專利名稱：空泡毒素中和劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)防、防復(fù)發(fā)或治療與幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)相關(guān)的消化器官疾病以及幽門螺桿菌所產(chǎn)生的空泡毒素的中和劑、藥品、醫(yī)藥部外品及飲食品，它們含有具有將幽門螺桿菌所產(chǎn)生的空泡毒素?zé)o毒化的效果的原花青素類、特別優(yōu)選為從蘋果或啤酒花中得到的原花青素類作為有效成分。
背景技術(shù)：
啤酒花(Humulus lupuls)為大麻科多年生植物，其球花(成熟的未受精的雌花)一般稱為啤酒花。啤酒花中除了該花部之外，還存在葉、蔓、根等各個部分。啤酒花的球花中存在的啤酒花苦味素部分(在球果的內(nèi)苞根部形成的黃色顆粒)是啤酒花的苦味和香味的來源，在啤酒釀造中與酵母、麥芽一起為重要的啤酒原料。另外，在民間療法中啤酒花作為鎮(zhèn)靜劑和抗催情劑而通用。啤酒花苞片是從啤酒花球花中除去了啤酒花苦味素部分而得到的，在啤酒釀造中是沒用的，不同情況下在釀造啤酒時被除去，作為副產(chǎn)物而生成。此時，啤酒花苞片除了用作土壤改良用的肥料之外，沒有其他特別有效的利用方法，因此希望開發(fā)更高附加價值的利用方法。
本申請人的申請中所涉及的專利文獻(xiàn)1、2、3、4、5、6中，確認(rèn)了啤酒花、特別是來自于啤酒花苞片的多酚類具有抗氧化作用、對發(fā)泡麥芽飲料的泡穩(wěn)定化作用、抗齲齒作用、除臭作用、抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制作用。另外，在專利文獻(xiàn)7中，確認(rèn)了對具有RNAN-糖苷酶活性或ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)毒素具有中和效果。
但是，到目前為止，對于來自于啤酒花的原花青素類，還沒有明確其對幽門螺桿菌所產(chǎn)生的空泡毒素的中和(無毒化)效果的例子。
幽門螺桿菌(以下僅稱為“幽門菌”)為具有螺旋狀形態(tài)的革蘭氏陰性桿菌，自從Warren和Marshal報道(非專利文獻(xiàn)1)其存在以來，已經(jīng)明確其與急性胃炎、慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等消化器官疾病的發(fā)病具有很大關(guān)系(參照非專利文獻(xiàn)2、3、4)。另外，由于90％或以上的胃癌患者為幽門菌的帶菌者等，因此幽門菌與胃癌的發(fā)生相關(guān)的可能性較高，WHO在1994年發(fā)表了《幽門菌確實為胃癌的致癌因子》。
作為產(chǎn)生幽門菌的病因因子，目前為止報道了尿素酶、過氧化氫酶、脂多糖(LPS)等，但近年來明確，通過向胃的粘膜細(xì)胞單獨投予引起空泡變性的空泡毒素(VacA)，可在動物模型中引發(fā)胃炎(非專利文獻(xiàn)5)，從而迅速認(rèn)識到空泡毒素為幽門菌的主要病因因子。
一直以來，在胃潰瘍、十二指腸潰瘍等潰瘍性疾病的治療中，使用了索法酮、普勞諾托等抗?jié)儎?；奧美拉唑、蘭索拉唑等質(zhì)子泵抑制劑(PPI)；法莫替丁、西咪替丁等胃酸分泌抑制劑(H2阻斷劑)等。但是，這些藥品不具有對幽門菌的增殖抑制效果，是對潰瘍性疾病的對癥療法藥劑。因此，雖然可看到通過上述藥劑對潰瘍性疾病的治愈，但由于幽門菌殘存于胃中，因此具有治療結(jié)束后的1年以內(nèi)的復(fù)發(fā)率高達(dá)80～90％的缺點。
