專利名稱：：用來檢測分析物的半透性傳感器的制作方法背景本發(fā)明涉及制造用來檢測葡萄糖之類分析物的傳感器。有效治療糖尿病需要監(jiān)控糖尿病患者體內(nèi)的葡萄糖水平的變化。目前是通過反復(fù)針刺糖尿病患者的手指獲取評價所需血樣來監(jiān)控患者的狀況。對葡萄糖的自監(jiān)控是不連續(xù)的，無法提供個人體內(nèi)葡萄糖水平的實(shí)時信息。已經(jīng)提出了各種用來連續(xù)監(jiān)控葡萄糖水平的具有可植入傳感器的系統(tǒng)，這些傳感器包含能夠監(jiān)測體內(nèi)葡萄糖水平的試劑。然而，由于許多會影響傳感器在宿主體內(nèi)適當(dāng)運(yùn)作的因素，很難制得有用的可植入傳感器。例如，宿主的免疫系統(tǒng)會對傳感器進(jìn)行攻擊。這種攻擊會在傳感器周圍形成纖維鞘，這種纖維鞘會妨礙，可能會阻止葡萄糖進(jìn)入傳感器，使傳感器基本無效。如果宿主免疫系統(tǒng)的各種組分能夠進(jìn)入傳感器，它們還會攻擊傳感器的試劑。如果傳感器的滲透性過高，試劑會從傳感器泄漏入宿主體內(nèi)，對宿主造成傷害，而且會耗盡可用來檢測葡萄糖的試劑的量。另外，如果傳感器的滲透性過于有限，或傳感器的試劑對宿主葡萄糖水平變化的應(yīng)答過慢，則傳感器所提供的信息無法準(zhǔn)確反應(yīng)宿主的生理狀況。需要能夠克服這些困難，并且能長期連續(xù)監(jiān)控葡萄糖的傳感器。概述在一個方面，本發(fā)明提供一種用來檢測分析物的傳感器，該傳感器包括含有水凝膠的芯；位于該芯內(nèi)的熒光試劑；包圍著該芯的半透性涂層，該半透性涂層包含分子量約為4kDa至18kDa、多分散指數(shù)大于1的多分散聚合物；以及包圍著所述半透性涂層的生物相容性涂層。在一些實(shí)施方式中，所述多分散聚合物的分子量約為8kDa至12kDa。在另外的實(shí)施方式中，所述多分散聚合物的分子量約為9kDa至10kDa。在一實(shí)施方式中，所述多分散聚合物的分子量約為9.4kDa。在一些實(shí)施方式中，所述多分散聚合物的多分散指數(shù)從大于1至約1.5。在另外的實(shí)施方式中，所述多分散聚合物包括聚賴氨酸。在一實(shí)施方式中，傳感器的直徑大于1毫米。在另外的實(shí)施方式中，傳感器的直徑至少為1.25毫米。在另一實(shí)施方式中，傳感器的直徑至少為1.5毫米。在一些實(shí)施方式中，傳感器的直徑不超過3毫米。在另外的實(shí)施方式中，傳感器的直徑不超過2.5毫米。在一些實(shí)施方式中，分析物包含葡萄糖。在一實(shí)施方式中，傳感器能夠根據(jù)非輻射熒光共振能量傳輸檢測分析物。在一些實(shí)施方式中，所述熒光試劑包含能量受體(acceptor)和能量給體(donor)。在另外的實(shí)施方式中，熒光試劑選自羰花青染料、磺化氨基香豆素染料(sulfonatedaminocourmarindye)、磺化若丹明染料及其組合。在一實(shí)施方式中，所述熒光試劑包含葡萄糖結(jié)合蛋白和糖基化的底物。在一些實(shí)施方式中，所述葡萄糖結(jié)合蛋白包括伴刀豆球蛋白A，糖基化的底物包括人血清白蛋白。在另一實(shí)施方式中，熒光試劑包含激發(fā)最大值約在581納米、發(fā)射最大值約在596納米的第一羰花青染料，伴刀豆球蛋白A，激發(fā)最大值約在675納米、發(fā)射最大值約在694納米的第二羰花青染料，和人血清白蛋白。在另外的實(shí)施方式中，所述第一羰花青與伴刀豆球蛋白A之比約為0.1-0.4。在一些實(shí)施方式中，所述第一羰花青與伴刀豆球蛋白A之比為0.2。在一實(shí)施方式中，第二羰花青與人血清白蛋白之比約為0.5-0.9。在一些實(shí)施方式中，所述人血清白蛋白是糖基化的，葡萄糖與人血清白蛋白的摩爾比約為7-12。在另一方面，本發(fā)明涉及制造傳感器的方法，該方法包括使水性藻酸鹽組合物的液滴與包含至少100mM第II族陽離子的離子溶液接觸，形成包含交聯(lián)凝膠的芯，所述水性藻酸鹽組合物包含含有至少1％重量/體積的藻酸鹽、在約25℃的粘度至少為1700厘泊的原液組合物的兩倍稀釋物。在一實(shí)施方式中，所述離子包括鋇離子、鈣離子或其組合。在一些實(shí)施方式中，所述藻酸鹽組合物包含約1％重量/體積至約10％重量/體積的藻酸鹽。在另外的實(shí)施方式中，所述藻酸鹽包含約1％重量/體積至約3％重量/體積的藻酸鹽。在一實(shí)施方式中，所述原液組合物在約25℃的粘度約為1700-2000厘泊。在另外的實(shí)施方式中，所述離子溶液包含約100mM至300mM的陽離子。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括用包含多分散指數(shù)大于1的多分散聚合物的組合物涂布該芯。在另外的實(shí)施方式中，該方法還包括用包含多分散指數(shù)從大于1至約1.5的多分散聚合物的組合物涂布該芯。在另一實(shí)施方式中，該方法還包括用生物相容性組合物涂布多分散聚合物。在一實(shí)施方式中，該方法還包括使芯與包含熒光試劑的組合物接觸。在一些實(shí)施方式中，所述水性藻酸鹽組合物包含熒光試劑。在一實(shí)施方式中，所述熒光試劑包含能量給體和能量受體。在另外的實(shí)施方式中，所述熒光試劑包含葡萄糖結(jié)合蛋白和糖基化的底物。在一實(shí)施方式中，所述葡萄糖結(jié)合蛋白包括伴刀豆球蛋白A，所述糖基化的底物包括人血清白蛋白。在一些實(shí)施方式中，所述熒光試劑選自羰花青染料、磺化氨基香豆素染料、磺化若丹明染料及其組合。在另外的實(shí)施方式中，所述熒光試劑包含羰花青染料、磺化氨基香豆素染料、磺化若丹明染料及其組合。在另一實(shí)施方式中，所述第一羰花青與伴刀豆球蛋白A之比約為0.1-0.4。在另外的實(shí)施方式中，所述第一羰花青與伴刀豆球蛋白A之比為0.2。在一些實(shí)施方式中，所述第二羰花青與人血清白蛋白之比約為0.5-0.9。在一實(shí)施方式中，葡萄糖結(jié)合蛋白包括伴刀豆球蛋白A，糖基化的底物包括人血清白蛋白。在另一實(shí)施方式中，所述人血清白蛋白是糖基化的，葡萄糖與人血清白蛋白的摩爾比約為7-12。在另外的實(shí)施方式中，所述熒光試劑包含具有在約578納米的激發(fā)最大值和在約603納米的發(fā)射最大值的第一染料，伴刀豆球蛋白A，具有在約650納米的激發(fā)最大值和在約665納米的發(fā)射最大值的第二染料，和人血清白蛋白。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)傳感器在37℃、pH值＝7.4的條件下，在10mMHEPES/0.15M食鹽水中貯存兩周時，熒光試劑的泄漏小于1摩爾％。