專利名稱：抑制分泌酶活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制分泌酶活性的方法和藥物組合物。具體來說，涉及通過抑制Synoviolin的表達(dá)，促進(jìn)分泌酶抑制劑的感受性，來抑制分泌酶活性的方法；以及通過使Synoviolin與Herp結(jié)合來抑制分泌酶活性的方法；以及含有抑制分泌酶活性的物質(zhì)的藥物組合物。
背景技術(shù)：
Synoviolin是作為存在于來自類風(fēng)濕病患者的滑膜細(xì)胞中的膜蛋白質(zhì)而被發(fā)現(xiàn)的新型蛋白質(zhì)(WO02/05207)。通過使用基因變異動物進(jìn)行的研究，表明該因子與骨·關(guān)節(jié)的發(fā)生和關(guān)節(jié)病的發(fā)病直接相關(guān)，因此，可認(rèn)為Synoviolin是對正常的骨形成或四肢的發(fā)育有貢獻(xiàn)的蛋白質(zhì)。
Synoviolin的表達(dá)不僅在骨·關(guān)節(jié)中，在全身可見其遍在，因此為了分析Synoviolin在生物體內(nèi)的功能，對于與Synoviolin結(jié)合的因子的探究成為有力的方法。特別是檢測Synoviolin的底物蛋白，這是鑒定Synoviolin相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要手段。
因此，本發(fā)明人為了了解Synoviolin參與了怎樣的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，通過以Synoviolin作為誘餌(Bait)的酵母雙雜交(Yeast TwoHybrid)法，進(jìn)行與Synoviolin結(jié)合的因子的探究。結(jié)果，鑒定出被稱為Herp(高半胱氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的遍在蛋白樣結(jié)構(gòu)域成員1，homocysteine-indusible endoplasmic reticulum stress-indusibleubiquitin-like domain member 1)的蛋白質(zhì)是與Synoviolin具有相互作用的分子。Herp是1996年由Miyata等人作為血管內(nèi)皮細(xì)胞中高半胱氨酸應(yīng)答型基因產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)(Kokame K，Kato H，Miyata T.Homocysteine respondent Genes in Vascular Endothelial CellsIdentified by Differential Display Analysis.J.Biol.Chem.1996 Nov22；271(47)29659-29665)。
之后的研究表明Herp是其表達(dá)受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的誘導(dǎo)，結(jié)構(gòu)上在N末端一側(cè)具有遍在蛋白樣結(jié)構(gòu)域(UBL，ubiquitin-like domain)的膜蛋白質(zhì)(Kokame K，Agarwala KL，Kato H，Miyata T.Herp，a NewUbiquitin-like Membrane Protein Induced by Endoplasmic ReticulumStress.J.Biol.Chem.2000 Oct 20；275(42)32846-32853)。還有報道稱Herp與被視為家族性阿爾茨海默病(FAD)的病因基因的早老蛋白(presenilinPS)具有相互作用，可提高與β-淀粉樣蛋白(Aβ)的膜內(nèi)切斷有關(guān)的蛋白質(zhì)分解酶—γ-分泌酶(γ-secretase)的活性(SaiX，Kawamura Y，Kokame K，Yamaguchi H，Shiraishi H，Suzuki R，Suzuki T，Kawaichi M，Miyata T，Kitamura T，Strooper BD，Yanagisawa K，Komano H.J.Biol.Chem.277(15)12915-12920)。
在老齡化日趨嚴(yán)重的現(xiàn)代，阿爾茨海默病是受到高度關(guān)心的疾病之一。其最重要的特征就是在腦中可觀察到老年斑，即纖維狀β-淀粉樣蛋白(Aβ)的沉淀。β蛋白是淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)被β-分泌酶和γ-分泌酶切斷而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，阿爾茨海默病患者中，該切斷增加。
因此，抑制分泌酶的酶活性的物質(zhì)作為阿爾茨海默病的治療藥物而受到人們的重視，世界各地均在進(jìn)行篩選。
但是，雖然得到了幾種候選物質(zhì)，但分泌酶抑制劑的開發(fā)尚未成功。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供用于治療腦神經(jīng)疾病，特別是阿爾茨海默病的有用的藥物。
本發(fā)明人為解決上述課題進(jìn)行了深入地研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)著眼于抑制分泌酶活性的物質(zhì)，如果使用該物質(zhì)，則可抑制Aβ的蓄積，治療阿爾茨海默病，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明如下所示。
(1)藥物組合物，其含有抑制分泌酶活性的物質(zhì)。
(2)(1)的藥物組合物，其中分泌酶是β-分泌酶或γ-分泌酶。
(3)(1)或(2)的藥物組合物，其中抑制分泌酶活性的物質(zhì)是促進(jìn)分泌酶抑制劑感受性的物質(zhì)。
(4)(3)的藥物組合物，其中促進(jìn)分泌酶抑制劑感受性的物質(zhì)是抑制Synoviolin表達(dá)的物質(zhì)。
(5)(4)的藥物組合物，其中抑制Synoviolin表達(dá)的物質(zhì)是針對編碼Synoviolin的基因的siRNA或shRNA。
(6)(5)的藥物組合物，其中編碼Synoviolin的基因含有SEQ IDNO.1所示的堿基序列。
(7)(5)的藥物組合物，其中siRNA以SEQ ID NO.1所示的堿基序列中的部分序列為靶。
(8)(7)的藥物組合物，其中部分序列為選自SEQ ID NO.3-16所示堿基序列的至少一種序列。
