專(zhuān)利名稱(chēng)：拮抗hmgb1的單克隆抗體的制作方法
相關(guān)應(yīng)用本申請(qǐng)主張2003年11月11日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/502568的利益。通過(guò)在此引述將上述申請(qǐng)的全部教導(dǎo)都合并于本文。
背景技術(shù)：
炎癥通常是由促炎癥細(xì)胞因子誘導(dǎo)的，例如腫瘤凋亡因子(TNF)，白細(xì)胞介素(IL)-α，IL-1β，IL-6，巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)，和其他化合物。這些促炎癥細(xì)胞因子是由許多不同類(lèi)型的細(xì)胞產(chǎn)生的，特別是免疫細(xì)胞(例如，單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞)，但也有非-免疫細(xì)胞如纖維原細(xì)胞，造骨細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，上皮細(xì)胞，和神經(jīng)細(xì)胞。這些促炎癥細(xì)胞因子導(dǎo)致在促炎癥細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)的早期階段的多種失調(diào)。
早期的促炎癥細(xì)胞因子(例如TNF，IN-1，等)介導(dǎo)炎癥，并導(dǎo)致高遷移率族匣蛋白B1(HMGB1；也稱(chēng)為HMG-1和HMG1)的釋放，該蛋白聚集于血清中并介導(dǎo)滯后的致命性及早期促炎癥細(xì)胞因子的進(jìn)一步誘導(dǎo)。HMGB1最初被認(rèn)為是DNA-結(jié)合蛋白家族中的一員，定義為高遷移率族匣(HMGB)蛋白，其對(duì)于DNA的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性是必要的。其被認(rèn)為是一種普遍存在的非序列特異性結(jié)合雙鏈DNA的核蛋白。HMGB1分子具有三個(gè)域兩個(gè)DNA結(jié)合基，定義為HMGB A匣和HMGB B匣，及一個(gè)酸性羧基末端。兩個(gè)HMGB匣是高度保守的80氨基酸，L-型域。HMG匣在其他轉(zhuǎn)錄因子中也有表達(dá)，包括RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄因子，人下游-結(jié)合因子和淋巴-特異因子。
最近的證據(jù)已經(jīng)暗示HMG1是一種引發(fā)內(nèi)毒素血癥中滯后毀壞性的細(xì)胞因子介導(dǎo)者(Andersson，U.，et al.，J.Exp.Med.192(4)565-570(2000))。該工作顯示細(xì)菌內(nèi)毒素(脂多糖(LPS))激活單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞釋放HMG1作為活化作用的隨后應(yīng)答反應(yīng)，并導(dǎo)致具毒性的血清HMG1水平的升高。即使在早期細(xì)胞因子應(yīng)答反應(yīng)之后再給予隨后的抗體治療，針對(duì)HMG1的抗體仍可以防止內(nèi)毒素的致命性。與其他促炎癥細(xì)胞因子類(lèi)似，HMG1是一種單核細(xì)胞的蛋白質(zhì)催化劑。HMG1在氣管內(nèi)的應(yīng)用導(dǎo)致急性肺損害，而抗-HMG1抗體可保護(hù)內(nèi)毒素-引發(fā)的肺水腫(Abraham，E.，et al.，J.Immunol.1652950-2954(2000))。血清HMG1水平在膿血病或出血性休克的急性病人中升高，并且其在非生還者中的水平要遠(yuǎn)高于生還者。
HMG1已經(jīng)被認(rèn)為是RAGE的一個(gè)配基，它是一種免疫球蛋白超家族的多-配基受體。RAGE在內(nèi)皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，單核細(xì)胞，神經(jīng)中表達(dá)，并且配基交互作用在MAP激酶，P21ras，NF-kB中轉(zhuǎn)換信號(hào)。HMG1在內(nèi)毒素血癥中顯示的滯后動(dòng)力學(xué)特性使其成為一種潛在的良好治療目標(biāo)，但對(duì)于HMG1信號(hào)傳導(dǎo)和毒性的分子基礎(chǔ)了解得很少。
因此，基于HMG1蛋白在介導(dǎo)炎癥中的重要性，確定用于診斷和治療的結(jié)合HMGB的抗體顯得十分有益。
發(fā)明概述在不同的實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)注于結(jié)合脊椎動(dòng)物高遷移率族匣蛋白(HMGB)多肽的抗體或其抗原-結(jié)合片段，檢定并且/或者鑒別結(jié)合HMGB多肽的藥劑的方法，對(duì)促炎癥細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)活化作用特征化的病人情況給予治療的方法和測(cè)定樣品中HMGB多肽的方法。
在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明指特異地結(jié)合脊椎動(dòng)物HMGBAbox，但并不特異地結(jié)合非-A boxHMGB表位的抗體或其抗原-結(jié)合片段，結(jié)合的抗體或抗原-結(jié)合片段可抑制HMGB蛋白處理的脊椎動(dòng)物細(xì)胞中促炎癥細(xì)胞因子的釋放。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明指鼠科雜交瘤6E6 HMGB1 mAb，鼠科雜交瘤6H9 HMGB1 mAb，鼠科雜交瘤2G7 HMGB1 mAb，鼠科雜交瘤2E11 HMGB1 mAb，或鼠科雜交瘤10D4 HMGB1mAb產(chǎn)生的抗體。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明指抗體或其抗原結(jié)合片段，其與脊髓動(dòng)物HMGB1多肽的結(jié)合可以被6E6 HMGB1mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb和/或10D4 HMGB1 mAb抑制。在另一方面，本發(fā)明指含有6E6HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1mAb和/或10D4 HMGB1 mAB特定表位的抗體或其抗原結(jié)合片段。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明指抗體或抗原結(jié)合片段，其可結(jié)合由SEQ ID NO1中46至63氨基酸殘基，SEQ ID NO1中61至78氨基酸殘基和/或SEQ ID NO1中151至168氨基酸殘基組成的多肽。在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明指抗體或抗原結(jié)合片段，其可結(jié)合由SEQ ID NO1中46至63氨基酸殘基組成的多肽，該結(jié)合可被2G7 HMGB1 mAb抑制。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明指抗體或抗原結(jié)合片段，其可結(jié)合由SEQ ID NO1中61至78氨基酸殘基組成的多肽，該結(jié)合能被6E6 HMGB1 mAb和/或6H9HMGB1 mAb抑制。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明指抗體或抗原結(jié)合片段，其可結(jié)合由SEQ ID NO1中151至168氨基酸殘基組成的多肽，該結(jié)合能被2E11 HMGB1 mAb抑制。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明指從6E6 HMGB1 mAb，6H9HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb和2E11HMGB1 mAb組選取的，包括抗體的CDRs(CDR1，CDR2和CDR3)輕鏈和CDRs(CDR1，CDR2，CDR3)重鏈的抗體或抗原結(jié)合片段。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明指鼠科雜交瘤6E6 HMGB1 mAb，鼠科雜交瘤6H9 HMGB1 mAb，鼠科雜交瘤2G7 HMGB1 mAb，鼠科雜交瘤2E11 HMGB1 mAb，或鼠科雜交瘤10D4 HMGB1mAb。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明指一種分離細(xì)胞，其可產(chǎn)生特異結(jié)合脊髓動(dòng)物HMGB A box但不特異結(jié)合非-A box HMGB表位的抗體或抗原結(jié)合片段。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明指一種分離細(xì)胞，可制備6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1mAb，2E11 HMGB1 mAb或10D4 HMGB1 mAb。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明指一種分離細(xì)胞，產(chǎn)生抗體或其抗原結(jié)合片段，其與脊髓動(dòng)物HMGB1多肽的結(jié)合可被6E6 HMGB1 mAb，6H9HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb和/或10D4HMGB1 mAb抑制。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明指一種分離細(xì)胞，產(chǎn)生有6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1mAb，2E11 HMGB1 mAb和/或10D4 HMGB1 mAb特定表位的抗體或其抗原結(jié)合片段。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明指一種組合物，包括本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段和制藥學(xué)上可接受的賦形劑。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種檢測(cè)和/或鑒定結(jié)合脊髓動(dòng)物HMGB多肽的，包括結(jié)合本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段的制劑的方法，一種檢測(cè)試劑，以及包括脊髓動(dòng)物HMGB多肽的組合物。在該方法中，抗體或抗原結(jié)合片段與HMGB多肽之間的聯(lián)合體形式能被檢測(cè)或測(cè)量，并且當(dāng)與合適的對(duì)照相比，聯(lián)合體形式的減少表示測(cè)試藥劑結(jié)合了HMGB多肽。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明指對(duì)以促炎癥細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)活化作用為特征的病人情況給予治療的方法，包括對(duì)病人給藥本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段。
在某些實(shí)施方案中，這種情況指膿血癥，關(guān)節(jié)炎，狼瘡。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明指在樣本中檢測(cè)脊髓動(dòng)物HMGB多肽的方法。在該方法中，在適合抗體或抗原結(jié)合片段結(jié)合樣本中HMGB多肽的條件下，樣本與本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段相互作用。如果能檢測(cè)到抗體-HMGB聯(lián)合體或抗原結(jié)合片段-HMGB聯(lián)合體，則表示在樣本中存在HMGB多肽。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明指用于檢測(cè)是否在樣本中存在脊髓動(dòng)物HMGB多肽或其部分的試劑盒。該試劑盒包括本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段，和一種或更多種適合的輔助試劑，檢測(cè)抗體或抗原結(jié)合片段與HMGB多肽之間是否存在聯(lián)合體。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是人(Homo sapiens)HMGB1多肽的氨基酸序列(SEQID NO1)。有下劃線(xiàn)的氨基酸殘基表示A box，B box和HMGB1多肽的酸性尾巴區(qū)域。
圖2A是包括人(Homo sapiens)HMGB1 A box的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。有下劃線(xiàn)的氨基酸殘基表示HMGB1多肽的A box，其在人，大鼠，小鼠中相同。
圖2B是包括人(Homo sapiens)HMGB1 B box的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO3)。有下劃線(xiàn)的氨基酸殘基表示HMGB1多肽的B box，其在人，大鼠，小鼠中相同。
圖3A是編碼作為免疫原引發(fā)單克隆抗體的重組體CBP-鼠HGMB1多肽的核酸序列(SEQ ID NO4)。
圖3B是作為免疫原引發(fā)單克隆抗體的重組體CBP-鼠HGMB1多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO5)。被凝血酶剪切的CBP親和標(biāo)簽以小寫(xiě)字體表示，而HMGB1的正常翻譯起始氨基酸以下劃線(xiàn)標(biāo)示。
圖4A是編碼6E6 HMGB1 mAb的VH區(qū)域的核酸序列(SEQID NO6)。
圖4B是6E6 HMGB1 mAb的VH區(qū)域的氨基酸序列(SEQ IDNO7)；有下劃線(xiàn)的是CDRs。
圖4C是編碼6E6 HMGB1 mAb的VK區(qū)域的核酸序列(SEQID NO8)。
圖4D是6E6 HMGB1 mAb的VK區(qū)域的氨基酸序列(SEQ IDNO9)；有下劃線(xiàn)的是CDRs。
圖5A是編碼2E11 HMGB1 mAb的VH區(qū)域的核酸序列(SEQID NO10)。
圖5B是2E11 HMGB1 mAb的VH區(qū)域的氨基酸序列(SEQID NO11)；有下劃線(xiàn)的是CDRs。
圖5C是編碼2E11 HMGB1 mAb的VK區(qū)域的核酸序列(SEQID NO12)。
圖5D是2E11 HMGB1 mAb的VK區(qū)域的氨基酸序列(SEQID NO13)；有下劃線(xiàn)的是CDRs。
圖6A是編碼10D4 HMGB1 mAb的VH區(qū)域的核酸序列(SEQ ID NO14)。
圖6B是10D4 HMGB1 mAb的VH區(qū)域的氨基酸序列(SEQID NO15)；有下劃線(xiàn)的是CDRs。
圖6C是編碼10D4 HMGB1 mAb的VK區(qū)域的核酸序列(SEQ ID NO16)。
圖6D是10D4 HMGB1 mAb的VK區(qū)域的氨基酸序列(SEQID NO17)；有下劃線(xiàn)的是CDRs。
圖7是一張總結(jié)了各種抗-HMGB1單克隆抗體特征的圖表。顯示了克隆名稱(chēng)，產(chǎn)生單克隆抗體的免疫原(鼠HMGB1-CBP(SEQ ID NO5(見(jiàn)圖3B)或人HMGB1多肽的B box(SEQ ID NO3(見(jiàn)圖2B))，同種型，抗體的結(jié)合區(qū)域和體內(nèi)CLP分析結(jié)果。
圖8是一張描述了抗-HMGB1單克隆抗體對(duì)TNF釋放阻遏作用的柱狀圖。用0.1ug/ml的CBP-鼠HMGB1多肽(SEQ ID NO5)重組體刺激RAW064.7細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生鼠TNF。圖中顯示了，分別加入20ug/ml的6E6 HMGB1 mAb(6E6)，10D4 HMGB1 mAb(10D4)，2E11 HMGB1 mAb(2E11)，9G2 HMGB1 mAb(9G2)，或鼠IgG抗體對(duì)照(mIgG)的情況。所有樣本重復(fù)兩次，并且顯示錯(cuò)誤條。
圖9是一張柱狀圖，描述了各種抗-HMGB1單克隆抗體對(duì)TNF釋放的阻遏作用。用0.01ug/ml或0.1ug/ml的CBP-鼠HMGB1多肽(SEQ ID NO5)重組體刺激RAW064.7細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生鼠TNF。圖中顯示了，加入20ug/ml的3G8 HMGB1 mAb(3G8)，1A9 HMGB1 mAb(1A9)，9G2 HMGB1 mAb(9G2)，6E6 HMGB1mAb(6E6)，2E11 HMGB1 mAb(2E11)，10D4 HMGB1 mAb(10D4)，6H9 HMGB1 mAb(6H9)或鼠IgG抗體對(duì)照(IgG)的情況。
圖10是一張圖表，反應(yīng)了在盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)一段時(shí)間后，各種抗-HMGB1單克隆抗體(6E6 HMGB1 mAb(6E6)，2E11HMGB1 mAb(2E11)，9G2 HMGB1 mAb(9G2))和對(duì)照IgG抗體(Ctrl IgG)對(duì)鼠存活率的影響。
圖11描繪了包含CHO HMGB1或CHO HMGB2和重組體HMGB1-His6(作為CHO HMGB2和rec-HMGB1-His6被標(biāo)簽)樣本的一系列分離Western blots，樣本的探針為抗-His Tag抗體，抗-HMGB2抗體，抗-HMGB1/2單克隆抗體或特殊的抗-HMGB1單克隆抗體(如，2E11 HMGB1 mAb(CT3-2E11)，
1G3 HMGB1 mAb(CT3-1G3)，6H9 HMGB1 mAb(CT3-6H9)，2G7HMGB1 mAb(CT3-2G7)，2G5 HMGB1 mAb(CT3-2G5)，6E6HMGB1 mAb(CT3-6E6))。
圖12是HMGB1多肽的氨基酸序列隊(duì)列，序列來(lái)源于大鼠(SEQ ID NO18；以“大鼠#P07155”或“大鼠”(GenBank編號(hào)No.P07155)作為標(biāo)簽)，小鼠(Mus musculus)(SEQ ID NO18；作為“小鼠#AAA20508”或“小鼠”(GenBank編號(hào)No.AAA20508)被標(biāo)簽)和人(Homo sapiens)(SEQ ID NO1；以“人#AAA64970”或“人”(GenBank編號(hào)No.AAA64970)作為標(biāo)簽)。正如顯示的，A box和B box區(qū)域以下劃線(xiàn)標(biāo)記。
圖13A是一張描繪了對(duì)應(yīng)于人HMGB1特定區(qū)域的各個(gè)多肽，它們各自的氨基酸序列，分子量，需要產(chǎn)生1mM儲(chǔ)液的計(jì)算量和可用的數(shù)量的表格。
圖13B是一張描繪HMGB1多肽結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的柱狀圖。通過(guò)ELISA，生物素標(biāo)記的對(duì)應(yīng)于人HMGB1特定18個(gè)氨基酸區(qū)域的多肽和對(duì)應(yīng)于人HMGB1的9-85氨基酸殘基的更長(zhǎng)多肽(圖13A中列出)被制備并且分析了與特殊的抗-HMGB1單克隆抗體(如2E11 HMGB1 mAb(2E11)，6E6 HMGB1 mAb(6E6)，6H9HMGB1 mAb(6H9)，2G7 HMGB1 mAb(2G7)的結(jié)合情況。
圖14是一張描述抗-HMGB1單克隆抗體ELISAs的結(jié)果的示意圖。在ELISAs實(shí)驗(yàn)中，特異的抗-HMGB1單克隆抗體(2E11HMGB1 mAb(2E11)，2G5 HMGB1 mAb(2G5)，2G7 HMGB1mAb(2G7)和6E6 HMGB1 mAb(6E6))作為捕獲抗體使用，多克隆HMGB1抗體作為檢測(cè)抗體使用。