為了克服上述缺點，除了對癥療法之外，還提出了除去幽門菌的治療方法，對幽門菌具有抗菌效果的阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、替硝唑等抗生素已在臨床上有所應(yīng)用?，F(xiàn)在，將質(zhì)子泵抑制劑與抗生素的2種藥劑組合、即新型3劑并用療法成為除菌治療的主流。
但是，在新型3劑并用療法中，由于必須長期地服用較多量的藥劑，因此藥劑的副作用、細(xì)菌替換癥的發(fā)病也作為臨床上的問題而在現(xiàn)實中產(chǎn)生。并且，抗生素的使用被認(rèn)為有可能隨著菌體的破壞而將作為產(chǎn)生幽門菌的病因因子的空泡毒素大量地排出至胃粘膜周圍。而且，抗生素的多量使用還有導(dǎo)致產(chǎn)生新型的、更強耐性菌的危險。綜合考慮上述內(nèi)容，很難說現(xiàn)在廣泛使用的新型3劑并用療法是理想的治療方法。
在日本，幽門菌的感染率特別是在40歲或以上的一代人中較高，而且與歐美相比，潰瘍性疾病和胃癌的發(fā)病率也高，如果發(fā)現(xiàn)了沒有副作用和耐性菌問題的治療方法，則在產(chǎn)業(yè)上的價值將非常大。
專利文獻(xiàn)1日本特開平09-002917號公報專利文獻(xiàn)2日本特開平09-163969號公報專利文獻(xiàn)3日本特開平09-295944號公報專利文獻(xiàn)4日本特開平10-025232號公報專利文獻(xiàn)5日本特開2000-327582號公報專利文獻(xiàn)6日本特開2001-039886號公報專利文獻(xiàn)7國際公開第02/07826號公開文本非專利文獻(xiàn)1Lancet，1273-1275(1983)非專利文獻(xiàn)2Med.J.Aust.，142，436(1985)非專利文獻(xiàn)3Gastroenterology，102，1575(1992)非專利文獻(xiàn)4N.Engl.Med.，328，308(1993)非專利文獻(xiàn)5Infect.Immun.63，4154-4160(1995)發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的在于提供副作用少、沒有耐性菌的產(chǎn)生、且預(yù)防、防復(fù)發(fā)或治療與幽門菌相關(guān)的消化器官疾病、以及對幽門菌所產(chǎn)生的空泡毒素具有中和效果的藥品、醫(yī)藥部外品、飲食品。
本發(fā)明人等鑒于這些現(xiàn)狀，嘗試了通過不殺死幽門菌，而是找到將幽門菌所產(chǎn)生的空泡毒素?zé)o毒化的因子來解決問題。如果發(fā)現(xiàn)了空泡毒素的有效的無毒化因子，則在醫(yī)學(xué)、產(chǎn)業(yè)上的意義是不可估量的。
本發(fā)明人等刻苦研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在啤酒花和蘋果中存在的多酚的一種將幽門菌所產(chǎn)生的空泡毒素有效地?zé)o毒化，進(jìn)而完成了本發(fā)明。該多酚特別在蘋果的未成熟果實和啤酒花的苞片部分中大量地含有。
啤酒花中含有的該多酚具有以下特性即吸附于苯乙烯-二乙烯基苯樹脂等與多酚表現(xiàn)出親和性的樹脂、通過級分分子量(fractionmolecular weight)為1000或以上的超濾膜進(jìn)行處理時不透過膜。另外，在含有5％左右鹽酸的醇溶液中加熱時被水解生成花青素，被認(rèn)為是原花青素類。另外，該原花青素類在GPC(凝膠滲透色譜)分析中顯示圖1所示的色譜圖，而在吸光度分析中顯示圖2所示的吸光度分布。
另外，在蘋果中含有的該多酚也吸附于苯乙烯-二乙烯基苯樹脂等與多酚表現(xiàn)出親和性的樹脂，在含有5％左右鹽酸的醇溶液中加熱時被水解生成花青素，被認(rèn)為是原花青素類。
