專利名稱：植物種子提取物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于預(yù)防動脈硬化等的新型植物種子提取組合物，含有該植物種子提取組合物的食品、飼料和醫(yī)藥組合物，以及該植物種子提取組合物的制備方法。
背景技術(shù)：
隨著近年來生活方式的歐美化，心絞痛、心肌梗塞、腦梗塞等動脈硬化性疾病與癌癥一起成為日本人的頭號死因。對于在動脈硬化巢形成的初期LDL(低密度脂蛋白)的氧化扮演著重要的角色這一觀點人們已基本達成共識，因此最近逐漸指出不僅要將血中膽固醇水平控制在適當(dāng)?shù)乃?，而且控制氧化LDL的生成也是重要的。
已知食品、特別是源于植物的物質(zhì)中含有豐富的抗氧化物質(zhì)，有人在考慮是否是綠茶或紅葡萄酒中含有的抗氧化物質(zhì)被攝入至LDL中(或其附近)并除去自由基來防止氧化LDL的生成(Fuhrman等，Am.J.Clin.Nutr.，61；pp549-54，1995)。也有積極攝入這些食品將抑制癌或心臟病的免疫學(xué)研究(Renaud等，Lancet，339pp1523-26，1992)。
有報告指出來自芝麻種子木質(zhì)素、葡萄種子多酚等特定的植物種子的特定成分對實驗動物顯示抗動脈硬化作用(Kang等，J.Nutr.，129pp1885-90，1999；Yamakoshi等，Atherosclerosis，142pp139-49，1999)。但現(xiàn)實是這種植物種子成分在動物實驗水平上明確抗動脈硬化性的例子還很少，眾多研究尚停留在試管水平。例如，特開平8-337536號公報中公開了焙炒植物種子并由經(jīng)發(fā)酵處理的種子中提取出的抗活性氧作用劑。在該技術(shù)中，雖然利用植物種子作為原料，但由于需要焙炒、發(fā)酵處理等操作，因此通用性低，并非實用的方法。另外沒有明確顯示出起到抑制動脈硬化的效果。另外，Zhang等人(Zhang等，Chem.Pham.Bull.，45pp1910-14，1997)報道了由紅花的油粕中利用各種溶劑的分配操作提取出的化合物組的結(jié)構(gòu)，其中有體外具有抗氧化活性的物質(zhì)。但是，現(xiàn)狀是這些具有抗氧化活性的化合物對于預(yù)防動脈硬化有效尚不明確?？紤]到已知體外的抗氧化活性未必與體內(nèi)的抗動脈硬化活性相關(guān)(Fruebis等，J.Lipid Res.，38pp2455-64，1997；Fruebis等，Atherosclerosis，117pp217-24，1995Munday等，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.，18pp114-19，1998)，植物種子中的抗氧化物質(zhì)是否具有抗動脈硬化性，至少需要在實驗動物水平上進行確認(rèn)。雖然Moon等人在紅花種子的粉末、乙醇提取物或熱水提取物中發(fā)現(xiàn)了抑制給與膽固醇負(fù)荷餌料的大鼠血中膽固醇上升的作用(Moon等，Nutr.Res.，21pp895-904，2001)，但該大鼠的膽固醇負(fù)荷實驗結(jié)果是用來評價抑制膽固醇吸收的，而不是用來評價抑制動脈硬化的。
另一方面，已知在紅花種子中含有體外抗氧化活性、抗炎性活性的血清素衍生物(Zhang等，Chem.Pham.Bull.，44pp874-876，1996；Kawasaki等，J.Interferon Cytokine Res.，18pp423-428，1998)。另外已知紅花種子中含有作為糖苷的血清素衍生物(Zhang等，Chem.Pham.Bull.，45pp1910-14，1997)。另外報告了紅花種子中含有血清素衍生物和作為腹瀉誘發(fā)性物質(zhì)的酚性糖苷2-羥基牛蒡子苷(2-hydroxyarctiin)(Palter.R.等，Phytochemistry，11pp2871-2874，1972)。雖然報告說該2-羥基牛蒡子苷是用pH5的水提取出的，但對血清素衍生物的行為并未進行考察(Lyon.C.K.等，J.Amer.Oil Chem.Soc.，56pp560-564，1979)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題在于提供大量含有體內(nèi)具有活性、且降低了副作用的新型植物種子提取組合物，含有該植物種子提取組合物的食品、飼料、醫(yī)藥組合物，以及提供該植物種子提取組合物的制備方法，該方法適用于食品、飼料、醫(yī)藥組合物的制備。