圖15是一張描述抗-HMGB1單克隆抗體ELISAs的結(jié)果的示意圖。在ELISAs實(shí)驗(yàn)中，特異的抗-HMGB1單克隆抗體(2F11HMGB1 mAb(2E11)，2G5 HMGB1 mAb(2G5)，2G7 HMGB1mAb(2G7)和6E6 HMGB1 mAb(6E6))作為捕獲抗體使用，6E6HMGB1 mAb作為檢測(cè)抗體使用。
圖16是一張描述在盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)后一段時(shí)間內(nèi)(天)，抗-HMGB1多克隆抗體6E6 HMGB1 mAb(6E6；見(jiàn)標(biāo)記，分別以1μg/小鼠，10μg/小鼠或100μg/小鼠的劑量)或?qū)φ誌gG抗體(對(duì)照IgG)對(duì)于小鼠存活率的劑量效應(yīng)曲線(xiàn)。
圖17是分別在CHO細(xì)胞(CHOHMGB1；SEQ ID NO36)；大鼠(大鼠HMGB1；SEQ IN NO18)，小鼠(musHMGB1；SEQ IDNO18)，人(huHMGB1；SEQ ID NO74)，豬(susHMGB1；SEQ IDNO37)和牛(bosHMGB1；SEQ ID NO38)中表達(dá)的HMGB1多肽的HMGB1多肽序列陣列。
圖18A是編碼包括5’6HIS標(biāo)簽的人重組HMGB1多肽核酸序列(rec-HMGB1-His；SEQ ID NO39)?？寺⌒蛄幸孕?xiě)字母顯示。
圖18B是包括5’6HIS標(biāo)簽的人重組HMGB1多肽的編碼氨基酸序列(rec-HMGB1-His；SEQ ID NO40)。
圖19A是編碼2G7 HMGB1 mAb的VH區(qū)域的核酸序列(SEQID NO41)。
圖19B是2G7 HMGB1 mAb的VH區(qū)域的編碼氨基酸序列(SEQ ID NO42)；CDRs以下劃線(xiàn)顯示。
圖19C是編碼2G7 HMGB1 mAb的VK區(qū)域的核酸序列(SEQID NO43)。
圖19D是2G7 HMGB1 mAb的VK區(qū)域的編碼氨基酸序列(SEQ ID NO42)；CDRs以下劃線(xiàn)顯示。
圖20是描述HMGB1多肽結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果的柱狀圖。對(duì)應(yīng)于HMGB1上46-63或61-78位氨基酸殘基的生物素標(biāo)記的多肽被制備并通過(guò)ELISA分析其與2G7 HMGB1 mAb(2G7)的結(jié)合情況。
圖21是描述HMGB1多肽結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果的柱狀圖。對(duì)應(yīng)于HMGB1上46-63或151-168位氨基酸殘基的生物素標(biāo)記的多肽被制備并通過(guò)ELISA分析其與21E11 HMGB1 mAb(2E11)的結(jié)合情況。
圖22是描述HMGB1和HMGB2多肽結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果的柱狀圖。分別對(duì)應(yīng)于人HMGB1上46-63位氨基酸殘基(標(biāo)記為“huHMGB1-46-63-B”)，人HMGB2上46-63位氨基酸殘基(標(biāo)記為“huHMGB2-46-63-B”)，人HMGB1上53-70位氨基酸殘基(標(biāo)記為“huHMGB1-53-70”)，或人HMGB1上61-78位氨基酸殘基(標(biāo)記為“huHMGB1-61-78-B”)的多肽被制備并通過(guò)ELISA分析其與2G7 HMGB1 mAb(2G7)或抗生物素蛋白的結(jié)合情況。
圖23是描述HMGB1和HMGB2多肽結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果的表。表中列出了各種多肽，它們各自的氨基酸序列和該多肽是否結(jié)合2G7 HMGB1 mAb的情況。列出的多肽包括對(duì)應(yīng)人HMGB1上40-57位氨基酸殘基(標(biāo)記為“人HMGB1-40-57”)，人HMGB1上46-63位氨基酸殘基(標(biāo)記為“人HMGB1-46-63-B”)，人HMGB1上53-70位氨基酸殘基(標(biāo)記為“人HMGB1-53-70”)，人HMGB2上46-63位氨基酸殘基(標(biāo)記為“人HMGB1-46-63-B”)和由不規(guī)則氨基酸序列組成的多肽，包括人HMGB1上46-63位不規(guī)則的氨基酸殘基(標(biāo)記為“人HMGB1 -46-63-scr”)。
圖24是描述HMGB1多肽結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果的表。表中列出了各種多肽，它們各自的氨基酸序列和該多肽是否結(jié)合6E6HMGB1 mAb的情況。列出的多肽包括對(duì)應(yīng)人HMGB1上53-70位氨基酸殘基(標(biāo)記為“人HMGB1-53-70”)，人HMGB1上61-78位氨基酸殘基(標(biāo)記為“人HMGB1-61-78-B”)，人HMGB1上67-84位氨基酸殘基(標(biāo)記為“人HMGB1-67-84”)和由不規(guī)則氨基酸序列組成的多肽，包括人HMGB1上61-78位不規(guī)則的氨基酸殘基(標(biāo)記為“人HMGB1-61-78-scr”)。
圖25是描述HMGB1多肽結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果的表。表中列出了各種多肽，它們各自的氨基酸序列和該多肽是否結(jié)合2E11HMGB1 mAb的情況。列出的多肽包括對(duì)應(yīng)人HMGB1上143-160位氨基酸殘基(標(biāo)記為“人HMGB1-143-160”)，人HMGB1上151-168位氨基酸殘基(標(biāo)記為“人HMGB1-151-168-B”)，人HMGB1上157-174位氨基酸殘基(標(biāo)記為“人HMGB1-157-174”)和由不規(guī)則氨基酸序列組成的多肽，包括人HMGB1上151-168位不規(guī)則的氨基酸殘基(標(biāo)記為“人HMGB1-151-168-scr”)。
圖26是一張柱狀圖，總結(jié)了多肽結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和描述了被2G7 HMGB1 mAb(2G7)，6E6 HMGB1 mAb(6E6)，2G5HMGB1 mAb(2G5)，6H9 HMGB1 mAb(6H9)，2E11 HMGB1 mAb(2E11)識(shí)別的HMGB1表位圖。
圖27A是完整的，未-裂解的6E6 HMGB1mAb的質(zhì)譜圖。
圖27B是經(jīng)過(guò)DTT裂解的6E6 HMGB1mAb的質(zhì)譜圖。
圖27C是經(jīng)過(guò)DTT裂解的6E6 HMGB1mAb輕鏈的質(zhì)譜圖。
圖27D是經(jīng)過(guò)DTT裂解的6E6 HMGB1mAb重鏈的質(zhì)譜圖。
圖28是一張描述在盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)后一段時(shí)間內(nèi)(天)，使用不同劑量的2G7 HMGB1mAb(0.004mg/kg，0.04mg/kg或0.4mg/kg)或?qū)φ誌gG抗體(0.4mg/kg)對(duì)于小鼠存活率的效果圖。
圖29是一張分別使用不同劑量(如4mg/kg，0.4mg/kg，0.04mg/kg，或0.004mg/kg)的6E6 HMGB1 mAb(6E6)，2G7HMGB1 mAb(2G7)，或?qū)φ誌gG后，小鼠的CLP存活率百分比示意圖。
圖30是人(Homo sapiens)HMGB2多肽的氨基酸序列(SEQID NO54；GenBank Accession No.M83665)。
圖31A是人(Homo spaiens)HMGB1多肽的氨基酸序列(SEQID NO74)。
圖31B是人(Homo spaiens)HMGB1多肽的的A匣(SEQ IDNO75)。
圖31C是人(Homo spaiens)HMGB1多肽的的B匣(SEQ IDNO76)。
圖32是一張描述不同抗-HMGB1單克隆抗體對(duì)TNF釋放的抑制作用柱狀圖。以0.1μg/ml重組CBP-鼠HMGB1多肽(SEQID NO5)刺激RAW264.7細(xì)胞可介導(dǎo)鼠TNF的釋放。介導(dǎo)的同時(shí)，加入不同的HMGB1單克隆抗體(培養(yǎng)上清中)，使之終濃度為13％。下列抗體被測(cè)試1A9 HMGB1 mAb(1A9)；2E11HMGB1 mAb(2E11)；2G5 HMGB1 mAb(2G5)；2G7 HMGB1mAb(2G7)；3G8 HMGB1 mAb(3G8)；4H11 HMGB1 mAb(4H11)；3-5A6 HMGB1 mAb(5A6)；6E6 HMGB1 mAb96E6)；9G2 HMGB1mAb(9G2)；4C9 HMGB1mAb(4C9)；和6H9HMGB1mAb(6H9).第一個(gè)深色柱表示在缺失任何抗體的條件下TNF的釋放情況。
圖33是一張描述不同抗-HMGB1單克隆抗體對(duì)TNF釋放的抑制作用柱狀圖。以0.1μg/ml重組CBP-鼠HMGB1多肽(SEQID NO5)刺激RAW264.7細(xì)胞可介導(dǎo)鼠TNF的釋放。介導(dǎo)的同時(shí)，加入不同的HMGB1單克隆抗體(培養(yǎng)上清中)，使之終濃度為13％。下列抗體被測(cè)試7H3 HMGB1 mAb(7H3)；9H3HMGB1 mAb(9H3)；10D4 HMGB1 mAb(10D4)；1C3 HMGB1mAb(1C3)；3E10 HMGB1 mAb(3E10)；4A10 HMGB1 mAb(4A10)；5C12 HMGB1 mAb(5C12)；和7G8 HMGB1 mAb(7G8).第一個(gè)深色柱表示在缺失任何抗體的條件下TNF的釋放情況。
發(fā)明的詳細(xì)描述在不同的實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)注于與脊椎動(dòng)物高遷移率簇匣(HMGB)多肽結(jié)合的抗體或抗原-結(jié)合片段，測(cè)定并且/或者鑒定結(jié)合HMGB多肽的試劑的方法，對(duì)以細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)活性為特性的病人給予治療的方法及測(cè)定樣本中HMGB多肽的方法。
抗體和制備抗體的細(xì)胞在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括結(jié)合HMGB多肽的抗體或抗原-結(jié)合片段。本發(fā)明的抗體可以是多克隆或單克隆抗體，術(shù)語(yǔ)“抗體”包括多克隆或單克隆抗體。術(shù)語(yǔ)多克隆和單克隆指所制備抗體的相同程度，而非限定于特定的制備方法。在某一實(shí)施方案中，抗體或抗原-結(jié)合片段是一個(gè)單克隆抗體或其抗原-結(jié)合片段。這里使用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”指僅含有一種能夠與本發(fā)明中特異多肽表位起免疫反應(yīng)的抗原結(jié)合位點(diǎn)類(lèi)型的抗體分子群。單克隆抗體組合物特異地顯示與其發(fā)生免疫反應(yīng)特異多肽的單一結(jié)合親和力。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”也包括抗體的功能片段，包括嵌合，人工，靈長(zhǎng)源，鑲嵌的或單鏈抗體的片段。功能片段包括與HMGB多肽(例如，哺乳動(dòng)物HMGB多肽(如哺乳動(dòng)物HMGB1多肽))結(jié)合的抗原-結(jié)合片段。例如，能夠結(jié)合HMGB多肽或其配基的抗體片段，包括，但不局限于Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab’和F(ab’)2片段。這些片段可以通過(guò)酶切或重組技術(shù)制備。例如，分別用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶酶解可以得到Fab和F(ab’)2片段。其他需要底物特異性的蛋白酶也可以被用于制備Fab和F(ab’)2片段。也可以通過(guò)在抗體基因的自然終止位點(diǎn)上游引入一個(gè)或多個(gè)終止密碼子來(lái)制備多種抗體縮短形式。例如，編碼F(ab’)2重鏈配基的嵌合基因可以通過(guò)設(shè)計(jì)引入編碼CH1區(qū)域和重鏈絞鏈區(qū)的DNA序列。
單鏈抗體，及嵌合，人工或靈長(zhǎng)源(CDR-嵌合)，或嵌合抗體，如嵌合，CDR-嵌合或嵌合單鏈抗體，包括了來(lái)源于不同物種的配基，并且被目前的發(fā)明和術(shù)語(yǔ)“抗體”所包括。這些抗體的不同配基可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)化學(xué)性地結(jié)合在一起，或可以通過(guò)遺傳工程技術(shù)制備成一種相似的蛋白。見(jiàn)，例如，Cabilly et al.，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,816,567；Cabilly et al.，歐洲專(zhuān)利號(hào)0,125,023 B1；Boss et al.，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,816,397；Boss et al.，歐洲專(zhuān)利號(hào)0,120,694 G1；Neuberger，M.S.et al.，WO 86/01533；Neuberger，M.S.et al.，歐洲專(zhuān)利號(hào)0,194,276 B1；Winter，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,225,539；Winter，歐洲專(zhuān)利號(hào)0,239,400 B1；Queen et al.，歐洲專(zhuān)利號(hào)10 451 216 B1；and Padian，E.A.et al.，EP0519596 A1。也可見(jiàn)，Newman，R.et al.，BioTechnology，101455-1460(1992)，關(guān)于靈長(zhǎng)源抗體，和Ladner et al.，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,946,778，and Bird，R.E.et al.，Science，242423-426(1988))關(guān)于單鏈抗體。
按照標(biāo)準(zhǔn)方法或其他合適的技術(shù)通過(guò)合成或重組DNA技術(shù)可以制備人源抗體。編碼人源可變區(qū)域的核酸(例如，cDNA)序列可以通過(guò)PCR突變法來(lái)構(gòu)建，改變編碼人或人源鏈的DNA序列，如來(lái)源于先前的人源可變區(qū)域的DNA模板。(見(jiàn)，Kamman，M.，et al.，Nucl.Acids Res.，175404(1989))；Sato，K.，et al.，CancerResearch，53851-856(1993)；Daugherty，G.L.et al.，Nucleic AcidsRes.，19(9)2471-2476(1991)；and Lewis，A.P.and S.Crowe，Gene，101297-302(1991))。利用這些或其他合適的方法，也可以制備可變區(qū)。在某一方面，克隆的可變區(qū)可以是突變的，從而可以挑選所期望的編碼可變區(qū)的特異序列(例如，從噬菌體文庫(kù)中；見(jiàn)，Krebber et al.，U.S.5,514,548；Hoogenboom et al.，WO 93/06213)。
抗體可以是人源抗體，其包括一種或多種免疫球蛋白鏈(例如，包括非人類(lèi)來(lái)源的CDR(如，從非人類(lèi)來(lái)源的抗體中得到的一種或多種CDRs)的抗體，及來(lái)源于人源輕鏈并且/或者重鏈的框架區(qū)域(如帶有或不帶有框架改變的CDR-嵌合抗體))。在某一實(shí)施方案中，抗體或其抗原-結(jié)合片段包括特定免疫球蛋白的輕鏈CDRs(CDR1，CDR2，CDR3)和重鏈CDRs(CDR1，CDR2，CDR3)。在另一實(shí)施方案中，抗體或抗原-結(jié)合片段進(jìn)一步包括人類(lèi)框架區(qū)域。
這里所敘述的抗體可以與一種試劑連接。在某一實(shí)施方案中，該試劑是一種標(biāo)簽，例如，放射性同位素，表位標(biāo)簽(標(biāo)簽)，親和標(biāo)簽(如，生物素，抗生物素蛋白)，自旋標(biāo)記，酶，熒光基團(tuán)或化學(xué)發(fā)光基團(tuán)。該發(fā)明中被標(biāo)記的抗體或抗原-結(jié)合片段可以用于，例如，這里敘述的診斷和/或預(yù)測(cè)方法。在另一實(shí)施方案中，抗體與藥物、毒素或抗-炎癥藥劑連接。本發(fā)明中藥物，毒素或抗-炎癥藥劑與抗-HMGB抗體和抗原-結(jié)合片段的結(jié)合可以將這些藥劑定位于HMGB表達(dá)和/或活躍的位置。該發(fā)明中可以與抗體連接的藥物和毒素包括，例如，化療藥劑(如，絲裂霉素C，paxlitaxol，氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶，cisplatin，cyclohexamide)，毒素(如，篦麻毒素，gelonin)和其他這里所敘述的藥劑(例如，所述的用于聯(lián)合治療的藥劑)。能夠連接的抗-炎癥藥劑包括，例如，這里所述的那些藥劑。
HMGB多肽(例如，哺乳動(dòng)物HMGB多肽)的特異抗體可以由適當(dāng)?shù)拿庖咴l(fā)，如分離的和/或重組HMGB多肽或其配基(包括合成分子，如合成多肽)?？贵w也可以通過(guò)用表達(dá)HMGB多肽的細(xì)胞免疫合適的宿主(如小鼠)的方法而產(chǎn)生，這些細(xì)胞如GH3細(xì)胞垂體后葉，巨噬細(xì)胞(例如RAW 246.7細(xì)胞，人巨噬細(xì)胞)，外周血單核細(xì)胞(PBMCs(例如，人PBMCs))，初級(jí)T細(xì)胞(例如，人初級(jí)T細(xì)胞)，腎上腺細(xì)胞(例如，鼠腎上腺PC-12細(xì)胞，人腎上腺細(xì)胞)和腎細(xì)胞(例如，鼠原初腎細(xì)胞，人原初腎細(xì)胞)。免疫合適的宿主(如，小鼠)。另外，表達(dá)重組HMGB多肽(如，哺乳動(dòng)物HMGB多肽)的細(xì)胞，如轉(zhuǎn)化細(xì)胞，可以作為免疫原或篩選與其結(jié)合的抗體而運(yùn)用(見(jiàn)，chuntharapaiet al.，J.Immunol.，1521783-1789(1994)；Chuntharapai et al.，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,440,021)。
免疫抗原，多克隆和單克隆抗體的制備可以通過(guò)任何適合的技術(shù)完成。許多方法已經(jīng)被描述(見(jiàn)，Kohler et al.，Nature，256495-497(1975)and Eur.J.Immunol.6511-519(1976)；Milstein et al.，Nature 266550-552(1977)；Koprowski et al.，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,172,124；Harlow，E.and D.Lane，1988，antibodiesAlaboratory Manual，(cold spring Harbor Laboratory；Cold SpringHarbor，NY)；current Protocols Inmolecular Biology，Vol.2(Supplement 27，Summer 94).Ausubel，F(xiàn).M.et al.，Eds.，(John wiley&SonsNew York，NY)，Chapter 11，(1991))。通常，如這里所舉例，雜交瘤可以通過(guò)將合適的永生細(xì)胞系(如，骨髓瘤細(xì)胞SP2/0，P3X63A g 8.653或heteromyeloma)與抗體表達(dá)細(xì)胞融合而制備?？贵w表達(dá)細(xì)胞可以從經(jīng)目標(biāo)抗原免疫的人或動(dòng)物的外周血或，更適宜地從脾或淋巴結(jié)中獲得。融合細(xì)胞(雜交瘤)通過(guò)選擇性培養(yǎng)基分離，并用有限稀釋法克隆。特異表達(dá)目標(biāo)抗體的細(xì)胞可以運(yùn)用合適的方法挑選(例如，ELISA)。
