專利名稱：含有g(shù)－csf的成纖維細(xì)胞動(dòng)員劑及創(chuàng)傷治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)作為有效成分的成纖維細(xì)胞動(dòng)員劑。另外，本發(fā)明涉及含有G-CSF作為有效成分的成纖維細(xì)胞固定生長(zhǎng)劑。并且，本發(fā)明涉及含有G-CSF作為有效成分的創(chuàng)傷治療劑。
背景技術(shù)：
人G-CSF是作為粒細(xì)胞系造血干細(xì)胞分化誘導(dǎo)因子被發(fā)現(xiàn)的造血因子，因其在機(jī)體內(nèi)促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞的造血，因而在臨床中被用作骨髓移植或癌癥化療后的嗜中性粒細(xì)胞減少癥治療劑。另外，除上述作用外，人G-CSF具有通過作用于干細(xì)胞而刺激其分化增殖的作用，或者將骨髓中的干細(xì)胞向外周血中動(dòng)員的作用。實(shí)際中，基于后者的作用，在臨床現(xiàn)場(chǎng)可實(shí)施以促進(jìn)施行強(qiáng)力化療后的癌癥患者的造血恢復(fù)為目的，移植被人G-CSF動(dòng)員的外周血造血干細(xì)胞的外周血干細(xì)胞移植術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是不移植成纖維細(xì)胞，簡(jiǎn)便地向創(chuàng)傷組織動(dòng)員成纖維細(xì)胞，使成纖維細(xì)胞在創(chuàng)傷組織固定生長(zhǎng)，從而治療創(chuàng)傷。
本發(fā)明者研究了心肌梗塞后創(chuàng)傷組織的再生。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過給予G-CSF，成纖維細(xì)胞向心肌梗塞灶移動(dòng)，防止了心臟功能的降低，改善了心臟的重構(gòu)。本發(fā)明基于這一認(rèn)識(shí)完成。
即，本發(fā)明提供了含有粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)作為有效成分的成纖維細(xì)胞動(dòng)員劑。
另外，本發(fā)明提供了含有G-CSF作為有效成分的、位于心臟疾病發(fā)病后心臟的成纖維細(xì)胞的固定生長(zhǎng)劑。
另外，本發(fā)明提供了含有G-CSF作為有效成分的創(chuàng)傷治療劑。
另外，本發(fā)明提供了包括給予有效劑量G-CSF的成纖維細(xì)胞動(dòng)員方法。
另外，本發(fā)明提供了包括給予有效劑量G-CSF的、用于使成纖維細(xì)胞在心臟疾病發(fā)病后的心臟固定生長(zhǎng)的方法。
另外，本發(fā)明提供了包括給予有效劑量G-CSF的創(chuàng)傷治療方法。
心肌梗塞后通過給予G-CSF，在梗塞灶內(nèi)觀察到了大量來自骨髓細(xì)胞的心肌細(xì)胞。另一方面，還觀察到了其近10倍數(shù)量的成纖維細(xì)胞。即可見，通過給予G-CSF，各種來自干細(xì)胞的細(xì)胞從骨髓向梗塞灶游走，使梗塞灶再生，從而防止了心肌梗塞后的重構(gòu)。認(rèn)為通過給予G-CSF，不僅急性期內(nèi)大量的白細(xì)胞浸潤，慢性期(梗塞后60日)內(nèi)成纖維細(xì)胞向梗塞灶的移動(dòng)促進(jìn)了創(chuàng)傷愈合，改善了重構(gòu)。文獻(xiàn)報(bào)道了通過向心肌梗塞后的梗塞灶內(nèi)移植成纖維細(xì)胞，能夠防止梗塞灶的重構(gòu)(Hutcheson KA，Atkins BZ，Hueman MT，Hopkins MB，GlowerDD，Taylor DA，Transplant.9，2000，359-368)。本發(fā)明中，在心肌梗塞后通過給予G-CSF，能夠使成纖維細(xì)胞從骨髓游走。從而，不必移植成纖維細(xì)胞就可以防止梗塞灶的重構(gòu)，在臨床應(yīng)用上極為有利。
另外，這一事實(shí)意味著除心肌梗塞外，G-CSF還可在臨床上應(yīng)用于外傷等各種創(chuàng)傷的愈合過程。即，在創(chuàng)傷的愈合過程中通過給予G-CSF，不僅在早期可使粒細(xì)胞浸潤，還能夠提供成纖維細(xì)胞、加速創(chuàng)傷的愈合，進(jìn)一步地生成更堅(jiān)固的愈合組織。此前，人們認(rèn)為在創(chuàng)傷愈合時(shí)給予G-CSF，會(huì)使粒細(xì)胞大量浸潤，從而破壞組織(Romson，JL，Hook BG，Kunkel SL，Abrams GD，Schork MA，Lucchesi BR，Circulation 67(5)，1983，1016-1023)，但在本發(fā)明中，通過給予G-CSF能夠使創(chuàng)傷部位更堅(jiān)固地愈合。


