專利名稱：生育三烯酚的保護(hù)性和治療性用途的制作方法
優(yōu)先權(quán)要求本申請要求2003年8月8日提交的美國臨時專利申請60/493,761的優(yōu)先權(quán)，將該美國臨時專利申請完整引用作為本文的參考。
聯(lián)邦資助的研究聲明該工作至少部分得到National Institutes of Neurological Disordersand Stroke of the National Institutes of Health，RO1-NS42617的撥款。政府具有該發(fā)明中的某些權(quán)利。
背景認(rèn)為中風(fēng)和其他創(chuàng)傷引起的發(fā)作和損傷受到12-脂加氧酶(“12-LOX”)活性的介導(dǎo)?？赡?2-LOX是帕金森病、肌萎縮性側(cè)索硬化、癲癇和相關(guān)狀況引起的創(chuàng)傷和彌散損傷引起的病灶損傷導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡的原因。12-LOX的活性可能還造成腦之外的組織中疾病的發(fā)展；所述疾病為例如，某些皮膚癌，如黑素瘤；由于心臟創(chuàng)傷導(dǎo)致的心臟損傷；和肌肉變性和與HIV感染有關(guān)的其他疾病。從而，12-LOX是預(yù)防或治療與谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性相關(guān)的疾病和病癥的抑制劑的潛在靶。靶定和抑制12-LOX活性的試劑和方法是所希望的。
黑素瘤和其他癌癥受到復(fù)雜細(xì)胞和生物化學(xué)機(jī)制的調(diào)節(jié)。已經(jīng)確定脂加氧酶在某些癌癥中具有中心作用。已經(jīng)證明12-脂加氧酶(12-LOX)通過其代謝物12()-羥基二十碳四烯酸[12()-HETE]，在實(shí)驗(yàn)性黑素瘤侵染和轉(zhuǎn)移中具有關(guān)鍵作用，并且12-LOX表達(dá)在早期人黑素瘤致癌作用中是重要的。研究了黑素瘤從人黑素細(xì)胞發(fā)展到良性和發(fā)育異常的痣到惡性轉(zhuǎn)移疾病期間12-LOX表達(dá)。已確定12-LOX表達(dá)在正常人皮膚黑素細(xì)胞中很低并且在復(fù)合痣、發(fā)育異常的痣和黑素瘤中發(fā)現(xiàn)的黑素細(xì)胞中觀察到12-LOX增加的表達(dá)。與發(fā)育異常的痣相比，黑素瘤具有更高水平的12-LOX表達(dá)，并且在復(fù)合痣和發(fā)育異常的痣黑素細(xì)胞之間12-LOX表達(dá)顯著不同。這些數(shù)據(jù)提示12-LOX可能是黑素瘤系統(tǒng)內(nèi)癌癥發(fā)展的重要的新的標(biāo)記，從而可以是有用的生物標(biāo)記和黑素瘤化學(xué)預(yù)防的治療靶。
脂加氧酶(包括12-LOX)已經(jīng)與創(chuàng)傷，包括神經(jīng)和心臟創(chuàng)傷導(dǎo)致的心臟細(xì)胞死亡有關(guān)。通過遍在表達(dá)的胞質(zhì)溶膠磷脂酶A(2)(PLA(2))產(chǎn)生花生四烯酸在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、炎癥和腫瘤發(fā)生的調(diào)節(jié)中具有重要作用。12-LOX催化花生四烯酸(C20:4)向12-氫過氧二十碳四烯酸的轉(zhuǎn)化，12-氫過氧二十碳四烯酸又由谷胱甘肽過氧化物酶還原成12-羥基二十碳四烯酸(12-HETE)。12-LOX的活化與心臟的多種病理有關(guān)。因此，對12-LOX具有抑制作用的治療劑是治療與12-LOX有關(guān)的癌癥和其他病癥和疾病所希望的。
概述根據(jù)本發(fā)明，提供了治療和預(yù)防中風(fēng)和與脂加氧酶，如12-脂加氧酶有關(guān)的其他病癥和疾病的發(fā)作的治療和預(yù)防方法。還根據(jù)本發(fā)明，提供了特異增強(qiáng)胎兒和新生兒腦中生育三烯酚濃度的方法。還根據(jù)本發(fā)明，提供了提高或恢復(fù)生育力的方法。
提供了抑制受試者中12-脂加氧酶介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的方法，該方法包括對處于發(fā)展為12-脂加氧酶介導(dǎo)的細(xì)胞損傷危險中的受試者施用生物學(xué)有效量的生育三烯酚。生物學(xué)有效量的生育三烯酚抑制12-脂加氧酶的活性。所述方法涉及保護(hù)免受12-脂加氧酶介導(dǎo)的細(xì)胞損傷，所述損傷選自神經(jīng)元損傷、心臟組織損傷、體被損傷、癌癥如黑素瘤的發(fā)展和肌肉組織損傷。
還根據(jù)本發(fā)明，提供了治療患有神經(jīng)創(chuàng)傷的受試者的方法，其包括對所述受試者施用生物學(xué)有效量的生育三烯酚。所述方法尤其可用于治療創(chuàng)傷，如中風(fēng)和心臟創(chuàng)傷。
還根據(jù)本發(fā)明，提供了預(yù)防處于發(fā)展為黑素瘤危險中的受試者中黑素瘤發(fā)展的方法，其包括對所述受試者施用生物學(xué)有效量的生育三烯酚。
還根據(jù)本發(fā)明，提供了預(yù)防和治療癌癥的方案，其包括對需要其的受試者施用包含生育三烯酚和可藥用載體的藥學(xué)制劑。認(rèn)為需要此類治療的個體或受試者由于環(huán)境暴露，如暴露于太陽，或者發(fā)展為癌癥的其他傾向而處于發(fā)展為癌癥的危險中，或者已經(jīng)診斷患有癌癥。
還根據(jù)本發(fā)明，提供了保護(hù)胎兒中神經(jīng)元的方法，其包括對懷有所述胎兒的孕婦施用包含至少一種生育三烯酚的組合物的步驟。
還根據(jù)本發(fā)明，提供了通過對孕婦施用包含至少一種生育三烯酚的組合物增強(qiáng)人類胎兒腦中生育三烯酚濃度的方法，其中所述組合物基本上無生育酚。
還根據(jù)本發(fā)明，提供了增強(qiáng)人類嬰兒的腦中生育三烯酚濃度的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括對哺乳期婦女施用包含至少一種生育三烯酚的組合物并用所述哺乳期婦女產(chǎn)生的乳喂養(yǎng)所述嬰兒。
還根據(jù)本發(fā)明，提供了增加成年人類受試者的腦中生育三烯酚濃度的方法，其包括對該受試者施用包含至少一種生育三烯酚的組合物，其中所述組合物基本上無生育酚并且其中在不存在含有生育酚的食品或飲食補(bǔ)料的條件下施用所述組合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在所述人攝入含有生育酚的食品或飲食補(bǔ)料之后至少半小時和之前至少半小時施用所述混合物。施用飲食補(bǔ)料Tocomin已經(jīng)得到了良好結(jié)果。
還根據(jù)本發(fā)明，提供了提高需要提高生育力的動物中生育力的方法，其包括每天一次對所述動物施用臨床有效量的至少一種生育三烯酚。優(yōu)選地，在計劃的受孕前，每天一次施用生育三烯酚，為期2周到約16周。更優(yōu)選地，在計劃的受孕前，每天一次施用生育三烯酚，為期至少6到8周。
如根據(jù)本發(fā)明方法所用的，如需要，以每劑約1到約1000mg的單劑或多劑每天一次對受試者施用生育三烯酚組合物。優(yōu)選地，成人劑量為約600mg，并且每天施用1到3次。優(yōu)選施用方式為以膠囊(gelcaps)的形式經(jīng)口施用。根據(jù)所述方法的生育三烯酚選自α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、γ-生育三烯酚、δ-生育三烯酚、它們的衍生物，和它們的一種或多種的混合物。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本方法的組合物基本上無生育酚。
還根據(jù)本發(fā)明，提供了使缺少功能性生育酚轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的動物恢復(fù)生育力的方法，其包括對所述動物施用包含生育三烯酚的制劑。
還根據(jù)本發(fā)明，提供了保持原代培養(yǎng)物中神經(jīng)元的方法，其包括提供從動物分離的至少一種神經(jīng)元；提供包含至少一種生育三烯酚的培養(yǎng)基；和在含有所述培養(yǎng)基的容器中保持所述至少一種神經(jīng)元。
還根據(jù)本發(fā)明，提供了用于保持原代培養(yǎng)物中神經(jīng)元的培養(yǎng)基形式的培養(yǎng)組合物，其中所述組合物包含至少一種生育三烯酚。
本發(fā)明的附加特征和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，并且部分將從本描述顯而易見，或者可以通過實(shí)踐本發(fā)明認(rèn)識到。通過所附權(quán)利要求書中具體指出的要素和組合可以實(shí)現(xiàn)和達(dá)到本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)。
將理解前面的一般描述和下面的詳細(xì)描述都僅僅是示例性和解釋性的，并且不限制所要求保護(hù)的本發(fā)明。
附圖描述引入并且構(gòu)成說明書的一部分的附圖闡明了本發(fā)明的一些實(shí)施方案，并與說明書一起用于解釋本發(fā)明的原理。


圖1顯示了α-生育三烯酚保護(hù)免受神經(jīng)元生存力喪失。
圖2顯示了大鼠原代皮層神經(jīng)元的谷氨酸誘導(dǎo)的變性的成像和通過α-生育三烯酚和BL15的保護(hù)。
圖3顯示了12-脂加氧酶的藥理學(xué)抑制賦予了免受TH4以及原代未成熟皮層神經(jīng)元的谷氨酸誘導(dǎo)的死亡的保護(hù)(B-D)。
圖4表明從12-脂加氧酶敲除小鼠分離的原代未成熟皮層神經(jīng)元抗谷氨酸誘導(dǎo)的死亡。
圖5顯示了谷氨酸處理的神經(jīng)元中12-脂加氧酶活性的產(chǎn)物。
圖6顯示了12-脂加氧酶的效應(yīng)超表達(dá)、局部化和對α-生育三烯酚的敏感性。
圖7顯示了12-脂加氧酶的三維建模和α-生育三烯酚對接分析。
圖8顯示了生育三烯酚保護(hù)心臟細(xì)胞免受12-LOX活性的影響。
圖9胎兒和母親大鼠腦中維生素E水平。
圖10 E+和E-組中差別表達(dá)的基因的平均倍數(shù)改變。
圖11聚簇圖像，其闡明在E+組的胎兒腦中差別表達(dá)的基因。
圖12在E+組的胎兒腦中上調(diào)的基因。
圖13在E+組的胎兒腦中下調(diào)的基因。
圖14基因芯片(GeneChip)微陣列表達(dá)分析的RT-PCR驗(yàn)證。
詳細(xì)描述除非另外定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員通常理解的含義。用于此處本發(fā)明說明書中的術(shù)語僅用于描述具體實(shí)施方案，并且不意在限制本發(fā)明。如在本發(fā)明的說明書和所附權(quán)利要求中所用的，除非上下文中另外明確地指出，單數(shù)形式“一個(a)”、“一個(an)”和“該(the)”意在也包括復(fù)數(shù)形式。將本文提到的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻(xiàn)完整引用作為參考。