其他合適的制備或分離具備必要特異性的抗體(例如，人類(lèi)抗體或抗原-結(jié)合片段)的方法也可以運(yùn)用，包括，例如，從文庫(kù)中(例如，噬菌體顯示文庫(kù))篩選重組抗體的方法。能夠產(chǎn)生全套人類(lèi)抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如，異種小鼠(Abgenix，F(xiàn)remont，CA))可以通過(guò)合適的方法生產(chǎn)(見(jiàn)，Jakobovits et al.，Proc.Natl.acad.Sci.USA，902552-2555(1993)；jakobovits et al.，Nature，362255-258(1993))。其他合適的生產(chǎn)能夠產(chǎn)生全套人類(lèi)抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法已有敘述(例如，Lonberg et al.，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,545,806；Surani et al.，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,545,807；Lonberg et al.，WO 97/13852)。
在某一實(shí)施方案中，抗體或其抗原-結(jié)合片段對(duì)于HMGB多肽(例如，哺乳動(dòng)物HMGB多肽)具有特異性。在另一方面，抗體或其抗原-結(jié)合片段對(duì)于HMGB1多肽(例如，在SEQ IDNO1和/或SEQ ID NO74中敘述的人類(lèi)HMGB1多肽)具有特異性。在另一實(shí)施方案中，抗體或其抗原-結(jié)合片段是IgG或IgG的抗原-結(jié)合片段。在另一實(shí)施方案中，抗體或其抗原-結(jié)合片段是IgGl或IgGl的抗原-結(jié)合片段。在另一實(shí)施方案中，抗體或其抗原-結(jié)合片段是IgG2a，IgG2b，IgG3，或任何前述的抗原-結(jié)合片段。
在另一實(shí)施方案中，抗體或抗原-結(jié)合片段可以結(jié)合HMGB多肽并抑制(減少或防止)HMGB多肽的異種或多種功能。這些HMGB功能包括，例如，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)(見(jiàn)，例如，PCT公開(kāi)號(hào)WO 02/092004)，增加細(xì)胞促炎癥因子的釋放(見(jiàn)，例如PCT公開(kāi)號(hào)WO 02/092004)，結(jié)合RAGE，TLR2，化學(xué)吸引力(見(jiàn)，例如，Degryse et al.，J，Cell biol.152(6)1197-1206(2001)；它們的全部教導(dǎo)都通過(guò)在這里引述而合并于本文)。
在某一實(shí)施方案中，抗體是人類(lèi)抗體或其抗原-結(jié)合片段。在另一實(shí)施方案中，抗體是人工類(lèi)抗體或其抗原-結(jié)合片段。而在另一實(shí)施方案中，抗體或抗原-結(jié)合片段能夠抑制多肽(如RAGE，TLR2)與HMGB多肽的結(jié)合并且/或抑制一種或多種由結(jié)合HMGB多肽或其他多肽引發(fā)的功能。
在某些實(shí)施方案中，抗體或其抗原-結(jié)合片段特異地結(jié)合HMGB表位或抗原決定簇(例如，HMGB表位，HMGB A匣表位，HMGB B匣表位)。正如這里所敘述的，抗體或其抗原-結(jié)合片段可以根據(jù)其抑制促炎癥因子釋放的能力運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行篩選，而不必使用不適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)方案?？梢砸种萍?xì)胞中促炎癥因子的產(chǎn)生和/或促炎癥因子的釋放，并且/或者抑制以炎癥因子級(jí)聯(lián)活性為特征的狀況的抗-HMGB A-匣抗體和抗-HMGB B-匣抗體，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明中的抗體或抗原-結(jié)合片段可以抑制TNF，IL-1β，和/或IL-6的產(chǎn)生。在另一方面，本發(fā)明中的抗體或抗原-結(jié)合片段可以抑制TNF的產(chǎn)生(例如，TNF-α)。
正如這里所述，命名為“6E6 HMGB1 mAb”，“2E11 HMGB1mAb”，“6H9 HMGB1 mAb”，“10D4 HMGB1 mAb”，“2G7 HMGB1mAb”的結(jié)合HMGB1的單克隆抗體已經(jīng)被制備。此外，其他命名為“9G2 HMGB1 mAb”，“1A9 HMGB1 mAb”，“3G8 HMGB1mAb”，“2G5 HMGB1 mAb”，“4H11 HMGB1 mAb”，“7H3 HMGB1mAb”，“3-5A6 HMGB1 mAb”，“9G1 HMGB1 mAb”，“4C9 HMGB1mAb”，“9H3 HMGB1 mAb”，“1C3 HMGB1 mAb”，“5C12 HMGB1mAb”，“3E10 HMGB1 mAb”，“7G8 HMGB1 mAb”，“4A10HMGB1 mAb”，的單克隆抗體已經(jīng)被制備。除了9G2 HMGB1mAb和1A9 HMGB1 mAb之外所有的抗體都能與HMGB1結(jié)合。9G2 HMGB1 mAb和1A9 HMGB1 mAb似乎與免疫原的CBP區(qū)域(其占免疫原中的一小部分，并未被分割)結(jié)合。
6E6 HMGB1 mAb，也稱(chēng)為6E6-7-1-1或6E6，可以由鼠雜交瘤6E6 HMGB1 mAb制備，其于2003年9月3日以CriticalTherapeutics有限公司的名義，675Massachusetts Avenue，14樓，Cambridge，MA02139，美國(guó)，被保存于美國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心，10801學(xué)院大道，Manassas，Virginia 20110，美國(guó)，保藏號(hào)，PTA-5431。本發(fā)明涉及鼠雜交瘤6E6 HMGB1 mAb，其表達(dá)的抗體及編碼該抗體的核酸。
2E11 HMGB1 mAb，也稱(chēng)為2E11-1-1-2或2E11，可以由鼠雜交瘤2E11 HMGB1 mAb制備，其于2003年9月3日以CriticalTherapeutics有限公司的名義，675Massachusetts Avenue，14樓，Cambridge，MA02139，美國(guó)，保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心，10801學(xué)院大道，Manassas，Virginia 20110，美國(guó)，保藏號(hào)，PTA-5431。本發(fā)明涉及鼠雜交瘤2E11 HMGB1 mAb，其表達(dá)的抗體及編碼該抗體的核酸。
6H9 HMGB1 mAb，也稱(chēng)為6H9-1-1-2或6H9，可以由鼠雜交瘤6H9 HMGB1 mAb制備，其于2003年9月3日以CriticalTherapeutics有限公司的名義，675Massachusetts Avenue，14樓，Cambridge，MA 02139，美國(guó)，保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心，10801學(xué)院大道，Manassas，Virginia 20110，美國(guó)，保藏號(hào)，PTA-5434。本發(fā)明涉及鼠雜交瘤6H9 HMGB1 mAb，其表達(dá)的抗體及編碼該抗體的核酸。
10D4 HMGB1 mAb，也稱(chēng)為10D4-1-1-1-2或10D4，可以由鼠雜交瘤10D4 HMGB1 mAb制備，其于2003年9月3日以Critical Therapeutics有限公司的名義，675 Massachusetts Avenue，14樓，Cambridge，MA 02139，美國(guó)，保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心，10801學(xué)院大道，Manassas，Virginia 20110，美國(guó)，保藏號(hào)，PTA-5435。本發(fā)明涉及鼠雜交瘤10D4 HMGB1 mAb，其表達(dá)的抗體及編碼該抗體的核酸。
2G7 HMGB1 mAb，也稱(chēng)為3-2G7-1-1-1或2G7，可以由鼠雜交瘤2G7 HMGB1 mAb制備，其于2003年9月3日以CriticalTherapeutics有限公司的名義，675Massachusetts Avenue，14樓，Cambridge，MA 02139，美國(guó)，保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心，10801學(xué)院大道，Manassas，Virginia 20110，美國(guó)，保藏號(hào)，PTA-5432。本發(fā)明涉及鼠雜交瘤2G7 HMGB1 mAb，其表達(dá)的抗體及編碼該抗體的核酸。
培養(yǎng)以上鑒定了的鼠雜交瘤(例如，6E6 HMGB1 mAb，6H9HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2G7HMGB1 mAb)，需要加入DMEM，10％FCS，1％IL-6，1％L-谷氨酸和1％Pen-Strep。
9G2 HMGB1 mAb，也稱(chēng)為9G2-7-1-1-1或9G2，可以由鼠雜交瘤9G2 HMGB1 mAb制備，本發(fā)明涉及鼠雜交瘤9G2 HMGB1mAb，其表達(dá)的抗體及編碼該抗體的核酸。
1A9 HMGB1 mAb，也稱(chēng)為1A9-1-2-1-4或1A9，可以由鼠雜交瘤1A9 HMGB1 mAb制備，本發(fā)明涉及鼠雜交瘤1A9 HMGB1mAb，其表達(dá)的抗體及編碼該抗體的核酸。
3G8 HMGB1 mAb，也稱(chēng)為3G8-7-2-1-5或3G8，可以由鼠雜交瘤3G8 HMGB1 mAb制備，本發(fā)明涉及鼠雜交瘤3G8HMGB1 mAb，其表達(dá)的抗體及編碼該抗體的核酸。
2G5 HMGB1 mAb，也稱(chēng)為3-2G5-4-1-2或2G5，可以由鼠雜交瘤2G5 HMGB1 mAb制備，本發(fā)明涉及鼠雜交瘤2G5HMGB1 mAb，其表達(dá)的抗體及編碼該抗體的核酸。
4H11 HMGB1 mAb，也稱(chēng)為4H11，可以由鼠雜交瘤4H11HMGB1 mAb制備，本發(fā)明涉及鼠雜交瘤4H11 HMGB1 mAb，其表達(dá)的抗體及編碼該抗體的核酸。
7H3 HMGB1 mAb，也稱(chēng)為7H3，可以由鼠雜交瘤7H3HMGB1 mAb制備，本發(fā)明涉及鼠雜交瘤7H3 HMGB1 mAb，其表達(dá)的抗體及編碼該抗體的核酸。
3-5A6 HMGB1 mAb，也稱(chēng)為3-5A6或5A6，可以由鼠雜交瘤3-5A6 HMGB1 mAb制備，本發(fā)明涉及鼠雜交瘤3-5A6HMGB1 mAb，其表達(dá)的抗體及編碼該抗體的核酸。
9G1 HMGB1 mAb，也稱(chēng)為9G1，可以由鼠雜交瘤9G1HMGB1 mAb制備，本發(fā)明涉及鼠雜交瘤9G1 HMGB1 mAb，其表達(dá)的抗體及編碼該抗體的核酸。
4C9 HMGB1 mAb，也稱(chēng)為9G1，可以由鼠雜交瘤9G1HMGB1 mAb制備，本發(fā)明涉及鼠雜交瘤9G1 HMGB1 mAb，其表達(dá)的抗體及編碼該抗體的核酸。
9H3 HMGB1 mAb，也稱(chēng)為9H3，可以由鼠雜交瘤9H3HMGB1 mAb制備，本發(fā)明涉及鼠雜交瘤9H3 HMGB1 mAb，其表達(dá)的抗體及編碼該抗體的核酸。
1C3 HMGB1 mAb，也稱(chēng)為1C31-1-1-1或1C3，可以由鼠雜交瘤1C3 HMGB1 mAb制備，本發(fā)明涉及鼠雜交瘤1C3HMGB1 mAb，其表達(dá)的抗體及編碼該抗體的核酸。
5C12 HMGB1 mAb，也稱(chēng)為5C12-1-1-1-1或5C12，可以由鼠雜交瘤5C12 HMGB1 mAb制備，本發(fā)明涉及鼠雜交瘤5C12HMGB1 mAb，其表達(dá)的抗體及編碼該抗體的核酸。
3E10 HMGB1 mAb，也稱(chēng)為3E10-5-4-1-1或3E10，可以由鼠雜交瘤3E10 HMGB1 mAb制備，本發(fā)明涉及鼠雜交瘤3E10HMGB1 mAb，其表達(dá)的抗體及編碼該抗體的核酸。
7G8 HMGB1 mAb，也稱(chēng)為7G8，可以由鼠雜交瘤7G8HMGB1 mAb制備，本發(fā)明涉及鼠雜交瘤7G8 HMGB1 mAb，其表達(dá)的抗體及編碼該抗體的核酸。
4A10 HMGB1 mAb，也稱(chēng)為4A10-1-3-1-1或4A10，可以由鼠雜交瘤4A10 HMGB1 mAb制備，本發(fā)明涉及鼠雜交瘤4A10HMGB1 mAb，其表達(dá)的抗體及編碼該抗體的核酸。
某一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或其抗原-結(jié)合片段是從含有6E6HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb及上述的任何抗原-結(jié)合片段的組群中挑選的。
在另一實(shí)施方案中，抗體或抗原-結(jié)合片段具有與從組群中挑選出的抗體或抗原-結(jié)合片段相同或相似的特異表位，該組群包含6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb及上述的任何抗原-結(jié)合片段。與6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4HMGB1 mAb，和/或2E11 HMGB1 mAb的表位特異性相同或相似的抗體或抗原-結(jié)合片段可以通過(guò)多種合適的方法鑒定。例如，與，例如，6E6 HMGB1 mAb的表位特異性相同或相似的抗體或抗原-結(jié)合片段，可以基于其與6E6 HMGB1 mAb競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HMGB(例如，哺乳動(dòng)物HMGB多肽(例如，哺乳動(dòng)物HMGB1多肽))的能力進(jìn)行鑒定。在另一個(gè)例子中，例如，6E6 HMGB1 mAb的結(jié)合，以及具有相同或相似的HMGB多肽表位特異性的抗體的結(jié)合，可以被單一的多肽抑制(例如，自然多肽，合成多肽)。在許多方面，多肽可以包括，例如，9到50氨基酸，9到40氨基酸，9到30氨基酸，9到25氨基酸或9到20氨基酸。
如這里所示例，對(duì)應(yīng)于人類(lèi)HMGB1多肽特異區(qū)域的18氨基酸多肽顯示其能與多種HMGB1單克隆抗體結(jié)合。這里敘述的研究定位了HMGB1中特異結(jié)合HMGB1抗體的表位。
例如，2E11 HMGB1 mAb顯示其可以結(jié)合對(duì)應(yīng)于人類(lèi)HMGB1 151-168氨基酸(SEQ ID NO1中151-168位氨基酸；即LKEKYEKDIAAYRAKGKP(SEQ ID NO30))的多肽。進(jìn)一步的研究表明2E11 HMGB1 mAb識(shí)別HMGB1中帶有156-161，155-161，155-162，156-162和/或156-163位氨基酸殘基的表位(見(jiàn)例14)。
6E6 HMGB1 mAb和6H9 HMGB1 mAb顯示其可以結(jié)合對(duì)應(yīng)于人類(lèi)HMGB 161-78位氨基酸(SEQ ID NO1中61-78氨基酸；即EDMAKADKARYEREMKTY(SEQ ID NO24))的多肽。進(jìn)一步的研究表明6E6 HMGB1 mAb識(shí)別HMGB1中帶有61-78位氨基酸殘基的表位(見(jiàn)例13)。
2G7 HMGB 1mAb顯示其可以結(jié)合對(duì)應(yīng)于人類(lèi)HMGB146-63位氨基酸(SEQ ID NO1中46-63氨基酸；即SERWKTMSAKERGKFEDM(SEQ ID NO23))的多肽(見(jiàn)例10)。進(jìn)一步的研究表明2G7 HMGB1 mAb識(shí)別HMGB1中帶有53-63位氨基酸殘基的表位(見(jiàn)例12)。此外，2G7 HMGB1 mAb不結(jié)合HMGB246-63為氨基酸殘基(SEQ ID NO48)，盡管在HMGB146-63多肽和HMGB2 46-63多肽間僅有一個(gè)氨基酸的差異(見(jiàn)例12)。這樣，在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明地抗體或抗原結(jié)合片斷與HMGB1結(jié)合，而不與HMGB2結(jié)合。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明中的抗體或抗原-結(jié)合片段與HMGB1或HMGB2都結(jié)合。
這些18氨基酸多肽，或其他對(duì)應(yīng)于HMGB1特定區(qū)域的多肽，可以用于表位研究，鑒定某抗體或抗原-結(jié)合片段是否能抑制某多肽與抗體的結(jié)合，而已知該抗體可與該多肽結(jié)合(例如，6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb，其他這里敘述的抗體)。這樣，例如，抗體或抗原-結(jié)合片段的表位特異性可以用，例如，2E11HMGB1 mAb及對(duì)應(yīng)于人類(lèi)HMGB1(已知可與2E11 HMGB1mAb結(jié)合)的151-168氨基酸的多肽進(jìn)行試驗(yàn)。
在另一個(gè)例子中，具有與本發(fā)明中的抗體(例如6E6 HMGB1mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，和/或2E11 HMGB1 mAb)相同或相似表位特異性的抗體可以用嵌合HMGB多肽進(jìn)行鑒定(見(jiàn)，例如，Banks，G.C.，et al.，J.biol.Chem.274(23)16536-16544(1999))。
在某一實(shí)施方案中，抗體或抗原-結(jié)合片段可以與6E6HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb和/或上述的任何抗原-結(jié)合片段競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HMGB多肽(例如，哺乳動(dòng)物HMGB多肽(例如哺乳動(dòng)物HMGB1多肽))。正如這里所述，結(jié)合的抑制可以是對(duì)相同或相似表位的競(jìng)爭(zhēng)或位點(diǎn)干涉(例如，在此處抗體結(jié)合交迭表位或鄰近表位)的結(jié)果。6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb和/或上述的任何抗原-結(jié)合片段引起的抑制，也可以歸因于HMGB多肽結(jié)構(gòu)的變化，該變化是由抗體或抗原-結(jié)合片段與HMGB多肽的結(jié)合引起的。
在另一實(shí)施方案中，抗體或抗原-結(jié)合片段是從包括了3G8HMGB1 mAb，2G5 HMGB1 mAb，4H11 HMGB1 mAb，7H3HMGB1 mAb，3-5A6 HMGB1 mAb，9G1 HMGB1 mAb，4C9HMGB1 mAb，9H3 HMGB1 mAb，1C3 HMGB1 mAb，5C12 HMGB1mAb，3E10 HMGB1 mAb，7G8 HMGB1 mAb，4A10 HMGB1 mAb，和上述的任何抗原-結(jié)合片段的群組中挑選出的。
在某一實(shí)施方案中，具有與群組中挑選出的，抗體或抗原-結(jié)合片段相同或相似的表位特異性，該群組包括了3G8 HMGB1mAb，2G5 HMGB1 mAb，4H11 HMGB1 mAb，7H3 HMGB1mAb，3-5A6 HMGB1 mAb，9G1 HMGB1 mAb，4C9 HMGB1mAb，9H3 HMGB1 mAb，1C3 HMGB1 mAb，5C12 HMGB1mAb，3E10 HMGB1 mAb，7G8 HMGB1 mAb，4A10 HMGB1 mAb。如上所述，具有與一個(gè)或多個(gè)這些抗體或抗原-結(jié)合片段相同或相似表位特異性的抗體或抗原-結(jié)合片段可以用多種合適的方法鑒定(例如，用這里敘述的和/或此領(lǐng)域中已知的方法)。