圖1是對(duì)骨髓移植60日后的外周血有核細(xì)胞的FACS分析結(jié)果示意圖。
圖2是骨髓細(xì)胞離心涂片標(biāo)本的激光共聚焦顯微鏡照片。綠色表示GFP陽性的骨髓來源細(xì)胞，藍(lán)色表示經(jīng)DAPI染色的有核細(xì)胞。
圖3是制成心肌梗塞后、皮下給予G-CSF 10日時(shí)間的小鼠(G-CSF給藥組)及給予生理鹽水的小鼠(對(duì)照組)的存活率示意圖。
圖4是制成心肌梗塞后60日的經(jīng)胸壁M型超聲心動(dòng)圖。自上到下依次為正常小鼠、對(duì)照小鼠及G-CSF給藥組(100μg/kg)小鼠的左心室。
圖5是制成心肌梗塞后60日給予G-CSF對(duì)左心室射血分?jǐn)?shù)的效果示意圖。自左到右依次顯示了正常組、G-CSF給藥組(100μg/kg)及G-CSF給藥組(300μg/kg)的結(jié)果。
圖6是制成心肌梗塞后60日給予G-CSF對(duì)左心室舒張末期徑的效果示意圖。自左依次顯示了正常組、G-CSF給藥組(100μg/kg)及G-CSF給藥組(300μg/kg)的結(jié)果。
圖7(a)是制成心肌梗塞后60日對(duì)照組(左圖)和G-CSF給藥組(右圖)的心臟左心室短軸切面偶氮染色圖。紅色部分為肌纖維，藍(lán)色部分為膠原纖維。
圖7(b)是制成心肌梗塞后60日G-CSF給藥組的心臟左心室短軸切面的偶氮(Azan)染色圖(左圖)及激光共聚焦顯微鏡照片(右圖)。
圖8是心肌梗塞灶的激光共聚焦顯微鏡照片。(a)表示非梗塞灶，(b)表示對(duì)照組心肌梗塞灶，(c)表示G-CSF給藥組(100μg/kg)心肌梗塞灶。(d)表示對(duì)Lac-Z轉(zhuǎn)基因小鼠給予G-CSF(100μg/kg)的心肌梗塞灶。
圖9是心肌梗塞灶內(nèi)存在的GFP陽性細(xì)胞數(shù)示意圖。
圖10是對(duì)心肌梗塞灶用抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體免疫染色的激光共聚焦顯微鏡照片。綠色表示GFP陽性細(xì)胞，藍(lán)色表示被DAP I染色的核，紅色表示α-平滑肌肌動(dòng)蛋白。
圖11是對(duì)心肌梗塞灶用抗血友病因子(vWF)抗體免疫染色的激光共聚焦顯微鏡照片。綠色表示GFP陽性細(xì)胞，藍(lán)色表示被DAPI染色的核，紅色表示vWF。
圖12是對(duì)心肌梗塞灶用抗輔肌動(dòng)蛋白抗體免疫染色的激光共聚焦顯微鏡照片。綠色表示GFP陽性細(xì)胞，藍(lán)色表示被DAPI染色的核，紅色表示輔肌動(dòng)蛋白。
圖13是對(duì)心肌梗塞灶用抗輔肌動(dòng)蛋白抗體免疫染色的激光共聚焦顯微鏡照片。綠色表示GFP陽性細(xì)胞，藍(lán)色表示被DAPI染色的核，紅色表示輔肌動(dòng)蛋白。
圖14是對(duì)心肌梗塞灶每1μm進(jìn)行切割后的切片，用抗輔肌動(dòng)蛋白抗體免疫染色的激光共聚焦顯微鏡照片。綠色表示GFP陽性細(xì)胞，藍(lán)色表示被DAPI染色的核，紅色表示輔肌動(dòng)蛋白。
圖15是給予G-CSF后的心肌梗塞灶中GFP陽性細(xì)胞類別的比例示意圖。
圖16是給予G-CSF后對(duì)全骨髓移植組及單一造血干細(xì)胞移植組的外周血有核細(xì)胞數(shù)的效果示意圖。
圖17是給予G-CSF對(duì)制作心肌梗塞后存活率的效果示意圖。圖中的虛線表示全骨髓移植組，直線表示單一造血干細(xì)胞移植組，方塊表示G-CSF給藥組(+)，圓形表示非G-CSF給藥組(-)。
圖18是單一造血干細(xì)胞移植組中的心肌梗塞灶用抗波形蛋白抗體免疫染色的激光共聚焦顯微鏡照片。綠色表示GFP陽性細(xì)胞，藍(lán)色表示被DAPI染色的核，紅色表示波形蛋白。
圖19是給予G-CSF對(duì)全骨髓移植組及單一造血干細(xì)胞移植組的GFP陽性細(xì)胞數(shù)的效果示意圖。
圖20是給予G-CSF后對(duì)單一造血干細(xì)胞移植組心肌梗塞邊緣區(qū)域用抗輔肌動(dòng)蛋白抗體免疫染色的激光共聚焦顯微鏡照片。綠色表示GFP陽性細(xì)胞，藍(lán)色表示被DAPI染色的核，紅色表示輔肌動(dòng)蛋白。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及含有G-CSF作為有效成分的成纖維細(xì)胞動(dòng)員劑。成纖維細(xì)胞被動(dòng)員的場(chǎng)所無特定限制。例如，存在受創(chuàng)傷組織時(shí)，通過給予G-CSF，能夠向受創(chuàng)傷的組織動(dòng)員成纖維細(xì)胞。
本發(fā)明中的創(chuàng)傷可以是身體組織的損害、損傷，例如，包括心臟、肺、腎臟、腸、肝臟、腱等內(nèi)部組織或臟器的損害、損傷，或者皮膚等的外傷。作為負(fù)有創(chuàng)傷的組織的具體例子，可以優(yōu)選舉出心肌梗塞后的心臟。
