專利名稱：Cupredoxin家族多肽在癌癥治療中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由微生物分泌的細(xì)胞毒性因子和細(xì)胞毒性因子抑制劑，以及它們在引起細(xì)胞生長停止和通過壞死和凋亡調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡中的用途。本發(fā)明也涉及這些細(xì)胞毒性因子的生產(chǎn)、分離和鑒別的方法，涉及摻入基本純細(xì)胞毒性因子的用于調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡和導(dǎo)致細(xì)胞生長停止的組合物。本發(fā)明也涉及治療與凋亡相關(guān)疾病的方法。更具體而言，本發(fā)明涉及基本純細(xì)胞毒性因子在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡或細(xì)胞生長停止的方法中的用途，涉及細(xì)胞毒性因子抑制劑在治療感染或其他病原體誘發(fā)病癥中的用途。
背景
感染性疾病可以是許多環(huán)境因素的產(chǎn)物。任何感染性疾病均涉及造成感染的因素。感染因素一般是致病微生物，例如致病細(xì)菌。致病微生物擊敗防御機(jī)制并導(dǎo)致疾病的程度或能力與它的毒力相關(guān)。已知致病性和非致病性微生物均表達(dá)細(xì)胞毒性因子，其允許微生物在宿主免疫系統(tǒng)中防護(hù)自身并阻止吞噬細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞)從身體清除微生物。當(dāng)致病微生物存活時，微生物可侵入宿主組織并增殖，造成嚴(yán)重的疾病癥狀。致病細(xì)菌已被鑒定是許多虛弱性或致命性疾病的根本原因，所述疾病例如結(jié)核病、霍亂、百日咳、鼠疫和類似疾病。為治療這些嚴(yán)重感染，施用藥物(例如抗生素)則殺死感染因素或消除細(xì)胞毒性因子，從而感染因素不再能夠在對抗宿主免疫系統(tǒng)中防護(hù)自身。然而，致病性細(xì)菌通常對抗生素產(chǎn)生抗藥性，需要改良藥物來阻止由這些微生物引起的感染的蔓延。癌癥是潛在的無限生長的惡性腫瘤。其主要是在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的多種類型細(xì)胞的致病性復(fù)制(正常調(diào)控的喪失)。這些疾病的最初治療通常是外科手術(shù)、放射線治療或這些療法的組合，但時常發(fā)生局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移疾病。對于一些癌癥可采用化學(xué)治療，但這些很少誘導(dǎo)長期的消退。因此，它們經(jīng)常是無法治愈的。通常，在稱作多藥耐藥發(fā)生的結(jié)果下，化學(xué)治療變得對腫瘤及其轉(zhuǎn)移難于治療。在許多病例中，腫瘤對一些類型的化學(xué)治療藥物具有本能的抗藥性。此外，這些威脅到非癌細(xì)胞的療法對人體產(chǎn)生應(yīng)激，并產(chǎn)生許多副作用。因此需要改良藥物來阻止癌細(xì)胞的擴(kuò)散。已知當(dāng)病人被致病性細(xì)菌感染時，許多腫瘤消退。然而，對細(xì)菌感染如何引起人類癌癥消退了解甚少。
概述
本發(fā)明涉及細(xì)胞毒性因子，其通過壞死或凋亡刺激細(xì)胞死亡，或者導(dǎo)致細(xì)胞生長停止。一方面，表征和分離了基本純的細(xì)胞毒性因子。通過對已暴露于致病性微生物的培養(yǎng)基的柱色譜分級分離得到基本純細(xì)胞因子。優(yōu)選，在哺乳動物蛋白存在下在致病生物生長期間刺激這些細(xì)胞毒性因子的生成和分泌。本發(fā)明的另一方面，作為描繪毒性和非毒性微生物的方法，對哺乳動物蛋白受體的鑒定可導(dǎo)致提高疾病治療的特異性。本發(fā)明的另一方面涉及治療與細(xì)胞死亡抗性或易感性相關(guān)疾病的方法，其包括的步驟是施用細(xì)胞毒性因子、細(xì)胞毒性因子抑制劑或其變體或衍生物，這些物質(zhì)任選摻入藥物學(xué)載體中。細(xì)胞毒性因子或其變體或衍生物可摻入用于預(yù)防和治療與異常細(xì)胞增生相關(guān)疾病的藥物學(xué)組合物中。例如，細(xì)胞毒性因子可用于治療癌癥。通過阻止巨噬細(xì)胞死亡并因此允許宿主免疫體系同入侵病原體斗爭，細(xì)胞毒性因子抑制劑或其變體或衍生物可用于治療細(xì)菌感染。在本發(fā)明的另一個實施方案中，細(xì)胞毒性因子及其分泌系統(tǒng)的組分可用作對抗感染因素的疫苗候選者。本發(fā)明也涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的方法，其包含控制細(xì)胞毒性因子分泌的步驟。在一個實施方案中，細(xì)胞毒性因子可用作對抗人癌癥細(xì)胞宿主的抗癌藥。細(xì)胞毒性因子也可用作通過抑制劑的篩選或合理設(shè)計進(jìn)行的藥物研發(fā)的靶標(biāo)。本發(fā)明也涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的方法，其包含使用細(xì)胞毒性因子例如天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素、鐵硫菌藍(lán)蛋白、假天青蛋白(pseudoazurin)或細(xì)胞色素c551，或這些細(xì)胞毒性因子突變體。本發(fā)明的這些和其它方面、優(yōu)點和特征將通過下面的附圖和優(yōu)選實施方案的詳細(xì)說明而變得顯而易見。
附圖的簡述


圖1圖表顯示了在來自洋蔥假單胞菌培養(yǎng)基的過濾的培養(yǎng)基上清液(SUP)或羥基磷灰石濾過(HAFT)、ATP-瓊脂糖濾過(AAFT)、和Q-瓊脂糖濾過(QSFT)的色譜柱級分存在或不存在下，1.0mM ATP對巨噬細(xì)胞殺傷的影響。通過對細(xì)胞內(nèi)酶乳酸脫氫酶(LDH)釋放來測定巨噬細(xì)胞的死亡程度。在測試中使用來自每種級分的2μg蛋白質(zhì)。所有的測試重復(fù)操作3次，并標(biāo)明誤差桿。圖2圖表顯示在ATP不存在下，洋蔥假單胞菌的經(jīng)過濾的培養(yǎng)基上清液(SUP)和色譜柱級分(HAFT、AAFT和QSFT)對巨噬細(xì)胞死亡的作用。通過對細(xì)胞內(nèi)酶乳酸脫氫酶(LDH)釋放來測定巨噬細(xì)胞的死亡程度。所有的測試重復(fù)操作3次，并標(biāo)明誤差桿。圖3該圖顯示經(jīng)洋蔥假單胞菌QSAFT級分處理的J774巨噬細(xì)胞胞漿提取物中胱天蛋白酶(圖3A-胱天蛋白酶-3；圖3B-胱天蛋白酶-9)的活性。胞漿提取物從與洋蔥假單胞菌QSFT級分培養(yǎng)過夜的巨噬細(xì)胞和未處理的巨噬細(xì)胞制得。用于測定胱天蛋白酶-3活性的底物是AcDEVD-pNA(N-乙酰-Asp-Glu-Val-Asp-對硝基苯胺)。胱天蛋白酶-9活性的底物是Ac-LEHD-pNA(N-乙酰-Leu-Glu-His-Asp-對硝基苯胺)。在37℃將提取物與底物按照標(biāo)明的時間培養(yǎng)。每組使用10μg巨噬細(xì)胞胞漿蛋白。在405nm處用光譜光度測量pNA(對硝基苯胺)的釋放。圖4圖表顯示了在天青蛋白(Az)、細(xì)胞色素c551(Cyt C551)和它們的組合存在下，用％乳酸脫氫酶(LDH)的釋放來測定的巨噬細(xì)胞中的細(xì)胞毒性。數(shù)字代表μg蛋白質(zhì)。緩沖液對照(緩沖液)在右側(cè)顯示。圖5圖表顯示在免疫前血清存在下，抗天青蛋白抗體和抗細(xì)胞色素c551抗體對洋蔥假單胞菌(A)和牛型分枝桿菌(B)QSFT級分的細(xì)胞毒性影響。A，天青蛋白(50ug)；C，細(xì)胞色素c551(25ug)；ab，抗天青蛋白抗體和抗細(xì)胞色素c551抗體的組合；P，免疫前血清。每次測試使用2μg QSFT級分。ab和P后的數(shù)目代表抗體或免疫前蛋白μg數(shù)。結(jié)果以重復(fù)三次試驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來顯示。圖6該圖顯示了誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞(UISO-Mel-2)后，在裸鼠中注射天青蛋白/細(xì)胞色素c551對腫瘤大小的影響。裸鼠皮下注射約106UISO-Mel-2細(xì)胞，接著每周一次腹膜內(nèi)注射檸檬酸緩沖液(對照)、已知的抗黑素瘤藥物DTIC(7.5ug)或每周三次高(150μg天青蛋白/75μg細(xì)胞色素C551)或低(10μg天青蛋白/5μg細(xì)胞色素C551)劑量的天青蛋白/細(xì)胞色素C551混合物，持續(xù)4周。在不同的時間，測定對照組(緩沖液處理組)、DTIC處理組以及高和低劑量天青蛋白/細(xì)胞色素C551處理組腫瘤大小(腫瘤體積)并作圖。圖7該圖顯示了在圖6描述的試驗期間，小鼠體重的增加或減少。在上述試驗期間，用天平給小鼠稱重，并將重量按克記錄。圖8該圖顯示了在天青蛋白(AZ)存在或不存在下，用牛型分枝桿菌QSFT級分處理的裸鼠中Mel-6腫瘤的消退。裸鼠皮下注射約106UISO-Mel-2細(xì)胞。約一周后形成小腫瘤。然后在所述小鼠腹膜內(nèi)注射磷酸鹽緩沖溶液(對照)、牛型分枝桿菌QSFT級分或牛型分枝桿菌QSFT級分與天青蛋白的混合物。圖9該圖顯示了用各種濃度天青蛋白處理72小時后，天青蛋白對MCF-7(■)和MDA-MB-157(□)細(xì)胞的細(xì)胞毒性。圖10該圖顯示了用天青蛋白(■)處理的裸鼠和對照組動物(□)中MCF-7腫瘤的消退。圖11(a)和(b)圖11(a)是顯示銅綠假單胞菌天青蛋白氨基酸序列與其它細(xì)菌天青蛋白的序列對比表。使用Genetyx軟件進(jìn)行氨基酸序列對比。圖11(b)是顯示野生型天青蛋白(wt天青蛋白)和嵌和突變天青蛋白的表格。圖12(a)和(b)圖12(a)是顯示野生型和氧化還原型突變天青蛋白對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性的圖。野生型天青蛋白(●)，去輔基天青蛋白(apo-azurin)(○)，M44KM64E(▲)，C112D(△)。圖12(b)是顯示野生型和嵌和突變天青蛋白對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性的圖。野生型天青蛋白(●)，S1(○)，S2(▲)，S3(■)，S4(△)，S6(□)，wtS5()，wtS4S5S6(◆)，S3S5()。圖12(b)也顯示了突變體的相對電子轉(zhuǎn)移效率，表示為野生型天青蛋白的電子轉(zhuǎn)移效率的百分比。為計算細(xì)胞毒性的百分?jǐn)?shù)，將未處理的存活細(xì)胞數(shù)目記作100％，并測量天青蛋白處理組樣品中存活細(xì)胞數(shù)。圖13是顯示天青蛋白、去輔基天青蛋白和天青蛋白突變體對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞凋亡活性。野生型天青蛋白(●)、去輔基天青蛋白(○)，M44KM64E(▲)，C112D(△)。圖14圖14是顯示野生型天青蛋白(wt型天青蛋白▲)、鐵硫菌藍(lán)蛋白(crude●)、去輔基鐵硫菌藍(lán)蛋白(apo-rus○)和假天青蛋白(Paz□)細(xì)胞毒性的圖。圖15是顯示野生型天青蛋白(●)和質(zhì)體藍(lán)素(■)細(xì)胞毒性的圖。
實施方案的詳細(xì)描述定義[32]根據(jù)本文說明書的意圖，術(shù)語“細(xì)胞毒性因子”是指由致病性或非致病性微生物分泌的因子，其通過壞死或凋亡促進(jìn)細(xì)胞死亡，或造成細(xì)胞生長停止。細(xì)胞毒性因子的實例包括天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素、鐵硫菌藍(lán)蛋白、假天青蛋白或細(xì)胞色素c551。術(shù)語“依賴ATP的”，當(dāng)用于修飾術(shù)語“細(xì)胞毒性因子”時，是指在5’-三磷酸腺苷(ATP)存在下造成細(xì)胞死亡或細(xì)胞生長停止的細(xì)胞毒性因子。術(shù)語“不依賴ATP的”，當(dāng)用于修飾術(shù)語“細(xì)胞毒性因子”時，是指在5’-三磷酸腺苷(ATP)不存在下造成細(xì)胞死亡或細(xì)胞生長停止的細(xì)胞毒性因子。根據(jù)本文說明書的意圖，術(shù)語“治療”包含預(yù)防、降低、停止或逆轉(zhuǎn)待治療的病癥或癥狀的進(jìn)展或嚴(yán)重性。同樣地，術(shù)語“治療”酌情包括醫(yī)療性的、治療性的和/或預(yù)防性的施用。如本文所用，術(shù)語“與細(xì)胞死亡抗性相關(guān)的病癥”是指經(jīng)理智熟練的內(nèi)科醫(yī)生或臨床醫(yī)生檢測，與健康的類似種類的細(xì)胞相比，至少以延長細(xì)胞生命趨勢為特征的疾病、狀態(tài)或失調(diào)。術(shù)語“與細(xì)胞死亡易感性相關(guān)的病癥”，如本文所用，是指經(jīng)理智熟練的內(nèi)科醫(yī)生或臨床醫(yī)生檢測，與健康的類似種類的細(xì)胞相比，至少以過早細(xì)胞死亡趨勢為特征的疾病、狀態(tài)或失調(diào)。如本文所用，術(shù)語“具有功能性p53腫瘤抑制基因”是指具有沒有被失活、突變、喪失或減少生成的p53腫瘤抑制基因的細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語“缺乏p53腫瘤抑制基因”是指具有被失活、突變、喪失或減少生成的p53腫瘤抑制基因的細(xì)胞。例如，這樣的缺乏可能作為p53基因內(nèi)的遺傳畸變或與病毒和細(xì)胞致癌基因相互作用的結(jié)果而發(fā)生。術(shù)語“基本純”，當(dāng)用作修飾術(shù)語“細(xì)胞毒性因子”時，如本文所用，是指例如形式為基本不含或不摻雜活性抑制化合物的細(xì)胞毒性因子，所述細(xì)胞毒性因子從分泌的培養(yǎng)基中分離。術(shù)語“基本純”是指以重量計因子在分離級分中的含量至少約75％，或至少“75％基本純”。更優(yōu)選，術(shù)語“基本純”是指以重量計化合物中含至少約85％的活性化合物，或至少“85％基本純”?；炯兊募?xì)胞毒性因子可與一種或多種其它基本純化合物或分離的細(xì)胞毒性因子組合使用。如本文所用，術(shù)語細(xì)胞毒性因子的“變體或衍生物”是指對細(xì)胞毒性因子或細(xì)胞毒性因子編碼基因進(jìn)行化學(xué)修飾或操縱所得到的化合物或物質(zhì)。細(xì)胞毒性因子的變體或衍生物可通過化學(xué)修飾所述細(xì)胞毒性因子或操縱編碼所述細(xì)胞毒性因子的基因來得到，例如通過改變所述細(xì)胞毒性因子的基本構(gòu)成或性狀，但不改變其毒性進(jìn)行。與此類似，細(xì)胞毒性因子抑制劑的“變體或衍生物”可包含對所述抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行的化學(xué)修飾或?qū)幋a所述抑制劑的基因進(jìn)行的操縱。術(shù)語“氨基酸序列相同性百分?jǐn)?shù)(％)”定義為當(dāng)兩個序列對比時，細(xì)胞毒性因子的氨基酸殘基與候選序列氨基酸殘基相同性的百分?jǐn)?shù)。為測定氨基酸相同性％，進(jìn)行序列對比，并且如果需要的話，引入缺口以獲得最大％序列相同性；保守取代不視為序列相同性的部分。測定相同性百分?jǐn)?shù)的氨基酸序列對比方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。通常使用可公開獲得的計算機(jī)軟件進(jìn)行肽序列對比，例如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)軟件。當(dāng)進(jìn)行氨基酸序列對比時，給定的氨基酸序列A同、與或相對給定的氨基酸序列B的％氨基酸序列相同性(其換句話說可表達(dá)為具有或包含同、與或相對給定氨基酸序列B的特定％氨基酸序列相同性的給定氨基酸序列A)可計算為％氨基酸序列相同性＝X/Y·100其中，X是氨基酸殘基數(shù)目，通過A和B的序列對比程序?qū)Ρ然蛐蛄袑Ρ人惴▽Ρ?，該?shù)目以相同匹配數(shù)來記分。
并且Y是B中氨基酸殘基的總數(shù)目。如果氨基酸序列A的長度不等于氨基酸序列B的長度，A對B的％氨基酸序列相同性將不等于B對A的％氨基酸序列相同性?！爸委熡行Я俊笔菍Υ委煂ο笞柚共∏榘l(fā)展或減輕現(xiàn)存癥狀的有效量。確定治療有效量屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍。
總則本發(fā)明提供由致病性或非致病性微生物分泌，并通過壞死或凋亡促進(jìn)細(xì)胞死亡，或?qū)е录?xì)胞生長停止的細(xì)胞毒性因子。當(dāng)致病性微生物侵入人或動物組織時，吞噬細(xì)胞成為宿主免疫系統(tǒng)中的第一道防線。典型地，吞噬細(xì)胞尋找并破壞侵入體內(nèi)的外源病原體。然而，由微生物病原體分泌的細(xì)胞毒性因子在吞噬細(xì)胞中可刺激細(xì)胞死亡。從而吞噬細(xì)胞被阻止行使其保護(hù)性免疫功能。發(fā)明人以前報道過，許多致病性細(xì)菌分泌可通過壞死引起吞噬細(xì)胞死亡的依賴ATP的細(xì)胞毒性因子，例如利用ATP的酶。[Zaborina O.等人，Infect.Immun.675231-5242(1999)；Melnikov A.等人，Mol.Microbiol.361481-1493(2000)；和Punj V.等人，Infect.Immun.684930-4937(2000)，出于各種目的，其內(nèi)容在此引作參考。]利用ATP的酶可作用于多種與能量相關(guān)的核苷酸衍生物，例如ATP、5’-二磷酸腺苷(ADP)、5’-腺苷酸(AMP)或腺苷，將它們轉(zhuǎn)化為多種產(chǎn)物，這些產(chǎn)物通過激活嘌呤受體來依次調(diào)節(jié)吞噬細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞的死亡。本發(fā)明的一方面涉及發(fā)現(xiàn)不依賴ATP的細(xì)胞毒性因子，例如氧化還原蛋白，也可由致病微生物的一些物種分泌，并且這些因子通過凋亡引起吞噬細(xì)胞死亡。[Zaborina O.等人，Microbiology 1462521-2530(2000)，出于各種目的，其內(nèi)容在此引作參考。]
本發(fā)明的另一方面涉及令人驚奇地發(fā)現(xiàn)不依賴ATP的細(xì)胞毒性因子在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡或細(xì)胞生長停止。這些細(xì)胞毒性因子可用于治療與細(xì)胞死亡抗性相關(guān)的病癥。這些病癥可包括，例如，人黑素瘤、白血病、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、間質(zhì)癌、結(jié)腸癌和呼吸消化道癌(例如胃癌、食管癌、喉癌和口腔癌)。通常癌細(xì)胞并不易于凋亡性死亡。這種對細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡的抗性可由編碼p53腫瘤抑制蛋白的基因的失活突變造成。已知哺乳細(xì)胞的凋亡要求p53蛋白的存在。然而，在50％人類癌癥中，在p53腫瘤抑制蛋白的編碼基因上存在失活突變。盡管也已知p53在哺乳動物細(xì)胞中調(diào)節(jié)氧化還原蛋白的表達(dá)，但是還沒有發(fā)現(xiàn)哺乳動物氧化還原蛋白直接涉及腫瘤細(xì)胞凋亡或生長停止的暗示。也沒有發(fā)現(xiàn)微生物的不依賴ATP的細(xì)胞毒性因子具有在癌癥細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡或減小腫瘤大小的功能。本發(fā)明的另一方面涉及鑒別和鑒定由微生物分泌的細(xì)胞毒性因子的方法。這些方法提供了發(fā)現(xiàn)細(xì)胞死亡的合適的抑制劑或刺激劑的方法。抑制劑和刺激劑可研發(fā)成藥用藥物，并用于治療以對細(xì)胞死亡有抗性或易感性為特征的病癥。本發(fā)明的另一方面涉及已被鑒定和分離的細(xì)胞毒性因子和這些細(xì)胞毒性因子的抑制劑。依照本發(fā)明的方法，細(xì)胞毒性因子可被激活或失活以預(yù)防或治療與細(xì)胞死亡相關(guān)的病癥。細(xì)胞毒性因子抑制劑可用于治療與細(xì)胞死亡易感性相關(guān)的病癥。