在另一實(shí)施方案中，抗體或抗原-結(jié)合片段可以與3G8HMGB1 mAb，2G5 HMGB1 mAb，4H11 HMGB1 mAb，7H3HMGB1 mAb，3-5A6 HMGB1 mAb，9G1 HMGB1 mAb，4C9HMGB1 mAb，9H3 HMGB1 mAb，1C3 HMGB1 mAb，5C12 HMGB1mAb，3E10 HMGB1 mAb，7G8 HMGB1 mAb，4A10 HMGB1 mAb，和/或上述任何抗原-結(jié)合片段競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HMGB多肽(例如，哺乳動(dòng)物HMGB多肽)。正如這里所述，結(jié)合的抑制可以是對(duì)相同或相似表位的競(jìng)爭(zhēng)或位點(diǎn)干涉(例如，在此處抗體結(jié)合交迭表位或鄰近表位)的結(jié)果。抑制也可以歸因于HMGB多肽結(jié)構(gòu)的變化，該變化是由抗體或抗原-結(jié)合片段與HMGB多肽的結(jié)合引起的。
在某一實(shí)施方案中，抗體或其抗原-結(jié)合片段包括了從含有6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb的群組中挑選出的抗體的6個(gè)CDRs(輕鏈CDRs(CDR1，CDR2，CDR3)和重鏈CDRs(CDR1，CDR2，CDR3))。在另一實(shí)施方案中，抗體是一個(gè)人源抗體，其包括從含有6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb的群組中挑選出的抗體的輕鏈CDRs(CDR1，CDR2，CDR3)和重鏈CDRs(CDR1，CDR2，CDR3)。在另一實(shí)施方案中，抗體或其抗原-結(jié)合片段包括任何這里敘述的其他抗體的6個(gè)CDRs(輕鏈CDRs(CDR1，CDR2，CDR3)和重鏈CDRs(CDR1，CDR2，CDR3))。
在另一實(shí)施方案中，抗體或其抗原-結(jié)合片段可以包括本發(fā)明中的任何抗體(例如6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb)的1到6個(gè)輕鏈和重鏈CDRs。例如，抗體或其抗原-結(jié)合片段可以包括1，2，3，4，5，6個(gè)輕鏈和重鏈CDRs。另一實(shí)施方案中，抗體或其抗原-結(jié)合片段包括本發(fā)明中某一種抗體的至少一個(gè)輕鏈CDR或重鏈CDR，及本發(fā)明中另一種抗體(例如，6H9 HMGB1mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1mAb)的至少一個(gè)輕鏈CDR或重鏈CDR。例如，抗體或其抗原-結(jié)合片段可以包括一個(gè)或多個(gè)6E6 HMGB1 mAb的及一個(gè)或多個(gè)6H9 HMGB1 mAbCDRs。聯(lián)合了本發(fā)明中其他不同抗體的CDRs組合物的抗體或其抗原-結(jié)合片段也包括在內(nèi)。
在另一實(shí)施方案中，抗體或其抗原-結(jié)合片段包括了從含有3G8 HMGB1 mAb，2G5 HMGB1 mAb，4H11 HMGB1 mAb，7H3HMGB1 mAb，3-5A6 HMGB1 mAb，9G1 HMGB1 mAb，4C9HMGB1 mAb，9H3 HMGB1 mAb，1C3 HMGB1 mAb，5C12 HMGB1mAb，3E10 HMGB1 mAb，7G8 HMGB1 mAb，4A10 HMGB1 mAb的群組中挑選出的抗體的6個(gè)CDRs(輕鏈CDRs(CDR1，CDR2，CDR3)和重鏈CDRs(CDR1，CDR2，CDR3))。另一方面，抗體或其抗原-結(jié)合片段包括上述抗體中一種抗體的1到6個(gè)輕鏈和重鏈CDRs。
在某些實(shí)施方案中，抗體或其抗原-結(jié)合片段包括的一種或多種CDRs與本發(fā)明中的抗體(例如6E6 HMGB1 mAb，6H9HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11HMGB1 mAb)的CDRs分別至少有80％，或至少90％，或至少95％的一致性。在其它的實(shí)施方案中，抗體或其抗原-結(jié)合片段包括的一種或多種CDRs與本發(fā)明中的抗體的CDRs分別至少有80％，或至少90％，或至少95％的相似性。測(cè)定兩種多肽序列的一致性和相似性的方法在這里有所敘述，并且/或者在本領(lǐng)域中是熟知的。
本發(fā)明也涉及一種雙特異性抗體，或其功能片段(如F(ab’)2)，其可以與HMGB多肽及至少其他一種抗原(例如，腫瘤抗原，病毒抗原)結(jié)合。在具體的實(shí)施方案中，雙特異性抗體，或其功能片段，具有與6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb和/或2E11 HMGB1 mAb，及其他至少一種抗體相同或相似的表位特異性。雙特異性抗體可以由triomas和hybird雜交瘤分泌。通常，triomas是通過(guò)雜交瘤與淋巴細(xì)胞(例如，抗體-分泌B細(xì)胞)的融合構(gòu)建而成，而hybrid雜交瘤是通過(guò)兩種雜交瘤融合構(gòu)建而成。每一種融合細(xì)胞(例如，雜交瘤，淋巴細(xì)胞)都分泌單一的抗體。然而，triomas和hybrid雜交瘤可以產(chǎn)生含有識(shí)別不同抗原的抗原-結(jié)合位點(diǎn)的抗體。triomas和hybrid雜交瘤的培養(yǎng)上清可以通過(guò)適合的方法(例如，ELISA)來(lái)化驗(yàn)其雙特異性抗體，并且雙特異性抗體可以用常規(guī)的方法純化(見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,959,084(Ring et al.)，U.S.Patent No.5,141,7369(Iwasa et at.)，U.S.Patent Nos.4,444,878，5,292,668，5,523,210(all to Paulus et al.)和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,496,549(Yamazaki et al.))。
在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生本發(fā)明中的抗體或抗原-結(jié)合片段的分離的細(xì)胞。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明中分離的抗體-制備細(xì)胞是一種永生細(xì)胞，如雜交瘤，異種雜交瘤，淋巴母細(xì)胞或重組細(xì)胞。除了制備抗體，本發(fā)明中的抗體-制備細(xì)胞還有其他應(yīng)用。例如，本發(fā)明中的抗體-制備細(xì)胞可以與其他細(xì)胞融合(如合適的藥物-標(biāo)記的人骨髓瘤，鼠骨髓瘤，人-鼠異源骨髓瘤或人異源骨髓瘤細(xì)胞)以制備，例如，額外的雜交瘤，這樣則提供了編碼抗體的基因的轉(zhuǎn)移方法。此外，該細(xì)胞可以作為能被分離和表達(dá)的抗-HMGB免疫球蛋白鏈的編碼核酸的來(lái)源而被應(yīng)用，(例如，通過(guò)運(yùn)用任何適合的技術(shù)轉(zhuǎn)化至其他細(xì)胞中(見(jiàn)，例如，Cabilly et al.，U.S.Patent No.4,816,567，Winter，U.S.Patent No.5,225,539))。例如，包括了編碼重排抗-HMGB輕和/或重鏈的序列的克隆可以被分離出來(lái)(例如，通過(guò)PCR)。此外，cDNA文庫(kù)可以由合適的細(xì)胞系中分離的mRNA制備，從而可以分離編碼抗-HMGB免疫球蛋白鏈的cDNA克隆。這樣，可以得到編碼抗體，或其配基的重和/或輕鏈的核酸，并用于在不同宿主細(xì)胞或體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中制備特異的免疫球蛋白，免疫球蛋白鏈，或其變量形式(例如，人工免疫球蛋白)。例如，包括cDNAs，或編碼其派生物如人工免疫球蛋白或免疫球蛋白鏈等變量形式的核酸，可以被連接入合適的原核或真核載體(例如，表達(dá)載體)，并利用適當(dāng)?shù)姆椒ń閷?dǎo)入合適的宿主細(xì)胞(例如，轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染，電轉(zhuǎn)化，感染)，經(jīng)改造，該核酸與一種或多種表達(dá)調(diào)控元件相接(例如，存在于載體上或共同插入宿主細(xì)胞基因組中)，以制備重組抗體-制備細(xì)胞。這樣，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種核酸，其編碼屬于該發(fā)明的抗體或抗原-結(jié)合片段。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種載體，其包括了編碼本發(fā)明的抗體或抗原-結(jié)合片段的核酸。
HMGB多肽，HMGB A匣和HMGB B匣如所述，在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明是結(jié)合HMGB多肽的抗體或其抗原-結(jié)合片段。
這里使用的“HMGB多肽”是一種多肽，其序列與從包括SEQ ID NO1，SEQ ID NO18，SEQ ID NO74的群組中挑選的序列有至少60％，優(yōu)選地，至少70％，75％，80％，85％，或90，或更優(yōu)選地至少95％的一致性(例如，運(yùn)用BLAST程序和這里敘述的參數(shù)進(jìn)行測(cè)定)。在某一實(shí)施方案中，HMGB多肽加強(qiáng)了炎癥反應(yīng)并且/或者增加了細(xì)胞中促炎癥因子的釋放。
術(shù)語(yǔ)“多肽”涉及氨基酸的聚合體，并不限定特定的長(zhǎng)度；這樣，多肽的定義包括了縮氨酸，寡肽和蛋白質(zhì)。在某一實(shí)施方案中，HMGB多肽是一種哺乳動(dòng)物HMGB多肽，例如，一種哺乳動(dòng)物HMGB多肽(如，人HMGB多肽)。在另一實(shí)施方案中，如述，HMGB多肽包括了B匣DNA結(jié)合區(qū)域和/或A匣DNA結(jié)合區(qū)域和/或羧酸基末端。
其他HMGB多肽的例子在genebank編號(hào)為AAA64970，AAB08987，P07155，AAA20508，S29857，P09429，NP_002119，CAA31110，S02826，U11431，X67668，NP_005333，NM_016957，J04179中有所敘述。它們的全部教導(dǎo)都通過(guò)在這里引述而被合并于本文。HMGB多肽的額外的例子包括，但不局限于，哺乳動(dòng)物HMG1(例如，在genebank編號(hào)U51677中敘述的(HMGB1))，HMG2(例如，在genebank編號(hào)M83665中敘述的(HMGB2))，HMG-2A(例如，在genebank編號(hào)NM_005342和NP_005333中敘述的(HMGB3，HMG-4))，HMG14(例如，在genebank編號(hào)P05114中敘述)，HMG17(例如，在genebank編號(hào)X13546中敘述)，HMGI(例如，在genebank編號(hào)L17131中敘述)，HMGY(例如，在genebank編號(hào)M23618中敘述)，非哺乳動(dòng)物HMG T1(例如，在genebank編號(hào)X02666中敘述)和HMG T2(例如，在genebank編號(hào)L32859中敘述)(彩虹鮭魚(yú))；HMG-X(例如，在genebank編號(hào)D30765中敘述)(爪蟾)，HMG D(例如，在genebank編號(hào)X71138中敘述)和HMG Z(例如，在genebank編號(hào)X71139中敘述)(果蠅)；NHP 10蛋白(HMG蛋白同源物NHP1)(例如，在genebank編號(hào)Z48008中敘述)(酵母)；非-組蛋白染色體蛋白(例如，在genebank編號(hào)O00479中敘述)(酵母)；HMG1/2類(lèi)似蛋白(例如，在genebank編號(hào)Z11540中敘述)(小麥，玉米，大豆)；上游結(jié)合因子(UBF-1)(例如，在genebank編號(hào)X53390中敘述)；PMS1蛋白類(lèi)似物1(例如，在genebank編號(hào)U13695中敘述)；單鏈識(shí)別蛋白(SSRP，結(jié)構(gòu)-特異識(shí)別蛋白)(例如，在genebank編號(hào)M86737中敘述)；HMG類(lèi)似物TDP-1(例如，在genebank編號(hào)M74017中敘述)；哺乳動(dòng)物性-決定區(qū)域Y蛋白(SRY，睪丸-決定因子)(例如，在genebank編號(hào)X53772中敘述)；真菌蛋白mat-1(例如，在genebank編號(hào)AB009451中敘述)，stell(例如，在genebank編號(hào)X53431中敘述)和Mc 1；SOX14(例如，在genebank編號(hào)AF107043中敘述)(如同SOX 1(例如，在genebank編號(hào)Y13436中敘述)，SOX 2(例如，在genebank編號(hào)Z31560中敘述)，SOX 3(例如，在genebank編號(hào)X71135中敘述)，SOX 6(例如，在genebank編號(hào)AF309034中敘述)，SOX 8(例如，在genebank編號(hào)AF226675中敘述)，SOX 10(例如，在genebank編號(hào)AJ001183中敘述)，SOX 12(例如，在genebank編號(hào)X73039中敘述)和SOX 21(例如，在genebank編號(hào)AF107044中敘述))；淋巴特異因子(LEF-1)(例如，在genebank編號(hào)X58636中敘述)；T-細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄因子(TCF-1)(例如，在genebank編號(hào)X59869中敘述)；MTT1(例如，在genebank編號(hào)M62810中敘述)；SP100-HMG核心自身抗原(例如，在genebank編號(hào)U36501中敘述)。
其他HMGB蛋白的例子是由HMGB核酸序列編碼的多肽，這些核酸屬于genebank編碼NG_000897(HMG1L10)(特別地NG_000897的658-1305位核苷酸)；AF076674(HMG1L1)(特別地AF076674的1-633位核苷酸)；AF076676(HMG1L4)(特別地AF076676的1-564位核苷酸)；AC010149(來(lái)源于BAC克隆RP11-395A23的HMG序列)(特別地AC010149的75503-76117位核苷酸)；AF165168(HMG1L9)(特別地AF165168的729-968位核苷酸)；XM_063129(LOC122441)(特別地XM_063129的319-558位核苷酸)；XM_066789(LOC139603)(特別地XM_066789的1-258位核苷酸)；AF165167(HMG1L8)(特別地AF165167的456-666位核苷酸)。
本發(fā)明的抗體和抗原-結(jié)合片段結(jié)合HMGB多肽(例如，一種或多種上述的HMGB多肽)。在某一實(shí)施方案中，抗體和抗原-結(jié)合片段結(jié)合脊椎動(dòng)物HMGB多肽。在另一實(shí)施方案中，抗體和抗原-結(jié)合片段結(jié)合哺乳動(dòng)物HMGB多肽(例如，大鼠HMGB，小鼠HMGB，人HMGB)。另一實(shí)施方案中，(例如，大鼠HMGB1，小鼠HMGB1，人HMGB1)。在特定的實(shí)施方案中，抗體和抗原-結(jié)合片段結(jié)合人HMGB1多肽(例如，在SEQ ID NO1或SEQ IDNO74中敘述的人HMGB1多肽)。
本發(fā)明的組合物和方法也反應(yīng)了針對(duì)高遷移簇B(HMGB)A匣的抗體特征。在某一實(shí)施方案中，抗體和其抗原-結(jié)合片段結(jié)合HMGB A匣但不與HMGB的非-A表位特異結(jié)合。在另一實(shí)施方案中，抗體和其抗原-結(jié)合片段結(jié)合脊椎動(dòng)物HMGB A匣但不與HMGB的非-A表位特異結(jié)合。另一方面，抗體和其抗原-結(jié)合片段結(jié)合哺乳動(dòng)物(例如，人類(lèi)，鼠，鼠)HMGB A匣但不與HMGB的非-A表位特異結(jié)合。另一實(shí)施方案中，抗體和其抗原-結(jié)合片段結(jié)合HMGB1多肽的A匣(例如，哺乳動(dòng)物HMGB1多肽(例如，人類(lèi)HMGB1，大鼠HMGB1，小鼠HMGB1))但不與HMGB1的非-A表位特異結(jié)合。
如本文中所使用，“HMGB A匣”，同時(shí)也指“A匣”或“HMGA匣”，是一種蛋白質(zhì)或多肽，其與HMGB A匣(例如，這里所述的HMGB A匣)相比，至少有50％，60％，70％，75％，80％，85％，90，95％的序列一致性。在一個(gè)實(shí)施方案中，HMGBA匣具有一種或多種下列的生物活性抑制由HMGB介導(dǎo)的炎癥和/或抑制細(xì)胞中促炎癥因子的釋放(見(jiàn)，例如，PCT公開(kāi)號(hào)WO 02/092004，其全部教導(dǎo)都通過(guò)在此引述而合并于本文)。在某一實(shí)施方案中，HMGB A匣多肽具有上述的一種生物活性。特別地，HMGB A匣多肽皆具上述的兩種生物活性。在某一實(shí)施方案中，A匣與在圖2A(SEQ ID NO2的9-85殘基)或圖31B(SEQ ID NO75)中描述的A匣相比，具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％的序列一致性。在另一實(shí)施方案中，A匣包括或由哺乳動(dòng)物HMGB蛋白中相應(yīng)區(qū)域的氨基酸序列組成。HMGB A匣也可以是與這里描述的A匣氨基酸序列相同的重組-制備多肽。優(yōu)選地，HMGB A匣是一種脊椎動(dòng)物HMGB A匣，例如，一種哺乳動(dòng)物HMGB A匣，更優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物HMGB1 A匣，例如，人類(lèi)HMGB1 A匣，而最優(yōu)選地，HMGB1 A匣包括或由在圖2A(SEQ ID NO2中的9-85殘基)或31B(SEQ ID NO75)中描述的A匣序列組成。
HMGB A匣通常不多于85個(gè)氨基酸，并不少于4個(gè)氨基酸。在其它實(shí)施方案中，HMGB A匣可以包括10-85個(gè)氨基酸，20-85個(gè)氨基酸，30-85個(gè)氨基酸，40-85個(gè)氨基酸。具備A匣序列的多肽例子包括，但不局限于上述的HMGB多肽。在這些HMGB多肽中的A匣序列可以通過(guò)這里敘述的方法測(cè)定并分離，例如，利用這里敘述的與A匣的序列比對(duì)，并利用這里敘述的方法測(cè)定其生物活性，和/或其他本領(lǐng)域中已知的方法。
HMGB A匣多肽序列的額外例子包括下列序列PDASVNFSEF SKKCSERWKT MASKEKGKFEDMARKADKARYEREMKTYIPPKGET(人HMGB1；SEQIDNO55)；DSSVNFAEFSKKCSERWKTMSAKERSKFEDMAKSDDARYDREMKNYVPPKGDK(人HMGB2；SEQ ID NO56)；PEVPVNFAEFSKKCSERWKT VSGKEKSKFD EMARKADKVRYDREMKDYGPA KGGK(人HMGB3；SEQ ID NO57)；PDASVNFSEF SKKCSERWKT MSAKEKGKFE DMAKADKARYEREMKTYIPP KGET(人HMG1L10；SEQ ID NO58)；SDASVNFSEF SNKCSERWKMSAKEEKGKFE DMAKADKTHYERQMKTYIPP KGET(人HMG1L1；SEQ ID NO；59)；PDASVNFSEF SKKCSERWKA MSAKDKGKFEDMARKVDKADY EREMKTYIPP KGET(HMG1L4；SEQ IDNO60)；PDASVKFSER LKKCSETWKT IFAKEKGKFEDMARKADKAHY EREMKTYIPP KGEK(來(lái)源于BAC克隆RP11-395A23的HMG序列；SEQ ID NO61)；PDASINFSEFSQKCPETWKT TIAKEKGKFE DMARKADKAHY EREMKTYIPPKGET(HMG1L9；SEQ ID NO62)；PDASVNSSERSKKCSERWKTMPTKQGKFE DMAKADRAH(HMG1L8；SEQ IDNO63)；PDASVNFSEF SKKCLVRGKT MSAKEKGQFEAMARADKARY EREMKTYIP PKGET(LOC12244；SEQ IDNO64)；LDASVSFSEF SNKCSER WKT MSVKEKGKFEDMAKADKACY EREMKIYPYL KGRQ(LOC139603；SEQ IDNO65)；和GKGDPKKPRG KMSSYAFFVQ TCREEHKKKHPDASVNFSEF SKKCSERWKT MSAKEKGKFE DMAKADKARYEREMKTYIPP KGET(人HMGB1A匣；SEQ ID NO66).
