專利名稱：生物可降解聚合物－配體偶聯(lián)物及其在細(xì)胞亞群的分離和細(xì)胞的低溫保藏、培養(yǎng)和移植 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及在體內(nèi)或體外用于醫(yī)學(xué)可用物質(zhì)的制備和運(yùn)輸?shù)尼t(yī)學(xué)設(shè)備。更具體地，本發(fā)明涉及與反應(yīng)活性配體偶聯(lián)的生物可降解的天然或合成樹脂的組合物。此外，本發(fā)明涉及將這些組合物用于細(xì)胞的具體亞群的富集、細(xì)胞的低溫保藏、細(xì)胞的體外維持和細(xì)胞治療的方法。
背景技術(shù)：
在分離的細(xì)胞培養(yǎng)中的真核細(xì)胞典型地有兩類。一類能夠在懸浮培養(yǎng)中生存和繁殖。特別適合此種存活模式的細(xì)胞包括來自癌癥和淋巴瘤的細(xì)胞，以及由化學(xué)或病毒試劑轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。相反，第二類細(xì)胞是為了細(xì)胞的存活和繁殖需要固著在基質(zhì)上的細(xì)胞。后一類細(xì)胞包括貼壁細(xì)胞，例如來自固體組織的細(xì)胞以及非轉(zhuǎn)化的、貼壁細(xì)胞類型例如那些來自肝、肺、腦等的細(xì)胞以及特別是來自固體組織的祖細(xì)胞群。通常，這些細(xì)胞需要貼附在胞外基質(zhì)成分上并維持在無血清的、激素合成培養(yǎng)基中來生長和/或存活?；|(zhì)成分可以是蛋白質(zhì)如膠原蛋白或?qū)诱车鞍谆蚩梢允堑鞍拙厶侨缌蛩嵋阴８嗡氐鞍拙厶恰＜に睾铣膳囵B(yǎng)基的組成對各細(xì)胞類型是獨(dú)特的且對于細(xì)胞類型的成熟或譜系階段是獨(dú)特的；因此，給定譜系的祖細(xì)胞與該譜系的成熟細(xì)胞具有重疊的要求但它們也有一些不同的要求。各種貼壁細(xì)胞類型的這些體外要求可能已被定義但即使已被定義這些要求也不易升級(jí)；即這些要求能在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)中建立但不易用于臨床治療、用于大量細(xì)胞培養(yǎng)或用在可被臨床或工業(yè)使用的生物反應(yīng)器中。此外，當(dāng)細(xì)胞需要融解后復(fù)蘇并以各種方法使用時(shí)，用于儲(chǔ)存貼壁細(xì)胞類型的條件例如低溫保藏是不實(shí)用的。因此，貼壁細(xì)胞需要細(xì)胞長期儲(chǔ)存、將一種細(xì)胞類型從另一種中分離、以及在這些細(xì)胞的期望醫(yī)學(xué)應(yīng)用中處理細(xì)胞的方法。
生物可降解聚合物已被用于組織工程學(xué)。最集中研究的用于組織工程學(xué)的生物相容的和生物可降解的聚合物包括聚(α-羥基酸)聚合物家族及相關(guān)的共聚物。這些聚合物中的一些被FDA批準(zhǔn)用于臨床應(yīng)用。因此，在本發(fā)明中它們被用作最可行的起始聚合物材料。但是，細(xì)胞與這些聚合物的貼附仍然存在問題。
在此公開了解決貼壁依賴性細(xì)胞相關(guān)問題的組合物和方法，由此實(shí)現(xiàn)了與分類、細(xì)胞保藏、細(xì)胞繁殖和細(xì)胞的醫(yī)學(xué)應(yīng)用相關(guān)的未得到滿足的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了生物可降解聚合物顆粒-細(xì)胞組合物，該組合物包含至少一種生物可降解顆粒，至少一種與其共價(jià)連接的接受基團(tuán)，和至少一種固著在所述的至少一種接受基團(tuán)上的細(xì)胞。該接受基團(tuán)可以是任何合適的基團(tuán)，包括但不限于抗體、抗體片段、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、或生物素基序、碳水化合物、合成配體、蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G，或它們的組合。接受基團(tuán)本身也可以是能夠發(fā)生配體-受體相互作用的配體。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種低溫保藏貼壁依賴性細(xì)胞的方法，包含允許細(xì)胞固著在包含至少一種生物可降解顆粒的組合物上并在合適的低溫保藏劑的存在下冷凍該混合物。可以以基本的單細(xì)胞懸浮液提供細(xì)胞與顆粒發(fā)生相互作用。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種分離細(xì)胞的方法，包含提供一組合物，該組合物包含至少一種生物可降解聚合物，至少一種與其共價(jià)連接的接受基團(tuán)，至少一種固著在所述的至少一種接受基團(tuán)上的細(xì)胞，以及至少一種不固著在所述的至少一種接受基團(tuán)上的細(xì)胞，并去除至少一種不固著在聚合物上的細(xì)胞。此外，聚合物可被制成帶有功能性受體基團(tuán)的大顆粒、微顆?；蚣{米顆粒。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種對貼壁依賴性細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)方法，包含提供一組合物，該組合物具有至少一種生物可降解聚合物，至少一種共價(jià)連接的接受基團(tuán)，和至少一種與所述的至少一種接受基團(tuán)貼附的細(xì)胞；且將該組合物與細(xì)胞培養(yǎng)基接觸。
在另一
具體實(shí)施例方式
中，本發(fā)明提供了一種對貼壁依賴性細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)方法，包含提供一組合物，該組合物具有至少一種生物可降解聚合物，至少一種共價(jià)連接的接受基團(tuán)，和至少一種與所述的至少一種接受基團(tuán)貼附的細(xì)胞；將該組合物與細(xì)胞培養(yǎng)基接觸，且其中該細(xì)胞包含肝前體細(xì)胞、造血前體細(xì)胞、纖維原細(xì)胞、間葉細(xì)胞、心臟細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞中的至少一種，或它們的組合。
在另一
具體實(shí)施例方式
中，本發(fā)明提供了一種對需要細(xì)胞治療的主體的治療，包含對主體以組合物的有效量給藥，該組合物包含至少一種生物可降解聚合物，至少一種與其共價(jià)連接的接受基團(tuán)，和至少一種固著在所述至少一種接受基團(tuán)上的細(xì)胞。細(xì)胞治療的聚合物可被制成大顆粒、微顆?；蚣{米顆粒。


圖1說明了通過與蛋白質(zhì)受體中的賴氨酸的ε胺基直接偶聯(lián)進(jìn)行的偶聯(lián)。
圖2說明了使用聚乙二醇?xì)埢B接的偶聯(lián)。
圖3說明了使用生物素-鏈霉抗生物素蛋白或生物素-抗生物素蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)。
圖4說明了使用生物素化聚乙二醇連接的偶聯(lián)。
圖5說明了使用物種專一性的或二級(jí)抗體鍵的偶聯(lián)。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明涉及具有與接受基團(tuán)或配體共價(jià)偶聯(lián)的生物可降解聚合物的組合物。此外，本發(fā)明涉及該組合物與細(xì)胞的進(jìn)一步的結(jié)合。細(xì)胞可被固著在接受配體或基團(tuán)上。接受配體或基團(tuán)可以是針對細(xì)胞表面抗原或受體的抗體或抗體片段、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白或生物素基序。組合物可進(jìn)一步包含細(xì)胞外基質(zhì)的一或多種成分，例如膠原蛋白、纖連蛋白、層粘蛋白或它們的組合。本發(fā)明還涉及將這樣的組合物用于細(xì)胞群的選擇和分離、細(xì)胞顆粒組合物的低溫保藏以及貼壁依賴性細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)的方法。
