專利名稱：含有芹菜素作為軟骨再生劑用于治療骨關(guān)節(jié)炎的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及芹菜素(apigenin)作為軟骨再生劑的新用途，所述芹菜素具有降低升高含量的軟骨破壞標(biāo)志物(marker)，改進(jìn)滑液細(xì)胞狀況，并使軟骨再生的作用，其中所述軟骨破壞標(biāo)志物包括總的滑液體積和滑液內(nèi)的蛋白多糖，總的蛋白質(zhì)和前列腺素，。此外，本發(fā)明涉及用于骨關(guān)節(jié)炎的治療劑，其包括芹菜素作為再生關(guān)節(jié)軟骨的制劑，和使用該治療劑治療骨關(guān)節(jié)炎的方法。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)炎是一種常見(jiàn)病，它可影響任何年齡段的任何人，且隨著年齡增加其發(fā)病率增加。在韓國(guó)，占總?cè)丝诩s20％的人患有關(guān)節(jié)炎。有多于100種的不同類型的關(guān)節(jié)炎，并且骨關(guān)節(jié)炎是所有關(guān)節(jié)炎疾病中最常見(jiàn)的一類。
骨關(guān)節(jié)炎牽涉在關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨的退化。覆蓋關(guān)節(jié)內(nèi)骨頭的軟骨隨著時(shí)間的流逝開(kāi)始破損并可完全磨損掉，并且骨頭相互摩擦，從而引起疼痛。由于關(guān)節(jié)內(nèi)的疼痛，因此周圍肌肉較少使用，和因此肌肉強(qiáng)度受到削弱。在過(guò)去被稱為變性關(guān)節(jié)炎的骨關(guān)節(jié)炎是一種經(jīng)常出現(xiàn)的關(guān)節(jié)疾病，這種疾病在關(guān)節(jié)的異?；驌p壞之后或者在沒(méi)有關(guān)節(jié)損壞的情況下發(fā)生。
骨關(guān)節(jié)炎的流行在男女中是類似的。然而，在女性中，較多數(shù)量的人關(guān)節(jié)會(huì)受到影響，而男性的髖關(guān)節(jié)病發(fā)病頻率較高。骨關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)因素包括年齡、肥胖、髖部的先天性發(fā)育不良、創(chuàng)傷、關(guān)節(jié)炎病史、特殊工種和遺傳。骨關(guān)節(jié)炎本身不會(huì)大大地影響人們的壽命，但持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間段的慢性骨關(guān)節(jié)炎引起疼痛和關(guān)節(jié)變形，并因此降低生活質(zhì)量。特別地，在膝蓋內(nèi)的骨關(guān)節(jié)炎被認(rèn)為是慢性殘疾的主要原因。最近，許多研究成功地開(kāi)發(fā)了各種藥物和治療方法，這些能減輕因骨關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致的疼痛和關(guān)節(jié)變形。
在骨關(guān)節(jié)炎中，關(guān)節(jié)內(nèi)的軟骨受到損壞并被磨損掉。這使得在軟骨下的骨頭相互摩擦。隨著時(shí)間流逝，骨頭受到損壞，且還可能變形，從而引起疼痛和其它數(shù)種癥狀。在骨關(guān)節(jié)炎的病因?qū)W和病理學(xué)方面，兩個(gè)因素可能是重要的一個(gè)是在關(guān)節(jié)上施加額外應(yīng)力并因此損壞關(guān)節(jié)內(nèi)組織的過(guò)大重量，其中關(guān)節(jié)中軟骨或骨頭的狀況正常；和另一個(gè)是在正常負(fù)載下關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨或骨頭虛弱。此外，骨關(guān)節(jié)炎在約50％超過(guò)60歲的人群中和在約70％超過(guò)65歲的老年人中出現(xiàn)。因此，最重要的風(fēng)險(xiǎn)因素可能是年齡。
骨關(guān)節(jié)炎主要在膝蓋、髖部、脊柱和手指內(nèi)的關(guān)節(jié)中發(fā)病。主要癥狀包括疼痛和關(guān)節(jié)變形，和被感染的關(guān)節(jié)出現(xiàn)水腫、潮熱和關(guān)節(jié)的異常增大。
最近，已開(kāi)發(fā)了各種藥物和治療方法并用于治療骨關(guān)節(jié)炎。治療的主要目的是減輕疼痛，維持關(guān)節(jié)的功能并防止因關(guān)節(jié)的功能性病變導(dǎo)致殘疾。
由于骨關(guān)節(jié)炎在早期僅僅表現(xiàn)出疼痛，因此治療方法集中在通過(guò)施用簡(jiǎn)單的止痛藥來(lái)減輕疼痛。當(dāng)骨關(guān)節(jié)炎隨著長(zhǎng)期疼痛發(fā)展時(shí)，使用具有強(qiáng)消炎作用的消炎劑。然而，一旦長(zhǎng)期施用，這些消炎劑負(fù)面影響胃、肝臟和腎臟并且還抑制軟骨細(xì)胞再生的能力。由于這些副作用，應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎使用消炎劑。
具體地，使用如氫化可的松和倍他米松的皮質(zhì)甾類消炎物質(zhì)治療骨關(guān)節(jié)炎，它們起到抑制前列腺素合成的作用。然而，一旦口服施用，這些類固醇激素可具有暫時(shí)的治療作用，但由于它們嚴(yán)重的副作用，應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎使用，并且基本上不通過(guò)口服施用而是通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)注射給藥。
治療關(guān)節(jié)炎的最常用的方法是給藥。迄今為止，已開(kāi)發(fā)了具有止痛和消炎作用的許多藥物，包括例如雙氯酚酸鈉、阿司匹林和布洛芬的非類固醇類消炎藥(NSAIDs)。
然而，常用于治療關(guān)節(jié)炎的NSAIDs，通過(guò)同時(shí)抑制環(huán)氧合酶1(COX-1)和環(huán)氧合酶2(COX-2)而有損壞胃腸道，特別是胃的副作用，其中環(huán)氧合酶1(COX-1)起到保護(hù)胃壁的作用，環(huán)氧合酶2(COX-2)引起疼痛和炎癥。另外，當(dāng)用于長(zhǎng)期給藥時(shí)，NSAIDs引起在胃或腸內(nèi)酸痛或潰瘍，最終導(dǎo)致穿孔。所形成的潰瘍可阻止胃的排空，從而引起嘔吐和體重?fù)p失，以及胃和十二指腸出血。除了NSAIDs以外，還開(kāi)發(fā)了不同類的治療劑治療關(guān)節(jié)炎，例如不能抑制COX-1的COX-2抑制劑，其具有優(yōu)良的止痛作用并且相對(duì)于引起形成潰瘍和出血具有溫和的副作用。
另一方面，骨關(guān)節(jié)炎是一種因年齡引起的最常見(jiàn)的現(xiàn)象，在過(guò)去它的治療僅僅集中在減輕疼痛和炎癥上，沒(méi)有根本的治療方法。最近，基于減少軟骨細(xì)胞破壞的與延遲或抑制關(guān)節(jié)炎發(fā)展有關(guān)的研究具有良好的結(jié)果。
例如，美國(guó)專利No.6,610,750公開(kāi)了一種通過(guò)使用大黃酸及其酯衍生物，雙醋瑞因，延遲關(guān)節(jié)軟骨的破壞進(jìn)展，從而治療骨關(guān)節(jié)炎的方法。
美國(guó)專利No.5,591,740公開(kāi)了通過(guò)使用從多孔海綿(marine sponge Hymeniacidon)中分離的debromohymenialdisine，減慢關(guān)節(jié)惡化和軟骨退化，從而治療骨關(guān)節(jié)炎的方法。
另外，基于蛋白質(zhì)酪氨酸激酶抑制劑，例如金雀異黃素(genistein)、核比霉素A(herbimycin A)、4，5-二苯胺基鄰苯二甲酰亞胺、酪氨酸磷酸化抑制劑(tyrphostin)AG82和酪氨酸磷酸化抑制劑AG556，可減慢白介素-1-誘導(dǎo)的軟骨退化的發(fā)現(xiàn)，美國(guó)專利No.6,552,066公開(kāi)了使用蛋白質(zhì)酪氨酸激酶抑制劑治療骨關(guān)節(jié)炎的方法。
此外，對(duì)應(yīng)于日本專利公開(kāi)No.07-025761)的美國(guó)專利No.5,650,433公開(kāi)了一種軟骨保護(hù)劑，其含有類黃酮化合物，其糖苷或其立體異構(gòu)體，對(duì)作為軟骨基質(zhì)的主要組分的蛋白多糖的消耗具有抑制作用，和通過(guò)施用軟骨保護(hù)劑，減少軟骨的破壞，從而治療關(guān)節(jié)病的方法。
然而，前述專利中公開(kāi)的方法和使用迄今為止已知的藥物治療骨關(guān)節(jié)炎的其它方法都是延遲或抑制軟骨破壞的進(jìn)展，但都不包括具有軟骨再生作用，并因此能恢復(fù)受損軟骨的治療劑。
最近，為了避免與采用具有副作用的藥物治療骨關(guān)節(jié)炎從而保護(hù)軟骨相關(guān)的難點(diǎn)，嘗試不使用藥物的方法。例如，嘗試使用間充質(zhì)干細(xì)胞使軟骨組織再生(EP早期公開(kāi)No.0989855A1和美國(guó)專利申請(qǐng)?jiān)缙诠_(kāi)No.20020110544A1)。
迄今為止，在骨關(guān)節(jié)炎的治療中，僅僅使用提供消炎和止痛作用或者延遲或抑制軟骨破壞的治療方法以減慢骨關(guān)節(jié)炎的臨床進(jìn)展。因此，需要開(kāi)發(fā)一種新型方法治療因軟骨退化引起的骨關(guān)節(jié)炎，所述方法能使軟骨組織再生或者改進(jìn)軟骨組織的狀況。