本發(fā)明中的組合物和方法也以針對(duì)高遷移率簇B(HMGB)B匣的抗體為特征。在某一實(shí)施方案中，抗體或其抗原-結(jié)合片段結(jié)合HMGB B匣，但不特異結(jié)合HMGB的非-B匣表位。在另一實(shí)施方案中，抗體或其抗原-結(jié)合片段結(jié)合脊椎動(dòng)物HMGB B匣但不特異結(jié)合HMGB的非-B匣表位。另一實(shí)施方案中，抗體或其抗原-結(jié)合片段結(jié)合哺乳動(dòng)物(例如，人，大鼠，小鼠)HMGBB匣但不特異結(jié)合HMGB的非-B匣表位。而另一實(shí)施方案中，抗體或其抗原-結(jié)合片段結(jié)合HMGB1多肽(例如，哺乳動(dòng)物HMGB1多肽(例如，人HMGB1，大鼠HMGB1，小鼠HMGB1))B匣但不特異結(jié)合HMGB1的非-B匣表位。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“HMGB B匣”，也指“B匣”，或“HMG B匣”，是一種與HMGB1多肽(例如，這里敘述的HMGB B匣)相比，具有至少60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％序列一致性的多肽。在某一實(shí)施方案中，HMGB1匣具有以下一種或多種生物學(xué)活性增加炎癥和/或增加細(xì)胞中炎癥細(xì)胞因子的釋放(見(jiàn)，例如，PCT公開(kāi)號(hào)WO 02/092004)。在某一實(shí)施方案中，HMGB B匣多肽具有上述一種生物學(xué)活性。特別地，HMGB B匣多肽具有以上一種或多種生物學(xué)活性。在某一實(shí)施方案中，HMGB B匣與圖2B(SEQ ID NO3)或圖31C(SEQ IDNO76)中描述的B匣相比具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％或95％的序列一致性。在另一實(shí)施方案中，B匣包括或包含哺乳動(dòng)物HMGB蛋白中對(duì)應(yīng)區(qū)域的氨基酸序列。HMGB B匣也可以是一種重組方法制備的產(chǎn)物，其氨基酸序列與這里敘述的B匣序列相同。較合適地，HMGB B匣是一種脊椎動(dòng)物HMGB B匣，例如，哺乳動(dòng)物HMGB B匣，例如，人類(lèi)HMGB1 B匣，而更合適地，HMGB1 B匣包括或包含圖2B(SEQID NO3)或圖31C(SEQ ID NO76)中描述的B匣序列。
HMGB B匣通常不多于85個(gè)氨基酸并且不少于4個(gè)氨基酸。具有B匣序列的多肽例子包括，但不局限于上述的HMGB多肽。在這些多肽中的B匣序列可以通過(guò)這里敘述的方面測(cè)定和分離，例如，通過(guò)與這里敘述的B匣序列比對(duì)和測(cè)試其生物學(xué)活性。
其他的HMGB B匣多肽序列例子包括以下序列FKDPNAPKRP PSAFFLFCSE YRPKIKGEHP GLSIGDVAKKLGEMWNNTAA DDKQPYEKKA AKLKEKYEKD IAAY(人HMGB1；SEQ ID NO67)；KKDPNAPKRP PSAFFLFCSEHRPKIKSEHP GLSIGDTAKK LGEMWSEQSA KDKQPYEQKAAKLKEKYEKD IAAY(人HMGB2；SEQ IDNO68)；PKDPNAPKRL PSAFFLFCSE YRPKIKGEHPGLSIGDVAKK LGEMWNNTAA DDKQPYEKKA AKLKEKYEKDIAAY(HMG1L10；SEQ ID NO69)；FKDPNAPKRP PSAFFLFCSEYHPKIKGEHP GLSIGDVAKK LGEMWNNTAA DDKQPGEKKAADLKEKYEKD IAAY(HMG1L1；SEQ ID NO70)；FKDSNAPKRPPSAFLLFCSE YCPKIKGEHP GLPISDVAKK LVEMWNNTFADDKQLCEKKA AKLKEKYKKD TATY(HMG1L4；SEQ IDNO71)；FKDPNAPKRP PSAFFLFCSE YRPKIKGEHPGLSIGDVVKK LAGMWNNTAA ADKQFYEKKAAKLKEKYKKD IAAY(來(lái)源于BAC克隆RP11-359A23的HMG序列，SEQ ID NO72)；及FKDPNAPKRP PSAFFLFCSEYRPKIKGEHP GLSIGDVAKK LGEMWNNTAA DDKQPYEKKAAKLKEKYEKD IAAYRAKGKP DAAKKGVVKA EK(人HMGB1匣，SEQ ID NO73)。
這里敘述的HMGB多肽，HMGB A匣，HMGB B匣，無(wú)論其是自然產(chǎn)生或非-自然產(chǎn)生的，包括了與HMGB多肽，HMGB A匣，和/或HMGB B匣具有序列一致性的多肽。這里所使用的，在其氨基酸序列具有至少60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更高的同源性或一致性時(shí)，兩種多肽(或多肽區(qū)域)具有充分的同源性或一致性。通過(guò)適合的比較目的進(jìn)行序列排列(例如，第一個(gè)序列中可以插入間隔)可以測(cè)定兩種氨基酸序列(或兩種核酸序列)的一致性百分比。通過(guò)比較相應(yīng)位置的氨基酸或核酸，以相一致位置的數(shù)量在該序列中所占比例作為兩個(gè)序列間的一致性百分比(例如，％一致性＝#一致性位置/全部#位置*100)。在某些實(shí)施方案中，HMGB多肽，HMGB A匣多肽，或HMGB B匣多肽的長(zhǎng)度，以比較目的進(jìn)行陣列比對(duì)，至少占參考序列的長(zhǎng)度的30％，更適合地40％，更適合地60％，更適合地70％，80％，90％，或100％，參考序列的例子為這里敘述的對(duì)應(yīng)于HMGB多肽的序列(例如，SEQ ID NO1；SEQ ID NO；18，SEQID NO74)，一種HMGB A匣多肽(例如，SEQ ID NO29-85位殘基，SEQ ID NO75)或HMGB B匣多肽(例如，SEQ IDNO3，SEQ ID NO76)。目前兩種序列間的比較可以通過(guò)熟知的方法完成，例如，數(shù)學(xué)運(yùn)算。Karlin等論述了一種首選的，非-特異性的數(shù)學(xué)運(yùn)算的例子(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，905873-5877(1993))。如Schaffer等所敘述，這些運(yùn)算被合并入BLASTN和BLASTX程序(版本2.2)(Nucleic Acids Res，292994-3005(2001))。當(dāng)運(yùn)用BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)，各自程序的默認(rèn)參數(shù)(例如，BLASTN；在國(guó)家生物技術(shù)信息中心的互聯(lián)網(wǎng)上提供)可以被使用。在某一方面，搜索的數(shù)據(jù)庫(kù)是一種非-多于的(NR)數(shù)據(jù)庫(kù)，參數(shù)和序列比較可以設(shè)定為無(wú)過(guò)濾；期望值為10；文字大小為3；矩陣為BLOSUM62；缺口的現(xiàn)實(shí)值為11，變動(dòng)范圍為1。
另一種非-限制的運(yùn)用數(shù)學(xué)運(yùn)算進(jìn)行序列比較的例子是Myers和Miller的運(yùn)算法則，CABIOS(1989)。此運(yùn)算法則被合并入ALIGN程序(版本2.0)，其是GCG(Acelrys，san Diego，California)序列運(yùn)算軟件包的一部分。當(dāng)運(yùn)用ALIGN程序比較氨基酸序列時(shí)，PAM120重量殘基表，缺口長(zhǎng)度罰分為12，及缺口罰分為4等設(shè)定值被應(yīng)用。其他序列分析的運(yùn)算法則在本領(lǐng)域中是熟知的，包括Torellis和Robotti所述的ADVANCE和ADAM(Comput.Appl.Biosci，103-5，1994)；及Pearson和Lipman所述的FASTA(Proc.Natl.Acad.Sci USA，852444-2448，1988)。
在另一實(shí)施方案中，兩個(gè)氨基酸序列間一致性百分比可以運(yùn)用GCG軟件包(Acelrys，san Diego，California)中的GAP程序完成，可以使用Blosson63矩陣或PAM250矩陣，缺口重量為12，10，80，6，4，長(zhǎng)度量為2，3，4。在另一方面，兩個(gè)核苷酸序列間一致性百分比可以運(yùn)用GCG軟件包(Acelrys，san Diego，California)中的GAP程序完成，缺口量為50，長(zhǎng)度量為3。
抑制促炎癥因子的釋放和治療方法在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明是抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中促炎癥因子釋放的方法。在某一實(shí)施方案中，該方法包括用本發(fā)明的抗體或抗原-結(jié)合片段對(duì)細(xì)胞進(jìn)行治療。這里敘述了合適的抗體或抗原-結(jié)合片段，包括，例如，6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb，及具有6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb的表位特異性的抗體，及可以與6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合脊椎動(dòng)物高遷移率簇匣(HMGB)多肽的抗體，及上述任何抗體的抗原-結(jié)合片段。
這里使用的，“細(xì)胞因子”是一種由哺乳動(dòng)物細(xì)胞自然產(chǎn)生的調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)并介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞交互作用的可溶性的蛋白或多肽。無(wú)論在正?；虿±砬闆r下，細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)單個(gè)細(xì)胞和組織的功能活性。促炎癥因子是一種可以引發(fā)一種或多種與下列炎癥或炎癥情況相關(guān)生理反應(yīng)的細(xì)胞因子血管舒張，充血，與水腫相關(guān)的血管滲透性的增加，粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞的聚集，纖維蛋白的沉淀。某些情況下，促炎癥細(xì)胞因子也可以導(dǎo)致凋亡。例如，在慢性心臟失調(diào)中，已經(jīng)顯示了TNF刺激心肌凋亡(Pulkki，Ann.med.29339-343(1997)；and Tsutsui，et al.，Immunol.Rev.174192-209(2000))。非限制性的促炎癥細(xì)胞因子例子是腫瘤壞死因子(TNF)，白細(xì)胞介素(IL)-1α，IL-1β，IL-6，IL-8，IL-18，干擾素γ，HMG-1，血小板-激活因子(PAF)，和巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種治療病人情況的方法，包括給予病人本發(fā)明中的抗體或抗原-結(jié)合片段以治療，在這里該情況以炎癥因子的級(jí)聯(lián)活性為特征。合適的抗體或抗原-結(jié)合片段是這里所敘述的，包括，例如，6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1mAb，具有6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb的表位特異性的抗體，及可以與6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合脊椎動(dòng)物高遷移率簇匣(HMGB)多肽的抗體，及上述任何抗體的抗原-結(jié)合片段。
在某一實(shí)施方案中，治療的方法包括給予病人本發(fā)明中有效量的抗體或抗原-結(jié)合片段。這里使用的，“有效量”或“治療有效量”是阻止或減少炎癥反應(yīng)，并且/或者改善和/或減短與促炎癥因子反應(yīng)相關(guān)的癥狀時(shí)間的足夠劑量。在治療中起效的，阻止或控制特定情況的本發(fā)明中組合物的有效量可以被測(cè)定，例如，對(duì)在此敘述的動(dòng)物模型和/或在本領(lǐng)域中所熟知的動(dòng)物模型給予組合物治療。此外，體外試驗(yàn)可以被使用以幫助測(cè)定最佳劑量范圍。
在考慮幾種對(duì)于本領(lǐng)域中的技術(shù)所熟知的因素的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以測(cè)定合適的有效劑量(例如，通過(guò)臨床試驗(yàn))。這些因素包括，例如，情況或被治療的情況，病人癥狀的嚴(yán)重程度，選擇何種抗體或抗原-結(jié)合片段用于治療，病人的年齡，病人的體質(zhì)，病人的免疫情況，個(gè)別病人的反應(yīng)，及其他本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的因素，以反應(yīng)所治療的藥物組合物的精確度。
在具體制劑中的精確劑量也可以依賴(lài)于治療的路徑，情況的嚴(yán)重程度，并將由研究者的判斷和每個(gè)病人的情況來(lái)決定。有效劑量可以通過(guò)體外試驗(yàn)或動(dòng)物模型試驗(yàn)系統(tǒng)得到的劑量-效應(yīng)曲線(xiàn)推算出。例如，如這里所示例，運(yùn)用體外盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)試驗(yàn)，進(jìn)行了抗-HMGB1單克隆抗體6E6 HMGB1 mAb的劑量效應(yīng)試驗(yàn)(劑量1μg/小鼠，101μg/小鼠，或1001μg/小鼠)。
對(duì)于抗體而言，以病人的體重計(jì)算，給予病人(例如，人類(lèi)病人)治療的劑量可以具體地為0.1mg/kg到100mg/kg之間。優(yōu)選地，給予病人的治療劑量在0.1mg/kg到20mg/kg之間，更優(yōu)選地，在1mg/kg到10mg/kg之間。本發(fā)明中的某些實(shí)施方案中，根據(jù)患者體重，劑量至少為1mg/kg，5mg/kg，10mg/kg，50mg/kg，100mg/kg，150mg/kg。通常，由于對(duì)外源多肽具有免疫反應(yīng)，人源或人工抗體比其他物種的抗體在人體內(nèi)具有更長(zhǎng)的半衰期。這樣，人源抗體更低的劑量和更少的治療頻率是可能的。例如，可以每天，或每星期，每?jī)尚瞧?，每月給予0.01mg/kg到5或10mg/kg之間的抗體的有效劑量的治療。
測(cè)定抗體或抗原-結(jié)合片段是否抑制促炎癥因子情況的方對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。例如，細(xì)胞中促炎癥因子釋放的抑制可以通過(guò)本領(lǐng)域中熟知的技術(shù)方法被測(cè)定。例如，如這里所述和示例，細(xì)胞中TNF的釋放可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)鼠纖維細(xì)胞L929(ATCC，美國(guó)典型培養(yǎng)保存中心，Rockville，Maryland)(Bianchi etal.，Journal of Experimental Medicine 183927-936(1996))，以30pg/ml的最小檢出濃度進(jìn)行細(xì)胞毒素生物測(cè)定。L929細(xì)胞毒素生物測(cè)定按以下方案進(jìn)行。RAW264.7細(xì)胞在含有10％胎牛血清(Gemini，Catabases，California)，青霉素和鏈霉素(LifeTechnologies)的RPMI1640培養(yǎng)基(Life Technologies，GrandIsland，New York)中培養(yǎng)。加入多粘菌素(Sigma，St.Louis，Missouri)使之終濃度為100單位/ml，以抑制任何污染的LPS的活性。細(xì)胞與這里所述的抗體共同在Opti-MEM I培養(yǎng)基中培養(yǎng)8小時(shí)，上清(含有從細(xì)胞中釋放的TNF)被收集。從細(xì)胞中釋放的TNF用標(biāo)準(zhǔn)鼠纖維細(xì)胞L929(ATCC)以最小檢出值30pg/ml進(jìn)行細(xì)胞毒素生物測(cè)定(Bianchi et al.，supra)。重組鼠TNF可以從R&D Systems Inc.(Minneapolis，Minnesota)得到并在此試驗(yàn)中作為對(duì)照使用。測(cè)定細(xì)胞釋放的其他因子的方法在本領(lǐng)域中是熟知的。
以這里所述的方法進(jìn)行治療的適合的炎癥情況可以是具有炎癥因子級(jí)聯(lián)活性情況中的一種。在某一實(shí)施方案中，炎癥因子級(jí)聯(lián)引起系統(tǒng)反應(yīng)，如內(nèi)毒素休克。在另一實(shí)施方案中，炎癥情況是由局部的炎癥因子級(jí)聯(lián)介導(dǎo)的，如在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中?？梢杂帽景l(fā)明中的抗體和抗原-結(jié)合片段進(jìn)行有效治療的炎癥情況的非限制性例子包括，例如，腸胃和相關(guān)組織的疾病(例如腸梗阻，闌尾炎，消化道，胃和十二指腸潰瘍，腹膜炎，胰腺炎，潰瘍性結(jié)腸炎，假膜性，急性和缺血性結(jié)腸炎，憩室炎，會(huì)厭炎，失弛緩癥，膽管炎，膽囊炎，乳糜泄，肝炎，節(jié)段性回腸炎，腸炎，和Whipple氏病)；系統(tǒng)或局部炎癥疾病和情況(如哮喘，過(guò)敏，過(guò)敏性休克，免疫組合物疾病，組織缺血，再灌注損傷，器官壞死，花粉熱，膿血癥，敗血病，內(nèi)毒素休克，惡性潰瘍，高燒，嗜酸性肉芽腫，肉芽腫病，肉狀瘤病)；泌尿生殖器系統(tǒng)和相關(guān)組織的疾病(如感染性流產(chǎn)，附睪炎，陰道炎，前列腺炎，尿道)；呼吸系統(tǒng)和相關(guān)組織的疾病(如支氣管炎，肺氣腫，鼻炎，囊腫性纖維化，肺炎，成人呼吸窘迫綜合征，pneumoultramicroscopicsilicovolcanoconiosis，alvealitis，細(xì)支氣管炎，咽炎，胸膜炎，竇炎)；由不同病毒感染導(dǎo)致的疾病(如流感，呼吸合胞病毒，HIV，乙肝病毒，丙肝病毒，皰疹)，細(xì)菌(如彌漫性菌血癥，登革熱)，真菌(如念珠菌病)和原生動(dòng)物和多細(xì)胞寄生物(如瘧原蟲(chóng)，絲蟲(chóng)，阿米巴蟲(chóng)，包蟲(chóng)囊腫)；皮膚的疾病和情況(如燒傷，皮炎，皮肌炎，曬斑，風(fēng)疹疣，水皰)；心血管系統(tǒng)和相關(guān)組織的疾病(如(器官)狹窄，再狹窄，血管炎，血管炎，心內(nèi)膜炎，動(dòng)脈炎，動(dòng)脈硬化癥，血栓(性)靜脈炎，心包炎，充血性心力衰竭，心肌炎，心肌缺血，結(jié)節(jié)性動(dòng)脈周?chē)?，風(fēng)濕熱)；阿滋海默癥，腦膜炎，腦炎，多發(fā)性硬化癥，腦梗塞，腦栓，guillame-barre綜合癥，神經(jīng)炎，神經(jīng)痛，脊髓損傷，麻痹，眼色素層炎)；骨，關(guān)節(jié)，肌肉和連接組織的疾病(如多種arthritides和關(guān)節(jié)痛，骨髓炎，筋膜炎，帕哲氏病，痛風(fēng)，牙周疾病，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)膜炎)；其他自體免疫的和發(fā)炎疾病(如重癥肌無(wú)力，thryoiditis，全身紅斑性狼瘡，肺出血-腎炎綜合征，白塞氏綜合征，同種異體移植物注射，移植物抗宿主病，I型糖尿病，僵直性脊椎炎，Berger’s疾病和Retier’s綜合癥)；及各種癌，腫瘤和類(lèi)風(fēng)濕性疾病(如Hodgkins疾病)；和宿主對(duì)于任何原發(fā)性病的炎癥或免疫應(yīng)答。
在某一實(shí)施方案中，該情況是從一種組群中挑選出的，該組群包括膿血癥，移植排斥，關(guān)節(jié)炎(例如，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)，哮喘，動(dòng)脈硬化癥，再狹窄，狼瘡，成人呼吸窘迫綜合征，銀屑癬，胰腺炎，腹膜炎，燒傷，心肌缺血，器官缺血，缺血-再灌注，白塞氏病，移植物抗宿主病，Crohn’s疾病，潰瘍性結(jié)腸炎，腸梗阻，多發(fā)性硬化，惡疾。在另一方面，該情況是從含有膿血癥，關(guān)節(jié)炎(例如，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)，哮喘，狼瘡，銀屑癬，炎癥性腸疾病和Crohn’s疾病的組群中挑選出的。