在另一方面，本發(fā)明涉及用來檢測分析物的傳感器，該傳感器包括包含聚合物基質(zhì)的芯；位于該芯內(nèi)的熒光試劑；包圍該芯的半透性涂層，該半透性涂層包含多分散聚合物；以及包圍著所述半透性涂層的生物相容性涂層。當(dāng)傳感器在37℃、pH值＝7.4的條件下，在10mMHEPES/0.15M食鹽水中貯存兩周時，熒光試劑的泄漏小于1摩爾％。本發(fā)明涉及一種可用來檢測葡萄糖之類的分析物的可植入、可移出(explantable)的傳感器。該傳感器的剛性足以進(jìn)行植入和移出，可發(fā)生足夠的形變以耐受身體的各種日常作用力而不發(fā)生破裂，尺寸大到足以觸知(palpable)。所述傳感器也足夠大，足以使宿主在傳感器周圍形成鞘，所形成的鞘足夠厚，足以使傳感器維持在原處，并且足夠薄，足以使相關(guān)分析物以生理學(xué)有用的速率擴(kuò)散入傳感器中和從傳感器中擴(kuò)散出來。傳感器足夠小，足以使分析物以生理學(xué)有用的速率擴(kuò)散入傳感器中和從傳感器中擴(kuò)散出來。所述傳感器具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度，使其能夠在宿主體內(nèi)穩(wěn)定存在至少6個月，甚至至少12個月，該傳感器具有足夠的生物相容性，使得在這至少6個月，甚至至少12個月內(nèi)傳感器不會引發(fā)對其適當(dāng)工作有害的纖維化應(yīng)答。該傳感器的可滲透性足以使分析物以生理學(xué)適當(dāng)?shù)乃俾蕯U(kuò)散入傳感器中和從傳感器中擴(kuò)散出來，其不可滲透性足以將試劑保持在傳感器內(nèi)(即該傳感器沒有或基本沒有試劑泄漏)，并且阻擋IgG，基本防止其進(jìn)入傳感器。由以下優(yōu)選實(shí)施方式的描述和權(quán)利要求書可清楚地了解其它特征和優(yōu)點(diǎn)。術(shù)語表根據(jù)本發(fā)明，這些術(shù)語含義如下在本文中，術(shù)語“熒光團(tuán)”表示能夠吸收能量，然后發(fā)光的分子。在本文中，術(shù)語“分析物類似物”表示一種材料，該材料至少有一些結(jié)合性質(zhì)與分析物的結(jié)合性質(zhì)相同，使得具有可同時結(jié)合二者的配體。然而，分析物類似物與分析物不能互相結(jié)合。所述分析物類似物可以是分析物的衍生物，例如通過在分析物上引入至少不會影響分析物的一些結(jié)合性質(zhì)的官能團(tuán)制得的化合物。另一種衍生物的例子是分析物的較低分子量的變體，該變體保持分析物的至少一些結(jié)合性質(zhì)。另一衍生物的例子是分析物或分析物的多份拷貝與載體蛋白質(zhì)的共價共軛物。在本文中，術(shù)語“可生物相容的”表示可被宿主的免疫系統(tǒng)接受，即誘發(fā)的免疫應(yīng)答最小且對宿主無毒。在本文中，術(shù)語“熒光”表示受到特定波長輻射激發(fā)而發(fā)射的輻射。其包括短壽命(納秒級)和長壽命激發(fā)態(tài)壽命；后者有時稱為磷光。在本文中，術(shù)語“熒光試劑”表示在存在受測分析物的條件下，熒光性能(例如強(qiáng)度、發(fā)射激發(fā)態(tài)壽命、光譜或激發(fā)光譜)發(fā)生變化的組分。在本文中，發(fā)射最大值或激發(fā)最大值是相對于在水中獲得的值而言。附1A是給體和受體分子吸收光譜和發(fā)射光譜的示意圖。圖1B是非輻射能量傳輸?shù)氖疽鈭D。圖2是通過立體解剖顯微鏡20X的物鏡得到的傳感器彩色照片，該照片包括包圍在鋸齒狀聚賴氨酸涂布的藻酸鹽芯周圍的藻酸鹽涂層。圖3是實(shí)施例1中測得的泄漏數(shù)據(jù)的圖。圖4是說明比較例1-3和實(shí)施例1的小球(bead)在第14天的Cy3.5泄漏的柱狀圖。詳述所述傳感器包括芯，該芯包含聚合物基質(zhì)和位于聚合物基質(zhì)中的試劑；包圍在所述芯周圍的包含多分散聚合物的半透性涂層；包圍著所述半透性涂層的生物相容性涂層。傳感器的構(gòu)造能夠保留住試劑，同時使分析物能夠以可提供分析物相關(guān)生理狀況的有用信息的速率擴(kuò)散入傳感器內(nèi)和從傳感器內(nèi)擴(kuò)散出來。傳感器的結(jié)構(gòu)可設(shè)計(jì)成適于以體內(nèi)、體外或其組合形式使用，可用來檢測包括體液在內(nèi)的各種液體(例如血液、血漿、血清、皮下組織液和腹膜液)中的分析物。通過激發(fā)傳感器的試劑，然后檢測傳感器發(fā)射的輻射來檢測分析物(并任選地定量)。優(yōu)選的傳感器足夠大，使得將其植入皮下時可被觸知(即在進(jìn)行以后的移出時便于定位)，而且足以誘發(fā)宿主在傳感器周圍形成鞘。鞘用來維持傳感器在宿主體內(nèi)的位置(例如固定)。優(yōu)選的是鞘的厚度足夠小，足以使分析物以生理學(xué)適當(dāng)?shù)乃俾蕯U(kuò)散入傳感器和從傳感器中擴(kuò)散出來。傳感器也足夠小，使得分析物能夠以生理學(xué)適當(dāng)?shù)乃俾蕯U(kuò)散入傳感器和從傳感器中擴(kuò)散出來，傳感器內(nèi)的試劑以生理學(xué)適當(dāng)?shù)乃俾蕦ι頎顩r的改變做出應(yīng)答。對于任意形狀的傳感器，分析物擴(kuò)散入傳感器的特征時間可用傳感器中心與表面上的點(diǎn)的平均距離表示。如果該距離稱為x，D是分析物的擴(kuò)散系數(shù)，則分析物擴(kuò)散通過傳感器的特征時間(t)可表示為t＝x2/6D。優(yōu)選的傳感器是球形的，直徑大于1毫米，至少為1.25毫米，至少1.5毫米，不大于3毫米，甚至不大于2.5毫米。有用的傳感器具有各種形狀，包括例如球形、圓柱形、橢圓形、卵形和圓盤形。傳感器可構(gòu)造成包括被相同的聚合物基質(zhì)包圍的多個芯，即多個聚合物基質(zhì)。優(yōu)選的是傳感器的折射率基本與水的折射率相同，使其不發(fā)生光散射，在水性環(huán)境下基本透明。優(yōu)選的是，傳感器具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度(例如剛性)，使其能夠植入宿主和從宿主體內(nèi)取出，具有足夠的可變形性，以吸收在日常過程中所受的宿主的作用力。優(yōu)選的是，傳感器具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度，使傳感器傳感器能夠保持長期植入宿主，例如至少6個月，甚至至少12個月而不發(fā)生破裂或喪失完整性。傳感器的機(jī)械強(qiáng)度可源自聚合物基質(zhì)、半透性涂層、生物相容性涂層及其組合。也可使用保護(hù)載體或外殼使傳感器具有機(jī)械強(qiáng)度。