專利名稱：抑制PARP活性的RNAi用于生產(chǎn)治療癌癥的藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制介導(dǎo)DNA鏈斷裂修復(fù)的酶的活性的活性劑用于治療某些形式的癌癥，尤其乳腺癌的用途。
背景技術(shù)：
已表明在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，同源重組(HR)在發(fā)生在DNA復(fù)制叉的損傷修復(fù)中起重要的作用(2)。從而，HR缺陷細(xì)胞表現(xiàn)為生長(zhǎng)遲緩并顯示出更高水平的遺傳不穩(wěn)定性。認(rèn)為人類癌癥中由于HR修復(fù)的喪失導(dǎo)致的遺傳不穩(wěn)定性明顯促進(jìn)了這些細(xì)胞中癌的發(fā)展(1)。
響應(yīng)DNA鏈的斷裂，由聚(ADP-核糖基)化(PARP)對(duì)核蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后修飾在DNA修復(fù)、程序性細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)以及基因組穩(wěn)定性的維持中起著重要的作用。
聚(ADP-核糖)聚合酶(PAPR-1)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中大量存在的一種核蛋白質(zhì)，它利用NAD+作為底物催化形成聚(ADP-核糖)(PAR)多聚體。一旦發(fā)生DNA損傷，PAPR-1迅速結(jié)合DNA鏈斷裂(單鏈或雙鏈)并催化向自身(自修飾)和其他蛋白質(zhì)加入帶負(fù)電的PAR鏈(綜述見[3，4])。認(rèn)為PAPR-1與DNA鏈斷裂的結(jié)合保護(hù)DNA損傷被進(jìn)一步加工，直到通過PAR多聚體導(dǎo)致的積聚的負(fù)電荷使PAPR-1從斷裂解離(5，6)。
雖然PAPR-1與一些核過程，比如染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)、DNA復(fù)制、DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄有關(guān)，但是PAPR-1敲除小鼠卻正常發(fā)育(7)。從這些小鼠分離的細(xì)胞表現(xiàn)為過度重組表型和SCE水平升高、微核和四倍性的遺傳不穩(wěn)定性(8-10)。通過端?？s短、染色體融合頻率增加和非整倍性也可以在這些PAPR-1敲除小鼠中發(fā)生遺傳不穩(wěn)定性(11)，盡管所有這些結(jié)果在另一組PARP-1敲除小鼠中不能重復(fù)(12)。在前一小鼠敲除中，PAPR-1無效突變挽救了SCID小鼠中受損的V(D)J重組(13)。這些結(jié)果支持Lindahl和同事提出的觀點(diǎn)，即PARP-1有抵抗重組的保護(hù)作用(5)。他們提出PARP-1與DNA鏈斷裂結(jié)合防止重組機(jī)器識(shí)別并處理DNA損傷，或者備選地，聚ADP-核糖基化后積累的負(fù)電荷排斥鄰近重組DNA序列。只有后一模型與PARP-1的自身抑制和顯性失活突變體PARP-1的表達(dá)、誘導(dǎo)SCE、基因擴(kuò)增和同源重組相一致(HR[14-18])。
基于PARP抑制劑處理的細(xì)胞或者來源于PARP-1或PARP-2敲除小鼠的細(xì)胞的研究表明，PARP-1活性的抑制增加細(xì)胞對(duì)于DNA損傷劑的敏感性，并且抑制鏈斷裂重接(3，4，8-11，19，20，47)。
PARP-1活性的抑制劑已經(jīng)與常規(guī)抗癌劑如放射療法和化學(xué)療法聯(lián)合使用(21)。抑制劑與甲基化劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶毒物及離子化放射聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)它可以提高這些治療形式的有效性。然而，我們知道此類治療導(dǎo)致對(duì)非癌細(xì)胞或者“健康”細(xì)胞的傷害和死亡，并與一些令人討厭的副作用有關(guān)。
因此現(xiàn)在需要一種癌癥治療，其既有效又可以選擇性地殺死癌細(xì)胞而且不必與放射治療和化學(xué)治療聯(lián)合使用。
本發(fā)明人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，與野生型細(xì)胞相比，同源重組(HR)缺陷的細(xì)胞對(duì)PARP抑制劑超敏感。這是令人驚奇的，因?yàn)镻ARP-1敲除小鼠正常生活，說明PARP-1對(duì)于生命并不是必需的。從而，不能預(yù)期細(xì)胞將對(duì)PARP抑制敏感。
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了抑制介導(dǎo)DNA鏈斷裂修復(fù)的酶的活性的活性劑用于生產(chǎn)治療由介導(dǎo)同源重組的基因中遺傳缺陷導(dǎo)致的疾病的藥物的用途。
另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療哺乳動(dòng)物(包括人類)中疾病或者狀況的方法，所述疾病或狀況是由于介導(dǎo)同源重組的基因中的遺傳缺陷引起的，所述方法包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的活性劑，該活性劑抑制介導(dǎo)復(fù)制叉中存在的DNA鏈斷裂或其它損傷的修復(fù)的酶的活性。