定義二倍體細(xì)胞的無血清、激素合成培養(yǎng)基(HDM-二倍體細(xì)胞)已發(fā)現(xiàn)該培養(yǎng)基引發(fā)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的二倍體亞群的群落擴(kuò)增、群落形成或完成細(xì)胞分裂。該培養(yǎng)基由任何營養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(例如RPMI 1640，HAM’sF12)組成，該培養(yǎng)基不含銅并含有低鈣(＜0.5mM)并進(jìn)一步補(bǔ)充了胰島素(1-5μg/ml)、運(yùn)鐵蛋白/Fe(1-10μg/ml)、以及脂肪混合物(與高度純化的、無脂肪酸的白蛋白結(jié)合的游離脂肪酸的混合物；可選擇的但有用的添加物還可以是10μg/ml的高密度脂蛋白)。制備該脂肪酸的細(xì)節(jié)作為附錄A附加在此。
在此定義的胚胎基質(zhì)飼養(yǎng)物是衍生自胚胎組織的間葉細(xì)胞基質(zhì)飼養(yǎng)細(xì)胞。對肝細(xì)胞理想的是衍生自胚胎肝的基質(zhì)細(xì)胞，存在組織專一性的一些證據(jù)，盡管是模糊的證據(jù)。本發(fā)明者已定義了大鼠但不是人的年齡極限(例如，胚胎基質(zhì)理想地從孕齡E13-E17的胚胎大鼠肝臟獲取)。在人中，我們只能對于相應(yīng)的孕齡進(jìn)行猜測，例如懷孕12-18周的人胚胎肝。本實(shí)驗(yàn)室沒有數(shù)據(jù)確定該推測。但是，最重要地，這些飼養(yǎng)細(xì)胞是年齡專一性的，且最具活性的形式來自胚胎組織。人們可以使用“STO”細(xì)胞，衍生自小鼠胚胎且常規(guī)地用于維持胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)的胚胎基質(zhì)細(xì)胞系。STO細(xì)胞沒有產(chǎn)生與胚胎肝基質(zhì)十分相同的效應(yīng)但作用足夠好以至于研究者使用它們以避免不得不制備胚胎組織的原代培養(yǎng)。
在此定義的群落擴(kuò)增指甚至在很低的接種密度(極端的1個(gè)細(xì)胞/盤)下能夠重復(fù)地傳代培養(yǎng)并擴(kuò)增的細(xì)胞。
群落形成包括從接種細(xì)胞到細(xì)胞群落的形成但包括在相對短的時(shí)間期間(1-2周)內(nèi)的有限次數(shù)的分裂(典型地5-7次細(xì)胞分裂)。細(xì)胞根本不易被傳代培養(yǎng)。不像群落擴(kuò)增，群落形成可包含分化步驟，該步驟排除不確定的細(xì)胞分裂和傳代培養(yǎng)。
在此定義的原始肝臟干細(xì)胞是具有群落擴(kuò)增潛力以及具有細(xì)胞角質(zhì)素19(CK19)和白蛋白(即膽和肝相應(yīng)的細(xì)胞標(biāo)記)的共表達(dá)但缺乏α-胎蛋白表達(dá)的多能細(xì)胞。在來自胎兒肝臟的人肝譜系中，這些細(xì)胞也共表達(dá)N-CAM、上皮CAM(EP-CAM)和CD133并且將在組織培養(yǎng)塑料上和HDM-二倍體細(xì)胞中群落擴(kuò)增。
在此定義的近肝干細(xì)胞(proximal hepatic stem cells)(也被稱作肝原細(xì)胞)是具有群落擴(kuò)增潛力和具有細(xì)胞角質(zhì)素19(CK19)、白蛋白及α-胎蛋白的共表達(dá)的多能細(xì)胞。在來自胎兒肝臟的人肝譜系中，這些細(xì)胞也共表達(dá)I-CAM、上皮CAM(Ep-CAM)和CD133并且將在胚胎基質(zhì)飼養(yǎng)物(例如STO細(xì)胞)和HDM-二倍體細(xì)胞中群落擴(kuò)增。
在此定義的定向祖細(xì)胞是能夠產(chǎn)生肝細(xì)胞(定向肝祖細(xì)胞)或膽上皮細(xì)胞(定向膽祖細(xì)胞)的單能細(xì)胞。這些細(xì)胞將在胚胎基質(zhì)飼養(yǎng)物上和HDM-二倍體細(xì)胞中形成群落。但還不太清楚它們在這些或其它條件下是否能夠群落擴(kuò)增。
在此定義的二倍體成人肝細(xì)胞(也被稱作“小肝細(xì)胞”)是大小在15-20μm之間的二倍體肝細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá)各種成人專一性功能(例如PEPCK、糖原)，但不表達(dá)EP-CAM、CD133或N-CAM，并且將在各種條件下形成群落，但如果養(yǎng)在進(jìn)一步補(bǔ)充了10-50μm的上皮生長因子(EGF)的胚胎基質(zhì)飼養(yǎng)物上和HDM-二倍體細(xì)胞中將理想地形成群落。
在此定義的多倍體肝細(xì)胞是多倍體的肝細(xì)胞(根據(jù)哺乳動(dòng)物種類從四倍體或4N至32N)。這些是肝的成熟細(xì)胞且已被發(fā)現(xiàn)進(jìn)行DNA合成但在再生條件下如果存在也是有限的胞質(zhì)分裂。
在此定義的祖細(xì)胞是廣義的術(shù)語，其包含干細(xì)胞的所有亞群和定向祖細(xì)胞。
在此定義的前體是功能性術(shù)語，表示細(xì)胞的一特定亞群是細(xì)胞的另一亞群的前體。例如，原始肝干細(xì)胞是肝原細(xì)胞的前體；肝原細(xì)胞是定向祖細(xì)胞的前體；二倍體成人肝細(xì)胞是多倍體肝細(xì)胞的前體。
當(dāng)在此使用時(shí)，術(shù)語“低溫保藏”涉及細(xì)胞和/或組織在一些條件下的冷凍，這些條件維持了細(xì)胞在隨后的融解后的活力。細(xì)胞低溫保藏的一般技術(shù)是本領(lǐng)域充分已知的；例如見Doyle等，(編)，1995，Cell & Tissue CultureLaboratory Procedures，John Wiley & Sons，Chichester；和Ho和Wang(編)，1991，Animal Cell Bioreactors，Butterworth-Heinemann，Boston，這些文獻(xiàn)在此被參考引用。
本發(fā)明的生物可降解聚合物-配體偶聯(lián)物被稱作細(xì)胞接受顆?；蚋唵蔚念w粒。這些術(shù)語與生物可降解聚合物-配體偶聯(lián)物的所有具體實(shí)施方式
一同使用，偶聯(lián)物包括但不限于直接的抗體偶聯(lián)物、與抗體片段的偶聯(lián)物、抗生物素蛋白偶聯(lián)物、生物素偶聯(lián)物、纖連蛋白偶聯(lián)物，將生物可降解顆粒和抗體用長間隔聯(lián)結(jié)子偶聯(lián)例如但不限PEG聯(lián)結(jié)子以及抗-抗體偶聯(lián)物。
1.聚合物的制備一些種類的生物相容和生物可降解聚合物適用于本發(fā)明，包括但不限于聚丙交酯、聚丙交酯-賴氨酸共聚物、聚丙交酯-賴氨酸-聚乙二醇共聚物、淀粉、藻酸鹽和蛋白質(zhì)。合適的蛋白是膠原蛋白、明膠、聚賴氨酸、層粘蛋白、纖連蛋白或它們的組合。本發(fā)明的一具體實(shí)施方式
使用聚(α-羥基酸)-賴氨酸共聚物和/或聚(丙交酯-共-乙交酯，PLGA)共聚物。在與含有氨基的配體或蛋白偶聯(lián)之前，PLGA可以由偶聯(lián)劑激活，偶聯(lián)劑例如但不限于戊二醛(Seifert，Romaniuk和Groth，1997 Biomaterials 181495-1502)。生物可降解PLGA聚合物也可以與蛋白A或蛋白G或其它蛋白受體的氨基基團(tuán)通過雙功能聯(lián)結(jié)子偶聯(lián)，雙功能聯(lián)結(jié)子如商業(yè)可獲取的聯(lián)結(jié)子(3[(2-氨乙基)-二硫]丙酸，AEDP)。在本發(fā)明中，聚(α-羥基酸)家族聚合物和共聚物也被用于制備沒有表面反應(yīng)活性基團(tuán)的生物相容的和生物可降解的珠(beads)，由此提供可降解聚合物顆粒的核心結(jié)構(gòu)。
當(dāng)在此使用時(shí)，如果聚合物或聚合物的任何降解產(chǎn)物對接受者是基本無毒的且對接受者身體也沒有呈現(xiàn)顯著有害的或不良的效應(yīng)，例如在注射位點(diǎn)顯著的免疫反應(yīng)，聚合物或聚合物基質(zhì)是“生物相容的”。
當(dāng)在此使用時(shí)，“生物可降解的”指將在體內(nèi)降解或腐蝕以形成更小化學(xué)物種的組合物。例如，降解可以通過酶、化學(xué)和/或物理過程產(chǎn)生。合適的生物相容的、生物可降解的聚合物包括，例如但不作為限定，聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚己酸丙酯、聚碳酸酯、聚(氨基酸)、聚原酸酯、聚醚酯、聚乙二醇和聚原酸酯的共聚物、它們的混合物和共聚物。