細(xì)胞毒性因子的分泌
在本發(fā)明的一方面中，本發(fā)明的細(xì)胞毒性因子可由一些不同的致病性微生物分泌，包括細(xì)菌和原生動物。提供細(xì)胞毒性因子的適宜的致病細(xì)菌的實例包括但不限于銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosam)(P.aeruginosa)，洋蔥假單胞菌(Burkholderia cepacia)(B.cepacia)，霍亂弧菌(Vibrio cholera)(V.cholera)，和牛型分枝桿菌(Mycobacterium bovis)(M.bovis)。此外，細(xì)胞毒性因子可由病原體分泌，例如利什曼原蟲亞馬遜亞種(Leishmaniaamazonensis)和馬來布魯線蟲(Brugia malayi)。已發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌(一種條件致病菌)、洋蔥假單胞菌(可導(dǎo)致囊性纖維化病和慢性肉芽腫疾病患者致命感染)、霍亂弧菌(導(dǎo)致霍亂的腸內(nèi)病原體)和分枝桿菌的緩慢生長的致病群例如結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)或牛型分枝桿菌(導(dǎo)致結(jié)核)能分泌利用ATP的酶。除了分泌利用ATP的酶，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌分泌不依賴ATP的細(xì)胞毒性因子。這些細(xì)胞毒性因子已被鑒定為兩種氧化還原蛋白天青蛋白和細(xì)胞色素c551。洋蔥假單胞菌也顯示分泌氧化還原蛋白。牛型分枝桿菌也顯示分泌對吞噬細(xì)胞具有高度不依賴ATP的細(xì)胞毒性的細(xì)胞毒性因子。
在哺乳動物蛋白存在下對細(xì)胞毒性因子分泌的刺激
在本發(fā)明的另一方面，在哺乳動物蛋白存在下，細(xì)胞毒性因子的產(chǎn)生和分泌在致病生物生長期間被刺激。例如，由致病微生物例如銅綠假單胞菌、牛型分枝桿菌和洋蔥假單胞菌分泌的細(xì)胞毒性因子被哺乳動物蛋白例如κ-酪蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或α2-巨球蛋白的存在所刺激。這提示致病微生物感受到特定哺乳動物蛋白的存在作為哺乳動物宿主環(huán)境的指征，從而啟動對細(xì)胞毒性劑的分泌系統(tǒng)以反擊并破壞宿主防御，但本文并不依賴于這種提示。發(fā)明人測定到一些洋蔥假單胞菌的臨床(有毒的)分離菌分泌大量的利用ATP的酶，例如腺苷酸激酶或5’-核苷酸酶，而一些環(huán)境(無毒的)分離菌只分泌減少量的這些酶。在臨床分離菌例如洋蔥假單胞菌株38中，在生長培養(yǎng)基中存在α2-巨球蛋白情況下，細(xì)胞毒性因子的分泌水平得到極大的提高。相比于環(huán)境分離菌，臨床分離菌的分泌物對巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞具有更高水平的細(xì)胞毒性。在α2-巨球蛋白存在下顯示提高的細(xì)胞毒性因子分泌的臨床分離菌也顯示在它們表面存在α2-巨球蛋白受體。在本發(fā)明的一個實施方案中，在哺乳動物蛋白存在下，不依賴ATP的細(xì)胞毒性因子的產(chǎn)生和分泌在致病生物生長期間被刺激。通過在含有哺乳動物蛋白的培養(yǎng)基上生長微生物生物體，可提高細(xì)胞毒性因子的分泌。適宜的培養(yǎng)基例如L肉湯、營養(yǎng)肉湯、胰胨豆胨培養(yǎng)液、胰蛋白胨-酵母提取物肉湯(Difco Laboratories，Maryland，U.S.A.)。典型地，約500-1000ml的無菌高壓滅菌培養(yǎng)基以104至106細(xì)胞/ml接種。然后，接種過的培養(yǎng)基在適合微生物生長的條件下培養(yǎng)，通常處于30-37℃的旋轉(zhuǎn)搖床上。對培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和其它影響細(xì)菌和其它微生成功培養(yǎng)的因素的選擇對于一名本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見。發(fā)明人觀察到培養(yǎng)基中細(xì)胞毒性因子的最大濃度出現(xiàn)在指數(shù)生長期的晚期和穩(wěn)定生長期的早期。在本發(fā)明的另一個實施方案中，對哺乳動物蛋白受體的鑒定提供了描繪微生物有毒株和無毒株的方法。例如，α2-巨球蛋白受體基本上存在于臨床分離菌，而不存在于環(huán)境分離菌，不僅與前者分泌細(xì)胞毒劑作為對抗宿主防御的武器的功能相關(guān)聯(lián)，而且可用于在臨床有毒株和環(huán)境無毒株之間的描繪。因此，生物的有毒株可被鑒定，然后針對其抗生素敏感性或其它臨床目的進(jìn)行測試。
不依賴ATP的細(xì)胞毒性因子的純化
在本發(fā)明的另一方面，基本純的不依賴ATP的細(xì)胞毒性因子可通過分泌型微生物的培養(yǎng)基的色譜柱分級分離獲得。優(yōu)選在分級分離之前將細(xì)菌細(xì)胞從培養(yǎng)基中去除。這可通過對培養(yǎng)基最初的離心和隨后的過濾來實現(xiàn)。適宜的過濾器通常小于或等于約0.5μm的孔徑，優(yōu)選約0.2μm。然而，其它去除病原體的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。未分級分離的培養(yǎng)基不具有高度不依賴ATP的細(xì)胞毒活性，因此色譜柱分級分離對增強(qiáng)凋亡誘導(dǎo)活性和使細(xì)胞生長停止的活性是必需的。分級分離去除依賴ATP的細(xì)胞毒性因子。這提示分級分離也可去除不依賴ATP的細(xì)胞毒性因子的抑制劑，該抑制劑可存在于未分級分離的培養(yǎng)基中，但本文不依賴于此提示。用于純化細(xì)胞毒性因子的色譜技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。這包括例如離子交換色譜、羥基磷灰石色譜、親和色譜和凝膠過濾色譜。用于細(xì)菌培養(yǎng)基分級分離的色譜柱包括例如羥基磷灰石、Superdex 75或200、Superose 6或12、Sephacryl S、Sephadex G或Sephadex LH、Mono Q或Mono S、Q-Sepharose、DEAE Sepharose或CM Sepharose、Sepharose XL、ATP-Sepharose、Hi Trap Blue、BlueSepharose、DNA Cellulose或Sepharose 2B、4B或6B，可從AmershamPharmacia Biotech AB，Uppsala，(Sweden)或Bio-Rad Laboratories，Hercules，California，(U.S.A.)獲得。利用ATP的酶可作為羥基磷灰石和ATP-瓊脂糖柱的濾過或洗脫級分通過色譜柱分級分離。在這些分級分離過程中，利用ATP的酶，例如三磷酸腺苷酶(ATPase)或腺苷酸激酶，吸附于色譜柱，并可被進(jìn)一步去除或純化。(參見，例如，Markaryan等人，J.Bacteriol.，183，pp 3345-3352，2001)
在本發(fā)明的一個實施方案中，不依賴ATP的細(xì)胞毒性因子作為Q-sepharose柱(QSFT)的濾過級分分離。Q-sepharose是一種季銨鹽強(qiáng)陰離子交換劑。這些柱子可從Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，(Sweden)獲得。上清液(SUP)或其它柱級分例如羥基磷灰石柱的濾過級分(HAFT)或ATP-瓊脂糖柱濾過級分(AAFT)沒有通常出現(xiàn)顯示高度不依賴ATP的細(xì)胞毒性。
不依賴ATP的細(xì)胞毒性因子的鑒定
在本發(fā)明的其它方面，測試分級分離過的培養(yǎng)基中不依賴ATP的細(xì)胞毒性因子的存在。細(xì)胞死亡的程度可通過細(xì)胞內(nèi)酶乳酸脫氫酶(LDH)的釋放來測定，如描述于Zaborina等人，Infection andImmunity，67，5231-5242(1999)和Zaborina等人，Microbiology，146，2521-2530(2000)，其內(nèi)容引作參考。不依賴ATP的細(xì)胞毒性因子誘導(dǎo)凋亡的能力可通過使用MITOSENSORTMAPOLERTTMMitochondrial Membrane Sensor試劑盒(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，California，U.S.A.)的mitosensorApoAlert共焦顯微術(shù)觀察到。在測試中，健康、非凋亡的細(xì)胞發(fā)紅色熒光而凋亡死亡的細(xì)胞發(fā)綠色熒光。紅和綠的組合產(chǎn)生發(fā)黃色熒光細(xì)胞，這代表凋亡性瀕死細(xì)胞。參見Zaborina等人，Microbiology，146，2521-2530(2000)，其內(nèi)容引作參考。凋亡通過激活酶級聯(lián)效應(yīng)來介導(dǎo)，所述酶稱作胱天蛋白酶(caspase)，其為在天冬氨酸殘基進(jìn)行切割的半胱氨酸蛋白酶。因此，凋亡也可通過測量兩種重要的胱天蛋白酶(稱作胱天蛋白酶-9和胱天蛋白酶-3)的活性來測定，已知這兩種酶在凋亡期間通過從線粒體中釋放的細(xì)胞色素c與胞漿蛋白Apaf-1的寡聚化被激活，所述測量使用的方法描述于Zou等人，J.Biol.Chem.，27411549-11556(1999)，其內(nèi)容引作參考。凋亡也可通過使用例如APOLERT DNA斷裂(fragmentation)試劑盒(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，California，U.S.A.)檢測凋亡誘導(dǎo)的細(xì)胞核DNA斷裂來觀察。該測試是基于末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Tdt)介導(dǎo)的dUTP切口末端標(biāo)記(TUNEL)，其中Tdt催化在凋亡中的細(xì)胞的斷裂的DNA的游離3’-羥基末端引入熒光素-dUTP。在斷裂的細(xì)胞核DNA引入熒光素-dUTP產(chǎn)生綠色熒光，其可被共焦顯微術(shù)檢測到。在本發(fā)明的一個實施方案中，測試分級分離過的培養(yǎng)基以測定這些級分誘導(dǎo)凋亡或細(xì)胞生長停止的能力。這些方法可用于鑒別和鑒定不依賴ATP的細(xì)胞毒性因子。
不依賴ATP的細(xì)胞毒性因子的鑒定
在另一方面，本發(fā)明提供經(jīng)鑒定的細(xì)胞毒性因子，所述因子顯示不依賴ATP觸發(fā)凋亡的細(xì)胞毒性或?qū)е录?xì)胞生長停止。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌和洋蔥假單胞菌的QSFT級分富含兩種蛋白天青蛋白和細(xì)胞色素c551。這兩種蛋白的鑒定是基于它們在SDS-PAGE上的分離和它們的N-末端氨基酸序列的鑒定。相比下，牛型分枝桿菌QSFT級分的SDS-PAGE分析顯示一條65kDa的牛血清白蛋白(BSA)濃條帶，其為用于生長牛型分枝桿菌的7H9培養(yǎng)基的成分，以及一些超過45kDa分子量的條帶，但沒有細(xì)胞色素c551或天青蛋白的特征條帶。
(參見實施例9)
天青蛋白和/或細(xì)胞色素c551以及QSFT級分顯示出對吞噬細(xì)胞觸發(fā)凋亡的細(xì)胞毒性。在分離中，細(xì)胞色素c551引起細(xì)胞生長停止。純化的天青蛋白/細(xì)胞色素c551混合物或洋蔥假單胞菌QSFT級分用抗天青蛋白抗體和抗細(xì)胞色素c551抗體處理后，顯示巨噬細(xì)胞細(xì)胞毒性有極大減少。相比而言，牛型分枝桿菌QSFT級分當(dāng)用抗天青蛋白抗體/抗細(xì)胞色素c551抗體預(yù)處理后，顯示在細(xì)胞毒性上幾乎沒有降低，確證牛型分枝桿菌QSFT級分含有除天青蛋白或細(xì)胞色素c551以外的細(xì)胞毒性因子。因而不同的病原體分泌不同誘導(dǎo)凋亡的或使細(xì)胞生長停止的細(xì)胞毒性因子，它們都將成為藥物研發(fā)中優(yōu)良的目標(biāo)。
不依賴ATP的細(xì)胞毒性因子I.Cupredoxin化合物
這些小藍(lán)銅蛋白(cupredoxin)是參與細(xì)菌的氧化還原鏈、光合作用或未知功能的電子轉(zhuǎn)移蛋白(10-20kDa)。銅離子唯一地結(jié)合于蛋白基質(zhì)。銅周圍兩個組氨酸和一個半胱氨酸的配體具有特殊的扭曲三角平面排列，引起在金屬位點非常特殊的電學(xué)性質(zhì)和強(qiáng)烈的藍(lán)色。一些cupredoxin已經(jīng)在介質(zhì)中以高分辨率進(jìn)行了結(jié)晶學(xué)鑒定。
天青蛋白
天青蛋白是具有128個氨基酸殘基的含銅蛋白質(zhì)，其屬于cupredoxin家族，涉及植物和一些細(xì)菌中的電子轉(zhuǎn)移。天青蛋白包括來自銅綠假單胞菌(PA)(SEQ ID NO1)、木糖氧化產(chǎn)堿菌(A.xylosoxidans)、和反硝化產(chǎn)堿菌(A.denitrificans)的那些。Murphy，L.M.等人，J.Mol.Biol.，vol.315，pp 859-71(2002)，其內(nèi)容引作參考。盡管天青蛋白間的序列同源性在60-90％變化，這些分子間的結(jié)構(gòu)同源性是高的。所有的天青蛋白具有獨特的具有Greek key基序的β-夾層(β-sandwich)，并且單個銅原子總是位于蛋白的同一區(qū)域。此外，天青蛋白在銅位點周圍具有基本中性的疏水區(qū)。(Murphy等人)質(zhì)體藍(lán)素
質(zhì)體藍(lán)素是真核植物中的可溶性蛋白，其在每個分子中含有一個銅分子，并且它們的氧化型為藍(lán)色。它們出現(xiàn)在葉綠體中，作為電子載體發(fā)揮功能。自從在1978年測定了白楊質(zhì)體藍(lán)素的結(jié)構(gòu)，藻類(柵藻(Scenedesmus)，滸苔(Enteromorpha)，衣藻(Chlamydomonas))和植物(法國菜豆(French bean))質(zhì)體藍(lán)素的結(jié)構(gòu)也用晶體學(xué)或NMR的方法得到測定，并且白楊質(zhì)體藍(lán)素的結(jié)構(gòu)已經(jīng)精確到1.33的分辨率。SEQ ID NO2顯示了來自層理席藻(Phormidium laminosum)的質(zhì)體藍(lán)素的氨基酸序列。盡管在藻類和維管植物之間的質(zhì)體藍(lán)素序列趨異(例如在衣藻蛋白和白楊蛋白之間序列相同性為62％)，但三維結(jié)構(gòu)是保守的(例如在衣藻蛋白和白楊蛋白之間Cα位置的0.76rms偏差)。結(jié)構(gòu)特征包括位于八股反平行β-桶一個末端的扭曲四面體型銅結(jié)合位點、顯著的負(fù)電區(qū)和平坦的疏水表面。銅的位置對于其電子轉(zhuǎn)移功能是優(yōu)化的，負(fù)電和疏水區(qū)被設(shè)想涉及生理反應(yīng)配偶體的識別?；瘜W(xué)修飾、交聯(lián)和定位誘變試驗已經(jīng)證實負(fù)電和疏水區(qū)在與細(xì)胞色素f的結(jié)合相互作用中的重要性，并證明在質(zhì)體藍(lán)素中有兩個功能重要的電子轉(zhuǎn)移路徑模型的正確。一個假定的電子轉(zhuǎn)移路徑是相對短的(約4)，并包括疏水區(qū)中暴露于溶劑的銅配體His-87，而另一條更長(約12-15)，包括負(fù)電區(qū)中幾乎保守的殘基Tyr-83，Redinbo等人，J.Bioenerg.Biomembr.，vol.26(1)，pp49-66(1994)，其內(nèi)容引作參考。
鐵硫菌藍(lán)蛋白
鐵硫菌藍(lán)蛋白是含有藍(lán)銅的單鏈多肽，其得自一種硫桿菌。利用多波長不規(guī)則衍射對來自氧化亞鐵硫桿菌(Thiobacillusferrooxidans)的極其穩(wěn)定和高氧化性的cupredoxin鐵硫菌藍(lán)蛋白(SEQID NO3)氧化型進(jìn)行X射線晶體結(jié)構(gòu)測定，精確到1.9分辨率。鐵硫菌藍(lán)蛋白由核心β-夾層折疊構(gòu)成，所述β-夾層折疊由六股和七股的b-片層組成。與其它cupredoxin類似，銅離子同分布于扭曲四面體的四個保守殘基(His 85，Cys138，His143，Met148)組成的簇相配位。Walter，R.L.等人，J.Mol.Biol.，vol.263，pp-730-51(1996)，其內(nèi)容引作參考。
假天青蛋白
假天青蛋白是含有藍(lán)銅的單鏈多肽家族。得自裂環(huán)無色桿菌(Achrorraobacter cycloclastes)的假天青蛋白的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO4。假天青蛋白的X射線結(jié)構(gòu)分析顯示它與天青蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)，盡管這些蛋白質(zhì)之間具有低序列同源性。在假天青蛋白和天青蛋白的整體結(jié)構(gòu)之間存在兩個主要的不同。相對于天青蛋白，假天青蛋白具有由兩個α-螺旋組成的羧基末端延伸。在中部肽區(qū)域，天青蛋白包含延伸的環(huán)，而在假天青蛋白中變短，其形成含有短α-螺旋的瓣。在銅原子位點上唯一的主要不同是，MET側(cè)鏈構(gòu)象和Met-S銅鍵長度，其在假天青蛋白中明顯短于在天青蛋白中。
II.細(xì)胞色素C551
來自銅綠假單胞菌的細(xì)胞色素C551(Pa-C551)是具有82個氨基酸殘基的單體氧化還原蛋白(SEQ ID NO5)，作為亞硝酸還原酶的生理電子供體涉及不同的脫氮作用。Pa-C551的功能性質(zhì)已被廣泛的研究。與非生理性無機(jī)小氧化還原反應(yīng)物和與其它大分子如藍(lán)銅蛋白、真核細(xì)胞色素c和生理亞硝酸還原酶配偶體的反應(yīng)提供了蛋白-蛋白間電子轉(zhuǎn)移的測試。Pa-C551是細(xì)菌I型細(xì)胞色素的一員，其三維結(jié)構(gòu)顯示具有His-Met連接的單一低自旋血紅素以及典型的多肽折疊，然而該折疊使得血紅素吡咯環(huán)II和III的邊緣暴露。(Cutruzzola等人，J.Inorgan.Chem.，vol 88，pp 353-61(2002)，其內(nèi)容引作參考。)存在于哺乳動物I型細(xì)胞色素中的20個殘基的ω環(huán)的缺乏引起血紅素邊緣在丙酸鹽13水平下的進(jìn)一步暴露。Pa-C551表面帶電殘基的分布是非常各向異性的一邊富含酸性殘基而另一邊顯示帶正電荷側(cè)鏈(主要是賴氨酸)的環(huán)，其位于圍繞著血紅素間隙的疏水區(qū)的邊緣。所述疏水區(qū)包含殘基Gly11，Val13，Ala14，Met22，Val23，Pro58，Ile59，Pro60，Pro62，Pro63和Ala65。各向異性的電荷分布導(dǎo)致很大的雙極力矩，這對電子轉(zhuǎn)移復(fù)合物的形成是重要的。上述對Pa-C551電荷分布的描述已用于報道其它電子轉(zhuǎn)移蛋白和它們的電子受體。此外，通過在疏水區(qū)或帶電區(qū)內(nèi)的殘基定位誘變的修飾已顯示出表面互補(bǔ)性對不同蛋白的結(jié)合和電子轉(zhuǎn)移的重要性。作為實例，在殘基Met44和Met64被改變?yōu)閹д姾蛶ж?fù)電的氨基酸的突變體上進(jìn)行的研究獲得了銅綠假單胞菌天青蛋白疏水區(qū)與其電子轉(zhuǎn)移性質(zhì)具有相關(guān)性的證據(jù)。(Cutruzzola等人)利用不依賴ATP的細(xì)胞毒性因子在癌癥細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡或生長停止