即，本發(fā)明涉及含有原花青素類、特別優(yōu)選為來自于啤酒花或蘋果的原花青素類作為有效成分的空泡毒素中和劑。
作為中和空泡毒素的物質(zhì)，Tombola等公開了5-硝基-2-(3-苯基丙胺基)苯酸、根皮素、以及一部分的多酚類抑制由空泡毒素所產(chǎn)生的細(xì)胞膜上的電流變化(Tombola F.et al.，F(xiàn)EBS Lett.543，184-189(2003))。但是在同一文獻(xiàn)中也闡述了在這些體系中的抑制細(xì)胞膜上電流變化的物質(zhì)，與空泡毒素導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)空泡化的抑制和對細(xì)胞毒性的中和沒有關(guān)系。并且，這些文獻(xiàn)中作為抑制細(xì)胞膜上電流變化的物質(zhì)所公開的化合物，雖然為多酚類，但都不是原花青素類的化合物。
因此，關(guān)于使用來自于植物、特別優(yōu)選來自于啤酒花或蘋果中的原花青素類而將空泡毒素?zé)o毒化的技術(shù)，到目前為止還從未報道過。


圖1所示為來自于啤酒花的原花青素類的GPC(凝膠滲透色譜)分析結(jié)果的圖。
圖2所示為來自于啤酒花的原花青素類的吸光度分布的圖。
圖3所示為來自于啤酒花的原花青素類的HPLC分析結(jié)果的圖。
圖4所示為人胃癌細(xì)胞AZ-521培養(yǎng)細(xì)胞中的空泡毒素的無毒化的圖。(實施例13)圖5所示為人腎癌細(xì)胞G401培養(yǎng)細(xì)胞中的空泡毒素的無毒化的圖。(實施例13)
圖6所示為抑制人胃癌細(xì)胞AZ-521培養(yǎng)細(xì)胞中的空泡毒素進(jìn)入細(xì)胞的圖。(實施例14)圖7所示為抑制人腎癌細(xì)胞G401培養(yǎng)細(xì)胞中的空泡毒素進(jìn)入細(xì)胞的圖。(實施例14)具體實施方式
作為本發(fā)明的空泡毒素中和劑的原料，除了蘋果的未成熟果實之外，還優(yōu)選啤酒花的蔓和苞片部分，特別是也可以不將蘋果或啤酒花的各部分分離而整體使用。
所謂的啤酒花苞片是指從啤酒花的球果中去除啤酒花苦味素部分而得到的物質(zhì)，一般來說，將啤酒花球果粉碎后，通過篩分將啤酒花苦味素部分除去，從而得到啤酒花苞片。但是，在最近的啤酒釀造中，為了節(jié)省將啤酒花苞片篩分除去的麻煩，有下述傾向即不將對啤酒釀造無用的啤酒花苞片除去，而是將啤酒花球果直接成形為顆粒狀，并作為啤酒花顆粒用于啤酒釀造中。因此，作為本發(fā)明的原料，只要含有啤酒花的蔓和苞片即可，沒有特別的限定，即使將含有啤酒花苞片的啤酒花球果或啤酒花顆粒作為原料也沒有任何問題。
作為從啤酒花中得到空泡毒素中和劑的制造方法為，將啤酒花蔓、苞片或含有啤酒花苞片的啤酒花球果、啤酒花顆粒、或者含有這些啤酒花植物體部分的物質(zhì)作為原料，將其用水或80v/v％或以下的醇、丙酮、乙腈等與水混合的有機溶劑的水溶液進(jìn)行提取。作為優(yōu)選例，可以舉出乙醇為50v/v％或以下的含水乙醇。原料與提取溶劑的比例優(yōu)選為120～100(重量比)左右，提取優(yōu)選在4～95℃、攪拌下進(jìn)行20～60分鐘左右。通過過濾得到提取液，此時如果需要也可以使用珍珠巖等過濾輔助材料。
通過濃縮、冷凍干燥、噴霧干燥等通常的方法從這樣得到的提取液中將溶劑除去，可以得到作為粉末狀態(tài)的空泡毒素中和劑。這里得到的空泡毒素中和劑足以供于實用，但如果需要，也可以通過下述的使用吸附樹脂的方法進(jìn)一步提高其純度。但是，此過程終究是用于提高空泡毒素中和劑的純度的工序，不需要的話也可以省略。
將與多酚類具有親和性的合成樹脂制成粒狀后，處理上述提取液，濃縮空泡毒素中和劑。此工序可在填充有粒狀合成樹脂的柱中通過啤酒花提取液，充分洗滌柱后，將吸附于柱上的空泡毒素中和劑溶出；也可將粒狀樹脂浸漬在啤酒花提取液中，進(jìn)行成批處理。