除非另外指出，用于本說明書和權(quán)利要求書中的表達(dá)成分的量、反應(yīng)條件等的所有數(shù)字在所有情況中都理解為通過術(shù)語“約”修飾。因此，除非指出相反情況，在下面的說明書和所附權(quán)利要求書中給出的數(shù)字參數(shù)為近似值，其可以取決于本發(fā)明尋求得到的所希望的性質(zhì)而變。至少，并且不試圖限制等同方案的學(xué)說應(yīng)用于權(quán)利要求的范圍，應(yīng)該根據(jù)有效數(shù)字?jǐn)?shù)目和普通四舍五入方法理解每個數(shù)字參數(shù)。
盡管闡明本發(fā)明的寬范圍的數(shù)字范圍和參數(shù)是近似值，但是在具體實(shí)施例中給出的數(shù)值盡可能精確地報導(dǎo)。然而，任何數(shù)值內(nèi)在地含有在它們的各自試驗(yàn)測量中發(fā)現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)差必定導(dǎo)致的某些誤差。該說明書全文中給出的每個數(shù)字范圍都包括落入此類較寬數(shù)字范圍的每個較窄的數(shù)字范圍，就像在此處明確寫出此類較窄數(shù)字范圍一樣。
本文關(guān)于疾病所用的術(shù)語“治療”以廣義使用并且不限于治療疾病的方法。術(shù)語“治療”包括用于減輕疾病的一種或多種病理作用或癥狀或者減少一種或多種這種病理作用或癥狀的發(fā)作或發(fā)展速度的任何方法。
本文所用術(shù)語“維生素E”一般指所有生育酚和生育三烯酚，包括生育酚和它們的具有RRR-α-生育酚生物學(xué)活性的衍生物。在自然界中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)8種物質(zhì)具有維生素E活性α-、β-、γ-和δ-生育酚；和α-、β-、γ-和δ-生育三烯酚。通常，術(shù)語維生素E與α-生育酚同義地使用，盡管該參考比此處的術(shù)語維生素E的計劃使用受到更大限制。盡管D-α-生育酚(RRR-α-生育酚)具有最高的生物利用率并且代表所有其他物質(zhì)用于比較的標(biāo)準(zhǔn)，但是它僅是8種天然形式的維生素E之一。生育三烯酚以前稱作ξ-、ε-、或η-生育酚，在化學(xué)上與生育酚相似，只是它們在三個位置具有不飽和的類異戊二烯尾，相對照而言α-、β-、γ-和δ-生育酚都具有飽和的植基尾。盡管α-、β-、γ-和δ-生育酚主要在玉米油、大豆油和橄欖油中發(fā)現(xiàn)，但是生育三烯酚在棕櫚油、米糠(rice bran)油和大麥油中尤其豐富。
本文所用術(shù)語“生育三烯酚”指α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、γ-生育三烯酚和δ-生育三烯酚，它們以前稱作并且有時備選地稱作ξ-、ε-或η-生育酚。生育三烯酚在氧化條件下非常不穩(wěn)定，從而希望在低氧條件保存生育三烯酚制劑和避熱。最佳地，用于藥物或者飲食補(bǔ)料的生育三烯酚將以抽成真空的劑量單位保存。
生育三烯酚主要發(fā)生在棕櫚油、米糠油和大麥中。盡管在市場上容易得到合成的和天然生育酚，但是天然生育三烯酚供應(yīng)有限。富含生育三烯酚(800-1500ppm)的粗品棕櫚油提供了天然生育三烯酚的潛在來源。馬來西亞的Carotech是世界上能夠從粗品棕櫚油提取和濃縮生育三烯酚的唯一工廠，其中使用新技術(shù)而不使用溶劑可最大化提取速率，而沒有不利的環(huán)境影響。
生育三烯酚的另一潛在來源是米糠油和其脂肪酸餾出物。然而，與粗品棕櫚油不同，米糠中生育三烯酚含量非常低，具有約45-55％總維生素E(生育酚和生育三烯酚)含量。剩余的維生素E由生育酚組成。棕櫚油是獨(dú)特的，因?yàn)樗邢鄬Ω邼舛鹊纳┓樱湔伎偩S生素E的約75-80％。流行病學(xué)研究已經(jīng)表明高濃度生育酚，特別是α-生育酚減弱生育三烯酚的膽固醇抑制作用。同樣，為了在降低血液總膽固醇中生育三烯酚具有最佳影響，優(yōu)選具有低含量生育酚(＜30％總維生素E)的制劑。
已經(jīng)表明飲食生育三烯酚摻入到循環(huán)人脂蛋白中，在其中它們與相應(yīng)生育酚異構(gòu)物一樣有效地與過氧化氫自由基反應(yīng)(Suarna等人，1993；Serbinova和Packer，1994)。飲食添加生育三烯酚有益地影響人體中頸動脈動脈粥樣硬化的病程(Tomeo等人，1995)。已經(jīng)證明微摩爾量的生育三烯酚而不是生育酚抑制羥基-3甲基戊二酰輔酶A還原酶的活性，該酶是負(fù)責(zé)膽固醇合成的關(guān)鍵的肝臟酶(Pearce等人，1992；Pearce等人，1994)。已經(jīng)表明與生育酚相比，生育三烯酚具有更佳的抗氧化、自由基清除效果，這可能是由于生育三烯酚在細(xì)胞膜的脂肪層中的更好分布。盡管已經(jīng)表明生育三烯酚具有比α-生育酚的更好的有益效果，但是對于精確作用機(jī)制還知之甚少。
在本發(fā)明公開前報導(dǎo)的研究結(jié)果已經(jīng)表明生育酚和生育三烯酚的轉(zhuǎn)運(yùn)、組織濃度和相對生物功能似乎有些不同或可能不相關(guān)(見ProcSoc Exp Biol Med(1993Mar)202(3)353-9)。α-生育酚轉(zhuǎn)移蛋白(αTTP)是導(dǎo)致家族性分離的維生素E缺乏的基因的產(chǎn)物，在決定血漿維生素E水平中起重要作用。已經(jīng)報導(dǎo)了αTTP識別所需維生素E類似物(包括生育三烯酚)的結(jié)構(gòu)特征的檢查，其中通過在體外評估未標(biāo)記的維生素E類似物和α-[3H]生育酚在膜之間轉(zhuǎn)移的競爭來評估配體特異性(見FEBS Lett 1997 Jun 2；409(1)105-8)。基于競爭程度確定αTTP對多種維生素E類似物的相對親和性，其中對多種形式的生育酚測量到最高親和性，對生育三烯酚測量到相對低的親和性。已顯示在相對親和性和從大鼠吸收-妊娠測定得到的已知生物活性之間具有線性關(guān)系。這些結(jié)果表明維生素E類似物對αTTP的親和性是生物活性的關(guān)鍵決定因素之一?；谇懊娴膬?nèi)容，以及本領(lǐng)域關(guān)于生育三烯酚和生育酚活性的其他信息，有證據(jù)表明維生素E的這些形式具有不同功能并且參與不同生物學(xué)機(jī)制系統(tǒng)。
12-脂加氧酶的抑制本文描述的申請人的努力得到的結(jié)果已經(jīng)將12-脂加氧酶(LOX)途徑鑒定為對生育三烯酚敏感。申請人給出第一個證據(jù)證明谷氨酸誘導(dǎo)的12-LOX活性對納摩爾濃度的生育三烯酚敏感。此外，申請人表明12-LOX缺陷的原代皮層神經(jīng)元抗谷氨酸攻擊。
如此處公開的，12LOX涉及中風(fēng)，受到生育三烯酚的有效抑制，并且如果在細(xì)胞死亡前施用生育三烯酚，那么可以逆轉(zhuǎn)12-LOX活性的神經(jīng)變性效應(yīng)。生育三烯酚可以用于保護(hù)免受病灶和彌散創(chuàng)傷的破壞效果，所述創(chuàng)傷包括中風(fēng)、帕金森病、ALS、癲癇和其他神經(jīng)變性疾病和創(chuàng)傷。在生理學(xué)相關(guān)范圍內(nèi)的濃度下，α-生育三烯酚在HT4以及不成熟的原代皮層神經(jīng)元中顯示出強(qiáng)烈的神經(jīng)保護(hù)性質(zhì)。當(dāng)前結(jié)果證實(shí)12-LOX在執(zhí)行神經(jīng)元的谷氨酸誘導(dǎo)的氧化毒性中的中心作用，并將α-生育三烯酚提供為基于營養(yǎng)的治療中的有希望的工具。
劑量和施用將生育三烯酚組合物施用于由于創(chuàng)傷、癲癇、ALS、帕金森病和其他創(chuàng)傷和病征導(dǎo)致的患有或者有危險患有中風(fēng)和其他神經(jīng)損傷(病灶或彌散的)的受試者。優(yōu)選在創(chuàng)傷開始前并且連續(xù)地將生育三烯酚組合物以足夠?qū)崿F(xiàn)損傷的逆轉(zhuǎn)和保護(hù)免受進(jìn)一步的12-LOX介導(dǎo)的損傷的量施用。對成年受試者以約1mg到1000mg按每天約2-3劑的頻率施用生育三烯酚組合物。更優(yōu)選地，對成年受試者以約100mg到800mg按每天約2-3劑的頻率提供劑量。最優(yōu)選地，對成年受試者提供每天約2-3劑的頻率的約600mg劑量。優(yōu)選遞送形式是用于口服的膠囊。用于青少年受試者的劑量為每劑約1-1000mg，更優(yōu)選地，為每劑約50-500mg，最優(yōu)選為每劑300mg，以每天約1到3劑的頻率施用。
黑素瘤和其他癌癥的預(yù)防和治療12-LOX已經(jīng)直接與黑素瘤和某些其他癌癥有關(guān)。本文公開了生育三烯酚對12-LOX的功能具有抑制作用。從而，指出生育三烯酚為治療黑素瘤和其他癌癥的藥學(xué)試劑。
劑量和施用對患有或者有危險患有黑素瘤和其他癌癥，尤其是涉及脂加氧酶，如12-脂加氧酶的癌癥的受試者施用生育三烯酚組合物。優(yōu)選在創(chuàng)傷開始前并且連續(xù)地將生育三烯酚組合物以足夠?qū)崿F(xiàn)損傷的逆轉(zhuǎn)和保護(hù)免受進(jìn)一步的12-LOX介導(dǎo)的損傷的量施用。對成年受試者以約1mg到1000mg按每天約2-3劑的頻率施用生育三烯酚組合物。更優(yōu)選地，對成年受試者以約100mg到800mg按每天約2-3劑的頻率提供劑量。最優(yōu)選地，對成年受試者提供每天約2-3劑的頻率的約600mg劑量。優(yōu)選遞送形式是用于口服的膠囊。用于青少年受試者的劑量為每劑約1-1000mg，更優(yōu)選地，為每劑約50-500mg，最優(yōu)選為每劑300mg，以每天約1到3劑的頻率施用。
心臟組織的保護(hù)劑量和施用對患有或者有危險患有心臟疾病和其他涉及脂加氧酶，如12-脂加氧酶的病癥的受試者施用生育三烯酚組合物。對成年受試者以約1mg到1000mg按每天約2-3劑的頻率施用生育三烯酚組合物。更優(yōu)選地，對成年受試者以約100mg到800mg按每天約2-3劑的頻率提供劑量。最優(yōu)選地，對成年受試者提供每天約2-3劑的頻率的約600mg劑量。優(yōu)選遞送形式是用于口服的膠囊。用于青少年受試者的劑量為每劑約1-1000mg，更優(yōu)選地，為每劑約50-500mg，最優(yōu)選為每劑300mg，以每天約1到3劑的頻率施用。
