專利名稱：利用標(biāo)記的橋合二哌啶的結(jié)合測試方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種被標(biāo)記的配體化合物，該化合物有用于鑒別、測試和/或篩選調(diào)節(jié)離子通道、尤其是諸如那些由ERG(包括hERG)編碼的心肌Ikr通道的化合物的方法。因此，所述配體化合物有用于評價臨床前化合物對ERG鉀通道的親和力。
背景技術(shù)：
現(xiàn)在已認(rèn)識到一些藥物誘導(dǎo)的突發(fā)死亡僅次于被稱為扭轉(zhuǎn)型室性心動過速(Torsades de Pointes，TdP)的心律失常的發(fā)展(Vandenberg JI，Walker BD，Campbell TJ.HERG K+channelsfriend and foe.Trends Pharmacol Sci 2001；22(5)240-6)。
隨著近來對這一現(xiàn)象理解的增進(jìn)，顯示出這些藥物的主要作用是對延遲整流鉀電流(Ikr)的快速組分的抑制。這些化合物與運(yùn)載該電流-亞單位的通道蛋白質(zhì)的成孔的α-亞單位結(jié)合，所述電流-亞單位由人類eag相關(guān)基因(human ether-a-go-go-related gene，hERG)編碼。由于IKr在心臟動作電位的再極化中起著關(guān)鍵作用，所以其抑制作用減緩了再極化并隨著QT間隔的延長而表現(xiàn)出來?？墒蔷推浔旧矶?，QT間隔延長是不安全的，它帶有高風(fēng)險的心血管副作用，并且在少量百分比的人群中，它能導(dǎo)致TdP并惡化為心室顫動。
許多化合物因?yàn)閷ERG編碼的心肌Ikr通道的抑制作用而不能成為可出售的藥物?；加蠰QT2綜合征的患者(其中hERG基因已經(jīng)突變)還表現(xiàn)出扭轉(zhuǎn)型室性心動過速。hERG通道含有對下述藥物的結(jié)合位點(diǎn)，例如III類抗心律失常的甲磺苯胺類藥物(多非利特，E-4031和MK-449)和許多在臨床上共享該位點(diǎn)的導(dǎo)致QT延長的藥物。因此，它們要么帶有警告標(biāo)記(如匹莫齊特)，要么已經(jīng)撤出市場(例如特非那定)。在hERG通道和所需靶點(diǎn)的活性之間的合適治療界限的缺乏將阻止?jié)撛谒幬锏倪M(jìn)一步開發(fā)。因此，盡可能早地評價hERG活性，從而減少新化合物類型的該種活性。
為了評價新化合物的ERG，尤其是hERG，對新化合物的活性和結(jié)合性需要進(jìn)行合適的測試方法。已經(jīng)研發(fā)出臨床前的測試方法，該方法使用與hERG結(jié)合的放射性標(biāo)記的化合物并允許置換研究以確定新化合物類型的親和力。但是，需要有做這種測試用的可供選擇的配體。

發(fā)明內(nèi)容
WO02/04446公開了橋合二哌啶(bispidine)化合物及其在心律失常治療中的用途。
因此，一方面，本發(fā)明涉及如WO02/04446中所述橋合二哌啶化合物的放射性標(biāo)記的衍生物或其鹽、水合物或溶劑化物。適當(dāng)?shù)卣f，該化合物包含放射性標(biāo)記的取代基，尤其是氚取代基。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，該化合物包含至少1、2或3個氚取代基。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有式I并包含至少一個放射性標(biāo)記的化合物或其鹽、水合物或溶劑化物 式I適當(dāng)?shù)卣f，該化合物包含至少1、2或3個氚取代基，該取代基優(yōu)選在硝基的鄰位。
這種放射性配體或放射性標(biāo)記的化合物有用于評價化合物對由ERG、尤其是hERG編碼的Ikr通道的親和力。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了式II的化合物或其鹽