本發(fā)明提供使用不依賴ATP的細(xì)胞毒性因子在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡性細(xì)胞死亡或生長停止的方法。不依賴ATP的細(xì)胞毒性因子，例如cupredoxin化合物和細(xì)胞色素C551，可用于治療與細(xì)胞死亡的異常故障相關(guān)的病癥。眾所周知，癌細(xì)胞不傾向于進(jìn)行凋亡。依照本發(fā)明的一個方面，施用足以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡或細(xì)胞生長停止的量的細(xì)胞毒性因子或刺激細(xì)胞毒性因子分泌的活性劑將有助于減少體內(nèi)腫瘤大小以及延緩腫瘤生長。例如，將天青蛋白和細(xì)胞色素C551與已知的抗黑素瘤藥物[5-(3，3′-N，N′-二甲基三氮烯-1-基)-咪唑-4-甲酰胺](DTIC)進(jìn)行測試比較，顯示天青蛋白和細(xì)胞色素C551的混合物提供有效無毒的組合物，該組合物促進(jìn)裸鼠體內(nèi)腫瘤消退。在本發(fā)明的一個實施方案中提供了一種方法，其中用cupredoxin化合物例如天青蛋白的治療誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡性細(xì)胞死亡。不希望受限于理論，據(jù)信cupredoxin化合物的細(xì)胞毒活性是由于其與腫瘤抑制蛋白p53形成復(fù)合物并使之穩(wěn)定。p53作為“腫瘤抑制子”基因發(fā)揮作用，其通過突變造成的生成下降或失活可導(dǎo)致腫瘤發(fā)展。p53在細(xì)胞中半衰期通常只有幾分鐘。p53的穩(wěn)定使得活性氧(ROS)顯著生成，這是凋亡有力的誘導(dǎo)劑。天青蛋白與p53形成復(fù)合物、使之穩(wěn)定并提高它在細(xì)胞內(nèi)的水平，因此通過依賴胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-9的線粒體途徑誘導(dǎo)凋亡Yamada，T.等人，Infec.Immun.，vol.70，pp 7054-62(2002)，其內(nèi)容引作參考。天青蛋白的氧化還原活性對其細(xì)胞毒活性并不是關(guān)鍵的。在復(fù)合物形成期活性氧的生成才是凋亡的誘導(dǎo)因子。Goto，M.等人，Mol.Microbiol.，47，pp549-59(2003)，其內(nèi)容引作參考。例如，具有如SEQ ID NO1的氨基酸序列但并不含有銅原子的去輔基天青蛋白(apo-azurin)相比于天青蛋白具有低的多的氧化還原活性，但顯示顯著的細(xì)胞毒活性。與p53形成復(fù)合物的重要性可通過兩種突變體天青蛋白C112D(SEQ ID NO.6)和雙突變體M44KM64E(SEQ ID NO.7)的細(xì)胞毒活性的不同來說明。銅與Cys-112殘基的結(jié)合對于氧化還原活性是重要的。與銅的配位有缺陷的C112D突變體具有天青蛋白約0.01％的氧化還原活性，但顯示顯著的細(xì)胞毒性。作為對比，M44KM64E突變體具有天青蛋白約2％的氧化還原活性，但幾乎不顯示細(xì)胞毒性。天青蛋白分子中含有一個疏水區(qū)，其是生理配偶體細(xì)胞色素C551和亞硝酸還原酶的相互作用位點(Cutruzzola等人)。疏水區(qū)沒有變化的C112D突變體能與p53形成復(fù)合物，并升高其細(xì)胞內(nèi)水平。然而，M44KM64E雙突變體的疏水區(qū)中形成一個電偶極，其不能形成如此穩(wěn)定的復(fù)合物。因此，與細(xì)胞色素C551和亞硝酸還原酶相互作用位點對于與p53復(fù)合物形成也是重要的。甘油梯度離心和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)沉淀法已用于顯示cupredoxin化合物與p53的相互作用。Yamada等人(2002)，其內(nèi)容引作參考。已知p53形成寡聚復(fù)合物，以及GST-p53融合蛋白在各種甘油級分例如5，10，15，20，或25％的甘油中沉淀，而天青蛋白在5％甘油中沉淀。先將天青蛋白與GST-p53融合蛋白溫育，然后在甘油梯度中離心，證明天青蛋白在所有的甘油級分中存在，表明其與p53締合。C112D突變體，而不是M44KM64E突變體，顯示相似的締合。Yamada等人(2002)。將GST-p53融合蛋白與天青蛋白M44KM64E突變體進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)改變p53寡聚化，導(dǎo)致大多數(shù)GST-p53存在于5-10％的甘油中，而突變體天青蛋白也被發(fā)現(xiàn)在這里。這表明天青蛋白的疏水區(qū)也涉及與p53的相互作用。天青蛋白疏水性的喪失不僅導(dǎo)致細(xì)胞毒性的喪失，而且干擾了寡聚化。盡管M44KM64E突變體幾乎不顯示誘導(dǎo)凋亡，它確實顯示了對細(xì)胞周期進(jìn)展顯著的抑制。因此，p53-cupredoxin復(fù)合物性質(zhì)的變化可將p53的特異性從對凋亡改變到細(xì)胞生長停止。天青蛋白的作用依賴于腫瘤細(xì)胞具有功能性p53腫瘤抑制基因。然而，細(xì)胞毒性因子也可造成具有p53腫瘤抑制基因不足的細(xì)胞生長延緩。例如，細(xì)胞色素C551不作用于p53，但其顯著增強(qiáng)腫瘤抑制蛋白p16的水平。C551在巨噬細(xì)胞中抑制細(xì)胞周期進(jìn)展，也增強(qiáng)天青蛋白的作用。此外，細(xì)胞毒性因子如天青蛋白和C551(或M44KM64E)的組合通過既誘導(dǎo)凋亡又誘導(dǎo)生長停止而可以更有效的抑制腫瘤進(jìn)展。由于細(xì)胞色素C551的作用模式不依賴于細(xì)胞中p53的狀態(tài)，這提供了在缺乏p53腫瘤抑制基因的人類癌癥的50％中的癌癥退化方法。除了C551，其它細(xì)胞色素，例如來自藍(lán)藻(cyanobacteria)的細(xì)胞色素，也證實有細(xì)胞毒性。
細(xì)胞毒性因子治療感染性疾病
在本發(fā)明的另一方面，細(xì)胞毒性因子的鑒定可用于鑒別例如在感染性疾病中抑制細(xì)胞死亡的新物質(zhì)。例如，抑制利用ATP的細(xì)胞毒性因子的分泌或活性，或ATP的生成，可減少或消除致病病原體的細(xì)胞毒活性。因此，合適的施用抑制細(xì)胞毒性因子分泌或活性的化合物提供了抗感染發(fā)展的有用工具。用于抑制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的細(xì)胞毒性因子的活性的活性劑的實例包括細(xì)胞毒性因子的抗體和阻止利用ATP的酶的活化的ATP類似物。用于抑制或刺激細(xì)胞毒性因子分泌或表達(dá)的細(xì)胞毒性因子和活性劑的實例包括但不限于利用ATP的酶、氧化還原蛋白、ATP生成激活劑、ATP生成抑制劑、氧化還原蛋白激活劑和氧化還原蛋白抑制劑。
包含細(xì)胞毒性因子的藥物組合物
包含細(xì)胞毒性因子的藥物組合物可用任何常規(guī)方法制備，例如常規(guī)混和、溶解、制粒、制糖衣(dragee-making)、乳化、包入膠囊(encapsulating)、包封(entrapping)或凍干過程?；炯兊募?xì)胞毒性因子或其它活性物質(zhì)易于與本領(lǐng)域公知的藥物學(xué)可接受載體組合。這些載體可使制備物被配制成片劑、丸劑、糖衣片、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑、混懸劑等等。合適的賦型劑也可包括例如填充劑和纖維素制品。其它的賦型劑包括例如矯味劑、著色劑、防粘劑、增稠劑和其他可接受的添加劑、佐劑或黏合劑。本發(fā)明組合物可用于與細(xì)胞死亡相關(guān)病癥的治療或預(yù)防。基本純的細(xì)胞毒性因子可以以足以預(yù)防或治療與細(xì)胞死亡相關(guān)病癥的量來施用。典型地，宿主生物是哺乳動物，例如人類或動物。
施用包含細(xì)胞毒性因子的組合物
本發(fā)明的組合物可以以任何合適的途徑給藥，例如口服、含服、吸入、舌下、直腸、陰道、經(jīng)尿道、經(jīng)鼻腔、局部、經(jīng)皮即透皮或注射(包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和冠狀動脈內(nèi))給藥。所述組合物及其藥物學(xué)配制品可以以有效達(dá)到其預(yù)期目標(biāo)的任何劑量來給藥。更特別地，所述組合物以治療有效量給藥。在各種實施方案中，所述細(xì)胞毒性因子組合物包括載體和賦型劑(包括但不限于緩沖液、碳水化合物、甘露醇、蛋白質(zhì)、多肽或氨基酸例如甘氨酸、抗氧化劑、抑菌劑、鰲合劑、助懸劑、增稠劑和/或防腐劑)、水、油、鹽溶液、水性葡萄糖和甘油溶液、為了近似于生理條件所要求的其它藥物學(xué)可接受的輔助物質(zhì)，例如緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、濕潤劑等等。應(yīng)理解的是，當(dāng)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任意合適載體被應(yīng)用于給予本發(fā)明的組合物時，載體的類型將根據(jù)給藥模式而變化?；衔镆部捎霉募夹g(shù)以脂質(zhì)體來包封。也可應(yīng)用生物可降解微球作為本發(fā)明藥物學(xué)組合物的載體。合適的生物可降解微球已公開于例如美國專利號4,897,268；5,075,109；5,928,647；5,811,128；5,820,883；5,853,763；5,814,344和5,942,252。本發(fā)明的組合物可按照常規(guī)的、眾所周知的滅菌技術(shù)來消毒或無菌過濾。所得水性溶液可以其現(xiàn)有形式或凍干形式被包裝，凍干制劑在給藥前與無菌溶液相組合。本發(fā)明的細(xì)胞毒性因子組合物可用多種方法給藥，包括注射(如真皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)等等)、吸入、局部給藥、栓劑、使用透皮貼劑或經(jīng)口給藥。當(dāng)注射給藥時，細(xì)胞毒性因子可在水性溶液中配制，優(yōu)選在生理相容性緩沖液中，例如Hanks溶液、Ringer′s溶液或生理鹽緩沖液。所述溶液可包含配制劑例如助懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘撸谑褂们?，所述細(xì)胞毒性因子組合物可以以粉末形式與合適的載體例如無菌無熱原水組合。當(dāng)吸入給藥時，所述細(xì)胞毒性因子可以以氣溶膠噴劑形式從承壓包裝中送遞，或從帶有使用合適拋射劑(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氧化碳或其他合適的氣體)的噴霧器送遞。如果是承壓氣溶膠，劑量單位可通過提供按計量量釋放的閥門來確定。用于吸入劑或吹入器的例如明膠的膠囊和藥筒可被配制成包含蛋白和合適粉末基質(zhì)(例如乳糖或淀粉)的混合粉末。當(dāng)局部給藥時，所述細(xì)胞毒性因子組合物可被配制成溶液、凝膠、油膏、乳劑、混懸劑等等，如本領(lǐng)域公知的。在一些實施方案中，利用透皮貼劑來給藥。當(dāng)通過栓劑(例如直腸或陰道)給藥時，細(xì)胞毒性因子組合物也可配制成包含常規(guī)栓劑基質(zhì)的組合物。當(dāng)口服給藥時，細(xì)胞毒性因子組合物可通過將細(xì)胞毒性因子與本領(lǐng)域公知的藥物學(xué)可接受載體組合而易于配制?？墒褂霉腆w載體，例如甘露醇、乳糖、硬脂酸鎂等等；這些載體可使趨化因子配制成片劑、丸劑、糖衣片、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑、混懸劑等等，以用于待治療對象口服吸收。對于口服固體配制品例如散劑、膠囊和片劑，合適的賦型劑包括填充劑例如糖類、纖維素制品、制粒劑和粘合劑。編碼細(xì)胞毒性因子的核酸分子可插入載體中并用作基因治療載體?；蛑委熭d體可通過例如靜脈內(nèi)注射、局部給藥(Nabel等人，美國專利號5,328,470 1994.美國)或立體定向注射(Chen等人，Proc Natl Acad Sci USA，vol.91，pp 3054-7(1994)送遞至對象?；蛑委熭d體的藥物學(xué)制劑包括可接受稀釋劑或包含基因送遞載體嵌入其中的緩釋基質(zhì)?；蛘撸暾幕蛩瓦f載體可從重組細(xì)胞中完整生成，如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，所述藥物學(xué)制劑可包括一種或多種生產(chǎn)所述基因送遞系統(tǒng)的細(xì)胞。其它常規(guī)載體，如本領(lǐng)域公知的，也包括多價載體，例如細(xì)菌莢膜多糖、葡聚糖，或被基因工程化的載體。此外，包括細(xì)胞毒性因子分子的緩釋配制品允許細(xì)胞毒性因子在延長的時間期間內(nèi)釋放，這樣如果不使用緩釋配制品，所述細(xì)胞毒性因子將從對象體系中被清除、和/或例如通過蛋白酶和在引出或增強(qiáng)治療效果之前的簡單水解被降解。確切的配制品、給藥途徑和劑量由主治醫(yī)生考慮患者情況來決定。給藥量和間隔可分別調(diào)整，以提供足以維持治療效果的活性細(xì)胞毒性因子的血漿水平。通常，期望的細(xì)胞毒性因子以與藥物學(xué)載體的混合物形式給藥，所述藥物學(xué)載體根據(jù)預(yù)期給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥物學(xué)操作進(jìn)行選擇。根據(jù)本發(fā)明使用的藥物學(xué)組合物可使用一種或多種包括賦型劑和輔助劑的生理學(xué)可接受載體以常規(guī)方式配制，所述賦型劑和輔助劑促進(jìn)將細(xì)胞毒性因子、用于抑制或刺激細(xì)胞毒性因子分泌的活性劑或它們的混合物加工成可用于治療的制劑。在一方面，細(xì)胞毒性因子作為DNA送遞，這樣多肽可在原位生成。在一個實施方案中，DNA是“裸露的”，例如Ulmer等人，Science，vol.259，pp-1745-49(1993)的描述和Cohen，Science，vol.259，pp-1691-92(1993)的綜述。通過將DNA包被于可有效地被運送進(jìn)細(xì)胞的載體例如生物可降解珠上，可提高裸DNA的攝取。在這些方法中，所述DNA可存在于多種本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的送遞系統(tǒng)中，包括核酸表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)菌和病毒表達(dá)系統(tǒng)。將DNA引入這些表達(dá)體系中的方法對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是公知的。參見例如WO90/11092，WO93/24640，WO93/17706和美國專利號5,736,524。用于生物間運輸遺傳物質(zhì)的載體可分為兩大類克隆載體是在適當(dāng)宿主細(xì)胞中帶有繁殖非必需區(qū)域的復(fù)制質(zhì)粒或噬菌體，外源DNA可插入其中；所述外源DNA可被復(fù)制和繁殖，如同它是載體的組分。表達(dá)載體(例如質(zhì)粒、酵母或動物病毒基因組)用于將外源遺傳物質(zhì)引入宿主細(xì)胞或組織中，以使得轉(zhuǎn)錄并翻譯所述外源DNA，例如細(xì)胞毒性因子的DNA。在表達(dá)載體中，引入的DNA與元件(例如向宿主細(xì)胞發(fā)出信號對插入DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的啟動子)可操縱地連接。一些啟動子特別地有用，例如響應(yīng)特定因子控制基因轉(zhuǎn)錄的可誘導(dǎo)啟動子。細(xì)胞毒性因子多核苷酸與可誘導(dǎo)啟動子的可操縱地連接可控制細(xì)胞毒性因子多肽或片斷的表達(dá)。標(biāo)準(zhǔn)的可誘導(dǎo)啟動子的實例包括那些對α-干擾素、熱休克蛋白、重金屬離子和類固醇例如糖皮質(zhì)激素(Kaufman，Methods Enzymol.，vol.185，pp.487-511(1990))和四環(huán)素作出反應(yīng)的啟動子。其它期望的可誘導(dǎo)啟動子包括對引入構(gòu)建體的細(xì)胞不是內(nèi)源性的，但是然而當(dāng)誘導(dǎo)劑被外源提供時在那些細(xì)胞中是反應(yīng)性的。一般而言，有用的表達(dá)載體通常是質(zhì)粒。然而，也包括其它形式的表達(dá)載體，例如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。載體的選擇由待使用的生物或細(xì)胞以及載體期望的命運決定。一般而言，載體包括信號序列、復(fù)制起始位點、標(biāo)記基因、增強(qiáng)子元件、啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。
包含細(xì)胞毒性因子的試劑盒在一方面，本發(fā)明提供了包含一種或多種處于包裝或容器中的下列物質(zhì)的試劑盒(1)包含細(xì)胞毒性因子的生物活性組合物；(2)藥物學(xué)可接受佐劑或賦形劑；(3)給藥載體，例如注射器；(4)給藥說明書。還包括同一容器中出現(xiàn)具有組分(1)-(4)中的兩個或多個的實施方案。當(dāng)提供試劑盒時，組合物中的不同成分可在分開的容器中包裝，并在使用前立即混合。分離組分的這樣包裝可允許長期的貯存，而不喪失活性組分的功能。試劑盒中的試劑可在任意種類的容器中提供，要求不同組分的使用期得到保存并不被容器的材料所吸收或改變。例如，密封的玻璃安瓿可含有凍干的細(xì)胞毒性多肽或多核苷酸，或在中性、不反應(yīng)性氣體例如氮氣下包裝的緩沖液。安瓿可由合適的材料構(gòu)成，例如玻璃、有機(jī)聚合物如聚碳酸酯、聚苯乙烯等、陶瓷、金屬或典型用于保存相似試劑的任何其它材料。其它合適容器的實例包括簡易瓶，其由與安瓿相似的物質(zhì)焊接而來，和封套(envelopes)，其可包含金屬箔封閉的內(nèi)部，例如鋁和合金。其它的容器包括試管、管形瓶、燒瓶、瓶、注射器等等。容器可有無菌存取口，例如有塞子的瓶子，該塞子可用皮下注射針頭刺穿。其它容器可具有兩室，兩室被容易去除的膜分開，去除所述膜后允許組分混合?？扇コた蔀椴Ａ?、塑料、橡膠等。試劑盒也可提供指導(dǎo)材料。說明書可印在紙或其它載體上，和/或以電子可讀介質(zhì)提供，例如軟盤、CD-ROM，DVD-ROM、壓縮盤(Zip disc)、錄像帶、錄音帶等。詳細(xì)的說明書與試劑盒可以不是以物理形式在一起的，而是使用者可以被指引去試劑盒的制造商或分銷商指定的互聯(lián)網(wǎng)站點，或由電子郵件提供。