成纖維細(xì)胞通常為結(jié)締組織的固有細(xì)胞，是以粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體發(fā)育良好為特征的具有橢圓形核和紡錘狀原生質(zhì)的細(xì)胞。另外，存在于多個(gè)臟器中的間質(zhì)細(xì)胞中有包埋實(shí)質(zhì)物質(zhì)細(xì)胞作用的細(xì)胞也包含在內(nèi)。成纖維細(xì)胞通常具有大量產(chǎn)生體內(nèi)間質(zhì)物質(zhì)(膠原、粘連蛋白、粘多糖等)的能力。通過向負(fù)有創(chuàng)傷的組織動(dòng)員成纖維細(xì)胞，能夠促進(jìn)創(chuàng)傷的愈合。
另外，本發(fā)明涉及含有G-CSF作為有效成分的、位于心臟疾病發(fā)病后心臟的成纖維細(xì)胞固定生長(zhǎng)劑。
心臟疾病的具體例子可舉出例如缺血性心臟疾病(心肌梗塞等)或心肌疾病(心肌病等)等。例如心肌梗塞后通過給予G-CSF，能夠使成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)在心肌梗塞灶。
另外，本發(fā)明涉及含有G-CSF作為有效成分的創(chuàng)傷治療劑。
本發(fā)明所用的G-CSF能夠使用任何G-CSF，但優(yōu)選高度純化的G-CSF，更為具體的，是哺乳動(dòng)物G-CSF、特別是具有與人G-CSF實(shí)質(zhì)上同樣的生物活性的物質(zhì)。G-CSF的來源無特別限定，可以使用天然來源的G-CSF、通過基因重組法得到的G-CSF等，但優(yōu)選使用通過基因重組法得到的G-CSF。在通過基因重組法得到的G-CSF中，可以是與天然來源的G-CSF氨基酸序列同樣的G-CSF，或者該氨基酸序列中的1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、替換、添加等了的與天然來源的G-CSF具有同樣生物活性的G-CSF。氨基酸的缺失、替換、添加等可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過使用定點(diǎn)誘變法(Gotoh，T.等(1995)Gene 152，271-275；Zoller，M.J.和Smith，M.(1983)Methods Enzymol.100，468-500；Kramer，W.等(1984)Nucleic Acids Res.12，9441-9456；Kramer，W.和Fritz，H.J.(1987)Methods Enzymol.154，350-367；Kunkel，T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，488-492；Kunkel(1988)Methods Enzymol.85，2763-2766)等，向G-CSF的氨基酸導(dǎo)入適當(dāng)?shù)耐蛔儯軌蛑苽渑cG-CSF具有同等功能的多肽。另外，氨基酸的變異也可以在自然界中產(chǎn)生。一般地，在被替換的氨基酸殘基中，優(yōu)選替換成保持有氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)的其他氨基酸。作為氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)可舉出例如疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)，親水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸(G、A、V、L、I、P)，具有含羥基的側(cè)鏈的氨基酸(S、T、Y)，具有含硫側(cè)鏈的氨基酸(C、M)，具有含羧酸和酰胺基的側(cè)鏈的氨基酸(D、N、E、Q)，具有含堿基側(cè)鏈的氨基酸(R、K、H)，具有含芳香族的側(cè)鏈的氨基酸(H、F、Y、W)(括號(hào)內(nèi)任何氨基酸都以一個(gè)字母表示)。眾所周知，具有相對(duì)于某氨基酸序列的1個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基缺失、添加和/或被其他氨基酸替換而修飾的氨基酸序列的多肽能夠維持其生物活性(Mark，D.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666；Zoller，M.J.和Smith，M.，Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500；Wang，A.等，Science 224，1431-1433；Dalbadie-McFarland，G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1982)79，6409-6413)。