(9)(1)或(2)的藥物組合物，其中抑制分泌酶活性的物質(zhì)是Synoviolin。Synoviolin例如是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的物質(zhì)。
(10)(1)-(9)中任一項的藥物組合物，該藥物組合物用于治療腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
(11)(10)的藥物組合物，其中腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病是阿爾茨海默病。
(12)抑制分泌酶活性的方法，其特征在于促進(jìn)分泌酶抑制劑的感受性。
(13)(12)的方法，其中分泌酶抑制劑的感受性的促進(jìn)通過抑制Synoviolin的表達(dá)來實現(xiàn)。
(14)抑制分泌酶活性的方法，其特征在于使Synoviolin與Herp結(jié)合。
(15)(14)的方法，其中Herp與Synoviolin的結(jié)合區(qū)域是Herp的氨基酸序列第161-200號氨基酸殘基所示的區(qū)域。
(16)(12)-(15)中任一項的方法，其中分泌酶是β-分泌酶或γ-分泌酶。


圖1是表示Synoviolin的全長結(jié)構(gòu)和用于誘餌的Syno dTM和SynoRing的結(jié)構(gòu)的示意圖。
圖2是表示Herp的全長結(jié)構(gòu)和片段化的Herp結(jié)構(gòu)的示意圖。
圖3是表示Flag-Syno dTM與Herp各構(gòu)成的GST融合蛋白的結(jié)合實驗的結(jié)果圖。
圖4是表示HA/Syno和Flag/Herp的免疫沉淀實驗的結(jié)果的圖。
圖5是表示野生型和Synoviolin缺失小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中γ-分泌酶抑制劑的效果的圖。
圖6是表示pull-down assay中的Synoviolin與Herp的關(guān)系的圖。
圖7是表示體內(nèi)Synoviolin與Herp的結(jié)合區(qū)域的圖。
圖8A是表示MEF細(xì)胞中Herp的表達(dá)的圖。
圖8B是表示Herp遍在蛋白化的圖。
圖8C是表示Herp分析中所使用的構(gòu)成的圖。
圖9是表示MEF中的γ-分泌酶活性的圖。
具體實施例方式
下面詳細(xì)說明本發(fā)明。
本發(fā)明人著眼于Synoviolin與阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)理相關(guān)的可能性，明確了在敲除了Synoviolin表達(dá)的細(xì)胞中，分泌酶抑制劑的感受性提高。這意味著在使Synoviolin的表達(dá)受到抑制的狀態(tài)下，分泌酶抑制劑的感受性得到促進(jìn)，顯示通過Synoviolin的缺失，分泌酶抑制劑的感受性得到促進(jìn)。驗證了使用促進(jìn)分泌酶抑制劑的感受性的物質(zhì)與阿爾茨海默病的治療有關(guān)。
另外，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，使Synoviolin與Herp蛋白結(jié)合，則Herp蛋白質(zhì)被遍在蛋白化，被降解，結(jié)果，分泌酶活性降低。
1.概要如上所述，阿爾茨海默病中，APP被分泌酶(例如γ-分泌酶活性)切下，Aβ蓄積，形成老年斑。因此本發(fā)明人著眼于分泌酶與阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)理相關(guān)這一點(diǎn)，考慮構(gòu)建以下方法通過抑制分泌酶活性來抑制Aβ的蓄積以及老年斑的形成。
因此，本發(fā)明的特征在于通過抑制分泌酶活性來抑制Aβ的蓄積。并通過抑制Aβ的蓄積來抑制老年斑的形成，從而可進(jìn)行阿爾茨海默病的治療。
Synoviolin是在全身可見其表達(dá)的蛋白質(zhì)，顯示在生物體中承擔(dān)著必須的功能。因此需要了解Synoviolin在生物體內(nèi)的功能。通常，為了明確蛋白質(zhì)的功能，探究與Synoviolin結(jié)合的因子是有力的方法之一，特別是檢測Synoviolin的底物蛋白，被認(rèn)為是對Synoviolin參與的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行鑒定的重要手段。
因此，為了了解Synoviolin參與了哪些細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，如前所述，本發(fā)明人通過酵母內(nèi)的結(jié)合實驗和GST Pull-down assay，顯示出Synoviolin與Herp具有相互作用。接著，為了確認(rèn)在細(xì)胞內(nèi)的相互作用，使Synoviolin與Herp在HEK293細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)，并通過免疫沉淀來觀察，結(jié)果與酵母內(nèi)·體外測定的結(jié)果同樣可見Synoviolin與Herp的相互作用。這都說明Synoviolin與Herp相互作用。通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測系統(tǒng)，顯示出Synoviolin上存在環(huán)指(RING finger)基序。已知該基序存在于與蛋白質(zhì)分解有關(guān)的E3遍在蛋白-蛋白連接酶中。另外，環(huán)指基序被認(rèn)為是E2遍在蛋白結(jié)合酶的結(jié)合部位。
因此，可認(rèn)為Synoviolin與阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)理、特別是分泌酶活性有關(guān)。
這里，本發(fā)明中認(rèn)為作為抑制分泌酶活性的機(jī)理有兩種情況促進(jìn)分泌酶抑制劑的感受性的情況、和使Synoviolin與Herp蛋白(以下簡稱為“Herp”)結(jié)合的情況。
前者是通過促進(jìn)分泌酶抑制劑的感受性來抑制分泌酶的活性，抑制Aβ的蓄積；后者是使Synoviolin與Herp結(jié)合，引起Herp的遍在蛋白化，分解Herp，從而抑制Aβ的蓄積。
以下對各方式進(jìn)行說明。