在優(yōu)選的方面，所述酶是PARP。在更優(yōu)選的方面，所述活性劑是PARP抑制劑或者對(duì)PARP基因特異的RNAi分子。
在進(jìn)一步優(yōu)選的方面，所述用途是癌癥的治療。
優(yōu)選地，所述藥物是藥物組合物，其由PARP抑制劑和可藥用載體或稀釋劑組成。
同源重組缺陷腫瘤對(duì)PARP-1抑制劑的特異敏感性意味著患者體內(nèi)正常分裂的細(xì)胞將不受治療的影響。用PARP-1抑制劑治療同源重組缺陷癌細(xì)胞還有一個(gè)好處，就是它不必和常規(guī)的放射療法或化學(xué)療法一起施用作為聯(lián)合療法，從而避免了與這些常規(guī)形式的治療相關(guān)的副作用。
介導(dǎo)同源重組的基因中的遺傳缺陷可以是由于編碼與同源重組有關(guān)的蛋白質(zhì)的基因中的突變、缺失或有缺陷的表達(dá)。
另一方面，本發(fā)明還提供了PARP-1抑制劑用于生產(chǎn)在同源重組缺陷細(xì)胞中誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的藥物的用途。
另一方面，本發(fā)明提供了在哺乳動(dòng)物的同源重組缺陷細(xì)胞中誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的方法，該方法包括對(duì)該哺乳動(dòng)物施用治療有效量的PARP抑制劑。
通過在同源重組缺陷細(xì)胞中導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡，有可能減小或者停止哺乳動(dòng)物中腫瘤的生長(zhǎng)。
優(yōu)選地，同源重組缺陷細(xì)胞是癌細(xì)胞。
同源重組缺陷的癌細(xì)胞可以在HR中部分或者完全缺陷。優(yōu)選地，癌細(xì)胞在HR中完全缺陷。
術(shù)語“癌”或“腫瘤”包括肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌或前列腺癌。癌還可以包括皮膚癌、腎癌、肝癌、膀胱癌或者腦癌。
待治療的癌可能是遺傳形式的癌癥，其中待治療的患者具有患癌癥的家族傾向。優(yōu)選地，待治療的癌癥是基因連鎖的遺傳性癌癥。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，癌癥是基因連鎖的遺傳性乳腺癌。
在優(yōu)選的方面，PARP-1抑制劑可用于治療涉及HR的基因的表達(dá)有缺陷的癌細(xì)胞的治療。在同源重組中具有所提出的功能的基因包括XRCC1、ADPRT(PARP-1)、ADPRTL2(PARP-2)、CTPS、RPA、RPA1、RPA2、RPA3、XPD、ERCC1、XPF、MMS19、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、DMC1、XRCC2、XRCC3、BRCA1、BRCA2、RAD52、RAD54、RAD50、MRE11、NBS1、WRN、BLM、Ku70、Ku80、ATM、ATR、chk1、chk2、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、RAD1、RAD9、FEN-1、Mus81、Eme1、DDS1、BARD(綜述見(2、3、5、22-28))。
涉及同源重組的基因可以是腫瘤抑制基因。本發(fā)明因此提供了腫瘤抑制基因表達(dá)缺陷的癌細(xì)胞的治療。優(yōu)選地，腫瘤抑制基因是BRCA1或BRCA2。
現(xiàn)在在西方國(guó)家乳腺癌是婦女中最常見的癌癥。某些家庭有很強(qiáng)的乳腺癌誘因，這常常是因?yàn)樵贐RCA1或BRCA2的一個(gè)等位基因中的遺傳突變。然而，這些患者仍然保持一個(gè)有功能的等位基因。因此，這些患者發(fā)育正常并且沒有該突變?cè)斐傻谋硇徒Y(jié)果。但是在一個(gè)細(xì)胞中，所述功能的等位基因可能丟失，使這個(gè)細(xì)胞癌變，同時(shí)在同源重組中有缺陷。這一步對(duì)于腫瘤發(fā)生是關(guān)鍵的(1)。
本發(fā)明人已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)BRCA2缺陷細(xì)胞對(duì)PARP抑制劑NU1025的細(xì)胞毒性的敏感性比野生型細(xì)胞強(qiáng)100倍。
從而，在優(yōu)選方面，本發(fā)明提供了PARP抑制劑用于生產(chǎn)治療HR缺陷(例如，由于BRCA1和/或BRCA2表達(dá)的損失)的癌細(xì)胞的藥物的用途。
待治療的癌細(xì)胞可以在BRCA1或BRCA2表達(dá)中部分或完全缺陷。BRCA1和BRCA2突變可以用多路PCR技術(shù)、陣列技術(shù)(29，30)或者技術(shù)人員已知的其他篩選來鑒定。
可用于本發(fā)明的PARP抑制劑可以選自PARP-1、PARP-2、PARP-3、PARP-4、端錨聚合酶1或端錨聚合酶2。(綜述見31)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明的PARP抑制劑是PARP-1活性的抑制劑。
可用于本發(fā)明的PARP-1抑制劑包括苯并咪唑-甲酰胺類、喹唑啉-4-[3H]-酮和異喹啉衍生物(如2-(4-羥基苯基)苯并咪唑-4-甲酰胺(NU1085)、8-羥基-2-甲基喹唑啉-4-[3H]酮(NU1025)、6(5H)菲啶酮、3氨基苯甲酰胺、苯并咪唑-4-甲酰胺(BZ1-6)和三環(huán)內(nèi)酰胺吲哚(TI1-5)[32]。通過設(shè)計(jì)[33]或者新的FlashPlate測(cè)定法[34]可以鑒定PARP的其他抑制劑。