所述外殼包括例如金屬(例如鈦、鉑、金及其組合)制網(wǎng)格狀封套。可通過改變用來形成聚合物基質(zhì)的可交聯(lián)組分的濃度以及聚合物基質(zhì)的交聯(lián)程度來改變聚合物基質(zhì)的機(jī)械強(qiáng)度。聚合物基質(zhì)優(yōu)選由可交聯(lián)組合物制得，使得最終的基質(zhì)當(dāng)完全水合時至少含50體積％，90體積％，92體積％，95體積％，98體積％，甚至99體積％的水。優(yōu)選的是聚合物基質(zhì)是水凝膠。水凝膠可由藻酸鹽之類的可交聯(lián)組分制成。一種可用的可交聯(lián)藻酸鹽組合物是由在室溫下(即約20-25℃)粘度至少為1700厘泊，甚至1700厘泊至約2000厘泊的藻酸鹽儲存液制成，該溶液在使用前1∶1地稀釋，形成包含至少1％重量/體積(w/v)，約1％w/v至約10％w/v，甚至約1％w/v至約3％w/v的藻酸鹽水溶液的可交聯(lián)組合物。優(yōu)選通過將藻酸鹽組合物滴入包含至少100mM(毫摩爾)，約100-300mM，甚至約100-150mM離子的濃離子溶液中，使藻酸鹽交聯(lián)。有用的離子包括第II族陽離子，包括例如鈣離子、鋇離子、鎂離子及其組合。優(yōu)選的藻酸鹽凝膠源自包含連接在一起的1，4-連接的(D-甘露糖醛酸)(M)和(-1-葡糖醛酸(glocoronicacid))(G)區(qū)段(例如MG區(qū)段交替連結(jié))的藻酸鹽。優(yōu)選的藻酸鹽具有高G區(qū)段含量，例如至少含有約60％的G區(qū)段。隨著藻酸鹽組合物中G區(qū)段百分含量的增加，所得凝膠基質(zhì)的孔徑和強(qiáng)度會增大。具有高M(jìn)區(qū)段含量的藻酸鹽凝膠比具有高G區(qū)段含量的凝膠更容易導(dǎo)致免疫。其它合適的凝膠包括能夠形成具有足夠強(qiáng)度的芯，使其能夠保持所需傳感器形狀的任何凝膠。可用的水凝膠的例子包括例如角叉藻聚糖、樹膠(例如黃原膠)、瓊脂糖、瓊脂、骨膠原、明膠、殼聚糖、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷及其組合。其它有用的聚合物基質(zhì)包括例如聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯及其組合。合適的形成聚合物基質(zhì)的方法包括例如向能夠形成凝膠的組合物(gelformingcomposition)中加入水，向可交聯(lián)組合物施加交聯(lián)劑，改變能夠形成凝膠的組合物的溫度(例如加熱)，使能夠形成凝膠的組合物暴露于輻射，以及它們的組合。對形成聚合物基質(zhì)的條件進(jìn)行選擇，以保持傳感器組分的整體性。可通過改變該組合物中可交聯(lián)組分的濃度、交聯(lián)劑的濃度、交聯(lián)過程的環(huán)境條件(例如溫度、pH值、鹽度和輻照)、加入鏈轉(zhuǎn)移劑、加入引發(fā)劑及其組合來改變聚合物基質(zhì)的交聯(lián)度?；蛘咚鲂具€可包括一種水溶液，在此情況下對半透膜進(jìn)行選擇，使傳感器具有足夠的剛性，使其適于植入和移出。芯可已有各種形狀，包括例如球形、扁圓球形、長球形、圓柱形和圓盤狀。優(yōu)選的是芯為球形小珠。可使用任何適合用來制造微球狀小珠的方法來制造芯，這些方法包括例如乳化、電噴鍍、滴下、Raleigh噴射(例如空氣噴射)，和澆注?？捎脕碇圃靾A柱形和圓片形芯的方法包括例如先擠出然后切割，以及澆住。所述聚合物基質(zhì)的孔隙率影響組分通過聚合物基質(zhì)的遷移，可通過幾種方法改變孔隙率，這些方法包括例如改變用來形成聚合物基質(zhì)的組合物中可交聯(lián)組分的濃度，改變可交聯(lián)材料的平均分子量，改變可交聯(lián)組分的分子量分散度，改變可交聯(lián)組分的組成，在可交聯(lián)組分中摻雜其他可交聯(lián)組分，使用不同的交聯(lián)劑，改變可交聯(lián)組分的羥基化程度，及其組合?？杉尤朐逅猁}中以改變由此形成的凝膠的組分包括例如明膠和骨膠原。其他合適的交聯(lián)劑包括例如鋇離子、鈣離子之類的其它具有相同價態(tài)的離子，蛋白質(zhì)交聯(lián)劑(例如伴刀豆球蛋白A(concavalinA)之類的外源凝聚素)，光致交聯(lián)劑，化學(xué)交聯(lián)劑(例如戊二醛(gluteraldehyde))以及它們的組合。可添加或減少加入凝膠基質(zhì)的物料以改變其孔隙率。例如在Thu，B.J.的名為″AlginatepolycationmicrocapsulesAstudyofsomemolecularandfunctionalpropertiesrelevanttotheiruseasabioartificialpancreas，″NorwegianUniversityofScienceandTechnology，pages35-46(August1996)的論文中描述了各種可用來改變藻酸鹽孔隙率的機(jī)理，其中包括改變藻酸鹽中M區(qū)段與G區(qū)段之比。用來形成水凝膠的可交聯(lián)組合物的溫度能夠影響所制得的凝膠基質(zhì)的孔徑。例如，可交聯(lián)組合物溫度的升高會導(dǎo)致水凝膠收縮，這會減小水凝膠的孔隙率。優(yōu)選的是芯的聚合物基質(zhì)的折射率與水的折射率基本相同，不會在用來激發(fā)傳感器的試劑的波常范圍內(nèi)發(fā)射熒光，而且不具有光散射性。優(yōu)選傳感器的外表面足夠光滑，使光散射最少，優(yōu)選消除光散射。通過立體解剖顯微鏡在透射光環(huán)照射下觀察傳感器來測定傳感器的平滑度，所述顯微鏡的物鏡為0.8X至5X，目鏡為10倍，總共放大倍數(shù)為8X至50X。一種有用的形成平滑傳感器的方法包括，通過將可交聯(lián)組合物的液滴分散在高濃度交聯(lián)劑中，使可交聯(lián)組合物快速交聯(lián)形成水凝膠芯，從而形成平滑的芯，該過程優(yōu)選在使振動最小(例如隔振)的條件下進(jìn)行。適用于交聯(lián)藻酸鹽的濃交聯(lián)劑組合物包括上述的可交聯(lián)組合物和離子交聯(lián)溶液，這些描述結(jié)合入本文中。傳感器的芯還包括能夠檢測是否存在分析物的試劑。該試劑優(yōu)選可在聚合物基質(zhì)中移動。傳感器的試劑可包含一種以上的組分。該試劑適合用來檢測體液(例如血液和間質(zhì)液)之類液體中的分析物。有用的試劑包括例如吸能試劑(例如吸光試劑和吸聲試劑)，x-射線試劑，自旋共振試劑，核磁共振試劑及其組合。在一些實(shí)施方式中，所述試劑的價態(tài)足以使試劑聚集，以增強(qiáng)在發(fā)生結(jié)合時，或不發(fā)生結(jié)合時試劑所發(fā)射的信號。