另外，本發(fā)明中，G-CSF可作為蛋白質(zhì)給予，也可以以基因治療的方式給予編碼G-CSF的基因。編碼G-CSF的基因一般是通常以包含表達(dá)盒的表達(dá)載體等被給予。載體無特別限定，既可以使用非病毒載體，也可以使用病毒載體(別冊(cè)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)，《基因?qū)牒捅磉_(dá)分析實(shí)驗(yàn)方法》，羊土社，1996等)。載體可舉出例如質(zhì)粒載體、病毒載體、噬菌體載體、粘粒載體、YAC載體等。表達(dá)載體中通常包含有啟動(dòng)子等調(diào)節(jié)因子等?；?qū)敕ㄊ褂煤畏N方法均可，例如，磷酸鈣法、脂轉(zhuǎn)染法、使用脂質(zhì)體法的導(dǎo)入方法、裸DNA法、受體介導(dǎo)性基因?qū)敕?、使用基因槍的方法、DEAE-葡聚糖法、毛細(xì)管法等均可使用。另外，本發(fā)明中，既可以將基因直接導(dǎo)入體內(nèi)，也可以向取出的細(xì)胞或培養(yǎng)后所得的細(xì)胞等中導(dǎo)入基因后再將該細(xì)胞放回體內(nèi)。
另外，也可以使用G-CSF與其他蛋白質(zhì)融合的蛋白質(zhì)。在制備融合的多肽時(shí)，例如，可以將編碼G-CSF的DNA與編碼其他蛋白質(zhì)的DNA符合讀框地連接并將其導(dǎo)入表達(dá)載體，使其在宿主中表達(dá)。作為本發(fā)明中可與G-CSF相融合的其他蛋白質(zhì)，無特別限定。
另外，也可以使用經(jīng)化學(xué)修飾后的G-CSF。作為經(jīng)化學(xué)修飾的G-CSF的例子，可舉出例如進(jìn)行糖鏈結(jié)構(gòu)的改變、添加、缺失操作的G-CSF，或與聚乙二醇、維生素B12等無機(jī)或有機(jī)化合物等的化合物相結(jié)合的G-CSF等。
本發(fā)明所使用的G-CSF可用任何方法制造，例如，培養(yǎng)人腫瘤細(xì)胞或產(chǎn)生人G-CSF的雜交瘤的細(xì)胞株，用各種方法從中提取分離純化得到的G-CSF，或通過基因工程方法由大腸桿菌、酵母菌、中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)、C127細(xì)胞、COS細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、BHK細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等中產(chǎn)生，并通過各種方法提取分離純化后得到的G-CSF等均可使用。本發(fā)明中所使用的G-CSF，優(yōu)選通過基因工程方法制造的G-CSF，并優(yōu)選使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞(特別是CHO細(xì)胞)制造的G-CSF(例如，特公平1-44200號(hào)公告，特公平2-5395號(hào)公告，特開昭62-129298號(hào)公告，特開昭62-132899號(hào)公告，特開昭62-236488號(hào)公告，特開昭64-85098號(hào)公告)。
本發(fā)明的成纖維細(xì)胞動(dòng)員劑等中，可以根據(jù)其給藥方法或劑型，適當(dāng)添加助懸劑、助溶劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、防腐劑、防吸附劑、表面活性劑、稀釋劑、賦形劑、pH調(diào)節(jié)劑、無痛劑、緩沖劑、含硫還原劑、抗氧化劑等。
作為助懸劑的實(shí)例，可舉出例如甲基纖維素、聚山梨酯80、羥乙基纖維素、阿拉伯膠、黃蓍膠粉末、羧甲基纖維素鈉、聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯等。
作為助溶劑，可舉出例如聚氧乙烯氫化蓖麻油、聚山梨酯80、煙酰胺、聚氧乙烯山梨糖醇單月桂酸酯、低分子聚乙二醇混合物(Macrogol)、蓖麻油脂肪酸乙酯等。
作為穩(wěn)定劑，可舉出例如葡聚糖40、甲基纖維素、明膠、亞硫酸鈉、偏亞硫酸鈉等。
作為等滲劑，可舉出例如D-甘露醇、山梨糖醇等。
作為防腐劑，可舉出例如對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、山梨酸、苯酚、甲酚、氯甲酚等。
作為防吸附劑，可舉出例如人血清白蛋白、卵磷脂、葡聚糖、環(huán)氧乙烷·環(huán)氧丙烷共聚物、羥丙纖維素、甲基纖維素、聚氧乙烯化氫化蓖麻油、聚乙二醇等。
作為含硫還原劑，可舉出例如N-乙酰半胱氨酸、N-乙?；甙腚装彼?、硫辛酸、硫撐二乙醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨糖醇、巰基乙酸及其鹽、硫代硫酸鈉、谷胱甘肽、碳原子數(shù)1～7的硫代鏈烷酸等含有巰基的化合物等。