使空泡毒素中和劑吸附于合成樹脂時，將啤酒花提取液冷卻至15～30℃的室溫左右后，如果需要，為了提高吸附效率，優(yōu)選通過減壓濃縮等預(yù)先將提取液的有機溶劑濃度降低。作為合成吸附劑的材質(zhì)，也可以使用羥丙基化葡聚糖、親水性乙烯聚合物、苯乙烯-二乙烯基苯聚合物等。
接下來洗滌合成樹脂，可以進(jìn)一步提高空泡毒素中和劑的純度。優(yōu)選使用水或1～10w/w％的乙醇水溶液作為用于洗滌的溶劑，優(yōu)選使用樹脂量1～10倍左右的溶劑量來進(jìn)行洗滌。
接著，將空泡毒素中和劑從吸附有多酚類的合成樹脂中脫離溶出。作為溶出中使用的溶劑，可以使用含水醇、含水丙酮、含水乙腈等，作為特別優(yōu)選的例子，可舉出30w/w％或以上的乙醇水溶液或者乙醇。溶出溶劑的在樹脂中通過的量優(yōu)選為樹脂量的2～6倍左右。
通過濃縮、冷凍干燥、噴霧干燥等通常的方法從所得溶出液中除去溶劑，可以得到作為粉末狀態(tài)的空泡毒素中和劑。另外，減壓濃縮時也可以將醇、丙酮、乙腈等回收并再利用。所使用的合成樹脂在用80v/v％或以上的醇水溶液、0.05N左右的氫氧化鈉水溶液等進(jìn)行洗滌后，可以反復(fù)使用。
這樣得到的空泡毒素中和劑能夠直接供于實際應(yīng)用，也可以通過使用下述超濾膜的方法來進(jìn)一步提高其純度。但是，該過程終究是用于提高空泡毒素中和劑的純度的工序，不需要的話也可以省略。
將利用上述方法得到的空泡毒素中和劑溶解于水或與水混合的有機溶劑中，用級分分子量為1000或以上的超濾膜進(jìn)行處理。作為膜的材料，只要是纖維素、醋酸纖維素、聚砜、聚丙烯、聚酯、聚醚砜、PVDF等通常用作超濾膜材料的物質(zhì)即可，可以沒有特別限定地使用。另外，級分分子量只要在1000或以上，則沒有特別問題都可使用，但如果使用級分分子量過大的膜，則產(chǎn)量急劇下降，而使用級分分子量小的膜時，則處理所需要的時間變長，因此優(yōu)選級分分子量為5000～50,000左右的超濾膜。另外，處理也根據(jù)提取溶劑的種類、提取溶劑與啤酒花或啤酒花苞片的比例的不同而不同，但優(yōu)選處理至大概上部殘留液的量變?yōu)樘幚黹_始時的1/10～1/100左右。此時的壓力也根據(jù)超濾膜、過濾裝置的不同而不同，但優(yōu)選大概為0.1～10.0kg/cm2。另外，如果需要，也可以再次用水等適當(dāng)溶劑將處理過一次的上部殘留液稀釋，并進(jìn)行同樣的再處理，從而提高純度。
通過濃縮、冷凍干燥、噴霧干燥等通常的方法除去所得上部殘留液中的溶劑，可以得到作為粉末狀態(tài)的空泡毒素中和劑。另外，減壓濃縮時也可以將醇、丙酮、乙腈等回收并再利用。
這樣得到的空泡毒素中和劑為略帶苦味的無臭的肉色、褐色或淡黃色的粉末，是吸附于與多酚具有親和性的合成樹脂并通過級分分子量為1000或以上的超濾膜進(jìn)行處理時不透過膜的原花青素。
收率以啤酒花苞片重量換算時為0.5～20.0w/w％、以啤酒花球果重量換算時為0.5～15.0w/w％。
作為從蘋果中得到空泡毒素中和劑的制造方法，可以將蘋果果實、優(yōu)選為蘋果的未成熟果實，通過壓榨進(jìn)行榨汁，制成含空泡毒素中和劑的溶液，將該溶液通過濃縮、冷凍干燥、噴霧干燥等通常的方法制成粉末來使用。另外，也可以根據(jù)需要，使用填充有對多酚具有親和性的粒狀樹脂等的柱等，將空泡毒素中和劑精制，提高純度后使用。該工序與將從啤酒花中得到的空泡毒素中和劑進(jìn)行濃縮精制的工序相同。
這樣得到的空泡毒素中和劑可與通常使用的載體、輔助劑、添加劑等一起制成制劑，可以按照常規(guī)方法作為口服、非口服制品、藥品而使用，還可以與食品材料混合后制成飲食品。