2.分泌酶抑制劑的感受性的促進(jìn)本發(fā)明人著眼于分泌酶抑制劑的感受性，考慮構(gòu)建以下方法通過提高該抑制劑的感受性來抑制Aβ的蓄積和老年斑的形成。另外還著眼于Synoviolin與阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)理有關(guān)的可能性，明確了在敲除了Synoviolin表達(dá)的細(xì)胞中，分泌酶抑制劑的感受性得到提高。這意味著在抑制Synoviolin表達(dá)的狀態(tài)下，分泌酶抑制劑的感受性得到促進(jìn)，顯示通過Synoviolin的缺失，分泌酶抑制劑的感受性得到促進(jìn)。驗證了使用促進(jìn)分泌酶抑制劑的感受性的物質(zhì)與阿爾茨海默病的治療有關(guān)。
這里，“促進(jìn)分泌酶抑制劑的感受性”是指提高分泌酶抑制劑的藥物效果，使之有效發(fā)揮功能。
(1)Synoviolin表達(dá)抑制和活性抑制為了提高分泌酶抑制劑的感受性，采用抑制Synoviolin表達(dá)的方法。
對于Synoviolin表達(dá)的抑制并沒有特別限定，例如可利用RNA干擾(RNAi)?？稍O(shè)計及合成針對Synoviolin基因的siRNA(小干擾RNA，smallinterfering RNA)，將其導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，從而引起RNAi。
RNAi是dsRNA(雙鏈RNA)與靶基因特異性且選擇性地結(jié)合，通過切斷該靶基因來有效地抑制其表達(dá)的現(xiàn)象。例如將dsRNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，則與該RNA同源序列的基因的表達(dá)受到抑制(敲除)。
siRNA的設(shè)計可如下進(jìn)行。
(a)只要是編碼Synoviolin的基因即可，沒有特別限定，任何區(qū)都可作為候選。例如為人時，可以以GenBank Accession numberAB024690(SEQ ID NO.1)的任意區(qū)作為候選。
(b)從所選擇的區(qū)中選擇由AA起始的序列，該序列的長度為19-25個堿基，優(yōu)選19-21個堿基?？梢赃x擇其序列的GC含量例如為40-60％的序列。具體來說，可在SEQ ID NO.1所示的堿基序列中使用含有以下堿基序列的DNA作為siRNA的靶序列。特別優(yōu)選以(i)(SEQID NO.3)、(ii)(SEQ ID NO.4)、(vi)(SEQ ID NO.8)、(vii)(SEQ ID NO.9)、(viii)(SEQ ID NO.10)為靶。
(i)AA TGTCTGCATCATCTGCCGA GA (SEQ ID NO.3)(ii)AA GCTGTGACAGATGCCATCA TG (SEQ ID NO.4)(iii)AA AGCTGTGACAGATGCCATC AT (SEQ ID NO.5)(iv)AA GAAAGCTGTGACAGATGCC AT (SEQ ID NO.6)(v)AA GGTTCTGCTGTACATGGCC TT (SEQ ID NO.7)(vi)AA CAAGGCTGTGTACATGCTC TA (SEQ ID NO.8)(vii)AA ATGTTTCCACTGGCTGGCT GA (SEQ ID NO.9)(viii)AA GGTGTTCTTTGGGCAACTG AG (SEQ ID NO.10)(ix)AA CATCCACACACTGCTGGAC GC (SEQ ID NO.11)(x)AA CACCCTGTATCCAGATGCC AC (SEQ ID NO.12)(xi)AA GGTGCACACCTTCCCACTC TT (SEQ ID NO.13)(xii)AA TGTTTCCACTGGCTGGCTG AG(SEQ ID NO.14)(xiii)AA GAGACTGCCCTGCAACCAC AT (SEQ ID NO.15)(xiv)AA CGTTCCTGGTACGCCGTCA CA (SEQ ID NO.16)
將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞時，可以采用將體外合成的siRNA與質(zhì)粒DNA連接，將其導(dǎo)入細(xì)胞的方法，以及將2條RNA退火的方法等。
另外，為了產(chǎn)生RNAi效果，本發(fā)明也可以使用shRNA。shRNA被稱為短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA)，是單鏈的一部分區(qū)與其它區(qū)形成互補(bǔ)鏈，因而具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA分子。
shRNA可以設(shè)計成其一部分形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。例如以某一區(qū)的序列為序列A，以與序列A互補(bǔ)的鏈為序列B，則設(shè)計成這些序列以序列A、間隔、序列B的順序存在于一根RNA鏈上，全體為45-60個堿基的長度。序列A是成為靶的Synoviolin基因(SEQ ID NO.1)的一部分區(qū)的序列，對于靶區(qū)域沒有特別限定，可以以任意區(qū)域作為候選。另外，序列A的長度為19-25個堿基，優(yōu)選19-21個堿基。
(2)分泌酶抑制活性作為評價分泌酶抑制劑的感受性的方法，在阿爾茨海默病患者的腦中進(jìn)行感受性測定試驗，這在倫理上是極為困難的，必須采用其它評價系統(tǒng)。因此，本發(fā)明人采用對細(xì)胞處置分泌酶抑制劑，以該細(xì)胞的增殖活性作為分泌酶抑制的指標(biāo)的評價系統(tǒng)。這里，分泌酶的種類沒有特別限定，有β-分泌酶、γ-分泌酶。因此，分泌酶抑制劑可以是β-分泌酶抑制劑和γ-分泌酶抑制劑的任意一種。分泌酶抑制劑沒有特別限定，例如有L-685，458((株)ペプチド研究所)、(3，5-二氟苯基乙?；?-Ala-Phg-Obut[DAPT]((株)ペプチド研究所)、Lys-Thr-Glu-Glu-Ile-Ser-Glu-Val-Asn-Sta-Val-Ala-Glu-Phe((株)ペプチド研究所)、Z-Leu-Leu-Nle-CHO(Wako公司)等。
細(xì)胞的增殖活性受到抑制時，則判斷為分泌酶活性受到抑制。即，細(xì)胞的增殖活性越受到抑制，分泌酶抑制劑的作用、感受性越強(qiáng)。細(xì)胞使用具有野生型Synoviolin基因的小鼠、以及敲除了Synoviolin基因的Synoviolin缺失小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)，通過Synoviolin表達(dá)的有無來比較分泌酶抑制劑的感受性的變化。
使用上述Synoviolin缺失細(xì)胞研究抑制劑的效果，結(jié)果缺失Synoviolin的細(xì)胞與具有Synoviolin的野生型細(xì)胞相比，可見細(xì)胞增殖降低。即意味著如果缺失Synoviolin，則分泌酶抑制劑的感受性得到促進(jìn)。