優(yōu)選地，足夠劑量的抗體和抗原-結(jié)合片段被用于病人所需要的治療，以用于抑制細(xì)胞中促炎癥因子的釋放和/或炎癥情況的治療。在某一實(shí)施方案中，運(yùn)用這里敘述的方法或其他本領(lǐng)域中已知的方法，至少10％，20％，25％，50％，75％，80％，90％，95％的促炎癥因子的釋放被抑制。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“治療”，“治療的”和“治療”，指改善疾病或情況相關(guān)的癥狀，例如，炎癥疾病或炎癥情況，包括阻止或減緩疾病癥狀的發(fā)作，和/或減少疾病或情況的癥狀的嚴(yán)重程度或發(fā)生次數(shù)。這里定義的術(shù)語(yǔ)“主體”和“個(gè)體”包括動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物，包括但不局限于，靈長(zhǎng)類(lèi)，牛，綿羊，山羊，馬，狗，貓，兔，豚鼠，鼠，鼠或其他牛，綿羊，馬，犬，貓，嚙齒類(lèi)，或鼠科動(dòng)物。在某一實(shí)施方案中，該動(dòng)物是人類(lèi)。
在某一實(shí)施方案中，賦形劑可以包含在本發(fā)明中的抗體和抗原-結(jié)合片段中。賦形劑的選擇可以基于治療應(yīng)用中運(yùn)用抗體或抗原-結(jié)合片段治療的期望通道的基礎(chǔ)。組合物治療的通道依賴(lài)于所治療的情況。例如，靜脈內(nèi)注射可以用于系統(tǒng)性紊亂的治療，如內(nèi)毒素休克，而口服治療適合于腸胃紊亂，如胃潰瘍。如上所述，用于治療的抗體或抗原-結(jié)合片段的劑量可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員決定，而不用進(jìn)行聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)劑量-效應(yīng)研究的試驗(yàn)。根據(jù)情況，抗體或抗原-結(jié)合片段可以通過(guò)口服，注射，鼻內(nèi)，鞘內(nèi)，直腸內(nèi)，舌，舌下，口腔，口腔內(nèi)，透皮的方式給予病人治療。
相應(yīng)地，以口服，舌，舌下，口腔和口腔內(nèi)方式設(shè)計(jì)的抗體和抗原-結(jié)合片段可以用本領(lǐng)域中已知的方法制備，例如，與惰性稀釋劑和/或口服載體聯(lián)合，而不用進(jìn)行其他試驗(yàn)?？贵w和抗原-結(jié)合片段可以裝入凝膠膠囊或制備成藥片形式。基于口服治療的目的，本發(fā)明中的抗體和抗原-結(jié)合片段可以與賦形劑聯(lián)合并制備成藥片，片劑，膠囊，西也劑，懸液，糖漿，薄片，橡皮糖，及其他類(lèi)似物。
藥片，藥丸，膠囊，片劑，及其他類(lèi)似物，也可以含有結(jié)合劑，接受劑，分解劑，潤(rùn)滑劑，甜味劑，調(diào)味劑。粘結(jié)劑的例子包括微晶纖維素，黃蓍膠，凝膠。賦形劑的例子包括淀粉和乳糖。分散劑的例子包括褐藻酸，玉米淀粉，及其類(lèi)似物。潤(rùn)滑劑的例子包括硬脂酸鎂和硬脂酸鉀。滑動(dòng)劑的例子是二氧化硅膠。甜味劑的例子包括蔗糖，糖精，及其類(lèi)似物。調(diào)味劑的例子包括薄荷油，甲基水楊酸鹽，橙味調(diào)味料，及其類(lèi)似物。制備這些不同的組合物的材料應(yīng)當(dāng)是藥物純和無(wú)-內(nèi)毒素的。
本發(fā)明中的抗體和抗原-結(jié)合片段可以通過(guò)注射途徑給藥，例如，靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，胸腔或皮下注射。注射給藥可通過(guò)將本發(fā)明中的抗體和抗原-結(jié)合片段混合入溶液或懸液的方法完成。這些溶液或懸液包括無(wú)菌稀釋劑，如注射用水，鹽溶液，抑菌鹽溶液(包含0.9％ mg/ml苯甲醇)，磷酸緩沖鹽(這里指PBS)，Hank’s液，Ringer’s乳酸鹽，不揮發(fā)油，聚乙二醇，甘油，丙二醇，和其他合成溶劑。注射劑也包括抗菌藥劑(例如，苯甲醇，甲基對(duì)羥基苯甲酸酯)，抗氧化劑(例如，抗壞血酸維生素C，亞硫酸氫鈉)，和鰲合劑(例如，EDTA)。也可以加入緩沖液，如醋酸鹽，檸檬酸鹽或磷酸鹽及調(diào)節(jié)滲透壓的試劑如氯化鈉和葡萄糖。注射劑可以裝在安瓿瓶，注射器或玻璃或塑料制備的多劑量瓶。
直腸注射包括將抗體和抗原-結(jié)合片段注射入直腸或大腸內(nèi)。這可以通過(guò)栓劑或灌腸劑來(lái)完成。栓劑的形式可通過(guò)該領(lǐng)域已知的方法制備。如，可通過(guò)加熱甘油至120℃左右，將抗體或抗原-結(jié)合片段溶解在甘油中并與加熱的甘油混合，然后加入凈化的水，最后將熱組合物倒入栓劑模具中，來(lái)制備栓劑形式。
皮下給藥包括通過(guò)皮膚抗體或抗原-結(jié)合片段的經(jīng)皮膚的吸收。皮下形式包括貼劑，油膏，乳油，凝膠，藥膏等類(lèi)似物。
本發(fā)明的抗體和抗原-結(jié)合片段能被通過(guò)鼻腔給藥進(jìn)入主體。通過(guò)鼻腔給藥或鼻腔給藥的方法，包括使抗體或抗原-結(jié)合片段進(jìn)入主體鼻腔通路黏液膜或鼻腔。用于鼻腔給藥的抗體或抗原-結(jié)合片段的藥物學(xué)組合物，包括治療性有效劑量的抗體或抗原-結(jié)合片段。用于鼻腔給藥的眾所周知的方法包括，如，鼻腔噴霧，滴鼻，懸浮液，凝膠，藥膏，乳油，或粉劑?？贵w或抗原-結(jié)合片段的給藥也可以用鼻腔棉球或鼻腔海綿替代。
正如上面描述的，不同的給藥方式包括，如，口服，食療，局部的，皮下的，直腸的，非腸道的(如，靜脈內(nèi)的，動(dòng)脈內(nèi)的，肌肉的，皮下的，皮內(nèi)的注射)，和吸入(如，支氣管內(nèi)的，鼻內(nèi)的，口服，鼻內(nèi)滴入)。正如顯示的，給藥可以是局部或全身的。給藥首選的模式可以根據(jù)被用于給藥的抗體或抗原-結(jié)合片段和被治療特殊條件(如疾病)而變化，但是口頭或非腸道的給藥一般是首選的模式。
如果期望，這里描述的抗體或抗原-結(jié)合片段可以帶著一種或多種額外成分被治療(如用于治療發(fā)炎條件的成分)。抗體或抗原-結(jié)合片段的其中一部分和額外成分能在單獨(dú)的組合物中出現(xiàn)或作為分離的組合物進(jìn)行治療。如果作為分離成分進(jìn)行治療，抗體或抗原-結(jié)合片段的其中部分和額外成分能被同時(shí)或分別治療。
在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或抗原-結(jié)合片段與抗-炎癥藥劑一起被給予治療。這些藥劑對(duì)于本領(lǐng)域中的技術(shù)人員是熟知的。在某一方面，該試劑是早期膿血癥介導(dǎo)因子的拮抗劑。這里使用的，早期膿血癥介導(dǎo)因子是由炎癥因子級(jí)聯(lián)(例如，暴露于LPS)引發(fā)的一種細(xì)胞快速分泌(例如，30-60分鐘內(nèi))的促炎癥因子。這些因子的非限制性例子是IL-1α，IL-1β，L-6，PAF，MIF。這些因子的受體(例如，腫瘤壞死因子受體類(lèi)型1)和產(chǎn)生這些因子所需要的酶(例如，白介-1β轉(zhuǎn)化酶)也可以是早期膿血癥介導(dǎo)因子的例子。已知的或今后發(fā)現(xiàn)的任何早期膿血癥介導(dǎo)因子的拮抗劑，通過(guò)進(jìn)一步抑制炎癥因子級(jí)聯(lián)作用而顯示其在這些情況下的可用性。
早期膿血癥介導(dǎo)因子拮抗劑的非限制性例子是結(jié)合早期膿血癥介導(dǎo)因子mRNA并抑制其表達(dá)的反義鏈組合物，(見(jiàn)，例如Ojwang et al.，Biochemistry 366033-6045(1997)；Pampfer et al.，Biol.Reprod.521316-1326(1995)；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,228,642；Yahataet al.，antisense Nucleic acid drug Dev.655-61(1996)；and Taylor etal.，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.8199-205(1998))，特異切斷早期膿血癥介導(dǎo)因子mRNA的核酸酶(見(jiàn)，Leavitt et al.antisenseNucleic acid Drug Dev.10409-414(2000)；Kisich et al.，J.Immunol.163(4)2008-2016(1999)；and Hendrix et al.，Biochem.J.314(Pt.2)655-661(1996))，和結(jié)合并抑制早期膿血癥介導(dǎo)因子的抗體(見(jiàn)，例如，Kam and Targan，Expert Opin.Pharmacother.1615-622(2000)；agahira et al.，J.Immunol.ethods 22283-92(1999)；Lavine et al.，J.Cereb.Blood Flow Metab.1852-58(1998)；and Holmes et al.，Hybridoma 19363-367(2000))。已知的或今后發(fā)現(xiàn)的早期膿血癥介導(dǎo)因子拮抗劑，預(yù)計(jì)屬于本發(fā)明范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以決定抑制任何特定炎癥因子級(jí)聯(lián)作用的早期膿血癥介導(dǎo)因子的使用量，而不需要進(jìn)行例常劑量-效應(yīng)研究試驗(yàn)。
其他可以與本發(fā)明中的抗體和抗原-結(jié)合片段共同治療的試劑包括，例如VitaxinTM和其他針對(duì)αvβ3粘合素的抗體(見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,753,230，PCT公開(kāi)號(hào)WO 00/78815和WO02/070007，其全部教導(dǎo)都通過(guò)在此引述而合并于本文)和抗-IL-9抗體(見(jiàn)，例如，PCT公開(kāi)號(hào)WO 97/08321；其全部教導(dǎo)都通過(guò)在此引述而合并于本文)。
在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明中的抗體和抗原-結(jié)合片段可與TNF生物學(xué)活性抑制劑(例如，TNF-α生物學(xué)活性抑制劑)共同治療。這些TNF生物學(xué)活性抑制劑包括，例如，多肽，蛋白，合成分子，如合成有機(jī)分子，自然-產(chǎn)生分子，如自然產(chǎn)生的有機(jī)分子，核酸分子，及其成分。抑制TNF生物學(xué)活性的試劑的首選例子包括infliximab(Remicade；Centocor，Inc.，Malvern，Pennsylvania)，etanercept(Immunex；Seattle，Washington)，adalimumab(D2E7；Abot Laboratories，Abbot Park Illinois)，CDP870(Pharmacia Corporation；Bridgewater，New Jersey)CDP571(Celltech Group plc，United Kingdom)，Lenercept(Roche，Switzerland)，和鎮(zhèn)靜劑。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明特指一種組合物，其包括這里所敘述的抗體或抗原-結(jié)合片段與藥物-可接受的賦形劑。如上所述，該組合物中與抗體或抗原-結(jié)合片段聯(lián)合的賦形劑的選擇是基于此成分的期望的治療通道。合適的藥物-可接受賦形劑包括上述的和其他本領(lǐng)域中熟知的那些賦形劑。
在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明特指HMGB的適體(aptamers)(例如，HMGB1的適體)。在本領(lǐng)域中所知，適體是核酸(例如，RNA，DNA)的大分子組合物，其與特定分子目標(biāo)(例如，HMGB蛋白，HMGB匣(例如HMGB A匣，HMGB B匣)，這里所述的HMGB多肽和/或HMGB表位)緊密結(jié)合。一種特定的適體可以是一條線(xiàn)性核酸序列，特定地為15-60核苷酸長(zhǎng)度。適體中核苷間的鏈通過(guò)分子內(nèi)的相互作用使該分子折疊形成三維結(jié)構(gòu)。依據(jù)在所有可能的核酸序列中廣泛存在的分子形態(tài)的特定差別，適體可以從廣泛的分子目標(biāo)隊(duì)列中獲得，包括蛋白和小分子。除了高度特異性，適體對(duì)其目標(biāo)物具有高親和性(例如，與從皮摩爾到微摩爾蛋白的親和性)。適體具有化學(xué)穩(wěn)定性，并在煮沸或凍結(jié)時(shí)也不失去其活性。因其為合成分子，可以進(jìn)行多種形式的修飾，從而可以?xún)?yōu)化其功能，以用于特定應(yīng)用。例如，適體可以被修飾以極大地減少其在血液中對(duì)于酶解的敏感性，以利于體內(nèi)應(yīng)用。此外，適體可以被修飾以改變其生物分布性或血漿殘留時(shí)間。
結(jié)合HMGB或其片段(例如HMGB1或其片段)的適體的選擇方法可以從本領(lǐng)域中已知的方法獲得。例如，適體可利用SELEX(配基系統(tǒng)進(jìn)展指數(shù)增長(zhǎng))方法選擇(Tuerk，C.，and Gold，L.，Science249505-510(1990))。在SELEX方法中，大量核酸分子文庫(kù)(例如，1015種不同的分子)被制備，并且/或者用目標(biāo)分子進(jìn)行篩選(例如，HMGB蛋白，HMGB匣(例如HMGB A匣，HMGB B匣)，這里所述的HMGB多肽和/或HMGB表位)。目標(biāo)分子可以與核酸序列文庫(kù)共同孵育一段時(shí)間。本領(lǐng)域中的多種方法，組合物中的適體目標(biāo)分子可以與未結(jié)合并被丟棄的分子分離從而物理地分離出來(lái)。與目標(biāo)分子具有高度親和性的適體可以從目標(biāo)分子上分離純化并通過(guò)酶放大作用制備新的分子文庫(kù)，其對(duì)于可結(jié)合目標(biāo)分子的適體是足夠充足的。該充足的文庫(kù)可以被用于發(fā)起新的選擇，分離和擴(kuò)大循環(huán)。約5-15次重復(fù)的選擇，分離和擴(kuò)大循環(huán)后，文庫(kù)減少為緊密結(jié)合目標(biāo)分子的少數(shù)適體。組合物中單獨(dú)的分子可以被分離出來(lái)，其核酸序列可被測(cè)定，其結(jié)合親和力和特異性的特征可被測(cè)定和比較。分離的適體可以進(jìn)一步被精制以除去任何對(duì)結(jié)合目標(biāo)和/或適體結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)的核酸，由此制備適體核心結(jié)合區(qū)域的截短形式。見(jiàn)Jayasena，S.D.Clin.Chem.451628-1650(1999)關(guān)于適體技術(shù)的綜述；其全部教導(dǎo)都通過(guò)在此引述而合并于本文)。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的適體具有與這里所述的抗體的結(jié)合特異性和/或功能活性。這樣，例如，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明是關(guān)于適體的，如這里所述，其具有與本發(fā)明中的抗體相同或相似的結(jié)合特異性(例如，與脊椎動(dòng)物HMGB多肽，脊椎動(dòng)物HMGB多肽片段(例如，HMGB A匣，HMGB B匣)，脊椎動(dòng)物HMGB多肽表位區(qū)域(例如，與一種或多種本發(fā)明中的抗體結(jié)合的HMGB1表位區(qū)域)的結(jié)合特異性)。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明中的適體可以結(jié)合HMGB多肽或其片段并抑制一種或多種HMGB多肽的功能。如本文所述，HMGB多肽的功能包括，例如，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，增加細(xì)胞中促炎癥因子的釋放，結(jié)合RAGE，結(jié)合TLR2，化學(xué)親和力。在特定實(shí)施方案中，適體具有結(jié)合HMGB1(例如，人HMGB1(例如，在SEQ ID NO1或SEQID NO74中描述))和其片段(例如，A匣(例如，SEQ ID NO；2，SEQ ID NO75中的9-85位殘基)，B匣(例如，SEQ ID NO3，SEQ ID NO76)，這里所述的HMGB1抗體結(jié)合表位)及抑制一種或多種HMGB多肽的功能(例如，抑制經(jīng)HMGB刺激的細(xì)胞中的促炎癥抑制的釋放)。
診斷和/或預(yù)測(cè)的方法在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了測(cè)定樣本中高遷移率簇蛋白匣(HMGB)多肽的診斷和/或預(yù)測(cè)方法。在本方法的某一實(shí)施方案中，在適合于抗體或抗原-結(jié)合片段與樣本中存在的HMGB多肽相互結(jié)合的條件下，樣本與本發(fā)明中的抗體或抗原-結(jié)合片段相結(jié)合。此方法進(jìn)一步包括測(cè)定抗體-HMGB組合物或抗原-結(jié)合片段-HMGB組合物，抗體-HMGB組合物或抗原-結(jié)合片段-HMGB組合物的測(cè)定結(jié)果顯示樣本中存在HMGB多肽。此方法中所使用的合適的抗體或抗原-結(jié)合片段包括這里所述的，例如，6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，任何上述抗原-結(jié)合片段。
在另一實(shí)施方案中，抗體或抗原-結(jié)合片段包括了可檢測(cè)的標(biāo)簽。合適的用于測(cè)定HMGB多肽(例如，哺乳動(dòng)物HMGB多肽)和抗體或抗原-結(jié)合片段形成的組合物的標(biāo)簽包括，例如，放射性同位元素，表位標(biāo)簽(標(biāo)記)，親和標(biāo)簽(例如，生物素，抗生物素蛋白)，自旋標(biāo)簽，酶，熒光簇或化學(xué)發(fā)光簇。
如本文所述，這里所述的抗體或抗原-結(jié)合片段可以用于測(cè)定或測(cè)量HMGB多肽的表達(dá)。例如，本發(fā)明中的抗體可以用于測(cè)定或測(cè)量生物樣本(例如，細(xì)胞，組織或來(lái)源于個(gè)體的體液如血液，血清，白血球(例如，活性T淋巴細(xì)胞)，支氣管肺泡灌洗液，唾液，腸液，滑液，活體組織樣本)中的HMGB多肽。在某一實(shí)施方案中，該樣本是血液或血清。例如，可以從某個(gè)體中獲得樣本(例如，組織和/或體液)并用合適的方法測(cè)試HMGB多肽的存在或數(shù)量情況。合適的方法包括免疫學(xué)或免疫化學(xué)方法如流式細(xì)胞計(jì)數(shù)(例如，F(xiàn)ACS分析方法)和免疫吸收方法，包括酶聯(lián)免疫吸收方法(ELISA)，放射免疫試驗(yàn)(RIA)，化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)，免疫印跡(例如，western blot)，免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫組織學(xué)。通常，適合于形成HMGB多肽和抗體或抗原-結(jié)合片段組合物的條件下，本發(fā)明中的樣本和抗體或抗原-結(jié)合片段相互結(jié)合，(通過(guò)直接或非直接的方法)這些組合物的構(gòu)成被評(píng)估。在某一實(shí)施方案中，診斷和/或預(yù)測(cè)是運(yùn)用ELISA和/或western blot方法進(jìn)行的。