作為抗氧化劑，可舉出例如異抗壞血酸、二丁基羥基甲苯、丁羥基苯甲醚、α-生育酚、生育酚乙酸酯、L-抗壞血酸及其鹽、L-抗壞血酸棕櫚酸酯、L-抗壞血酸硬脂酸酯、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、沒食子酸三戊酯、沒食子酸丙酯、或乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、焦磷酸鈉、偏磷酸鈉等螯合劑。
進(jìn)而，還可以含有氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、磷酸鈉、磷酸鉀、碳酸氫鈉等無機(jī)鹽；檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、醋酸鈉等有機(jī)鹽等通常添加的成分。
本發(fā)明的成纖維細(xì)胞動(dòng)員劑等，可以注射劑(皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)等)，或是以適于經(jīng)皮、經(jīng)粘膜、經(jīng)鼻等給藥的劑型，或是以適于口服給藥的劑型(片劑、膠囊劑、顆粒劑、液體制劑、混懸劑等)給藥。本發(fā)明并不受給藥途徑或劑型的限制。
本發(fā)明的以G-CSF為有效成分的成纖維細(xì)胞動(dòng)員劑等的給藥量、給藥次數(shù)可考慮治療對(duì)象的患者的癥狀由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)決定，通常，給藥G-CSF以成人每人為0.1～500μg/kg/日，優(yōu)選為1～50μg/kg/日的用量。給藥次數(shù)可以是每周1～7天給藥。但本發(fā)明并不受人G-CSF的用量的限制。另外，本發(fā)明的成纖維細(xì)胞動(dòng)員劑等還可以與其他藥物聯(lián)合使用。
[實(shí)施例1] 全骨髓移植(1)骨髓移植模型小鼠的制備用4×106V直線加速器，對(duì)8～10周齡的C57BL/6小鼠(CLEA，東京，日本)全身單次照射致死量放射線(850cGy)，作為受體小鼠使用。由GFP轉(zhuǎn)基因小鼠(C57BL/6，10～12周齡)(Oka be等，(1997)FEBS.Lett.407，313-319)的股骨和頸骨采集粗級(jí)分骨髓，通過尾靜脈向受體小鼠移植5×106個(gè)骨髓細(xì)胞。
為確認(rèn)受體小鼠骨髓中來自供體的GFP陽性骨髓細(xì)胞生長(zhǎng)程度如何(被稱作“嵌合率”)，對(duì)骨髓移植后60日的外周血有核細(xì)胞，用FACS Calibur(Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)進(jìn)行分析。結(jié)果如圖1所示。對(duì)照小鼠的骨髓有核細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)GFP，但受體小鼠的細(xì)胞中97.8％為GFP陽性。嵌合率的多少是定量供體來源的GFP陽性細(xì)胞的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中，作為骨髓移植模型小鼠，使用了外周血細(xì)胞嵌合率平均在95％以上的小鼠。這是基于滿足骨髓來源細(xì)胞對(duì)創(chuàng)傷治療貢獻(xiàn)的定量評(píng)價(jià)的條件來考慮的。
圖2中顯示了骨髓細(xì)胞離心涂片標(biāo)本。經(jīng)DAPI染色后，在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，幾乎所有的有核細(xì)胞(藍(lán)色)發(fā)出綠色，骨髓細(xì)胞為GFP陽性。
(2)給予G-CSF對(duì)心肌梗塞小鼠的效果骨髓移植60日后，對(duì)小鼠進(jìn)行0.5％異氟醚吸入麻醉，開胸、露出左心室，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈，制成心肌梗塞。制成心肌梗塞后24小時(shí)，將溶解于生理鹽水的重組人G-CSF(中外制藥(株)制)(100或300μg/kg/日)每日1次，連續(xù)10日，皮下給予小鼠(G-CSF給藥組)。對(duì)照組小鼠僅給予生理鹽水。
存活率調(diào)查了G-CSF給藥組(300μg/kg)和對(duì)照組的存活率(n＝68)(圖3)。對(duì)照組存活率在制成心肌梗塞后60日為約60％，G-CSF給藥組的存活率為約90％。