式II合適的鹽包括其酸加成鹽或堿鹽。一些合適的鹽的綜述記載于Berge等人，J Pharm Sci，66，1-19(1977)。鹽可由以下酸形成，例如強(qiáng)無機(jī)酸如礦酸，如硫酸、磷酸或氫鹵酸；強(qiáng)有機(jī)酸，如未被取代或取代的(如被鹵素取代)具有1-4個碳原子的烷羧酸，例如乙酸；飽和或不飽和的二羧酸，例如草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、鄰苯二甲酸或?qū)Ρ蕉?；羥基羧酸，例如抗壞血酸、羥基乙酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸或檸檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或有機(jī)磺酸，如未被取代或取代的(如被鹵素取代)(C1-C4)-烷基或芳基-磺酸，例如甲磺酸或?qū)妆交撬帷?br> 本發(fā)明還包括式I或II放射性標(biāo)記的化合物的所有對映異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將識別出具有光學(xué)性質(zhì)(一個或多個手性碳原子)或互變特性的化合物。相應(yīng)的對映異構(gòu)體和/或互變異構(gòu)體可以按照本領(lǐng)域已知的方法分離/制備。
此外，本發(fā)明包括式I或II放射性標(biāo)記的化合物的任何立體異構(gòu)體和/或幾何異構(gòu)體。例如，可以存在一個或多個不對稱和/或幾何中心，由此所述化合物可以以兩種或多種立體異構(gòu)體和/或幾何異構(gòu)體形成存在。本發(fā)明涵蓋這些物質(zhì)的所有單個立體異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體、及其混合物的用途。權(quán)利要求中所用的術(shù)語包含這些形式，只要所述形式保留合適的功能活性(雖然不必達(dá)到同樣的程度)。
本發(fā)明還包括所述化合物或其鹽的其它同位素變體。本發(fā)明試劑或其可藥用鹽的同位素變體被定義為其中至少一個原子被具有相同原子數(shù)但與自然界最常見原子量不同的原子量的原子所替代的物質(zhì)?？珊喜⑷胨龌衔镏械钠渌凰氐睦影洹⑻?、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，例如分別為2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F和36Cl。如式II中所示，特別優(yōu)選氚化物，即3H?？梢允褂肅-14(即14C)同位素并由于它們?nèi)菀字苽浜蜋z測而被優(yōu)選。同位素變體一般可按照常規(guī)的方法使用合適試劑的適宜同位素變體制備。
本發(fā)明還包括所述化合物的溶劑化物形態(tài)的用途。權(quán)利要求中所用術(shù)語包括這些形態(tài)。
放射性配體化合物在結(jié)合測試中的成功使用依賴于許多參數(shù)，包括所述放射性配體對所關(guān)心通道的親和力，以及一旦結(jié)合該化合物的離解速率(off rate)。理論上，合適的放射性配體將具有允許與可結(jié)合同一位點(diǎn)的候選化合物競爭的親和力，以及允許所述放射性配體保持接觸足夠長時間以使能檢測出其結(jié)合的離解速率?；衔锏倪@些性質(zhì)是不可預(yù)料的。因此，本發(fā)明涉及這樣的發(fā)現(xiàn)，即1、2或3個氚取代的式I化合物或式II化合物是可以合成的，并且適合用于競爭性結(jié)合測試。
本發(fā)明第二方面，提供了使用本發(fā)明的化合物鑒定作為IKr通道阻滯劑的化合物的活性的方法。
適當(dāng)?shù)卣f，所述方法是包括下述步驟的測試方法a)在存在或不存在測試化合物或測試化合物的混合物的情況下，在式II的放射性配體化合物存在下，培養(yǎng)含有IKr通道的細(xì)胞膜；b)在存在或不存在測試化合物的情況下，定量特異性結(jié)合標(biāo)記的化合物；c)計算測試化合物或測試化合物的混合物對標(biāo)記化合物結(jié)合的抑制作用。