試劑的聚集也有助于將試劑保持在傳感器中，即試劑不會通過半透性涂層到傳感器的外面。優(yōu)選試劑是多價的，例如包括至少兩個能夠與分析物結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)。在基于非輻照熒光能量傳輸?shù)那闆r下，如下面將更詳細(xì)討論的，該試劑可包含分析物類似物和能夠與該分析物類似物結(jié)合的配體。優(yōu)選的是所述分析物類似物具有至少兩個能夠與配體結(jié)合的位點(diǎn)。優(yōu)選該試劑至少為2價，2-15價，甚至3-10價。對試劑進(jìn)行選擇，使得位于檢測器和傳感器之間的皮膚和其他人體組織不會影響試劑發(fā)射的信號。優(yōu)選的試劑所發(fā)射的光信號的波長能夠透過皮膚，優(yōu)選的是試劑發(fā)光為600nm至1100nm。一種有用的試劑包括熒光試劑，即包含熒光團(tuán)的試劑或用熒光團(tuán)標(biāo)記的化合物。熒光試劑能夠可逆地與分析物結(jié)合，當(dāng)發(fā)生與分析物結(jié)合時，試劑的熒光性能會發(fā)生變化?？赏ㄟ^幾種方法測量與分析物的存在相關(guān)的熒光變化。這些變化包括熒光團(tuán)(或用熒光團(tuán)標(biāo)記的組分)激發(fā)態(tài)壽命的變化，或所發(fā)射熒光強(qiáng)度的變化。這些變化還包括熒光團(tuán)(或用熒光團(tuán)標(biāo)記的組分)的激發(fā)光譜或發(fā)射光譜的變化。激發(fā)光譜或發(fā)射光譜的變化也可通過測量以下現(xiàn)象來測量(a)發(fā)射峰的出現(xiàn)或消失，(b)在兩個或更多發(fā)射波長觀察到的信號之比，(c)激發(fā)峰的出現(xiàn)或消失，(d)在兩個或更多激發(fā)波長觀察到的信號的比例或(e)熒光偏振的變化?？蓪υ噭┻M(jìn)行選擇，使其具有非輻射熒光共振能量傳輸(FRET)，該能量傳輸可用來測量特定結(jié)合對之間是否發(fā)生了結(jié)合或結(jié)合的程度。FRET的基本原理FRET通常包括兩個熒光團(tuán)之間的非輻射能量傳輸，一個是能量給體(D)，另一個是能量受體(A)。可使用任何適當(dāng)選擇的給體-受體對，只要給體的發(fā)射光譜與受體的激發(fā)光譜相重疊，而且兩者均能夠在一定波長吸收光能，并在不同的波長發(fā)射光能?；蛘呓o體和受體均能吸收光能，但是僅有其中之一能夠發(fā)射光能。例如一種分子(給體)可以是熒光性的，另一種分子(受體)可以是非熒光性的。還可使用一種給體-受體對，其中受體在用來激發(fā)(熒光)給體的波長下通常不會被激發(fā)；然而，非輻射FRET會造成受體激發(fā)?？蓪ぐl(fā)波長進(jìn)行選擇，使其主要僅激發(fā)給體分子。使用術(shù)語″主要″說明由于滲過現(xiàn)象(bleedthroughphenomena)，也可能有一些受體被激發(fā)。因此，在本文中，術(shù)語給體或受體的″激發(fā)″表示主要激發(fā)給體或受體的激發(fā)波長。激發(fā)之后，通過測量兩個發(fā)射波長的熒光信號的比例測定非輻射熒光共振能量傳輸，其中一個波長的熒光是給體發(fā)射的，另一個是受體發(fā)射的。正如在激發(fā)的情況那樣，熒光信號可能有一些″滲出″，使得受體的發(fā)射對給體發(fā)射信號的貢獻(xiàn)較小，反之亦然。因此，當(dāng)稱一種信號是“由于”給體發(fā)射或受體發(fā)射時，表示這種信號主要是由于給體發(fā)射或受體發(fā)射造成的。或者可對激發(fā)進(jìn)行選擇，使其在第一波長激發(fā)給體，在第二波長激發(fā)受體。換句話說，采用兩種獨(dú)立的激發(fā)，每種激發(fā)采用不同的波長。在此情況下，通過測定由于給體激發(fā)之后受體發(fā)射的熒光信號與以及受體激發(fā)后受體產(chǎn)生的熒光信號之比來測定非輻射熒光能量傳輸。也可通過評估是否會有給體壽命會縮短、給體熒光強(qiáng)度猝滅或受體熒光強(qiáng)度增大來測量FRET；后面兩者在相應(yīng)于在不同波長激發(fā)的波長測量(與上述的比例測量相反，其包括測量兩個不同波長的發(fā)射比或測量在由于兩個單獨(dú)的波長的激發(fā)的波長的發(fā)射比)。盡管在本文中將給體和受體稱為″對″，但是這“對”中的兩個″成分″可以是相同的物質(zhì)。通常這兩種成分是不同的(例如Cy3.5和Cy5.5)。一種分子(例如Cy3.5或Cy5.5)可既作為給體又作為受體；在此情況下，通過測量熒光去偏振來測定能量傳輸。特別有效的用于能夠檢測葡萄糖的FRET基傳感器的試劑包括一種受體和一種給體，所述受體包含與伴刀豆球蛋白A(例如重組伴刀豆球蛋白A)結(jié)合的Cy5.5，其中染料與蛋白質(zhì)之比約為0.1-0.4，甚至約為0.2，所述給體包括與人血清白蛋白結(jié)合的Cy3.5，其中染料與蛋白質(zhì)之比約為0.5-0.9，葡萄糖與蛋白質(zhì)之比約為7-12。根具生產(chǎn)商AmershamBioSciences(CardiffWales)的報(bào)道，Cy3.5是激發(fā)最大值在581納米、發(fā)射最大值在596納米的羰花青染料。根據(jù)生產(chǎn)商AmershamBioSciences報(bào)道，Cy5.5是激發(fā)最大值在675納米，發(fā)射最大值在694納米的羰花青染料。另一種有用的試劑包含一種給體和一種受體，所述給體包含與伴刀豆球蛋白A(例如重組伴刀豆球蛋白A)結(jié)合的ALEXA568，所述受體包含與人血清白蛋白結(jié)合的ALEXA647。根據(jù)生產(chǎn)商MolecularProbes，(Eugene，Oregon)所述，ALEXA568的激發(fā)最大值約為578納米，發(fā)射最大值約為603納米。根據(jù)生產(chǎn)商MolecularProbes所述，ALEXA647的激發(fā)最大值約為650nm，發(fā)射最大值約為665納米。給體/受體對的其他例子是NBDN-(7-硝基苯并-2-，1，3-二唑-4-基)與若丹明，NBD或熒光素與曙紅或赤蘚紅，丹酰與若丹明，以及吖啶橙與若丹明。在本文中，術(shù)語熒光素表示包括各種相關(guān)化合物及其衍生物的化合物。類似的，在本文中，術(shù)語若丹明表示一類包括各種相官化合物及其衍生物的化合物。較佳的是，所述傳感器包括能夠在400-800納米，532納米，635納米，645納米，655納米，660納米，或甚至670納米波長激發(fā)，能夠發(fā)射600-1100納米，或甚至600-700納米輻射的試劑?？捎玫暮瑹晒鈭F(tuán)染料的種類包括例如羰花青染料，磺化的aminocourmarin和若丹明，以及它們的組合。