胎兒、新生兒和成年人腦組織的保護(hù)已知生育酚形式的維生素E改善胎兒和新生兒與某些形式的細(xì)胞損傷有關(guān)的狀態(tài)。最近的科學(xué)證據(jù)已經(jīng)證明維生素E的生育三烯酚形式具有不同于生育酚的細(xì)胞效應(yīng)；在神經(jīng)元細(xì)胞中，已經(jīng)表明生育三烯酚在谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的預(yù)防中比生育酚更有效。根據(jù)科學(xué)文獻(xiàn)，已經(jīng)提出飲食性α-生育三烯酚不能到達(dá)腦，包括胎兒和哺乳的新生兒的腦。因此，希望鑒定有效增強(qiáng)胎兒和新生兒中生育三烯酚水平的方法。
長期以來，成年人的營養(yǎng)補(bǔ)料一直含有維生素E，其主要是α-生育酚的形式，且偶然為生育三烯酚形式(盡管通常為低于臨床有效水平的量)。不斷增多的證據(jù)證明生育三烯酚賦予不同于α-生育酚的益處。然而，還有證據(jù)證明難以在成年人腦中吸收和保持有益水平的生育三烯酚。因此，希望能夠?qū)崿F(xiàn)在成年人腦和其他關(guān)鍵組織中生育三烯酚的有效吸收的方法和組合物。
妊娠期間攝入缺少維生素E的膳食僅兩周就可以極大降低胎兒腦中維生素E水平而不影響成年人腦的維生素E水平，從而強(qiáng)調(diào)了在妊娠期間飲食中該維生素的恰當(dāng)水平的重要性。當(dāng)為懷孕母親提供生育三烯酚的飲食補(bǔ)料時，與成年人腦相比，在胎兒腦中觀察到維生素E的α-生育三烯酚形式的更高吸收。從而，胎兒腦生育三烯酚水平與母親的飲食生育三烯酚攝入高度相關(guān)。根據(jù)該公開內(nèi)容，飲食生育三烯酚是胎兒腦可以生物利用的。不僅生育三烯酚遞送到胎兒腦，而且響應(yīng)飲食生育三烯酚材料的基因表達(dá)模式提示妊娠飲食中的維生素E有利地影響正發(fā)育的胎兒腦的基因表達(dá)譜。
本文提供的公開內(nèi)容進(jìn)一步表明在成年人中，飲食或者藥物補(bǔ)充的生育三烯酚向成年人腦的吸收受到生育酚的部分抑制。認(rèn)為這些試劑的該差別吸收由跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)的共同載體的支配。通過施用基本上無生育酚的飲食和補(bǔ)料形式的生育三烯酚組合物可以增強(qiáng)生育三烯酚吸收。
劑量和施用對患有或有危險患有由于創(chuàng)傷、氧化應(yīng)激和谷氨酸毒性、分娩創(chuàng)傷或者窒息導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷的受試者，包括成年人、懷孕母親和胎兒和青少年施用生育三烯酚組合物。優(yōu)選在創(chuàng)傷開始前并且連續(xù)地將生育三烯酚組合物以足夠?qū)崿F(xiàn)保護(hù)免受由于谷氨酸的作用、氧化應(yīng)激導(dǎo)致的損傷和/或12-LOX介導(dǎo)的損傷的量施用。對成年受試者以約1mg到1000mg按每天約2-3劑的頻率施用生育三烯酚組合物。更優(yōu)選地，對成年受試者以約100mg到800mg按每天約2-3劑的頻率提供劑量。最優(yōu)選地，對成年受試者提供每天約2-3劑的頻率的約600mg劑量，并且在沒有生育酚的情況下施用。優(yōu)選遞送形式是用于口服的膠囊。用于青少年受試者的劑量為每劑約1-1000mg，更優(yōu)選地，為每劑約50-500mg，最優(yōu)選為每劑300mg，以每天約1到3劑的頻率施用。任選地，對青少年施用的劑量可以缺少生育酚。
用生育三烯酚治療以恢復(fù)或增強(qiáng)生育力許多研究和產(chǎn)品針對以生育酚形式使用維生素E作為干預(yù)不育癥的基于營養(yǎng)的方案的部分。然而，有證據(jù)表明生育酚和其他營養(yǎng)補(bǔ)料的效果不足以抑制引起細(xì)胞損傷的細(xì)胞過程。同樣，某些個體缺少組織中生育酚轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收所需的細(xì)胞因子，即轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，從而，在那些個體中喪失了生育酚的任何有益效果。從而，使用維生素E的生育酚形式，通過當(dāng)前基于營養(yǎng)的和藥物的干預(yù)通常不能令人滿意地解決導(dǎo)致不育癥的潛在病因。因此，希望用備選物質(zhì)提供不育癥治療的基于營養(yǎng)的支持。
生育三烯酚可以用于飲食方案中以代替生育酚或作為生育酚的補(bǔ)料，用來保持或者恢復(fù)由于生育酚吸收障礙或者生育酚攝取或利用中的其他功能失常破壞的生育力。對于涉及生育力的組織，如附睪或腹部脂肪或羊水的情況，飲食生育三烯酚的作用是長效的。因此，希望進(jìn)行的飲食方案，其涉及生育三烯酚和生育酚的共同施用。
劑量和施用對由于生育酚吸收障礙或者生育酚攝取或利用中的其他功能失常正經(jīng)歷生育力破壞的受試者施用生育三烯酚組合物。對成年受試者以約1mg到1000mg按每天約2-3劑的頻率施用生育三烯酚組合物。更優(yōu)選地，對成年受試者以約100mg到800mg按每天約2-3劑的頻率提供劑量。最優(yōu)選地，對成年受試者提供每天約2-3劑的頻率的約600mg劑量。優(yōu)選遞送形式是用于口服的膠囊。在計劃受孕前優(yōu)選每天一次施用治療，為期至少6-8周。
使用生育三烯酚允許生育酚轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TTP)敲除小鼠生育飲食或藥物補(bǔ)充的生育酚的吸收和從腸向身體的多種部分的轉(zhuǎn)運(yùn)受到TTP的支配。為了理解和區(qū)分生育酚和生育三烯酚在哺乳動物中的重要作用，已經(jīng)產(chǎn)生了敲除小鼠，其中已經(jīng)消除了TTP的表達(dá)。TTP的中斷導(dǎo)致這些小鼠中生育力的喪失，這使得不可能生育并從而保持該品系用于進(jìn)一步研究。本公開內(nèi)容提供了首次證據(jù)證明使用生育三烯酚導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)TTP敲除小鼠中TTP依賴性的不育。
施用和劑量對成年受試者以約1mg到1000mg按每天約2-3劑的頻率施用生育三烯酚組合物。更優(yōu)選地，對成年受試者以約1mg到500mg按每天約2-3劑的頻率提供經(jīng)口劑量。最優(yōu)選地，對成年受試者提供每天約2-3劑的頻率的約50mg劑量。在計劃受孕前優(yōu)選每天一次施用治療，為期至少6-8周。
生育三烯酚作為腦細(xì)胞培養(yǎng)物中的試劑原代神經(jīng)元從成年和青少年組織分離，并且具有許多用途，包括治療和研究。原代神經(jīng)元的成功培養(yǎng)對于臨床計劃的可行性非常重要，所述臨床計劃包括原代神經(jīng)元植入的用途和治療某些神經(jīng)變性疾病。同樣，培養(yǎng)物中原代神經(jīng)元的建立和保持對于進(jìn)行包括神經(jīng)元發(fā)育、分化和對刺激的應(yīng)答的實(shí)驗(yàn)是必需的。這些細(xì)胞由于它們對培養(yǎng)環(huán)境的超敏感性而難以在培養(yǎng)物中保持。具體地，從更年老的受試者得到的組織在培養(yǎng)環(huán)境中更容易受到破壞和死亡。
約0.001到100μM，更優(yōu)選0.01到10μM，最優(yōu)選約0.5到2μM的濃度的生育三烯酚已經(jīng)有效用于將腦細(xì)胞保持在原代培養(yǎng)物中。用約1μM濃度的生育三烯酚已經(jīng)得到了良好結(jié)果。原代神經(jīng)元可用于生物學(xué)研究、用于潛在的診斷和治療應(yīng)用，和用于篩選藥物。用生育三烯酚培養(yǎng)尤其可用于來自年老受試者的神經(jīng)元，因?yàn)樯窠?jīng)保護(hù)效果將增加培養(yǎng)這些另外敏感性細(xì)胞的可行性。用生育三烯酚培養(yǎng)還可用于意在用于神經(jīng)元應(yīng)用的干細(xì)胞。
生育三烯酚的形式和施用本文所用術(shù)語“生物學(xué)有效量”是足夠抑制12-LOX活性的量。所需的生育三烯酚的量將取決于所治療的狀況的性質(zhì)和嚴(yán)重性，和受試者經(jīng)歷的以前治療的性質(zhì)，和所靶向的缺陷或疾病的類型。最后，將使用臨床試驗(yàn)確定劑量。開始時，臨床醫(yī)生將施用來自動物研究的劑量。通過生育三烯酚組合物的一次施用也可以實(shí)現(xiàn)有效量。備選地，通過對受試者多次施用生育三烯酚組合物實(shí)現(xiàn)有效量。術(shù)語“治療有效的”和“藥理學(xué)有效的”意在限定生育三烯酚組合物的量，所述生育三烯酚組合物將實(shí)現(xiàn)改善疾病嚴(yán)重性和發(fā)病頻率，同時避免通常與備選治療相關(guān)的不利副作用的目標(biāo)。本文所用術(shù)語“治療有效量”和“藥理學(xué)有效量”指生育三烯酚組合物的總活性量，所述生育三烯酚組合物足夠顯示出對受試者有意義的益處，即與神經(jīng)創(chuàng)傷或者心臟創(chuàng)傷有關(guān)的疾病癥狀的減輕，或者腫瘤大小的減小、腫瘤生長和/或游動性或轉(zhuǎn)移的阻止、抑制，和/或細(xì)胞凋亡的增加，和/或與腫瘤的存在相關(guān)的癥狀減輕，且對于不育癥的情況，為受孕能力的恢復(fù)。
根據(jù)本發(fā)明的生育三烯酚組合物的最初劑量為1mg到1000mg范圍，每天約1到3次的頻率。盡管本發(fā)明的方法涉及生育三烯酚的用途，但是顯然它們可以與其他治療劑組合以擴(kuò)大臨床用途。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是施用的確切劑量和頻率將取決于所施用的用于本發(fā)明方法的具體化合物、待治療的具體狀況、待治療狀況的嚴(yán)重性、具體患者的年齡、體重、一般身體狀況和該個體將服用的其他藥物，如本領(lǐng)域主治醫(yī)生公知的。
在一些實(shí)施方案中，生育三烯酚組合物基本上沒有生育酚。本文所用“基本上沒有”指包含一種或多種生育三烯酚的組合物，其含有按重量計小于1％的一種或多種生育酚化合物。優(yōu)選地，該組合物含有按重量計小于0.5％，更優(yōu)選按重量計小于0.1％，最優(yōu)選按重量計小于0.01％的一種或多種生育酚化合物。
含有生育三烯酚的組合物可以通過經(jīng)口、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)和腹膜內(nèi)途徑施用。優(yōu)選地，經(jīng)口或靜脈內(nèi)施用組合物，且最優(yōu)選地，經(jīng)口施用組合物。
可以設(shè)想經(jīng)口施用將是生育三烯酚制劑的預(yù)防性和治療性施用的主要途徑，盡管也可以使用通過注射或局部應(yīng)用的遞送?？梢杂贸Ｓ玫南♂寗?、賦形劑、載體和添加劑，如填充劑、膨脹劑、粘合劑、載體、鹽、濕潤劑、崩解劑、崩解劑阻滯劑、吸收促進(jìn)劑、吸附劑、助流劑、緩沖劑、防腐劑、分散劑、潤濕劑、助懸劑、表面活性劑、潤滑劑等等制備含有生育三烯酚的適宜劑量的藥物組合物。組合物可以具有多種劑型，例如，凝膠片劑、溶液、懸浮液、乳劑、注射劑(例如，溶液、懸浮液)。