例如但不作為限定，適用于本發(fā)明的生物相容的、非生物可降解的聚合物包括非生物可降解聚合物，選自聚丙烯酸酯、乙烯-醋酸乙烯聚合物和其它?；〈拇姿崂w維素酯、非降解的聚亞安酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯基咪唑)、氯磺酸聚烯烴、聚環(huán)氧乙烯、它們的混合物和共聚物。
此外，聚合物的末端功能基團(tuán)可被修飾。例如，聚酯可以是封閉的、未封閉的或封閉的和未封閉的聚酯的混合物。如本領(lǐng)域經(jīng)典定義的，封閉的聚酯特別地具有封閉的羧端基團(tuán)。一般地，封閉基團(tuán)來自聚合的引發(fā)劑且典型地是烷基。如本領(lǐng)域經(jīng)典定義的，未封閉的聚酯特別地具有游離的羧端基團(tuán)。
用于本發(fā)明的可接受的聚合物的分子量可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員考慮一些因素后決定，這些因素如希望的聚合物降解速率、物理性質(zhì)如機(jī)械強(qiáng)度、以及聚合物在溶劑中的溶解速率。典型地，分子量的可接受范圍在大約2,000道爾頓至大約2,000,000道爾頓之間。在優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，該聚合物是生物可降解聚合物或共聚物。在更優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，聚合物是丙交酯∶乙交酯的比例大約為但不限于1∶1且分子量在大約5,000道爾頓至大約70,000道爾頓的聚(丙交酯-共-乙交酯)(此后的“PLGA”)或衍生物。在甚至更優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，用于本發(fā)明的PLGA的分子量具有大約5,000道爾頓至大約42,000道爾頓的分子量。
在一具體實(shí)施方式
中，包含具有反應(yīng)活性側(cè)鏈的氨基酸如賴氨酸的共聚物與包含乳酸的單體、包含乙醇酸的單體或其它任何具有相似聚合機(jī)制的單體共聚合。作為實(shí)施例，包含乳酸的單體可以是丙交酯且包含乙醇酸的單體可以是乙交酯。氨基酸上的反應(yīng)活性位點(diǎn)由標(biāo)準(zhǔn)的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)。類似地，帶有被保護(hù)的側(cè)鏈基團(tuán)的聚合物可被去保護(hù)以產(chǎn)生具有反應(yīng)活性的氨基。在將聚(乳)酸-賴氨酸共聚物制成理想的多孔顆粒后，去保護(hù)的聚(乳)酸-賴氨酸共聚物可通過偶聯(lián)賴氨酸殘基的ε-氨基進(jìn)一步地與接受試劑共價(jià)偶聯(lián)形成直接連接的偶聯(lián)物。在某些具體實(shí)施方式
中，接受基團(tuán)可以是蛋白質(zhì)，包括但不限于抗體、抗體片段、膠原蛋白、層粘蛋白、纖連蛋白、抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白、或小分子配體基團(tuán)包括但不限于生物素和包含RGD的肽、蛋白A或蛋白G。
當(dāng)在此使用時(shí)，預(yù)期用于本發(fā)明的抗體包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體(mAbs)、人源化或嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab’)2片段，由Fab表達(dá)文庫產(chǎn)生的片段、抗特型(anti-Id)抗體、和以上任何抗體的抗原決定簇結(jié)合片段。
當(dāng)在此使用時(shí)，小分子配體基團(tuán)是分子量不大于10,000道爾頓，更優(yōu)選地小于5,000道爾頓的基團(tuán)。例如可以使用組合技術(shù)構(gòu)建小有機(jī)分子或小肽的組合文庫。一般地見例如Kenan等，Trends Biochem.Sc.，1957-64(1994)；Gallop等，J.Med.Chem.，371233-1251(1994)；Gordon等，J.Med.Chem.，371385-1401(1994)；Ecker等，Biotechnology，13351-360(1995)。化合物的這些組合文庫可被用作本發(fā)明中的接受基團(tuán)。隨機(jī)肽可由例如重組表達(dá)文庫(例如噬菌體表面展示文庫)或體外翻譯文庫(例如mRNA展示文庫，見Wilson等，Proc Natl Acad Sci 983750-3755(2001))提供。小分子配體也可包括諸如碳水化合物的分子，以及在美國專利號(hào)5,792,783中公開的化合物(小分子配體在此被定義為分子量為大約1000道爾頓或更小的小分子配體，這些分子作為血管靶點(diǎn)或血管細(xì)胞標(biāo)記的配體)，由噬菌體表面展示文庫選擇的肽例如在美國專利號(hào)5,403,484中說明的肽，以及從頭設(shè)計(jì)的與腫瘤表達(dá)受體互補(bǔ)的肽；抗原性決定基；或其它受體靶基團(tuán)。
當(dāng)在此使用時(shí)，術(shù)語“RGD”不僅指肽序列Arg-Gly-Asp，其一般性地指一類介導(dǎo)與粘合素的專一性相互作用的最小的或核心的肽。因此，“RGD導(dǎo)向序列”包含了整個(gè)一類的粘合素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。已知將分子導(dǎo)向細(xì)胞的表面將促進(jìn)據(jù)推測通過內(nèi)吞方式的對分子的吸收。見例如Hart等，J.Biol.Chem.26912468-74(1994)(噬菌體攜帶RGD的內(nèi)化)；Goldman等，Gene Ther.3811-18(1996)(RGD-介導(dǎo)腺病毒感染)和Hart等，Gene Ther.41225-30(1997)(RGD-介導(dǎo)轉(zhuǎn)染)。因此，在很多情況下導(dǎo)向結(jié)構(gòu)域也發(fā)揮內(nèi)化結(jié)構(gòu)域的作用。本領(lǐng)域已知很多這樣的導(dǎo)向結(jié)構(gòu)域。一類與粘合素(胞外基質(zhì)結(jié)合的位點(diǎn))專一性結(jié)合的導(dǎo)向信號(hào)具有基于Arg-Gly-Asp(RGD)的肽信號(hào)序列。但另一類包括具有Ile-Lys-Val-Ala-Val(IKVAV)核心的肽。見Weeks等，Cell Inmunol.15394-104(1994)。
圖1涉及賴氨酸連接的親水性本質(zhì)，該連接允許偶聯(lián)反應(yīng)在水性介質(zhì)中進(jìn)行。
如圖2中說明，為了進(jìn)一步擴(kuò)展共聚物在連接蛋白(包括例如抗體)方面的容量，聚乙二醇(“PEG”)聯(lián)結(jié)子可由磺酰氯和類似物活化且與伯胺基團(tuán)偶聯(lián)，伯胺基團(tuán)例如但不限于賴氨酰殘基或蛋白質(zhì)的ε-氨基，由此形成具有三維分布和結(jié)構(gòu)特征的延展的連接。商業(yè)上可獲取的各種長度和線性的聯(lián)結(jié)子結(jié)構(gòu)適于本發(fā)明由此可以得到各種表面分布。各種聯(lián)結(jié)子，例如但不限于那些從Pierce Chemical公司商業(yè)獲取的聯(lián)結(jié)子，適用于本發(fā)明的方法?？商鎿Q地，這些聯(lián)結(jié)子結(jié)構(gòu)可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的常規(guī)的合成有機(jī)化學(xué)方法合成。接受位點(diǎn)的表面分布是影響新聚合物表面上的靶向細(xì)胞的受體分子的密度和分布的重要性質(zhì)。在任何情況下，采用的接受簇位點(diǎn)的表面分布必須足夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞的接觸，這對細(xì)胞的生長和分化、移動(dòng)和形態(tài)是重要的(例如Cima，L.G 1994，J.Cellular Biochemistry 56155-161)。接受位點(diǎn)的表面分布可以根據(jù)個(gè)案，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的專門的分析針對具體的細(xì)胞類型確定。這些表征不受限的包括確定由配體靶向的放射活性或熒光標(biāo)記的受體在聚合物表面上的結(jié)合(例如Rolwey J.A.，Madlambayan，G.，Mooney，D.J.1999，Biomaterials2045-53；Massia，S.P.，Hubbell，J.A.1991，J.Cell Biology1141089-1100)、X-ray和中子反射率分析(例如Russell，T.P.1990 Material Science Reports 5171-271)、以及表面接受基團(tuán)的免疫熒光標(biāo)記抗體的結(jié)合分析(例如Massia，S.P.，Hubbell，J.A.1991，J.Cell Biology 1141089-1100)。如圖2中說明的，根據(jù)聯(lián)結(jié)子的結(jié)構(gòu)，末端共聚物可以具有線性的或分支的帶有單個(gè)或多個(gè)反應(yīng)活性基團(tuán)的聯(lián)結(jié)子。聯(lián)結(jié)子優(yōu)選地是親水的，且可被暴露于水性介質(zhì)，由此對引入的偶聯(lián)劑而言變得可以接近。