如本領(lǐng)域中所熟知，從個(gè)體獲得的樣本(例如，組織樣本)中的HMGB多肽(例如，HMGB1)水平的增高可以作為診斷和/或預(yù)測(cè)指標(biāo)，用于預(yù)測(cè)和監(jiān)控膿血癥相似病例的嚴(yán)重性，而該病人顯示了與以炎癥因子級(jí)聯(lián)活性為特征的情況相關(guān)的癥狀(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,303,321，其全部教導(dǎo)都在此通過(guò)引述而合并于本文)。這樣，在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明中的抗體和抗原-結(jié)合片段可以用于診斷和預(yù)測(cè)方法，預(yù)測(cè)與HMGB表達(dá)相關(guān)的炎癥情況臨床相似病例(例如，這里所述的情況)并/或監(jiān)控其嚴(yán)重性。在某些實(shí)施方案中，診斷和/或預(yù)測(cè)方法包括測(cè)試樣本的濃度，優(yōu)選地為血清樣本中HMGB的濃度，并將其與類(lèi)似樣本中HMGB正常水平范圍的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)相比較，在這里高水平的HMGB表明較差的預(yù)后性或毒素作用的可能性。診斷方法也可以應(yīng)用于其他組織或體液，如腦脊髓的液體或尿。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種用于測(cè)定樣本中高遷移率簇匣(HMGB)多肽或其配基的存在情況的檢測(cè)試劑盒。這些檢測(cè)試劑盒包括，例如，抗體或抗原-結(jié)合片段及一種或多種適合的輔助試劑，用于檢測(cè)抗體或抗原-結(jié)合片段和HMGB多肽或其配基形成的組合物的存在情況。本發(fā)明中的抗體或抗原-結(jié)合片段可以單獨(dú)或與特異結(jié)合其他表位的附加的抗體聯(lián)合，以?xún)龈尚问教峁?biāo)記或非標(biāo)記的抗體或抗原-結(jié)合片段，可以與佐劑成分(例如，緩沖液，如Tris(Tris(羥甲基)氨基甲烷)，磷酸鹽和碳酸鹽，穩(wěn)定劑，賦形劑，生物殺滅劑和/或惰性蛋白，例如，牛血清白蛋白)聯(lián)合包括在試劑盒中。例如，抗體或抗原-結(jié)合片段可以與佐劑成分混合的凍干形式提供，或者佐劑成分可以分開(kāi)提供，由使用者進(jìn)行混合。通常這些佐劑材料以小于占活性抗體重量的5％的量存在，或其總量小于抗體重量的0.001％。當(dāng)需要使用可以結(jié)合抗-HMGB抗體或抗原-結(jié)合片段的二抗或其抗原-結(jié)合片段時(shí)，這些二抗或其抗原-結(jié)合片段可由試劑盒提供，例如，獨(dú)立包裝在瓶?jī)?nèi)或容器內(nèi)。這些二抗或其抗原-結(jié)合片段，如果存在，是被特異地標(biāo)記的，并可以由與這里所述的抗體配制方法相似的方式進(jìn)行配制。抗體，試劑盒中的抗原-結(jié)合片段和/或附屬試劑可以用合適的容器(如瓶，盒子，封袋，管子)單獨(dú)或合并包裝。當(dāng)試劑盒包括一系列單獨(dú)的包裝成分，這些單獨(dú)包裝可以包含在一個(gè)大的單獨(dú)的包裝形式中(例如，瓶，盒子，封袋，管子)。
篩選的方法在另一實(shí)施方案中，該發(fā)明是一種測(cè)定或鑒定結(jié)合HMGB多肽(例如，哺乳動(dòng)物HMGB多肽(例如，HMGB1多肽))的試劑的方法。在某一實(shí)施方案中，測(cè)定或鑒定結(jié)合HMGB多肽的方法是一種競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)，其中被測(cè)試試劑對(duì)本發(fā)明的抗體或抗原-結(jié)合片段的抑制能力被檢測(cè)。例如，抗體或抗原-結(jié)合片段可以被這里所述的合適的標(biāo)記物標(biāo)記，在此試驗(yàn)中飽和HMGB多肽所需的標(biāo)記抗體或抗原-結(jié)合片段的量可以被測(cè)定。例如，在適合于結(jié)合和組合物形成的條件下，飽和HMGB多肽所需的標(biāo)記抗體或抗原-結(jié)合片段的量及被測(cè)試試劑的不同的量可以與HMGB多肽相聯(lián)系。在這種測(cè)試類(lèi)型中，標(biāo)記的抗體或抗原-結(jié)合片段和HMGB多肽形成的組合物量的減少表明被測(cè)試試劑可以與HMGB多肽結(jié)合。在另一實(shí)施方案中，HMGB多肽可以被標(biāo)記。適合的標(biāo)記抗體，抗原-結(jié)合片段和/或HMGB多肽的標(biāo)記物包括以上所述的示例。
各種不同的試劑，如蛋白質(zhì)(如抗體)，多肽，虛擬縮氨酸，小組織分子，核酸和其類(lèi)似物，可以測(cè)定其與HMGB多肽(例如，哺乳動(dòng)物HMGB多肽(例如，HMGB1多肽))的結(jié)合情況。根據(jù)本發(fā)明的方法，試劑可以單獨(dú)地進(jìn)行篩選或一種或多種試劑可以同時(shí)進(jìn)行測(cè)試。當(dāng)測(cè)試某種組合物時(shí)，通過(guò)所述的方法進(jìn)行選擇的組合物可以利用合適的方法(例如，測(cè)序，色譜)被分離(適當(dāng)?shù)?和鑒定。被測(cè)試樣本中的一種或多種混合成分(例如，配基，抑制子，啟動(dòng)子)也可以由這些方法進(jìn)行檢測(cè)。
如此所述，可以利用這里所述的或其他合適的方法，通過(guò)對(duì)分子文庫(kù)或收集庫(kù)，如，國(guó)家癌癥中心化學(xué)庫(kù)，進(jìn)行篩選，從而對(duì)結(jié)合HMGB多肽并有益于治療方法的試劑進(jìn)行鑒定。由組合化學(xué)或其他方法制備的組合物(例如，組織成分，重組或合成多肽，“peptoids”，核酸)的文庫(kù)，如組合文庫(kù)，可以被鑒定(見(jiàn)，例如，Zuckerman，R.N et al.，J.Med Chem.，372678-2685(1994)及其中引用的參考文獻(xiàn)；也可見(jiàn)，Ohlmeyer，M.H.J.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9010922-10926(1993)and DeWitt，H.H.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906909-6913(1993)，relating to taggedcompounds；Rutter W.J et al.美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,010,175；Huebner，V.D.et al.，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,182,366；和Geysen，H.M.，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,833,092)。當(dāng)從文庫(kù)中挑選的組合物帶有唯一的標(biāo)記時(shí)，用色譜方法鑒定單獨(dú)的成分是可行的。
本發(fā)明將由以下的例子進(jìn)行闡明，這些例子并非是限制性的。在此之前還未被清楚地合并于本文的被引用的所有出版物的相關(guān)技術(shù)，都將在此通過(guò)引述而合并于本文。
例1材料和方法HMGB1的單克隆抗體的制備每間隔2星期用20μg與Freund’s佐劑混合的重組CBP-鼠HMGB1(小鼠HMGB11-215位氨基酸聯(lián)接了CBP；CBP-鼠HMGB1的核酸序列被描述為SEQ ID NO4而氨基酸序列被描述為SEQ ID NO5(見(jiàn)圖3A和3B))腹膜內(nèi)免疫BALB/c小鼠，為期6周。8周后用溶解在PBS中的10μgCBP-鼠HMGB1腹膜內(nèi)免疫BALB/c小鼠作為最后一次加強(qiáng)免疫。最后一次加強(qiáng)免疫后4天，小鼠的脾細(xì)胞被分離并用于融合。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)進(jìn)行融合。脾臟通過(guò)細(xì)胞濾網(wǎng)的輕緩擠壓，得到單細(xì)胞懸液。充分洗滌后，脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞混合。緩慢加入聚乙二醇(PEG)，孵育5分鐘。細(xì)胞經(jīng)過(guò)洗滌并重新懸浮在含有20％FCS和HAT的DMEM中，轉(zhuǎn)移至96孔板并在37℃，10％CO2條件下培養(yǎng)10-14天。
在另一試驗(yàn)中，人HMGB1 B匣多肽(SEQ ID NO3；圖2B)作為免疫原被使用。每間隔3周用10μg/混合了Freund’s佐劑的注射用HMGB1 B匣對(duì)5只雌性BALB/c小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)免疫。每次加強(qiáng)免疫后1周進(jìn)行采血。第三次加強(qiáng)免疫后3周，給予最后一次小鼠HMGB1 B匣的腹膜內(nèi)注射免疫(10μg/小鼠)。最后加強(qiáng)免疫的72小時(shí)后，如上所述進(jìn)行雜交瘤融合試驗(yàn)。雜交瘤在含有20％FBS，HAT，CondiMed和1％pen/strep的DMEM中培養(yǎng)。通過(guò)光學(xué)讀數(shù)并鑒定那些5被高于背景值的克隆，從而對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定。
CBP-大鼠HMGB1和人HMGB1 B匣的抗體可通過(guò)有限稀釋和ELISA篩選。ELISA板用3μg/ml的重組HMGB1包被過(guò)夜，并用含有1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸緩沖鹽(PBS)封閉。ELISA板中加入雜交瘤上清，室溫孵育30分鐘。板經(jīng)洗滌后加入連接了辣根過(guò)氧化酶的抗-鼠Ig。室溫孵育30分鐘后，板經(jīng)洗滌并顯影。從陽(yáng)性細(xì)胞中得到的細(xì)胞被轉(zhuǎn)入到24孔板并通過(guò)有限稀釋進(jìn)行克隆。
HMGB1刺激TNF的釋放小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 264.7(可從美國(guó)典型培養(yǎng)中心(ATCC)獲得，Manassas，VA)與不同濃度的HMGB1在無(wú)血清的Opti-MEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)中于37℃共同培養(yǎng)4小時(shí)。收集上清并用ELISA試劑盒(R&D系統(tǒng)，Minneapolis，NM)測(cè)試TNF水平。此方法也可以運(yùn)用于肝素處理的全血。在這種情況下，HMGB1用Opti-MEM稀釋?zhuān)尤?00全血使終濃度至200μl，移至U-形底96孔板。將板置于37℃4小時(shí)并收集血漿用于ELISA試驗(yàn)。
為了篩選抑制HMGB1的mAbs，純化的mAbs用Opti-MEM稀釋并與鼠HMGB1在室溫下混合。5分鐘后，該組合物被轉(zhuǎn)移至含有RAW 264.7細(xì)胞的組織培養(yǎng)孔中。將板置于37℃4小時(shí)并收集血漿用于ELISA試驗(yàn)。
HMGB1單克隆抗體的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，WesternBlot分析和篩選為了測(cè)定HMGB1 mAbs和HMGB1，樣本與4XNuPAGE LDS樣本緩沖液混合，10X NuPAGE樣本濃縮試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA)。樣本在沸水中加熱5分鐘，立即置于冰上并上樣至SDS-聚丙烯酰胺凝膠。利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可進(jìn)行Western Blot分析。
對(duì)于測(cè)定HMGB1單克隆抗體的選擇性的試驗(yàn)(例如，對(duì)于HMGB1和/或HMGB2的選擇性)，Western Blot分析可用于以下樣本，如來(lái)源于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的含有非-重組(例如，自然的)HMGB1的樣本(圖11；標(biāo)記為CHO HMGB1；SEQID NO36)或來(lái)源于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的含有非-重組(例如，自然的)HMGB2的樣本及一些可測(cè)定的重組人HMGB1-His6(圖11；標(biāo)記為CHO HMGB2，rec-HMGB1-His6)。圖18A和18B顯示了帶有5’HIS標(biāo)簽的人重組HMGB1多肽的核酸和編碼的氨基酸序列(rec-HMGB1-His6；SEQ ID Nos39和40)。
對(duì)于含有CHO HMGB1的樣本，含有～2.5-5ng/μl非-重組(如，自然的)HMGB1的來(lái)源于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的樣本。20μl的樣本(例如，～50-100ng HMGB1)被上樣至凝膠并進(jìn)行SDS-PAGE。為了分離CHO HMGB1多肽，CHO細(xì)胞經(jīng)裂解后離心分離上清。運(yùn)用離子交換色譜和肝磷脂-親和色譜，具有HMGB1免疫反應(yīng)但無(wú)可檢測(cè)到HMGB2免疫反應(yīng)的峰區(qū)域被收集并作為CHO HMGB1來(lái)源。
對(duì)于來(lái)源于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的含有非-重組(例如，自然的)HMGB2和一些可檢測(cè)的重組HMGB1-His6的樣本(圖11；標(biāo)記為CHO HMGB2，HMGB1-His6)，轉(zhuǎn)染重組HMGB1-His6-表達(dá)質(zhì)粒的CHO細(xì)胞可以被利用。為了分離CHO HMGB2多肽，CHO細(xì)胞被裂解并經(jīng)離心分離上清。運(yùn)用離子交換色譜和肝磷脂-親和色譜，具有HMGB2免疫反應(yīng)，但無(wú)可檢測(cè)到自然HMGB1免疫反應(yīng)的峰區(qū)域被收集并作為CHO HMGB2來(lái)源。在一些情況下，收集的CHO HMGB2部分含有可測(cè)出量的重組HMGB-1-His6多肽，然而在SDS-PAGE中，基于其較慢的遷移率(并顯示了更高分子量)重組HMGB-1-His6多肽很容易與HMGB2相區(qū)分。如圖11，運(yùn)用凝膠系統(tǒng)進(jìn)行的Western blots示，非-重組CHO HMGB2的分子量顯示為～27000，非-重組CHOHMGB1的分子量顯示為～29000，重組HMGB-1-His6的分子量顯示為31000。對(duì)于CHO HMGB2，rec-HMGB1-His6樣本，20μ1的樣本(例如，～10-20ng HMGB2)被上樣至凝膠并進(jìn)行SDS-PAGE。
對(duì)于圖11中描述的Western blots，可以使用抗-His標(biāo)簽抗體(Santa Cruz，CA；2μg/ml)，抗-HMGB2抗體(Pharmingen，SanDiego，CA；2μg/ml)，抗-HMGB1/2mAb(MBL International，Watertown，MA；2μg/ml)或特異抗-HMGB1單克隆抗體(例如，2E11 HMGB1 mAb(CT3-2E11)，1G3 HMGB1 mAb(CT3-1G3)，6H9 HMGB1 mAb(CT3-6H9)，2G7 HMGB1 mAb(CT3-2G7)，2G5HMGB1 mAb(CT3-2G5)和6E6 HMGB1 mAb(CT3-6E6)；每種2μg/ml)。
單克隆抗體的測(cè)序根據(jù)試劑盒的程序，運(yùn)用Rneasy MiniKit(Qiagen，Valencia，CA)從雜交瘤細(xì)胞中提取全部RNA。根據(jù)試劑盒程序，運(yùn)用ProtoScript first Strand cDNA Synthesis Kit(New England biolabs，Catalog#E6500S)合成第一條cDNA鏈。在PCR反應(yīng)體系中加入5μgcDNA(如鼠Ig-引物設(shè)計(jì)程序中描述，Catalog#69831-3，Novagen，Madison，WI)，該體系還含有25pmol適當(dāng)?shù)?’引物(如Novagen Ig-引物設(shè)計(jì)程序中描述，重鏈引物MuIgGVH5’-A，MuIgGVH5’-B，MuIgGVH5’-C，MuIgGVH5’-D，MuIgGVH5’-E，MuIgGVL5’-A，MuIgGVL5’-B，MuIgGVL5’-C，MuIgGVL5’-D，MuIgGVL5’-E)和3’引物(如Novagen Ig-引物設(shè)計(jì)程序中描述，重鏈引物MuIgGVH3’-2和輕鏈引物MuIgGVL3’-2)。PCR反應(yīng)條件為94℃ 1分鐘，50℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘共35個(gè)循環(huán)，隨后72℃延長(zhǎng)6分鐘。PCR產(chǎn)物克隆入TOPO(Invitrogen，San Diego，CA)。用Genaissance Pharmaceuticals(New Haven，CT)進(jìn)行DNA序列分析。
HMGB1多肽結(jié)合試驗(yàn)結(jié)合抗-結(jié)合鏈霉親和素-包被板(Pierce，rockford，IL，目錄號(hào)#15501)的生物素化多肽和結(jié)合聚-D-賴(lài)氨酸包被ELISA板的非-生物素化多肽被用于抗-多肽ELISAs。對(duì)應(yīng)于人HMGB1特定的18個(gè)氨基酸區(qū)域的生物素化多肽，及對(duì)應(yīng)于人HMGB1特定的9-85個(gè)氨基酸區(qū)域的更長(zhǎng)的多肽，被制備，并用ELISA分析其結(jié)合特異抗-HMGB1單克隆抗體的情況。這些多肽，及其相應(yīng)序列，在圖13A中已有描述。通過(guò)加入60-100μg/孔的0.1mg/ml聚-D-賴(lài)氨酸水溶液制備聚-D-賴(lài)氨酸包被ELISA板。板置于室溫5分鐘并水漂洗除去溶液。
簡(jiǎn)要地，運(yùn)用相應(yīng)多肽的分子量，可用無(wú)-熱源-水制備1mM多肽溶液并稀釋入1X磷酸鹽緩沖液中。并在指定孔中加入100μl不同量的多肽溶液。板子覆蓋后在室溫放置60分鐘。然后用大于100μl的含有0.05％聚氧乙烯山梨聚糖(這里指Tween20TM)的PBS洗3遍，每孔加入200μl封閉劑(溶于PBS的5％脫脂奶粉，0.05％Tween20TM)。板子覆蓋后在室溫放置60分鐘。用大于100μl的含有0.05％Tween20TM的PBS洗3遍。
在指定孔中加入100μl一抗體(例如，2E11 HMGB1 mAb，6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，以2μg/ml溶解在封閉液中)，板子覆蓋后在室溫放置30分鐘。用大于100μl的含有0.05％Tween20TM的PBS洗3遍。
每孔中加入100μl羊-抗鼠辣根過(guò)氧化酶(HRP)-連接的二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA，目錄號(hào)115-035-071；1∶2000稀釋使用)。板子覆蓋后在室溫放置30分鐘，隨后用大于100μl的含有0.05％Tween20TM的PBS洗3遍。每孔中加入50μl 1X TMB(Sigma，St.Louis，MO)，
在室溫放置10分鐘，用icroplate/Manager軟件和BioRad680型讀板儀在655nm處測(cè)量吸收值。平均背景值均從每個(gè)樣本值中減去。
盲腸結(jié)扎穿孔盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)按上述方法進(jìn)行(Fink and Heard，J.Surg.Res.49186-196(1990)；Wichmann et al.，Crit.Care Med.262078-2086(1998)；and Remick et al.，Shock 489-95(1995))。簡(jiǎn)要地，BALB/c小鼠按75mg/kg克他命(Fort Dodge，F(xiàn)ort Dodge，Iowa)和20mg/kg甲苯噻嗪(Bohringer Ingelheim，St.Joseph，MO)肌肉內(nèi)注射麻醉。按中線(xiàn)進(jìn)行切口，分離出盲腸。在遠(yuǎn)離回盲閥方向的盲腸端5mm處用6-0聚丙烯紡織纖維縫合繃帶結(jié)扎。
結(jié)扎的盲腸末端用22-規(guī)格針頭刺孔，不需直接擠出糞便。盲腸被放回入正常的腹腔位置。腹部用6-0聚丙烯紡織纖維進(jìn)行雙層連續(xù)縫合縫合，腹膜和繃帶應(yīng)分離以防止流液滲漏。所有的動(dòng)物以20ml/kg體重皮下注射正常鹽溶液使之復(fù)蘇。復(fù)蘇后30分鐘，每只小鼠皮下注射imipenem(0.5mg/小鼠)(Primaxin，Merck & Co.，Inc.，West Point，PA)。動(dòng)物隨之復(fù)原。一星期后記錄死亡率；存活者接著觀察2星期以確保無(wú)死亡發(fā)生。
從進(jìn)行CLP的第二天開(kāi)始，用100μg特異的抗-HMGB1單克隆抗體(例如，6E6 HMGB1 mAb(Mab(6E6))；2E11 HMGB1mAb(Mab(2E11))；9G2 HMGB1 mAb(Mab(9G2))；和對(duì)照IgG抗體每1天或2天對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)注射，共5次。圖16的數(shù)據(jù)顯示，不同劑量(1μg/小鼠，10μg/小鼠，100μg/小鼠)6E6HMGB1 mAb或?qū)φ誌gG抗體進(jìn)行了腹腔內(nèi)注射。
HMGB1 ELISA用不同的HMGB1單克隆抗體進(jìn)行兩種ELISA方法。