這種測試方法可用于辨別和鑒定具有潛在心臟毒性副作用的化合物。該測試方法測量所述測試化合物從IKr通道、優(yōu)選ERG通道替換式II的放射性配體化合物的能力。適當(dāng)?shù)卣f，該測試方法可以在高通量測試系統(tǒng)上實(shí)施。該測試方法能夠選擇出合適的化合物(即那些對IKr通道沒有、低度或減小的親和力的化合物)用于進(jìn)一步的研發(fā)。
另外，這種測試方法可用于鑒定能夠結(jié)合IKr通道從而可能有用于治療患有心律失常的患者的化合物。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述測試方法包括步驟a)制備一或多個濃度的測試化合物溶液；b)將式II的放射性配體化合物與含有IKr通道的細(xì)胞膜混合；c)用式II的放射性配體化合物與含有IKr通道的細(xì)胞膜的混合物與測試化合物溶液孵育；d)從溶液中分離出膜并測定該膜的放射性；e)計算存在測試化合物的樣品相比于不存在測試化合物的對照物的放射性。
適當(dāng)?shù)卣f，計算對放射性配體化合物與細(xì)胞膜的結(jié)合產(chǎn)生50％抑制率的所述測試化合物的濃度(IC50)。這些數(shù)值可用于預(yù)測易于對人類產(chǎn)生不需要副作用的化合物濃度。
在一個實(shí)施方案中，所述測試方法是點(diǎn)試驗(yàn)。在另一實(shí)施方案中，所述測試方法測試濃度范圍，優(yōu)選5或更多個濃度。
分離細(xì)胞膜并測定放射性的合適的方法包括諸如本文所述測試方法的濾膜結(jié)合試驗(yàn)?；蛘撸梢允褂靡孕≈闉榛椎臏y試方法例如閃爍近似測定法(SPA，Amersham Biosciences)測定放射性。
優(yōu)選IKr通道是人ERG(hERG/HERG)。
在一個實(shí)施方案中，包含IKr通道的細(xì)胞膜來自ERG基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。適當(dāng)?shù)卣f，ERG基因是人(hERG)、靈長類或犬科的。
在人胚腎(HEK)細(xì)胞中已經(jīng)將HERG表達(dá)為穩(wěn)定或短暫表達(dá)的功能性通道(例如，參見Circulation 2001年，11月27日；104(22)2645-8Phospholipidmetabolite 1-palmitoyl-lysophosphatidylcholine enhances humanether-a-go-go-related gene(HERG)K(+)channel function。Wang J，Wang H，Han H，Zhang Y，Yang B，Nattel S，Wang Z；J Biol Chem 1998年8月14日；273(33)21061-6HERG channel dysfunction in human long QT syndrome。Intracellular transport and functional defects.Zhou Z，Gong Q，Epstein ML，January CT)。
因此，合適的細(xì)胞系包括HEK(人胚腎)細(xì)胞，如HEK 293細(xì)胞。其它合適的細(xì)胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢)細(xì)胞、CHL(中國倉鼠肺)細(xì)胞或COS(猴)細(xì)胞。此外，所述通道可以在細(xì)菌、酵母或昆蟲細(xì)胞如SF9中表達(dá)。
本發(fā)明的另一方面，提供了本發(fā)明化合物在鑒定一種或多種測試化合物的IKr通道阻滯劑活性的測試方法中的用途。
另一方面，提供了式II化合物在鑒別能與IKr通道結(jié)合的一種或多種候選化合物的測試方法中的用途。
適當(dāng)?shù)卣f，該測試方法是競爭性結(jié)合測試方法。
本發(fā)明的另一方面，提供了如本文所定義的式II化合物的制備方法，所述方法包括在(1，5-環(huán)辛二烯)二(甲基二苯基-膦)銥(I)六氟磷酸鹽存在下，氚化3，7-二[2-(4-硝基苯基)乙基]-3，7-二氮雜二環(huán)[3.3.1]壬烷。