本發(fā)明人中的小山等人發(fā)現(xiàn)脫脂后的植物種子、特別是紅花種子或菜籽種子的有機溶劑提取物(用己烷洗滌脫脂種子的含水乙醇提取液之后，用乙酸乙酯提取出的提取物)體外具有抑制人血漿中的LDL的氧化的作用，脫脂后的植物種子的有機溶劑提取物體內(nèi)還具有抑制小鼠的血管內(nèi)壁上形成的粥狀斑(plaque)的形成的作用，在實驗動物中對預(yù)防動脈硬化有效(PCT/JP03/04607)。而且，本發(fā)明人中的小山等人發(fā)現(xiàn)血清素衍生物(對香豆酰血清素和阿魏酰血清素)的混合物在實驗動物中對預(yù)防動脈硬化有效(PCT/JP03/04607)。由此發(fā)現(xiàn)可容易地類推出與這些血清素衍生物一樣，已知紅花種子中含有的作為糖苷的血清素衍生物體內(nèi)具有活性，對預(yù)防動脈硬化有效。
對于預(yù)防動脈硬化，腹瀉是有害的。于是，本發(fā)明人基于上述情況和發(fā)現(xiàn)，著眼于獲得體內(nèi)具有活性、對預(yù)防動脈硬化有效的血清素衍生物的含量多、且作為腹瀉誘發(fā)性物質(zhì)的2-羥基牛蒡子苷的含量少的植物種子提取組合物，和為了獲得所述組合物的提取方法。
本發(fā)明人為了解決上述課題進行了銳意研究，結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)通過用水洗滌脫脂后的植物種子，從得到的洗滌處理物中用有機溶劑進行提取，可得到血清素衍生物的含量多、且2-羥基牛蒡子苷的含量少的組合物，完成了本發(fā)明。由于使用食品、飼料、醫(yī)藥組合物的制備中通?？墒褂玫闹苽溆脛┛蓪嵤┍景l(fā)明的方法，因此適用于食品、飼料、醫(yī)藥組合物的制備。本發(fā)明包含以下項目。
(1)一種植物種子提取組合物，其是用水洗滌脫脂后的植物種子，從得到的洗滌處理物中用有機溶劑提取得到的。
(2)一種植物種子提取組合物，其是對用水洗滌脫脂后的植物種子、從得到的洗滌處理物中用有機溶劑提取得到的提取物進行濃縮、干燥得到的。
(3)上述(1)或(2)所述的組合物，其中植物種子為紅花的種子。
(4)一種紅花種子提取組合物，其中，對香豆酰血清素、阿魏酰血清素、對香豆酰血清素糖苷和阿魏酰血清素糖苷的總含量，與2-羥基牛蒡子苷的含量的重量比為1∶0.01～0.2。
(5)上述(4)所述的組合物，其是用水洗滌脫脂后的紅花的種子，從得到的洗滌處理物中用有機溶劑提取得到的。
(6)上述(4)所述的組合物，其是對用水洗滌脫脂后的紅花的種子、從得到的洗滌處理物中用有機溶劑提取得到的提取物進行濃縮、干燥得到的。
(7)上述(1)、(2)、(3)、(5)或(6)所述的組合物，其中有機溶劑為低級醇。
(8)上述(7)所述的組合物，其中低級醇為乙醇。
(9)含有上述(1)～(8)中任一項所述的組合物的食品。
(10)含有上述(1)～(8)中任一項所述的組合物的飼料。
(11)含有上述(1)～(8)中任一項所述的組合物的醫(yī)藥組合物。
(12)一種植物種子提取組合物的制備方法，其含有用水洗滌脫脂后的植物種子、從得到的洗滌處理物中用有機溶劑提取的工序。
(13)一種植物種子提取組合物的制備方法，其含有對用水洗滌脫脂后的植物種子、從得到的洗滌處理物中用有機溶劑提取得到的提取物進行濃縮、干燥的工序。
(14)上述(12)或(13)所述的制備方法，其中，植物種子為紅花的種子。
(15)上述(12)、(13)或(14)中任一項所述的制備方法，其中，有機溶劑為低級醇。
(16)上述(15)所述的制備方法，其中，低級醇為乙醇。
本發(fā)明的植物種子提取組合物為作為有效成分的血清素衍生物的含量多、且作為腹瀉誘發(fā)性化合物的2-羥基牛蒡子苷的含量少的新型組合物。根據(jù)本發(fā)明的方法可適合于制備上述植物種子提取組合物，而且本發(fā)明的方法不使用一般在食品、飼料等用途中作為制備用劑不優(yōu)選使用的乙酸乙酯也可進行制備，因此適于食品、飼料等的制備。
圖1為關(guān)于參考例1中各試樣的LDL的被氧化性的效果的示意曲線圖。