對細(xì)胞毒性因子分泌的刺激或抑制細(xì)胞毒性因子的鑒別和鑒定也可導(dǎo)致刺激細(xì)胞毒性因子分泌的方法的發(fā)展。致病性生物已經(jīng)顯示在哺乳動物蛋白存在下可分泌大量的細(xì)胞毒性因子。這個原理可在人體修飾以提供刺激期望的或抑制不期望的細(xì)胞毒性因子的產(chǎn)生的方法。這些方法可用于抑制或刺激細(xì)胞凋亡或造成細(xì)胞生長停止。對細(xì)胞毒性因子的了解及其鑒定和研發(fā)也允許進(jìn)行適于調(diào)節(jié)細(xì)胞毒性因子活性或分泌的活性劑或化合物的藥物研發(fā)和篩選。涉及細(xì)胞毒性因子在細(xì)胞中的分泌系統(tǒng)的了解另外提供了設(shè)計用于細(xì)胞毒性因子的抑制劑或刺激劑的研制和鑒定的新途徑。對哺乳動物蛋白受體的存在的描繪和鑒定也可用作區(qū)分有毒和無毒微生物的手段，這可以提供在治療疾病中的特異性。
細(xì)胞毒性因子的修飾細(xì)胞毒性因子也可被化學(xué)修飾或遺傳改變以產(chǎn)生缺少利用ATP的酶活性或氧化還原活性但保留毒性的變體。細(xì)胞毒性因子的突變和/或截短可產(chǎn)生多種也表現(xiàn)功能活性的組合物的細(xì)胞毒劑。尤其具有高效能和低抗原性的截短衍生物可從最初的細(xì)胞毒性因子制得。這些經(jīng)過修飾或改變的細(xì)胞毒性因子也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。細(xì)胞毒性因子的各種衍生物也可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)合成。衍生物是天然化合物直接或經(jīng)修飾或部分取代形成的氨基酸序列。類似物是與天然化合物結(jié)構(gòu)相似但不一致，但區(qū)別涉及特定的組分或側(cè)鏈的氨基酸序列。類似物可以是合成的或來自于不同的進(jìn)化起源。如果衍生物或類似物含有經(jīng)修飾的氨基酸，那么所述衍生物或類似物可以是全長或不同于全長。細(xì)胞毒性因子的衍生物或類似物包括但不限于包含與細(xì)胞毒性因子基本同源的區(qū)域的分子，所述同源是在相同大小的氨基酸序列中，或當(dāng)與對齊序列進(jìn)行比較時，至少約65％、70％、75％、85％、90％、95％、98％或99％的相同性所述其中序列對比是通過同源算法進(jìn)行的。除了自然發(fā)生的細(xì)胞毒性因子的等位基因變體，也可通過突變在細(xì)胞毒性因子中引入變化，所述突變引起被編碼的細(xì)胞毒性因子的氨基酸序列變化，而這不明顯改變細(xì)胞毒活性?！胺潜匦琛卑被釟埢强稍谝吧图?xì)胞毒性因子序列中改變，而不改變生物學(xué)活性的殘基。而“必需”氨基酸殘基是這種生物學(xué)功能所要求的。例如，在本發(fā)明的細(xì)胞毒性因子中保守的氨基酸殘基預(yù)計是尤其不能改變 影響(1)多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如β-折疊或α-螺旋構(gòu)象，(2)電荷，(3)疏水性，或(4)靶位點的側(cè)鏈體積的非保守取代可改變細(xì)胞毒性因子的功能。如表2所示，基于共同側(cè)鏈的性質(zhì)，對殘基進(jìn)行分組。非保守取代要求這些類型中的一個的成員變換成另一種類型。取代可引入至保守取代位點，或更優(yōu)選非保守位點。
表2氨基酸分類 多肽變體可使用本領(lǐng)域已知的方法制得，例如寡核苷酸介導(dǎo)的(定位)誘變、丙胺酸掃描(alanine scanning)和PCR誘變。定位誘變(Carter，Biochem J.，vol.237，pp 1-7(1986)；Zoller和Smith，MethodsEnzymol.，vol.154，pp 329-50(1987))、盒式誘變(cassette mutagenesis)、限制選擇誘變(Wells等人，Gene，vol.34，pp 315-23(1985))或其它已知的技術(shù)可在克隆DNA上操作以產(chǎn)生細(xì)胞毒性因子變體DNA。上面已描述了C112D和M44KM64E細(xì)胞毒性因子突變體的細(xì)胞毒活性。此外，實施例19顯示了一些嵌合型天青蛋白突變體的細(xì)胞毒活性，這些突變體以如實施例18所描述的定位誘變制得。本發(fā)明也使用了細(xì)胞毒性因子，例如去輔基天青蛋白，其不存在銅原子。去輔基天青蛋白和C112D突變體都顯示了顯著的細(xì)胞毒活性，而M44KM64E突變體卻沒有。然而M44KM64E突變體引起對細(xì)胞周期進(jìn)展顯著的抑制。本發(fā)明的一個實施方案使用突變型細(xì)胞毒性因子，該因子保持與p53形成復(fù)合物并穩(wěn)定它的能力，以及因此誘導(dǎo)凋亡。在另一個實施方案中，本發(fā)明使用突變的細(xì)胞毒性因子，例如M44KM64E突變體，其具有與p53相互作用的能力并導(dǎo)致細(xì)胞生長停止。對本發(fā)明更完整的理解可通過參考下列具體實施例來獲得。描述實施例目的僅在于說明，而并不是試圖限制本發(fā)明的范圍。當(dāng)環(huán)境提示或使得這樣更便利時，形式的變化和等同取代也包含在本發(fā)明中。盡管在本文使用了特定的術(shù)語，但是這些術(shù)語是為了描述，而不是為了限制。如上文所列出的對本發(fā)明的修飾和變化可以在不偏離本發(fā)明精神或范圍下進(jìn)行，因此應(yīng)當(dāng)認(rèn)為限制只有如所附權(quán)利要求書中所指明的那樣。
實施例實施例1利用哺乳動物蛋白刺激細(xì)胞毒性因子的分泌洋蔥假單胞菌的臨床和環(huán)境分離菌(每種5個)在具有或不具有添加的α2-巨球蛋白(1mg/ml)的蛋白胨-酵母提取物(PPY)肉湯中生長。在搖床上于34℃生長10小時后，將每個培養(yǎng)物的一部分培養(yǎng)基離心，上清液通過0.22μm微孔過濾器過濾以去除整細(xì)胞和碎片。然后過濾的上清液按照Melnikov A等人，Mol.Microbiol.，361481-1493(2000)描述的方法測試腺苷酸激酶活性。腺苷酸激酶從[γ-32p]ATP轉(zhuǎn)移末端磷酸于AMP得到ADP。該反應(yīng)的產(chǎn)物可通過薄層色譜檢測到。當(dāng)洋蔥假單胞菌細(xì)胞在PPY肉湯中生長時，腺苷酸激酶的分泌最小。然而，α2-巨球蛋白的存在刺激臨床分離菌的分泌，而不刺激環(huán)境分離菌。使用抗α2-巨球蛋白抗體的免疫熒光顯微術(shù)顯示臨床分離菌具有結(jié)合α2-巨球蛋白的受體，而環(huán)境分離菌缺少這樣的受體。洋蔥假單胞菌的臨床和環(huán)境分離菌在存在或不存在1mg/ml的α2-巨球蛋白的PPY肉湯中生長1小時。通過磷酸緩沖鹽水沖洗，去除無關(guān)的α2-巨球蛋白。細(xì)胞與異硫氰酸熒光素(FITC)綴合的α2-巨球蛋白抗體溫育2小時，該抗體通過給兔子注射α2-巨球蛋白得到。用磷酸緩沖鹽水沖洗后，F(xiàn)ITC綴合的抗體處理的細(xì)胞用16％的多聚甲醛固定，包被在涂布聚-L-賴氨酸玻片上，并用共焦顯微鏡檢查。只有臨床分離菌在α2-巨球蛋白存在下有增強(qiáng)的細(xì)胞毒性因子的分泌的發(fā)熒光(綠色熒光細(xì)胞)，證明α2-巨球蛋白受體的存在。
實施例2得自洋蔥假單胞菌培養(yǎng)基的過濾的上清液或色譜柱級分對依賴ATP的巨噬細(xì)胞的殺死在搖床上洋蔥假單胞菌的臨床分離菌(株38-收集號95828，D.G Allison，University of Manchester Institute of Science andTechnology，Manchester，UK)于34℃在TB培養(yǎng)基生長至OD550nm為1.3。然后離心培養(yǎng)基，上清液通過0.22μm微孔過濾器過濾以去除整細(xì)胞和碎片。巨噬細(xì)胞從J774細(xì)胞系分離，按照aborina O等人，Infect.Immun.675231-5242(1999)描述的方法生長于RPMI培養(yǎng)基164(GIBRO-BRL，Grand Island，N.Y.)。將過濾的培養(yǎng)基依次加于羥基磷灰石、ATP-瓊脂糖和Q-瓊脂糖柱。來自羥基磷灰石柱(HAFT)的濾過級分在ATP-瓊脂糖柱(AAFT)上分級分離。AAFT級分在Q-瓊脂糖柱(QSFT)上分級分離。將106巨噬細(xì)胞加于96孔板的孔中，并在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時。將來自上清液或上述每個柱子的濾過級分的2μg蛋白加于孔中，培養(yǎng)板在存在或不存在1.0mM ATP下培養(yǎng)4小時。然后按照Zaborina O.等人，Infect.Immun.，675231-5242(1999)描述的方法通過對細(xì)胞內(nèi)酶乳酸脫氫酶(LDH)釋放來測定巨噬細(xì)胞的死亡程度。在存在或不存在1.0mM ATP下，過濾的上清液(SUP)和HAFT，AAFT和QSFT的色譜柱級分殺死巨噬細(xì)胞的程度顯示于圖1。所有的測試重復(fù)操作3次，并標(biāo)明誤差桿。
實施例3得自洋蔥假單胞菌培養(yǎng)基的過濾的上清液或色譜柱級分對不依賴ATP的巨噬細(xì)胞的殺死得自洋蔥假單胞菌培養(yǎng)基的上清液(SUP)或色譜柱級分(HAFT、AAFT或QSFT)如實施例2。巨噬細(xì)胞的分離如實施例2。如實施例2所述，通過對LDH的釋放來測定巨噬細(xì)胞的死亡程度，并顯示于圖2。只有QSFT級分顯示對巨噬細(xì)胞高的不依賴ATP的細(xì)胞毒性。
實施例4用銅綠假單胞菌細(xì)胞毒性因子誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡銅綠假單胞菌在L肉湯中于37℃生長12小時至OD550nm為1.2。然后離心培養(yǎng)基，上清液用0.22μm過濾器過濾。上清液(SUP)和色譜柱級分(HAFT，AAFT和QSFT)按照實施例2所述收集。如實施例2所述分離巨噬細(xì)胞。將來自上清液或濾過級分之一的2μg蛋白加于含1×105巨噬細(xì)胞的200μl RPMI培養(yǎng)基中，混合物培養(yǎng)過夜。在未處理的或通過與SUP或HAFT、AAFT或QSFT級分過夜溫育而處理的巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)的凋亡用共聚焦顯微術(shù)來測量，共聚焦顯微術(shù)按照Zaborina O.等人，Microbiology 1462521-2530(2000)描述的方法使用ApoAlert線粒體膜傳感器試劑盒(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，California，U.S.A.)進(jìn)行。在這次測定中，健康未凋亡細(xì)胞發(fā)紅色熒光，而凋亡致死細(xì)胞發(fā)綠色熒光。紅色與綠色的組合產(chǎn)生發(fā)黃色熒光細(xì)胞，表明凋亡性瀕死細(xì)胞。未處理巨噬細(xì)胞或用HAFT、AAFT和QSFT級分過夜處理的巨噬細(xì)胞主要發(fā)紅色熒光，表明無凋亡性細(xì)胞死亡。用QSFT級分過夜處理的巨噬細(xì)胞主要發(fā)綠光，表明大多數(shù)巨噬細(xì)胞凋亡死亡。時間過程研究顯示凋亡在約6小時時開始(通過紅色熒光與綠色熒光組合使細(xì)胞變成黃色來表明)，在12-16小時結(jié)束。
實施例5用洋蔥假單胞菌細(xì)胞毒性因子在肥大細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡肥大細(xì)胞按照MelnikovA.等人，Mol.Microbiol.361481-1493(2000)描述的方法來分離。按照實施例2制備洋蔥假單胞菌分級分離的培養(yǎng)基。按照實施例4描述的使用共聚焦顯微術(shù)來測量用洋蔥假單胞菌細(xì)胞毒因子在肥大細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。未處理的肥大細(xì)胞或用洋蔥假單胞菌培養(yǎng)基的SUP，HAFT或AAFT級分過夜處理的肥大細(xì)胞，基本發(fā)紅色熒光，顯示無凋亡性細(xì)胞死亡。用洋蔥假單胞菌QSFT級分過夜處理的肥大細(xì)胞主要發(fā)綠光，表明大多數(shù)巨噬細(xì)胞凋亡性死亡。
實施例6用洋蔥假單胞菌和牛型分枝桿菌的QSFT級分在巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡如實施例2進(jìn)行巨噬細(xì)胞分離。使用實施例4的方法測定用洋蔥假單胞菌和牛型分枝桿菌的細(xì)胞毒性分子在巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)的凋亡。當(dāng)用洋蔥假單胞菌和牛型分枝桿菌的QSFT級分處理時，觀察到對巨噬細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。
實施例7在洋蔥假單胞菌QSFT級分處理過的巨噬細(xì)胞的胞漿提取物中測量胱天蛋白酶活性(胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-9)如實施例2分離巨噬細(xì)胞。使用實施例2中描述的方法用洋蔥假單胞菌的QSFT級分處理巨噬細(xì)胞過夜。按照ZaborinaO等人，Microbiology1462521-2530(2000)的描述進(jìn)行巨噬細(xì)胞胞漿提取物的制備和胱天蛋白酶的測定。簡單而言，胱天蛋白酶-3活性測定使用Ac-DEVD-pNA(N-乙酰-Asp-Glu-Val-Asp-對硝基苯胺)作為底物進(jìn)行。pNA(對硝基苯胺)的釋放用分光光度計在405nm處測定，所述pNA的釋放源于與下述巨噬細(xì)胞胞漿提取物在37℃溫育15，30，45，60，75和90分鐘的胱天蛋白酶-3的底物(200μm)(圖3A)未誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞胞漿提取物；與洋蔥假單胞菌的QSFT級分(10μg蛋白)過夜溫育的巨噬細(xì)胞胞漿提取物；與洋蔥假單胞菌的QSFT級分(10μg蛋白)和加入的抑制劑(DEVD-CHO)過夜溫育的巨噬細(xì)胞胞漿提取物。每組使用10μg巨噬細(xì)胞胞漿蛋白。在胱天蛋白酶-9的測試中，對來自200μm胱天蛋白酶-9底物Ac-LEHD-pNA(N-乙酰-Leu-Glu-His-Asp-對硝基苯胺)的pNA的釋放進(jìn)行測定，所述pNA的釋放源于與下述巨噬細(xì)胞胞漿提取物在37℃溫育15，30，45，60，75和90分鐘的胱天蛋白酶-9的底物(圖3B)未誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞胞漿提取物；與洋蔥假單胞菌的QSFT級分(10μg蛋白)過夜溫育的巨噬細(xì)胞胞漿提取物；與洋蔥假單胞菌的QSFT級分(10μg蛋白)加上抑制劑(LEHD-CHO)過夜溫育的巨噬細(xì)胞胞漿提取物。每組使用10μg巨噬細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)蛋白。DEVD-CHO和LEHD-CHO各自阻斷胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9的活性，它們可從Biomol Research Laboratories，PlymouthMeeting，PA，U.S.A.獲得。當(dāng)巨噬細(xì)胞用洋蔥假單胞菌的QSFT級分過夜處理后，胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9的活性提高(圖3A和B)。未處理的巨噬細(xì)胞或存在抑制劑時這些酶活性很低，表明用QSFT級分誘導(dǎo)凋亡涉及胱天蛋白酶活性。
實施例8在經(jīng)洋蔥假單胞菌或牛型分枝桿菌的QSFT級分處理的巨噬細(xì)胞中用TUNEL分析法測量核DNA斷裂使用實施例2描述的方法得到分級分離的洋蔥假單胞菌培養(yǎng)基。牛型分枝桿菌BCG生長于補(bǔ)充有2％甘油，0.02％吐溫80和ADC(白蛋白/葡萄糖/檸檬酸鹽)(可從Difco Laboratories，Maryland，U.S.A.得到)的Middlebrook 7H9肉湯(Difco Laboratories，Maryland，U.S.A.)中。收集之前，細(xì)菌于32℃在搖床上生長幾天。使用實施例2描述的方法得到分級分離的牛型分枝桿菌培養(yǎng)基。按照實施例2分離巨噬細(xì)胞。通過ApoAlert DNA斷裂試劑盒(ClontechLaboratories，Inc.，Palo Alto，California，U.S.A.)檢測凋亡誘導(dǎo)的核DNA斷裂，經(jīng)共聚焦顯微術(shù)測量在未處理的或用SUP或HAFT、AAFT或QSFT級分過夜處理的巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)的凋亡。該方法基于末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Tdt)-介導(dǎo)的dUTP原位切口末端標(biāo)記(TUNEL)，其中在經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞中Tdt催化在斷裂的DNA的游離3’-羥基末端摻入熒光素-dUTP。在斷裂的核DNA片段摻入熒光素-dUTP產(chǎn)生綠色熒光，這可通過共聚焦顯微術(shù)檢測到。用洋蔥假單胞菌或牛型分枝桿菌的QSFT級分處理的巨噬細(xì)胞顯示在胞漿紅色背景中的黃-綠色核。表明核DNA斷裂。在未處理的巨噬細(xì)胞或用其它柱級分處理的巨噬細(xì)胞中，極少或沒有斷裂被觀察到。
實施例9來自銅綠假單胞菌、洋蔥假單胞菌和牛型分枝桿菌的培養(yǎng)基的上清液和HAFT、AAFT和QSFT級分中的蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析SDS-PAGE分離顯示蛋白質(zhì)存在于來自銅綠假單胞菌、洋蔥假單胞菌和牛型分枝桿菌的上清液和HAFT，AAFT和QSFT級分中。來自黏液型銅綠假單胞菌8821株的QSFT培養(yǎng)基級分顯示存在兩個條帶，它們是通過N末端分析相應(yīng)于天青蛋白的18kD條帶和相應(yīng)于細(xì)胞色素C551的9kD條帶。洋蔥假單胞菌的QSFT級分顯示存在三種主要條帶，75kDa，20kDa和8kDa。通過Edman降解測定了20kDa條帶N-末端氨基酸序列的10個氨基酸(AHHSVDIQGN)，顯示與銅綠假單胞菌N末端10個氨基酸具有80％的序列同源性，而8kDa條帶N-末端氨基酸序列的10個氨基酸(EDPEVLFKNK)顯示與銅綠假單胞菌細(xì)胞色素c551的相應(yīng)序列100％匹配。因此具有高細(xì)胞毒活性的銅綠假單胞菌和洋蔥假單胞菌的QSFT級分顯示富含天青蛋白和細(xì)胞色素c551類型的氧化還原蛋白。相比之下，牛型分枝桿菌的QSFT級分顯示65kD的小牛血清白蛋白(BSA)濃條帶(BSA是用于牛型分枝桿菌生長的7H9培養(yǎng)基的組分)以及一些分子量超過45kD的條帶，但沒有8kDa或22kDa細(xì)胞色素c551或天青蛋白類型的蛋白。