配制成藥物組合物的PARP抑制劑可以以對(duì)靶定癌細(xì)胞有效而方便的方式施用，例如，經(jīng)口、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、局部途徑等施用。可用于該藥物組合物的載體或者稀釋劑可以包括，但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇和它們的組合。
在治療中或是作為預(yù)防劑，活性劑可以作為可注射的組合物，例如作為無菌水性分散體施用于個(gè)體。抑制劑可以直接施用于腫瘤，或者可以通過全身施用靶向腫瘤。
抑制劑的治療有效量是足夠?qū)崿F(xiàn)所希望的效果的量并且可以根據(jù)疾病狀況的本質(zhì)和嚴(yán)重性以及抑制劑的效力而變。將理解除了治療活動(dòng)性疾病外，不同的濃度還可以用于預(yù)防。
對(duì)于哺乳動(dòng)物，特別是人的給藥，預(yù)計(jì)活性劑的日劑量將最多100mg/kg，例如0.01mg/kg到50mg/kg體重，通常最多0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10、15、20或30mg/kg體重。然而，最終，由醫(yī)生決定所施用的抑制劑的量和施用頻率。
使用PARP抑制劑治療癌細(xì)胞的治療上的優(yōu)點(diǎn)是僅用很小的劑量就可以達(dá)到治療癌癥中的治療效果，從而減小抑制劑的全身性積累和相關(guān)的毒性作用。
本發(fā)明的優(yōu)選方面提供了一種活性劑，它是抑制性RNA(RNAi)分子。
一種特異廢除基因功能的技術(shù)是通過把雙鏈RNA，也稱作抑制性(RNAi)導(dǎo)入細(xì)胞，導(dǎo)致與該RNAi分子中包括的序列互補(bǔ)的mRNA的破壞。RNAi分子包含RNA的兩條互補(bǔ)鏈(有義鏈和反義鏈)，它們相互退火形成雙鏈RNA分子。RNAi分子通常來自待廢除的基因的外顯子序列或編碼序列。
優(yōu)選地，所述RNAi分子來源于核酸分子，其包含選自如下的核酸序列
a)如圖9、10、11、12、13或14中序列代表的核酸序列或其片段；b)核酸序列，其與圖9、10、11、12、13或14的核酸序列雜交或者編碼PARP的基因；c)核酸序列，其包含在a)和b)中定義的核酸序列由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性得到的序列。
最近的研究提示來源于編碼序列的100-1000bp的RNAi分子是基因表達(dá)的有效抑制劑。令人驚奇的是，僅需要幾個(gè)RNAi分子來阻斷基因表達(dá)，這暗示著它的機(jī)制是催化性的。作用位點(diǎn)似乎在細(xì)胞核，因?yàn)樵诩?xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中幾乎檢測(cè)不到(如果有)RNAi，表明RNAi分子在mRNA合成或加工期間發(fā)揮其作用。
更優(yōu)選地，所述RNAi分子的長(zhǎng)度為10個(gè)核苷酸堿基(nb)到1000nb。甚至更優(yōu)選地，所述RNAi分子的長(zhǎng)度為10nb、20nb、30nb、40nb、50nb、60nb、70nb、80nb、90nb或者100nb。甚至更優(yōu)選地，所述RNAi分子的長(zhǎng)度為21nb。
甚至更優(yōu)選地，所述RNAi分子包含核酸序列aaa agc cau ggu gga guauga(PARP-1)。
甚至更優(yōu)選地，所述RNAi分子由核酸序列aag acc aau cuc ucc aguuca ac組成(PARP-2)。
甚至更優(yōu)選地，所述RNAi分子由核酸序列aag acc aac auc gag aacaac組成(PARP-3)。
RNAi分子可以包含經(jīng)修飾的核苷酸堿基。
本發(fā)明的各個(gè)方面的優(yōu)選特征做必要的修正可用于各個(gè)其它方面。
現(xiàn)在僅用舉例的方式，參考所附的附圖描述本發(fā)明，其中

圖1是曲線圖，其表明HR缺陷細(xì)胞對(duì)PARP-1的抑制導(dǎo)致的細(xì)胞毒性超敏感。中國(guó)倉(cāng)鼠細(xì)胞系A(chǔ)A8(野生型)、irsISF(HR缺陷型[4])、CXR3(與XRCC3互補(bǔ)的irsISF[2])、V79(野生型)、irsI(HR缺陷型[5])或irsIX2.2(與XRCC2互補(bǔ)的irsI[1])暴露于3-AB(A)、ISQ(B)或NU1025(C)時(shí)的集落生長(zhǎng)暈。顯示了至少三次實(shí)驗(yàn)的平均值(符號(hào))和標(biāo)準(zhǔn)差(條線)。使用集落生長(zhǎng)暈測(cè)定法；圖2為曲線圖，其顯示了在wt V79細(xì)胞、BRCA2缺陷的VC-8細(xì)胞和與功能性BRCA2基因互補(bǔ)的VC-8細(xì)胞(VC-8#13，VC-8+B2)中PARP抑制劑NU1025存在下的細(xì)胞生存力；圖3是柱狀圖，其顯示用NU1025孵育72小時(shí)后程序性細(xì)胞死亡的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)；圖4(a)用siRNA轉(zhuǎn)染48小時(shí)后從MCF-7(p53wt)或MDA-MB-231(p53mut)乳腺癌細(xì)胞分離的蛋白質(zhì)裂解物的蛋白質(zhì)印跡分析。(b)siRNA處理的MCF-7細(xì)胞的集落生長(zhǎng)暈或(c)暴露于PARP抑制劑NU1025后MDA-MB-231細(xì)胞的集落生長(zhǎng)暈。顯示了至少三次實(shí)驗(yàn)的平均值(符號(hào))和標(biāo)準(zhǔn)差(條線)。