固體組合物包括常規(guī)無毒固體載體中的生育三烯酚，所述載體為例如葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、纖維素或纖維素衍生物、碳酸鈉和碳酸鎂。用于局部，即經(jīng)皮使用的制劑包括已知的凝膠、乳膏、油和軟膏。脂肪酸來源的制劑可以用于增強(qiáng)生物相容性。此外，組合物可以含有著色劑、防腐劑、香料、調(diào)味劑、增甜劑和/或其他藥物。將生育三烯酚的注射液、溶液、乳劑和懸浮液形式滅菌并優(yōu)選與血液等滲。此類形式可以用常用于本領(lǐng)域的稀釋劑制備，所述稀釋劑為例如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、乙氧基化異十八烷醇、聚氧異十八烷醇和聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯。組合物可以含有制備等滲溶液必需的氯化鈉、葡萄糖或者甘油，以及通常的增溶劑、緩沖劑和安撫劑。
膠囊也稱作干填充膠囊，是經(jīng)口固體劑型，其中組合物包含在具有適宜大小，通常由明膠制造的可吞咽容器中。適于含有本發(fā)明的營養(yǎng)藥組合物的硬的空膠囊可以從一些來源得到，例如，從TishconGel-Tec，2410 N.Zion Rd.，Salisbury，Md.21801；所述膠囊以兩個半膠囊和多種尺寸提供。所述尺寸通常通過數(shù)字和范圍指定，范圍的較大端為000，范圍的最小端為5。膠囊的一半可以通過適宜的著色劑著色并且每一半可以具有相同或不同顏色。
尤其適于本發(fā)明方法的劑型為軟明膠膠囊。從而，1mg到1000mg生育三烯酚與適宜的稀釋劑如植物油混合然后在軟明膠膠囊中膠囊化。其他劑型包括例如懸浮液，其中用諸如調(diào)味劑的賦形劑將生育三烯酚懸浮或溶解在醇中。
當(dāng)靜脈內(nèi)施用時，適宜的載體包括，但不限于，生理鹽水、磷酸緩沖鹽水(PBS)，和含有增稠劑和增溶劑如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇和其混合物的溶液。包括組織靶定的脂質(zhì)體的脂質(zhì)體懸浮液也可以適于作為可藥用載體。這些載體可以根據(jù)本領(lǐng)域已知方法制備。
可以用保護(hù)化合物免于從身體快速清除的載體，如定時釋放制劑或者包衣配制本發(fā)明化合物。此類載體包括控釋制劑，諸如，但不限于，植入物和微囊化遞送系統(tǒng)，和生物可降解的、生物相容的聚合物，如膠原、乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚乳酸等等。制備此類制劑的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
實(shí)施例通過參考下面的實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明，所述實(shí)施例用于闡明并且不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1生育三烯酚制劑#1(TOCOMIN(Carotech Sdn.Bhd.生產(chǎn)))
實(shí)施例2培養(yǎng)物中大鼠和HT4神經(jīng)元的保護(hù)nM濃度的α-生育三烯酚保護(hù)HT4神經(jīng)元免于谷氨酸誘導(dǎo)的死亡；該保護(hù)獨(dú)立于α-生育三烯酚的抗氧化性質(zhì)(Sen等人，2000)。參考圖1，將原代大鼠未成熟皮層神經(jīng)元(A-C)或HT4(D)用或不用α-生育三烯酚(如所指出的)處理5分鐘并用谷氨酸(10mM；A)；L-高半胱磺酸(1mM；B)；或丁硫氨酸亞砜胺(buthionine sulfoximine)(0.15mM；BSO)攻擊24小時?；ㄉ南┧?0.05mM，C)增強(qiáng)BSO-誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。α-生育三烯酚賦予針對所有上面的神經(jīng)毒素的總體保護(hù)。D，100nM生育三烯酚不僅防止谷氨酸誘導(dǎo)的毒性，而且允許谷氨酸處理的細(xì)胞以與不用谷氨酸處理的細(xì)胞相當(dāng)?shù)乃俾试鲋场Ｔ诠劝彼峁艉?2、24和36小時計數(shù)細(xì)胞。A ，與對照谷氨酸未處理的組相比較低；*，與谷氨酸處理組相比較高。B ，與對照L-高半胱磺酸未處理組相比較低；*，與L-高半胱磺酸處理組相比較高。C ，與相應(yīng)對照相比較低；*，與用毒素攻擊的相應(yīng)組相比較高。D ，與相應(yīng)對照未處理的組相比較低；*，與相應(yīng)谷氨酸處理的組相比較高。P＜0.05。
在用TH4和大鼠神經(jīng)元進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，nM濃度的α-生育三烯酚保護(hù)用標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)毒素刺激的未成熟原代神經(jīng)元，所述神經(jīng)毒素為諸如谷氨酸、L-高半胱磺酸、L-丁硫氨酸-[S，R]亞砜胺(BSO)和BSO和花生四烯酸的組合(圖1A-C)。
其中用谷氨酸攻擊HT4神經(jīng)元進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)揭示nM水平的α-生育三烯酚不僅保護(hù)免于細(xì)胞生存力喪失，而且保持培養(yǎng)物中這些細(xì)胞的正常生長速率，表明完整的細(xì)胞功能(圖1D)。
用谷氨酸攻擊原代神經(jīng)元導(dǎo)致軸-樹突觸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的顯著破壞，如通過β-微管蛋白、神經(jīng)絲的染色和通過定時相差顯微鏡術(shù)證實(shí)的。參考圖2，接種24小時后，用谷氨酸攻擊細(xì)胞。如其中指出的，谷氨酸處理前用α-生育三烯酚(250nM)或者BL15(2.5μM)預(yù)處理神經(jīng)元5分鐘。a-h，所培養(yǎng)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的神經(jīng)元特異性III類β-微管蛋白(對于相差顯微鏡術(shù)，見i-p)。谷氨酸處理24小時后，固定細(xì)胞并染色。a，對照；b，谷氨酸；c，α-生育三烯酚+谷氨酸；d，BL15+谷氨酸。e-h，所培養(yǎng)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的神經(jīng)絲染色(對于相差顯微鏡術(shù)，見i-p)。e對照；f，谷氨酸；g，α-生育三烯酚+谷氨酸；h，BL15+谷氨酸。i-p，標(biāo)準(zhǔn)(不是玻璃蓋玻片)培養(yǎng)條件下谷氨酸處理的神經(jīng)元的活細(xì)胞成像。從谷氨酸處理后8小時開始每15分鐘收集相差圖像一次，持續(xù)18小時。畫面闡明神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的時間依賴性的崩解。i，谷氨酸處理后8小時；j，谷氨酸處理后12小時；k，谷氨酸處理后16小時；和I，谷氨酸處理后26小時。用α-生育三烯酚(250nM)預(yù)處理的谷氨酸攻擊的神經(jīng)元抗變性并持續(xù)生長。m，谷氨酸處理后28小時；n，谷氨酸處理后30小時；o，谷氨酸處理后32小時；和p，谷氨酸處理后34小時。已經(jīng)附加了兩張(i-I和m-p).avi視頻顯微照片用于在線公開。200倍放大率。
用α-生育三烯酚預(yù)處理細(xì)胞不僅防止谷氨酸-誘導(dǎo)的神經(jīng)變性，而且在10nM谷氨酸存在下保持神經(jīng)元生長(圖2)。通過定時相差顯微鏡術(shù)觀察到原代神經(jīng)元中針對谷氨酸誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)改變的保護(hù)(圖2)。在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)板中生長的神經(jīng)元具有成功的圖像，而不必使它們生長在玻璃蓋玻片上。在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，神經(jīng)元和它們的軸-樹突網(wǎng)絡(luò)相當(dāng)能動。在生育三烯酚處理的細(xì)胞的顯微照片中這明顯可見，其中谷氨酸在觸發(fā)神經(jīng)毒性中無效(圖2)。谷氨酸處理的對照神經(jīng)元的定時成像揭示網(wǎng)絡(luò)破壞前細(xì)胞結(jié)構(gòu)運(yùn)動的阻滯(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例3培養(yǎng)物中12-LOX敲除小鼠神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)首先，我們測試了在我們的模型中谷氨酸誘導(dǎo)的死亡的執(zhí)行中12-LOX的參與。我們通過使用12-LOX特異抑制劑黃芩黃素或者BL15開始。參考圖3，將TH4神經(jīng)元(A)用或不用α-生育三烯酚(250nM)或者BU 5(2.5μM，12-脂加氧酶抑制劑)處理5分鐘，然后用谷氨酸(10mM)攻擊。用碘化丙錠(PI)排阻流式細(xì)胞術(shù)測定法測定細(xì)胞生存力。PI-＝活的，PI+＝死亡的。將大鼠原代未成熟皮層神經(jīng)元(B-D)用或不用α-生育三烯酚(100nM)或者BL15(2.5μM)處理5分鐘，然后用谷氨酸(10mM；B)；L-高半胱磺酸(1mM；C)或者丁硫氨酸亞砜胺(0.15mM；BSO；D)攻擊24小時。用50μM花生四烯酸攻擊24小時。BL15，黃芩黃素5，6，7-三羥基黃酮。μ-生育三烯酚和BL15都保護(hù)神經(jīng)元免于谷氨酸攻擊，盡管喪失了細(xì)胞谷胱甘肽(GSH；E)。B-E 與相應(yīng)對照未處理組相比較低；*，與相應(yīng)毒素處理的組相比較高。P＜0.05。
用BL15對細(xì)胞的預(yù)處理顯然保護(hù)TH4細(xì)胞以及原代神經(jīng)元免于谷氨酸誘導(dǎo)的死亡(圖3A和B)。此外，BL15預(yù)處理保護(hù)原代神經(jīng)元免于L-高半胱磺酸或者BSO觸發(fā)的毒性(圖3C&D)。我們以前已經(jīng)報導(dǎo)nM α-生育三烯酚保護(hù)HT4細(xì)胞免于谷氨酸誘導(dǎo)的死亡而不阻礙細(xì)胞GSH的谷氨酸誘導(dǎo)的喪失(27)。相比而言，針對谷氨酸毒性作用的BL15依賴性的保護(hù)與谷氨酸處理的原代神經(jīng)元中降低的GSH水平有關(guān)(圖3E)。盡管一些關(guān)鍵文章已經(jīng)給出了藥理學(xué)證據(jù)支持谷氨酸誘導(dǎo)的12-LOX激活在神經(jīng)元死亡的執(zhí)行中起重要作用，但是仍然沒有結(jié)論性證據(jù)。