形態(tài)觀察制成心肌梗塞后60日時(shí)，對(duì)正常小鼠和對(duì)照組及G-CSF給藥組小鼠，使用配有15MHz相控陣探頭的ImagePoint1500超聲波診斷儀(Philips Co.，USA)，進(jìn)行經(jīng)胸壁心回波(M型超聲心動(dòng)圖)檢查，對(duì)心肌梗塞灶進(jìn)行形態(tài)觀察。將小鼠用氯胺酮(30mg/kg)和甲苯噻嗪(6mg/kg)麻醉，使之維持自主呼吸。由圖4明顯看到，對(duì)照組中，與正常左心室相比，其前壁部分心肌變薄，無收縮，左心室內(nèi)徑擴(kuò)大。與此相對(duì)，G-CSF給藥組(100μg/kg)中，左心室舒張末期徑的擴(kuò)大程度與對(duì)照組相比受到抑制。另外，左心室前壁雖呈現(xiàn)低收縮，但與對(duì)照組相比有顯著的改善。
心功能制成心肌梗塞后60日時(shí)，根據(jù)對(duì)照組和G-CSF給藥組(100或300μg/kg)的M型超聲心動(dòng)圖測(cè)定左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)和舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)(n＝68)。另外，根據(jù)Teichholz法計(jì)算舒張末期容積(EDV)及收縮末期容積(ESV)。左心室射血分?jǐn)?shù)(EF)按下式進(jìn)行計(jì)算。
EF％＝[(EDV-ESV)/EDV]×100結(jié)果如圖5和圖6所示。觀察到所有G-CSF給藥組的心功能得到顯著改善。
組織學(xué)檢查(i)切片的制作將小鼠用氯胺酮(30mg/kg)和甲苯噻嗪(6mg/kg)麻醉，用PBS進(jìn)行心臟灌流，用溶于PBS的4％多聚甲醛進(jìn)行灌注固定。取出心臟，將其包埋于OCT化合物(Miles Scientific，Naperville，IL，USA)中，用液氮快速冷凍。將包埋后的心臟切成薄片，制成切片。
(ii)偶氮染色制成心肌梗塞后60日時(shí)，將對(duì)照組和G-CSF給藥組(300μg/kg)的心臟左心室短軸切面的冷凍切片進(jìn)行偶氮染色。結(jié)果如圖7(a)所示。對(duì)照組中觀察到左心室徑擴(kuò)大，梗塞灶的“壁薄化”、伸展化，即觀察到所謂的心肌梗塞后重構(gòu)。與之相對(duì)比的是，G-CSF給藥組中，梗塞后的重構(gòu)為輕度，梗塞灶的“壁薄化”、伸展化減輕。即，通過給予G-CSF，心肌梗塞灶的組織再生，防止了重構(gòu)。
另外，用激光共聚焦顯微鏡觀察G-CSF給藥組的切片時(shí)，顯示心肌梗塞灶中GFP陽性骨髓細(xì)胞多數(shù)浸潤(圖7(b)，右圖)。
(iii)免疫染色將冷凍切片(6μm)用PBS洗凈，4℃下用抗體進(jìn)行染色過夜。之后，用PBS洗滌3次，4℃下同與TRI TC(DAKO，Japan)結(jié)合的二抗一起溫育4小時(shí)(紅色)。核用DAPI(Sigma Aldrich)染色(藍(lán)色)。
用激光共聚焦顯微鏡(LSM410；Carl Zeiss，Jena，Germany)觀察心肌梗塞灶(圖8)。非梗塞灶切片用抗α-輔肌動(dòng)蛋白抗體(cloneEA-53；Sigma Aldrich，Saint Louis，MO，USA)染色。心肌細(xì)胞被染為紅色，血管內(nèi)殘存極少數(shù)GFP陽性細(xì)胞(a)。對(duì)照組梗塞灶中只觀察到極少數(shù)GFP陽性細(xì)胞(b)。與之相對(duì)比的是，G-CSF給藥組(300μg/kg)中，梗塞灶中觀察到大量GFP陽性細(xì)胞(c)。使用作為供體小鼠的Lac-Z轉(zhuǎn)基因小鼠(10～12周齡Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME，USA)(c)進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)(c)的梗塞灶中的綠色螢光不是非特異性螢光(d)。另外，將激光共聚焦顯微鏡下拍照得到的圖像輸入計(jì)算機(jī)，用NIH Image進(jìn)行分析。計(jì)算對(duì)應(yīng)梗塞灶單位面積細(xì)胞數(shù)中的GFP陽性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果如圖9所示?？梢悦鞔_，通過給予G-CSF，來自骨髓的細(xì)胞向心肌梗塞灶游走。
接下來，確認(rèn)該GFP陽性細(xì)胞為何種細(xì)胞。
圖10顯示了用抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體(clone 1A4；SigmaAldrich)進(jìn)行免疫染色的結(jié)果。來自骨髓的GFP陽性細(xì)胞被染為紅色，可以明確其分化成為平滑肌細(xì)胞。
接著，對(duì)作為內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物的血友病因子(vWF)，使用抗vWF抗體(clone F8/86；DAKO)進(jìn)行免疫染色(圖11)。確認(rèn)了GFP信號(hào)被vWF信號(hào)包圍的區(qū)域，從而明確GFP陽性細(xì)胞也分化成為了內(nèi)皮細(xì)胞。