圖5.BRCA2缺陷細(xì)胞不能修復(fù)由PARP抑制劑在復(fù)制叉處形成的重組損傷。通過脈沖凝膠電泳顯示用NU1025(0.1mM)處理24小時(shí)后BRCA2完整或缺陷的細(xì)胞。2mM羥基脲用作陽(yáng)性對(duì)照。(b)未處理的V-C8+B2細(xì)胞和V-C8細(xì)胞中γH2Ax轉(zhuǎn)化灶的顯示。(c)用NU1025(10μM)處理24小時(shí)后在V-C8+B2和V-C8細(xì)胞中顯示的含有γH2Ax轉(zhuǎn)化灶或(c)RAD51轉(zhuǎn)化灶(d)的細(xì)胞數(shù)。顯示了至少三次實(shí)驗(yàn)的平均值(符號(hào))和標(biāo)準(zhǔn)差(條線)。(e)所提出的在BRCA2缺陷細(xì)胞中誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的模型。
圖6.PARP-1而不是PARP-2對(duì)于預(yù)防重組損傷的形成中是重要的，在BRCA2缺乏時(shí)引起細(xì)胞死亡。(a)從BRCA2、PARP-1和PARP-2以所示組合處理48小時(shí)的SW480SN.3細(xì)胞分離的RNA進(jìn)行的RT-PCR。(b)BRCA2、PARP-1和PARP-2的48小時(shí)耗竭后產(chǎn)克隆細(xì)胞存活。顯示了至少三次實(shí)驗(yàn)的平均值(符號(hào))和標(biāo)準(zhǔn)差(條線)。兩個(gè)星號(hào)和三個(gè)星號(hào)分別指斯氏t檢驗(yàn)中p＜0.01和p＜0.001的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。(c)用不同siRNA處理的SW480SN.3細(xì)胞中PARP-1的蛋白質(zhì)印跡。
圖7.(a)未處理的和(b)用胸苷處理的V79細(xì)胞(5mM處理24小時(shí))的PAR多聚體的顯示。(c)羥基脲(0.2mM)和胸苷(5mM)處理后含有＞10個(gè)PARP活性位點(diǎn)的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。對(duì)每次處理和實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)至少300個(gè)細(xì)胞核。(d)用羥基脲(e)或胸苷與NU1025(10μM)共處理后V-C8+B2細(xì)胞的存活。(f)用MMS、羥基脲(0.5mM)或者胸苷(10mM)處理后，通過游離NAD(P)H11的水平測(cè)量PARP的活性。描繪了從至少3次實(shí)驗(yàn)得到的平均值(符號(hào))和標(biāo)準(zhǔn)差(誤差線)。
圖8.(a)未處理的V-C8細(xì)胞和(b)V-C8+B2細(xì)胞中PAR多聚體的顯示。(c)未處理的V-C8細(xì)胞和V-C8+B2細(xì)胞中含有＞10個(gè)PARP活性位點(diǎn)的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的定量(d)未處理的V-C8和V-C8+B2細(xì)胞中測(cè)量的NAD(P)H水平。3個(gè)星號(hào)表示在斯氏t檢驗(yàn)中p＜0.001。(e)24小時(shí)胸苷(5mM)處理后V79細(xì)胞中RAD51和PARP活性位點(diǎn)的顯示。(f)PARP和HR在停止的復(fù)制叉中的作用的模型。
圖9.人PARP-1的cDNA序列；圖10.人PARP-2的cDNA序列；圖11.人PARP-3的cDNA序列；圖12.人端錨聚合酶1的cDNA序列；圖13人端錨聚合酶2的mRNA序列；圖14.人VPARP的mRNA序列。
材料和方法PARP抑制劑對(duì)HR缺陷細(xì)胞XRCC2、XRCC3或BRCA2的細(xì)胞毒性細(xì)胞培養(yǎng)irsI、irsIX2.1和V79-4細(xì)胞系由John Thacker贈(zèng)送[40]，AA8、irsISF和CXR3細(xì)胞系由Larry Thompson提供[41]。
VC-8、VC-8+B2、VC-8#13由Malgorzata Zdzienicka贈(zèng)送[42]。該研究中所有的細(xì)胞系均在37C含5％CO2的大氣下，在用Dulbecco′smodified Eagle′s Medium(DMEM)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，培養(yǎng)基中加入10％胎牛血清和青霉素(100U/ml)和硫酸鏈霉素(100μg/mL)。
毒性測(cè)定-集落生長(zhǎng)暈測(cè)定在培養(yǎng)皿中鋪上500個(gè)懸浮在培養(yǎng)基中的細(xì)胞，4小時(shí)后加入3-AB、ISQ或NU1025。ISQ和NU1025溶解在DMSO中，在處理培養(yǎng)基中的終濃度是0.2％。7-12天后，當(dāng)可以觀測(cè)到細(xì)胞集落時(shí)，將這些集落固定并用溶于甲醇的亞甲基蘭染色(4g/L)染色。隨后計(jì)數(shù)多于50個(gè)細(xì)胞組成的集落。