(3)藥物組合物本發(fā)明中制備的shRNA、siRNA是抑制Synoviolin表達(dá)的物質(zhì)，可用作含有促進(jìn)分泌酶抑制劑感受性的物質(zhì)的藥物組合物(特別是阿爾茨海默病等腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療藥)。
使用本發(fā)明的藥物組合物作為腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療藥物時，以腦(大腦、間腦、中腦、小腦)、延髓、脊髓等中樞神經(jīng)系統(tǒng)為對象進(jìn)行使用。
上述腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病可以是單獨(dú)一種，也可以并發(fā)。
使用本發(fā)明的藥物組合物作為基因治療劑時，除了將本發(fā)明的藥物組合物通過注射直接給藥的方法之外，還可以是給予摻入了核酸的載體的方法。上述載體有腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、皰疹病毒載體、痘苗病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體等，通過使用這些病毒載體，可以有效地給藥。
另外，還可以將本發(fā)明的藥物組合物導(dǎo)入脂質(zhì)體等磷脂小胞體，給予該小胞體。通過脂轉(zhuǎn)染法將保有siRNA或shRNA的小胞體導(dǎo)入給定的細(xì)胞中。將所得細(xì)胞全身給予如靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)等。也可以是腦等局部給藥。
本發(fā)明的藥物組合物的給藥量根據(jù)年齡、性別、癥狀、給藥途徑、給藥次數(shù)、劑型而不同，例如腺病毒時，給藥量每天一次，為106-1013個左右，間隔1周-8周給藥。
為了將siRNA或shRNA導(dǎo)入目標(biāo)組織或器官，也可以使用市售的基因?qū)朐噭┖?例如アデノエクスプレスクロ-ンテツク公司)。
3.Synoviolin與Herp的結(jié)合如上所述，已知Herp是其表達(dá)受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)，結(jié)構(gòu)上在N末端一側(cè)具有UBL的貫穿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的蛋白質(zhì)，細(xì)胞內(nèi)源性的Herp被多遍在蛋白化。本發(fā)明人著眼于該Herp，考慮構(gòu)建以下方法通過降解該Herp來抑制γ-分泌酶活性、抑制Aβ的膜內(nèi)切斷，從而抑制Aβ的蓄積以及老年斑的形成。
另一方面，如上所述，通過以Synoviolin為誘餌的酵母雙雜交法進(jìn)行與Synoviolin結(jié)合的因子的探究，結(jié)果顯示Synoviolin與Herp具有相互作用，該相互作用在細(xì)胞內(nèi)也可觀察到。因此，本發(fā)明人研究了通過使Synoviolin與Herp結(jié)合來抑制分泌酶活性的方法。
(1)Synoviolin與Herp的最小結(jié)合部位的確定使用Herp的各種切斷片段，通過進(jìn)行該片段與Synoviolin的結(jié)合實驗，可以確定Synoviolin與Herp的最小結(jié)合部位。使用Herp進(jìn)行與Synoviolin的結(jié)合實驗時，Herp與Synoviolin的最小結(jié)合部位為由人Herp基因(SEQ ID NO.17)編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO.18)中的第161-200號的40個氨基酸殘基的區(qū)域(下述序列)。
GYTPYGWLQLSWFQQIYARQYYMQYLAATAASGAFVPPPS(SEQ ID NO.19)其中，本發(fā)明中所使用的Synoviolin可以具有由上述SEQ ID NO.1編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)，另外，也可以是該氨基酸序列中有1個或數(shù)個氨基酸缺失、置換或附加而成的氨基酸序列并具有通過遍在蛋白化使Herp分解的活性。本發(fā)明中，上述缺失、置換等變異的導(dǎo)入可通過公知的定點(diǎn)誘變法進(jìn)行，例如可使用GeneTailorTMSite-Directed Mutagenesis System(Invitrogen公司制造)、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K、Mutan-Super Express Km等(Takara公司制造)。
鑒定培養(yǎng)細(xì)胞中與Synoviolin結(jié)合所必需的Herp蛋白質(zhì)區(qū)域時，可如下進(jìn)行。
關(guān)于人Herp，制備缺失上述40個氨基酸殘基區(qū)的Herp(-bind)基因，將該基因插入到適當(dāng)?shù)妮d體中，導(dǎo)入HEK293T等細(xì)胞中，使之與Synoviolin強(qiáng)表達(dá)，則可知缺失部位是否是Synoviolin與Herp結(jié)合的必須部位。為了進(jìn)行免疫沉淀試驗，在該Herp(-bind)的N末端帶有HA標(biāo)簽(HA tag)，進(jìn)行標(biāo)記，同樣Synoviolin的標(biāo)記也可以帶FLAG標(biāo)簽。
對結(jié)果進(jìn)行分析可以在強(qiáng)表達(dá)后，提取全細(xì)胞提取物(WCE)，確認(rèn)蛋白質(zhì)的表達(dá)，在此基礎(chǔ)上用抗HA抗體或抗FLAG抗體進(jìn)行免疫沉淀。通過蛋白質(zhì)印跡法對所得免疫沉淀產(chǎn)物進(jìn)行試驗，可知Herp與Synoviolin結(jié)合，但Herp(-bind)不與Synoviolin結(jié)合，因此Herp蛋白質(zhì)上的第161號至第200號氨基酸區(qū)域(SEQ ID NO.19)是與Synoviolin結(jié)合所必須的。