2.將新聚合物制成骨架或珠本發(fā)明的另一個(gè)重要方面涉及將生物可降解聚合物制成顆粒、珠、纖維或骨架?？梢杂帽景l(fā)明的方法制備尺寸達(dá)到1000微米(microns)的多孔顆粒。此外，本發(fā)明公開了修飾顆粒的表面多孔性、內(nèi)部多孔性、降解和表面反應(yīng)活性基團(tuán)的分布的方法。通過對包埋在NaCl或確定尺寸的相似的晶體顆粒中的聚合物液滴的低溫快速冷凍制備直徑大于500微米的聚合物顆粒，稱作大顆粒。該聚合物顆?？删哂谐叽绶秶ǖ幌抻诖蠹s500微米、大約550微米、大約600微米、大約650微米、大約700微米、大約750微米、大約800微米、大約850微米、大約900微米、大約950微米、大約1000微米、大約1050微米、大約1,100微米，或在需要產(chǎn)生時(shí)更大的尺寸。本方法通過由選擇用于溶解晶體但非聚合物的溶劑溶解包埋的晶體制造多孔結(jié)構(gòu)。
為了制造尺寸在大約200至大約500微米的顆粒，被稱作微顆粒，在表面活性劑的存在下將確定配方的聚合物的乳液以微小液滴分散進(jìn)水性介質(zhì)。液滴的連續(xù)分散允許溶劑的提取和蒸發(fā)，使得聚合物顆粒固化。該聚合物微顆粒可具有尺寸范圍包括但不限于大約200微米、大約250微米、大約300微米、大約350微米、大約400微米、大約450微米、大約500微米等。通過使用超聲剪切力將聚合物溶液迅速地分散成微小液滴制備直徑小于大約200微米的小聚合物顆粒，被稱作納米顆粒，超聲剪切力典型地由超聲霧化器提供。
小顆粒的聚合物在低溫固化且使用第二或第三種溶劑將聚合物的溶劑去除。該聚合物微顆?？删哂谐叽绶秶ǖ幌抻诖蠹s25微米、大約50微米、大約75微米、大約100微米、大約125微米、大約150微米、大約175微米、大約200微米等。由此，顆?？梢允谴箢w粒、微顆粒、納米顆?；蛩鼈兊娜我饨M合。聚合物也可形成纖維，包括中空纖維。
3.抗體和其它蛋白在聚乳酸(-賴氨酸共聚物)上的直接偶聯(lián)通過使用交聯(lián)劑，感興趣的蛋白質(zhì)可被偶聯(lián)至生物可降解聚合物顆粒或骨架上。合適的蛋白不受限的包括抗體、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、和胞外基質(zhì)蛋白、包含RGD序列的肽、蛋白A/G。
靶向細(xì)胞表面標(biāo)記和其它蛋白的抗體可以直接與聚合物珠表面上的共聚物的賴氨酰殘基的ε氨基偶聯(lián)，由此形成連接在表面上的抗體或其它蛋白。商業(yè)可獲取的(例如從Pierce Chemical公司)各種偶聯(lián)劑例如但不限于戊二醛可被用于將抗體或其它蛋白偶聯(lián)至生物可降解聚合物上。例如，在抗體或其它蛋白以及顆粒存在下，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸可在pH4-6的范圍內(nèi)與緩沖液反應(yīng)。連接也可以一般地作為兩步過程發(fā)生，該過程使用6-(4-疊氮基-2-硝基苯氨基)己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯。在該方法中，顆粒首先在黑暗中在pH6.5至8.5的范圍下與琥珀酰亞胺試劑反應(yīng)。隨后加入抗體或其它蛋白且偶聯(lián)由250-350納米的照射以產(chǎn)生活性氮賓起始。氮賓插入附近的分子包括抗體。未反應(yīng)的試劑隨后可通過水介質(zhì)的清洗被去除。
交聯(lián)伯胺基團(tuán)的一些其它的試劑也同樣適于將抗體或其它蛋白連接至生物可降解顆粒上，包括S-乙酰巰基琥珀酸酐；S-乙酰硫乙醇酸N-羥基-琥珀酰亞胺酯；4-疊氮基苯甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯；N-(5-疊氮基-2-硝基苯甲酸基)琥珀酰亞胺；溴乙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯；二甲基3，3’-二硫-雙(丙酰亞胺)二鹽酸；二甲基庚二亞胺二鹽酸；二甲基辛二亞胺二鹽酸；4，4’二硫-雙(苯基疊氮)；3，3’二硫-雙(丙酸)N-(羥基琥珀酰亞胺酯)；乙二醇-雙(琥珀酸N-羥基琥珀酰亞胺酯)；6-(碘乙酰氨基)己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯；碘乙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯；3-馬來酰亞氨基苯甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯；γ-馬來酰亞氨基丁酸N-羥基琥珀酰亞胺酯；ε-馬來酰亞氨基己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯；4-(N-馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己胺-1-羧酸N-羥基琥珀酰亞胺酯；4-(N-馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己胺-1-羧酸3-磺基-N-琥珀酰亞胺酯鈉鹽；β-馬來酰亞氨基丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯；雙(聚氧乙烯雙[咪唑基羰基])；3-(2-吡啶基二硫)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯；辛二酸雙(N-羥基琥珀酰亞胺酯)；和雙(磺化琥珀酰亞胺酰)辛二酸酯。
抗體或其它蛋白與生物可降解顆粒的偶聯(lián)可以在10-9至10-3M的交聯(lián)劑的各種濃度下進(jìn)行。在一具體實(shí)施方式
中，使用了大約10-5M的濃度。
抗體濃度可以在大約20ng/ml至大約20mg/ml之間。其它蛋白的可以在大約5mg/ml至大約50mg/ml之間。在一具體實(shí)施方式
中，偶聯(lián)反應(yīng)的抗體或其它蛋白的濃度是大約2mg/ml。顆粒濃度可以在大約10-10至大約10-2M賴氨酸等價(jià)物之間。在一具體實(shí)施方式
中，顆粒的濃度是大約10-3M賴氨酸等價(jià)物。
表面分布、連接的長度和抗體或其它蛋白與細(xì)胞表面標(biāo)記之間的相互作用的優(yōu)化可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用例如將生物可降解聚合物和抗體偶聯(lián)的聚乙二醇(PEG)聯(lián)結(jié)子改變。以上將一個(gè)這樣的聚乙二醇聯(lián)結(jié)子說明為雙(聚氧乙烯雙[咪唑基羰基])。連接的抗體的專一性首先確定了抗體-聚合物偶聯(lián)物的細(xì)胞選擇性?？贵w片段例如Fab或Fab片段，包括Fab’，適于與生物可降解聚合物連接。