在例如Panchuk-Voloshina，Nataliya等的″AlexaDyes，aSeriesofNewFluorescentDyesthatYieldExceptionallyBright，PhotostableConjugates，″TheJounialofHistocheniistryandCytochemistry，vol.47(9)1179-1188(1999)中進(jìn)一步描述一些這種化合物的化學(xué)性質(zhì)。有用的可在市場上購得的含熒光團(tuán)染料，它們的生產(chǎn)商以及它們相應(yīng)的近似發(fā)射最大值列于下表1。表11MolecularProbes，Eugene，Oregon.2AmershamBioSciences，CardiffWales.3DeNovoBiolabelsGmbH，Munster，Germany.有用的能量給體和能量受體對列于下表2。表2FRET的概念見圖1。圖1A顯示了分別表示為A(D)和E(D)的給體的吸收和發(fā)射，分別表示為A(A)和E(A)的受體的吸收和發(fā)射。給體發(fā)射光譜和受體吸收光譜的重疊面積(即重疊積分)是很重要的。如果在波長I發(fā)生激發(fā)，給體會在波長II發(fā)射光線，但是受體不會在波長III發(fā)光，這是由于受體不會吸收波長I的光。圖1B顯示發(fā)生的非輻射傳輸過程。D分子吸收電場矢量表示為E的光子。D的激發(fā)態(tài)顯示為一偶極子，其一側(cè)具有正電荷，另一側(cè)具有負(fù)電荷。如果受體分子(A)與D足夠接近(例如通常小于100埃)，會在其上誘導(dǎo)出相反的偶極子(被激發(fā)到激發(fā)態(tài))。這種偶極子誘導(dǎo)的偶極子相互作用以給體-受體分子間距離的六次冪衰減。典型地說，可發(fā)生部分的能量傳輸。然而在FRET中不會如此，F(xiàn)RET是一種要么完全發(fā)生，要么完全不發(fā)生的量子力學(xué)情況。也即是說，給題無法將其部分的能量傳輸給受體。必須傳輸所有的能量，只有在能級(即光譜)發(fā)生重疊的情況下才會發(fā)生能量傳輸。當(dāng)A離開其激發(fā)態(tài)時，所發(fā)射的光相對于入射光來說是旋轉(zhuǎn)的(rotated)或去偏振的。結(jié)果，F(xiàn)RET自身表示為在II的熒光強(qiáng)度降低(即給體發(fā)射減少)，在III出現(xiàn)熒光強(qiáng)度(即敏化的發(fā)射的增加)以及熒光相對于入射光的去偏振。FRET的最后一種表現(xiàn)是激發(fā)態(tài)的壽命。熒光可看作是一個平衡過程，在此過程中分子停留在其激發(fā)態(tài)的時間長度是被入射光將其激發(fā)入激發(fā)態(tài)的速率與使其離開激發(fā)態(tài)的速率的總和(熒光和非輻射過程)之間競爭的結(jié)果。如果添加其他的非輻射過程FRET(其他條件不變)，則衰減占優(yōu)勢，這意味著在II的給體壽命縮短。當(dāng)激發(fā)光譜和發(fā)射光譜重疊的兩個熒光團(tuán)近似足夠接近時，給體分子的激發(fā)態(tài)能量通過共振偶極子誘導(dǎo)偶極子相互作用傳輸?shù)较噜彽氖荏w熒光團(tuán)上。在FRET中，在一定波長輻照一樣品或混合物，該輻射能夠激發(fā)給體，但是不會直接激發(fā)受體分子。然后在給體發(fā)射波長和受體發(fā)射波長這兩種波長下檢測該樣品。如果給體和受體不夠接近，不會發(fā)生FRET，僅會在給體波長有發(fā)射。如果給體和受體足夠接近，會發(fā)生FRET。這種互相作用的結(jié)果是給體壽命縮短，給體熒光猝滅，受體熒光強(qiáng)度增大，熒光強(qiáng)度消偏振。隨著給體分子和受體分子之間的距離R的增加，能量傳輸效率Et迅速降低。對于孤立的給體受體對，能量傳輸效率表示為Et＝1/[1+(R/Ro)6](1)式中R是給體與受體之間的間距，Ro是半傳輸?shù)木嚯x。Ro是取決于給體發(fā)射光譜與受體激發(fā)光譜之間的重疊積分、折射率、給體的量子產(chǎn)率、給體發(fā)射和受體吸收時刻的取向的數(shù)值。Forster，T.，ZNaturforsch.4A，321-327(1949)；Forster，T.，Disc.FaradaySoc.27，7-17(1959)。由于FRET與1/R的相關(guān)性，F(xiàn)RET與分子距離有很大的關(guān)系，被稱為″光譜規(guī)則″。(Stryer，L.和Haugland，R.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98719(1967)。例如，該技術(shù)已被用來有效地測定包括蛋白質(zhì)和核酸之類的各種聚合物中本征和非本征熒光團(tuán)的給體和受體之間的距離。Cardullo等證明可采用FRET檢測兩種低聚脫氧核苷酸的雜化(Cardullo，R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，858790-8794(1988))。使用FRET檢測分析物的原理通常采用兩種方法的其中之一使用FRET來檢測分析物。第一種方法是競爭分析法，在此方法中對待測分析物的類似物和能夠與類似物和分析物結(jié)合的配體進(jìn)行標(biāo)記，其中一種用給體熒光團(tuán)標(biāo)記，另一種用受體熒光團(tuán)標(biāo)記。因此，類似物可用給體標(biāo)記，配體可用受體標(biāo)記，或者類似物可被受體標(biāo)記，配體被給體標(biāo)記。當(dāng)標(biāo)記的試劑接觸分析物時，分析物替換了與配體相連的類似物。由于配體和類似物互相不夠接近，無法發(fā)生FRET，由FRET產(chǎn)生的熒光信號減少；這種減少與分析物的濃度相關(guān)(可在此前的標(biāo)定步驟中建立這種關(guān)聯(lián))。為了能重新利用該熒光試劑，分析物與配體之間的結(jié)合在生理?xiàng)l件下應(yīng)當(dāng)是可逆的。類似地，分析物-配體結(jié)合的平衡結(jié)合常數(shù)與類似物-配體結(jié)合的平衡結(jié)合常數(shù)應(yīng)使得分析物能夠取代類似物。換句話說，類似物-配體的結(jié)合不應(yīng)過強(qiáng)，使得分析物無法取代類似物。優(yōu)選的是，傳感器不含由傳感器的試劑引起的內(nèi)部過濾作用(innerfiltereffect)。根據(jù)傳感器的化學(xué)性質(zhì)，對最小過濾作用的需要具有不同的后果。