這一需求受到下述事實(shí)的影響軟骨組織由約95％水和胞外軟骨基質(zhì)和僅僅5％的軟骨細(xì)胞組成，并且軟骨細(xì)胞在體內(nèi)具有最長(zhǎng)的細(xì)胞周期，因此非常難以增殖(骨關(guān)節(jié)炎和神經(jīng)原性關(guān)節(jié)病，第487和492頁(yè)，Merck Manual，英文第17版/韓國(guó)第1版，2003)。因此，可通過(guò)尋找能促進(jìn)軟骨再生且在體內(nèi)試驗(yàn)中沒(méi)有副作用的物質(zhì)，使用增殖誘導(dǎo)劑使從骨關(guān)節(jié)炎患者中分離的軟骨細(xì)胞增殖，并將增殖的軟骨細(xì)胞植入到患者體內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重大進(jìn)展。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)自然存在的類黃酮化合物，芹菜素，具有作為促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖并因此使軟骨組織再生的新用途，以及具有延遲軟骨細(xì)胞破壞的已知作用，從而導(dǎo)致完成本發(fā)明。
發(fā)明公開(kāi)第一方面，本發(fā)明提供使軟骨再生的組合物，它包括芹菜素和藥學(xué)上可接受的載體，其中芹菜素的用量有效地促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖且沒(méi)有細(xì)胞毒性。
在所述的第一方面，根據(jù)本發(fā)明使軟骨再生的組合物包括芹菜素，其含量使患者的關(guān)節(jié)軟骨和滑液內(nèi)達(dá)到0.1μM-100μM的濃度。在這一劑量范圍內(nèi)，芹菜素具有降低骨關(guān)節(jié)炎的指示劑或標(biāo)志物的生化作用升高的關(guān)節(jié)滑液體積和在滑液內(nèi)升高含量的蛋白多糖，總蛋白質(zhì)和前列腺素，且通過(guò)改進(jìn)滑液細(xì)胞狀況具有改進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的額外作用。
優(yōu)選地，施用有效量的包含在本發(fā)明中使軟骨再生的組合物內(nèi)的芹菜素，使其含量導(dǎo)致在患者的關(guān)節(jié)軟骨和滑液內(nèi)有1μM-80μM的濃度。
第二方面，本發(fā)明提供使軟骨再生的用于骨關(guān)節(jié)炎的治療劑，其包括根據(jù)所述第一方面的使軟骨再生的組合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
在所述的第二方面中，用于骨關(guān)節(jié)炎的治療劑為可口服給藥的制劑形式，例如溶液、膠囊、顆粒、片劑或丸劑；局部可施涂的制劑，例如藥膏或經(jīng)皮給藥的制劑；或注射劑。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的用于骨關(guān)節(jié)炎的治療劑為口服制劑形式時(shí)，芹菜素每日給藥劑量為10mg-1000mg。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的用于骨關(guān)節(jié)炎的治療劑為藥膏配方時(shí)，芹菜素每日給藥劑量為1mg-100mg。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的用于骨關(guān)節(jié)炎的治療劑為可注射配方時(shí)，芹菜素每日給藥劑量為0.1mg-10mg。
第三方面，本發(fā)明提供通過(guò)使關(guān)節(jié)軟骨再生治療骨關(guān)節(jié)炎的方法，該方法包括給骨關(guān)節(jié)炎患者施用用于骨關(guān)節(jié)炎的治療劑，所述用于骨關(guān)節(jié)炎的治療劑包括所述第一方面使軟骨再生的組合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
附圖簡(jiǎn)述根據(jù)下述詳細(xì)說(shuō)明，并結(jié)合附圖，將更清楚地理解本發(fā)明的上述和其它目的，特征和其它優(yōu)點(diǎn)，其中

圖1圖示了骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的兔子的軟骨，其中對(duì)照組(A)用生理鹽水治療，和試驗(yàn)組(B)用本發(fā)明的芹菜素治療；圖2是顯示在骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的兔子中，根據(jù)本發(fā)明通過(guò)芹菜素給藥時(shí)總的滑液體積的變化的圖表(正常在正常兔子中總滑液體積；OA在骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)之后立即測(cè)量的總滑液體積；+在用芹菜素或生理鹽水治療的右腿內(nèi)的結(jié)果；-在未治療的左腿內(nèi)的結(jié)果)；圖3是顯示在骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的兔子中，根據(jù)本發(fā)明通過(guò)芹菜素給藥時(shí)在關(guān)節(jié)滑液內(nèi)總的蛋白多糖含量的變化的圖表(正常在正常兔子中在關(guān)節(jié)滑液內(nèi)總的蛋白多糖含量；OA在骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)之后立即測(cè)量的在關(guān)節(jié)滑液內(nèi)總的蛋白多糖含量；+和-與圖2中的含義相同)；圖4是顯示在骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的兔子中，根據(jù)本發(fā)明通過(guò)芹菜素給藥時(shí)在關(guān)節(jié)滑液內(nèi)總的蛋白質(zhì)含量的變化的圖表(正常在正常兔子中在關(guān)節(jié)滑液內(nèi)總的蛋白質(zhì)含量；OA在骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)之后立即測(cè)量的在關(guān)節(jié)滑液內(nèi)總的蛋白質(zhì)含量；+和-與圖2中的含義相同)；圖5是顯示在骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的兔子中，通過(guò)芹菜素給藥時(shí)在關(guān)節(jié)滑液內(nèi)總的前列腺素E2(PGE2)含量的變化的圖表(正常在正常兔子中在關(guān)節(jié)滑液內(nèi)總的PGE2含量；OA在骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)之后立即測(cè)量的在關(guān)節(jié)滑液內(nèi)總的PGE2含量；+和-與圖2中的含義相同)；圖6是顯示在骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的兔子中，通過(guò)芹菜素給藥時(shí)在關(guān)節(jié)滑液內(nèi)的膠原蛋白含量的變化的圖表(正常在正常兔子中在關(guān)節(jié)滑液內(nèi)總的膠原蛋白含量；OA在骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)之后立即測(cè)量的在關(guān)節(jié)滑液內(nèi)總的膠原蛋白含量；+和-與圖2中的含義相同)；圖7是顯示在骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的兔子中，通過(guò)芹菜素給藥時(shí)Mankin分?jǐn)?shù)變化的圖表(+和-與圖2中的含義相同)；圖8A和8B圖示了采用芹菜素(圖8A)和生理鹽水(圖8B)給藥的骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的兔子的關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨染色的結(jié)果(H&E用蘇木精和曙紅染色的治療組；Saf-O用沙黃O染色的治療組)；圖9圖示了用芹菜素(A)和生理鹽水(B)給藥的骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的兔子的關(guān)節(jié)內(nèi)滑液膜的染色結(jié)果；圖10是顯示通過(guò)芹菜素給藥的骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的兔子中滑液膜襯細(xì)胞數(shù)量變化的圖表；圖11示出了在LPS誘導(dǎo)的發(fā)炎過(guò)程中，根據(jù)本發(fā)明通過(guò)芹菜素給藥時(shí)，從小鼠中得到的巨噬細(xì)胞襯內(nèi)iNOS、COX-2和IκBα的表達(dá)水平變化的Western印跡的結(jié)果，其中β-肌動(dòng)蛋白用作內(nèi)部標(biāo)志物；圖12是顯示根據(jù)本發(fā)明通過(guò)芹菜素給藥時(shí)，檢測(cè)從小鼠中得到的巨噬細(xì)胞襯RAW264.7內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NFκB和特異基因之間結(jié)合的EMSA(電泳遷移率變動(dòng)分析)的圖表；和圖13圖示了根據(jù)時(shí)間誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎并收集滑液的過(guò)程。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明提供用于治療骨關(guān)節(jié)炎的芹菜素的新用途，這是基于芹菜素能延遲軟骨細(xì)胞的破壞并通過(guò)刺激軟骨細(xì)胞增殖使軟骨再生的作用。