進(jìn)一步地，使用抗α-輔肌動(dòng)蛋白抗體，對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行免疫染色(圖12～14)。由圖12和圖13表明，GFP陽性細(xì)胞為輔肌動(dòng)蛋白陽性信號(hào)。另外，其中可見一些橫紋，暗示其為心肌細(xì)胞。由GFP陽性細(xì)胞可再生成為具有完全橫紋的心肌。圖14為每1μm進(jìn)行切割的切片照片。顯示來自骨髓的GFP陽性細(xì)胞再生成為完全的心肌細(xì)胞。
制成心肌梗塞后60日時(shí)，心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞占心肌梗塞灶中所觀察到的GFP陽性細(xì)胞的比率總結(jié)于圖15中。細(xì)胞數(shù)按如下方法求得。將心臟分為心尖部、中部、底部3部分，根據(jù)各自GFP陽性細(xì)胞的面積和組織厚度算出梗塞部組織的體積。測(cè)算每單位面積的GFP陽性細(xì)胞數(shù)，求出GFP陽性細(xì)胞的密度。根據(jù)GFP陽性細(xì)胞的密度和梗塞部位體積，算出梗塞部位組織中GFP陽性細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)。80％以上的細(xì)胞為紡錘形，其形態(tài)與造血細(xì)胞不同。另外，這些細(xì)胞為CD45陰性，Mac-1陰性。即，這顯示心肌梗塞灶中存在最多的是成纖維細(xì)胞。
來自骨髓的單一造血干細(xì)胞的移植從GFP轉(zhuǎn)基因小鼠采集骨髓，用細(xì)胞分類器分離出GFP陽性級(jí)分后，回收c-kit陽性、Sca-1陽性、linage抗原陰性、CD34陰性的造血干細(xì)胞。將這些細(xì)胞中的1個(gè)與由其他正常供體小鼠采集的粗分離骨髓細(xì)胞5×106個(gè)向經(jīng)致死量放射量照射后的受體小鼠進(jìn)行骨髓移植。3個(gè)月后，確認(rèn)骨髓中GFP陽性細(xì)胞的生長(zhǎng)率。麻醉開胸后，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈制成心肌梗塞。之后，連續(xù)10日經(jīng)皮下給予G-CSF(300μg/kg)。全骨髓移植組和單一造血干細(xì)胞移植組在給予G-CSF后10日的外周血有核細(xì)胞數(shù)均為30,000左右，未見差異(圖16)。
對(duì)單一造血干細(xì)胞組(直線)和全骨髓移植組(虛線)，分別考察其給予G-CSF(方塊)和不給予G-CSF(圓形)時(shí)的存活率(圖17)。不僅是全骨髓移植組，單一造血干細(xì)胞移植組中，通過給予G-CSF，存活率也得到顯著的改善。
接著，用與實(shí)施例1同樣的方法制作單一造血干細(xì)胞移植組的心肌梗塞灶切片，用抗波形蛋白抗體(PROGEN BIOTECHNIK GMBH公司制，Cat.No.GP53)進(jìn)行免疫染色。由圖18可明確，認(rèn)為在心肌梗塞灶中有GFP陽性細(xì)胞存在。明確有1個(gè)GFP陽性造血干細(xì)胞在心肌梗塞灶生長(zhǎng)。另外，因其被抗波形蛋白抗體染色，認(rèn)為其向成纖維細(xì)胞分化。
進(jìn)一步地，對(duì)單一造血干細(xì)胞移植組和全骨髓移植組，與實(shí)施例1同樣，測(cè)定了給予G-CSF和不給予G-CSF場(chǎng)合下的GFP陽性細(xì)胞數(shù)(圖19)。不僅是全骨髓移植組，單一造血干細(xì)胞移植組中，通過給予G-CSF，GFP陽性細(xì)胞數(shù)也顯著性增加。
對(duì)單一造血干細(xì)胞移植組給予G-CSF時(shí)的左心室切片，用抗心肌輔肌動(dòng)蛋白抗體進(jìn)行免疫染色(圖20)。GFP陽性細(xì)胞變?yōu)檩o肌動(dòng)蛋白陽性，顯示其分化為心肌細(xì)胞。
上述實(shí)施例1和2中的數(shù)值以平均值±SEM表示。通過ANOVA分析算出平均值間的顯著性差異。對(duì)照組與G-CSF給藥組的比較用log-rank檢驗(yàn)或非參數(shù)Fisher多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行。以p＜0.05為具有顯著性。