用于本發(fā)明的方法的單克隆抗體可以通過由培養(yǎng)中的連續(xù)細(xì)胞系提供抗體分子制備的任何技術(shù)獲得。這些技術(shù)包括但不限于Kohler和Milstein的雜交瘤技術(shù)(Nature，256495-497，1975；和美國專利號(hào)4,376,110)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等，Immunology Today，472，1983；Cole等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，802026-2030，1983)和BV雜交瘤技術(shù)(Cole等，Monoclonal AntibodiesAnd Cancer Therapy(Alan R.Liss.公司1985)，第77-96頁)。這樣的抗體可以是任何的免疫球蛋白類型包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和它們的任何亞類。產(chǎn)生本發(fā)明的mAb的雜交瘤可以在體外或體內(nèi)培養(yǎng)。體內(nèi)的高滴度的mAb的制備使其成為目前優(yōu)選的制備方法。
除了在本發(fā)明的方法中使用單克隆抗體，嵌合抗體和單鏈抗體也可被使用。嵌合抗體是一分子，其中不同的部分衍生自不同的動(dòng)物種，例如那些具有衍生自小鼠mAb的可變區(qū)和衍生自人免疫球蛋白的恒定區(qū)的抗體。可以通過將來自具有合適的抗原專一性的小鼠抗體分子的基因和來自合適的生物活性的人抗體分子的基因一起剪切制備“嵌合抗體”。(見Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.，816851-6855，1984；Neuberger等，Nature，312604-608，1984；Takeda等，Nature，314452-454，1985；和美國專利號(hào)816,567)。
可替換地，可以使用經(jīng)說明用于單鏈抗體的制備的技術(shù)(例如美國專利號(hào)4,946,778；Bird，Science，242423-426，1988；Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，855879-5883，1988；和Ward等，Nature，334544-546，1989)和用于制備人源化單克隆抗體的技術(shù)(美國專利號(hào)5,225,539)制備用于本發(fā)明的方法的單鏈抗體。
在一具體實(shí)施方式
中，顆粒被生長許可的、天然的胞外基質(zhì)(“ECM”)包被且交聯(lián)形成用于將細(xì)胞在基質(zhì)上固著的基質(zhì)表面。因此，這些ECM-包被的顆粒為貼壁依賴性細(xì)胞提供了貼附支持物。可使用以上的交聯(lián)劑使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法將ECM附著在顆粒上。ECM可以包括任何膠原蛋白的變體、纖連蛋白、層粘蛋白，或它們的組合。
在另一具體實(shí)施方式
中，使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法通過與交聯(lián)劑的交聯(lián)將抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白與生物可降解顆粒偶聯(lián)。
根據(jù)本發(fā)明，聚合物分子可以以任何適于形成活性偶聯(lián)物的方式與蛋白質(zhì)交聯(lián)。例如，可以使用與兩個(gè)或多個(gè)聚合物以及蛋白質(zhì)分子共價(jià)相連的雙功能或多功能的交聯(lián)劑將生物可降解的聚合物交聯(lián)。典型的雙功能的交聯(lián)劑包括醛的衍生物、環(huán)氧、琥珀酰亞胺、碳二亞胺、馬來酰亞胺、疊氮、碳酸鹽、異氰酸鹽、二乙烯砜、醇、胺、亞胺酯、酐、鹵化物、硅烷、重氮乙酸乙酯、氮丙啶等。可替換地，交聯(lián)可以通過使用氧化劑或其它試劑完成，例如高碘酸鹽，其活化聚合物上側(cè)鏈或基團(tuán)由此這些側(cè)鏈或基團(tuán)與其它側(cè)鏈或基團(tuán)反應(yīng)形成交聯(lián)鍵。交聯(lián)的其它方法包括將聚合物和蛋白質(zhì)暴露于照射，例如γ照射以活化側(cè)鏈聚合物允許交聯(lián)反應(yīng)。
在生物可降解顆粒和蛋白質(zhì)之間可以形成偶聯(lián)物，蛋白質(zhì)包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體或其片段、膠原蛋白I、膠原蛋白III、膠原蛋白IV、層粘蛋白、纖連蛋白、抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素蛋白。
4.聚合物珠的表面的反應(yīng)活性基團(tuán)的生物素化為了制備用于偶聯(lián)抗體的有力的、化學(xué)彈性的表面，本發(fā)明設(shè)想將生物素-抗生物素蛋白復(fù)合物或生物素-鏈霉抗生物素蛋白用作將抗體與生物可降解顆粒表面連接的手段。參考圖3，使用常規(guī)的或商業(yè)可獲得的生物素化試劑將共聚物的賴氨酰的ε-NH2基團(tuán)生物素化。合適的商業(yè)試劑的試劑盒是Sigma產(chǎn)品BK-101，其使用磺化-NHS生物素化試劑。對于某些應(yīng)用，可以使用可裂解生物素化試劑，如同在例如商業(yè)試劑盒BK-200(Sigma)中發(fā)現(xiàn)的一樣。通過將生物素引入生物可降解聚合物，獨(dú)立制備的抗體與抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白的偶聯(lián)物可以與生物素化的聚合物反應(yīng)。通過使用例如以上列舉的交聯(lián)試劑的標(biāo)準(zhǔn)方法可以制備抗生物素蛋白-抗體偶聯(lián)物或可替換的鏈霉抗生物素蛋白抗體偶聯(lián)物。
在可替換的具體實(shí)施方式
中，使用交聯(lián)試劑如碳二亞胺或以上列舉的其它試劑將生物可降解聚合物與抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白共價(jià)連接。抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白連接的生物可降解聚合物隨后和生物素化的抗體反應(yīng)產(chǎn)生與生物可降解聚合物顆粒連接的抗體，盡管是非共價(jià)連接的。參照圖4，這些方法允許將任何生物素化的抗體用于連接鏈霉抗生物素蛋白表面，由此產(chǎn)生與表面連接的抗體，抗體靶向細(xì)胞表面標(biāo)記。
5.由抗體-抗體偶聯(lián)進(jìn)行的抗體偶聯(lián)現(xiàn)在參照圖5，說明了本發(fā)明抗體連接的可替換的具體實(shí)施方式
。圖5說明了動(dòng)物種中針對靶向細(xì)胞的抗體的Fc部分的物種專一性抗體的應(yīng)用，該動(dòng)物種與用于產(chǎn)生針對細(xì)胞表面標(biāo)記抗體的物種不同。例如，在小鼠中靶向細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體與針對小鼠的Fc標(biāo)記產(chǎn)生的抗Fc單克隆抗體連接?？笷c抗體直接與聚(乳酸)-賴氨酸共聚物或共聚物活化的PEG連接偶聯(lián)，由此產(chǎn)生靶向相應(yīng)的細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體表面?？商鎿Q地，物種專一性抗體可被生物素化并隨后與聚合物顆粒上的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白表面偶聯(lián)，如圖5中所示。本發(fā)明因此創(chuàng)造了識(shí)別具有普通Fc結(jié)構(gòu)域的一組抗體的抗體表面。本方法的優(yōu)勢是針對細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體無需之前的化學(xué)修飾能夠連接到聚合物顆粒的表面。
6.靶向細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體的選擇本發(fā)明中使用了廣泛的針對肝細(xì)胞和非肝細(xì)胞的表面標(biāo)記的抗體。這些抗體包括商業(yè)可獲取抗體、由本發(fā)明者制備的抗體以及由其他人制備的抗體。這些抗體可包括ICAM-1的抗體、抗-大鼠RT1Aa，b，l或其人的等價(jià)物、抗-MHC I抗體、粘合素的抗體、生長因子受體的抗體以及糖蛋白的抗體。
本發(fā)明的組合物和應(yīng)用的實(shí)施例提供以下具體實(shí)施例是為了在實(shí)踐本發(fā)明的各個(gè)方面中更好地幫助讀者。由于這些具體實(shí)施例僅是說明性的，在以下說明中沒有任何事物應(yīng)被理解為以任何方式限定本發(fā)明。這樣的限定當(dāng)然僅由所附的權(quán)利要求定義。