圖2為顯示參考例2中紅花粕提取組合物、菜籽粕提取組合物具有抑制apoE(-/-)小鼠[動脈硬化小鼠模型](給藥第5周，14周齡)的大動脈內(nèi)的動脈硬化的效果的照片概略圖，(a-1)表示對照組，(b-1)表示紅花組，(c-1)表示菜籽組。照片本來為彩色照片，染紅的部分為粥狀斑。圖2為為了明確該染紅部分對該照片繪圖并且將染紅的部分涂成黑色顯示的概略圖。
圖3為參考例3中給與各試樣第15周的apoE基因敲除小鼠(21周齡，雄性)的大動脈起始部病變面積的示意曲線圖。圖中，SFM表示紅花粕提取組合物，CS表示對香豆酰血清素，F(xiàn)S表示阿魏酰血清素。
具體實施例方式
本發(fā)明中使用的植物種子可以是任何植物的種子，例如可列舉出紅花、菜籽、大豆等的種子，優(yōu)選紅花的種子。本發(fā)明中，植物種子是指構(gòu)成植物種子的全體、或其一部分，例如可以是取出了種皮、胚乳、胚芽等的種子，或它們的混合物。
本發(fā)明中使用脫脂后的植物種子、即脫脂物(粕)作為原料。植物種子的脫脂物可利用本身公知的方法脫脂植物種子而得到，例如可壓榨提取種子或在種子的破碎物中加入正己烷等提取后，從提取系統(tǒng)中取出固形分，干燥該固形分而得到。脫脂程度通常為60重量％以上，優(yōu)選為80重量％以上。
本發(fā)明的特征在于，在后述的有機溶劑提取前，用水洗滌作為原料的脫脂后的植物種子。
水無特別限定，例如可使用蒸餾水、自來水、工業(yè)用水和它們的混合水等的任一種。只要能獲得本發(fā)明的效果，水中可含有其他物質(zhì)，例如無機鹽(例如氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等)、酸(例如氯化氫、乙酸、碳酸、過氧化氫、磷酸等)、堿(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉等)等。洗滌時的pH通常為2～9，優(yōu)選為5～7。
水的用量，作為總量相對于作為原料的脫脂后的植物種子通常為2～100倍量(水容量/脫脂后的植物種子重量，下同)，優(yōu)選為10～40倍量。
洗滌可用本身公知的方法使作為原料的脫脂后的植物種子和水接觸來進行。例如，可列舉出在水中混懸脫脂后的植物種子后，過濾，回收固形的洗滌處理物的方法等。洗滌可使上述量的水一次或多次、或連續(xù)地接觸脫脂后的植物種子來進行。接觸時的溫度通常為5～45℃，優(yōu)選為25～35℃。接觸時間通常為10～240分鐘，優(yōu)選為15～60分鐘。
本發(fā)明的特征在于，從如上得到的脫脂后的植物種子的洗滌處理物中用有機溶劑提取，得到植物種子提取組合物。
有機溶劑可列舉出例如低級醇、丙酮和它們的混合溶劑等，但并不限定于此。有機溶劑可以含水，也可以是無水物。有機溶劑的濃度通常為20～95重量％，優(yōu)選為50～90重量％?？紤]到提取后的提取物的濃縮、干燥和制備食品，有機溶劑優(yōu)選低級醇。低級醇可列舉出例如碳原子數(shù)1～4的醇，具體可列舉出，例如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇等，但并不限于此?？紤]到制備食品，低級醇優(yōu)選乙醇。乙醇優(yōu)選含有50重量％以上的乙醇分的含水乙醇或無水乙醇。
有機溶劑的用量通常為作為原料的脫脂后的植物種子的2～40倍量(有機溶劑容量/脫脂后的植物種子重量，下同)，優(yōu)選為2～10倍量。提取溫度通常為20～75℃，優(yōu)選為50～70℃。提取時間通常為10～240分鐘，優(yōu)選為60～120分鐘。
提取后，利用過濾等從懸濁液中分離固形分得到的提取液，可以直接或者根據(jù)需要濃縮、干燥作為本發(fā)明的植物種子提取物使用。濃縮、干燥可以直接濃縮、干燥提取液，也可以添加賦形劑(例如乳糖、蔗糖、淀粉、環(huán)糊精等)來實施。上述溶劑提取出的組合物的純度作為本發(fā)明的植物種子提取組合物有用，也可以利用本身公知的方法進一步精制。
作為食品、飼料、醫(yī)藥組合物(動脈硬化預(yù)防劑等)使用利用上述方法得到的本發(fā)明的植物種子提取組合物時，組合物存在于對生理有害的溶劑中的情況下，使用經(jīng)干燥的物質(zhì)，或者生理上允許的溶劑中溶解、混懸或乳化該干燥物得到的物質(zhì)。組合物的形態(tài)包括水性液等液狀物，和減壓濃縮而干燥的固體、冷凍干燥品等固形物。