已知芹菜素具有抗癌作用，例如具有細(xì)胞毒性和細(xì)胞增殖抑制活性。與芹菜素的這些已知作用相反，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)芹菜素通過(guò)刺激軟骨細(xì)胞增殖，具有使軟骨再生的作用，同時(shí)在特定濃度范圍內(nèi)的有效劑量下沒(méi)有細(xì)胞毒性。也就是說(shuō)，發(fā)現(xiàn)芹菜素的軟骨再生作用作用與施加到靶向位點(diǎn)上的精確劑量和最終用量直接相關(guān)。具體地，當(dāng)以導(dǎo)致在關(guān)節(jié)軟骨和滑液內(nèi)0.1-100μM，和優(yōu)選1-80μM的濃度的量使用芹菜素時(shí)，當(dāng)對(duì)關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的動(dòng)物模型進(jìn)行組織學(xué)檢查時(shí)，發(fā)現(xiàn)芹菜素具有使關(guān)節(jié)軟骨再生的總作用，所述總作用包括在細(xì)胞試驗(yàn)中抑制與炎癥有關(guān)的酶的活性和抑制產(chǎn)生疼痛誘導(dǎo)劑的作用，在使用關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的動(dòng)物模型中的試驗(yàn)中減少關(guān)節(jié)滑液和滑液內(nèi)蛋白多糖，總的蛋白質(zhì)和前列腺素含量的生化作用，和使軟骨再生并改進(jìn)滑液細(xì)胞的狀況的作用。這些結(jié)果表明芹菜素具有作為使關(guān)節(jié)軟骨再生的試劑的優(yōu)良活性?；谶@一發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供芹菜素作為預(yù)防或抑制骨關(guān)節(jié)炎的試劑，以及作為改進(jìn)或治療骨關(guān)節(jié)炎的試劑的新用途。
下文將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
骨關(guān)節(jié)炎是一種退化的關(guān)節(jié)疾病，它是最古老和最常見(jiàn)類型的關(guān)節(jié)炎，并且以關(guān)節(jié)軟骨的破壞為特征。骨關(guān)節(jié)炎是老齡的必然結(jié)果，并且肥胖可導(dǎo)致膝蓋關(guān)節(jié)內(nèi)骨關(guān)節(jié)炎。若通過(guò)諸如運(yùn)動(dòng)或工作之類的活動(dòng)反復(fù)使用關(guān)節(jié)或者因事故使關(guān)節(jié)受傷的話，則形成骨關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)可增加。此外，在膝蓋骨關(guān)節(jié)炎中，當(dāng)在一個(gè)膝蓋中出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎時(shí)，患者更加依賴于另一個(gè)膝蓋以避免疼痛，從而增加在另一膝蓋內(nèi)進(jìn)一步形成骨關(guān)節(jié)炎的幾率。因此，在兩個(gè)膝蓋均有骨關(guān)節(jié)炎的患者中，改善一個(gè)膝蓋中骨關(guān)節(jié)炎可減少施加到另一膝蓋上的重量，從而降低了在另一膝蓋內(nèi)骨關(guān)節(jié)炎狀況惡化的風(fēng)險(xiǎn)，從而獲得減輕以前已經(jīng)形成的骨關(guān)節(jié)炎的積極作用。
由于骨關(guān)節(jié)炎具有不同于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病因，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是因炎癥引起的自身免疫疾病，在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中有效的物質(zhì)在骨關(guān)節(jié)炎中是無(wú)效的(Ziolkowska等人，TheJournal of Immunology，1642832-2838(2000))，且可惡化軟骨損傷的損害程度。由于這一原因，不能預(yù)期對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有效的物質(zhì)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎具有治療作用，并且它們對(duì)軟骨再生的作用更加難以預(yù)測(cè)。
在引起骨關(guān)節(jié)炎的軟骨破壞的過(guò)程中，可部分地誘導(dǎo)炎癥并導(dǎo)致釋放與炎癥有關(guān)的酶，從而加速軟骨的退變。在骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展過(guò)程中，滑液體積隨著炎癥加重而增加。這一現(xiàn)象涉及由于軟骨受到破壞導(dǎo)致蛋白多糖釋放到滑液內(nèi)。因此，降低滑液內(nèi)蛋白多糖的水平是骨關(guān)節(jié)炎改善的重要指示劑。
另外，當(dāng)誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎時(shí)，隨著關(guān)節(jié)的炎癥加重疼痛增加。這種增加的疼痛是由于前列腺素E2的升高的濃度導(dǎo)致的，前列腺素E2的升高的濃度是與增加的疼痛有關(guān)的重要因素。因此，降低滑液內(nèi)的前列腺素E2的濃度從而改善骨關(guān)節(jié)炎也是重要的。
隨著骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展，在關(guān)節(jié)滑液內(nèi)滑液膜襯細(xì)胞的數(shù)量增加，和滑液的襯里層表面不光滑且變厚(Asari，A.等人，Arch.Histol.Cytol.61(2)125-35(1998))。
此外，已知膠原蛋白與關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率有關(guān)。特別地，膠原蛋白是含關(guān)節(jié)軟骨的材料，且它的過(guò)量產(chǎn)生促進(jìn)軟骨硬化且與關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率有關(guān)。因此，比正常水平高的膠原蛋白含量用作骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率的指示劑。此外，這種增加的膠原蛋白水平的下降可用作骨關(guān)節(jié)炎改善的指示劑。
因此，在骨關(guān)節(jié)炎的治療中非常重要的是降低這些組織的生化標(biāo)志物，且這種下降是受損組織改善的間接證據(jù)。
典型地，在炎癥位點(diǎn)處生成過(guò)量的NO并刺激細(xì)胞組織的壞死(Moncada，S.等人，Pharmacol.Rev.43109-142(1991))。因此，在許多炎癥疾病的治療中，重要的是抑制造成NO生成的iNOS(可誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶)的活性或表達(dá)。iNOS在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量NO防御身體遭受外部刺激，但在如關(guān)節(jié)炎的疾病中，過(guò)量產(chǎn)生NO引起壞死和繼發(fā)性的副作用，例如疼痛。因此，抑制iNOS的過(guò)度表達(dá)對(duì)于治療骨關(guān)節(jié)炎來(lái)說(shuō)是重要的。
環(huán)氧合酶2(COX-2)是一種酶，它合成疼痛誘導(dǎo)劑，前列腺素。通過(guò)NO或其它刺激劑刺激前列腺素的合成。因此，抑制COX-2的表達(dá)或活性也是治療骨關(guān)節(jié)炎的重要指示劑。
另外，NFκB是通過(guò)相關(guān)的信號(hào)路徑被激活并起始前述iNOS和COX-2的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。NFκB以失活形式結(jié)合到抑制因子IκBα上而被螯合在細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)受到如炎癥的外部刺激時(shí)，IκBα抑制因子磷酸化并降解。這使得NFκB轉(zhuǎn)運(yùn)到其中它起始iNOS基因轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞核上。因此，抑制存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的IκBα的磷酸化或降解是評(píng)價(jià)治療骨關(guān)節(jié)炎的重要指示劑。
如上所述，由于NFκB在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)以失活形式螯合，且一旦受到如炎癥的外部刺激時(shí)，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并起始iNOS和COX-2的基因轉(zhuǎn)錄，因此，抑制NFκB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并結(jié)合到靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件上是評(píng)價(jià)在患有骨關(guān)節(jié)炎的患者中骨關(guān)節(jié)炎改善的重要指示劑。