1.生物可降解聚合物-抗體偶聯(lián)物在細(xì)胞結(jié)合和細(xì)胞群分離中的應(yīng)用在接近生理的條件下，將與靶向細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體連接的聚合物顆粒與混和細(xì)胞群的懸浮液共同培養(yǎng)。由此使用0℃至40℃的溫度，大約6至大約7.5的pH以及等滲溶液。在一具體實(shí)施方式
中，細(xì)胞與顆粒-抗體偶聯(lián)物在大約25℃、pH大約7.0在Hank’s BSS中培養(yǎng)大約30分鐘或更長。抗體-表面受體相互作用促進(jìn)了靶細(xì)胞和聚合物珠的結(jié)合。本發(fā)明假設(shè)多個(gè)細(xì)胞與各生物可降解聚合物顆粒的相互作用，或若干微顆粒珠與單個(gè)細(xì)胞的相互作用，或它們之間的任何比例。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠調(diào)整抗體的表面密度以及連接的長度從而為了任何目的優(yōu)化細(xì)胞和顆粒之間的相互作用。通過這些方法，由抗體識(shí)別的特定的細(xì)胞群連接到顆粒-抗體偶聯(lián)物上。由此，顆粒允許一個(gè)細(xì)胞群從混和群中的簡易分離。換句話說，本發(fā)明形成了對選定細(xì)胞群的積極分類方法和富集。顆粒-抗體偶聯(lián)物同樣地可被很好地用于消極分類或清除步驟，即通過使用為那些特定群選定的抗體將認(rèn)為不感興趣的細(xì)胞群去除。
在一具體實(shí)施例中，顆粒-抗體偶聯(lián)物被用于分離間葉細(xì)胞，將它們從包括肝祖細(xì)胞在內(nèi)的其它細(xì)胞中分離。將用間葉細(xì)胞的抗體制備的顆粒-抗體偶聯(lián)物與包含間葉細(xì)胞的混和細(xì)胞群共同培養(yǎng)。在培養(yǎng)后，將帶有貼附細(xì)胞的顆粒分離并接種至帶有分離小室的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。其它祖細(xì)胞例如肝祖細(xì)胞被隨后接種至其它小室中。在本實(shí)施例中，當(dāng)小室具有鄰近的培養(yǎng)基連接時(shí)，例如在Transwells皿中，隨后可以觀察肝祖細(xì)胞和間葉干細(xì)胞的遠(yuǎn)程相互作用。
可以使用顆粒通過將細(xì)胞固著在顆粒上富集細(xì)胞群中的細(xì)胞。固著在顆粒上的細(xì)胞可以是肝細(xì)胞、肝前體細(xì)胞、纖維原細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、或其它任何貼壁依賴性細(xì)胞。沒有固著在生物可降解顆粒上的細(xì)胞可以是任何非貼壁依賴性細(xì)胞包括造血細(xì)胞、造血前體細(xì)胞、紅血球、白血病細(xì)胞、和淋巴瘤細(xì)胞、以及不具有抗體-聚合物表面靶向的表面受體的細(xì)胞。
2.生物可降解的聚合物-抗體偶聯(lián)物在顆粒-細(xì)胞偶聯(lián)物的體外培養(yǎng)中的應(yīng)用以及它們在三維生物反應(yīng)器中的應(yīng)用如上所述，將與胞外基質(zhì)偶聯(lián)的生物可降解顆粒與貼壁依賴性細(xì)胞共同培養(yǎng)。胞外基質(zhì)的使用為貼壁依賴性細(xì)胞提供了有利的生長環(huán)境且允許細(xì)胞懸浮液從一個(gè)容器到另一個(gè)容器的便捷轉(zhuǎn)移。此外，本方法允許細(xì)胞群的簡易擴(kuò)增和細(xì)胞群的簡易取樣。
多種貼壁依賴性細(xì)胞適于與生物可降解顆粒-胞外基質(zhì)偶聯(lián)物一同使用，包括肝前體細(xì)胞、間葉細(xì)胞、間葉前體細(xì)胞、肌肉細(xì)胞包括心臟細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、纖維原細(xì)胞、干細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞。此外，內(nèi)分泌細(xì)胞也適于在顆粒-胞外基質(zhì)偶聯(lián)物上生長。
顆粒-細(xì)胞組合物也適于在生物反應(yīng)器的三維培養(yǎng)中生長。這樣的應(yīng)用為貼壁細(xì)胞群提供了營養(yǎng)培養(yǎng)基流和營養(yǎng)氣體流以及所需的代謝物和代謝廢物的方便交換。
3.生物可降解聚合物-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物在貼壁依賴性細(xì)胞的低溫保藏中的應(yīng)用通過將富集的細(xì)胞貼附在生物可降解聚合物支持物上，本發(fā)明的組合物也可提高低溫保藏的細(xì)胞的存活和復(fù)蘇。早前的用于細(xì)胞的低溫保藏的方法對通常存在于懸浮液中的造血細(xì)胞和適于細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞系是成功的，但對于貼壁依賴性細(xì)胞類型作用很差。通過使用胰蛋白酶或其它消化試劑的重懸浮的常規(guī)方法對貼壁依賴性肝細(xì)胞的低溫保藏造成相當(dāng)主要的細(xì)胞活力的喪失。此外，細(xì)胞喪失了它們的分化的特征且喪失了與固體表面貼附的能力。本發(fā)明將衍生的生物可降解顆粒用于細(xì)胞的固著。為細(xì)胞貼附提供顆粒-胞外基質(zhì)偶聯(lián)物，且隨后將其暴露于玻璃固化溶液中以防止冰晶的形成。合適的低溫保藏或玻璃固化溶液包括血清補(bǔ)充培養(yǎng)基的5至15％，典型地10％的二甲基亞砜(v/v)?？商鎿Q的玻璃固化溶液包含在不包含血清或血漿的合成培養(yǎng)基中10％的二甲基亞砜。此改進(jìn)是重要的改進(jìn)因?yàn)榘裨诳商鎿Q材料例如胞外基質(zhì)或藻酸鹽中的細(xì)胞必須在融解后重懸以具有大多數(shù)研究或臨床需要的實(shí)際用途。但是在融解后立即對細(xì)胞進(jìn)行酶處理幾乎不變地導(dǎo)致絕大多數(shù)細(xì)胞存活能力的喪失。細(xì)胞對操作特別敏感且對傳統(tǒng)低溫保藏和融解后立即進(jìn)行的酶處理高度脆弱。通過避免在融解后的酶處理，珠上的細(xì)胞強(qiáng)壯得多。顆粒上的細(xì)胞可以簡單地用細(xì)胞培養(yǎng)基沖洗或不做任何進(jìn)一步地處理直接使用。該步驟提高了低溫保藏的貼壁依賴性細(xì)胞的存活和功能以及細(xì)胞庫建立和細(xì)胞分型的高效運(yùn)作。
4.生物可降解聚合物-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物在細(xì)胞移植中的應(yīng)用在本發(fā)明的另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的方法為為了移植制備富集的貼壁依賴性細(xì)胞提供了有力的方法。生物可降解聚合物-蛋白質(zhì)-細(xì)胞偶聯(lián)物被直接移植進(jìn)血管或接受者的器官。在富集的祖細(xì)胞生長和成熟以及天然的胞外基質(zhì)以及組織結(jié)構(gòu)形成的同時(shí)，聚合物經(jīng)設(shè)計(jì)降解成組成的分子，這些分子在體內(nèi)天然存在。此外，據(jù)假設(shè)聚合物材料的溶解和清除將外來體排斥的問題最小化。
5.通過消極分類的細(xì)胞富集在需要的細(xì)胞沒有呈現(xiàn)獨(dú)特的可識(shí)別的細(xì)胞表面標(biāo)記的情況下，消極分類，可選擇地重復(fù)消極分類，可以在細(xì)胞群中富集需要的細(xì)胞型。典型實(shí)例如下。
通過上述方法制備生物可降解顆粒-血型糖蛋白A抗體(顆粒-Ab(GA))偶聯(lián)物。將濃度為106細(xì)胞/ml的107胚胎肝細(xì)胞的基本的單細(xì)胞的懸浮液與0.5g濕重的顆粒-Ab(GA)偶聯(lián)物混和。本上下文中的“基本的”指至少大約70％的細(xì)胞和其它細(xì)胞是分離的。在一具體實(shí)施方式