利用上述方法得到的本發(fā)明的植物種子提取組合物，其特征在于，作為總量血清素衍生物(例如對香豆酰血清素、阿魏酰血清素、對香豆酰血清素糖苷和阿魏酰血清素糖苷等)的含量多、且2-羥基牛蒡子苷的含量少。在此，含量是指添加賦形劑時，除去添加的賦形劑求得的含量。利用上述方法得到的本發(fā)明的植物種子提取組合物中、例如紅花種子提取組合物，根據(jù)組合物的純度等不同，但作為總量，相對于植物種子提取組合物總量，通常含有10～70重量％、優(yōu)選20～50重量％的對香豆酰血清素、阿魏酰血清素、對香豆酰血清素糖苷和阿魏酰血清素糖苷，2-羥基牛蒡子苷的含量相對于植物種子提取組合物總量，通常為20重量％以下，優(yōu)選5重量％以下。利用上述方法得到的本發(fā)明的植物種子提取組合物中、例如紅花種子提取組合物，對香豆酰血清素、阿魏酰血清素、對香豆酰血清素糖苷和阿魏酰血清素糖苷的總含量，與2-羥基牛蒡子苷的含量的重量比通常為1∶0.05～0.2，優(yōu)選為1∶0.01～0.2。
本發(fā)明還涉及一種新型紅花種子提取組合物，其中，對香豆酰血清素、阿魏酰血清素、對香豆酰血清素糖苷和阿魏酰血清素糖苷的總含量，與2-羥基牛蒡子苷的含量的重量比為1∶0.05～0.2，優(yōu)選為1∶0.01～0.2。本發(fā)明的新型紅花種子提取組合物優(yōu)選利用上述本發(fā)明的方法來制備。
本發(fā)明中，血清素衍生物的含量是使用高效液相色譜，用資生堂公司制Capcell Pak C18柱，將含水乙腈作為線性梯度洗脫溶劑，檢測UV290nm，與標(biāo)準(zhǔn)樣品進行比較，測定的值。本發(fā)明中，2-羥基牛蒡子苷的含量是使用高效液相色譜，用資生堂公司制Capcell PakC18柱，將含水乙腈作為線性梯度洗脫溶劑，檢測UV279nm，與標(biāo)準(zhǔn)樣品進行比較，測定的值。
本發(fā)明的植物種子提取組合物、特別是紅花種子提取組合物，由于血清素衍生物的含量多，因此給與或攝取血清素衍生物、或者預(yù)防性給與或攝取可用于有效的疾病的治療或預(yù)防，例如動脈硬化的預(yù)防等。而且，本發(fā)明的植物種子提取組合物、特別是紅花種子提取組合物，由于作為腹瀉誘發(fā)性物質(zhì)的2-羥基牛蒡子苷的含量少，因此副作用小。因此，本發(fā)明的植物種子提取組合物、特別是紅花種子提取組合物，作為動脈硬化預(yù)防劑等的醫(yī)藥組合物、動脈硬化預(yù)防用等的食品、動脈硬化預(yù)防用等的飼料極為有用。
本發(fā)明的植物種子提取組合物、特別是紅花種子提取組合物可預(yù)防動脈硬化，結(jié)果對于動脈硬化引起的疾病、例如心絞痛、心肌梗塞、間歇性跛行、腦梗塞等的預(yù)防有用。
本發(fā)明的植物種子提取組合物，適用于人、人以外的動物(例如人以外的哺乳類(豬、牛、馬、狗、貓等家畜)、鳥類(火雞、雞等家禽)等)等。
本發(fā)明的“食品”是指所有食品，在含有所謂健康食品的一般食品之外，也包括厚生勞動省的保健功能食品制度中規(guī)定的特定保健用食品和營養(yǎng)功能食品，還包括補充劑。
作為食品、飼料、醫(yī)藥組合物可使用本發(fā)明的植物種子提取組合物本身。還可以在各種食品、例如調(diào)味醬、蛋黃醬等一般食品(包括所謂的健康食品)中含有本發(fā)明的植物種子提取組合物來使用。將本發(fā)明的植物種子提取組合物與賦形劑(例如乳糖、蔗糖、淀粉等)一起，根據(jù)情況與香料、色素等一起，制成片劑、丸劑、顆粒、細(xì)粒、粉末、微球、膠囊、溶液、乳液、混懸液、糖漿和含片等制劑，可用作特定保健用食品和營養(yǎng)功能食品等保健功能食品、補充劑、醫(yī)藥制劑(醫(yī)藥組合物)(主要口服)來使用。另外，本發(fā)明的植物種子提取組合物可用于飼料，可在通常的飼料中添加使家禽和家畜等攝取或給與家禽和家畜等。
特別是醫(yī)藥組合物的情況下，可與可藥用載體(還包括添加劑)一起制劑化。作為可藥用載體，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，可列舉出，例如賦形劑(例如乳糖、蔗糖、淀粉、D-甘露醇等)、粘合劑(例如纖維素、蔗糖、糊精、羥丙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等)、崩解劑(例如淀粉、羧甲基纖維素等)、潤滑劑(例如硬脂酸鎂等)、表面活性劑(例如月桂基硫酸鈉等)、溶劑(例如水、鹽水、豆油等)、保存劑(例如對羥基安息香酸酯等)等，但并不限于此。