藥品，作為口服劑有片劑、膠囊劑、顆粒劑、糖漿劑等，作為非口服劑有軟膏劑、乳劑、水劑等外用劑，無菌溶液劑、混懸劑等注射劑等。將這些制品作為藥品投予給人體時，以每天1～數(shù)次投予2mg～500mg、即以2mg～1000mg的全天量進(jìn)行投予，能夠充分達(dá)到其效果。
含有本發(fā)明的空泡毒素中和劑的藥品可與生理學(xué)上允許的賦形藥、載體、賦形劑、協(xié)調(diào)劑、穩(wěn)定劑、香味劑等一起為所要求的單位體積形態(tài)。混合于片劑、膠囊劑的佐藥為下述的物質(zhì)即黃芪膠、阿拉伯膠、玉米淀粉、明膠等結(jié)合劑，微晶纖維素等賦形劑，玉米淀粉、全凝膠化淀粉、褐藻酸等膨化劑，硬脂酸鎂等潤滑劑，蔗糖、乳糖、糖精等甜味劑，薄荷、acamono oil、櫻桃等香味劑。另外，為膠囊劑時，在上述材料中還可以進(jìn)一步含有油脂等液體載體，而且，其他材料可以作為覆蓋劑或者以其他方法使制劑的物理形態(tài)發(fā)生改變。例如，片劑可被蟲膠、砂糖覆蓋。糖漿劑或西也劑可含有作為甜味劑的蔗糖、作為防腐劑的對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯、色素以及櫻桃或橙香等香味劑。
用于注射劑的無菌組合物可通過下述的常用方法進(jìn)行配方使注射用水等賦形藥中的活形物質(zhì)，芝麻油、椰子油、花生油、棉籽油等天然產(chǎn)植物油，或者油酸乙酯等合成脂肪賦形藥溶解或者混懸的方法。另外，根據(jù)需要還可以配合緩沖劑、防腐劑、抗氧化劑等。作為外用劑，可以使用作為基材的凡士林、石蠟、油脂類、羊毛脂、聚乙二醇等，通過常用的方法制成軟膏劑、乳劑等。
含有本發(fā)明的空泡毒素中和劑的飲食品可以是上述制劑的形態(tài)，也可以以糖、薄脆餅干、小甜餅、飲料等形態(tài)在各自的食品原料中添加所要量，并通過常用的制造方法進(jìn)行加工制造。作為健康食品、功能性食品的攝取，由于是用于預(yù)防疾病和維持健康，因此制成每天分?jǐn)?shù)次口服攝取、包含全日量為5mg～500mg的加工品來攝取。
向這些飲食品中添加空泡毒素中和劑時，可以將空泡毒素中和劑以粉末狀態(tài)直接添加，但優(yōu)選將空泡毒素中和劑制成1～2％的水溶液、醇水溶液的溶液或醇溶液，按照最終濃度變?yōu)?～10,000ppm、優(yōu)選為100～5000ppm的方式添加至飲食品中。
本發(fā)明的空泡毒素中和劑在以預(yù)防該消化器官疾病為目的而使用時可用作預(yù)防劑，在以預(yù)防一度治愈過的該消化器官疾病的復(fù)發(fā)為目的而使用時可用作防復(fù)發(fā)劑，在以通過除去幽門菌來治療該消化器官疾病為目的而使用時可用作除菌劑。另外，在預(yù)防、防復(fù)發(fā)或治療該消化器官疾病時，可以單獨使用本發(fā)明的幽門螺桿菌除菌劑，也可以與質(zhì)子泵抑制劑和/或抗生素組合使用。
本發(fā)明的空泡毒素中和劑的一日給藥量可根據(jù)其用法、患者的年齡、性別等其他條件、疾病程度等來適當(dāng)選擇，通常作為有效成分的本發(fā)明化合物的量為成人每天0.1～2000mg左右、優(yōu)選為0.5～1800mg左右、特別優(yōu)選為1.0～1500mg左右，每日分1～4次給藥，如可在空腹時給藥。
以下列舉實施例，但本發(fā)明不受其限定。
實施例1(通過凝膠型合成吸附劑從啤酒花球果制備空泡毒素中和劑)在研缽中將20g啤酒花球果粉碎，用2L的水?dāng)嚢瑁?5℃下提取40分鐘。過濾后放冷，將提取液通過填充有80ml親水性乙烯聚合物樹脂的柱，接著使用400ml的5％乙醇水溶液進(jìn)行洗滌。接著，在同一柱中通過400ml 80％乙醇水溶液，回收相同的溶出液，冷凍干燥，得到800mg作為無臭的略帶苦味的淡黃色粉末狀態(tài)的空泡毒素中和劑。從啤酒花得到的收率為4％。