適當(dāng)?shù)卣f，3，7-二[2-(4-硝基苯基)乙基]-3，7-二氮雜二環(huán)[3.3.1]壬烷和(1，5-環(huán)辛二烯)二(甲基二苯基-膦)銥(I)六氟磷酸鹽溶解于二氯甲烷中。
在一個實(shí)施方案中，使用氚化反應(yīng)槽(manifold)進(jìn)行氚化。
在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，式II化合物的制備方法基本上如本文中所述。
下述非限制性顯示了所述合成方法的應(yīng)用和式II化合物的應(yīng)用。
實(shí)施例實(shí)施例1-放射性配體的合成放射性標(biāo)記之前3，7-二[2-(4-硝基苯基)乙基]-3，7-二氮雜二環(huán)[3.3.1]壬烷的合成描述于WO02/04446中。
放射性標(biāo)記得到式II化合物 3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮雜二環(huán)[3.3.1]壬烷(式II)按照如下進(jìn)行將3，7-二[2-(4-硝基苯基)乙基]-3，7-二氮雜二環(huán)[3.3.1]壬烷(1.62mg，3.82μmol)和(1，5-環(huán)辛二烯)二(甲基二苯基-膦)銥(I)六氟磷酸鹽(8.6mg，10.3μmol)溶解于二氯甲烷中，并轉(zhuǎn)移至2ml厚玻璃壁圓底燒瓶中。將該燒瓶與RC Tritec氚化反應(yīng)槽相連，進(jìn)行如下循環(huán)冷凍、抽真空至＜0.01mbar并解凍使樣品脫氣。該二氯甲烷溶液最終在液氮和氚氣(大約130GBq，61μmol)中冷凍，氚氣是由反應(yīng)槽上初級鈾床產(chǎn)生的，被引入溶液上方的空隙中。使反應(yīng)物升溫至室溫并由磁力攪拌棒攪拌20小時。
所述溶液在液氮和再吸收在反應(yīng)槽的第二鈾儲存床中的殘留氚氣中再次冷凍。將燒瓶從反應(yīng)槽中撤去，使用乙醇(2×5ml)對所述溶液進(jìn)行兩次凍干循環(huán)，以除去不穩(wěn)定的氚。將所得殘留物溶解于乙醇(10ml)中，得到3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮雜二環(huán)[3.3.1]壬烷的儲備液(19.33GBq，放射化學(xué)純度34％)。
取儲備液等分試樣(2ml，3.87GBq)并在氮?dú)饬飨麓蹈?，殘留物再次溶解于乙?0.5％v/v三氟乙酸水溶液(體積比1∶1，400μl)中。使用下述HPLC條件，分大約5份等量注射液對該樣品進(jìn)行純化Xterra MS C-8 150×8mm，35％乙腈/0.5％v/v三氟乙酸水溶液，流速3ml/min，240nm檢測。每次均收集3，7-二[2-(4-硝基苯基)乙基]-3，7-二氮雜二環(huán)[3.3.1]壬烷的餾分(保留時間10.77分鐘)并合并(放射化學(xué)純度＞97％)。向合并的餾分中加入硫代硫酸鈉溶液(50％w/v，50μl)以穩(wěn)定樣品，之后減壓除去有機(jī)溶劑。冷凍干燥所得水溶液，余下白色殘留物，將其重新溶解于乙醇/水(體積比2∶1，15ml)中，得到純化的3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮雜二環(huán)[3.3.1]壬烷的儲備液(881.7MBq；放射化學(xué)純度97.5％)。由質(zhì)譜測定摩爾比放射性，為2941.5GBq/mmol。
實(shí)施例2-hERG結(jié)合測試方法規(guī)程測試板96-孔聚丙烯板(Costar C3600)Whatman GF/B濾板(Packard(6005177N))測試和洗滌緩沖液10mM HEPES130mM NaCl5mM KCl1mM EGTA0.8mM MgCl2pH 7.4的NaOHGF/B板涂敷溶液0.3％(v/v)聚氮丙啶(polyethylenimine)
0.2％(w/v)BSA在采集之前，GF/B濾板在涂敷溶液中預(yù)先浸泡最少20分鐘。