本發(fā)明的植物種子提取組合物的攝取量或給與量，根據(jù)組合物的純度、對象人的年齡、體重、健康狀態(tài)、疾病的種類等不同，例如優(yōu)選作為動脈硬化預(yù)防用通常成人每日10mg～10g、優(yōu)選100mg～10g，1日1次至數(shù)次攝取或服用。
利用本發(fā)明的方法制備的植物種子提取組合物，使用作為以往食用等使用的植物種子、特別是食用油的原料的紅花的種子，且腹瀉誘發(fā)性物質(zhì)的含量少，因此毒性極低，幾乎看不到副作用。
實施例下面列舉實施例更加具體地例示本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于這些實施例1在帶有攪拌機的容器中裝入0.1kg脫脂后的紅花種子(紅花粕)，加入0.5L水，在30℃溫度下攪拌30分鐘，然后在室溫下，在離心過濾機(200g)中加入內(nèi)容物，分離為固形分和洗滌液分。重復(fù)4次在固形分中加入0.5L水的洗滌。然后，在0.17kg該洗滌后的粕中加入0.5L含水乙醇(水∶乙醇＝1∶9重量比)溶液，60℃下攪拌1小時，在離心過濾機(200g)中加入內(nèi)容物，分離為固形分和提取液分，得到0.5L的提取液。減壓濃縮0.5L該提取液后，進行真空干燥，得到2.7g紅花粕提取物。
實施例2在帶有攪拌機的容器中裝入0.1kg脫脂后的紅花種子(紅花粕)，加入0.5L水，在30℃溫度下攪拌30分鐘，然后在室溫下，在離心過濾機(200g)中加入內(nèi)容物，分離為固形分和洗滌液分。重復(fù)4次在固形分中加入0.5L水的洗滌。在0.17kg洗滌后的粕中加入0.5L含水乙醇(水∶乙醇＝5∶5重量比)溶液，60℃下攪拌1小時，在離心過濾機(200g)中加入內(nèi)容物，分離為固形分和提取液分，得到0.5L的提取液。減壓濃縮0.5L該提取液后，進行真空干燥，得到2.4g紅花粕提取物。
實施例3在帶有攪拌機的容器中裝入0.1kg脫脂后的紅花種子(紅花粕)，加入2L水，在30℃溫度下攪拌30分鐘，然后在室溫下，在離心過濾機(200g)中加入內(nèi)容物，分離為固形分和洗滌液分。在0.17kg洗滌后的粕中加入0.5L含水乙醇(水∶乙醇＝1∶9重量比)溶液，60℃下攪拌1小時，在離心過濾機(200g)中加入內(nèi)容物，分離為固形分和提取液分，得到0.5L的提取液。減壓濃縮0.5L該提取液后，進行真空干燥，得到2.4g紅花粕提取物。
比較例1在0.1kg脫脂后的紅花種子(紅花粕)中加入0.5L含水乙醇(水∶乙醇＝1∶9重量比)溶液，60℃下攪拌3小時，抽濾內(nèi)容物，分離為固形分和提取液分，得到0.5L的提取液。作為第2工序，減壓濃縮0.5L該提取液后，溶解在0.1L水中。添加0.1L己烷洗滌0.1L該水溶液后，添加0.1L乙酸乙酯，混合后，實施分配，得到乙酸乙酯層。減壓濃縮該乙酸乙酯提取液，進行真空干燥，得到1.2g紅花粕提取物。
實施例4紅花粕提取物的分析和評價對于制備的各例的紅花粕提取物，利用下述方法進行紅花粕提取物的分析，分析對香豆酰血清素(CS)、阿魏酰血清素(FS)、對香豆酰血清素糖苷(CS-Glc)、阿魏酰血清素糖苷(FS-Glc)和2-羥基牛蒡子苷。結(jié)果見表1～3。
表6.實驗設(shè)計
通過快速推注cH36，接著注入來阻斷TF，在被E.Coli攻擊的狒狒中，能夠?qū)⑶把仔约?xì)胞因子IL-8和Il-6的系統(tǒng)性表達削弱至較低的水平(圖11A-B)，并提供對腎和肺的部分保護。期間的分析顯示，cH36的施予削弱了平均肺動脈壓、肺系統(tǒng)順應(yīng)性的增加(圖8A-B)以及肺泡-動脈氧梯度的增加。迄今所檢查的動物的腎臟在尸體剖檢中看起來總體正常，腎髓過氧化物酶水平保持得更低(圖9A)，尿輸出在實驗期間被維持。被處理的動物中小腸濕/干比顯著低于對照動物，表明cH36處理過的動物中水腫更少(圖9B)。
這些數(shù)據(jù)顯示，用Sunol-CH36靶向TF對凝血進行阻斷，可以預(yù)防革蘭氏陰性膿毒病中的器官損傷的發(fā)展以及炎癥。這些數(shù)據(jù)還第一次顯示了用于用抗凝血劑控制人類ARDS的新策略。
B.下述數(shù)據(jù)進一步顯示，cH36和cH36-Fab有用于預(yù)防膿毒病狒狒中的肺損傷。
簡言之，本實施例這部分的目的是進一步驗證Sunol-cH36和cH36-Fab對肺中炎癥以及前凝血-纖維蛋白溶解平衡的作用，并將之關(guān)聯(lián)于狒狒的實驗性膿毒病模型中ALI中結(jié)構(gòu)和氣體交換的異常。見上文中A節(jié)。