實(shí)施例4生育三烯酚對12-脂加氧酶的抑制已知維生素E和它的類似物是5-LOX的有效抑制劑(37)。該效應(yīng)獨(dú)立于維生素E的抗氧化性質(zhì)。還已知維生素E通過與酶蛋白質(zhì)特異復(fù)合來抑制15-LOX活性(38)。已經(jīng)提出可誘導(dǎo)的12-LOX在谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡的執(zhí)行中的中心作用(16，20)。從而，我們設(shè)法檢查維生素Eα-生育三烯酚是否通過抑制12-LOX活性來保護(hù)谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)變性。
已經(jīng)提出了可誘導(dǎo)的12-LOX在谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡的執(zhí)行中的中心作用(Li等人，1997；Tan等人，2001)。參考圖4，用谷氨酸(10mM)攻擊鼠原代未成熟皮層神經(jīng)元細(xì)胞(C57BL/6，A；B6.129S2-A/ox15tmlFun，B)24小時。通過乳酸脫氫酶測定評估細(xì)胞生存力。在圖1的圖例中描述了處理說明。α-生育三烯酚，100nM， 與相應(yīng)對照未處理組相比較低，與12-脂加氧酶缺陷的神經(jīng)元中的相應(yīng)組比較也較低；*，與相應(yīng)毒素處理組相比較高。P＜0.05。
從12-LOX缺陷小鼠分離的神經(jīng)元抗谷氨酸誘導(dǎo)的死亡(圖4)。該顯著發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)了我們測試α-生育三烯酚作為神經(jīng)元細(xì)胞中谷氨酸可誘導(dǎo)的12-LOX活性抑制劑的興趣。參考圖5，使用基于HPLC的分析方法評估谷氨酸處理的神經(jīng)元中12-脂加氧酶活性的產(chǎn)物。圖A描繪了脂加氧酶活性的關(guān)鍵副產(chǎn)物HETE的代表性層析譜；圖B描繪了谷氨酸處理12小時的結(jié)果，導(dǎo)致TH4神經(jīng)元中12-脂加氧酶活性的一種產(chǎn)物12(S)-HETE水平的升高。ND，不可檢測的。觀察到在基本培養(yǎng)條件下沒有檢測到HT4細(xì)胞中12-LOX活性的副產(chǎn)物12(S)-HETE(圖5)。谷氨酸處理顯著增加了細(xì)胞12(S)-HETE含量。然而，在α-生育三烯酚處理的細(xì)胞中防止了此類增加(圖5)。這種觀察導(dǎo)致TH4細(xì)胞中12-LOX的超表達(dá)是否將使它們對谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性敏感和α-生育三烯酚是否將抵抗此類毒性的問題。
參考圖6，將HT4細(xì)胞進(jìn)行谷氨酸處理2小時。處理導(dǎo)致12-脂加氧酶在胞質(zhì)溶膠中的存在減小(A)和膜中的存在增加(B)，從而提示該酶從胞質(zhì)溶膠向膜的移動。圖C描繪了HT4細(xì)胞中12-脂加氧酶的成功的超表達(dá)；圖D描繪了α-生育三烯酚對純12-脂加氧酶活性的劑量依賴性的抑制。將純化的12-脂加氧酶(豬白細(xì)胞；10單位)與[14C]-花生四烯酸(25μM)在37℃溫育30分鐘。用如材料和方法中描述的薄層層析分辨花生四烯酸和12-HETE。我們觀察到在HT4細(xì)胞中，用谷氨酸處理使胞質(zhì)溶膠12-LOX蛋白質(zhì)運(yùn)動到細(xì)胞膜(圖6A&B)。[14C]-花生四烯酸存在下12-LOX活性的薄層層析分析揭示α-生育三烯酚非劑量依賴性地抑制純酶的活性(圖6D)。
實(shí)施例5 12-LOX的三維建模參考圖7，進(jìn)行了12-脂加氧酶和α-生育三烯酚對接分析的三維建模。A，12-脂加氧酶的三維結(jié)構(gòu)。在Silicon Graphics 02上以300MHz MIPS R5000，OS IRIX release 6.5進(jìn)行同源性模型構(gòu)建。用Sybyl GeneFold module(v6.8，Tripos，Inc.，St.Louis，MO)構(gòu)造12-脂加氧酶的理論模型。B & C，理論模型和α-生育三烯酚對接(所示兩個位置B和C具有10個不同對接位置)。鐵原子側(cè)翼的紅色氨基酸殘基為His-360、His-365、His-540和Ile-663，它們以粗體顯示。D，10個不同對接位置的Autodock計算的結(jié)合自由能，并將它們以結(jié)合能按升序排列。RMSD，均方根差。脂加氧酶的N-末端結(jié)構(gòu)域包含8鏈反平行β桶并且其分子大小隨著其基因組來源(哺乳動物或植物)而變(Minor等人，1996)。理論模型的大小和結(jié)構(gòu)的描述與1YGE的晶體結(jié)構(gòu)匹配。在哺乳動物物種中，蛋白質(zhì)的C-末端形成酶的催化結(jié)構(gòu)域，并且由約18-22個螺旋和一個反平行β桶折疊組成。兩個長的中心螺旋在活性位點(diǎn)交叉并且包括用于結(jié)合鐵配體的組氨酸(Minor等人，1996)。在我們的理論模型中在360、365和540位觀察到這些組氨酸(圖7A)。末端異亮氨酸在保持活性位點(diǎn)腔的大小中起重要作用(Borngraber等人，1999)。對于理論模型，也可以看到鐵原子活性中心的腔。這是雙加氧(dioxygenation)反應(yīng)和底物結(jié)合的中心(Gillmor等人，1997)。在理論模型中可以觀察到30個溶劑腔，最大的腔大小為124Cu.A，其位于活性位點(diǎn)附近。理論模型的PROCHECK蛋白質(zhì)幾何計算出85％的殘基處于允許區(qū)中，相比而言1YGE的為88％。剩下的殘基處于相對允許區(qū)。Autodock計算10個不同對接位置的結(jié)合自由能并且將它們以結(jié)合能按升序排列(圖7D)。從結(jié)合自由能和配體的內(nèi)能計算對接能。隨后將抑制常數(shù)與對接能相聯(lián)系。我們發(fā)現(xiàn)α-生育三烯酚在接近活性位點(diǎn)的溶劑腔的開口處濃縮(圖7B和C)。
實(shí)施例2-5的材料和方法材料從所示來源得到下面的材料。L-谷氨酸單鈉鹽；花生四烯酸、二甲基亞砜；L-丁硫氨酸-[S，R]亞砜胺；L-高半胱磺酸(Sigma St.Louis，MO)；黃芩黃素；5，6，7，三羥基黃酮(BL15；Oxford BiomedicalResearch，Oxford，MI)；生育三烯酚(BASF，德國；Carotech，馬來西亞)。對于細(xì)胞培養(yǎng)，使用Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基；極限必需培養(yǎng)基；胎牛血清和青霉素和鏈霉素(Gibco，Gaithersburg，MD)；和培養(yǎng)皿(Nunc，Denmark)。
細(xì)胞培養(yǎng)使小鼠海馬HT4細(xì)胞生長在含有95％空氣和5％CO2的濕潤空氣中37℃下補(bǔ)加10％胎牛血清、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100μg/ml)的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基中。由D.E.Koshland Jr.博士(University of California at Berkeley)提供HT4細(xì)胞(Sen等人2000)。原代皮層神經(jīng)元。從大鼠胎兒(Sprague Dawley；妊娠17天)或小鼠胎兒(C57BL/6小鼠，妊娠14天)的大腦皮層如所描述的分離細(xì)胞(Murphy等人，1990)。對于12-LOX敲除研究，從B6.129S2-Alox15tmlFun(Jackson Laboratory，MI)的胎兒分離神經(jīng)元。從腦分離后，對細(xì)胞計數(shù)并將其以每35mm平板2-3×106個細(xì)胞的密度接種在培養(yǎng)板中(Murphy等人，1990)。使細(xì)胞生長在補(bǔ)加10％熱滅活的胎牛血清、40μM胱氨酸和抗生素(100μg/ml鏈霉素，100單位/ml青霉素，0.25μtg/ml兩性霉素)的極限必需培養(yǎng)基(MEM)中。培養(yǎng)物在37℃于5％CO2和95％空氣中在濕潤培養(yǎng)箱中保持。所有實(shí)驗(yàn)都在鋪板后24小時進(jìn)行。
用神經(jīng)毒性劑處理。緊在實(shí)驗(yàn)前，將培養(yǎng)基用補(bǔ)加血清和抗生素的新鮮培養(yǎng)基代替。以水溶液將谷氨酸(10mM)加入培養(yǎng)基(Han等人，1997a；Sen等人，2000；Tirosh等人，2000)。沒有觀察到加入谷氨酸引起的培養(yǎng)基pH改變。用于誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞死亡的其他試劑已經(jīng)在相關(guān)附例中描述。維生素E處理。在乙醇中制備α-生育三烯酚的貯存液(103×工作濃度)。將各自對照用等體積(0.1％，v/v)乙醇處理。如各自圖例中指出的谷氨酸處理前或者谷氨酸處理后5分鐘將α-生育三烯酚加入培養(yǎng)皿。
測定細(xì)胞生存力。使用我們以前描述的(Sen等人，2000；Tirosh等人，2000)流式細(xì)胞儀，使用碘化丙錠排阻測定法測定HT4細(xì)胞的生存力。因?yàn)樵窠?jīng)元培養(yǎng)物在流式細(xì)胞術(shù)期間傾向于聚集，所以使用來自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO，美國)的體外毒理學(xué)測定試劑盒通過測量谷氨酸處理后24小時乳酸脫氫酶(LDH)從細(xì)胞向培養(yǎng)基的泄漏(Han等人，1997a)來評估這些細(xì)胞的生存力。該方案已經(jīng)在以前報導(dǎo)(Han等人，1997a)中詳細(xì)描述。簡言之，使用下面的等式確定細(xì)胞生存力生存力＝單細(xì)胞層中細(xì)胞的LDH活性/總LDH活性(即，單細(xì)胞層中細(xì)胞的LDH活性+脫附的細(xì)胞的LDH活性+細(xì)胞培養(yǎng)基中的LDH活性)。
12-脂加氧酶表達(dá)為了在TH4中超表達(dá)12-LOX，用質(zhì)粒pcDNA 3.1 12-LOX(ResGen，Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)或pcDNA 3.1，使用Fugene 6(Roche Molecular Biochemical，Indianapolis，IN)按照生產(chǎn)商的說明瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞。為了評估12-LOX表達(dá)水平，轉(zhuǎn)染后24小時收獲HT4細(xì)胞并使用BCA蛋白質(zhì)試劑測定蛋白質(zhì)濃度。在NuPAGETM 4-12％Bis-Tris凝膠(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)上在還原條件下分離樣品(20μg蛋白質(zhì)/泳道)，將樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜，并用12-LOX多克隆抗血清(Cayman chemicals，AnnArbor，Michigan)探測。為了評估裝載效率，將膜剝?nèi)ゲ⒂每功?肌動蛋白抗體(Sigma St.Louis，MO)再次探測。