衍生于植物的天然存在的類黃酮化合物是酚類化合物，根據(jù)其結(jié)構(gòu)可分成四組黃酮醇類，黃烷酮類，黃烷醇類和黃烷類。已知類黃酮以各種形式存在于植物、水果、茶葉、中草藥和類似物中，且在體內(nèi)具有各種作用，其中包括抗病毒活性(例如，Kaul，T.N.等人，J.Med.Virol.1571-79(1985))，抗癌活性(例如，Miller，A.B.等人，Rev.Oncol.387-95(1990))，消炎活性(例如，F(xiàn)errandiz，M.L.等人，J.Natl.CancerInst.851038-1049(1993))，和抗氧劑活性(例如，Cao，G.等人，F(xiàn)reeRadi.Biol.Med.，22749-760(1997))。
類黃酮之一的芹菜素(4’，5，7-三羥基黃酮)的分子量為270.24，具有下述化學(xué)結(jié)構(gòu)，且是在大量的植物和水果中發(fā)現(xiàn)的天然存在的化合物，包括歐芹(含有大于0.05％的芹菜素)和百里香(含有大于0.05％的芹菜素)。已知芹菜素具有各種生物活性，包括消炎、血管擴(kuò)張(vasordilatory)、抗氧化、抗病毒和抗癌作用。
關(guān)于其抗癌活性，芹菜素甚至在非常低濃度，例如低于約50μM下有效地起作用。在細(xì)胞增殖和血管生成過(guò)程中，芹菜素通過(guò)引起細(xì)胞凋亡和壞死機(jī)理顯示出抗增殖和細(xì)胞毒性作用，從而導(dǎo)致抑制癌細(xì)胞的增殖，其中細(xì)胞增殖和血管生成是各種癌細(xì)胞的主要特征，其中包括前列腺癌、乳癌、肺癌、直腸癌、血癌(白血病)、皮膚癌、甲狀腺癌和肝癌。
另外，芹菜素具有細(xì)胞毒性和增殖抑制作用作用，例如在非腫瘤細(xì)胞如鼠的胚胎成纖維細(xì)胞以及癌細(xì)胞內(nèi)累積腫瘤抑制因子蛋白質(zhì)p53，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且還對(duì)人類正常的前列腺上皮細(xì)胞具有輕微的增殖抑制作用(Plaumann B.等人，Oncogene13(8)，1605-14(1996)和Gupta，S.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.287(4)914-920)。
然而，根據(jù)最近的研究報(bào)道，芹菜素在其中用各種濃度的芹菜素治療肺癌和直腸癌細(xì)胞系的體外試驗(yàn)中顯示出優(yōu)良的效率，但在體內(nèi)幾乎沒(méi)有作用(Engelmann，C.等人，Phytomedicine 9(6)489-495(2002))。特別地，基于其增殖抑制活性的芹菜素的作用同時(shí)包括增殖抑制和細(xì)胞毒性，且在低濃度芹菜素下非常敏感。相反，基于其中包括芹菜素在內(nèi)的類黃酮的抗氧化作用的各種試驗(yàn)表明，類黃酮對(duì)細(xì)胞毒性具有保護(hù)或預(yù)防作用(Wang，C.N.等人，J.Biol.Chem.276(7)5287-5295(2001))。
在美國(guó)專利No.5,650,433及其相應(yīng)專利中提及了在關(guān)節(jié)炎中芹菜素與軟骨的關(guān)系。所引用的專利表明包括芹菜素和糖苷化合物的類黃酮化合物可用于治療關(guān)節(jié)炎，這是因?yàn)樗鼈冄舆t關(guān)節(jié)軟骨的破壞。然而，在其中用類黃酮化合物和蛋白多糖消耗劑PMA(佛波醇肉豆蔻乙酸酯)治療軟骨細(xì)胞的這一精神和范圍內(nèi)的實(shí)施方案中，僅僅評(píng)價(jià)了類黃酮化合物對(duì)蛋白多糖消耗的抑制作用。也就是說(shuō)，所引用的專利公開(kāi)了類黃酮化合物僅僅作為軟骨保護(hù)劑的用途，而不是用于軟骨再生，且也沒(méi)有證明芹菜素具有軟骨再生作用作用。此外，在所引用的專利中，僅僅通過(guò)體外試驗(yàn)測(cè)量蛋白多糖消耗的程度，并且沒(méi)有具體地證明類黃酮化合物對(duì)軟骨保護(hù)和軟骨再生的實(shí)質(zhì)性體內(nèi)效果。此外，所引用的專利公開(kāi)了關(guān)節(jié)病，所述關(guān)節(jié)病包括骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，但僅僅描述了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，其中類黃酮化合物的前述軟骨保護(hù)作用涉及抑制蛋白多糖的消耗。
迄今為止，沒(méi)有出版物涉及芹菜素對(duì)關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨細(xì)胞增殖和軟骨再生的作用或者施加精確濃度的芹菜素以實(shí)現(xiàn)這些作用。
當(dāng)因骨關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致受損的軟骨再生時(shí)，由于應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生與抗癌劑作用的抗增殖和細(xì)胞毒性機(jī)理相反的作用，因此應(yīng)當(dāng)主要在體外試驗(yàn)中確定在軟骨細(xì)胞上實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒性和抗增殖作用的芹菜素的精確濃度。此外，通過(guò)其中芹菜素施加到骨關(guān)節(jié)炎患者上的體內(nèi)試驗(yàn)，應(yīng)當(dāng)確定芹菜素能起到增殖軟骨細(xì)胞作用且沒(méi)有毒性的基本上有效的濃度。
為了確定芹菜素作為用于骨關(guān)節(jié)炎治療劑的可能性與常規(guī)地確認(rèn)芹菜素的細(xì)胞毒性和抗增殖相反的作用之間的關(guān)系，發(fā)明人首先檢驗(yàn)了芹菜素在體外是否對(duì)軟骨細(xì)胞具有細(xì)胞毒性和抗增殖作用。結(jié)果，在用低于10μM的非常低濃度的芹菜素治療1-2天的軟骨細(xì)胞中，芹菜素幾乎沒(méi)有顯示出細(xì)胞毒性和抗增殖作用。在2天和6天培養(yǎng)時(shí)，芹菜素對(duì)軟骨細(xì)胞的50％抑制濃度(IC50)值分別為約100μM和約30μM。另外，在1-10μM的濃度下，發(fā)現(xiàn)芹菜素具有約10-20％的增殖作用。
基于這些體外試驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明人研究了在骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的動(dòng)物模型中芹菜素的軟骨細(xì)胞增殖作用。
使用新西蘭白兔作為骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的動(dòng)物模型，檢驗(yàn)在骨關(guān)節(jié)炎患者中芹菜素的各種作用，其中包括生化作用、組織學(xué)作用和軟骨再生和滑液膜改善作用，新西蘭白兔進(jìn)行前交叉韌帶切斷術(shù)(ACLT)并強(qiáng)制它在密閉的空間內(nèi)保持運(yùn)動(dòng)，以誘導(dǎo)嚴(yán)重的骨關(guān)節(jié)炎。
當(dāng)將各種濃度的芹菜素直接注射到骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的兔子的感染位點(diǎn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)芹菜素在約0.1-100μM，和優(yōu)選1-80μM的劑量下具有軟骨再生作用且沒(méi)有細(xì)胞毒性。芹菜素的這一濃度范圍與體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)的結(jié)果不相關(guān)，因此僅僅通過(guò)體外試驗(yàn)難以預(yù)測(cè)芹菜素使軟骨再生的有效量。在本發(fā)明的實(shí)施例1中，使用約80μM的芹菜素溶液(通過(guò)在50μl DMSO內(nèi)溶解50μg芹菜素并將所得溶液與450μl生理鹽水混合而制備)，評(píng)價(jià)芹菜素對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的影響。
具體地，采用前述用量的芹菜素總計(jì)4次(每周1次)注射試驗(yàn)組，和采用PBS注射對(duì)照組。每2周收集滑液，并測(cè)量作為骨關(guān)節(jié)炎的指示劑滑液體積的變化。
另外，進(jìn)行生化試驗(yàn)。在所收集的滑液內(nèi)，測(cè)量用作骨關(guān)節(jié)炎標(biāo)志物的蛋白多糖、總蛋白質(zhì)，前列腺素和膠原蛋白含量的變化。此外，通過(guò)測(cè)量滑液內(nèi)氮氧化物(NO)水平的變化作為炎癥指示劑并在巨噬細(xì)胞細(xì)胞系RAW 264.7內(nèi)測(cè)量芹菜素對(duì)LPS-誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生的影響，從而評(píng)價(jià)芹菜素對(duì)炎癥的影響。此外，評(píng)價(jià)在巨噬細(xì)胞系內(nèi)芹菜素對(duì)前列腺素的產(chǎn)生的影響。
為了確定芹菜素是否在基因水平上調(diào)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎標(biāo)志物蛋白質(zhì)，評(píng)價(jià)芹菜素對(duì)iNOS、COX-2和IκBα基因表達(dá)的影響。此外，評(píng)價(jià)芹菜素對(duì)NFκB結(jié)合到其細(xì)胞核靶基因上的抑制作用。