實施例2(通過凝膠型合成吸附劑從啤酒花苞片制備空泡毒素中和劑)用600ml 50％乙醇水溶液攪拌20g啤酒花苞片，在30℃下提取20分鐘。過濾后減壓濃縮，將該濃縮液通過填充有80ml苯乙烯-二乙烯基苯樹脂的柱，接著用400ml的水進(jìn)行洗滌。接著，在同一柱中通過400ml80％乙醇水溶液，回收相同的溶出液，冷凍干燥，得到1.6g作為無臭的略帶苦味的淡黃色粉末狀態(tài)的空泡毒素中和劑。從啤酒花苞片得到的收率為8％。
實施例3(通過超濾膜從啤酒花球果制備空泡毒素中和劑)在研缽中將20g啤酒花球果粉碎，用2L的水?dāng)嚢?，?5℃下提取40分鐘。過濾后放冷，利用級分分子量為50,000的超濾膜、在1.0kg/cm2、室溫下處理提取液，直至變?yōu)?0ml。將所得的上部殘留液減壓干燥，得到200mg作為無臭的略帶苦味的淡黃色粉末狀態(tài)的空泡毒素中和劑。從啤酒花得到的收率為1％。
實施例4(通過超濾膜從啤酒花苞片制備空泡毒素中和劑)用600ml 50％乙醇水溶液攪拌20g啤酒花苞片，在80℃下提取40分鐘。過濾后，利用級分分子量為1,000的超濾膜、在3.0kg/cm2、室溫下處理提取液，直至變?yōu)?0ml。將所得的上部殘留液冷凍干燥，得到0.8g作為無臭的略帶苦味的淡黃色粉末狀態(tài)的空泡毒素中和劑。從啤酒花苞片得到的收率為4％。
實施例5(空泡毒素中和劑的進(jìn)一步精制和定性分析)將0.8g實施例2所得到的空泡毒素中和劑溶解于500ml 10％乙醇水溶液中，利用級分分子量為5,000的超濾膜、在1.0kg/cm2、室溫下處理，直至變?yōu)?0ml。將所得的上部殘留液冷凍干燥，得到0.4g作為無臭的略帶苦味的肉色粉末狀態(tài)的空泡毒素中和劑。在下述條件下對該粉末進(jìn)行HPLC分析時，顯示圖3所示的特征性色譜圖，另外，進(jìn)行作為通常的多酚類定量法之一的兒茶酸定量(食品標(biāo)準(zhǔn)分析法)時，換算為兒茶酸含量，得到的值為40.6％。
(HPLC條件)裝置島津LC-10A系統(tǒng)，色譜柱ODS-80TM(Toso、4.6mmI.D.×25cm)，流動相從(A液∶B液)＝(100∶0)到(50∶50)的30分鐘的直線梯度、A液5％乙腈(含0.1％HCl)、B液乙腈，進(jìn)樣量20μg，檢測200～300nm的多波長檢測。
實施例6(從蘋果的未成熟果實制備空泡毒素中和劑)將400g蘋果的未成熟果實(平均重量為5.03g)與1％鹽酸酸性甲醇一起進(jìn)行均質(zhì)化后，邊加熱回流邊提取(3次)，將提取液減壓濃縮餾去甲醇后，加入氯仿進(jìn)行分層(2次)，回收水層，過濾后加蒸餾水至200ml。然后，通過使用了Sep-pak C18的固相萃取法進(jìn)行精制，冷凍干燥得到空泡毒素中和劑。
實施例7(片劑、膠囊劑)按照實施例5所得到的物質(zhì)10.0g乳糖 75.0g硬脂酸鎂 15.0g合計 100.0g將上述各重量份均勻混合，按照常法制成片劑、膠囊劑。另外，代替按照實施例5所得到的物質(zhì)，分別添加按照實施例1、2、3、4、6所得到的物質(zhì)，也同樣地得到片劑、膠囊劑。
實施例8(散劑、顆粒劑)按照實施例5所得到的物質(zhì)20.0g淀粉 30.0g乳糖 50.0g
合計100.0g將上述各重量份均勻混合，按照常法制成散劑、顆粒劑。另外，代替按照實施例5所得到的物質(zhì)，分別添加按照實施例1、2、3、4、6所得到的物質(zhì)，也同樣地得到散劑、顆粒劑。
實施例9(注射劑)按照實施例5所得到的物質(zhì)1.0g表面活性劑 9.0g生理鹽水 90.0g合計 100.0g將上述各重量份加熱混合、滅菌，制成注射劑。另外，代替按照實施例5所得到的物質(zhì)，分別添加按照實施例1、2、3、4、6所得到的物質(zhì)，也同樣地得到注射劑。