對(duì)8～10周齡的C57BL/6小鼠進(jìn)行致死量的放射線照射，將采集自CAG-EGFP小鼠(Okabe M.等，F(xiàn)EBS Lett.1997，407313-319)骨髓的全骨髓細(xì)胞(w-BM)或c-kit陽性、Sca-1陽性、lineage抗原陰性的單一細(xì)胞群(KSL-SP)通過尾靜脈移植入其體內(nèi)。8周后，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈制成心肌梗塞(MI)。MI制成后24小時(shí)，將生理鹽水(G-CSF(-))或300μg/kg/日的G-CSF(G-CSF(+))每日1次，連續(xù)10日，經(jīng)皮下給予小鼠。MI制成后8周時(shí)，解剖小鼠，對(duì)心臟進(jìn)行免疫組織學(xué)分析。對(duì)各小鼠組(n＝10)的100個(gè)樣品標(biāo)本，測(cè)算梗塞灶的GFP陽性細(xì)胞、GFP陽性波形蛋白陽性細(xì)胞和GFP陽性輔肌動(dòng)蛋白陽性細(xì)胞。GFP陽性細(xì)胞的平均值如表1所示。
表1 梗塞灶中GFP陽性細(xì)胞的定量分析

*梗塞灶的所有GFP陽性細(xì)胞數(shù)。
w-BM組中波形蛋白陽性細(xì)胞(成纖維細(xì)胞)和輔肌動(dòng)蛋白陽性細(xì)胞(心肌細(xì)胞)從所有骨髓中再生，而KSL-SP組中只有成纖維細(xì)胞再生。這一結(jié)果暗示，造血干細(xì)胞無法再生長(zhǎng)為心肌細(xì)胞。認(rèn)為心肌細(xì)胞的再生是由間質(zhì)干細(xì)胞分化得到的。
接著來看G-CSF的效果，w-BM組中動(dòng)員了成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞。KSL-SP組中盡管動(dòng)員了成纖維細(xì)胞，但心肌細(xì)胞僅觀察到3個(gè)。認(rèn)為這些心肌細(xì)胞恐怕不是由再生而產(chǎn)生，而是細(xì)胞融合的結(jié)果。
如圖17所示，所有組中，通過給予G-CSF，存活率得到改善。這些效果中，w-BM組中是有助于成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞的動(dòng)員，KSL-SP組中是有助于成纖維細(xì)胞的動(dòng)員。特別是，成纖維細(xì)胞的增加作用于心肌梗塞部位的創(chuàng)傷愈合，作為促進(jìn)抑制眾所周知的與死亡率相關(guān)的重構(gòu)的物質(zhì)，非常重要。
工業(yè)實(shí)用性通過使用本發(fā)明的成纖維細(xì)胞動(dòng)員劑，僅通過使少量的來自骨髓的細(xì)胞游走，能夠不進(jìn)行成纖維細(xì)胞移植，而使心肌梗塞灶等的組織再生，提高存活率。另外，通過使用本發(fā)明的創(chuàng)傷治療劑，能夠使創(chuàng)傷部位堅(jiān)固地愈合。
權(quán)利要求
1.成纖維細(xì)胞動(dòng)員劑，含有粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)作為有效成分。
2.權(quán)利要求1所述的動(dòng)員劑，其特征在于，向創(chuàng)傷組織動(dòng)員成纖維細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1所述的動(dòng)員劑，其特征在于，向心臟動(dòng)員成纖維細(xì)胞。
4.權(quán)利要求3所述的動(dòng)員劑，其特征在于，心臟是心臟疾病發(fā)病后的心臟。
5.權(quán)利要求4所述的動(dòng)員劑，心臟疾病是心肌梗塞。
6.成纖維細(xì)胞固定生長(zhǎng)劑，含有G-CSF作為有效成分、位于心臟疾病發(fā)病后的心臟。
7.權(quán)利要求6所述的固定生長(zhǎng)劑，其心臟疾病是心肌梗塞。
8.權(quán)利要求6所述的固定生長(zhǎng)劑，其心臟疾病發(fā)病后的心臟是心肌梗塞后的心肌梗塞灶。
9.創(chuàng)傷治療劑，含有G-CSF作為有效成分。
10.成纖維細(xì)胞動(dòng)員方法，包括給予有效劑量的G-CSF。
11.用于使心臟疾病發(fā)病后的心臟生長(zhǎng)成纖維細(xì)胞的方法，包括給予有效劑量的G-CSF。
12.創(chuàng)傷治療方法，包括給予有效劑量的G-CSF。
全文摘要
本發(fā)明的目的是，不移植成纖維細(xì)胞，簡(jiǎn)便地向創(chuàng)傷組織動(dòng)員成纖維細(xì)胞，使成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)在創(chuàng)傷組織，從而治療創(chuàng)傷。通過給予G－CSF，成纖維細(xì)胞向心肌梗塞灶移動(dòng)，防止心臟功能的降低，改善心臟的重構(gòu)。
文檔編號(hào)A61P9/00GK1886150SQ200480031859
公開日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2004年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月27日
發(fā)明者福田惠一, 藤田淳 申請(qǐng)人:學(xué)校法人慶應(yīng)義塾, 中外制藥株式會(huì)社