在組織學(xué)試驗(yàn)中，根據(jù)用于骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分體系，Mankin分?jǐn)?shù)，評(píng)價(jià)退化變化，例如軟骨的結(jié)構(gòu)變化，軟骨的細(xì)胞數(shù)量變化和通過(guò)用染料使軟骨染色時(shí)表面的染色分布(Mankin，H.J.等人，Orthopedic Clinics of North America，219-30(1971))。在本發(fā)明中，根據(jù)Mankin標(biāo)準(zhǔn)，由兩個(gè)檢查員進(jìn)行盲試驗(yàn)。
上述評(píng)價(jià)導(dǎo)致下述發(fā)現(xiàn)在關(guān)節(jié)軟骨和滑液內(nèi)導(dǎo)致0.1μM-100μM濃度的劑量下，芹菜素在降低骨關(guān)節(jié)炎常見(jiàn)的前述生化指示劑方面具有優(yōu)良的生物活性，且更重要的是，具有刺激軟骨再生以及軟骨保護(hù)的組織學(xué)作用?；谶@些結(jié)果，本發(fā)明提供了具有軟骨再生作用的作為軟骨再生劑的芹菜素的新用途以及含有芹菜素用于骨關(guān)節(jié)炎的治療劑。
本說(shuō)明書(shū)中所使用的術(shù)語(yǔ)具有下述含義。
此處所使用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”是指在醫(yī)學(xué)上合理的范圍內(nèi)適合于與人類或動(dòng)物組織接觸同時(shí)不引起不可預(yù)測(cè)的毒性、疼痛和過(guò)敏的載體。藥學(xué)上可接受的載體的實(shí)例可包括蒸餾水、等滲鹽水、林格液和可注射用水，它們中的每一種含有小量允許芹菜素在其內(nèi)溶解的有機(jī)溶劑，例如DMSO。
此處所使用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的賦形劑”是指無(wú)毒的惰性固體、半固體或液體填料、稀釋劑、膠囊材料或一些類型的配方助劑。藥學(xué)上可接受的賦形劑的實(shí)例可包括乳糖、葡萄糖、蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素；龍須膠；麥芽；明膠；滑石；可可油；天然植物油，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；二元醇，如聚丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯類，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩沖液，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；藻酸；蒸餾水；等滲鹽水；林格液；乙醇；和磷酸鹽緩沖液，和可進(jìn)一步包括適合于在藥物配方中使用的其它無(wú)毒的物質(zhì)。
另外，賦形劑的實(shí)例可進(jìn)一步包括保濕劑、乳化劑和潤(rùn)滑劑；以及著色劑、脫模劑、胞衣劑、甜味劑、芳香劑和香料。
此處所使用的術(shù)語(yǔ)“軟骨再生作用”是指芹菜素刺激軟骨細(xì)胞增殖以及抑制軟骨細(xì)胞破壞且沒(méi)有細(xì)胞毒性或細(xì)胞增殖抑制的本發(fā)明所述的作用。
關(guān)于軟骨再生作用，術(shù)語(yǔ)“刺激軟骨細(xì)胞增殖且沒(méi)有細(xì)胞毒性的芹菜素的有效量”是指當(dāng)給要求軟骨細(xì)胞增殖的患者施用芹菜素時(shí)，刺激受損軟骨細(xì)胞增殖且沒(méi)有引起患者毒性的芹菜素的有效量。根據(jù)本發(fā)明，在約0.1-約100μM，優(yōu)選約1-約80μM，和更優(yōu)選約1-約10μM的濃度下，芹菜素誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨再生。
關(guān)于骨關(guān)節(jié)炎的治療，術(shù)語(yǔ)“治療有效量的用于使軟骨再生的組合物”是指用于使軟骨再生的組合物，它含有當(dāng)給要求軟骨再生的骨關(guān)節(jié)炎患者施用芹菜素時(shí)，通過(guò)使受損的關(guān)節(jié)軟骨再生，有效改善骨關(guān)節(jié)炎的有效量的芹菜素。
在本發(fā)明的組合物或配方中，可通過(guò)主治醫(yī)生的判斷在醫(yī)學(xué)可接受的范圍內(nèi)確定“治療有效量”。對(duì)于特定的患者來(lái)說(shuō)，特定的治療有效量可根據(jù)各種因素而變化，這些因素包括組合物或配方的類型；患者年齡、體重、健康狀況、性別和飲食；給藥的持續(xù)時(shí)間和途徑；治療期；共施用的藥物；和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域眾所周知的其它因素。例如，當(dāng)在一周的時(shí)間間隔內(nèi)每天一次給藥時(shí)，對(duì)于口服給藥來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的組合物可典型地以10mg-1000mg/天的單位劑量形式給藥，在可注射配方的情況下，以0.1mg-10mg/天的單位劑量形式給藥，和在使用藥膏的情況下，以1mg-100mg/天的單位劑量形式給藥，但本發(fā)明不限于這些實(shí)例。上述劑量說(shuō)明平均情況，但可根據(jù)個(gè)體之間的差異減少或增加，并且這一改變也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
可將本發(fā)明的組合物或配方施用給易于患骨關(guān)節(jié)炎的所有動(dòng)物，其中包括人類上。
以含用于軟骨再生的本發(fā)明組合物的單位劑量形式提供本發(fā)明用于骨關(guān)節(jié)炎的治療劑。在可注射制劑情況下，例如可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，使用合適的分散劑或濕潤(rùn)劑和懸浮劑，配制無(wú)菌的可注射的含水或油狀懸浮體。無(wú)菌的可注射制劑可以是在無(wú)毒、非口服的可接受載體或溶劑內(nèi)的無(wú)菌的可注射溶液、懸浮液或乳液?？山邮艿妮d體和溶劑包括水、林格液和等滲氯化鈉溶液。另外，可使用典型地用作溶劑或懸浮介質(zhì)的無(wú)菌的硬化油?？勺⑸渲苿┛伸o脈內(nèi)、體腔內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和管內(nèi)注射。
對(duì)于腸胃外給藥來(lái)說(shuō)，最優(yōu)選無(wú)菌的水溶液形式。為了與血液等滲，該溶液可含有例如諸如鹽或糖，例如葡萄糖和甘露醇之類的材料。
用于口服給藥的固體劑量形式包括膠囊、片劑、丸劑、粉劑和顆粒劑。在這些固體劑量形式當(dāng)中，活性化合物可與例如一種或多種惰性稀釋劑，例如蔗糖、乳糖或淀粉混合。此外，除了惰性稀釋劑，可包括添加劑，例如，潤(rùn)滑劑和其它助劑如硬脂酸鎂和微晶纖維素。在膠囊、片劑和丸劑的情況下，劑量形式可包括緩沖劑。片劑和丸劑可進(jìn)一步使用腸衣劑和其它持續(xù)釋放的胞衣材料。在軟質(zhì)和硬質(zhì)明膠膠囊中，賦形劑如乳糖或牛奶糖和高分子量的二元醇可用作填料。
可使用胞衣和制殼系統(tǒng)，制備包括片劑、糖衣片劑、膠囊、丸劑和顆粒劑在內(nèi)的固體劑量形式。
用于口服給藥的液體劑量形式可包括藥學(xué)上可接受的乳液、溶液、懸浮體、糖漿和酏劑，它們含有在本領(lǐng)域中常用的惰性稀釋劑，例如水。這些組合物可包括潤(rùn)濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑和調(diào)味劑與香料。
另外，本發(fā)明的配方可制備成在局部或經(jīng)皮給藥劑量形式的藥膏、糊劑、軟膏、洗劑、凝膠或貼劑。經(jīng)皮貼劑的額外優(yōu)勢(shì)是調(diào)節(jié)輸送到身體的組合物用量?？赏ㄟ^(guò)在合適的介質(zhì)內(nèi)溶解或分散化合物，從而制備這些劑量形式?？墒褂梦沾碳┰黾踊衔锝?jīng)皮吸收。對(duì)于經(jīng)皮給藥來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的組合物可配制成含有聚丙烯酸鈉、甘油和對(duì)羥基苯甲酸甲酯的藥學(xué)上可接受的泥敷劑，或者含有丙二醇、液體石蠟和肉豆蔻酸異丙酯的膏劑。
通過(guò)下述實(shí)施例可獲得本發(fā)明的更好理解，其中列出所述實(shí)施例闡述本發(fā)明，而不是解釋為限制本發(fā)明。
實(shí)施例1芹菜素的抗增殖和細(xì)胞毒性作用已知芹菜素對(duì)腫瘤細(xì)胞以及正常細(xì)胞具有抗增殖和細(xì)胞毒性作用。因此，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明芹菜素的軟骨細(xì)胞的增殖作用，在體外評(píng)價(jià)芹菜素對(duì)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
為了確定發(fā)揮其對(duì)軟骨細(xì)胞的抗增殖和細(xì)胞毒性作用有效的芹菜素濃度，在從新西蘭白兔中分離的軟骨細(xì)胞中測(cè)量IC50值。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)膠原蛋白酶處理，從兔子的正常軟骨中分離軟骨細(xì)胞，并用各種濃度1、10、20、30、40、50、100和200μM的芹菜素(含有小于0.05％DMSO)處理。在培養(yǎng)過(guò)程中，在第1、2、4和6天時(shí)，通過(guò)MTT分析，基于細(xì)胞的存活測(cè)量IC50值。
結(jié)果，下表1給出了在兔子的軟骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)物上芹菜素的IC50值，從而表明芹菜素的抗增殖作用。