當(dāng)試劑包含熒光團(tuán)時，當(dāng)熒光試劑的濃度高到足以對發(fā)射的光造成顯著的再吸收時，會產(chǎn)生內(nèi)部過濾作用。如果試劑通過直接改變分析物結(jié)合時的熒光起作用，如果分析物的結(jié)合常數(shù)處于測量所需范圍內(nèi)，此時可通過降低傳感器內(nèi)熒光試劑的濃度，同時保持足夠的熒光信號，可以使內(nèi)部過濾作用最小化。當(dāng)試劑通過熒光分析物類似物和熒光分析物結(jié)合劑之間的FRET起作用時，可通過選擇相互的親和力遠(yuǎn)高于分析物和分析物結(jié)合劑之間親合力，但是與分析物的親和力在所需濃度范圍之內(nèi)的試劑使內(nèi)部過濾作用最小化。也可將類似的方法用于任何競爭熒光檢測。例如在美國專利第5,342,789號中所述的傳感器化學(xué)在試劑間具有微摩爾的親和力，但是能夠檢測具有毫摩爾范圍的親和性的葡萄糖。試劑可通過許多方法結(jié)合在芯內(nèi)。根據(jù)一種方法，在形成芯之前將試劑加入可交聯(lián)組合物中。根據(jù)另一種方法，將芯置于包含該試劑的組合物中，使試劑滲透入芯內(nèi)。傳感器的半透性涂層是由各種聚合物制備的多孔聚合物涂層，所述各種聚合物是例如雜聚物、均聚物及其混合物。該涂層的滲透性使得相關(guān)分析物能夠流入傳感器和從其中流出，從而可以測量分析物的生理相關(guān)變化，傳感器內(nèi)的試劑保持在傳感器內(nèi)(即宿主未暴露于試劑)，使相關(guān)分析物與試劑接觸，同時抑制、優(yōu)選防止預(yù)定分子量的組分進(jìn)入傳感器內(nèi)。對用來制備半透性涂層的聚合物種類和分子量和涂層的厚度進(jìn)行選擇，使其具有所需的滲透性。優(yōu)選的是在37℃2周后，從傳感器泄漏的熒光試劑少于5摩爾％，少于1摩爾％，少于0.5摩爾％，甚至少于0.2摩爾％。優(yōu)選的是用來制備半透性涂層的多分散聚合物的重均分子量約為4千道爾頓(kDa)至18kDa，約8kDa至12kDa，或者甚至約9kDa至10kDa。優(yōu)選的多分散聚合物的多分散指數(shù)Mn/Mw(dI)大于1，從約大于1.0至約1.5，甚至約1.1至1.4。有用的聚合物的例子包括聚氨基酸(例如聚賴氨酸和聚鳥氨酸)，聚核苷酸及其組合。優(yōu)選的聚合物包括例如長度為19-60個氨基酸，約38-60個氨基酸，或約43-48個氨基酸的聚氨基酸。合適的多分散聚氨基酸可購自SigmaChemical公司(St.Louis，Missouri)。所述半透性涂層可包含不同分子量的單分散聚合物的混合物。不希望受限于理論，本發(fā)明人預(yù)期用低分子量聚合物填充芯表面上較小的區(qū)域，以及較高分子量聚合物之間的間隔。所述半透性涂層可包括多個層，其中每個層由相同的聚合物組合物或不同的聚合物組合物制成。例如，半透性涂層可包括一層或多層多分散聚合物，單分散聚合物及其組合。有用的單分散聚合物包括單分散聚氨基酸，其包括例如具有33，47和60個殘基的聚-L-賴氨酸單分散均聚物。在一些情況下，盡管在傳感器上施加多個層，但是單獨(dú)的層是無法單獨(dú)辨別的。優(yōu)選的是半透性涂層不含IgG和補(bǔ)體(例如補(bǔ)體Clq)。優(yōu)選半透性涂層不會使分子量大于100kDa，大于60kDa，或大于30kDa的分子進(jìn)入傳感器?？蓪Π胪感酝繉拥慕M成進(jìn)行選擇以減小芯的體積。包含較低分子量的多分散聚氨基酸(例如聚賴氨酸或聚鳥氨酸(polyornithine))的涂層組合物可顯著減小其將要施用的凝膠芯的體積。在許多情況下體積的減小至少約為50％，至少60％，甚至至少70％。優(yōu)選聚氨基酸的分子量不大于約30,000Da，不大于約15kDa，不大于約10kDa，不大于約8kDa，不大于約7kDa，不大于約5kDa，不大于約4kDa，不大于約3kDa，甚至不大于約1.5kDa。分子量為3kDa，7kDa，9.6kDa甚至12kDa的多分散聚賴氨酸能夠?qū)е聦⒁谄渖鲜┯猛繉拥男镜闹睆斤@著減小(在一些情況下約30％)。低分子量聚氨基酸還可形成具有良好滲透選擇性的涂層，可形成“修剪過的”即鋸齒狀的(即比較卷曲的或粗糙的)表面。這種修剪的表面可能造成纖維化的應(yīng)答。對此修剪的表面施用藻酸鹽可在傳感器的外部提供較平滑的表面，這會抑制纖維化和減少光散射效應(yīng)。圖2顯示在20X的透射光環(huán)的照射下通過立體解剖顯微鏡(CarlZiessInc.，Thornwood，NewYork)觀察的傳感器10，在該傳感器10鋸齒狀聚賴氨酸涂布的14藻酸鹽芯12外包圍有藻酸鹽涂層16。傳感器的外表面具有足夠的生物相容性，以免引起宿主免疫系統(tǒng)的纖維化應(yīng)答，所述纖維化應(yīng)答將減少或阻止相關(guān)分析物以生理相關(guān)的速率分散入傳感器內(nèi)或從傳感器中分散出來，同時傳感器的外表面具有足夠的非生物相容性，使宿主在傳感器周圍形成鞘，使傳感器在宿主體內(nèi)固定起來。合適的生物相容性涂層組合物包含上述芯的聚合物基質(zhì)的可交聯(lián)組合物(結(jié)合在其中)，包括例如水凝膠(例如藻酸鹽和瓊脂糖)。在美國專利第6,126,936號中描述有用的提供生物相容性涂層的方法。優(yōu)選在傳感器上涂敷一層足夠厚的生物相容性涂層，以完全包封傳感器。外部生物相容性涂層的厚度優(yōu)選至少為1微米，約1-25微米，甚至約5-20微米。所述外部涂層優(yōu)選足夠光滑，以免宿主引發(fā)纖維化應(yīng)答，這種應(yīng)答會減少或阻止分析物分散入傳感器內(nèi)和從傳感器內(nèi)分散出來。在2002年3月11日提交的名為″MICROREACTORANDMETHODOFDETERMININGAMICROREACTORSUITABLEFORAPREDETERMINEDMAMMAL.″的美國專利申請第10/095,503號中有關(guān)于纖維化應(yīng)答的討論。傳感器可具有合適的結(jié)構(gòu)，用來檢測各種分析物，所述分析物包括例如碳水化合物(例如葡萄糖，果糖及其衍生物)。在本文中，″碳水化合物″表示由碳、氫和氧組成的任何種類的有機(jī)化合物，包括糖、淀粉和纖維素。其他合適的分析物包括糖蛋白(例如血紅蛋白，甲狀腺球蛋白，糖基化的白蛋白，糖基化的白蛋白和糖基化的載脂蛋白)，糖肽和糖脂(例如鞘磷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂GM2)。其他合適的分析物包括離子。這些離子可以是無機(jī)的或有機(jī)的。例子包括鈣、鈉、氯、鎂、鉀、碳酸氫根、磷酸根、碳酸根、檸檬酸根、乙酸根、膽堿及其組合。所述傳感器也可用來檢測蛋白質(zhì)和肽(后者是前者較低分子量的形式)；已知有許多生理狀態(tài)能改變血液和其他體液中蛋白質(zhì)的含量。