對所有的狒狒(Papio cyanocephalus)進行機械通風(fēng)(21％O2)，麻醉，并在活的E.coli(1-2×1010CFU/kg)膿毒病發(fā)作之前12小時，通過靜脈給予熱殺死的E.coli的劑量(1×109CFU/kg)。研究設(shè)計由三組狒狒構(gòu)成，如下文中表7所示。第一組中的狒狒(n＝6)被施予<p>在50ml乙醇中溶解分散5mg紅花粕提取物。將該分散物作為分析樣品。在下述條件下將該分析樣品供于高效液相色譜，分析血清素衍生物。應(yīng)說明的是，作為標(biāo)準(zhǔn)樣品的對香豆酰血清素、阿魏酰血清素使用了血清素和反-4-香豆酸或反-4-阿魏酸縮合得到的物質(zhì)。對香豆酰血清素糖苷、阿魏酰血清素糖苷使用Chemical andPharmaceutical Bulletin 45卷1910-1914(1997)中記載的方法得到的物質(zhì)。
高效液相色譜的條件固定相資生堂Capcell Pak C18 5μm柱徑4.6mm，柱長250mm洗脫溶劑由0.1％三氟乙酸水溶液至0.1％三氟乙酸-40％乙腈水溶液，線性梯度洗脫40分鐘洗脫溶劑流量1ml/分鐘檢測器UV(290nm)2-羥基牛蒡子苷的分析在50ml乙醇中溶解分散5mg紅花粕提取物。將該分散物作為分析樣品。在下述條件下將該分析樣品供于高效液相色譜，分析2-羥基牛蒡子苷。應(yīng)說明的是，作為標(biāo)準(zhǔn)樣品的2-羥基牛蒡子苷使用Journal of the American oil chemists’society 35卷560-564(1978)中記載的方法得到的物質(zhì)。
高效液相色譜的條件固定相資生堂Capcell Pak C18 5μm柱徑4.6mm，柱長250mm洗脫溶劑由0.1％三氟乙酸水溶液至0.1％三氟乙酸-40％乙腈水溶液，線性梯度洗脫40分鐘洗脫溶劑流量1ml/分鐘檢測器UV(279nm)實施例5對大鼠(SD(IGS)，雄性，7周齡)單次給予(混懸在％羧甲基纖維素中)紅花粕提取物(表1組合物和表3組合物)，在糞皿上直接確認(rèn)有無給藥后24小時內(nèi)的腹瀉、軟便。結(jié)果見表4。
由表4可知，在經(jīng)口給予比較例1的未實施水洗樣品(表3組合酸轉(zhuǎn)移酶也可用于本發(fā)明的方法中。
表8.用Galβ1，4GlcNAc序列作為受體底物的唾酸轉(zhuǎn)移酶
1)Goochee et al.，Bio/Technology 91347-1355(1991)2)Yamamoto et al.，J.Biochem.120104-110(1996)3)Gilbert et al.，J.Biol.Chem.27128271-28276(1996)用于本發(fā)明方法中的唾酸轉(zhuǎn)移酶的一個例子是ST3GalIII，它也稱為α(2，3)唾酸轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.4.99.6)。該酶催化唾液酸向Galβ1，3GlcNAc或Galβ1，4GlcNAc糖苷的Gal的轉(zhuǎn)移(參見如Wen等人，J.Biol.Chem.26721011(1992)；Van den Eijnden等人，J.Biol.Chem.2563159(1991))，且負(fù)責(zé)糖肽中天冬酰胺連接的寡糖的唾液酸化。唾液酸與Gal連接，從而在兩個糖之間形成α-連接。糖之間的鍵(連接)是在NeuAc的2-位置和Ga l的3-位置之間的。該特定的酶可從大鼠肝中分離(Weinstein等人，J.Biol.Chem.25713845(1982))；人的cDNA(Sasaki等人(1993)J.Biol.Chem.26822782-22787；Kitagawa & Paulson(1994)J.Biol.Chem.2691394-1401)和基因組(Kitagawa等人(1996)J.Biol.Chem.271931-938)DNA序列是已知的，從而促進了通過重組表達對該酶的生產(chǎn)。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的唾液酸化方法應(yīng)用大鼠ST3GalIII。