(2)對通過Herp遍在蛋白化進(jìn)行的降解的確認(rèn)Herp通過與Synoviolin結(jié)合而遍在蛋白化，降解。因此，Herp是否為Synoviolin的底物，可通過Herp的多遍在蛋白化來確認(rèn)。即，HEK293T細(xì)胞中，帶有FLAG標(biāo)簽，再制備使氨基酸殘基的一部分發(fā)生變異的Herp變異體，使HA-遍在蛋白和Synoviolin表達(dá)。然后，提取細(xì)胞提取物(WCE)，通過蛋白質(zhì)印跡法確認(rèn)各蛋白質(zhì)的表達(dá)，然后通過進(jìn)行抗HA抗體的免疫沉淀，確認(rèn)Herp在細(xì)胞內(nèi)是否被多遍在蛋白(poly-Ubiquitin；Ub)化。
Herp野生型中，只使遍在蛋白強(qiáng)表達(dá)時、或者使遍在蛋白和Synoviolin同時強(qiáng)表達(dá)時，可觀察到多遍在蛋白化的條帶。另外，使遍在蛋白和Synoviolin同時強(qiáng)表達(dá)時，與只使遍在蛋白強(qiáng)表達(dá)時相比，Herp和Herp變異體的Ub化條帶弱，由此可知Ub化的Herp的降解亢進(jìn)。另一方面，Herp(-bind)中，只使遍在蛋白強(qiáng)表達(dá)的場合，以及使遍在蛋白與Synoviolin同時強(qiáng)表達(dá)的場合，均未檢測出多遍在蛋白化的條帶。另外，為由Herp缺失遍在蛋白區(qū)(UBL)而得到的Herp(-UBL)時，使遍在蛋白和Synoviolin同時強(qiáng)表達(dá)的情況與只使遍在蛋白強(qiáng)表達(dá)的情況相比，Herp(-UBL)的Ub化條帶強(qiáng)。由以上可知Herp的UBL區(qū)對于與Synoviolin的結(jié)合或通過Synoviolin進(jìn)行的Ub化不是必須的，但對于降解是必須的。
(3)MEF中的γ-分泌酶活性的比較阿爾茨海默病中Synoviolin的參與性，可通過使用敲除了Synoviolin的細(xì)胞(例如MEF(syno(-/-))，與野生型細(xì)胞(例如MEF(syno(+/+))中的γ-分泌酶活性進(jìn)行比較而研究。即，將MEF細(xì)胞用溶解緩沖液處理，制成細(xì)胞溶解液，然后加入反應(yīng)緩沖液和熒光標(biāo)記的底物，進(jìn)行酶促反應(yīng)，用給定的激發(fā)波長、測定波長測定熒光，則可以確認(rèn)MEF中γ-分泌酶活性有無增加。
本發(fā)明中，使Synoviolin與Herp結(jié)合，則Herp被降解，可以抑制γ-分泌酶的活性。另外，已知Herp與被視為FAD的病因基因的早老蛋白(presenilinPS)具有相互作用，通過形成復(fù)合物，可提高γ-分泌酶的活性。因此證實了，如果使用Synoviolin與Herp的結(jié)合體、以及Synoviolin與Herp-PS復(fù)合物的結(jié)合體，則與阿爾茨海默病的治療相關(guān)。
(4)藥物組合物本發(fā)明中，使Synoviolin與Herp或Herp-PS復(fù)合物結(jié)合，通過遍在蛋白化引起Herp的降解，繼而抑制成為阿爾茨海默病病因的Aβ蛋白質(zhì)的蓄積，因此，Synoviolin是與分泌酶活性的抑制相關(guān)的物質(zhì)，可以作為用于治療阿爾茨海默病等腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物使用。
使用本發(fā)明的藥物組合物作為腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療藥物時，以腦(大腦、間腦、中腦、小腦)、延髓、脊髓等中樞神經(jīng)系統(tǒng)為對象進(jìn)行使用。本發(fā)明的藥物組合物可以直接用于患處，也可以通過所有的公知方法、例如靜脈、肌肉、腹腔內(nèi)或皮下等的注射，或者由鼻腔、口腔或肺的吸入，口服，使用導(dǎo)管等的血管內(nèi)給藥等導(dǎo)入成為對象的細(xì)胞或臟器。
另外，例如通過冷凍等方法，使其容易處理后，可直接或與賦型劑、增量劑、粘合劑、潤滑劑等公知的藥學(xué)上可接受的載體，公知的添加劑(包含緩沖劑、等滲劑、螯合劑、著色劑、防腐劑、香料、風(fēng)味劑、甜味劑等)等混合。
本發(fā)明的藥物組合物可根據(jù)片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、丸劑、液體制劑、糖漿劑等口服給藥制劑，注射劑、外用劑、栓劑、滴眼劑等非口服給藥制劑等的形式，口服給藥或非口服給藥。優(yōu)選肌肉、腹腔等的局部注射、靜脈注射等。
給藥量可根據(jù)有效成分的種類、給藥途徑、給藥對象、患者的年齡、體重、性別、癥狀及其它條件適當(dāng)選擇，作為每天的維持量，成人每1kg約為0.1mg-約100mg，優(yōu)選0.1mg-10mg，更優(yōu)選0.1mg-1.0mg。Synoviolin可以每天給藥一次，也可以分多次給藥。
使本發(fā)明的藥物組合物(Synoviolin)在生物體內(nèi)進(jìn)行基因表達(dá)并使用時(基因治療時)，與對上述基因治療藥物闡述的同樣，除通過注射直接給予Synoviolin基因的方法之外，還有給予摻入了Synoviolin基因的載體的方法。作為上述載體，有腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、皰疹病毒載體、痘苗病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體等，通過使用這些病毒載體，可以有效地給藥。
其中，本發(fā)明中使用的Synoviolin基因不僅限定為具有上述SEQID NO.1所示的堿基序列的基因，也包含在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與該堿基序列的互補(bǔ)序列雜交且編碼具有與Herp的結(jié)合活性的蛋白質(zhì)的基因?！皣?yán)謹(jǐn)條件”是指雜交過程中，漂洗時的鹽濃度為100-500mM，優(yōu)選150-300mM，溫度為50℃-70℃，優(yōu)選55-65℃的條件。
另外，也可以將Synoviolin基因?qū)胫|(zhì)體等磷脂小胞體中，給予該小胞體。通過脂轉(zhuǎn)染法將保有上述基因的小胞體導(dǎo)入給定的細(xì)胞中。另外，將所得細(xì)胞全身給予如靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)等。也可以是腦等的局部給予。
Synoviolin基因的給藥量根據(jù)年齡、性別、癥狀、給藥途徑、給藥次數(shù)、劑型而不同，例如腺病毒的場合，給藥量每天一次，為106-1013個左右，間隔1周-8周給藥。
為了將Synoviolin基因?qū)肽繕?biāo)組織或器官，也可以使用市售的基因?qū)朐噭┖?例如アデノエクスプレスクロ一ンテツク公司)。
以下，通過實施例具體說明本發(fā)明。但是本發(fā)明并不受這些實施例限定。