胞質(zhì)溶膠制備將細(xì)胞(1.7×106)接種在140×20mm板中。12-18小時后，用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞(2×板/樣品)并通過從皿刮除來收獲。將樣品以700g旋轉(zhuǎn)(4℃，5分鐘)。向細(xì)胞沉淀加入緩沖液(400μl)，其含有10mM HEPES，pH 7.8，10mM KCl，1mM，EDTA-Na2，2mMMgCl2，5％甘油，1mM二硫蘇糖醇，1mM苯甲基磺酰氟，5μg/ml亮抑酶肽，5μg/ml抑酶肽和5μg/ml抗蛋白酶。重懸浮樣品并在冰上保持15分鐘。15分鐘后，向每個樣品加入30μl 10％NP40并將樣品渦旋30秒。然后以14,000g在4℃離心20分鐘。收集上清液胞質(zhì)溶膠并在-80℃保存。用BCA蛋白質(zhì)試劑測定蛋白質(zhì)濃度。
總膜制備將細(xì)胞(1.7×106)接種在140×20mm平板中。12-18小時后，收獲細(xì)胞(每種樣品5板)用于總膜制備。如以前描述的制備總膜(Bashan等人，1992)。用冰冷的PBS洗滌后，通過刮除收獲細(xì)胞。將樣品以700g旋轉(zhuǎn)(4℃，10分鐘)。向細(xì)胞沉淀加入緩沖液(10ml)，其含有20mM HEPES-Na，pH 7.4 250mM蔗糖，2mM EGTA，1mM疊氮化鈉，100μM苯甲基磺酰氟，1μM蛋白酶抑制劑混合物(SigmaSt.Louis，MO)。用馬達(dá)驅(qū)動的勻漿器(15沖程)在4℃勻漿樣品。于760g旋轉(zhuǎn)樣品(4℃，3分鐘)。離心后，收集上清液并以190,000g旋轉(zhuǎn)(4℃，1小時)。將所得總膜沉淀重懸浮在上述緩沖液中并在-80℃保存樣品。用BCA蛋白質(zhì)試劑測定蛋白質(zhì)濃度。
12-脂加氧酶活性為了研究生育三烯酚是否直接影響12-LOX(12-LOX)的活性，將10單位12-LOX(Biomol Research labs Inc，Plymouth Meeting，PA)如各自圖例中指出的與或不與生育三烯酚在室溫溫育15分鐘。反應(yīng)混合物含有50mM Tris HCl，pH 7.4和1mM EDTA。15分鐘后，通過每個樣品加入25μM[1-14C]-花生四烯酸開始反應(yīng)。將樣品在37℃保持30分鐘。通過加入200μl冰冷的終止溶液來終止反應(yīng)，所述終止溶液含有30∶4∶1體積比的二乙醚、甲醇和1M檸檬酸?；旌虾?，離心樣品并將乙醚萃取物點(diǎn)樣在硅膠薄層板上。用溶劑系統(tǒng)(85∶15∶0.1體積比的二乙醚、石油醚和乙酸)在-20℃進(jìn)行薄層層析45-60分鐘。用成像分析儀定量板上底物和產(chǎn)物的放射性分布。
谷胱甘肽測定用HPLC-庫侖電極陣列檢測器(Coularray Detector-model 5600with 12 channels；ESA Inc.，Chelmsford，MA)檢測谷胱甘肽(GSH)。用于谷胱甘肽測定的樣品制備、流動相和柱子如以前描述(Sen等人，2000)。作為以前報導(dǎo)的方法的改進(jìn)，當(dāng)前方法提供了用于檢測谷胱甘肽的庫侖電極陣列檢測器(Roy等人，2002)。該系統(tǒng)使用具有不同氧化還原電位的多通道。在設(shè)置為下面電位的通道檢測谷胱甘肽I)600mV，II)700mV；和III)800mV。將來自設(shè)置為800mV的信號用于定量(Sen等人，2000)。
12-HETE檢測用基于HPLC-UV的方法檢測來自HT4細(xì)胞的12-羥基二十碳四烯酸(HETE)(Eberhard等人，2000)。
免疫熒光顯微鏡術(shù)對于免疫熒光顯微鏡術(shù)，將大鼠皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng)物鋪在用聚-L-賴氨酸預(yù)先涂覆的35mm板上。24小時后，用α-生育三烯酚或者BL15處理細(xì)胞5分鐘，然后用谷氨酸攻擊或者暴露于谷氨酸。24小時的谷氨酸暴露后，將細(xì)胞用PBS洗滌三次，在4％多聚甲醛中室溫下固定10分鐘，并在室溫下用PBS-T(含有0.2％Triton X-100的PBS)透化20分鐘。將樣品用PBS-T沖洗3次并在室溫下封閉(PBS-T中的2％BSA)1小時。封閉后，將樣品與第一抗體{抗神經(jīng)絲200(1∶100，Sigma St.Louis，MO)或者III類神經(jīng)元β-微管蛋白(1∶500，Covance Berkeley，CA)}在4℃過夜溫育。用PBS洗滌(3次，每次5分鐘)后，將樣品與Alexa Fluor 488綴合的山羊抗-小鼠或者抗兔(Molecular Probes Eugene，OR)第二抗體在室溫溫育45分鐘。然后用PBS洗滌三次，并在水性介質(zhì)中封固。用Zeiss Axiovert 200M顯微鏡收集熒光圖像。用Axiovision 3.1獲得圖像。
活細(xì)胞成像對于活細(xì)胞成像，將大鼠皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng)物鋪在用聚-L-賴氨酸預(yù)先涂覆的35mm板上。對于來自谷氨酸暴露8小時到26小時(18小時持續(xù)時間)的未處理細(xì)胞進(jìn)行活細(xì)胞成像，因?yàn)檫@是形態(tài)學(xué)改變最顯著的時間。α-生育三烯酚處理的細(xì)胞對谷氨酸不敏感。這些細(xì)胞從谷氨酸處理后26小時-34小時(8小時持續(xù)時間)成像以證明健康生長模式。用適于常規(guī)培養(yǎng)板中生長的細(xì)胞成像的專門的相差Zeiss光學(xué)裝置每15分鐘收集一次圖像。顯微鏡安裝適當(dāng)?shù)母郊杂靡员３昼R臺處于與培養(yǎng)箱相當(dāng)?shù)?7℃和氣體環(huán)境。用Axiovision 4.0將圖像輸出到.avi視頻格式。
12-脂加氧酶模型在具有300MHz MIPS R5000，OS IRIX release 6.5的SiliconGraphics 02上實(shí)施同源性模型構(gòu)造。用Sybyl GeneFold模塊(v6.8，Tripos，Inc.，St.Louis，MO)建立12-LOX的理論模型。該模塊用對RSCB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http//www.rcsb.org/pdb)進(jìn)行的BLAST檢索以尋找可能的蛋白質(zhì)比對。用于鑒定同源蛋白質(zhì)的模塊使用四個打分函數(shù)，它們包括序列相似性、局部相互作用、埋藏相似性和二級結(jié)構(gòu)相似性。這些特征組合反映為“比對得分”，其中得分1000表明關(guān)于所有打分函數(shù)的完美比對。血小板型12-LOX的靶序列從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫得到。BLAST檢索指出與大豆1-LOX 97％序列相似性和999.9的“比對得分”(PDB編碼1YGE)(Bernstein等人，1977)，反映了與靶序列相似的折疊模式。1YGE的結(jié)構(gòu)隨后用作使用Sybyl中的“主鏈方法”選項(xiàng)建模的模板蛋白質(zhì)。用Tripos力場，采用恒定介電函數(shù)(ε2.0)和非結(jié)合的截斷距離8.OA進(jìn)行分子力學(xué)計算。分配Gasteiger-Hückel電荷后通過0.05kcal/mol的能量會聚梯度值將最終結(jié)構(gòu)能量最小化。然后將鐵原子建模成理論模型。用PROCHECK(Laskowski，1993)檢查蛋白質(zhì)幾何學(xué)并將其與模板蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)1YGE進(jìn)行比較。
α-生育三烯酚與12-脂加氧酶的對接用Autodock(v3.0.5)(Morris，2001)實(shí)施配體結(jié)合研究。Autodock是三個程序Autotors、Autogrid和Autodock的匯編(Goodsell等人，1996)。Autotors方便輸入配體坐標(biāo)，autogrid事先基于分子坐標(biāo)計算相互作用能量的三維柵格，而autodock使用Lamarckian遺傳算法(Genetic Algorithm)進(jìn)行對接模擬。將配體分子α-生育三烯酚用Sybyl-Sketch Molecule選項(xiàng)構(gòu)建，使能量最小化并分配MOPAC電荷。然后用AutoDock中的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置和參數(shù)進(jìn)行對接。用MOLMOL(v2K.2)(MOLecule分析和MOLecule展示)軟件產(chǎn)生理論模型和對接圖。
數(shù)據(jù)顯示以條形圖顯示的數(shù)據(jù)為平均值±SD。用斯氏t檢驗(yàn)測試平均值之間差異的顯著性。將p＜0.05解釋成平均值之間的顯著差異。
實(shí)施例6生育三烯酚保護(hù)心臟細(xì)胞免于12-LOX途徑的活化誘導(dǎo)的死亡遍在表達(dá)的胞質(zhì)溶膠磷脂酶A(2)(PLA(2))產(chǎn)生花生四烯酸在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、炎癥和腫瘤發(fā)生中具有重要作用。12-脂加氧酶(12-LO)催化花生四烯酸(C20:4)向12-氫過氧二十碳四烯酸的轉(zhuǎn)化，12-氫過氧二十碳四烯酸又由谷胱甘肽過氧化物酶還原成12-羥基二十碳四烯酸(12-HETE)。我們已經(jīng)表明生育三烯酚有效抑制12-LOX途徑的活化。12-LOX的活化與心臟的多種病理有關(guān)。實(shí)施本工作并且其證明生育三烯酚可以保護(hù)心臟細(xì)胞免于12-LOX途徑的活化。
用從成年(5-6周齡)小鼠心室分離的原代心臟成纖維細(xì)胞(CF)進(jìn)行測定。細(xì)胞培養(yǎng)在5％O2條件下。分離后5天，在250nM生育三烯酚存在或不存在下用花生四烯酸(50μM)+丁硫氨酸亞砜胺處理分離的細(xì)胞24小時。用Zeiss活細(xì)胞成像顯微鏡進(jìn)行相差成像。