用于請求保護的方法的唾酸轉(zhuǎn)移酶的例子是來自彎曲桿菌屬(Campylobacter)的CST-I(參見如美國專利No.6,503,744、234nm的吸收5小時。由過氧化脂質(zhì)生成曲線，根據(jù)近藤等人(J.Nutr.Sci.Vitaminol.，43pp435-44，1997)的方法，計算延遲時間，用將對照組(僅添加溶劑)的值作為100的相對值評價各樣品對LDL的被氧化性的影響(圖1)。任何樣品均可見或多或少地抑制了LDL的被氧化性(即，延長延遲時間)的傾向，但菜籽粕和紅花粕特別強地抑制了LDL的氧化。在上述試驗中，被稀釋的LDL與混和前的階段下的各樣品的稀釋倍數(shù)為菜籽粕、紅花粕200倍稀釋，其他50稀釋。
參考例2(體內(nèi)的動脈硬化預(yù)防效果)如下調(diào)制菜籽粕、紅花粕的提取物。
在榨油后的600g菜籽粕中加入3000ml的90體積％乙醇水，60℃的水浴中加溫、攪拌3小時后，過濾。對過濾后的固形分進行1次同樣的操作，將得到的濾液合并，利用減壓濃縮得到500ml的濃縮液。在濃縮液中加入水，使總量為1000ml，混懸內(nèi)容物后，用500ml的正己烷洗滌2次，用500ml乙酸乙酯提取2次洗滌后的水層。用無水硫酸鎂脫水乙酸乙酯提取液，過濾后減壓濃縮，得到12.5g固形物。
對榨油后的600g紅花粕實施與上述同樣的操作，得到10.1g的提取物。
將9周齡的雄性apoE基因敲除小鼠(apoE(-/-)；購自JacksonLaboratory)以1組9只分為對照/菜籽(菜籽粕提取物給藥組)/紅花(紅花粕提取物給藥組)的3組，使各組分別自由攝取表5所示的組成的餌料5周。在第2周(n＝6)和第5周(n＝3)處死小鼠，從大動脈起始部至大腿動脈分支部摘出大動脈，將用Sudan IV染色的血管內(nèi)壁部分上形成的粥裝斑的面積與對照組相比較。經(jīng)過2周給藥，菜籽組、紅花組與對照組相比顯示了抑制斑形成的傾向。在之后延長3周給藥的組間比較中，上述傾向進一步增強(斑面積紅花＜菜籽＜對照)，這些油糧植物粕提取物具有抑制動脈硬化的初期病變形成的效果(圖2)。
表19.由HPLC確定的來自ST3Gal3重構(gòu)的Cri-IgG1的不同糖形式的相對量。
通過比較，G0糖形式的ST6Gal1重構(gòu)不能達到在ST3Gal3重構(gòu)中發(fā)現(xiàn)的完全水平。圖115A-115D和圖116A-116C分別顯示了從CE和HPLC分析獲得的結(jié)果。在任意一種糖重構(gòu)樣品中均沒有發(fā)現(xiàn)S2G2糖形式。然而，所有G2糖形式均轉(zhuǎn)變?yōu)镾1-G2。MALDI-MS分析也支持這些數(shù)據(jù)(圖117A-117C)。
Cri-IgG1的重構(gòu)聚糖的穩(wěn)定性.最后，研究了通過外切糖苷酶處理和糖基化進行重構(gòu)的Cri-IgG1聚糖的穩(wěn)定性。將每一種糖重構(gòu)的Cri-IgG1抗體貯存于4℃，并在重構(gòu)后2周通過SDS-PAGE檢查降解。如圖118A-118E所示，重構(gòu)的DEAE和SPA抗體均保持約150kDa的分子量，顯示很少至沒有降解，而不管進行的糖重構(gòu)類型如何。Fc Cri-IgG1抗體保持約38kDa的分子量，也顯示很少至沒有降解，而不管進行的重構(gòu)類型如何。
重構(gòu)的Cri-IgG1抗體的效應(yīng)子功能生物測定.效應(yīng)子功能生物測定源自Mimura等人(2000，Molecular Immunology 37697-706)的方法。Cri-IgG1抗體的糖形式的IC50是通過抑制由紅細(xì)胞引起的U937細(xì)胞的超氧化物反應(yīng)來確定的，其中紅細(xì)胞由天然抗-NIP抗體進行了敏化。
在1000單位/mL干擾素γ存在時將單細(xì)胞的U937細(xì)胞培養(yǎng)2日，以誘導(dǎo)細(xì)胞分化及其產(chǎn)生超氧化物的能力。然后將細(xì)胞洗滌并以2×106細(xì)胞/mL重懸于Hanks平衡鹽溶液中，該鹽溶液中不具有酚紅，而含有20mM pH7.4的HEPES和0.15mM BSA。在Cri-IgG1抗體的各種糖形式不存在或存在時于37℃溫育30分鐘用抗-NIP(5-碘-4-羥基-3-硝基苯乙酰)抗體對紅細(xì)胞進行敏化。然后用PBS洗滌細(xì)胞3次，并將其以2.5×<p>[表6]