中，基本的單細(xì)胞懸浮液具有至少大約90％的細(xì)胞和其它細(xì)胞是分離的。在由Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基和Ham’s F12(DMEM/F12，GIBCO/BRL，Grand Island，NY)1∶1的混和組成的合成培養(yǎng)基(HDM)中將混合物在24℃培養(yǎng)24小時(shí)，在該培養(yǎng)基中加入了20ng/mlEGF(Collaborative Biomedical Products)、5μg/ml胰島素(Sigma)、10-7M地塞米松(Sigma)、10μg/ml鐵飽和的運(yùn)鐵蛋白(Sigma)、4.4×10-3M煙酰胺(Sigma)、0.2％(w/v)牛血清白蛋白(Sigma)、5×10-5M 2-巰基乙醇(Sigma)、7.6μeq/l游離脂肪酸、2×10-3M谷氨酰胺(GIBCO/BRL)、1×10-6M CuSO4、3×10-8M H2SeO3和抗生素。保留在懸浮液中且沒有與珠貼附的細(xì)胞在新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)或進(jìn)行隨后的分類。
6.通過積極分類的細(xì)胞富集在需要的細(xì)胞型呈現(xiàn)了至少一個(gè)獨(dú)特的可識(shí)別的細(xì)胞表面標(biāo)記的情況下，積極分類，可選擇地重復(fù)積極分類或積極和消極分類的組合，可以在細(xì)胞群中富集需要的細(xì)胞型。典型實(shí)例如下。
通過上述方法制備生物可降解顆粒-ICAM-1抗體(顆粒-Ab(ICAM-1))偶聯(lián)物。將濃度為106細(xì)胞/ml的107胚胎肝細(xì)胞的基本的單細(xì)胞的懸浮液與0.5g濕重的顆粒-Ab(ICAM-1)偶聯(lián)物混和。在由Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基和Ham’s F12(DMEM/F12，GIBCO/BRL，Grand Island，NY)1∶1的混和組成的合成培養(yǎng)基(HDM)中將混合物在24℃培養(yǎng)24小時(shí)，在該培養(yǎng)基中加入了20ng/ml EGF(CollaborativeBiomedical Products)、5μg/ml胰島素(Sigma)、10-7M地塞米松(Sigma)、10μg/ml鐵飽和的運(yùn)鐵蛋白(Sigma)、4.4×10-3M煙酰胺(Sigma)、0.2％(w/v)牛血清白蛋白(Sigma)、5×10-5M 2-巰基乙醇(Sigma)、7.6μeq/l游離脂肪酸、2×10-3M谷氨酰胺(GIBCO/BRL)、1×10-6M CuSO4、3×10-8M H2SeO3和抗生素。將貼附在顆粒上的細(xì)胞在新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
在另一實(shí)施例中，通過上述方法制備生物可降解顆粒-EpCAM-1抗體(顆粒-Ab(EpCAM-1))/NCAM-1(顆粒-Ab(NCAM-1))偶聯(lián)物。在另一具體實(shí)施方式
中，通過上述方法制備生物可降解顆粒-EpCAM-1抗體(顆粒-Ab(EpCAM-1))/ICAM-1(顆粒-Ab(ICAM-1))偶聯(lián)物。這些具有至少一個(gè)獨(dú)特的可識(shí)別的細(xì)胞表面標(biāo)記的生物可降解顆粒-抗體可被用于從細(xì)胞群中富集需要的細(xì)胞型。
7.顆粒-ECM偶聯(lián)物上的細(xì)胞培養(yǎng)在HDM中將通過任何方法富集的肝祖細(xì)胞群和與膠原蛋白IV偶聯(lián)的生物可降解顆粒共同培養(yǎng)。通過上述方法制備膠原IV-顆粒以產(chǎn)生500微米直徑的具有膠原IV對顆粒0.02％的比例(w/w)的顆粒。在37℃下，在95％(v/v)空氣/5％(v/v)CO2的大氣中將10克總濕重的膠原蛋白IV-顆粒懸浮于500ml的HDM。用106肝祖細(xì)胞接種膠原蛋白IV-顆粒且每兩天更換培養(yǎng)基。通過溫和振蕩將顆粒保持懸浮。通過pH和葡萄糖濃度的變化對細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞代謝進(jìn)行監(jiān)測且通過確定DNA含量監(jiān)測細(xì)胞生長。通過向培養(yǎng)混合物中加入新鮮顆粒為生長的培養(yǎng)物提供新的生長表面。
在其它實(shí)施例中，將通過任何方法富集的肝祖細(xì)胞群與和其它任何合適的專一化的基質(zhì)化學(xué)偶聯(lián)的生物可降解顆粒共同培養(yǎng)，基質(zhì)一般不受限的出現(xiàn)在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的層粘蛋白的胎兒形式、透明質(zhì)酸和肝素聚糖硫酸。
8.使用顆粒-貼壁細(xì)胞的細(xì)胞低溫保藏通過將帶有貼壁細(xì)胞的顆粒重懸在10％(v/v)二甲基亞砜的HDM溶液中并將含有大約1×106細(xì)胞的一份培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至無菌安瓶或管中，將如實(shí)施例6.4中在生物可降解顆粒上生長的貼壁依賴性細(xì)胞低溫保藏。安瓶或管被合適地密封且溫度以每分鐘大約1℃的速度降低至大約-80℃至大約-160℃之間。細(xì)胞不定期地保存在大約-160℃直至需要。當(dāng)需要時(shí)，安瓶或管被迅速融解，例如在溫水浴中。隨后將內(nèi)容物無菌地轉(zhuǎn)移至帶有培養(yǎng)基HDM的培養(yǎng)皿中。
9.肝衰竭模型中肝祖細(xì)胞的移植肝衰竭的大鼠模型被用于評估異源細(xì)胞移植治療。在10只雄性大鼠(125至160克體重)的實(shí)驗(yàn)組中通過手術(shù)去除大約70％的肝并/或?qū)⒖偰懝芙Y(jié)扎建立肝衰竭的模型。對10只年齡和性別匹配的大鼠組成的操作對照組進(jìn)行相似的麻醉、中線開腹和肝處理，但沒有膽管結(jié)扎也沒有肝切除。
如上所述制備固著在生物可降解珠上的富集的肝前體細(xì)胞群。簡言之，將12只胚胎大鼠仔(胚胎天數(shù)14)的肝臟無菌地移除、切碎，在不含鈣或鎂的pH7.0的Hank’s BSS的1mM EDTA中沖洗，隨后在含有0.5mg/ml的膠原蛋白酶的Hank’s BSS中培養(yǎng)達(dá)20分鐘以制備接近單細(xì)胞的懸浮液。
如上制備與ICAM-1抗體偶聯(lián)的無菌生物可降解顆粒。將12只鼠仔的單細(xì)胞肝懸浮液與1.5ml堆積體積的ICAM-1-微顆粒在25℃下共同培養(yǎng)1小時(shí)。隨后將顆粒稀釋在10倍體積的HDM中并在1×g下靜置5分鐘后棄掉。隨后重復(fù)該步驟。將顆粒溫和地重懸在新鮮的HDM中并在37℃下在95％空氣、5％CO2(v/v)的大氣中培養(yǎng)5天。
在肝切除或?qū)φ詹僮骱蟮谌欤瑢?shí)驗(yàn)和操作對照的大鼠進(jìn)行5mm腹切以暴露脾臟。對隨機(jī)選擇的實(shí)驗(yàn)和操作對照組動(dòng)物的各一半動(dòng)物向脾中直接各注射0.1ml的生物可降解-顆粒-ICAM-1-胚胎肝細(xì)胞組合物。用手術(shù)針關(guān)上所有的切口。每日進(jìn)行1mg/kg體重的免疫抑制劑環(huán)孢靈的腹腔內(nèi)給藥。
在肝切除或?qū)φ崭吻谐僮鞯膬商烨盎蚴中g(shù)后第3、7、14和28天監(jiān)測膽紅素、γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的血液水平。在同一天記錄體重、水消耗和嗜睡的視覺檢查。在肝切除后的第28天，殺死所有的存活動(dòng)物以進(jìn)行脾和肝的組織學(xué)評估。
在此參考的所有的公開物、專利、和專利文件由此分別完整地被參考引用。
已參考此前的具體的和優(yōu)選的具體實(shí)施方式
以及方法對本發(fā)明進(jìn)行了說明。但是，應(yīng)當(dāng)明白可以在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)進(jìn)行很多變化。因此，此前的實(shí)施例是非限定性的，且本發(fā)明的范圍應(yīng)僅由隨后的權(quán)利要求限定。
附錄A表1.游離脂肪酸(FFA)混合物的制備純化的脂肪酸的來源見表2儲(chǔ)備液的制備通過將各獨(dú)立成分溶解在100％乙醇中制備游離脂肪酸。建議如下軟脂酸(固體)1M儲(chǔ)備液；溶于熱醇棕櫚油酸1M儲(chǔ)備液；易溶于醇油酸1M儲(chǔ)備液；易溶于醇亞油酸 1M儲(chǔ)備液；易溶于醇亞麻酸 1M儲(chǔ)備液；易溶于醇151mM儲(chǔ)備液，以每21毫升1克溶于醇且必硬脂酸(固體)須加熱。