實施例10(糖)蔗糖20.0g麥芽糖漿(75％固體成分) 70.0g水 9.5g著色劑 0.45g香料0.045g按照實施例5所得到的物質(zhì) 0.005g合計100.0g使用上述各重量份的各成分，按照常法制成糖。另外，代替按照實施例5所得到的物質(zhì)，分別添加按照實施例1、2、3、4、6所得到的物質(zhì)，也同樣地得到糖。
實施例11(果汁)濃縮桔子果汁15.0g果糖5.0g檸檬酸 0.2g香料0.1g色素0.15g抗壞血酸鈉 0.048g按照實施例5所得到的物質(zhì) 0.002g水 79.5g合計100.0g使用上述各重量份的各成分，按照常法制成果汁。另外，代替按照實施例5所得到的物質(zhì)，分別添加按照實施例1、2、3、4、6所得到的物質(zhì)，也同樣地得到果汁。
實施例12(小甜餅)軟質(zhì)面粉32.0g整個雞蛋16.0g奶油16.0g砂糖25.0g水 10.8g發(fā)酵粉 0.198g按照實施例5所得到的物質(zhì) 0.002g合計100.0g使用上述各重量份的各成分，按照常法制成小甜餅。另外，代替按照實施例5所得到的物質(zhì)，分別添加按照實施例1、2、3、4、6所得到的物質(zhì)，也同樣地得到小甜餅。
實施例13空泡毒素對培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞毒性試驗將來自于人胃癌的細(xì)胞株AZ-521細(xì)胞或者來自于人腎癌的細(xì)胞株G401細(xì)胞調(diào)整為2.0×105細(xì)胞/ml的懸浮液。將其100μl分裝于96孔板中后，放置一晚，制備各個細(xì)胞的單層膜。將一定濃度的空泡毒素與各種濃度的實施例5或6所得到的空泡毒素中和劑混合，在37℃下培養(yǎng)30分鐘，之后將其加入至上述板中。空泡毒素的最終濃度為120nM，實施例5或6的最終濃度為0～100μg/ml。將板在5％CO2氛圍中、37℃下培養(yǎng)8小時后，通過中性紅(0.05％PBS溶液)進(jìn)入至空泡的程度(Ab540)來評價空泡毒素對細(xì)胞的毒性。其結(jié)果示于圖4和圖5。依賴于實施例5和6所得到的空泡毒素中和劑的濃度，相對于AZ-521細(xì)胞和G401細(xì)胞兩者，由空泡毒素所導(dǎo)致的細(xì)胞毒性都被無毒化。
實施例14對培養(yǎng)細(xì)胞的結(jié)合將來自于人胃癌的細(xì)胞株AZ-521細(xì)胞或者來自于人腎癌的細(xì)胞株G401細(xì)胞調(diào)整為2.0×105細(xì)胞/ml的懸浮液。將其100μ1分裝于96孔板中后，放置一晚，制備各個細(xì)胞的單層膜。將各種濃度的生物素標(biāo)記的空泡毒素與一定濃度的實施例5或6所得到的空泡毒素中和劑在37℃下培養(yǎng)30分鐘后，添加至細(xì)胞的單層膜中?？张荻舅氐淖罱K濃度為0～100nM，實施例5或6的最終濃度為10μg/ml。將細(xì)胞的單層膜在5％CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時后，用0.25％戊二醛將細(xì)胞固定。利用抗生物素蛋白標(biāo)記的辣根過氧化物酶(Pharmacia)和TMBZ色素的顯色(Ab450nm)來評價粘著在細(xì)胞表面的生物素標(biāo)記的空泡毒素的量。其結(jié)果示于圖6和圖7。依賴于實施例5或6所得到的空泡毒素中和劑的濃度，空泡毒素對細(xì)胞的結(jié)合被抑制。