表1在軟骨細(xì)胞上芹菜素的IC50值

特別地，在非常低濃度，低于約10μM的芹菜素存在下培養(yǎng)1和2天的軟骨細(xì)胞中，觀察到?jīng)]有顯著的增殖抑制或細(xì)胞毒性。相反，在1μM-10μM的濃度下，芹菜素在軟骨細(xì)胞上顯示出約10-20％的細(xì)胞增殖作用。因此，認(rèn)為低于10μM濃度的芹菜素在體外具有軟骨再生作用同時(shí)刺激軟骨細(xì)胞增殖并使其細(xì)胞毒性最小化。
這些結(jié)果證明，在使用芹菜素治療骨關(guān)節(jié)炎時(shí)，確定芹菜素的有效濃度是實(shí)現(xiàn)芹菜素的消炎和軟骨再生作用同時(shí)避免芹菜素的抗增殖和細(xì)胞毒性作用的重要因素。
實(shí)施例2在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎為了制備骨關(guān)節(jié)炎模型，使新西蘭白兔在其兩條后腿的關(guān)節(jié)內(nèi)進(jìn)行前交叉韌帶切斷術(shù)(ACLT)。3天后，強(qiáng)制兔子在5×5m3的空間內(nèi)運(yùn)動(dòng)4周，以誘導(dǎo)嚴(yán)重的骨關(guān)節(jié)炎?？傆?jì)4次將50μg芹菜素(A3145，Sigma)(每周一次共4周)施用到骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的兔子的感染的右腿內(nèi)。通過(guò)在50μl DMSO(二甲亞砜)和450μl生理鹽水的混合物內(nèi)溶解50μg芹菜素，制備可注射的制劑。已感染的左腿用作已感染的右腿的對(duì)照，并注射含有50μl DMSO的450μl生理緩沖液PBS，以便比較芹菜素的作用。在骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)后的第2周和第4周中，施用芹菜素之后1周時(shí)，收集關(guān)節(jié)滑液和軟骨并用于試驗(yàn)。圖13示出了骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)和滑液收集的過(guò)程。全部使用與該實(shí)施例2一樣制備的骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的新西蘭白兔關(guān)節(jié)，進(jìn)行以下的實(shí)施例3-10。
圖1圖示了試驗(yàn)和對(duì)照組的感染關(guān)節(jié)。如圖1所示，在用本發(fā)明有效量的芹菜素給藥的兔子中，關(guān)節(jié)軟骨的表面肉眼看是光滑的。相反，在PBS對(duì)照組中，關(guān)節(jié)軟骨的表面由于關(guān)節(jié)軟骨的損傷，因此是非常粗糙的。另外，發(fā)現(xiàn)在用芹菜素給藥的試驗(yàn)組的左關(guān)節(jié)內(nèi)的軟骨在一定程度上得到改善，這是因?yàn)樵谟谊P(guān)節(jié)內(nèi)軟骨的改善導(dǎo)致的重量減輕所致。
實(shí)施例3測(cè)量總的關(guān)節(jié)滑液體積典型地，當(dāng)骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展時(shí)，滑液體積隨炎癥加重而增加。在骨關(guān)節(jié)炎(OA)誘導(dǎo)之前(正常狀態(tài))和在骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)之后的第2周和第4周時(shí)，施用芹菜素之后1周時(shí)，收集滑液并離心，以除去血細(xì)胞和其它細(xì)胞。在本試驗(yàn)中使用上清液。
據(jù)報(bào)道，由于滑液體積隨骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展而變化，因此測(cè)量總的滑液體積，以研究滑液隨骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)和藥物治療的變化。使用Arsenazo III絡(luò)合(complexion)方法，通過(guò)測(cè)量滑液內(nèi)Ca2+的濃度，從而測(cè)定滑液體積(Michaylova V.等人，Anal.Chim.Acta，53194(1971))。使用Donnan平衡方程式，計(jì)算總的滑液體積。將0.01ml滑液和1mlArsenazo III試劑(588-3，Sigma)混合并使之在室溫下靜置5分鐘，使用分光光度計(jì)(DU650，Beckman)，在600nm下測(cè)量吸光度。
下表2和圖2中給出了結(jié)果。在注射藥物之后4周時(shí)，在PBS對(duì)照組中，約0.25ml正常的總滑液體積(在OA誘導(dǎo)之前)增加到約1.7ml。相反，芹菜素治療組顯示出總滑液體積較小的增加，在注射藥物之后4周時(shí)，增加到約1.16ml，這表明芹菜素對(duì)滑液體積的增加具有強(qiáng)烈的抑制作用。另外，在芹菜素治療組中，(沒(méi)有用芹菜素治療的)感染左關(guān)節(jié)在芹菜素注射之后4周時(shí)顯示出較小的滑液體積，約1.58ml，相比之下，PBS對(duì)照組具有約1.91ml的滑液體積。在感染左關(guān)節(jié)內(nèi)的這種改善是由于右關(guān)節(jié)通過(guò)芹菜素注射得到改善導(dǎo)致的重量減輕所致。
表2總的滑液體積(ml)

實(shí)施例4測(cè)量關(guān)節(jié)滑液內(nèi)的蛋白多糖水平在實(shí)施例3所制備的關(guān)節(jié)滑液內(nèi)，使用1，9-二甲基亞甲基藍(lán)分析法，測(cè)量蛋白多糖水平(Houselmann H.J.等人，Am.J.Physiol.271C742-752(1996))。將50μl滑液樣品與250μl 1，9-二甲基亞甲基藍(lán)(34，108-8，Aldrich)混合，并使用分光光度計(jì)(Power Wave X340，BioTek)，在530nm下測(cè)量吸光度。
下表3和圖3中給出了結(jié)果。在注射藥物之后4周時(shí)，在PBS對(duì)照組中，約3.79μg/ml正常的蛋白多糖水平(在OA誘導(dǎo)之前)增加到約59.65μg/ml。相反，與對(duì)照組相比，芹菜素治療組顯示出蛋白多糖水平的急劇下降，在注射藥物之后4周時(shí)，為約12.22μg/ml，這表明在OA誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)內(nèi)芹菜素具有降低蛋白多糖水平的強(qiáng)烈的作用。另外，在芹菜素的治療組中，(沒(méi)有用芹菜素治療的)感染的左關(guān)節(jié)比PBS對(duì)照組顯示出較低的蛋白多糖水平。
表3在關(guān)節(jié)滑液內(nèi)的蛋白多糖水平(μg/ml)

實(shí)施例5測(cè)量在關(guān)節(jié)滑液內(nèi)的總蛋白質(zhì)水平隨著骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展軟骨被破壞時(shí)，包含在其內(nèi)的蛋白質(zhì)釋放到滑液內(nèi)。關(guān)于這一點(diǎn)，測(cè)量在滑液內(nèi)總的蛋白質(zhì)水平。使用實(shí)施例3中制備的關(guān)節(jié)滑液，使用Bradford方法測(cè)量在滑液內(nèi)總的蛋白質(zhì)水平。將50μl滑液與200μl蛋白質(zhì)分析劑(500-0006，Bio-Rad)混合并使之在室溫下靜置5分鐘，和在595nm下測(cè)量吸光度。
下表4和圖4中給出了結(jié)果。在注射藥物之后4周時(shí)，在PBS對(duì)照組中，約4.27mg/ml正常的總蛋白質(zhì)水平(在OA誘導(dǎo)之前)增加到約39.74mg/ml。相反，與對(duì)照組相比，芹菜素治療組顯示出總蛋白質(zhì)水平的顯著下降，在注射藥物之后4周時(shí)，為約24.91mg/ml。
表4在關(guān)節(jié)滑液內(nèi)的總蛋白質(zhì)水平(mg/ml)

實(shí)施例6測(cè)量在關(guān)節(jié)滑液內(nèi)的前列腺素E2(PGE2)的水平使用實(shí)施例3中制備的關(guān)節(jié)滑液，使用酶免疫分析(EIA)試劑盒(DE0100，R&DSystems)，測(cè)量在滑液內(nèi)的前列腺素E2(PGE2)的水平。在試劑盒內(nèi)提供的平板內(nèi)，將100μl 1∶10稀釋的滑液樣品與50μl綴合物和50μl抗體混合，并在室溫下在攪拌下培養(yǎng)2小時(shí)。然后，用洗滌緩沖液洗滌該平板，并向其中添加200μl pNPP溶液，接著在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。之后，在405nm下測(cè)量吸光度。
下表5和圖5中給出了結(jié)果。在注射藥物之后4周時(shí)，在PBS對(duì)照組中，約88.05pg/ml正常的PGE2水平(在OA誘導(dǎo)之前)增加到約862.72pg/ml。相反，在芹菜素治療組中，從正常的PGE2水平略微增加到約196.71pg/ml，因此與對(duì)照組相比大大地下降。這些結(jié)果表明，芹菜素對(duì)PGE水平的增加具有強(qiáng)烈的抑制作用。另外，在芹菜素治療組中，(沒(méi)有用芹菜素治療的)感染的左關(guān)節(jié)顯示出約753.2pg/ml顯著下降的PGE2水平，相比之下對(duì)照組具有約509.3pg/ml的PGE2水平。
表5在關(guān)節(jié)滑液內(nèi)的PGE2水平(pg/ml)