膜用于測試的膜按照如下制備使用標(biāo)準(zhǔn)的方法培養(yǎng)HEK(人胚腎)細(xì)胞以提供所需的數(shù)量，然后收集并沉淀。在無血清培養(yǎng)基中制備最終的沉淀并測量壓緊細(xì)胞體積(pcv)。
將該沉淀物再次懸浮于4倍pcv體積的低滲緩沖液(3份水∶1份無血清介質(zhì)或緩沖液)中，其中加入了1片/50ml Boehringer蛋白酶抑制劑(目錄號1697498)。
讓細(xì)胞在冰上膨脹兩三分鐘，然后使用Polytron組織勻漿器(設(shè)置在22,000rpm)使細(xì)胞裂解。所述細(xì)胞懸浮液保持在冰中，使Polytron勻漿器加速、然后關(guān)閉并在重復(fù)之前使其冷卻30秒。通常3次猝發(fā)足以完全地裂解細(xì)胞。顯微鏡檢查樣品以確保完全裂解，如果需要重復(fù)該程序。
將10ml冷的41％蔗糖的緩沖溶液加入38ml Beckman超離心管(目錄號344058)中。將已裂解的膜溶液小心地覆蓋到所述41％緩沖液上。用緩沖液將可能粘貼在側(cè)壁上的任何碎片從Polytron管中沖洗下來。向超離心管中加入冷緩沖液以完全裝滿該管(這是防止在離心期間離心管破裂)。使用具有在800rpm制動的SW-28甩平式轉(zhuǎn)子，在@4℃、28,000rpm下離心1小時。
觀察到膜是處于在蔗糖/緩沖液界面上的白色帶狀物。棄去緩沖液的上層，然后采集帶有盡可能少量蔗糖的所有膜帶并將其加入新的離心管中。用至少3倍體積的含有蛋白酶抑制劑的冰冷的緩沖液對其進(jìn)行充分地稀釋和混合。在4℃、23,000rpm下離心20分鐘并在0轉(zhuǎn)下停止。
棄去上清液，在冰上以1×108細(xì)胞當(dāng)量/ml將粒狀沉淀物再次懸浮于測試緩沖液+蛋白酶抑制劑中。然后等分該制備物并冷凍至-80℃或更低。
測試時，將所述膜溶液稀釋65倍，例如0.5mL膜稀釋至32.5mL測試緩沖液/測試板。3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮雜二環(huán)[3.3.1]壬烷的總結(jié)合率不超過總加入量的10％。
放射性標(biāo)記根據(jù)上述規(guī)程制得3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮雜二環(huán)[3.3.1]壬烷并加入67％(v/v)乙醇、33％(v/v)的含3.3mg/mL硫代硫酸鈉的水中。這些研究中所用的放射性標(biāo)記的比放射性為2941.5GBq/mmol(79.5Ci/mmol)并且其濃度為20μM。將該儲備放射性標(biāo)記稀釋2000倍至10nM并每孔加入20μL至最終測試體積為200μL，得到最終放射性配體濃度為1nM。
總結(jié)合在沒有競爭配體的情況下，在載體對照物存在下定義總結(jié)合。在該種情況下，其是1％(v/v)DMSO(20μL/孔，來自10％(v/v)DMSO測試緩沖液的儲備液)。
NSB通過在10μM阿司咪唑(20μL/孔，來自10％(v/v)DMSO測試緩沖液中的100μM儲備液)存在下，測量3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮雜二環(huán)[3.3.1]壬烷的結(jié)合量來確定非特異結(jié)合。
測試化合物將測試化合物溶解于DMSO中制成濃度為10mM的儲備液。通常每板測試至多7個化合物并帶有內(nèi)標(biāo)。使用8道移液器在96孔板中將它們同時稀釋。將化合物連續(xù)在DMSO中稀釋至待使用的最終測試濃度的100倍，所述最終測試濃度通常為3mM-30μM的半對數(shù)單位。這可以通過將30μL的每個連續(xù)稀釋液加入96孔板中的65μL DMSO中而實(shí)現(xiàn)。進(jìn)一步的稀釋按照如下在測試緩沖液中進(jìn)行用測試緩沖液將化合物稀釋10倍，得到化合物在10％DMSO中的5個濃度。然后將20μL的每種稀釋液加入測試板中。當(dāng)加入其它添加物時，使得總體積為200μL并且最終DMSO濃度為1％(v/v)。