實施例15小鼠胃傷害實驗對絕食了24小時(僅自由攝取飲水)的4周齡C57BL/6J小鼠，使用攝食器(ingestion probe)投予相當(dāng)于每10g體重為5μg的空泡毒素和50～250μg的實施例5所得到的物質(zhì)。分開飼養(yǎng)動物，一只小鼠一個籠子。給藥48小時后，將胃摘除。將摘除標(biāo)本用10％福爾馬林固定，用立體顯微鏡觀察其前后。對固定標(biāo)本進(jìn)行蘇木精嗜紅染色，按照Ghiara等人的方法(Ghiara.P.，et al.Infect.Immun.63，4154-4160.(1995))，將胃損傷的程度點數(shù)化，進(jìn)行評價。其結(jié)果示于表1。實施例5顯著地抑制了胃的損傷。
表1

*表示與3相比，危險率為5％以下，有顯著差異。
綜上所述，本發(fā)明的空泡毒素中和劑由于具有將空泡毒素?zé)o毒化的效果，因此在以空泡毒素為病原因子的感染癥的預(yù)防和治療上有效。本發(fā)明品可以作為以空泡毒素為病原因子的感染癥的預(yù)防/治療劑以及生物化學(xué)上的實驗用試劑等而進(jìn)行產(chǎn)品化。
作為與幽門菌相關(guān)的消化器官疾病，可例示出胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃炎、胃癌、MALT淋巴瘤等。
權(quán)利要求
1.一種具有將幽門螺桿菌所產(chǎn)生的空泡毒素中和(無毒化)效果的原花青素類。
2.如權(quán)利要求1所述的原花青素類，該原花青素類來自于啤酒花或啤酒花苞片。
3.如權(quán)利要求1所述的原花青素類，該原花青素類來自于蘋果。
4.與幽門螺桿菌相關(guān)的消化器官疾病的預(yù)防劑、防復(fù)發(fā)劑或者治療劑，其含有權(quán)利要求1所述的原花青素類作為有效成分。
5.與幽門螺桿菌相關(guān)的消化器官疾病的預(yù)防劑、防復(fù)發(fā)劑或者治療劑，其含有權(quán)利要求2所述的原花青素類作為有效成分。
6.與幽門螺桿菌相關(guān)的消化器官疾病的預(yù)防劑、防復(fù)發(fā)劑或者治療劑，其含有權(quán)利要求3所述的原花青素類作為有效成分。
7.幽門螺桿菌所產(chǎn)生的空泡毒素的中和劑，其含有權(quán)利要求1所述的原花青素類作為有效成分。
8.幽門螺桿菌所產(chǎn)生的空泡毒素的中和劑，其含有權(quán)利要求2所述的原花青素類作為有效成分。
9.幽門螺桿菌所產(chǎn)生的空泡毒素的中和劑，其含有權(quán)利要求3所述的原花青素類作為有效成分。
10.含有權(quán)利要求1所述的原花青素類作為有效成分的醫(yī)藥部外品。
11.含有權(quán)利要求2所述的原花青素類作為有效成分的醫(yī)藥部外品。
12.含有權(quán)利要求3所述的原花青素類作為有效成分的醫(yī)藥部外品。
13.含有權(quán)利要求1所述的原花青素類作為有效成分的飲食品。
14.含有權(quán)利要求2所述的原花青素類作為有效成分的飲食品。
15.含有權(quán)利要求3所述的原花青素類作為有效成分的飲食品。
全文摘要
本發(fā)明提供副作用少、不產(chǎn)生耐性菌、且具有預(yù)防、防復(fù)發(fā)或治療與幽門螺桿菌相關(guān)的消化器官疾病以及幽門螺桿菌的除菌效果的藥品、醫(yī)藥部外品或飲食品。本發(fā)明提供含有對幽門螺桿菌所產(chǎn)生的空泡毒素具有中和(無毒化)效果的原花青素類、特別優(yōu)選為來自于蘋果未成熟果實或者啤酒花苞片的原花青素類作為有效成分的藥品、醫(yī)藥部外品、飲食品。
文檔編號A61K36/185GK1863524SQ20048002880
公開日2006年11月15日 申請日期2004年10月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月2日
發(fā)明者八壽錦之助, 田頭素行, 平山壽哉, 野田公俊 申請人:朝日啤酒株式會社, 平山壽哉, 野田公俊