實(shí)施例7測(cè)量關(guān)節(jié)滑液內(nèi)的膠原蛋白水平通過(guò)Sirius Red染色，測(cè)量總的膠原蛋白水平(Heide T.R.等人，Histochem.Cell Biol.，112271-276(1999))。將100μl滑液樣品放置在96孔平板內(nèi)的每一孔中并在干燥烘箱中，在34℃下培養(yǎng)24小時(shí)，以涂布孔底。100μl通過(guò)在苦味酸內(nèi)溶解Sirius Red(1mg/ml，36，554-8，Aldrich)而制備的染料溶液加入到每一孔內(nèi)，并振蕩平板30分鐘。使用0.01NHCl(H7020，Sigma)除去剩余的染料，并使用100μl 0.1N的NaOH(S8045，Sigma)溶解膠原蛋白。然后，通過(guò)在550nm下測(cè)量吸光度，確定總的膠原蛋白水平。通過(guò)測(cè)量不同濃度0、100、200、300、400和500μg下的I型膠原蛋白(C1188，Sigma)在550nm處的吸光度，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用該標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定在滑液內(nèi)的膠原蛋白水平。
下表6和圖6中給出了結(jié)果。在注射藥物之后4周時(shí)，在PBS對(duì)照組中，約118.64μg/ml正常的膠原蛋白水平增加到約1912.54μg/ml。相反，芹菜素治療組顯示出406.56μg/ml大大地下降的膠原蛋白水平，從而表明芹菜素顯著抑制膠原蛋白水平。另外，在芹菜素治療組中，(沒(méi)有用芹菜素治療的)感染的左關(guān)節(jié)顯示出約1019.2μg/ml在滑液內(nèi)顯著下降的膠原蛋白水平，相比之下對(duì)照組具有約1551μg/ml的PGE2水平。
表6在關(guān)節(jié)滑液內(nèi)的膠原蛋白水平(μg/ml)

實(shí)施例8關(guān)節(jié)的Mankin評(píng)分從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的膝關(guān)節(jié)的內(nèi)側(cè)副髕骨(parapatella)滑膜中橫切30mm的滑液組織，用10％甲酸(F0507，Sigma)固定24小時(shí)，并包埋在石蠟中，制備4mm的蠟塊。對(duì)這4mm的部分進(jìn)行H&E(蘇木精和曙紅)染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察，以確定Mankin分?jǐn)?shù)。在評(píng)價(jià)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展程度所使用的數(shù)種方法中，最常用的方法是Mankin評(píng)分。這一方法基于在每一項(xiàng)目上以等級(jí)形式用數(shù)字表達(dá)退化變化，其中包括軟骨的結(jié)構(gòu)變化，軟骨內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的增加或減少，通過(guò)用沙黃O染色軟骨得到的表面的染色分布和潮線的持續(xù)。通過(guò)由兩個(gè)檢查員進(jìn)行的盲試驗(yàn)，進(jìn)行Mankin評(píng)分，和根據(jù)退化的進(jìn)展程度確定Mankin分?jǐn)?shù)，和范圍為0(所有項(xiàng)目正常)到最大分?jǐn)?shù)14，從而計(jì)算退化變化指數(shù)。
圖7中給出了結(jié)果。在骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)之后，在對(duì)照組和芹菜素治療組中的平均分?jǐn)?shù)分別為12.5和6.6。也就是說(shuō)，與對(duì)照組相比，芹菜素治療組在退化變化指數(shù)方面顯示出兩倍的改進(jìn)。
實(shí)施例9關(guān)節(jié)的H&E染色和沙黃O染色從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上收集遠(yuǎn)端股骨，并用4％福爾馬林(F8775，Sigma)固定24小時(shí)以上。將待分析的遠(yuǎn)端股骨區(qū)域橫切成5mm的厚度，用5％硝酸(25，811-3，Sigma)脫鈣24小時(shí)以上，并包埋在石蠟內(nèi)，以提供蠟塊。橫切該蠟塊，并對(duì)所得4μm的部分進(jìn)行H&E染色，并用軟骨特異的染料沙黃O(S2255，Sigma)染色并在光學(xué)顯微鏡下觀察，以評(píng)價(jià)軟骨的狀況。
圖8A和8B給出了結(jié)果，圖8A和8B分別示出了在芹菜素治療組和用生理鹽水治療的對(duì)照組中H&E染色和沙黃O染色的結(jié)果。當(dāng)沙黃O染色時(shí)，觀察到所有的骨關(guān)節(jié)炎特征，但在芹菜素治療組中，軟骨破壞足夠低可用肉眼識(shí)別，且與對(duì)照組相比，顯示出蛋白多糖相對(duì)高的染色。當(dāng)對(duì)芹菜素治療組進(jìn)行組織學(xué)分析用以肉眼評(píng)價(jià)軟骨特異的ECM合成，例如蛋白多糖和細(xì)胞形態(tài)時(shí)，發(fā)現(xiàn)軟骨的受損區(qū)域得到恢復(fù)。
實(shí)施例10評(píng)價(jià)滑液細(xì)胞的分布與數(shù)量根據(jù)與實(shí)施例9相同的方法制備組織并評(píng)價(jià)細(xì)胞數(shù)量和其表面狀況。在深度為120微米的位點(diǎn)處測(cè)量細(xì)胞數(shù)量。
圖9和10給出了結(jié)果。正如圖9所示，與用生理鹽水治療的對(duì)照組相比，芹菜素治療組在右腿截面內(nèi)具有相對(duì)光滑的表面。另外，如圖10所示，在骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)之后，在對(duì)照組內(nèi)的滑液細(xì)胞數(shù)量為632.3個(gè)，而在芹菜素治療組內(nèi)為406.6個(gè)。也就是說(shuō)，與對(duì)照組相比，芹菜素治療組具有顯著下降的滑液細(xì)胞數(shù)量，下降約34.5％。
實(shí)施例11測(cè)量在滑液內(nèi)的一氧化氮(NO)水平為了測(cè)定滑液內(nèi)的NO水平，將硝酸還原成最穩(wěn)定的形式，亞硝酸鹽，和使用Griess反應(yīng)，測(cè)量亞硝酸鹽?；汉虶riess試劑以1∶1的比值混合(100μl∶100μl)，并在室溫下放置10分鐘，和使用分光光度計(jì)(Power Wave X340，Bio-Tek)，在540nm處測(cè)量吸光度。使用0.1g磺胺(S9251，Sigma)、0.5ml磷酸(P6560，Sigma)和0.01gN-萘基-二胺-H-鹽酸鹽(102397，ICN)，制備最終體積為10ml的Griess試劑。使用亞硝酸鈉(S2252，Sigma)獲得亞硝酸鹽的定量曲線。
下表7中給出了結(jié)果。在骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)之后，在PBS對(duì)照組中，約4.48μM的正常NO水平(在OA誘導(dǎo)之前)增加到約12.1μM，而在芹菜素治療組中略微增加到約6.01μM。這些結(jié)果表明芹菜素具有良好的消炎作用。
表7在滑液內(nèi)的NO水平(μM)

實(shí)施例12芹菜素對(duì)巨噬細(xì)胞的NO產(chǎn)生的抑制作用從小鼠得到的巨噬細(xì)胞系RAW 264.7(KCLB 40071)購(gòu)于韓國(guó)細(xì)胞系庫(kù)(Cell LineBank)。將密度為3×106個(gè)細(xì)胞的RAW 264.7細(xì)胞在60mm的培養(yǎng)皿內(nèi)接種，所述培養(yǎng)皿含有DMEM(Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基，12800-017，Gibco)并補(bǔ)加10％FBS(胎牛血清，26140-079，Gibco)、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(15140-122，Gibco)，且在5％二氧化碳和濕度下在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。為了誘導(dǎo)NO產(chǎn)生，用500ng/ml大腸桿菌細(xì)胞壁組分，即脂多糖(LPS，L2654，Sigma)處理RAW 264.7細(xì)胞。僅僅用DMSO處理對(duì)照組，和用濃度為10、20、40和80μM芹菜素處理試驗(yàn)組16小時(shí)。此處，將LPS溶解在蒸餾水內(nèi)，和將芹菜素溶解在DMSO內(nèi)。然后，將培養(yǎng)基和Griess試劑以1∶1的比值混合(100μl∶100μl)，并使之在室溫下放置10分鐘。之后，使用分光光度計(jì)(Power WaveX340，Bio-Tek)，在540nm下測(cè)量吸光度。
下表8中給出了結(jié)果。未處理組產(chǎn)生2μM一氧化氮，和僅僅用LPS處理的組生成40μM一氧化氮。相反，在用LPS和芹菜素處理的組中，隨芹菜素的濃度不同，NO的生成下降到最大9μM，從而表明芹菜素在體外具有優(yōu)良的消炎作用。
表8在RAW 264.7細(xì)胞內(nèi)的一氧化氮水平

實(shí)施例13芹菜素對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素E2(PGE2)的抑制作用在與實(shí)施例12相同的條件下處理RAW 264.7細(xì)胞。使用PGE2免疫分析試劑盒(DE0100，R&D Systems)測(cè)量PGE2水平。在試劑盒內(nèi)，使100μl培養(yǎng)基與50μl綴合物和50μl抗體反應(yīng)2小時(shí)，然后使之與200μl展開(kāi)劑，pNPP反應(yīng)1小時(shí)。之后，使用分光光度計(jì)(Power Wave X340，Bio-Tek)，在405nm下測(cè)量吸光度。