還包括酶(例如與細(xì)胞死亡相關(guān)的酶，例如LDH，SGOT，SGTT，以及酸性和堿性磷酸酶)，與妊娠相關(guān)的激素，例如人絨膜促性腺激素)，脂蛋白(例如高密度、低密度和極低密度的脂蛋白)和抗體(例如自身免疫病(例如AIDS，重癥肌無力和狼瘡)的抗體)?？乖桶肟乖彩呛线m的分析物。另外，傳感器可檢測類固醇(例如膽固醇、雌激素及其衍生物)之類的分析物。傳感器可用來檢測和監(jiān)控茶堿和肌酸酐之類的物質(zhì)。所述傳感器也可用來檢測和監(jiān)控農(nóng)藥和藥物。在本文中，″藥物″表示一種當(dāng)通過攝食、吸氣、吸收或其他方法被人體吸收時能夠引發(fā)生理應(yīng)答的材料。其包括醇、治療藥物(例如環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿、足葉乙苷、順氯氨鉑和卡波鉑之類的化療劑)，麻醉劑(例如可卡因和海洛因)以及精神藥物(例如LSD)。傳感器也可用來檢測和監(jiān)控多核苷酸(例如DNA和RNA)。傳感器可用來例如測定總DNA水平，作為細(xì)胞溶解作用的測量?；蛘呖捎脗鞲衅鳒y量特定序列(例如HIVRNA)的表達(dá)。傳感器可在體內(nèi)或原位使用。對于體內(nèi)應(yīng)用，傳感器可置入皮膚內(nèi)、皮膚上或皮下，或置于器官或血管(例如靜脈或動脈)內(nèi)?？赏ㄟ^激發(fā)傳感器(例如直接或透皮激發(fā)植入的傳感器)，然后檢測傳感器發(fā)射的熒光信號(例如直接或透皮檢測植入的傳感器發(fā)出的熒光)來檢測分析物。下面將通過以下實(shí)施例描述本發(fā)明。實(shí)施例測試步驟以下是用于所述實(shí)施例地測試步驟。熒光滲漏測量法制造傳感器，計(jì)算各傳感器中熒光試劑的含量。將傳感器置于pH值超過7.4的10mMHEPES/0.15M的鹽水中，在37℃保溫(incubate)過夜以除去傳感器表面的殘余物。從傳感器移出上清液，使用QM-1PTI型QuantumMaster熒光分光計(jì)(PTIQuantumMaster，SouthBrunswick，NewJersey)測量上清液的熒光發(fā)射光譜。通過在試劑熒光團(tuán)的激發(fā)最大值附近激發(fā)上清液，然后測量包括熒光團(tuán)發(fā)射最大值的波長范圍的發(fā)射以測量發(fā)射光譜。當(dāng)熒光試劑包含多個不同的熒光團(tuán)時，對各個不同的熒光團(tuán)重復(fù)上述步驟。然后將傳感器置入另外的過量體積的新鮮HEPES/鹽水中，該傳感器在37℃保溫過夜，然后移去HEPES/食鹽水。將足夠數(shù)量的(N)傳感器與足夠體積的HEPES/鹽水一起置于試管內(nèi)，使得如果熒光染料發(fā)生100％的滲漏，所得上清液的濃度將為10-10摩爾熒光團(tuán)/毫升上清液。準(zhǔn)備大量相同的試管，為該研究提供足夠數(shù)量的樣品。每個時間點(diǎn)在來自三個不同的試管的一式三份的樣品，即等分樣品中進(jìn)行測量。從三個試管中取出100微升HEPES/食鹽水的樣品等分試樣，對這三個樣品分別進(jìn)行熒光測量。這些樣品定義為0時間。余下的樣品在37℃保溫所需的時間。在每個時間點(diǎn)從三個試管中取出等分樣品，如上所述對各等分試樣進(jìn)行熒光測量。如果檢測到熒光，則使用能夠?yàn)V出游離熒光染料的過濾器過濾樣品，保留熒光試劑(10kDaMWcutoffCentricon過濾器(Amicon，WRGrace的分公司))，測量洗提液的熒光，以測定游離染料的含量。標(biāo)記的蛋白質(zhì)的滲漏百分?jǐn)?shù)通過計(jì)算(上清液的熒光強(qiáng)度-洗提劑的熒光強(qiáng)度)/(與每單位體積HEPES/鹽水毫升的傳感器數(shù)量(N)等當(dāng)量的染料混合物溶液的熒光強(qiáng)度)來測定。包括熒光試劑的微球小珠的制備一定體積的Cy3.5HSA(人血清白蛋白，分子量66,430克/摩爾)和Cy5.5-ConA(伴刀豆球蛋白A，分子量104,000克/摩爾)在pH＝7.4的10mMHEPES/0.15M鹽水的溶液加入等體積的3％的無菌藻酸鹽的HEPES/食鹽水溶液。該溶液在振蕩器上混合5分鐘。然后對該混合物進(jìn)行離心，用14號(gauge)的導(dǎo)管將其抽入注射器。從樣品中除去空氣氣泡。移去該14號的導(dǎo)管，代之以24號的導(dǎo)管。然后緩慢地推壓注射器的柱塞，使藻酸鹽滴落入含有25毫升HEPES/食鹽水和1.5％(重量/體積)的無水氯化鈣的試管內(nèi)。所述小珠浸沒20分鐘。然后用HEPES/食鹽水和2mM氯化鈣淋洗小珠四次，然后將小珠貯存在HEPES/食鹽水中。比較例1由1％的具有33肽殘基的單分散聚賴氨酸溶于HEPES/鹽水緩沖儲液制備0.2％的單分散聚賴氨酸(BoehringerMannheim)涂料溶液(溶于HEPES/食鹽水)，然后加熱至37℃。所述第一涂料溶液的體積是涂敷的微球小珠體積的15倍。第二涂料溶液的體積是涂敷的微球小珠體積的10倍。兩種溶液均無菌過濾并保持在37℃。微球傳感器小珠包括第一熒光試劑組分，Cy3.5HSA(人血清白蛋白，分子量66,430克/摩爾)和第二熒光組分Cy5.5-ConA(伴刀豆球蛋白A，分子量104,000克/摩爾)，在振蕩器上用一定體積的聚賴氨酸涂料溶液涂敷該小珠5分鐘，所述涂料溶液的體積是所述微球小珠體積的15倍。移出小珠，用HEPES/食鹽水淋洗三次。然后該小珠在室溫下的HEPES/食鹽水中蔽光保溫60分鐘。60分鐘后從小珠移去HEPES/食鹽水。向所述微球小珠加入第二體積的聚賴氨酸涂料溶液。該第二體積的聚賴氨酸涂料溶液是所述微球小珠體積的10倍，小珠在振蕩器上在聚賴氨酸涂料溶液中37℃保溫5分鐘。然后取出小珠，用HEPES/食鹽水淋洗三次。比較例2依照比較例1所述制備用聚賴氨酸涂敷的微球小珠，其不同之處在于比較例2的聚賴氨酸具有47肽殘基。比較例3依照比較例1所述制備用聚賴氨酸涂敷的微球小珠，其不同之處在于比較例2的聚賴氨酸具有60肽殘基。實(shí)施例1用pH值為7.4，而且包含2mM氯化鈣的1％的多分散聚賴氨酸HEPES/食鹽水儲液制備0.2％的多分散聚賴氨酸(SigmaChemical公司)涂料溶液。將此0.2％的多分散聚賴氨酸組合物加熱至37℃。所述多分散聚賴氨酸的重均分子量為11,200Da，數(shù)均分子量為9800Da，多分散指數(shù)為1.14。將包括Cy3.5HSA(人血清白蛋白，分子量66,430克/摩爾)和Cy5.5ConA(伴刀豆球蛋白A，分子量104,000克/摩爾)的藻酸鹽微球小珠置于一定體積的聚賴氨酸涂料溶液中，所述涂料溶液的體積比小珠的體積大15倍，該小珠在振蕩器上，在聚賴氨酸涂料溶液中37℃保溫15分鐘。