測試標(biāo)準(zhǔn)匹莫齊特(一種hERG-活性化合物)被用作測試標(biāo)準(zhǔn)。其pIC50為7.7±0.1(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝7，范圍7.5-8.0)。該化合物制成10mM的DMSO中的儲備液并在-20℃等分冷凍以用于每次試驗(yàn)。在每個測試板中測試一個標(biāo)準(zhǔn)化合物。
測試方法在Costar聚丙烯圓底96孔板中進(jìn)行測試。每個測試板含有用于總結(jié)合和非特異結(jié)合的對照。通常，以5個對數(shù)級稀釋液，一式兩份地測試化合物。這使得每個測試板可測試八個化合物。一般在30μM-0.3μM的范圍內(nèi)測試化合物。
在表1中匯總了向每個測試板中加入的物質(zhì)表1測試板孔中所含物質(zhì)

在加入所有的添加物之后，將該板放在板振蕩器上1分鐘進(jìn)行混合。然后在室溫(18-20℃)培養(yǎng)該板3小時。在此期間，將用于每個測試板的一個GF/B板浸漬在涂敷溶液中。培養(yǎng)之后，使用Tomtec采集器采集測試孔中的內(nèi)容物并洗滌7次，每次循環(huán)使用大約250μL洗滌緩沖液(總共1750μL)。所述板的布局(layout)轉(zhuǎn)換至采集器中，由此測試板中的孔A1被采集到了GF/B板的孔A12。
將20μL的10nM 3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮雜二環(huán)[3.3.1]壬烷加入干燥濾板中以測定加入測試孔中的總放射性。該板要么在58℃的烘箱中干燥2小時，要么室溫放置過夜干燥。在每個板下部粘上底部密封，并向每個濾板中加入50μL/孔Microscint 0。向每個板加上頂部密封，使用Packard TopCount沿著倒轉(zhuǎn)的板方向，在[3H]測定條件下測定放射活性，其中沿著倒轉(zhuǎn)的板方向能夠校正過濾期間產(chǎn)生的轉(zhuǎn)換的布局。
數(shù)據(jù)分析計算總的結(jié)合、非特異結(jié)合和加入的總[3H]的平均CPM值。還計算每個濃度的測試化合物的平均CPM值并且減去平均NSB。以平均CPM對應(yīng)測試化合物的濃度繪制濃度-效應(yīng)曲線。然后測定pIC50值。
結(jié)果3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮雜二環(huán)[3.3.1]壬烷以高親和力與來自hERG-轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的膜可逆性結(jié)合(Kd 0.91±0.01nM；Bmax23.1±0.4pmol/mg蛋白質(zhì)；平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝3)。
對于競爭性置換測試，使用1nM的放射性配體濃度，它提供了相對于非特異結(jié)合10倍的結(jié)合范圍，并證實(shí)具有可逆的、單位點(diǎn)結(jié)合特性。
與已公開的[3H]-多非利特數(shù)據(jù)比較3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮雜二環(huán)[3.3.1]壬烷被以前描述的作為hERG通道阻滯劑的一類化合物從hERG-轉(zhuǎn)染的HEK膜上完全置換掉。
表2使用3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮雜二環(huán)[3.3.1]壬烷和[3H]-多非利特(Finlayson等人)在hERG-轉(zhuǎn)染的HEK膜上進(jìn)行競爭性結(jié)合測試而得到的已知hERG通道阻滯劑的pIC50值的比較(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n≥4)。