本實施例是通過酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行的Herp篩選的實施例。
酵母雙雜交系統(tǒng)使用MATCHMAKER系統(tǒng)(CLONTECH)，通過酵母形質(zhì)轉(zhuǎn)化法(Pro.Natl.Aca.Sci.USA，889578-9582，1991)進(jìn)行。
將從Synoviolin cDNA的706bp(第236號氨基酸)至1851bp(第617號氨基酸)、或從805bp(第269號氨基酸)至1260bp(第420號氨基酸)的末端作為EcoR I/Xho I，插入到pGBT9載體的EcoR I/XhoI位點(diǎn)(以下，將Synoviolin的706bp(第236號氨基酸)至1851bp(第617號氨基酸)稱為Syno dTM，將從805bp(第269號氨基酸)至1260bp(第420號氨基酸)稱為Syno Ring。參照圖1)。圖1中，“bp”表示堿基序列的位置編號。
Herp的篩選所使用的文庫采用將來自人軟骨的cDNA插入pACT2載體而得到的文庫(pACT2-Y)。在42℃進(jìn)行15分鐘的熱休克之后，向酵母株Y190中導(dǎo)入pGBT9-Syno dTM或pGBT9-Syno Ring(2.0μg)、pACT2-Y(20μg)。
將導(dǎo)入了各載體的Y190用Tris-EDTA(pH 7.5)緩沖液(TE)漂洗，然后在SD-Trp-Leu-His板上鋪展用TE稀釋的Y190溶液，在30℃培養(yǎng)10天。對產(chǎn)生的集落進(jìn)行以0.5mg/ml X-gal為底物的β-半乳糖苷酶濾膜測定，檢測出陽性克隆。
將陽性克隆在SD-Leu-His培養(yǎng)基中、在30℃振蕩培養(yǎng)10天，通過堿-SDS法(Methods Enzymol.，194169-182，1991)提取質(zhì)粒DNA。將提取的質(zhì)粒DNA形質(zhì)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株HB101，鋪于M9板(-Leu)，在37℃培養(yǎng)2天。將產(chǎn)生的集落在20μg/ml LB培養(yǎng)基中、在37℃振蕩培養(yǎng)16小時，通過堿-SDS法提取質(zhì)粒DNA。
使用BigDye Terminater Cycle Sequencing system(AppliedBiosystems)對插入到提取的質(zhì)粒DNA中的來自人軟骨的cDNA片段進(jìn)行分析。通過BLAST檢索測序的分析結(jié)果，結(jié)果得到了高半胱氨酸誘導(dǎo)性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)——高半胱氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的遍在蛋白樣結(jié)構(gòu)域成員1(homocysteine-indusible endoplasmic reticulumstress-indusible ubiquitin-like domain member 1)(ACCESSIONNO.BC032673，以下簡稱為Herp)。
本實施例是體外使Synoviolin與Herp結(jié)合的實施例。
制備插入了TNT-coupled Translation System(Promega)和Synoviolin的706bp至1854bp的pcDNA3-Flag-Syno dTM。使用它進(jìn)行體外翻譯，制備(i)Flag-Syno dTM融合蛋白、(ii)Herp的GST融合蛋白、(iii)片段化的Herp的GST融合蛋白(圖2)。圖2中，“a.a.”表示氨基酸序列的位置編號，UBQ表示遍在蛋白結(jié)構(gòu)域。
將這些融合蛋白和(iv)作為對照的GST蛋白質(zhì)加入到含有20mMHepes(pH 7.9)、100mM氯化鈉、1mM EDTA、0.05％吐溫、5％甘油、1mM DTT、0.2mM NaVO4、5mM NaF、1mM PMSF的結(jié)合緩沖液中，在4℃反應(yīng)16小時。對該反應(yīng)物進(jìn)行SDS-PAGE，通過圖像分析儀(BAS2000，F(xiàn)ujiix)檢測放射活性。
結(jié)果，觀察到Herp-M和Herp-C的GST融合蛋白與[35S]pcDNA3-Flag-Syno dTM的結(jié)合。
未見作為對照的GST與pcDNA3-Flag-Syno dTM的結(jié)合(圖3)。由該結(jié)果可推測Synoviolin與Herp通過蛋白質(zhì)的相互作用結(jié)合。
本實施例是體內(nèi)使Synoviolin與Herp結(jié)合的實施例。
將2×106個HEK293細(xì)胞接種于10cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24小時，然后將插入了Synoviolin的由1bp至1854bp的pcDNA3-HA/Syno、和插入了Herp的由1bp至1176bp的pcDNA3-Flag/Herp各3μg進(jìn)行基因?qū)??；驅(qū)?4小時后回收細(xì)胞，溶解于Lysis緩沖液，然后通過抗HA和抗Flag抗體在4℃下進(jìn)行過夜的免疫沉淀。通過離心操作將結(jié)合蛋白質(zhì)和游離蛋白質(zhì)分開，通過蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行檢測。檢測使用抗HA和抗Flag抗體。
結(jié)果，在Synoviolin和Herp共表達(dá)的細(xì)胞中，使用抗HA抗體進(jìn)行免疫沉淀后，用抗Flag抗體進(jìn)行檢測，則可確認(rèn)Flag-Herp的條帶。另外，使用抗Flag抗體進(jìn)行免疫沉淀后，用抗HA抗體檢測，則可確認(rèn)HA-Synoviolin的條帶。由該結(jié)果可推測與體外條件下同樣地，Synoviolin與Herp通過蛋白質(zhì)的相互作用結(jié)合(圖4)。另外，圖4中，IP表示免疫沉淀中所使用的抗體的種類，WB表示蛋白質(zhì)印跡中使用的抗體的種類。*號表示IgG HC(IgG重鏈)。
本實施例是確認(rèn)Synoviolin缺失細(xì)胞中γ-分泌酶抑制劑對細(xì)胞增殖活性的影響的實施例。
將由導(dǎo)入了Synoviolin基因的小鼠(野生型小鼠)和Synoviolin基因缺失小鼠得到的胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)接種于96孔板，使之為1×103個細(xì)胞/孔，培養(yǎng)過夜。對培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行γ-分泌酶抑制劑(Z-Leu-Leu-Nle-CHO、Wako)處理，培養(yǎng)24小時后加入AlamerBlue，2小時后測定吸光度。