程序性細(xì)胞死亡實(shí)驗(yàn)將0.25×106個(gè)細(xì)胞加入培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)4小時(shí)后用NU1025處理。72小時(shí)后，細(xì)胞用胰酶消化并重懸于含有來自那個(gè)樣品的任何懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)基。細(xì)胞經(jīng)離心沉淀和重新懸浮后根據(jù)生產(chǎn)商的方案用FITC綴合的膜聯(lián)蛋白V和碘化丙錠(PI)(ApoTarget，Biosource International)進(jìn)行程序性細(xì)胞死亡分析。通過流式細(xì)胞術(shù)(Becton-Dickenson FACSort，488nm激光)分析樣品，通過結(jié)合FITC綴合的膜聯(lián)蛋白V的活細(xì)胞(PI陰性)的分?jǐn)?shù)確定程序性細(xì)胞死亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。
免疫熒光將細(xì)胞鋪在蓋玻片上，4小時(shí)后如上述處理24小時(shí)。處理后，除去培養(yǎng)基，蓋玻片用PBS在37℃洗滌并如別處所述的進(jìn)行固定[2]。用于該研究的一級(jí)抗體和稀釋液為兔多克隆抗PAR(Trevigen；1∶500)；羊多克隆抗Rad51(C-20，Santa Cruz；1∶200)；兔多克隆抗Rad51(H-92，Santa Cruz；1∶1000)。二級(jí)抗體為Cy-3綴合的山羊抗兔IgG抗體(Zymed；1∶500)，Alexa555山羊抗兔F(ab′)2IgG抗體(Molecular Probes；1∶500)，Alexa 546驢抗山羊IgG抗體(Molecular Probes；1∶500)和Alexa 488驢抗山羊IgG抗體(Molecular Probes；1∶500)?？贵w用含有3％牛血清白蛋白的PBS稀釋。DNA用1μg/ml To Pro(Molecular Probes)染色。用Zeiss LSM 510倒置共聚焦顯微鏡，使用63X/NA 1.4油浸物鏡和488、546和630nm的獲取圖像。通過焦點(diǎn)最大投影，從相隔0.50μm和1.0μm切片厚度的光學(xué)切片獲得圖像。圖像用Adobe PhotoShop(Abacus公司)處理。每張載玻片上計(jì)數(shù)至少300個(gè)細(xì)胞核，并將含有10個(gè)以上RAD51轉(zhuǎn)化灶或PARP活性位點(diǎn)的那些細(xì)胞核分類為陽(yáng)性。
PARP活性測(cè)定用水溶性的四唑鹽(5mM WST-8)通過它還原成黃色甲 染料來監(jiān)測(cè)NAD(P)H的量[43]。將5000個(gè)細(xì)胞以至少一式三份鋪在96孔板的孔中并在100μl正常培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)4小時(shí)。隨后加入含有WST-8的CK8緩沖液(Dojindo Molecular Technology，Gaithersburg，USA)，用或不用所指出濃度的DNA損傷劑處理。通過每30分鐘測(cè)量可見吸收(OD450)確定NAD(P)H存在下WST-8的還原。還制備了只含有培養(yǎng)基和CK8緩沖液的培養(yǎng)基空白。NAD(P)H水平的變化可以通過比較含經(jīng)DNA損傷劑處理的細(xì)胞的孔的吸收和僅用DMSO處理的細(xì)胞的孔的吸收來計(jì)算。或者，在CK8緩沖液中孵育4小時(shí)后計(jì)算不同細(xì)胞系中NAD(P)H的相對(duì)水平。
用Halldorsson等人[44]的方法的改進(jìn)方法(在別處有詳細(xì)[45])測(cè)定通透細(xì)胞中NU1025抑制PARP-1活性的能力。簡(jiǎn)言之300μL NU1025處理的通透細(xì)胞在26℃與寡核苷酸(終濃度2.5μg/mL)和75μM NAD+[32P]NAD(Amersham Pharmacia，Amersham，UK)孵育，總體積是400μL。5分鐘后，加入冰預(yù)冷的10％TCA，10％Na Ppi后60分鐘以終止反應(yīng)，之后用Whatman GF/C濾器(LabSales，Maidstone，UK)過濾，用1％TCA 1％NaPPi沖洗6次，讓其干燥并測(cè)量摻入的放射性來測(cè)定PARP-1活性。參考[32P]NAD標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)據(jù)表示為摻入的pmol NAD/106個(gè)細(xì)胞。
脈沖凝膠電泳將1.5×106個(gè)細(xì)胞鋪在100mm的培養(yǎng)皿中，貼壁4小時(shí)。暴露于藥物18小時(shí)，之后用胰酶消化細(xì)胞。每個(gè)1％瓊脂糖加樣孔(insert)中融解106個(gè)細(xì)胞。如別處描述(8)的孵育這些加樣孔，并通過脈沖凝膠電泳24小時(shí)分離(BioRad；120°角度，60到240轉(zhuǎn)換時(shí)間，4V/cm)。將凝膠隨后用溴化乙錠染色用于分析。
siRNA處理購(gòu)買預(yù)先設(shè)計(jì)好的BRCA2 SMART庫(kù)和亂序siRNAs(Dharmacon，Lafayette，CO)。將10000個(gè)細(xì)胞接種在6孔板中，并放置過夜，之后用Oligofectamine Reagent(Invitrogen)根據(jù)生產(chǎn)商的使用手冊(cè)用100nMsiRNA轉(zhuǎn)染。細(xì)胞在正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)后，用胰酶消化，重新鋪板后進(jìn)行毒性測(cè)定。使用針對(duì)BRCA2的抗體(Oncogene，Nottingham，UK)，通過用siRNA處理過的蛋白質(zhì)提取物的蛋白質(zhì)印跡(如前述[46])來證實(shí)BRCA2的抑制。