實施例10在用天青蛋白/細(xì)胞色素c551處理的巨噬細(xì)胞中的細(xì)胞死亡在按照實施例2制備的巨噬細(xì)胞中加入純化天青蛋白和細(xì)胞色素c551，混合物培養(yǎng)2小時。天青蛋白和細(xì)胞色素c551的濃度如圖4。數(shù)字代表μg蛋白。使用實施例2的方法，通過對胞內(nèi)酶乳酸脫氫酶(LDH)釋放來測定巨噬細(xì)胞死亡。天青蛋白和細(xì)胞色素c551均可造成巨噬細(xì)胞死亡。天青蛋白和細(xì)胞色素c551的組合引起更大范圍的巨噬細(xì)胞死亡。緩沖液對照組(緩沖液)顯示在右側(cè)。(圖4)實施例11用天青蛋白/細(xì)胞色素c551處理的巨噬細(xì)胞中凋亡的誘導(dǎo)按照實施例2的方法分離巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞用天青蛋白/細(xì)胞色素c551(50/25μg)處理4-6小時，然后使用如實施例4中的ApoAlert線粒體膜傳感器試劑盒用共焦顯微術(shù)檢查來測量凋亡程度。巨噬細(xì)胞在天青蛋白/細(xì)胞色素c551混合物存在下，隨著溫育時間的增加，凋亡水平也增加。未處理的對照組巨噬細(xì)胞(用磷酸緩沖鹽水處理6小時)沒有顯示凋亡。
實施例12用抗天青蛋白抗體和抗細(xì)胞色素c551抗體預(yù)處理后，天青蛋白/細(xì)胞色素c551混合物或來自洋蔥假單胞菌或牛型分枝桿菌的QSFT級分在巨噬細(xì)胞中的細(xì)胞毒性按照實施例2進(jìn)行巨噬細(xì)胞分離。在存在或不存在抗天青蛋白抗體和抗細(xì)胞色素c551抗體下(抗體在兔中制備)，用純化的天青蛋白和細(xì)胞色素c551混合物(50/25μg)、或洋蔥假單胞菌或牛型分枝桿菌的QSFT級分處理巨噬細(xì)胞。抗體以1∶1的比例混合，混合抗體(1、2、3或4mg)用于處理巨噬細(xì)胞。如實施例2通過LDH的釋放測量巨噬細(xì)胞的死亡程度。圖5顯示當(dāng)天青蛋白/細(xì)胞色素c551抗體存在時，用天青蛋白/細(xì)胞色素c551混合物(A+C)、或洋蔥假單胞菌的QSFT級分(Bc-QSFT)處理的巨噬細(xì)胞細(xì)胞毒性下降。這種下降在牛型分枝桿菌的QSFT級分(Mb-QSFT)中沒有觀察到。因此，當(dāng)用抗天青蛋白抗體和抗細(xì)胞色素c551抗體混合物處理天青蛋白和細(xì)胞色素c551混合物或洋蔥假單胞菌的QSFT級分，然后測量巨噬細(xì)胞細(xì)胞毒性時，細(xì)胞毒性大大的減少了。相比之下，當(dāng)用抗天青蛋白抗體和抗細(xì)胞色素c551抗體預(yù)處理牛型分枝桿菌的QSFT級分，然后分析巨噬細(xì)胞毒性時，觀察到細(xì)胞毒性完全沒有減少，所述牛型分枝桿菌的QSFT級分先前已經(jīng)由SDS-PAGE凝膠顯示缺少天青蛋白和細(xì)胞色素c551條帶(實施例9)。
實施例13用共聚焦顯微術(shù)檢測利用洋蔥假單胞菌的QSFT級分和天青蛋白抗體/細(xì)胞色素c551在腫瘤細(xì)胞系中誘導(dǎo)凋亡H460肺癌、PA-1卵巢癌、NCF乳腺癌、HT-29結(jié)腸癌和HT-1080白血病細(xì)胞系得自American Type Culture Collection(Manassas，VA，U.S.A.)。MDD7和MN1乳腺癌細(xì)胞系來自AndreiGudkov，博士，Cleveland Clinic Foundation(Cleveland，OH U.S.A.)。UISO-BCA-9乳腺癌和UISO-MEL-1、MEL-2、MEL-6和MEL-29黑素瘤細(xì)胞系按照Rauth，S等人，In vitro Cellular and DevelopmentalBiology，30a(2)79-84(1994)和Rauth，S等人，Anticancer Research，14(6)2457-2463(1994)描述的方法發(fā)育和維持。在洋蔥假單胞菌的QSFT級分(5μg蛋白)或天青蛋白/細(xì)胞色素c551混合物(50/25μg)存在下，將約1×105的每種類型細(xì)胞在0.15mm厚dTC3培養(yǎng)皿(Bioptech，Butler PA，U.S.A.)中過夜培養(yǎng)。如實施例4，細(xì)胞隨后用共焦顯微術(shù)檢測，以測定凋亡程度。過夜培養(yǎng)后，在H460肺癌、HT-29結(jié)腸癌、HT-1080白血病、PA-1卵巢癌、MDD7、NCF和MN1乳腺癌、和USIO-MEL-1、MEL-2、MEL-6和MEL-29黑素瘤細(xì)胞中，洋蔥假單胞菌的QSFT級分和天青蛋白/細(xì)胞色素c551混合物均誘導(dǎo)廣泛的凋亡。在每組中，未用細(xì)毒性因子處理的細(xì)胞(加入磷酸緩沖鹽水)沒有顯示廣泛的凋亡。
實施例14用TUNEL分析法測量用牛型分枝桿菌的QSFT級分在USIO-Mel-6黑素瘤細(xì)胞系中誘導(dǎo)的凋亡如實施例8按照Rauth，S等人，AnticancerResearch，14(6)2457-2463(1994)描述的方法制備USIO-Mel-6黑素瘤細(xì)胞。將用牛型分枝桿菌的QSFT級分(5μg蛋白)處理的黑素瘤細(xì)胞和未處理的對照細(xì)胞培養(yǎng)12小時。如實施例8使用TUNEL分析法檢出凋亡誘導(dǎo)的DNA斷裂以進(jìn)行誘導(dǎo)凋亡的檢測。用牛型分枝桿菌的QSFT級分處理的黑素瘤細(xì)胞在紅色胞漿背景下顯示黃-綠細(xì)胞核，表明核DNA斷裂。未處理的黑素瘤細(xì)胞觀察到極少或無斷裂。
實施例15用天青蛋白抗體/細(xì)胞色素c551處理后在裸鼠中黑素瘤細(xì)胞(USIO-Mel-2)生長的降低將約106USIO-Mel-2細(xì)胞皮下注射于裸鼠(得自FrederickCancer Research and Development Center，F(xiàn)rederick，Maryland U.S.A.)。約3周后形成小腫瘤。然后小鼠接受每周一次腹膜內(nèi)注射已知的抗黑素瘤藥物，DTIC[5-(3，3′-N，N-二甲基三氮烯-1-基)-咪唑-4-羧酰胺](7.5μg)(參見Ahlmais等人，Cancer6324-7(1989))，或每周三次腹膜內(nèi)注射高(150μg天青蛋白/75μg細(xì)胞色素c551)、低(10μg天青蛋白/5μg細(xì)胞色素c551)劑量的天青蛋白/細(xì)胞色素c551混合物或?qū)φ?檸檬酸緩沖液)，持續(xù)4周。每隔一段時間測定對照組、用DTIC處理組、以及高和低劑量天青蛋白/細(xì)胞色素c551混合物處理組的小鼠中的腫瘤體積。圖6顯示在對照、用DTIC處理的、和天青蛋白/細(xì)胞色素c551處理的裸鼠腫瘤大小的增加，圖7顯示這些小鼠體重增加/減少。相比于DTIC，高劑量的150μg天青蛋白/75μg細(xì)胞色素c551注射后產(chǎn)生延遲生長和腫瘤大小收縮。圖7顯示注射DTIC或天青蛋白/細(xì)胞色素c551混合物沒有影響小鼠體重增加。所有的小鼠在試驗期間體重增加。實施例16在注射黑素瘤細(xì)胞(Mel-6)后，在裸鼠腫瘤位點注射天青蛋白和牛型分枝桿菌的QSFT級分后的效果將約106USIO-Mel-2細(xì)胞皮下注射于3只裸鼠(得自Frederick Cancer Research and Development Center，F(xiàn)rederick，Maryland U.S.A.)。約3周后形成小腫瘤。一只小鼠腹膜內(nèi)注射磷酸鹽緩沖鹽水(對照)，一只小鼠注射牛型分枝桿菌的QSFT級分(5μg)以及一只小鼠注射牛型分枝桿菌的QSFT級分(5μg蛋白)和天青蛋白(50μg)混和物。按照實施例8的方法制備牛型分枝桿菌的QSFT級分。對對照組、牛型分枝桿菌的QSFT級分處理的和牛型分枝桿菌的QSFT級分/天青蛋白處理的小鼠腫瘤大小(腫瘤體積)的測量超過30天。這些數(shù)據(jù)顯示于圖8。與對照組小鼠相比，處理組小鼠均顯示腫瘤生長的降低。
實施例17天青蛋白誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞凋亡和消退人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(p53+/+)和MDA-MB-157(p53-/-)來自culture collection of the Department of Surgical Oncology，University of Illinois at Chicago(UIC)，Chicago。正常乳腺細(xì)胞(MCF-1OF)和皮膚細(xì)胞為同一來源。HBL100細(xì)胞由Department ofBiochemistry and Molecular Biology，Mayo Clinics，Rochester，MN的Nita J.Mahile博士惠贈。細(xì)胞生長于MEM培養(yǎng)基或Macoy′s 5A培養(yǎng)基，其中MEM培養(yǎng)基補(bǔ)加Earle′s鹽、10％FBS、氨芐青霉素/鏈霉素。細(xì)胞于37℃在6％CO2環(huán)境下生長。銅綠假單胞菌的天青蛋白編碼基因在pU19中擴(kuò)增和克隆。來自大腸桿菌(E.coli)JM109的天青蛋白的純化按照Yamada，T等人，Infect.Immun.，vol.70，pp 7054-62(2002)描述的方法進(jìn)行，其內(nèi)容引作參考。天青蛋白對細(xì)胞系的細(xì)胞毒性使用按照Yamada等人，(2002)描述MTT測試法來測定。圖9顯示了用各種濃度天青蛋白處理72小時的MCF-7和MDA-MB-157細(xì)胞中天青蛋白的細(xì)胞毒性。處理72小時后，28.5μM(400μg/ml)濃度的天青蛋白在72小時中誘導(dǎo)50％MCF-7細(xì)胞死亡。在同樣的試驗條件下，MDA-MB-157細(xì)胞死亡50％要求57μM(800μg/ml)。為測定天青蛋白是否在正常細(xì)胞中誘導(dǎo)相似的細(xì)胞死亡，測試了兩種乳腺上皮細(xì)胞系(HBL100和MCF-10F)。與57μM(800μg/ml)的天青蛋白培養(yǎng)72小時后，只有20％MCF-10F細(xì)胞和18％HBL100細(xì)胞無法存活。使用來自Promega(Madison，WI)的試劑盒通過細(xì)胞效價96的水性蛋白水解分析法(Eilon，G.F.等人，Cancer Chemother.Pharmacol.，vol.45，pp183-91(2001)來測定細(xì)胞生存力。
實施例18對被注射乳腺癌腫瘤細(xì)胞的裸鼠用天青蛋白治療減少腫瘤大小將按照實施例17得到的約500,000個MCF-7細(xì)胞注射于雌性裸鼠(得自Frederick Cancer Research and Development Center，F(xiàn)rederick，Maryland U.S.A.)右側(cè)乳房脂肪墊最低處，該雌鼠經(jīng)過雌二醇預(yù)處理。將鼠隨機(jī)分成兩組，每組10只。治療組每天接受腹膜內(nèi)注射含1mg天青蛋白的1ml生理鹽水溶液，持續(xù)28天，對照組每天接受1ml生理鹽水，持續(xù)28天。接種MCF-7三天后開始治療。在試驗期間，每天檢查小鼠，每周測量兩次三軸腫瘤大小和體重。在第29天，處死動物，進(jìn)行詳細(xì)的尸體解剖。保存所有的腫瘤和內(nèi)臟以進(jìn)行組織學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)檢查。與對照組動物相比，每天用1mg天青蛋白治療持續(xù)28天的小鼠的腫瘤體積具有顯著更慢的增長速率。對數(shù)據(jù)的單變量分析顯示這兩組動物(天青蛋白對對照組)的腫瘤生長速率差異顯著。例如，開始治療的22天里，受治療小鼠的平均腫瘤體積只是對照組小鼠平均腫瘤體積的22％(即各自為0.0267cm3和0.1240cm3，P＝0.0179，Kruskal-Wallis檢驗)，證實78％的腫瘤生長抑制。在第29天試驗結(jié)束時，天青蛋白治療組的平均腫瘤體積只是對照組平均腫瘤體積的15％。通過圖10可得到進(jìn)一步的說明，圖10是顯示以cm3表示的兩組平均腫瘤體積隨時間變化的圖。在多變量分析中，用非線形混合效應(yīng)模型對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。針對腫瘤生長擬合的一個模型是以時間為指數(shù)的，系數(shù)是對象特異的混合效應(yīng)。對于對照組，擬合的模型是腫瘤體積＝exp{-4.23+0.06*時間}，而對于治療組，則是腫瘤體積＝exp{-4.23+0.03*時間}。差異是統(tǒng)計學(xué)顯著的(P＝0.0456)。在治療期間(28天)，以體重減少和/或其它通?？捎^察到的毒性癥狀作為依據(jù)，治療組動物沒有顯示任何毒性癥狀。按照實施例8的TUNEL染色法評估腫瘤中凋亡的程度。與對照組相比，天青蛋白治療組顯示在凋亡特征上有明顯增加，而對照組很少碰見凋亡細(xì)胞。
實施例19天青蛋白突變體的制備微生物和質(zhì)粒根據(jù)Kukimoto等人，F(xiàn)EBS Lett，vol.394，pp87-90(1996)描述的方法通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增天青蛋白基因(野生型天青蛋白)，該文獻(xiàn)內(nèi)容引作參考。使用銅綠假單胞菌PAO1株的基因組DNA作為模板DNA，進(jìn)行PCR。所用的正向引物和反向引物是5′-GCCCAAGCTTACCTAGGAGGCTGCTCCATGCTA-3′(SEQ IDNO8)和5′-TGAGCCCCTGCAGGCGCCCATGAAAAAGCCCGGC-3′(SEQ ID NO9)，其中加下劃線的是額外引入的HindIII和Pst I限制性位點。545bp的擴(kuò)增DNA片段用HindIII和Pst I消化，插入pUC19相應(yīng)位點，使得天青蛋白基因置于lac啟動子下游，產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒pUC19-azuA。大腸桿菌JM 109用作表達(dá)天青蛋白的宿主菌株。重組大腸桿菌菌株于37℃在2YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時產(chǎn)生天青蛋白，該培養(yǎng)基包含50μg ml-1氨芐青霉素、0.1mM IPTG和0.5mM CuSO4。
天青蛋白基因的定位誘變使用QuickChange定位誘變試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA)進(jìn)行天青蛋白基因的定位誘變。如下對每種突變設(shè)計了一套寡核苷酸。對C112D5′-CAGTACATGTTCTTCGACACCTTCCCGGGCCAC-3′(SEQ IDNO10)和5′-TGGCCCGGGAAGGTGTCGAAGAACATGTACTGC-3′(SEQ IDNO11)；對M44K5′-CCTGCCGAAGAACGTCAAGGGCCACAACTGGG-3′(SEQ IDNO12)和5′-CCCAGTTGTGGCCCTTGACGTTCTTCGGCAGG-3′(SEQ ID NO13)；對M64E5′-GGTCACCGACGGCGAGGCTTCCGGCCTGG-3′(SEQ ID NO14)和
5′-CCAGGCCGGAAGCCTCGCCGTCGGTGACC-3′(SEQ ID NO15)。通過DNA測序來確證突變。
天青蛋白的嵌合型突變體用GENETYX軟件(Software Development，Tokyo)檢索天青蛋白被視為T細(xì)胞表位候選物的氨基酸殘基進(jìn)行搜索。發(fā)現(xiàn)如下7個推定的表位EP1-EP7EP 1，I20TVDKS25(SEQ ID NO16)；EP2，V49LSTAA54(SEQ ID NO17)；EP3，G58VVT61(SEQ ID NO18)；EP4，G63HASG66(SEQ ID NO19)；EP5，R79VIAH83(SEQ ID NO20)；EP6，K85LIG88(SEQ ID NO21)；和EP7，M121KGTLT126(SEQ ID NO22)。各種微生物天青蛋白的氨基酸序列來自GeneBank，用GENETYX軟件進(jìn)行序列對比，以比較推定的T細(xì)胞表位(EP)位點附近的氨基酸(圖11(a))。EP位點，編號為1-7，用條棒顯示于序列上方。PA，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1(SEQ ID NO23)；AF，糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)(SEQ ID NO24)；AX，木糖氧化產(chǎn)堿菌反硝化亞種I(Achromobacter xylosoxidans ssp.Denitrificans I)(SEQ ID NO25)；BB，支氣管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)(SEQ ID NO26)；MJ，Methylomonassp.J(SEQ ID NO27)；NM，腦膜炎奈瑟氏球菌Z2491(Neisseria meningitidis Z2491)(SEQ ID NO28)；PF，熒光假單胞菌(Pseudomonas fiuorescen)(SEQ ID NO29)；PC，綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)(SEQ ID NO30)；XE，苛養(yǎng)木桿菌9a5c(Xylella fastidiosa 9a5c)(SEQ ID NO31)。設(shè)計用其它微生物天青蛋白的氨基酸取代銅綠假單胞菌推定的表位的氨基酸，以得到表位發(fā)生改變的嵌合型蛋白。通過定位誘變累積構(gòu)建嵌合型突變體，并且使用下列寡核苷酸取代天青蛋白基因中的BstEII限制片段EP1內(nèi)的T21Q突變體使用5′-CAACACCAATGCCATCcagGTCGACAAGAGCTGCAAGC-3′(SEQID NO32)和5′-AGCTCTTGTCGACctgGATGGCATTGGTGTTGAACTGC-3′(SEQID NO33)；EP7內(nèi)的T126K突變體使用5′-GAAGGGCACCCTGAagCTGAAGTGATGCGCG-3′(SEQ ID NO34)，和5′-GCGCATCACTTCAGctTCAGGGTGCCCTTCATC-3′(SEQID NO35)；EP2內(nèi)的T52K/A53S突變體使用5′-AACTGGGTACTGAGCAagtCCGCCGACATGCAGGGC-3′(SEQID NO36)和5′-CTGCATGTCGGCGGactTGCTCAGTACCCAGTTGTG-3′(SEQ IDNO37)；EP3內(nèi)的G58P/V591突變體使用5′-CCGCCGACATGCAGccCaTGGTCACCGACGGCATGGC-3′(SEQID NO38)和5′-GCCATGCCGTCGGTGACCAtGggCTGCATGTCGGCGG-3′(SEQID NO39)；EP3內(nèi)的M591N60A突變體使用5′-CATGCAGCCCATcGcCACCGACGGCATGGC-3′(SEQ ID NO40)和5′-CATGCCGTCGGTGgCgATGGGCTGCATGTCG-3′(SEQ ID NO41)；EP4、EP5和EP6內(nèi)的S66A/G67A/H83F/K85P/L861突變體使用5′-GTCACCGACGGCATGGCTgCCGcCCTGGACAAGGATTACCTGAAGCCCGACGACAGCCGTGTCATCGCCttCACccGaTcATCGGCTCGGGCGAGAAGG ACTCG-3′(SEQ ID NO42)和5′GTCACCGAGTCCTTCTCGCCCGAGCCGATgAtCggGGTGaaGGCGATGACACGGCTGTCGTCGGGCTTCAGGTAATCCTTGTCCAGGgCGGcAGCCATGCCGTCG-3′(SEQ ID NO43)，其中加下劃線的是BstE II位點，它們用于取代來自野生型的BstE II片段。寡核苷酸中的小寫字母表示誘變核苷酸。圖11(b)顯示野生型天青蛋白和使用上述方法制備的嵌合型突變天青蛋白。S1(SEQ ID NO.45)、S2(SEQ ID NO.46)、S3(SEQID NO.47)、S4(SEQ ID NO.50)、和S6(SEQ ID NO.51)通過累積定位誘變以此順序構(gòu)建。通過各自用突變BstE II片段取代野生型天青蛋白(wtS5)和S3天青蛋白(S3S5)的野生型BstE II片段((SEQ ID NO.44)，WtS5(SEQ ID NO.52)和S3S5(SEQ ID NO.48)得以構(gòu)建。使用wtS5基因和S3S5基因各自作為模板DNA，通過兩輪定位誘變，WtS5S4S6(SEQ ID NO.53)和S3S5S4S6(SEQ ID NO.49)得以構(gòu)建。通過DNA測序確定引入突變。被取代的氨基酸用粗體顯示?；蛟诖竽c桿菌中表達(dá)如上述針對野生型天青蛋白所述。沒有觀察到S3S5S4S6的表達(dá)。根據(jù)Kukimoto等人(1996)描述的方法使用Q-Sepharose FF柱和Superdex 75柱(Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)從重組大腸桿菌細(xì)胞的胞質(zhì)組分中純化野生型和突變天青蛋白。為制備去輔基天青蛋白，用0.1M MES緩沖液pH6.0處理野生型天青蛋白16小時，緩沖液中包含0.2M硫脲、0.25M NaCI和1mM EDTA。根據(jù)vanPouderroyen等人，Biochemistry，vol.35，pp 1397-1407(1996)描述的方法，采用透析將釋放的銅離子去除。