下表9給出了結(jié)果。未處理組產(chǎn)生71pg/ml PGE2，和僅僅用LPS處理的組生成4156pg/ml PGE2。相反，在用LPS和芹菜素處理的組中，隨芹菜素的濃度不同，PGE2的產(chǎn)生下降到最大300pg/ml。
表9在RAW 264.7細(xì)胞內(nèi)的PGE2水平

實(shí)施例14評(píng)價(jià)芹菜素對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)iNOS、COX-2、IκBα的表達(dá)的影響在與實(shí)施例12相同的條件下處理RAW 264.7細(xì)胞。為了研究芹菜素對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)iNOS、COX-2和IκBα的表達(dá)的影響，進(jìn)行Western印跡法。此處對(duì)于IκBα的表達(dá)來(lái)說(shuō)，用LSP處理細(xì)胞僅僅2小時(shí)。在除去培養(yǎng)基之后，收集細(xì)胞并用抽提緩沖液(0.32M蔗糖(S0389，Sigma)、0.2M Hepes(H3375，Sigma)，1mM EDTA(808288，BM)、1mMPMSF(P7626，Sigma)、10μg/ml抑蛋白酶肽(A1153，Sigma)、10μg/ml亮抑蛋白酶肽(L0649，Sigma)、10μg/ml SBTI(T9128，Sigma))裂解。在測(cè)量細(xì)胞裂解物內(nèi)的蛋白質(zhì)濃度之后，在8-16％SDS(十二烷基硫酸鈉)聚丙烯酰胺凝膠(EC60452，NOVEX)上分離40mg蛋白質(zhì)樣品。將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF(聚偏二氟乙烯，IPVH00010，Millipore)上。在5％NFDM(非脂肪干乳)內(nèi)封阻(block)該印跡并使之與初級(jí)抗體反應(yīng)，然后與二級(jí)抗體反應(yīng)。然后使用ECL(增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光)的試劑盒(RPN2106，Amersham)形成印跡，并暴露于X-射線薄膜(AGFA)下。使用下述初級(jí)抗體0.13μg/ml抗-iNOS(N32020，Transduction)、2μg/ml抗-COX-2(sc-1745，Santacruz)、1μg/ml抗-β-肌動(dòng)蛋白(A5441，Sigma)和0.4μg/ml抗-IκBα(sc-371，Santacruz)。80ng/ml抗小鼠IgG-HRP(sc-2005，Santacruz)用作抗-iNOS和抗-β-肌動(dòng)蛋白的二級(jí)抗體。80ng/ml抗兔子IgG-HRP(sc-2004，Santacruz)用作抗-COX-2和抗-IκBα的二級(jí)抗體。
圖11中給出了結(jié)果。在沒(méi)有外部刺激的正常條件下，沒(méi)有觀察到iNOS的表達(dá)。當(dāng)LPS處理時(shí)增加的iNOS的表達(dá)水平用100％表示。當(dāng)芹菜素處理時(shí)，增加的iNOS的表達(dá)水平從100％下降到0％。在沒(méi)有外部刺激的正常條件下，沒(méi)有觀察到COX-2的表達(dá)。當(dāng)LPS處理時(shí)增加的COX-2的表達(dá)水平用100％表示。當(dāng)芹菜素處理時(shí)，增加的COX-2的表達(dá)水平從100％下降到0％。
在沒(méi)有外部刺激的正常條件下，IκBα的表達(dá)水平用100％表示。LPS處理導(dǎo)致下降到18.56％。當(dāng)用僅僅10μM的芹菜素處理時(shí)，下降的IκBα的表達(dá)水平恢復(fù)到75.82％。
實(shí)施例15評(píng)價(jià)芹菜素對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)NFκB結(jié)合到特異基因上的影響在與實(shí)施例12相同的條件下處理RAW 264.7細(xì)胞，所不同的是處理持續(xù)2小時(shí)而不是16小時(shí)。為了研究芹菜素對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)NFκB和特異基因之間結(jié)合的影響，進(jìn)行EMSA(電泳遷移率變動(dòng)分析)。在除去培養(yǎng)基之后，收集細(xì)胞，用緩沖液A(10mMHepes，pH7.9(H3375，Sigma)、10mM KCl(P9541，Sigma)、1.5mM MgCl2(M2393，Sigma)、0.5mM二硫代蘇糖醇(D0632，Sigma)、0.2mM PMSF(P7626，Sigma)、0.5％NonidetP-40(N3268，Sigma))裂解，并在5000rpm下離心15分鐘。在緩沖液B(20mMHepes，pH7.9(H3375，Sigma)、300mM KCl(P9541，Sigma)、1.5mM MgCl2(M2393，Sigma)、10％甘油(G7757，Sigma)、0.5mM二硫代蘇糖醇(D0632，Sigma)、0.2mMEDTA(808288，BM)、0.2mM PMSF(P7626，Sigma))內(nèi)懸浮顆粒物，以破壞細(xì)胞膜，并在13000rpm下離心30分鐘，獲得核蛋白質(zhì)。用[γ-32P]ATP(PB10218，Amersham)標(biāo)記能結(jié)合到NFκB上的合成的核酸低聚物(5’-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’，GenoTech)。使10mg蛋白質(zhì)樣品與0.5ng標(biāo)記的核酸低聚物反應(yīng)。然后，為了評(píng)價(jià)探針與NFκB之間的結(jié)合，使反應(yīng)溶液進(jìn)行6％聚丙烯酰胺凝膠電泳，并干燥該凝膠，并暴露于X-射線薄膜下。
圖12中給出了結(jié)果。在沒(méi)有外部刺激的正常條件下，NFκB的表達(dá)水平用100％表示。LPS處理導(dǎo)致增加到186。相反，當(dāng)同時(shí)用LPS和芹菜素處理時(shí)，正常的NFκB的表達(dá)水平下降到最大111(當(dāng)用20μM的芹菜素處理時(shí))。
工業(yè)實(shí)用性如前所述，本發(fā)明提供芹菜素作為軟骨再生劑的新用途，所述芹菜素具有降低升高含量的軟骨破壞標(biāo)志物，改善滑液細(xì)胞的狀況，并使軟骨再生的作用，其中軟骨破壞標(biāo)志物包括總的滑液體積和滑液內(nèi)的蛋白多糖、總的蛋白質(zhì)和前列腺素。此外，本發(fā)明提供用于骨關(guān)節(jié)炎的治療劑，其包括單一化合物芹菜素作為再生關(guān)節(jié)軟骨的試劑，和使用該治療劑治療骨關(guān)節(jié)炎的方法。
權(quán)利要求
1.一種使軟骨再生的組合物，它包括芹菜素和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述的芹菜素的有效用量使關(guān)節(jié)軟骨和滑液內(nèi)的芹菜素形成1μM-80μM的濃度。
2.如權(quán)利要求1所述的使軟骨再生的組合物，其中所述組合物具有降低關(guān)節(jié)滑液體積，和在滑液內(nèi)的蛋白多糖，總蛋白質(zhì)和前列腺素水平，并改善滑液細(xì)胞的狀況。
3.使軟骨再生的用于骨關(guān)節(jié)炎的治療劑，其包括如權(quán)利要求1所述的使軟骨再生的組合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
4.如權(quán)利要求3所述的用于骨關(guān)節(jié)炎的治療劑，其中該治療劑為溶液、膠囊、顆粒、片劑或丸劑的口服給藥制劑形式；局部可施涂的藥膏制劑或經(jīng)皮給藥的制劑；或注射劑。
5.如權(quán)利要求4所述的用于骨關(guān)節(jié)炎的治療劑，其中治療劑為口服給藥的制劑形式，其含有每日10mg-1000mg有效量的芹菜素。
6.如權(quán)利要求4所述的用于骨關(guān)節(jié)炎的治療劑，其中治療劑為藥膏形式，其含有每日1mg-100mg有效量的芹菜素。
7.如權(quán)利要求4所述的用于骨關(guān)節(jié)炎的治療劑，其中治療劑為注射劑形式，其含有每日0.1mg-10mg有效量的芹菜素。
8.通過(guò)使關(guān)節(jié)軟骨再生治療骨關(guān)節(jié)炎的方法，該方法包括給骨關(guān)節(jié)炎患者施用用于骨關(guān)節(jié)炎的治療劑，所述用于骨關(guān)節(jié)炎的治療劑包括如權(quán)利要求1所述的使軟骨再生的組合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了芹菜素作為軟骨再生劑的新用途，所述芹菜素具有降低升高含量的軟骨破壞標(biāo)志物，改進(jìn)滑液細(xì)胞狀況，并使軟骨再生的作用，其中所述軟骨破壞標(biāo)志物包括總的滑液體積和滑液內(nèi)的蛋白多糖，總的蛋白質(zhì)和前列腺素作用。此外，本發(fā)明公開(kāi)了用于骨關(guān)節(jié)炎的治療劑，其包括芹菜素作為再生關(guān)節(jié)軟骨的試劑，和使用該治療劑治療骨關(guān)節(jié)炎的方法。
文檔編號(hào)A61P19/02GK1897932SQ200480030411
公開(kāi)日2007年1月17日 申請(qǐng)日期2004年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月15日
發(fā)明者樸昌信, 姜柱惠, 金京美 申請(qǐng)人:凱姆斯有限公司, 黃成淵, 黃成完