藥是愈創(chuàng)甘油醚。
14.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述藥合物進(jìn)一步包括至少一種賦形劑，其選自表面活性劑、穩(wěn)定劑、吸收加強(qiáng)劑、芳香劑和藥學(xué)上可接受的載體。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述穩(wěn)定劑是環(huán)狀糊精。
16.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述吸收加強(qiáng)劑是殼聚糖。
17.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述疾病是選自慢性阻塞肺部疾病(COPD)、炎癥肺病、囊性纖維化和傳染性疾病。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述COPD是選自肺氣腫、慢性支氣管炎和哮喘。
19.一種藥用組合物，其配制成以吸入方式輸送至肺部，其包括有效降低粘蛋白合成或分泌的量的權(quán)利要求1的化合物、其鹽、其衍生物和其前藥。
20.權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述組合物包括(+)-他尼氟酯、(+)-他尼氟酯衍生物、其鹽或其前藥。
21.權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述組合物包括(-)-他尼氟酯、(-)-他尼氟酯衍生物、其鹽或其前藥。
22.權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包括至少一種祛痰藥、粘液溶解劑、抗生素或減充血?jiǎng)?br> 23.含有權(quán)利要求19藥用組合物的吸入裝置。
24.權(quán)利要求4所述的方法，其中配制所述組合物以提高生物利用度。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中將所述組合物微粉化。
26.一種治療有慢性竇炎的患者的方法，包括向患者施用有效量的包含權(quán)利要求1的化合物的藥用組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)粘蛋白合成的方法和化合物在控制與疾病相關(guān)的粘蛋白過(guò)量產(chǎn)生中的治療應(yīng)用，所述疾病例如包括哮喘和慢性支氣管炎的慢性阻塞肺病(COPD)、炎癥肺病、囊性纖維化和急性或慢性的呼吸感染疾病。
文檔編號(hào)A61K31/4433GK1835942SQ200480023617
公開日2006年9月20日 申請(qǐng)日期2004年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月19日
發(fā)明者洪笑玲, 艾瑞克·查爾奎斯特, 羅伊·C·里維特, 邁克爾·麥克嵐 申請(qǐng)人:金納萊公司