然后將小珠從聚賴氨酸溶液移出，用HEPES/食鹽水和2mM的氯化鈣淋洗三次。該小珠在室溫下在HEPES/食鹽水中蔽光保溫60分鐘。60分鐘后從小珠移去HEPES/食鹽水，向該小珠加入第二體積的聚賴氨酸涂料溶液，該溶液的體積是小珠體積的10倍，該小珠在振蕩器上在聚賴氨酸溶液中在37℃保溫15分鐘。然后移出涂敷過的小珠，用HEPES/食鹽水淋洗三次。然后涂敷的小珠在無菌試管內(nèi)在4℃的HEPES/食鹽水中貯存過夜。然后用1.5％的UP藻酸鹽溶液進(jìn)一步涂敷該涂敷過的小珠，然后置于pH＝7.2、包含1.5％氯化鈣的HEPES溶液中10分鐘。對實(shí)施例1和比較例的各組聚賴氨酸涂敷的小珠進(jìn)行滲漏百分?jǐn)?shù)測試。這些小珠在37所述的貯存3天，每天用HEPES/食鹽水淋洗。在3天的淋洗期后，在50天內(nèi)根據(jù)上述熒光滲漏測量法周期性地測量小珠的熒光組分Cy5.5和Cy3.5的滲漏。具體來說，計(jì)算實(shí)施例1和比較例的小珠中熒光試劑的含量。將一定量(180)的小珠置于30毫升HEPES/食鹽水中，在37℃保溫過夜以除去小珠表面上的殘余物。從小珠移出上清液，測量上清液的熒光發(fā)射。然后將小珠置于20毫升新鮮HEPES/食鹽水中，在37℃保溫過夜，然后移去HEPES/食鹽水。通過在570納米激發(fā)上清液，測量575-625納米的發(fā)射，從而得到發(fā)射光譜。通過在660納米激發(fā)上清液，然后在670-725納米測量發(fā)射，獲得第二光譜。將10種小珠各自置于18個裝有2毫升HEPES/食鹽水的試管中。從三個試管中取出100微升的HEPES/食鹽水溶液等分樣品，對各三個樣品進(jìn)行熒光測量。這些樣品定義為0時間。余下的樣品繼續(xù)保溫在37上述的。在所需的時間點(diǎn)從三個試管取出等分樣品，進(jìn)行熒光測量。入過檢測到熒光，使用10kDaMWcutoffCentricon過濾器(Amicon，adivisionofW.R.Grace)過濾樣品，改樣品能夠?yàn)V去游離的熒光染料，留下熒光試劑。測量洗提劑的熒光以測定游離染料的量。結(jié)果在圖3中作圖，圖中的方塊表示Cy3.5的滲漏百分?jǐn)?shù)，圓點(diǎn)表示Cy5.5滲漏百分?jǐn)?shù)。圖4是根據(jù)比較例1-3和實(shí)施例1制備的小珠在第14天的Cy3.5滲漏的柱狀圖。權(quán)利要求1.一種用來檢測分析物的傳感器，所述傳感器包括含有水凝膠的芯；位于該芯內(nèi)的熒光試劑；包圍著該芯的半透性涂層，該半透性涂層包含重均分子量約為4kDa至18kDa、多分散指數(shù)大于1的多分散聚合物；包圍著所述半透性涂層的生物相容性涂層。2.如權(quán)利要求1所述的傳感器，其特征在于，所述生物相容性涂層的厚度約為1-25微米。3.如權(quán)利要求1所述的傳感器，其特征在于，所述熒光試劑可在芯內(nèi)移動。4.如權(quán)利要求1所述的傳感器，其特征在于，所述多分散聚合物包含聚賴氨酸。5.如權(quán)利要求1所述的傳感器，該傳感器的直徑大于1毫米。6.如權(quán)利要求1所述的傳感器，該傳感器的直徑至少為1.25毫米。7.如權(quán)利要求1所述的傳感器，其特征在于，所述分析物包含葡萄糖。8.如權(quán)利要求1所述的傳感器，其特征在于，所述傳感器能夠基于非輻射熒光共振能量傳輸檢測分析物。9.如權(quán)利要求1所述的傳感器，其特征在于，所述熒光試劑選自羰花青染料，磺化氨基香豆素染料，磺化若丹明染料及其組合。10.如權(quán)利要求1所述的傳感器，其特征在于，所述熒光試劑包含葡萄糖結(jié)合蛋白和糖基化的底物。11.如權(quán)利要求10所述的傳感器，其特征在于，所述葡萄糖結(jié)合蛋白包括伴刀豆球蛋白A，所述底物包括人血清白蛋白。12.如權(quán)利要求1所述的傳感器，其特征在于，所述熒光試劑包含具有在約581納米的激發(fā)最大值和在約596納米的發(fā)射最大值的第一羰花青染料、伴刀豆球蛋白A、具有在約675納米的激發(fā)最大值和在約694納米的發(fā)射最大值的第二羰花青染料、和人血清白蛋白。13.如權(quán)利要求11所述的傳感器，其特征在于，所述葡萄糖結(jié)合蛋白包括重組伴刀豆球蛋白A。14.如權(quán)利要求12所述的傳感器，其特征在于，所述第一羰花青染料與伴刀豆球蛋白A的摩爾比約為0.1-0.4。15.如權(quán)利要求12所述的傳感器，其特征在于，所述第二羰花青染料與人血清白蛋白的摩爾比約為0.5-0.9。16.如權(quán)利要求12所述的傳感器，其特征在于，所述人血清白蛋白是糖基化的。17.如權(quán)利要求1所述的傳感器，其特征在于，所述熒光試劑包含具有在約578納米的激發(fā)最大值和在約603納米的發(fā)射最大值的第一染料、伴刀豆球蛋白A、具有在約650納米的激發(fā)最大值和在約665納米的發(fā)射最大值的第二染料、和人血清白蛋白。18.一種制造傳感器的方法，該傳感器包括包含熒光試劑的芯，所述方法包括使第一水性藻酸鹽組合物的液滴與包含第II族陽離子的離子溶液接觸，形成交聯(lián)凝膠芯，所述第一水性藻酸鹽組合物包含水、藻酸鹽和任選的熒光試劑，所述方法還包括以下步驟中的至少一個使所述的芯與熒光試劑接觸，使所述芯與一種組合物接觸，該組合物包含多分散指數(shù)大于1的多分散聚合物。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述多分散聚合物在所述芯上形成涂層，所述方法還包括在所述多分散聚合物涂層上涂敷生物相容性組合物。20.如權(quán)利要求1所述的傳感器，其特征在于，當(dāng)所述傳感器在37℃下在pH＝7.4的10mMHEPES/0.15M食鹽水中貯存兩周后，其熒光試劑的滲漏小于1摩爾％。21.一種用來檢測分析物的傳感器，所述傳感器包括包含聚合物基質(zhì)的芯；位于該芯內(nèi)的熒光試劑；包圍著該芯的半透性涂層，該半透性涂層包含多分散聚合物；包圍著所述半透性涂層的生物相容性涂層，當(dāng)所述傳感器在37℃下在pH＝7.4的10mMHEPES/0.15M食鹽水中貯存兩周后，其熒光試劑的滲漏小于1摩爾％。全文摘要揭示了一種用來檢測分析物的傳感器，該傳感器包括含有水凝膠的芯，位于該芯內(nèi)的熒光試劑，包圍著芯的半透性涂層，以及包圍著半透性涂層的生物相容性涂層，所述半透性涂層包含分子量約為4kDa－18kDa，多分散指數(shù)大于1的多分散聚合物。文檔編號A61K49/00GK1874719SQ200480031828公開日2006年12月6日申請日期2004年10月28日優(yōu)先權(quán)日2003年10月31日發(fā)明者D·E·沃爾夫申請人:傳感技術(shù)有限公司