產(chǎn)業(yè)實用性如上所述，可知本發(fā)明提供的植物種子提取組合物對預(yù)防動脈硬化顯著有效。另外，本發(fā)明的植物種子提取組合物為天然原料，因此安全性高，幾乎無副作用，本發(fā)明的食品、飼料、醫(yī)藥組合物有利于沒有使用上的問題。而且，本發(fā)明的方法對于獲得有效成分的含量多、腹瀉誘發(fā)性物質(zhì)的含量少的本發(fā)明的植物種子提取組合物是有效的。
以上對于若干本發(fā)明的
具體實施方式
進行了詳細(xì)的說明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可對所示的特定方案根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)和優(yōu)點在不實質(zhì)上超出的范圍內(nèi)進行各種修正和變更。因此，這種修正和變更也包括在所有后述的權(quán)利要求書要求保護的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。
本申請以在日本申請的特愿2003-352829為基礎(chǔ)，其內(nèi)容均包含在本申請中。
權(quán)利要求
1.一種植物種子提取組合物，其是用水洗滌脫脂后的植物種子，從得到的洗滌處理物中用有機溶劑提取得到的。
2.一種植物種子提取組合物，其是對用水洗滌脫脂后的植物種子、從得到的洗滌處理物中用有機溶劑提取得到的提取物進行濃縮、干燥得到的。
3.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中，植物種子為紅花的種子。
4.一種紅花種子提取組合物，其中，對香豆酰血清素、阿魏酰血清素、對香豆酰血清素糖苷和阿魏酰血清素糖苷的總含量，與2-羥基牛蒡子苷的含量的重量比為1∶0.01～0.2。
5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其是用水洗滌脫脂后的紅花的種子，從得到的洗滌處理物中用有機溶劑提取得到的。
6.如權(quán)利要求4所述的組合物，其是對用水洗滌脫脂后的紅花的種子、從得到的洗滌處理物中用有機溶劑提取得到的提取物進行濃縮、干燥得到的。
7.如權(quán)利要求1、2、3、5或6所述的組合物，其中，有機溶劑為低級醇。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其中，低級醇為乙醇。
9.含有如權(quán)利要求1～8中任一項所述的組合物的食品。
10.含有如權(quán)利要求1～8中任一項所述的組合物的飼料。
11.含有如權(quán)利要求1～8中任一項所述的組合物的醫(yī)藥組合物。
12.一種植物種子提取組合物的制備方法，其含有用水洗滌脫脂后的植物種子、從得到的洗滌處理物中用有機溶劑提取的工序。
13.一種植物種子提取組合物的制備方法，其含有對用水洗滌脫脂后的植物種子、從得到的洗滌處理物中用有機溶劑提取得到的提取物進行濃縮、干燥的工序。
14.如權(quán)利要求12或13所述的制備方法，其中，植物種子為紅花的種子。
15.如權(quán)利要求12、13或14中任一項所述的制備方法，其中，有機溶劑為低級醇。
16.如權(quán)利要求15所述的制備方法，其中，低級醇為乙醇。
全文摘要
提供大量含有作為具有體內(nèi)活性的有效成分的血清素衍生物、且降低了副作用的新型植物種子提取組合物，含有該植物種子提取組合物的食品、飼料、醫(yī)藥組合物。還提供該植物種子提取組合物的制備方法，該方法適用于食品、飼料、醫(yī)藥組合物的制備。本發(fā)明涉及用水洗滌脫脂后的植物種子，從得到的洗滌處理物中用有機溶劑提取出植物種子提取組合物；對香豆酰血清素、阿魏酰血清素、對香豆酰血清素糖苷和阿魏酰血清素糖苷的總含量，與2－羥基牛蒡子苷的含量的重量比為1∶0.01～0.2的紅花種子提取組合物；含有用水洗滌脫脂后的植物種子、從得到的洗滌處理物中用有機溶劑提取工序的植物種子提取組合物的制備方法。
文檔編號A61K31/7048GK1863542SQ20048002957
公開日2006年11月15日 申請日期2004年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月10日
發(fā)明者小山直人, 關(guān)哲也, H·蟻坂, 石井康一 申請人:味之素株式會社