結(jié)果如圖5所示。圖5中，實心柱表示來自野生型小鼠的細(xì)胞，空心柱表示來自Synoviolin缺失小鼠的細(xì)胞。來自Synoviolin缺失小鼠的細(xì)胞中，γ-分泌酶抑制劑的作用比來自野生型小鼠的細(xì)胞顯著。另外，Tuni.表示衣霉素。
由圖5可知Synoviolin缺失小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Syno-/-)中，與Synoviolin小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Syno+/+)比較，抑制γ-分泌酶活性的情況下，細(xì)胞的增殖活性也受到抑制。這意味著細(xì)胞對γ-分泌酶抑制劑的感受性根據(jù)Synoviolin的有無而變化，即如果Synoviolin缺失，則γ-分泌酶抑制劑的感受性得到促進(jìn)。因此，Synoviolin的抑制劑調(diào)節(jié)被視為阿爾茨海默病病理過程的第一階段的Aβ蓄積，由此可作為阿爾茨海默病的藥療藥物加以利用。
本實施例是確定Herp與Synoviolin的最小結(jié)合部位的實施例。
即，通過以Synoviolin為誘餌的酵母雙雜交篩選，對由人軟骨cDNA文庫得到的Synoviolin的底物候選分子Herp確定其與Synoviolin的最小結(jié)合部位。即，以摻入到pcDNA3 Flag或HA載體中的Herp為模板，通過PCR，進(jìn)行片段化插入片段的制備。為了進(jìn)行GST Pull Downassay，將Synoviolin和Herp片段化，插入到pGEX和pcDNA3載體中。
結(jié)果可以推測Herp的氨基酸序列編號中的第161-200號與synodTM結(jié)合(圖6)。
本實施例是鑒定與培養(yǎng)細(xì)胞中的Synoviolin結(jié)合所必須的Herp蛋白質(zhì)區(qū)域的實施例。
由實施例5的結(jié)果可知Synoviolin與Herp的結(jié)合所必須的Herp一側(cè)的氨基酸是第161-200號共40個氨基酸(圖6)。因此，制備除去Herp的第161-200號共40個氨基酸的Herp(-bind)，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)與Synoviolin的結(jié)合實驗。
明確了Herp與Synoviolin進(jìn)行結(jié)合，同時進(jìn)行Herp蛋白質(zhì)上與Synoviolin結(jié)合的區(qū)域(氨基酸序列的第161-200號之間)的鑒定。本實施例中，對于缺失該區(qū)域時Herp與Synoviolin的結(jié)合會受到怎樣的影響，進(jìn)行以下的實驗。
Herp基因上，通過PCR法使編碼第161號至第200號氨基酸的部分缺失，制備Herp(-bind)基因(圖7上)。然后，使該基因的N端帶上HA標(biāo)簽，插入到pcDNA3載體中。接著，在HEK293T細(xì)胞中，分別使帶HA標(biāo)簽的Herp、Herp(-bind)、空載體與帶FLAG標(biāo)簽的Synoviolin一起強(qiáng)表達(dá)。24小時后，提取全細(xì)胞提取物(WCE)，確認(rèn)各蛋白質(zhì)的表達(dá)，在此基礎(chǔ)上用抗HA抗體或抗FLAG抗體進(jìn)行免疫沉淀。
用含有150mM氯化鈉的漂洗緩沖液漂洗免疫沉淀產(chǎn)物，用該產(chǎn)物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法，結(jié)果可知，Herp與Synoviolin結(jié)合，但Herp(-bind)不與Synoviolin結(jié)合(圖7下)。由此表明Herp蛋白質(zhì)上的第161號至第200號氨基酸區(qū)域是與Synoviolin結(jié)合的必須區(qū)域。
本實施例是研究Herp為Synoviolin的底物的實施例。
實驗方法如下所示。
通過酵母雙雜交、GST-pull down實驗，明確了Herp在細(xì)胞內(nèi)與Synoviolin結(jié)合。有報告稱Herp是N端具有UBL的貫穿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞中表達(dá)的Herp被多遍在蛋白化(Kokame K，Kato H，Miyata T.Homocysteine respondent Genes in Vascular EndothelialCells Identified by Differential Display Analysis.J.Biol.Chem.1996Nov 22；271(47)29659-29665)。另外，與Synoviolin(+/+)MEF細(xì)胞中的相比，可觀察到Synoviolin(-/-)MEF細(xì)胞中Herp蛋白蓄積(圖8A)。因此認(rèn)為Herp為Synoviolin的底物的可能性很大。
另外，在上述實驗中，使用含有Herp的氨基酸序列中第37-50號的區(qū)域LKAHLSRVYPERPR(SEQ ID NO.20)的氨基酸序列作為抗Herp(N)抗體的識別部位。
但是，體外的遍在蛋白反應(yīng)系統(tǒng)中，在Synoviolin非存在下，對Herp的GST融合蛋白GST-Herp也觀察到遍在蛋白化的條帶。
因此，本實施例中，對于Herp為Synoviolin的底物，自身是否遍在蛋白化進(jìn)行研究。
HEK293T細(xì)胞中，使用帶有FLAG標(biāo)簽的各種Herp變異構(gòu)成(圖8C)，分別與HA-遍在蛋白/pcDNA3或Synoviolin/pcDNA3一起強(qiáng)表達(dá)。
強(qiáng)表達(dá)24小時后，由細(xì)胞提取全細(xì)胞提取物(WCE)，通過蛋白質(zhì)印跡法確認(rèn)各蛋白質(zhì)的表達(dá)，并用抗HA抗體進(jìn)行免疫沉淀，通過抗FLAG抗體研究是否有Herp蛋白的多遍在蛋白化。