實施例20天青蛋白和突變天青蛋白的細(xì)胞毒活性實施例19中制備的野生型天青蛋白、去輔基天青蛋白、C112D和M44KM64E突變體、和嵌合型突變體用于巨噬細(xì)胞細(xì)胞毒性測定。按照實施例2進(jìn)行巨噬細(xì)胞分離。37℃，5％CO2，在96孔培養(yǎng)板中每孔接種含有約1×105細(xì)胞的200μl RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有10％FBS。過夜生長后，用同樣的培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞，然后用含有天青蛋白或突變天青蛋白的新培養(yǎng)基取代。處理24小時后向培養(yǎng)基中加入10μl的5mg mi4MTT[3-(45-二甲基噻唑-2-基-2，5-二苯基四唑溴)]溶液，并在37℃下培養(yǎng)2.5小時。MTT反應(yīng)通過加入40mM HCl的異丙醇溶液來結(jié)束。根據(jù)Mosmann，J.Immunol.Methods，vol.65，pp55-63(1983)描述的方法，用分光光度法測量MTT甲(formazan)的形成。圖12(a)和12(b)顯示了天青蛋白和突變天青蛋白的細(xì)胞毒性。圖12(b)也顯示了以野生型天青蛋白的電子轉(zhuǎn)移效率的百分比來表示的突變體的相對電子轉(zhuǎn)移效率。在這里，按照Cutruzzola等人，Journal of Inorganic Biochemistry 88；353-361，2002描述的方法，氧化型天青蛋白和還原型細(xì)胞色素c551之間的電子轉(zhuǎn)移效率用激光閃光光解法來測量。
實施例21天青蛋白和突變型天青蛋白的凋亡活性為測量由野生型天青蛋白或天青蛋白突變體誘導(dǎo)的凋亡率，使用ApoAlert線粒體膜傳感器試劑盒(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，California，U.S.A.).，利用流式細(xì)胞計量術(shù)測量線粒體電勢的變化。按照實施例2分離巨噬細(xì)胞。于37℃，5％CO2，在6孔培養(yǎng)板中每孔接種含有約1×106細(xì)胞的2ml RPMI-1640培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中含有10％FBS。過夜生長后，用同樣的培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞，然后用含有天青蛋白或突變天青蛋白的新培養(yǎng)基取代。處理16小時后，用MitoSensor染料將細(xì)胞染色，并根據(jù)制造商的手冊用FL-1濾膜通過流式細(xì)胞計量術(shù)進(jìn)行分析。圖13顯示了天青蛋白、去輔基天青蛋白和C112D和M44KM64E突變體對巨噬細(xì)胞的凋亡活性。凋亡率(％)以從對照群轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)綠色熒光的凋亡群的細(xì)胞群分?jǐn)?shù)表示。
實施例22鐵硫菌藍(lán)蛋白、去輔基鐵硫菌藍(lán)蛋白(apo-rusticyanin)和假天青蛋白的細(xì)胞毒活性按照實施例19制備野生型天青蛋白。來自Thiobacillusferrooxidans的鐵硫菌藍(lán)蛋白和來自Aclzromobacter cycloclastes的假天青蛋白以它們基因的高表達(dá)來制備，并按照對天青蛋白所描述的方法(Yamada等人2002；Goto等人2003)，進(jìn)行柱色譜分級分離。按照實施例18描述的方法制備去輔基鐵硫菌藍(lán)蛋白。按照實施例13的方法得到UISO-Mel-2細(xì)胞。于37℃，5％CO2下，在96孔培養(yǎng)板中每孔接種含有約5×103細(xì)胞的200μl MEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有10％FBS。過夜生長后，用同樣的培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞，然后用緩沖液(PBS pH 7.4或Tris-HCl pH5.0)、在Tris-HCl pH 5.0中的含有鐵硫菌藍(lán)蛋白的粗樣品、或去輔基鐵硫菌藍(lán)蛋白的PBS溶液pH7.4替換。24小時后，按照實施例19描述的進(jìn)行MTT分析操作。圖14顯示野生型天青蛋白、鐵硫菌藍(lán)蛋白、去輔基鐵硫菌藍(lán)蛋白和假天青蛋白的細(xì)胞毒性。
實施例23質(zhì)體藍(lán)素的細(xì)胞毒活性按照實施例18制備野生型天青蛋白。來自Phormidiumlaminosum的質(zhì)體藍(lán)素以它的基因高表達(dá)來制備，并按照對天青蛋白所描述的方法，進(jìn)行柱色譜分級分離。按照實施例2描述的方法分離巨噬細(xì)胞。于37℃，5％CO2下，在96孔培養(yǎng)板中每孔接種含有約1×105細(xì)胞的200μl RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有10％FBS。過夜生長后，用同樣的培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞，然后用含有天青蛋白或突變型天青蛋白的新培養(yǎng)基取代。處理24小時后向培養(yǎng)基中加入10μl的5mg mi4MTT[3-(4 5-二甲基噻唑-2-基-2，5-二苯基四唑溴)]溶液，并在37℃下培養(yǎng)2.5小時。MTT反應(yīng)通過加入40mM HCl的異丙醇溶液來結(jié)束。根據(jù)Mosmann，J.Immunol.Methods，vol.65，pp55-63(1983)描述的方法，用分光光度法測量MIT甲的形成。圖15顯示野生型天青蛋白和質(zhì)體藍(lán)素的細(xì)胞毒性。
序列表<110>伊利諾斯大學(xué)理事會<120>Cupredoxin家族多肽在癌癥治療中的用途<130>11472-11<150>60/414,550<151>2003-08-15<150>10/047,710<151>2002-01-15<150>60/269,133<151>2001-02-15<160>53<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>128<212>PRT<213>Pseudomonas aeruginosa<400>1Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn1 5 10 15Thr Asn Ala Ile Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn20 25 30Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp35 40 45Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met50 55 60Ala Sap Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val65 70 75 80Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr85 90 95Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys100 105 110Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys115 120 125
<210>2<211>105<212>PRT<213>Phormidium laminosum<400>2Glu Thr Phe Thr Val Lys Met Gly Ala Asp Ser Gly Leu Leu Gln Phe1 5 10 15Glu Pro Ala Asn Val Thr Val His Pro Gly Asp Thr Val Lys Trp Val20 25 30Asn Asn Lys Leu Pro Pro His Asn Ile Leu Phe Asp Asp Lys Gln Val35 40 45Pro Gly Ala Ser Lys Glu Leu Ala Asp Lys Leu Ser His Ser Gln Leu50 55 60Met Phe Ser Pro Gly Glu Ser Tyr Glu Tle Thr Phe Ser Ser Asp Phe65 70 75 80Pro Ala Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Cys Ala Pro His Arg Gly Ala Gly85 90 95Met Val Gly Lys Ile Thr Val Glu Gly100 105<210>3<211>155<212>PRT<213>Thiobacillus ferrooxidans<400>3Gly Thr Leu Asp Thr Thr Trp Lys Glu Ala Thr Leu Pro Gln Val Lys1 5 10 15Ala Met Leu Glu Lys Asp Thr Gly Lys Val Ser Gly Asp Thr Val Thr20 25 30Tyr Ser Gly Lys Thr Val His Val Val Ala Ala Ala Val Leu Pro Gly35 40 45Phe Pro Phe Pro Ser Phe Glu Val His Asp Lys Lys Asn Pro Thr Leu50 55 60Glu Ile Pro Ala Gly Ala Thr Val Asp Val Thr Phe Ile Asn Thr Asn65 70 75 80
Lys Gly Phe Gly His Ser Phe Asp Ile Thr Lys Lys Gly Pro Pro Tyr85 90 95Ala Val Met Pro Val Ile Asp Pro Ile Val Ala Gly Thr Gly Phe Ser100 105 110Pro Val Pro Lys Asp Gly Lys Phe Gly Tyr Thr Asp Phe Thr Trp His115 120 125Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Tyr Val Cys Gln Tle Pro Gly His Ala130 135 140Ala Thr Gly Met Phe Gly Lys Ile Val Val Lys145 150 155<210>4<211>124<212>PRT<213>Achromobacter cycloclastes<400>4Ala Asp Phe Glu Val His Met Leu Asn Lys Gly Lys Asp Gly Ala Met1 5 10 15Val Phe Glu Pro Ala Ser Leu Lys Val Ala Pro Gly Asp Thr Val Thr20 25 30Phe Ile Pro Thr Asp Lys Gly His Asn Val Glu Thr Ile Lys Gly Met35 40 45Tle Pro Asp Gly Ala Glu Ala Phe Lys Ser Lys Tle Asn Glu Asn Tyr50 55 60Lys Val Thr Phe Thr Ala Pro Gly Val Tyr Gly Val Lys Cys Thr Pro65 70 75 80His Tyr Gly Met Gly Met Val Gly Val Val Gln Val Gly Asp Ala Pro85 90 95Ala Asn Leu Glu Ala Val Lys Gly Ala Lys Asn Pro Lys Lys Ala Gln100 105 110Glu Arg Leu Asp Ala Ala Leu Ala Ala Leu Gly Asn115 120<210>5<211>82<212>PRT
<213>Pseudomonas aeruginosa<400>5Glu Asp Pro Glu Val Leu Phe Lys Asn Lys Gly Cys Val Ala Cys His1 5 10 15Ala Ile Asp Thr Lys Met Val Gly Pro Ala Tyr Lys Asp Val Ala Ala20 25 30Lys Phe Ala Gly Gln Ala Gly Ala Glu Ala Glu Leu Ala Gln Arg Ile35 40 45Lys Asn Gly Ser Gln Gly Val Trp Gly Pro Ile Pro Met Pro Pro Asn50 55 60Ala Val Ser Asp Asp Glu Ala Gln Thr Leu Ala Lys Trp Val Leu Ser65 70 75 80Gln Lys<210>6<211>128<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>C112D azurin mutant<400>6Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn1 5 10 15Thr Asn Ala Ile Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn20 25 30Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp35 40 45Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met50 55 60Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val65 70 75 80Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr85 90 95Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Asp
100 105 110Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys115 120 125<210>7<211>128<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>M44KM64E azurin mutant<400>7Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn1 5 10 15Thr Asn Ala Ile Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn20 25 30Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Lys Gly His Asn Trp35 40 45Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Glu50 55 60Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val65 70 75 80Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr85 90 95Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys100 105 110Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys115 120 125<210>8<211>33<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer<400>8gcccaagctt acctaggagg ctgctccatg cta 33<210>9<211>34
<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer<400>9tgagcccctg caggcgccca tgaaaaagcc cggc 34<210>10<211>33<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>ofoligonucleotide for C112D mutation<400>10cagtacatgt tcttcgacac cttcccgggc cac 33<210>11<211>33<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>ofoligonucleotide for C112D mutation<400>11tggcccggga aggtgtcgaa gaacatgtac tgc 33<210>12<211>32<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>ofoligonucleotide for M44K mutation<400>12cctgccgaag aacgtcaagg gccacaactg gg32<210>13<211>32<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>ofoligonucleotide for M44K mutation<400>13cccagttgtg gcccttgacg ttcttcggca gg32<210>14<211>29<212>DNA<213>Artificial Sequence
<220>