這些化合物的pIC50值與使用輝瑞的多非利特作為放射性配體所觀測到的已公開數(shù)據(jù)非常一致(表2；數(shù)據(jù)來自Finlayson等人)。這一相關(guān)性與下述觀點(diǎn)相一致即3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮雜二環(huán)[3.3.1]壬烷占據(jù)與許多已知與hERG通道相互作用的藥物所占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)類似的結(jié)合位點(diǎn)。
已知的hERG阻滯劑的電生理學(xué)數(shù)據(jù)的比較3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮雜二環(huán)[3.3.1]壬烷結(jié)合pIC50值與那些hERG通道阻滯劑的電生理學(xué)pIC50值之間的比較顯示出，該結(jié)合測試方法可預(yù)測將會與所述通道發(fā)生功能性相互作用的那些化合物(表3)。
表3.使用3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮雜二環(huán)[3.3.1]壬烷進(jìn)行競爭性結(jié)合測試和電生理學(xué)而得到的已知hERG通道阻滯劑的pIC50值的比較。

候選化合物的電生理學(xué)數(shù)據(jù)比較在3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮雜二環(huán)[3.3.1]壬烷結(jié)合測試中對代表不同結(jié)構(gòu)類型的化合物進(jìn)行篩選。這些數(shù)據(jù)與來自電生理學(xué)研究的功能性pIC50數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，顯示出大多數(shù)化合物在結(jié)合測試中比電生理學(xué)測試中活性低3至10倍。但是，在結(jié)合測試中檢測到所有化合物的功能性活性均大于10微摩。
標(biāo)準(zhǔn)化合物的數(shù)據(jù)表明該結(jié)合測試方法適合用于考查通道阻滯劑的SAR。與標(biāo)準(zhǔn)物相反，當(dāng)處理的對象化合物是通常是效力低很多的化合物時，在該測試方法的靈敏度之內(nèi)不能得到清楚的SAR。
該測試方法清楚地提供了一種快速、早期檢測對象化合物與hERG通道相互作用能力的便利方法。
結(jié)論本發(fā)明已經(jīng)提供了一種簡單、有力的放射性配體-結(jié)合測試方法，該方法可鑒別不同結(jié)構(gòu)類型的hERG結(jié)合活性。
對于大多數(shù)化合物而言，結(jié)合測試中的活性低于電生理學(xué)確定的活性，但這兩種篩選方法間的總正相關(guān)性確保了在功能性篩選中具有顯著活性的化合物類型將能在結(jié)合測試中檢測出。該結(jié)合測試方法可用于檢測能導(dǎo)致QT延長的化合物類型。
該結(jié)合測試方法適合用作初級hERG篩選，使需要電生理學(xué)測試的化合物的數(shù)量降低到最低。
參考文獻(xiàn)1)Chadwick C.，等，Identification of a specific ligand for the cardiacrapidly activating delayed rectifier K+current.Circ.Res.(1993)72707-714.
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3)Kang J.，等，High affinity blockade of the hERG cardiac K+channel bythe neuroleptic pimozide.Eur.J.Pharmacol.(2000)392137-140.
4)Suessbrich H.，等，The inhibitory effect of the antipsychotic drughaliperidol on hERG potassium channels expressed in Xenopus oocytes.BritishJournal of Pharmacol.(1997)120968-974.