Herp野生型中，只使遍在蛋白強(qiáng)表達(dá)時、或者使遍在蛋白和Synoviolin同時強(qiáng)表達(dá)時，可觀察到多遍在蛋白化的條帶。另外，使遍在蛋白和Synoviolin同時強(qiáng)表達(dá)時，與只使遍在蛋白強(qiáng)表達(dá)時相比，Herp的Ub化條帶變?nèi)?，由此可知Ub化的Herp的分解亢進(jìn)。與此相對，Herp(-bind)中，只使遍在蛋白強(qiáng)表達(dá)時、或者遍在蛋白與Synoviolin同時強(qiáng)表達(dá)時，均未檢測出多遍在蛋白化的條帶。另外，Herp(-UBL)的場合，遍在蛋白和Synoviolin同時強(qiáng)表達(dá)的情況與只有遍在蛋白強(qiáng)表達(dá)的情況相比，herp(-UBL)的Ub化條帶強(qiáng)(圖8B)。由此可認(rèn)為Herp的UBL區(qū)對于與Synoviolin結(jié)合或通過Synoviolin進(jìn)行Ub化不是必須的，但對于分解是必須的。
本實施例是為了研究Synoviolin在阿爾茨海默病中的關(guān)系，而對MEF(syno(+/+)和(-/-))中的γ-分泌酶活性進(jìn)行比較。
將MEF(syno(+/+)和(-/-))用溶解緩沖液處理，制成細(xì)胞溶解液，然后加入反應(yīng)緩沖液、熒光標(biāo)識的底物——合成APP，在37℃進(jìn)行2小時酶促反應(yīng)。通過用360nm的激發(fā)波長、465nm的測定波長測定熒光來進(jìn)行測定。
結(jié)果，與syno(+/+)相比，syno(-/-)的MEF中可見γ-分泌酶活性的增加(圖9)。
工業(yè)實用性本發(fā)明提供抑制分泌酶活性的方法。另外，本發(fā)明提供含有抑制分泌酶活性的物質(zhì)的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物作為阿爾茨海默病等腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療藥物是有用的。
序列表<110>Locomogene，Inc.
<120>抑制分泌酶活性的方法<130>P03-112PCT<150>JP2003-359704<151>2003-10-20<160>20<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3374<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(403)..(2256)<223>
<400>1gccctttctt atgagcatgc ctgtgttggg ttgacagtga gggtaataat gacttgttgg60ttgattgtag atatagggct ctcccttgca aggtaattag gctccttaaa ttacctgtaa120gattttcttg ccacagcatc cattctggtt aggctggtga tcttctgagt agtgatagat180tggttggtgg tgaggtttac aggtgttccc ttctcttact cctggtgttg gctacaatca240ggtggcgtct agagcagcat gggacaggtg ggtaagggga gtcttctcat tatgcagaag300tgatcaactt aaatctctgt cagatctacc tttatgtagc ccggcagtcg cgcggattga360
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1 5 10
權(quán)利要求
1.藥物組合物，含有抑制分泌酶活性的物質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中分泌酶是β-分泌酶或γ-分泌酶。
3.權(quán)利要求1或2的藥物組合物，其中抑制分泌酶活性的物質(zhì)是促進(jìn)分泌酶抑制劑感受性的物質(zhì)。
4.權(quán)利要求3的藥物組合物，其中促進(jìn)分泌酶抑制劑感受性的物質(zhì)是抑制Synoviolin表達(dá)的物質(zhì)。
5.權(quán)利要求4的藥物組合物，其中抑制Synoviolin表達(dá)的物質(zhì)是針對編碼Synoviolin的基因的siRNA或shRNA。
6.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中編碼Synoviolin的基因含有SEQID NO.1所示的堿基序列。
7.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中siRNA以SEQ ID NO.1所示的堿基序列中的部分序列為靶。
8.權(quán)利要求7的藥物組合物，其中部分序列為選自SEQ ID NO.3-16所示的堿基序列中的至少一種序列。
9.權(quán)利要求1或2的藥物組合物，其中抑制分泌酶活性的物質(zhì)是Synoviolin。
10.權(quán)利要求1-9中任一項的藥物組合物，其用于治療腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
11.權(quán)利要求10的藥物組合物，其中腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病是阿爾茨海默病。
12.抑制分泌酶活性的方法，其特征在于促進(jìn)分泌酶抑制劑的感受性。
13.權(quán)利要求12的方法，其中分泌酶抑制劑感受性的促進(jìn)通過抑制Synoviolin的表達(dá)來實現(xiàn)。
14.抑制分泌酶活性的方法，其特征在于使Synoviolin與Herp結(jié)合。
15.權(quán)利要求14的方法，其中Herp與Synoviolin的結(jié)合區(qū)域是Herp的氨基酸序列第161-200號的氨基酸殘基所示的區(qū)域。
16.權(quán)利要求12-15中任一項的方法，其中分泌酶是β-分泌酶或γ-分泌酶。
全文摘要
本發(fā)明提供抑制分泌酶活性的方法。為了抑制分泌酶活性，采用促進(jìn)分泌酶抑制劑的感受性的方法、或使Synoviolin與Herp(高半胱氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的遍在蛋白樣結(jié)構(gòu)域成員1，homocysteine－indusible endoplasmic reticulum stress－indusible ubiquitin－like domain member 1)結(jié)合的方法等。
文檔編號A61K48/00GK1871030SQ20048003087
公開日2006年11月29日 申請日期2004年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月20日
發(fā)明者中島利博, 天野徹也, 山崎聰士, 八木下尚子, 池田理惠, 張蕾 申請人:株式會社洛科摩基因