參考圖8，分離后5天將所分離的心臟成纖維細(xì)胞用花生四烯酸(AA)(50μM)+丁硫氨酸亞砜胺(BS)在250nM生育三烯酚(T3)存在或不存在下處理24小時。用Zeiss活細(xì)胞成像顯微鏡進(jìn)行相差成像。24小時后，在用12-LO的底物AA；和已知抑制細(xì)胞谷胱甘肽合成的BSO處理的心臟細(xì)胞中觀察到大量細(xì)胞死亡。已經(jīng)提出降低細(xì)胞谷胱甘肽以觸發(fā)12-LOX途徑的活化。生育三烯酚完全阻斷AA+BSO誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(圖8)。
實(shí)施例7胎兒大鼠腦和成年腦中生育三烯酚濃度的增加本文公開的結(jié)果提供了正發(fā)育的胎兒腦中維生素E敏感基因的首次全局評估。在所研究的8000種基因中，僅17種基因顯示出由于對母親喂飼維生素E導(dǎo)致胎兒腦中基因表達(dá)水平增加，而34種顯示出表達(dá)的減小，表明高度特異組的基因?qū)φl(fā)育的胎兒腦中維生素E水平敏感。
基于成體中原發(fā)性維生素E缺乏的癥狀，已經(jīng)證明維生素E在保持神經(jīng)學(xué)結(jié)構(gòu)和功能中具有重要作用。然而，缺少系統(tǒng)地評估維生素E對腦作用的分子基礎(chǔ)的努力。我們的數(shù)據(jù)表明胎兒腦中α-生育酚水平為母親腦中觀察到的水平的幾分之一。該數(shù)據(jù)與前面的研究一致，在前面研究中，胎兒腦中α-生育酚水平與21天齡的大鼠腦相比較低。此外，在人類中，已知足月新生兒中血清α-生育酚水平為它們的母親的幾分之一(0.212±0.127對1.160±0.513mg/dl)。我們以前表明與α-生育酚相比，生育三烯酚在保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免于谷氨酸誘導(dǎo)的變性中明顯更有效。然而，缺少證明腦中可以利用飲食生育三烯酚的體內(nèi)數(shù)據(jù)。本研究首次提供了證據(jù)證明在妊娠期間飲食補(bǔ)充TRF導(dǎo)致母親和胎兒腦中α-生育三烯酚的顯著富集。飲食維生素E在腸中被吸收并且由脂蛋白攜帶到肝臟。在肝臟中，α-生育酚級分由α-生育酚轉(zhuǎn)移蛋白摻入到極低密度脂蛋白(VLDL)，然后分泌到血流中。最近的研究表明B類I型清除劑受體(SR-BI)(其介導(dǎo)從脂蛋白的細(xì)胞選擇性膽固醇酯吸收)促進(jìn)α-生育酚從高密度脂蛋白(HDL)向所培養(yǎng)細(xì)胞的有效轉(zhuǎn)移。此外，在SR-BI缺陷突變小鼠中，相對于野生型對照動物，血漿α-生育酚水平顯著升高(1.1到1.4倍高)，其主要是由于它們的異常大血漿HDL樣顆粒的升高的α-生育酚含量。器官和組織中生育三烯酚的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制在成年組織中知之甚少，在胎兒組織中更是如此。
HO-3是在胎兒腦中上調(diào)的一些維生素E敏感基因之一。HO同工酶HO-1、HO-2和HO-3是熱激蛋白32蛋白質(zhì)同源物，其具有催化血紅素分子，包括NO合酶的血紅素分子的異構(gòu)體特異性氧化的已知功能。HO-1是高度誘導(dǎo)型的，而HO-2和HO-3為組成性表達(dá)。這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞防御機(jī)制中起重要作用。HO活性負(fù)責(zé)等摩爾量CO、膽綠素和游離鐵的產(chǎn)生。用HO進(jìn)行的最近的發(fā)現(xiàn)表明這些蛋白質(zhì)可以作為NO的細(xì)胞內(nèi)“池”。鑒定LINE1是另一種維生素E敏感轉(zhuǎn)錄物。LINE-1，或者散布重復(fù)序列的L1家族占哺乳動物基因組的至少10％。像其他生物的基因組中其他散布重復(fù)序列DNA家族一樣，L1通過一系列復(fù)制轉(zhuǎn)座事件在整個基因組中散布和擴(kuò)增。由于基因組中L1序列的高拷貝數(shù)，所以L1是在多數(shù)細(xì)胞的RNA群體中大量存在的。然而，含有L1的多數(shù)轉(zhuǎn)錄物是偶然轉(zhuǎn)錄的結(jié)果并且不是L1反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座中的中間物。該含有L1的轉(zhuǎn)錄物的高背景(許多轉(zhuǎn)錄物是截短和重排的)使得難以區(qū)分活性L1元件編碼的轉(zhuǎn)錄物。ApoB mRNA是與E-胎兒組相比在E+組中較低的主要候選者之一。ApoB在脂蛋白代謝中起重要作用并且在血漿中以兩種同種型apoB-100和apoB-48存在。高水平apoB和LDL膽固醇與冠心病的增加的危險有關(guān)。早先的研究表明施用TRF(100mg/天)降低血清apoB。已經(jīng)表明生育酚抑制細(xì)胞中蛋白激酶C(PKC)活性。PKC-調(diào)節(jié)的氯化物通道是在E+組受到抑制的基因之一。
測定母親和胎兒大鼠腦中的生育酚水平。參考圖9，將懷孕(3天)大鼠隨機(jī)分成(i)E+組-用富含α-生育酚的標(biāo)準(zhǔn)大鼠食物喂養(yǎng)。此外，對該組每天用懸浮在除去維生素E的玉米油中的TRF管飼補(bǔ)充，為期兩周；和(ii)E-組-用缺少維生素E的食物喂養(yǎng)并且補(bǔ)充相匹配體積的除去維生素E的玉米油。在妊娠第17天，收集腦并用HPLC進(jìn)行維生素E分析。*P＜0.05，與E+組相比顯著不同。#P＜0.05，與母親腦相比顯著不同。n.d.，未檢測到。胎兒腦中α-生育酚水平為母親腦中觀察到的水平的幾分之一(圖9A)。與E+組相比，妊娠期間用缺少維生素E的飲食喂養(yǎng)僅2周不顯著降低成年母親腦中的α-生育酚水平。然而，在相似條件下，與來自E+組的胎兒相比，來自E-組母親的胎兒在腦中具有顯著更低的α-生育酚水平(圖9A)。
在E-組的母親以及胎兒的腦中α-生育三烯酚低于檢測極限。在妊娠期間對母親經(jīng)口補(bǔ)充TRF 2周導(dǎo)致α-生育三烯酚遞送到母親以及胎兒腦。重要的是，在胎兒腦中生育三烯酚的摻入顯著高于母親腦中的(圖9B)。重要的是，妊娠飲食中短期維生素E缺乏不影響幼畜的重要參數(shù)，如體重或總體健康(申請人未公開的觀察)。
實(shí)施例8轉(zhuǎn)錄組(ttanscriptome)特征使用U34A大鼠基因組高密度寡核苷酸GeneChip陣列比較E+和E-組的正在發(fā)育的胎兒腦的轉(zhuǎn)錄組。該陣列分析約7000條全長序列和約1000個EST簇。使用從兩組可以得到的所有重復(fù)實(shí)驗(yàn)的原始數(shù)據(jù)，總共產(chǎn)生了6個逐對比較。計算差別表達(dá)的所有基因的平均(6個逐對比較)倍數(shù)改變。數(shù)據(jù)表明多數(shù)基因保持未改變(圖10)。與E-組相比，在維生素E+組中共645(7.3％)種基因受到上調(diào)。其中416種基因增加了兩倍或以上。另一方面，152(1.7％)種基因受到下調(diào)，其中的74種降低到1/2或以下(圖10)。使用本文描述的t檢驗(yàn)分析，觀察到與補(bǔ)充組相比，在維生素E缺乏組中總共144種基因顯著改變(P＜0.05)。根據(jù)中位數(shù)中心調(diào)節(jié)數(shù)據(jù)用于維生素E敏感基因的清楚的圖形表示(圖11A，B)。接著，選擇逐對比較中一致性超過50％的那些基因，特別是如果用冗余探針組檢測基因的話。使用該數(shù)據(jù)分析方法，發(fā)現(xiàn)共19個探針組受到上調(diào)并且與E-組相比在E+組中34種受到抑制(圖12和圖13)。參考圖12，從個體胎兒得到的腦中6個逐對比較，所述胎兒的母親在妊娠期間用維生素E+和維生素E-飲食喂養(yǎng)2周。選擇逐對比較中一致性超過50％的那些基因，特別是如果用冗余探針組檢測基因的話。排除不能得到描述的EST。參考圖13，從個體胎兒得到的腦中6個逐對比較，所述胎兒的母親在妊娠期間用維生素E+和維生素E-飲食喂養(yǎng)2周。選擇逐對比較中一致性超過50％的那些基因，特別是如果用冗余探針組檢測基因的話。排除不能得到描述的EST。
實(shí)施例9使用RT-PCR證實(shí)GeneChip數(shù)據(jù)使用常規(guī)半定量RT-PCR驗(yàn)證通過GeneChip方法鑒定的選擇維生素E敏感基因(圖14)。參考圖14，用RT-PCR獨(dú)立地確定表達(dá)水平。使用RT-PCR驗(yàn)證使用GeneChip微陣列分析鑒定為與E-組相比在E+組中差別表達(dá)的下列基因HO-3、細(xì)胞周期蛋白D1、HMG2、NOPP140和GAPDH。定量PCR產(chǎn)物的帶強(qiáng)度并計算與E-組相比E+組中每種基因的倍數(shù)改變(實(shí)心條形)。對于比較，對使用GeneChip微陣列分析(一個或多個探針組)在特定基因的表達(dá)中觀察到的倍數(shù)改變還進(jìn)行作圖(空的和陰影線的條形)。在上調(diào)的基因中，靶定HO-3的兩個探針組分別增加3.9和3.1倍(圖14)。相反，maspin、GAPDH、載脂蛋白B(apoB)和G蛋白β1亞基(rGb1)基因的表達(dá)響應(yīng)飲食維生素E而受到高度(3-5倍)抑制。定量PCR產(chǎn)物的帶強(qiáng)度并計算與E-組相比E+組中每種基因的倍數(shù)改變。數(shù)據(jù)表明對于基因上調(diào)的E+對E-組，使用GeneChip或者RT-PCR方法檢測的倍數(shù)改變是相當(dāng)?shù)?圖14)。對于GAPDH，微陣列和RT-PCR數(shù)據(jù)均表明與E-組相比，E+組中表達(dá)減小。然而，GAPDH表達(dá)中倍數(shù)改變在微陣列數(shù)據(jù)中比RT-PCR數(shù)據(jù)中高得多(圖14)。
實(shí)施例7-9的材料和方法將懷孕(3天)大鼠(10周齡；Sprague-Dawley，Harlan，Indianapolis，IN，美國)隨機(jī)分成下面的兩組(i)E+組-用富含α-生育酚(～200nmol/g飲食)的標(biāo)準(zhǔn)大鼠食物喂養(yǎng)。此外，對該組每天用懸浮在除去維生素E的玉米油(Harlan)中的富含生育三烯酚的級分(TRF)管飼補(bǔ)充，為期兩周；基于每千克體重將1g TRF中含有的110mgα-生育酚和119mg α-生育三烯酚混合物喂飼懷孕大鼠。以Carotech Sdn Bhd(Perak，馬來西亞)提供的Tocomin50％的形式提供TRF；(ii)E-組-用缺少維生素E的食物(TD88163，Harlan；α-生育酚/生育三烯酚水平低于檢測極限)喂養(yǎng)并且補(bǔ)充相匹配體積的除去維生素E的玉米油。所有大鼠都在標(biāo)準(zhǔn)條件下于22±2℃以12∶12小時黑暗∶光亮周期保持。所有動物方案都得到Ohio State University，Columbus，OH，美國的Institutional Laboratory Animal Care and UseCommittee(ILACUC)的批準(zhǔn)。樣品收集。在妊娠第17天，記錄每只大鼠的體重。殺死大鼠。取出母親和胎兒腦，用冰冷的磷酸緩沖鹽水，pH 7.4(PBS)沖洗并在液氮中驟凍。將樣品在-80℃短暫保存。