實(shí)施例同源重組缺陷細(xì)胞對(duì)PARP-1抑制有超敏感性為了研究HR參與對(duì)PARP-1抑制的細(xì)胞應(yīng)答，研究了PARP-1抑制劑對(duì)HR修復(fù)缺陷細(xì)胞系存活的影響。我們發(fā)現(xiàn)HR中缺陷的細(xì)胞(即，XRCC3缺陷的irsISF或XRCC2缺陷的irsI[見表1])對(duì)3-氨基苯甲酰胺(3-AB)的毒性效應(yīng)非常敏感，對(duì)另外兩種更有效的PARP-1抑制劑1，5-二羥基異喹啉(ISQ；[37])或8-羥基-2-甲基喹唑啉(NU1025[38，39])也非常敏感(圖1)。irsISF細(xì)胞對(duì)3-AB、ISQ或NU1025的敏感性可以通過導(dǎo)入含有功能XRCC3基因(CXR3)的粘粒來校正。類似地，irsI細(xì)胞對(duì)3-AB、ISQ或NU1025的敏感性可以通過導(dǎo)入含有功能XRCC2基因的粘粒來校正(irsIX2.2)。
BRCA2缺陷的細(xì)胞對(duì)PARP-1抑制超敏感研究了在PARP-1的抑制劑存在下BRCA2缺陷細(xì)胞(VC8)和野生型細(xì)胞(V79Z)的存活。發(fā)現(xiàn)VC8細(xì)胞對(duì)NU1025的毒性效應(yīng)非常敏感(圖2)。VC8細(xì)胞的敏感性可以通過在13號(hào)染色體(VC8#13)上或者過表達(dá)載體(VC8+B2)上導(dǎo)入功能BRCA2基因來校正。結(jié)果表明對(duì)PARP-1抑制劑的敏感性是BRCA2功能喪失的直接的結(jié)果。
為了研究是否PARP-1的抑制引發(fā)了BRCA2缺陷中程序性細(xì)胞死亡，研究了暴露于NU1025 72小時(shí)后程序性細(xì)胞死亡的水平。發(fā)現(xiàn)NU1025僅在VC8細(xì)胞中引發(fā)程序性細(xì)胞死亡，表明BRCA2缺陷細(xì)胞中PARP-1活性的喪失引發(fā)了這種死亡(圖3)。
BRCA2缺陷的乳腺癌細(xì)胞對(duì)PARP-1抑制超敏感檢查了當(dāng)耗竭BRCA2時(shí)，MCF7(野生型p53)和MDA-MB-231(突變型p53)乳腺癌細(xì)胞系是否表現(xiàn)出對(duì)NU1025相似的敏感性。發(fā)現(xiàn)只有用BRCA2 siRNA混合物耗竭BRCA2時(shí)，PARP-1抑制劑才能很大程度的降低MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞的存活(圖4)。這表明BRCA2耗竭的乳腺癌細(xì)胞對(duì)PARP抑制劑敏感性，其與p53狀態(tài)無關(guān)。
不存在DNA雙鏈斷裂(DSB)但是存在γH2Ax時(shí)BRCA2缺陷細(xì)胞因PARP-1抑制而死亡已知HR與DNA復(fù)制中DSB和其它損傷的修復(fù)有關(guān)[2]。為了確定BRCA2缺陷細(xì)胞的敏感性是否是NU1025處理后不能修復(fù)DSM的結(jié)果，在用高毒性水平的NU1025處理后，測(cè)量V79和V-C8細(xì)胞中DSB的積累。發(fā)現(xiàn)用從經(jīng)處理的細(xì)胞得到的DNA的脈沖凝膠電泳分析沒有檢測(cè)到DSB(圖5A)，說明在HR缺陷細(xì)胞中，PARP抑制后積累低水平的DSB或其它重組底物，這引發(fā)γH2Ax(圖5B)。BRCA2缺陷細(xì)胞在誘導(dǎo)了這些重組損傷后死亡的原因可能是因?yàn)椴荒苄迯?fù)這些損傷失。為了驗(yàn)證這一說法，測(cè)定了BRCA2缺陷的V-C8細(xì)胞和BRCA2互補(bǔ)的細(xì)胞響應(yīng)NU1025形成RAD51轉(zhuǎn)化灶的能力。經(jīng)NU1025處理后，在V-C8+B2細(xì)胞中確實(shí)誘導(dǎo)了RAD51轉(zhuǎn)化灶(在t檢驗(yàn)中p＜0.05時(shí)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的；圖5D)。這表明重組的損傷引起這些細(xì)胞中重組修復(fù)，使這些細(xì)胞存活下來。相比，BRCA2缺陷的V-C8細(xì)胞對(duì)不能響應(yīng)NU1025形成RAD51轉(zhuǎn)化灶(圖5D)，說明沒有HR，這將使得重組損傷未被修復(fù)并從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
PARP-1而不是PARP-2在預(yù)防重組損傷形成中是重要的在哺乳動(dòng)物細(xì)胞核中存在著兩種主要的PARPPARP-1和PARP-2。所有報(bào)道的PARP抑制劑都能抑制這兩種PARP。為了區(qū)分哪種PARP造成所述效應(yīng)，我們通過用siRNA耗竭人細(xì)胞中的PARP-1和/或PARP-2和BRCA2來測(cè)試沒有PARP-1和/或PARP-2是否導(dǎo)致有毒損害的積累(圖6a)。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)從細(xì)胞同時(shí)耗竭PARP-1和BRCA2時(shí)，產(chǎn)克隆細(xì)胞存活顯著下降(圖6b)。耗竭PARP-2和BRCA2對(duì)產(chǎn)克隆細(xì)胞存活無影響并且耗竭PARP-2、PARP-1和BRCA2不導(dǎo)致額外的毒性。這些結(jié)果提示，在人細(xì)胞中PARP-1而不是PARP-2負(fù)責(zé)減輕毒性重組損害。在PARP-1和BRCA2共同耗竭的細(xì)胞中克隆化效率僅減小到對(duì)照的60％，然而沒有HR缺陷的細(xì)胞在用PARP抑制劑處理后幸存下來。這可能與siRNA對(duì)大量PARP-1蛋白質(zhì)的不完全耗竭有關(guān)(圖6c)，這可以足夠在一些細(xì)胞中保持PARP-1功能。