<223>ofoligonucleotide for M64E mutation<400>14ggtcaccgac ggcgaggctt ccggcctgg29<210>15<211>29<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>ofoligonucleotide for M64E mutation<400>15ccaggccgga agcctcgccg tcggtgacc29<210>16<211>6<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Antigenic epitope，EP1<400>16Ile Thr Val Asp Lys Ser1 5<210>17<211>6<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Antigenic epitope，EP2<400>17Val Leu Ser Thr Ala Ala1 5<210>18<211>4<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Antigenic Epitope，EP3<400>18Gly Val Val Thr1<210>19<211>5
<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Antigenic epitope，EP4<400>19Gly Met Ala Ser Gly1 5<210>20<211>5<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Antigenic epitope，EP5<400>20Arg Val Ile Ala His1 5<210>21<211>4<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Antigenic epitope，EP6<400>21Lys Leu Ile Gly1<210>22<211>6<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Antigenic epitope，EP7<400>22Met Lys Gly Thr Leu Thr1 5<210>23<211>128<212>PRT<213>Pseudomonas aeruginosa<400>23Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn1 5 10 15
Thr Asn Ala Ile Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn20 25 30Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp35 40 45Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met50 55 60Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val65 70 75 80Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr85 90 95Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys100 105 110Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys115 120 125<210>24<211>128<212>PRT<213>Alcaligenes faecalis<400>24Ala Cys Asp Val Ser Ile Glu Gly Asn Asp Ser Met Gln Phe Asn Thr15 10 15Lys Ser Ile Val Val Asp Lys Thr Cys Lys Glu Phe Thr Ile Asn Leu20 25 30Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Lys Ala Ala Met Gly His Asn Val Val35 40 45Val Ser Lys Lys Ser Asp Glu Ser Ala Val Ala Thr Asp Gly Met Lys50 55 60Ala Gly Leu Asn Asn Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Glu Arg Val Ile65 70 75 80Ala His Thr Ser Val Ile Gly Gly Gly Glu Thr Asp Ser Val Thr Phe85 90 95Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Asp Tyr Ala Phe Phe Cys ser100 105 110
Phe Pro Gly His Trp Ser Ile Met Lys Gly Thr Ile Glu Leu Gly Ser115 120 125<210>25<211>129<212>PRT<213>Achromobacter xylosoxidans ssp.denitrificans<400>25Ala Gln Cys Glu Ala Thr Ile Glu Ser Asn Asp Ala Met Gln Tyr Asn1 5 10 15Leu Lys Glu Met Val Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val His20 25 30Leu Lys His Val Gly Lys Met Ala Lys Val Ala Met Gly His Asn Trp35 40 45Val Leu Thr Lys Glu Ala Asp Lys Gln Gly Val Ala Thr Asp Gly Met50 55 60Asn Ala Gly Leu Ala Gln Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val65 70 75 80Ile Ala His Thr Lys Val Ile Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr85 90 95Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Pro Gly Glu Ala Tyr Ala Tyr Phe Cys100 105 110Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Met Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Ser115 120 125Asn<210>26<211>129<212>PRT<213>Bordetella bronchiseptica<400>26Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Ala Gly Thr Asp Gln Met Gln Phe Asp1 5 10 15Lys Lys Ala Ile Glu Val Ser Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn20 25 30
Leu Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Arg Asn Val Met Gly His Asn Trp35 40 45Val Leu Thr Lys Thr Ala Asp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly Ile50 55 60Ala Ala Gly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val65 70 75 80Leu Ala His Thr Lys Val Leu Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr85 90 95Phe Asp Val Ala Lys Leu Ala Ala Gly Asp Asp Tyr Thr Phe Phe Cys100 105 110Ser Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Val115 120 125Asp<210>27<211>129<212>PRT<213>Methylomonas sp.J<400>27Ala Ser Cys Glu Thr Thr Val Thr Ser Gly Asp Thr Met Thr Tyr Ser1 5 10 15Thr Arg Ser Ile Ser Val Pro Ala 5er Cys Ala Glu Phe Thr Val Asn20 25 30Phe Glu His Lys Gly His Met Pro Lys Thr Gly Met Gly His Asn Trp35 40 45Val Leu Ala Lys Ser Ala Asp Val Gly Asp ValAla Lys Glu Gly Ala50 55 60His Ala Gly Ala Asp Asn Asn Phe Val Thr Pro Gly Asp Lys Arg Val65 70 75 80Ile Ala Phe Thr Pro Ile Ile Gly Gly Gly Glu Lys Thr Ser Val Lys85 90 95Phe Lys Val Ser Ala Leu Ser Lys Asp Glu Ala Tyr Thr Tyr Phe Cys100 105 110
Ser Tyr Pro Gly His Phe Ser Met Met Arg Gly Thr Leu Lys Leu Glu115 120 125Glu<210>28<211>166<212>PRT<213>Neisseria meningitidis<400>28Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Ala1 5 10 15Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp20 25 30Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser35 40 45Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp Ile Gln Val Ser Lys Ala50 55 60Cys Lys Glu Phe Thr Ile Thr Leu Lys His Thr Gly Thr Gln Pro Lys65 70 75 80Thr Ser Met Gly His Asn Ile Val Ile Gly Lys Thr Glu Asp Mer Asp85 90 95Gly Ile Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys100 105 110Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Gly Gly115 120 125Glu Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu Ala Asp Gly Glu130 135 140Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly145 150 155 160Lys Val Thr Leu Val Asp165<210>29<211>128<212>PRT
<213>Pseudomonas fluorescens<400>29Ala Glu Cys Lys Thr Thr Ile Asp Ser Thr Asp Gln Met Ser Phe Asn1 5 10 15Thr Lys Ala Ile Glu Ile Asp Lys Ala Cys Lys Thr Phe Thr Val Glu20 25 30Leu Thr His Ser Gly Ser Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Leu35 40 45Val Ile Ser Lys Gln Ala Asp Met Gln Pro Ile Ala Thr Asp Gly Leu50 55 60Ser Ala Gly Ile Asp Lys Asn Tyr Leu Lys Glu Gly Asp Thr Arg Val65 70 75 80Ile Ala His Thr Lys Val Ile Gly Ala Gly Glu Lys Asp Ser Leu Thr85 90 95Ile Asp Val Ser Lys Leu Asn Ala Ala Glu Lys Tyr Gly Phe Phe Cys100 105 110Ser Phe Pro Gly His Ile Ser Met Met Lys Gly Thr Val Thr Leu Lys115 120 125<210>30<211>128<212>PRT<213>Pseudomonas chlororaphis<400>30Ala Glu Cys Lys Val Asp Val Asp Ser Thr Asp Gln Met Ser Phe Asn1 5 10 15Thr Lys Glu Ile Thr Ile Asp Lys Ser Cys Lys Thr Phe Thr Val Asn20 25 30Leu Thr His Ser Gly Ser Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp35 40 45Val Leu Ser Lys Ser Ala Asp Met Ala Gly Ile Ala Thr Asp Gly Met50 55 60Ala Ala Gly Ile Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Gly Asp Ser Arg Val65 70 75 80
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<223>oligonucleotide for T21Q mutation within EP1
<400>32caacaccaat gccatccagg tcgacaagag ctgcaagc 38<210>33<211>38<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>oligonucleotide for T21Q mutation within EP1<400>33agctcttgtc gacctggatg gcattggtgt tgaactgc 38<210>34<211>31<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>oligonucleotide for T126K mutation within EP7<400>34gaagggcacc ctgaagctga agtgatgcgc g 31<210>35<211>33<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>oligonucleotide for T126K mutation within EP7<400>35gcgcatcact tcagcttcag ggtgcccttc atc 33<210>36<211>36<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>oligonucleotide for T52K/A53S mutations within EP2<400>36aactgggtac tgagcaagtc cgccgacatg cagggc36<210>37<211>36<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>oligonucleotide for T52K/A53S mutations within EP2<400>37ctgcatgtcg gcggacttgc tcagtaccca gttgtg36
<210>38<211>37<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>oligonucleotide for G58P/V591 mutations within EP3<400>38ccgccgacat gcagcccatg gtcaccgacg gcatggc 37<210>39<211>37<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>oligonucleotide for G58P/V591 mutations within EP3<400>39gccatgccgt cggtgaccat gggctgcatg tcggcgg 37<210>40<211>30<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>oligonucleotide for M591/V60A mutations within EP3<400>40catgcagccc atcgccaccg acggcatggc 30<210>41<211>31<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>oligonucleotide for M591/V60A mutations within EP3<400>41catgccgtcg gtggcgatgg gctgcatgtc g 31<210>42<211>104<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>oligonucleotide for S66A/G67A/H83F/K85P/L861 mutations within EP4，EP5，and EP6<400>42gtcaccgacg gcatggctgc cgccctggac aaggattacc tgaagcccga cgacagccgt 60gtcatcgcct tcacccgatc atcggctcgg gcgagaagga ctcg 104
<210>43<211>105<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>oligonucleotide for S66A/G67A/H83F/K85P/L861 mutations within EP4，EP5，and EP6<400>43gtcaccgagt ccttctcgcc cgagccgatg atcggggtga aggcgatgac acggctgtcg 60tcgggcttca ggtaatcctt gtccagggcg gcagccatgc cgtcg 105<210>44<211>128<212>PRT<213>Pseudomonas aeruginosa<400>44Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn1 5 10 15Thr Asn Ala Ile Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn20 25 30Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp35 40 45Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met50 55 60Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val65 70 75 80Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr85 90 95Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys100 105 110Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys115 120 125<210>45<211>128<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>chimeric azurin mutant S1