上述說明書中提及的所有出版物和所述出版物中引用的參考文獻(xiàn)在本說明書中作為參考文獻(xiàn)引入。在不脫離本發(fā)明范圍和精神的前提下，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員對本發(fā)明所述方法和體系作出各種改進(jìn)和變化將是顯而易見的。雖然本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合具體優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行描述，但應(yīng)理解的是如權(quán)利要求所要求的本發(fā)明不應(yīng)過分局限于這些具體實(shí)施方案。實(shí)際上，為實(shí)施本發(fā)明而描述的實(shí)施方式的各種改進(jìn)也包括在下述權(quán)利要求的范圍內(nèi)，所述改進(jìn)對于化學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員而言是顯而易見的。
權(quán)利要求
1.具有式I并包含至少一個放射性標(biāo)記的化合物或其鹽、水合物或溶劑化物 式I。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物在間位包含至少1、2或3個氚取代基。
3.式II化合物 式II或其鹽。
4.一種鑒定作為IKr通道阻滯劑的化合物的活性的測試方法，其包括下述步驟a)在存在或不存在測試化合物的情況下，在式II化合物存在下，培養(yǎng)含有IKr通道的細(xì)胞膜；b)在存在或不存在測試化合物的情況下，測定特異性結(jié)合的標(biāo)記化合物；c)計算測試化合物對標(biāo)記化合物結(jié)合的抑制作用。
5.權(quán)利要求4的測試方法，其包括步驟a)制備一或多個濃度的測試化合物溶液；b)將式II化合物與含有IKr通道的細(xì)胞膜混合；c)用式II化合物與含有IKr通道的細(xì)胞膜的混合物與測試化合物溶液孵育；d)從溶液中分離出膜并測定該膜的放射性；e)計算在測試化合物存在的樣品相比于不存在測試化合物的對照物的放射性。
6.權(quán)利要求4或5的測試方法，其中IKr通道是人ERG。
7.權(quán)利要求6的測試方法，其中所述細(xì)胞膜是來自人ERG基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。
8.權(quán)利要求7的測試方法，其中所述細(xì)胞系是HEK。
9.式II化合物在鑒定一種或多種候選化合物的IKr通道阻滯劑活性的測試方法中的用途。
10.權(quán)利要求9的用途，其中所述測試方法是競爭性結(jié)合測試方法。
11.一種制備權(quán)利要求3所定義的式II化合物的方法，所述方法包括在(1，5-環(huán)辛二烯)二(甲基二苯基-膦)銥(I)六氟磷酸鹽存在下，氚化3，7-二[2-(4-硝基苯基)乙基]-3，7-二氮雜二環(huán)[3.3.1]壬烷。
12.權(quán)利要求11要求保護(hù)的方法，其中3，7-二[2-(4-硝基苯基)乙基]-3，7-二氮雜二環(huán)[3.3.1]壬烷和(1，5-環(huán)辛二烯)二(甲基二苯基-膦)銥(I)六氟磷酸鹽溶解于二氯甲烷中。
13.權(quán)利要求11或12所述的方法，其中使用氚化反應(yīng)槽進(jìn)行氚化。
14.基本上如本說明書中所述的式II化合物的制備方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種被標(biāo)記的配體化合物，該化合物有用于鑒別、測試和/或篩選調(diào)節(jié)離子通道、尤其是諸如那些由ERG(包括hERG)編碼的心肌Ikr通道的化合物的方法。因此，所述配體化合物有用于評價臨床前化合物對ERG鉀通道的親和力。所述配體化合物是具有式I并包含至少一個放射性標(biāo)記的化合物或其鹽、水合物或溶劑化物。
文檔編號A61P9/00GK1871516SQ200480030753
公開日2006年11月29日 申請日期2004年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月20日
發(fā)明者布賴恩·斯普林索普, 格特·斯特蘭隆 申請人:阿斯利康(瑞典)有限公司