PARP-1受到復(fù)制抑制劑活化HR也與停止的復(fù)制叉上發(fā)生的損傷修復(fù)有關(guān)，其可能不包括可檢測(cè)的DSB。為了測(cè)試PARP是否在復(fù)制叉中有作用，檢查了用延緩或者阻止DNA復(fù)制叉的試劑(胸苷或羥基脲)處理的細(xì)胞中的PARP活化。胸苷消耗細(xì)胞的dCTP并減慢復(fù)制叉的速度但不導(dǎo)致DSB。羥基脲耗竭幾種dNTP并且阻斷復(fù)制叉，伴隨著在復(fù)制叉處形成DSB[2]。這兩種試劑都能有效地誘導(dǎo)HR[2]。用胸苷或羥基脲處理24小時(shí)的V79倉(cāng)鼠細(xì)胞對(duì)PAR多聚體染色。這揭示了含有PARP活性位點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)目的顯著增加(圖7C)。該結(jié)果提示在停止的復(fù)制叉處PARP的功能。并且還顯示用NU1025抑制PARP增強(qiáng)了對(duì)V-C8+B2細(xì)胞中胸苷或羥基脲的敏感性(圖7D，E)。該結(jié)果提示PARP活性在停止的復(fù)制叉的修復(fù)中是重要的或者備選地，它防止具有停止的復(fù)制叉的細(xì)胞中死亡的誘導(dǎo)。
PARP在DNA單鏈斷裂(SSB)處被快速活化，并且吸引DNA修復(fù)酶[3-6]。甲基甲磺酸(MMS)導(dǎo)致DNA的烷基化，其通過堿基切除修復(fù)得到修復(fù)。PARP被這個(gè)修復(fù)過程中形成的SSB中間產(chǎn)物快速活化，它耗竭NAD(P)H水平(圖7F)。我們發(fā)現(xiàn)在胸苷或羥基脲處理后，PARP的活化和NAD(P)H水平的降低都慢得多。這種PARP活化的減慢可以通過是胸苷和羥基脲的間接作用和細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期S期后積累停止的復(fù)制叉需要的時(shí)間來解釋。
PARP-1和HR在停止的復(fù)制叉中具有單獨(dú)的作用測(cè)定了未處理的BRCA2缺陷的V-C8細(xì)胞中PARP活性位點(diǎn)的數(shù)目。發(fā)現(xiàn)和V-C8+B2細(xì)胞相比更多V-C8細(xì)胞含有PARP活性位點(diǎn)(圖8A、B、C)。而且V-C8細(xì)胞中游離NAD(P)H水平低于校正的細(xì)胞的水平(圖8D)，可能是由于增加的PARP活性。重要的是，這些PARP活性位點(diǎn)不與RAD51轉(zhuǎn)化灶重疊(圖8E)。
此處的結(jié)果提示PARP和HR在保護(hù)或挽救停止的復(fù)制叉方面中具有單獨(dú)的作用(圖8F)。PARP活性的喪失可以通過增加的HR來彌補(bǔ)，而HR的喪失可以通過增加的PARP活性來彌補(bǔ)。然而，這兩條通路的同時(shí)喪失導(dǎo)致停止的復(fù)制叉的積累以至細(xì)胞死亡，正如PARP被抑制的BRCA2缺陷細(xì)胞一樣。
如圖8F中概述的模型中所示，PARP和HR在停止的復(fù)制叉處有互補(bǔ)作用。(i)當(dāng)遇到DNA模板的障礙物時(shí)，復(fù)制叉可能停止。另外，由于缺乏dNTPs或其它DNA復(fù)制輔因子，復(fù)制叉也會(huì)暫時(shí)停止。(ii)PARP結(jié)合停止的復(fù)制叉或者其它復(fù)制相關(guān)的損傷，引發(fā)PAR多聚化。所得帶負(fù)電的PAR多聚體可以通過正常情況下處理復(fù)制叉的蛋白質(zhì)(例如，解離酶)保護(hù)停止的復(fù)制叉，直到當(dāng)可以利用dNTPs或其它輔因子時(shí)，可以自發(fā)恢復(fù)復(fù)制叉。備選地，PAR多聚體或PARP可以通過其他方式吸引蛋白質(zhì)來分解復(fù)制叉。(iii)在缺乏PARP活性的情況下，HR可以作為修復(fù)停止的復(fù)制叉的替代途徑。該補(bǔ)償模型解釋了在PARP缺陷細(xì)胞(即V-C8)中發(fā)現(xiàn)的HR和RAD51轉(zhuǎn)化灶的升高的水平3-5。在在PARP和HR都不存在時(shí)，自發(fā)復(fù)制阻斷/損害反而是致命的表1.研究中用到的細(xì)胞系的基因型和來源

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權(quán)利要求
1.抑制介導(dǎo)DNA鏈斷裂修復(fù)的酶活性的活性劑用于生產(chǎn)治療由介導(dǎo)同源重組的基因中缺陷導(dǎo)致的疾病的藥物的用途。
2.權(quán)利要求1中要求保護(hù)的用途，其中所述酶是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)。
3.權(quán)利要求2中要求保護(hù)的用途，其中所述活性劑是PARP抑制劑。
4.權(quán)利要求3中要求保護(hù)的用途，其中PARP抑制劑選自PARP-1、PARP-2、PARP-3、PARP-4、端錨聚合酶1和端錨聚合酶2。
5.權(quán)利要求4中要求保護(hù)的用途，其中所述PARP是PARP-1。
6.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中要求保護(hù)的用途，其中所述活性劑是對(duì)PARP基因特異的RNAi分子。
7.權(quán)利要求6中要求保護(hù)的用途，其中所述RNAi分子來源于核酸分子，其包含選自如下的核酸序列a)如圖9、10、11、12、13或14中的序列代表的核酸序列或其片段；b)核酸序列，其與圖9、10、11、12、13或14的核酸序列雜交，并且編碼PARP的基因；或者c)核酸序列，其包含在a)和b)中定義的核酸序列由于遺傳密碼簡(jiǎn)并得到的序列。