<400>45Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn1 5 10 15Thr Asn Ala Ile Gln Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn20 25 30Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp35 40 45Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met50 55 60Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val65 70 75 80Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr85 90 95Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys100 105 110Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys115 120 125<210>46<211>128<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>chimeric azurin mutant S2<400>46Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn1 5 10 15Thr Asn Ala Ile Gln Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn20 25 30Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp35 40 45Val Leu 5er Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met50 55 60Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val65 70 75 80
Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr85 90 95Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys100 105 110Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Lys115 120 125<210>47<211>128<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>chimeric azurin mutanr S3<400>47Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn1 5 10 15Thr Asn Ala Ile Gln Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn20 25 30Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp35 40 45Val Leu Ser Lys Ser Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met50 55 60Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val65 70 75 80Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr85 90 95Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys100 105 110Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Lys115 120 125<210>48<211>128<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>chimeric azurin mutant s3s5
<400>48Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn1 5 10 15Thr Asn Ala Ile Gln Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn20 25 30Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp35 40 45Val Leu Ser Lys Ser Ala Asp Met Gln Gly Val Ala Thr Asp Gly Met50 55 60Ala Ala Ala Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val65 70 75 80Tle Ala Phe Thr Pro Ile Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr85 90 95Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys100 105 110Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Lys115 120 125<210>49<211>128<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>chimeric azurin mutant s3s5s4s6<400>49Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn1 5 10 15Thr Asn Ala Ile Gln Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn20 25 30Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp35 40 45Val Leu Ser Lys Ser Ala Asp Met Gln Pro Ile Ala Thr Asp Gly Met50 55 60Ala Ala Ala Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val65 70 75 80
Ile Ala Phe Thr Pro Ile Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr85 90 95Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys100 105 110Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Lys115 120 125<210>50<211>128<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>chimeric azurin mutant S4<400>50Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn1 5 10 15Thr Asn Ala Ile Gln Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn20 25 30Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp35 40 45Val Leu Ser Lys Ser Ala Asp Met Gln Met Ile Val Thr Asp Gly Met50 55 60Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val65 70 75 80Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr85 90 95Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys100 105 110Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Lys115 120 125<210>51<211>128<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>chimeric azurin mutant s6
<400>51Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn1 5 10 15Thr Asn Ala Ile Gln Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn20 25 30Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp35 40 45Val Leu Ser Lys Ser Ala Asp Met Gln Pro Ile Ala Thr Asp Gly Met50 55 60Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val65 70 75 80Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr85 90 95Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys100 105 110Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Lys115 120 125<210>52<211>128<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>chimeric azurin mutant wts5<400>52Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Ash Asp Gln Met Gln Phe Asn1 5 10 15Thr Asn Ala Ile Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn20 25 30Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp35 40 45Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met50 55 60Ala Ala Ala Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val65 70 75 80
Ile Ala Phe Thr Pro Ile Tle Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr85 90 95Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys100 105 110Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys115 120 125<210>53<211>128<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>chimeric azurin mutant wts5s4s6<400>53Ala Glu Cys Ser Val Asp Tle Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn1 5 10 15Thr Asn Ala Ile Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn20 25 30Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp35 40 45Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Pro Ile Ala Thr Asp Gly Met50 55 60Ala Ala Ala Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val65 70 75 80Ile Ala Phe Thr Pro Ile Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr85 90 95Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys100 105 110Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys115 120 12權(quán)利要求
1.一種治療與細(xì)胞死亡抗性相關(guān)的病癥的方法，包括給予有效量的cupredoxin，或其變體或衍生物，以在顯示細(xì)胞死亡抗性的細(xì)胞中促進(jìn)細(xì)胞死亡。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述cupredoxin或其變體或衍生物結(jié)合腫瘤抑制蛋白p53。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述cupredoxin選自由天青蛋白、假天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素和鐵硫菌藍(lán)蛋白組成的一組。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述cupredoxin是天青蛋白。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述cupredoxin是包含SEQ ID NO1氨基酸序列或與SEQ ID NO1具有至少90％的序列相同性的氨基酸序列的天青蛋白。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述cupredoxin是包含SEQ ID NO1氨基酸序列或與SEQ ID NO1具有至少90％的序列相同性的氨基酸序列的天青蛋白，并且其中所述cupredoxin結(jié)合腫瘤抑制蛋白p53。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述天青蛋白包含SEQ ID NO6的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述天青蛋白包含SEQ ID NO7的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求3的方法，其中所述cupredoxin是質(zhì)體藍(lán)素。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述cupredoxin是包含SEQ ID NO2氨基酸序列或與SEQ ID NO2具有至少90％序列相同性的氨基酸序列的質(zhì)體藍(lán)素。
11.權(quán)利要求3的方法，其中所述cupredoxin是假天青蛋白。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述cupredoxin是包含SEQ ID NO4氨基酸序列或與SEQ ID NO4具有至少90％序列相同性的氨基酸序列的假天青蛋白。
13.權(quán)利要求3的方法，其中所述cupredoxin是鐵硫菌藍(lán)蛋白。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述cupredoxin是包含SEQ ID NO3氨基酸序列或與SEQ ID NO3具有至少90％序列相同性的氨基酸序列的鐵硫菌藍(lán)蛋白。
15.一種治療與細(xì)胞死亡抗性相關(guān)的病癥的方法，包括給予有效量的細(xì)胞色素C551或其變體或衍生物，以在顯示細(xì)胞死亡抗性的細(xì)胞中促進(jìn)細(xì)胞生長停止。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述細(xì)胞色素C551包含SEQ ID NO5的氨基酸序列或與SEQ ID NO5具有至少90％的序列相同性的氨基酸序列。
17.權(quán)利要求15的方法，其中與細(xì)胞死亡抗性相關(guān)的病癥選自由人黑素瘤、白血病、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、間質(zhì)細(xì)胞癌、結(jié)腸癌和呼吸消化道癌組成的一組。
18.權(quán)利要求17的方法，其中與細(xì)胞死亡抗性相關(guān)的病癥是乳腺癌。
19.權(quán)利要求15的方法，進(jìn)一步包含給予有效量的選自由天青蛋白、假天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素和鐵硫菌藍(lán)蛋白組成的一組的cupredoxin。
20.權(quán)利要求1的方法，其中與細(xì)胞死亡抗性相關(guān)的病癥選自由人黑素瘤、白血病、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、間質(zhì)細(xì)胞癌、結(jié)腸癌和呼吸消化道癌組成的一組。
21.權(quán)利要求20的方法，其中與細(xì)胞死亡抗性相關(guān)的病癥是乳腺癌。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的細(xì)胞毒性因子，以及它們在治療與壞死或凋亡相關(guān)病癥的方法中的用途。本發(fā)明也涉及鑒定用于治療與細(xì)胞死亡或不受控制的生長相關(guān)病癥的活性劑的方法。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)不同微生物產(chǎn)生具有抗腫瘤活性的不同細(xì)胞毒性因子?；炯兊募?xì)胞毒性因子可用于治療感染性疾病或癌癥的方法中。
文檔編號A61P35/00GK1863545SQ200480029453
公開日2006年11月15日 申請日期2004年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月15日
發(fā)明者阿曼達(dá)·M·查克拉伯蒂, 塔帕斯·K·達(dá)斯古普塔, 瓦蘇·邦吉, 奧爾佳·扎伯利納, 義范平岡, 亨山田 申請人:伊利諾斯大學(xué)理事會