維生素E提取和分析如以前描述的使用HPLC-庫侖電極陣列檢測器(CoularrayDetector-model 5600，具有12個通道；ESA Inc.，Chelmsford，MA，美國)進(jìn)行從母親和胎兒腦的維生素E提取和分析[13]。該系統(tǒng)使用具有不同氧化還原電位的多通道。檢測分別設(shè)置為200mV、300mV和400mV的通道上的α-、γ-和δ-生育酚和生育三烯酚。
Affymetrix GeneChip探針陣列分析通過在液氮中粉碎胎兒腦然后用Trizol(Gibco BRL)提取來提取總RNA[14和15]。用RNeasy試劑盒(Qiagen)進(jìn)行RNA的進(jìn)一步提純。根據(jù)以前描述的方案[14]制備用于微陣列雜交的靶。為了評估樣品質(zhì)量，將樣品在45℃與GeneChip Test-2陣列雜交16小時。使?jié)M意的樣品與大鼠基因組(Rat Genome)陣列(U34A)雜交。將陣列洗滌，用鏈霉抗生素蛋白-藻紅蛋白染色，然后用我們自己的設(shè)施中的GeneArray掃描儀(Agilent Technologies)掃描。
收集原始數(shù)據(jù)并使用Affymetrix Microarray Suite 4.0(MAS)和Data Mining Tool 2.0(DMT)軟件進(jìn)行分析。下面的兩種方法用于鑒定差別表達(dá)的基因(i)使用MAS中的比較分析，從E+和E-組的重復(fù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生六個逐對比較。為上調(diào)和下調(diào)的基因計算平均倍數(shù)改變。選擇逐對比較中一致性超過50％的基因，特別是如果用冗余探針組檢測基因的話；(ii)使用DMT進(jìn)行t檢驗(yàn)，并選擇與E-組相比E+組中顯著(P＜0.05)改變(增加或減小)的基因。將所選基因的平均差異值加載到Cluster和TreeView軟件[16]。根據(jù)中位數(shù)中心調(diào)節(jié)數(shù)據(jù)以得到維生素E敏感基因的清晰的圖形表示。
逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)如以前描述的[17]，使用RT-PCR獨(dú)立地測定血紅素加氧酶3(HO-3)、細(xì)胞周期蛋白D1、高速泳動族蛋白2(HMG2)、核仁磷蛋白p130(NOPP140)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)mRNA的表達(dá)水平。簡言之，使用寡脫氧胸苷酸引物和Superseript II將總RNA(1μg)轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用如表1中描述的基因特異性引物通過PCR擴(kuò)增RT-產(chǎn)生的cDNA。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物在含有0.25μg/ml溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠中電泳。在紫外透照條件下對凝膠數(shù)字成像。使用基于NIH Image軟件的Scion Image(Scion Corporation)進(jìn)行帶強(qiáng)度定量。
表1 用于RT-PCR的引物
實(shí)施例10生育三烯酚制劑#2每份食物的量％ 每天值維生素E..............................98.8iu329％混合的生育酚一般分布γ-生育酚.........................210.0mgδ-生育酚..........................78.4mgα-生育酚..........................66.3mgβ-生育酚..........................3.5mgTocomin全譜天然生育三烯酚復(fù)合物 *一般分布γ-生育三烯酚.....................35.5mgα-生育三烯酚......................18.5mgδ-生育三烯酚......................9.3mg貫穿本說明書全文中提到的所有專利、專利申請(和在其上公開的任何專利，以及任何相應(yīng)公開的外國專利申請)、GenBank和其他編號和相關(guān)數(shù)據(jù)，和出版物都在此處完整引用作為參考。然而，不是明確承認(rèn)引用作為本文參考的任何文獻(xiàn)教導(dǎo)或公開了本發(fā)明。
應(yīng)該理解貫穿本說明書全文中給出的每個最大數(shù)字界限將包括每個較低的數(shù)字界限，就像此類較低的數(shù)字界限在此處明確寫出一樣。該說明書中給出的每個最小數(shù)字界限將包括每個較高的數(shù)字界限，就像此類較高的數(shù)字界限在此處明確寫出一樣。貫穿該說明書全文中給出的每個數(shù)字范圍將包括落入此類較寬數(shù)字范圍內(nèi)的每個較窄的數(shù)字范圍，就像此類較窄的數(shù)字范圍在此處明確寫出一樣。
盡管已經(jīng)描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但是對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是可以進(jìn)行本發(fā)明的多種改變和修飾而不背離本發(fā)明的精神和范圍。此外，盡管已經(jīng)結(jié)合本發(fā)明的某些具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是將理解這是用于闡明并且不作為限制，并且本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求限定，將所述權(quán)利要求在現(xiàn)有技術(shù)允許的范圍內(nèi)盡可能寬的理解。
考慮此處公開的本發(fā)明的說明書和實(shí)踐后，本發(fā)明的其他實(shí)施方案對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。意在將本發(fā)明說明書和實(shí)施例理解為僅是示例性的，本發(fā)明的真實(shí)范圍和精神由下面的權(quán)利要求書指出。
權(quán)利要求
1.抑制受試者中12-脂加氧酶介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的方法，其包括對該受試者施用生物有效量的生育三烯酚。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者處于發(fā)展為神經(jīng)元損傷、心臟組織損傷、體被損傷、肌肉組織損傷或它們的組合的危險中。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述生育三烯酚選自α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、γ-生育三烯酚、δ-生育三烯酚、它們的衍生物，和它們的一種或多種的組合。
4.權(quán)利要求1的方法，其中每天一次所施用的生育三烯酚組合物的量為約600mg。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物基本上無生育酚。
6.治療患有創(chuàng)傷的受試者的方法，其包括對所述受試者施用生物有效量的生育三烯酚。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述創(chuàng)傷是中風(fēng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述創(chuàng)傷是心臟創(chuàng)傷。
9.預(yù)防或治療癌癥的治療方案，其包括對需要所述治療方案的受試者施用藥學(xué)有效量的包含生育三烯酚和可藥用載體的藥物制劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述受試者處于發(fā)展為黑素瘤的危險中。
11.保護(hù)胎兒中神經(jīng)元的方法，其包括對懷有所述胎兒的孕婦施用包含至少一種生育三烯酚的組合物的步驟。
12.增加人類受試者的腦中生育三烯酚濃度的方法，其包括對該受試者施用包含至少一種生育三烯酚的組合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述組合物基本上無生育酚并且在不存在含有生育酚的食品或飲食補(bǔ)料的條件下施用。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中在所述人攝入含有生育酚的食品或飲食補(bǔ)料之后至少半小時和之前至少半小時施用所述混合物。
15.權(quán)利要求12的方法，其中所述組合物包含Tocomin。
16.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述人類受試者是嬰兒并且所述組合物是從施用包含至少一種生育三烯酚的組合物的婦女得到的乳或乳提取物。
17.權(quán)利要求12的方法，其中所述生育三烯酚選自α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、γ-生育三烯酚、δ-生育三烯酚、它們的衍生物，和它們的一種或多種的組合。
18.權(quán)利要求12的方法，其中每天一次所施用的生育三烯酚組合物的量為約600mg。
19.提高需要其的動物中生育力的方法，其包括每天一次對所述動物施用有效量的至少一種生育三烯酚，為期至少2個月。
20.權(quán)利要求19的方法，其中每天一次所施用的生育三烯酚組合物的量為約600mg。
21.權(quán)利要求19的方法，其中受試者中編碼生育酚轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因的表達(dá)已經(jīng)被中斷。
22.保持培養(yǎng)物中神經(jīng)元的方法，其包括將神經(jīng)元與包含至少一種生育三烯酚的培養(yǎng)基接觸。
全文摘要
提供了包含生育三烯酚的治療和預(yù)防劑，和使用所述治療和預(yù)防劑的方法，以治療和預(yù)防中風(fēng)和與升高的谷氨酸水平和脂加氧酶如12－脂加氧酶的作用有關(guān)的其他病癥和疾病的發(fā)作。
文檔編號A61KGK1863525SQ200480029160
公開日2006年11月15日 申請日期2004年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月8日
發(fā)明者C·森, S·羅伊, S·漢納 申請人:俄亥俄州州立大學(xué)研究基金會