8.權(quán)利要求6或7中要求保護(hù)的用途，其中所述RNAi分子包含核酸序列aaa agc cau ggu gga gua uga。
9.權(quán)利要求6或7中要求保護(hù)的用途，其中所述RNAi分子由核酸序列aag acc aau cuc ucc agu uca ac組成。
10.權(quán)利要求6或7中要求保護(hù)的用途，其中所述RNAi分子由核酸序列aag acc aac auc gag aac aac組成。
11.前面權(quán)利要求任一項(xiàng)中要求保護(hù)的用途，其中所述缺陷是編碼與HR有關(guān)的蛋白質(zhì)的基因中的突變。
12.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)中要求保護(hù)的用途，其中所述缺陷是編碼與HR有關(guān)的蛋白質(zhì)的基因的缺失。
13.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)中要求保護(hù)的用途，其中所述缺陷存在于編碼與HR有關(guān)的蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)中。
14.前面權(quán)利要求任一項(xiàng)中要求保護(hù)的用途，其中介導(dǎo)HR的基因選自XRCC1、ADPRT(PARP-1)、ADPRTL2(PARP-2)、CTPS、RPA、RPA1、RPA2、RPA3、XPD、ERCC1、XPF、MMS19、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、DMC1、XRCC2、XRCC3、BRCA1、BRCA2、RAD52、RAD54、RAD50、MRE11、NBS1、WRN、BLM、Ku70、Ku80、ATM、ATR、chk1、chk2、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、RAD1、RAD9、FEN-1、Mus81、Eme1、DDS1和BARD。
15.前面權(quán)利要求任一項(xiàng)中要求保護(hù)的用途，用于癌癥的治療。
16.權(quán)利要求15中要求保護(hù)的用途，其中所述癌癥選自肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌和前列腺癌。
17.權(quán)利要求15或16中要求保護(hù)的用途，其中所述癌癥在人體中。
18.權(quán)利要求15到17任一項(xiàng)要求保護(hù)的用途，其中所述癌癥是基因連鎖的遺傳性癌癥。
19.權(quán)利要求18中要求保護(hù)的用途，其中所述癌癥是乳腺癌。
20.權(quán)利要求15到19任一項(xiàng)中要求保護(hù)的用途，其中待處理的癌細(xì)胞是BRCA1表達(dá)缺陷的。
21.權(quán)利要求15到19任一項(xiàng)中要求保護(hù)的用途，其中待處理的癌細(xì)胞是BRCA2表達(dá)缺陷的。
22.權(quán)利要求20或21中要求保護(hù)的用途，其中所述癌細(xì)胞部分缺乏BRCA1和/或BRCA2表達(dá)。
23.權(quán)利要求20或21中要求保護(hù)的用途，其中所述癌細(xì)胞完全缺乏BRCA1和/或BRCA2表達(dá)。
24.前面權(quán)利要求任一項(xiàng)中要求保護(hù)的用途，其中介導(dǎo)HR的基因是腫瘤抑制基因。
25.權(quán)利要求24中要求保護(hù)的用途，其中所述腫瘤抑制基因是BRCA1。
26.權(quán)利要求24中要求保護(hù)的用途，其中所述腫瘤抑制基因是BRCA2。
27.PARP抑制劑用于生產(chǎn)在HR缺陷細(xì)胞中誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的藥物的用途。
28.權(quán)利要求27中要求保護(hù)的用途，其中HR缺陷細(xì)胞是癌細(xì)胞。
29.權(quán)利要求28中要求保護(hù)的用途，其中HR缺陷癌細(xì)胞在HR中部分缺陷。
30.權(quán)利要求28中要求保護(hù)的用途，其中HR缺陷癌細(xì)胞在HR中完全缺陷。
31.治療包括人的哺乳動(dòng)物中由介導(dǎo)同源重組的基因中遺傳缺陷導(dǎo)致的疾病或狀況的方法，所述方法包括對(duì)該哺乳動(dòng)物施用治療有效量的抑制介導(dǎo)DNA鏈斷裂修復(fù)的酶的活性的活性劑。
32.誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物中HR缺陷細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡的方法，所述方法包括對(duì)該哺乳動(dòng)物施用治療有效量的PARP抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及抑制介導(dǎo)DNA鏈斷裂修復(fù)的酶的活性的活性劑的用途，用于生產(chǎn)治療介導(dǎo)同源重組的基因中缺陷導(dǎo)致的疾病的藥物。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1856572SQ200480027294
公開日2006年11月1日 申請(qǐng)日期2004年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月25日
發(fā)明者T·赫勒代 申請(qǐng)人:設(shè)菲爾德大學(xué)