可以通過在各儲(chǔ)備液中吹入氮?dú)鈿馀莶㈦S后儲(chǔ)存在-20℃穩(wěn)定這些儲(chǔ)備液。
游離脂肪酸混合物儲(chǔ)備溶液軟脂酸(固體)31.0mM棕櫚油酸2.8mM油酸13.4mM亞油酸 35.6mM亞麻酸 5.6mM硬脂酸 11.6mM這產(chǎn)生了總的100mM的混和游離脂肪酸。也可以通過吹入氮?dú)鈿馀莶㈦S后將其儲(chǔ)存在-20℃穩(wěn)定具有所有游離脂肪酸的該儲(chǔ)備液。
終溶液在每升培養(yǎng)基中加入76μl的游離脂肪酸混合物儲(chǔ)備液以達(dá)到7.6μEq的終濃度。除非與純化的、無脂肪酸、無內(nèi)毒素的血清白蛋白(例如Pentex V型血清)一起存在，否則游離脂肪酸是有毒的。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基或PBS中制備將要使用的且典型濃度在0.1-0.2％的白蛋白。
表2.基礎(chǔ)培養(yǎng)基/生長因子/基質(zhì)成分以及其它培養(yǎng)成分的來源





權(quán)利要求
1.一種組合物，包含至少一種生物可降解顆粒，至少一種與其共價(jià)連接的接受基團(tuán)，和至少一種固著在所述的至少一種接受基團(tuán)上的細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中該接受基團(tuán)包含抗體、抗體片段、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、生物素基序或它們的組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中該顆粒包含聚丙交酯、聚丙交酯-賴氨酸共聚物、聚丙交酯-賴氨酸-聚乙二醇共聚物、淀粉或蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，進(jìn)一步包含胞外基質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中該胞外基質(zhì)包含膠原蛋白、纖連蛋白、層粘蛋白、或它們的組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中顆粒是大顆粒、微顆?；蚣{米顆粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中該細(xì)胞選自肝細(xì)胞、肝前體細(xì)胞和造血前體細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中該顆粒是生物相容的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中該接受基團(tuán)在至少一種水或有機(jī)溶劑中穩(wěn)定。
10.一種低溫保藏貼壁依賴性細(xì)胞的方法，包含(a)允許細(xì)胞固著在包含至少一種生物可降解顆粒的組合物上形成混合物，且(b)冷凍該混合物；(c)從細(xì)胞-聚合物顆粒偶聯(lián)物中融解并復(fù)蘇細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中該生物可降解顆粒進(jìn)一步包含與該顆粒共價(jià)連接的接受基團(tuán)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中該接受基團(tuán)包含抗體、抗體片段、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、生物素基序或它們的組合。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，進(jìn)一步包含胞外基質(zhì)。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，進(jìn)一步包含低溫保藏溶液。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中該低溫保藏溶液包含10％(v/v)的二甲基亞砜。
16.一種分離細(xì)胞的方法，包含(a)提供一組合物，該組合物包含至少一種生物可降解顆粒，至少一種與其共價(jià)連接的接受基團(tuán)，至少一種固著在所述的至少一種接受基團(tuán)上的細(xì)胞，以及至少一種不固著在其上的細(xì)胞。(b)去除至少一種不固著在該生物可降解顆粒上的細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中該接受基團(tuán)是抗體、抗體片段、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、生物素基序或它們的組合。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中該固著在生物可降解顆粒上的細(xì)胞包含肝細(xì)胞或肝前體細(xì)胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中不固著在生物可降解顆粒上的該細(xì)胞包含造血前體細(xì)胞。
20.一種對貼壁依賴性細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)方法，包含(a)提供一組合物，該組合物包含至少一種生物可降解顆粒、至少一種與其共價(jià)連接的接受基團(tuán)，和至少一種與所述的至少一種接受基團(tuán)貼附的細(xì)胞；且(b)將該組合物與細(xì)胞培養(yǎng)基接觸。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中該組合物進(jìn)一步包含胞外基質(zhì)。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中該細(xì)胞包含肝前體細(xì)胞、造血前體細(xì)胞、纖維原細(xì)胞、間葉細(xì)胞、心臟細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞中的至少一種，或它們的組合。
23.一種對需要細(xì)胞治療的主體的治療，包含對主體以組合物的有效量給藥，該組合物包含至少一種生物可降解顆粒，至少一種與其共價(jià)連接的接受基團(tuán)，和至少一種固著在所述至少一種接受基團(tuán)上的細(xì)胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的治療，其中該細(xì)胞包含肝前體細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的治療，其中該組合物被靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)或它們的任意組合給藥。
26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中該有效量落在大約102至大約1011個(gè)細(xì)胞的范圍內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明公開了生物可降解顆粒－細(xì)胞組合物，該組合物具有至少一種生物可降解顆粒，至少一種與其共價(jià)連接的接受基團(tuán)，和至少一種與其貼附的細(xì)胞。該顆粒可以是聚丙交酯、聚丙交酯－賴氨酸共聚物、聚丙交酯－賴氨酸－聚乙二醇共聚物、淀粉或膠原蛋白。該接受基團(tuán)可以是抗體、抗體片段、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、或生物素基序。此外，該顆粒還可以具有除膠原蛋白以外的胞外基質(zhì)成分。該顆粒－細(xì)胞組合物可被用于從細(xì)胞群中的細(xì)胞選擇，貼壁依賴性細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)，貼壁依賴性細(xì)胞的低溫保藏，作為細(xì)胞治療的移植。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1875101SQ200480031658
公開日2006年12月6日 申請日期2004年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月2日
發(fā)明者艾潤·S·L·徐, 洛拉·M·里德 申請人:北卡羅來納-查佩爾山大學(xué)