用單克隆(捕獲)+多克隆(測(cè)定)抗體對(duì)進(jìn)行HMGB1 ELISA在第一種方法中，ELISA板包被了許多純化的抗-HMGB1mAbs(例如，2E11 HMGB1 mAb，2G5 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1mAb，6E6 HMGB1 mAb)，4℃孵育過(guò)夜。板子用含1％BSA的PBS置37℃封閉1小時(shí)。沖洗后，加入指示濃度的重組鼠HMGB1，板子置37℃1小時(shí)。板子沖洗后與2μg/ml兔抗HMGB1多克隆抗體孵育(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,303,321，6,448,223和6,468,533)。室溫1小時(shí)后，板子沖洗后與用PBS 1∶1000稀釋的羊抗-兔Ig-HPR(Jackson ImmunoResearch Laboratories，WestGrove，PA)孵育30分鐘。沖洗后，板子用TMB顯色(Invitrogen，San Diego，CA)并用讀板機(jī)在655nm處測(cè)定吸收值。
用單克隆抗體對(duì)進(jìn)行HMGB1 ELISA(用6E6 HMGB1 mAb測(cè)定)ELISA板經(jīng)覆蓋和封閉，按上述隨后加入重組鼠HMGB1。洗去非結(jié)合的HMGB1多肽后，加入2μg/ml生物素標(biāo)記的6E6HMGB1 mAb并在室溫下孵育1小時(shí)。鏈霉素親和素-HRP被用于測(cè)定結(jié)合的6E6 HMGB1 mAb，板子按上述方法用TMB顯色。
例如2鑒定和描述抗-HMGB1單克隆抗體用重組全長(zhǎng)大鼠HMGB1(SEQ ID NO4；圖3A和3B)或人HMGB1 B-匣多肽(SEQ ID NO3；圖2B)免疫，已經(jīng)分離和純化出許多新的抗-HMGB1單克隆抗體。圖7顯示了描述這些抗體特征的表格(克隆名稱(chēng)，免疫原，同型，純化抗體結(jié)合區(qū)域，體內(nèi)CLP試驗(yàn)結(jié)果)。
例3測(cè)定抗-HMGB1單克隆抗體的選擇性測(cè)定HMGB1單克隆抗體選擇性的試驗(yàn)(例如，ELISA，Western blot試驗(yàn))顯示了特異的抗-HMGB1單克隆抗體可以結(jié)合HMGB1 A匣區(qū)域，HMGB1 B匣區(qū)域和/或完整的HMGB1蛋白。例如，圖7顯示，經(jīng)鑒定抗-HMGB1單克隆抗體可以結(jié)合HMGB1 A匣(例如，6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，10D4HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，2G5HMGB1 mAb，4H11 HMGB1 mAb，7H3 HMGB1 mAb，9H3HMGB1 mAb)。其他單克隆抗體經(jīng)鑒定可以結(jié)合HMGB1 B匣(例如，2E11 HMGB1 mAb，3G8 HMGB1 mAb，3-5A6 HMGB1 mAb，9G1 HMGB1 mAb，4C9 HMGB1 mAb，1C3 HMGB1 mAb，5C12HMGB1 mAb，3E10 HMGB1 mAb，7G8 HMGB1 mAb，4A10HMGB1 mAb)。
例4測(cè)定抗-HMGB1單克隆抗體的核酸和氨基酸序列對(duì)于特異的HMGB1單克隆抗體(6E6 HMGB1 mAb，2E11HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb)，也可以得到VH區(qū)域和VK區(qū)域包括CDRs的核酸和氨基酸序列(圖。4A-4D，5A-5D，6A-6D，19A-19D)。
例5利用抗-HMGB1單克隆抗體抑制TNF的釋放特異的HMGB1單克隆抗體抑制TNF的釋放的能力被測(cè)試。圖8和9顯示了此項(xiàng)研究的結(jié)果，柱狀圖顯示了分別運(yùn)用HMGB1，HMGB1加上特異HMGB1單克隆抗體，或?qū)φ誌gG抗體對(duì)RAW 264.7細(xì)胞作用后TNF釋放的情況。圖8顯示了6E6HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb，9G2 HMGB1 mAb，和對(duì)照IgG抗體引發(fā)的對(duì)HMGB1-介導(dǎo)的TNF釋放的抑制結(jié)果。圖9顯示了3G8 HMGB1 mAb，1A9 HMGB1mAb，9G2 HMGB1 mAb，6E6 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，和對(duì)照IgG抗體等引發(fā)的對(duì)HMGB1-介導(dǎo)的TNF釋放的抑制結(jié)果。如圖8和9所示，特異的HMGB1單克隆抗體(例如，6E6 HMGB1 mAb，10D4HMGB1 mAb)抑制TNF釋放，顯示這些抗體可以用于調(diào)節(jié)一種或多種HMGB的功能(例如，如此所述)。例如，這些阻抑抗體可以用于綜合HMGB1的生物學(xué)活性(例如，HMGB1-介導(dǎo)的細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)效應(yīng))。
例6用抗-HMGB1單克隆抗體對(duì)膿血癥小鼠進(jìn)行治療增加小鼠的存活率一種由外科手術(shù)-創(chuàng)造的盲腸支囊膿血癥特定模型，并導(dǎo)致多微生物腹膜炎和膿血癥(Fink and Heard，supra；Wichmann et al.，Supra；and Remick et al.，supra)的盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)實(shí)施于小鼠后，以特異抗-HMGB1單克隆抗體(6E6 HMGB1 mAb，2E11mAb或9G2 HMGB1)或?qū)φ誌gG抗體(以100μl抗體每天兩次)進(jìn)行治療。存活率被監(jiān)視7天。圖10顯示了此研究的結(jié)果，柱狀圖表示膿血癥小鼠在經(jīng)對(duì)照抗體或特異抗-HMGB1單克隆抗體治療后的存活率。結(jié)果顯示在盲腸穿孔后24小時(shí)后，與對(duì)照IgG抗體治療相比，抗-HMGB1單克隆抗體進(jìn)行治療可減少動(dòng)物的死亡率。對(duì)于6E6 HMGB1 mAb，第7天的存活率仍非常顯著(與對(duì)照相比p＜0.03，F(xiàn)isher的準(zhǔn)確試驗(yàn))。
6E6 HMGB1 mAb對(duì)膿血癥小鼠進(jìn)行治療的劑量效應(yīng)曲線(xiàn)也被實(shí)踐。圖16顯示，1，10和100μg劑量的6E6 HMGB1 mAb作用于小鼠。結(jié)果顯示經(jīng)10μg劑量的6E6 HMGB1 mAb治療的膿血癥小鼠具有最大的存活率。
例7抗-HGB1單克隆抗體的選擇性如上所述，特異抗-HMGB1單克隆抗體可以進(jìn)行western blot分析。圖11顯示了含有CHO或CHO HMGB2或者重組HMGB1-His6(標(biāo)記CHO HMGB2，rec-HMGB1-His6)的樣本的western blot，這些樣本用抗-His標(biāo)記抗體，抗-HMGB1抗體，抗-HMGB1/1單克隆抗體，或特異抗-HMGB1單克隆抗體(例如，2E11 HMGB1 mAb，1G3 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7HMGB1 mAb，2G5 HMGB1 mAb，6E6 HMGB1 mAb)作為探針。試驗(yàn)結(jié)果顯示2G7 HMGB1 mAb可結(jié)合HMGB1但不與HMGB2結(jié)合，而2E11 HMGB1 mAb，1G3 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1mAb可檢測(cè)HMGB2及HMGB1。
例8HMGB1多肽結(jié)合試驗(yàn)對(duì)應(yīng)于人HGMB1特異18個(gè)氨基酸區(qū)域的生物素標(biāo)記多肽及更長(zhǎng)的對(duì)應(yīng)于人HGMB1 9-85位氨基酸殘基的多肽被制備并通過(guò)ELISA試驗(yàn)分析其特異抗-HMGB1單克隆抗體的結(jié)合。圖13A顯示了這些多肽和其對(duì)應(yīng)序列。
圖13B顯示了這些多肽結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果。如圖13B顯示，2E11HMGB1 mAb結(jié)合對(duì)應(yīng)于人HMGB1 151-168氨基酸殘基的多肽(例如，氨基酸殘基151-168 SEQ ID NO1)。6E6 HMGB1 mAb和6H9 HMGB1 mAb結(jié)合對(duì)應(yīng)于人HMGB1 61-78氨基酸殘基的多肽(例如，氨基酸殘基61-78 SEQ ID NO1)。2G7 HMGB1 mAb結(jié)合對(duì)應(yīng)于人HMGB1 46-63氨基酸殘基的多肽(例如，氨基酸殘基46-63 SEQ ID NO1)。此外，2G7 HMGB1 mAb和6E6HMGB1 mAb也可以結(jié)合更長(zhǎng)的對(duì)應(yīng)于人HGMB1 9-85位氨基酸殘基的多肽。這些試驗(yàn)顯示特異的抗-HMGB1單克隆抗體識(shí)別HMGB1多肽上的不同表位。例如，6E6 HMGB1 mAb，其了結(jié)合包含于HMGB1 61-78位氨基酸的表位并顯示了對(duì)HMGB1-介導(dǎo)的TNF釋放抑制。HMGB1特定區(qū)域中阻抑表位的發(fā)現(xiàn)可以用于額外的阻抑藥劑的篩選(例如，抑制HMGB1功能(例如，HMGB1-介導(dǎo)的細(xì)胞級(jí)聯(lián)活性)的藥劑)。
例9HMGB1 ELISA如圖S14和15顯示，兩種不同的ELISA方法被用于測(cè)試特異抗-HMGB1單克隆抗體的特性。在某一方法中，HMGB1單克隆抗體2E11 HMGB1 mAb，2G5 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，6E6 HMGB1 mAb作為捕獲抗體使用，而HMGB1多克隆抗體作為檢測(cè)抗體使用。在另一種ELISA方法中，，HMGB1單克隆抗體2E11 HMGB1 mAb，2G5 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，6E6HMGB1 mAb作為捕獲抗體使用，而6E6 HMGB1 mAb作為檢測(cè)抗體使用。兩種ELISA方法的結(jié)果都顯示單克隆HMGB1抗體可以檢測(cè)HMGB1并適用于這里所述的診斷和/或預(yù)兆方法。
例102G7 HMGB1 mAb與HMGB1的結(jié)合被對(duì)應(yīng)于HMGB146-63位氨基酸殘基的多肽抑制用2G7 HMGB1 mAb進(jìn)行HMGB1多肽結(jié)合試驗(yàn)。如述，對(duì)應(yīng)于人HMGB1 46-63位氨基酸殘基或人HMGB1 61-78位氨基酸殘基的生物素標(biāo)記合成多肽被制備并用ELISA分析其與2G7HMGB1 mAb(2G7)的結(jié)合情況。簡(jiǎn)要地，2μg/m2G7 HMGB1mAb 1的被加入到含有指示濃度(0，0.33，1，3，9，27，81，243μM多肽)的HMGB1 46-63多肽或HMGB1 61-78多肽的孔中，置于25℃1小時(shí)以制備抗體-多肽樣本。ELISA板子用10μg/ml重組鼠HMGB1包被，4℃孵育過(guò)夜。板子用再造奶粉封閉，置37℃1小時(shí)。加入以上所列濃度的抗體-多肽樣本并于室溫孵育1小時(shí)。板子經(jīng)洗滌并用辣根過(guò)氧化物酶-HRP孵育。洗滌后，板子用TMB顯色(Invitrogen，San Siego，CA)并用讀板儀在655nm出測(cè)量吸收值。
圖20顯示最大信號(hào)百分比的結(jié)果(y-軸)。如圖20顯示，任何濃度的HMGB1 46-63多肽抑制了2G7 HMGB1 mAb同HMGB1的結(jié)合(以最大信號(hào)減少量百分比顯示)。相反，HMGB161-78多肽不抑制2G7 HMGB1 mAb同HMGB1的結(jié)合。這些試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證2G7 HMGB1 mAb與位于HMGB1 46-63位氨基酸的表位相結(jié)合。
例11與HMGB1的結(jié)合被高濃度的對(duì)應(yīng)于HMGB1 151-168位氨基酸殘基的多肽抑制如本文所述，用2E11 HMGB1 mAb和對(duì)應(yīng)于人HMGB146-63位氨基酸殘基(SEQ ID NO23)或人HMGB1 151-168位氨基酸殘基(SEQ ID NO30)的生物素標(biāo)記的合成多肽進(jìn)行HMGB1多肽結(jié)合試驗(yàn)。圖21顯示了這些試驗(yàn)的結(jié)果(最大信號(hào)百分比的結(jié)果(y-軸))。圖21顯示，9或更高濃度的HMGB1 151-168多肽顯著地抑制2E11 HMGB1 mAb同HMGB1的結(jié)合。3μM或更低濃度的HMGB1 151-168多肽不能顯著地抑制2E11 HMGB1mAb同HMGB1的結(jié)合(圖21)。此外，HMGB1 46-63多肽不能抑制2E11 HMGB1 mAb同HMGB1的結(jié)合。這些試驗(yàn)驗(yàn)證2E11HMGB1 mAb與位于HMGB1 151-168位氨基酸的表位相結(jié)合。
例122G7 HMGB1 mAb識(shí)別位于HMGB1 53-63位氨基酸的表位不同的合成多肽被制備。這些合成多肽包括對(duì)應(yīng)于人HMGB1 46-63位氨基酸殘基的生物素標(biāo)記多肽(SEQ ID NO23；標(biāo)記為“huHMGB1-46-63-B”或“Human HMGB1-46-63-B”)，對(duì)應(yīng)于人HMGB2 46-63位氨基酸殘基的生物素標(biāo)記多肽(SEQ IDNO48；標(biāo)記為“huHMGB2-46-63-B”或“HumanHMGB2-46-63-B”)，對(duì)應(yīng)于人HMGB1 53-70位氨基酸殘基的非-生物素標(biāo)記多肽(SEQ ID NO47；標(biāo)記為“huHMGB1-53-70”或“Human HMGB1-53-70”)，對(duì)應(yīng)于人HMGB1 61-78位氨基酸殘基的生物素標(biāo)記多肽(SEQ ID NO24；標(biāo)記為“huHMGB1-61-78-B”)，對(duì)應(yīng)于人HMGB1 40-57位氨基酸殘基的非-生物素標(biāo)記多肽(SEQ ID NO46；標(biāo)記為“HumanHMGB1-40-57”)及由混雜的氨基酸序列組成的生物素標(biāo)記多肽，其中的混雜的氨基酸殘基屬于人HMGB1 46-63位氨基酸殘基(SEQ ID NO45；標(biāo)記為“Human HMGB-46-63-scr”)。如此所述，運(yùn)用ELISA，通過(guò)分析2G7 HMGB1 mAb與這些交迭多肽的結(jié)合情況進(jìn)一步特定地確定HMGB1中結(jié)合2G7 HMGB1 mAb的表位。圖23顯示了這些多肽和其對(duì)應(yīng)序列。
圖22和23顯示了多肽結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果。如圖22和23顯示，2G7 HMGB1 mAb結(jié)合HMGB1 46-63多肽(例如，SEQ ID NO1或SEQ ID NO23中的46-63位氨基酸殘基)但不結(jié)合人HMGB2對(duì)應(yīng)區(qū)域(例如，HMGB2 46-63多肽，SEQ ID NO54或SEQ IDNO48中46-63位氨基酸殘基)。此外，2G7 HMGB1 mAb結(jié)合HMGB1 53-70多肽但不結(jié)合HMGB1 40-57多肽。2G7 HMGB1mAb也不結(jié)合由HMGB1 46-63位氨基酸殘基混雜序列組成的多肽。除了顯示2G7 HMGB1 mAb與不同合成多肽的結(jié)合情況，圖22還顯示了抗生物素蛋白與這些合成多肽的結(jié)合情況。
在例8中，具顯示2G7 HMGB1 mAb結(jié)合包含HMGB1 46-63氨基酸殘基的表位。已知2G7 HMGB1 mAb結(jié)合HMGB1 46-63為多肽和HMGB1 53-70位多肽，這些試驗(yàn)顯示識(shí)別位于由HMGB1 53-63氨基酸殘基構(gòu)成的氨基酸區(qū)域的表位。這些試驗(yàn)進(jìn)一步表明2G7 HMGB1 mAb不結(jié)合HMGB2 46-63多肽，盡管在HMGB1 46-63多肽和HMGB2 46-63多肽間僅有一個(gè)氨基酸的差別。同樣地，HMGB1的第58位甘氨酸殘基((Gly-58)，其對(duì)應(yīng)于HMGB2中的絲氨酸殘基，在2G7 HMGB1 mAb識(shí)別的HMGB1表位中是一個(gè)重要的氨基酸殘基(圖23)。
例136E6 HMGB1 mAb識(shí)別位于HMGB1 67-78位氨基酸的表位不同的合成多肽被制備。這些合成多肽包括對(duì)應(yīng)于人HMGB1 53-70位氨基酸殘基的非-生物素標(biāo)記多肽(SEQ IDNO47；標(biāo)記為“Human HMGB1-53-70-B”；如上述)，對(duì)應(yīng)于人HMGB1 67-84位氨基酸殘基的非-生物素標(biāo)記多肽(SEQ IDNO50；標(biāo)記為“Human HMGB1-67-84”；如上述)，對(duì)應(yīng)于人HMGB1 61-78位氨基酸殘基的生物素標(biāo)記多肽(SEQ ID NO24；標(biāo)記為“Human HMGB1-61-78-B”；如上述)及由混雜的氨基酸序列組成的非-生物素標(biāo)記多肽，其中的混雜的氨基酸殘基屬于人HMGB1 61-78位氨基酸殘基(SEQ ID NO49；標(biāo)記為“HumanHMGB-61-78_ser”)。如此所述，運(yùn)用ELISA，通過(guò)分析6E6HMGB1 mAb與這些交迭多肽的結(jié)合情況進(jìn)一步特定地確定HMGB1中結(jié)合6E6 HMGB1 mAb的表位。這些多肽和其對(duì)應(yīng)序列及結(jié)合6E6 HMGB1 mAb的多肽多肽顯示在圖24中。
圖24顯示了多肽結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果。如圖24顯示，6E6 HMGB1mAb結(jié)合HMGB1 61-78多肽(SEQ ID NO24)。此外，6E6HMGB1 mAb結(jié)合HMGB1 67-84多肽(SEQ ID NO50)但不結(jié)合HMGB1 53-70多肽(SEQ ID NO47)。6E6 HMGB1 mAb也不結(jié)合由HMGB1 61-78位氨基酸殘基混雜序列組成的多肽(SEQID NO49)(圖24)。在例8中，顯示6E6 HMGB1 mAb結(jié)合包含HMGB1 61-78位氨基酸殘基的表位。根據(jù)6E6 HMGB1 mAb結(jié)合HMGB1 61-78位多肽和HMGB1 67-84為多肽，這些試驗(yàn)顯示6E6 HMGB1 mAb識(shí)別存在于HMGB1 67-78為氨基酸殘基構(gòu)成的氨基酸區(qū)域的表位。
例142E11 HMGB1 mAb的HMGB1多肽結(jié)合試驗(yàn)不同的合成多肽被制備。這些合成多肽包括對(duì)應(yīng)于人HMGB1 151-168位氨基酸殘基的生物素標(biāo)記多肽(SEQ IDNO30；標(biāo)記為“Human HMGB1-151-168-B”)，對(duì)應(yīng)于人HMGB1143-160位氨基酸殘基的非-生物素標(biāo)記多肽(SEQ ID NO52；標(biāo)記為“Human HMGB1-143-160”)，對(duì)應(yīng)于人HMGB1 157-174位氨基酸殘基的生物素標(biāo)記多肽(SEQ ID NO53；標(biāo)記為“HumanHMGB1-157-174”)及由混雜的氨基酸序列組成的非-生物素標(biāo)記多肽，其中的混雜的氨基酸殘基屬于人HMGB1 151-168位氨基酸殘基(SEQ ID NO51；標(biāo)記為“Human HMGB-151-168 ser”)。如此所述，運(yùn)用ELISA，通過(guò)分析2E11 HMGB1 mAb與這些交迭多肽的結(jié)合情況進(jìn)一步特定地確定HMGB1中結(jié)合2E11HMGB1 mAb的表位。這些多肽和其對(duì)應(yīng)序列及結(jié)2E11 HMGB1mAb的多肽顯示在圖25中。
如圖25顯示，2E11 HMGB1 mAb結(jié)合HMGB1 151-168多肽(SEQ ID NO30)，但不結(jié)合HMGB1 143-160多肽(SEQ IDNO52)或HMGB1 157-174多肽(SEQ ID NO53)。在本領(lǐng)域中所熟知，存在兩種類(lèi)型的表位或抗原決定簇線(xiàn)性的，連續(xù)的或持續(xù)的及非-線(xiàn)性的，構(gòu)象的或非連續(xù)的表位。典型的抗體表位常常由6個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，但也可能為不同大小。這些試驗(yàn)顯示2E11 HMGB1 mAb識(shí)別的表位可能包含HMGB1的156-161位氨基酸殘基。然而，2E11 HMGB1 mAb也可識(shí)別包括此區(qū)域側(cè)翼氨基酸的表位，例如，HMGB1 155-161，155-162，156-162和/或156-163位氨基酸殘基。
圖26顯示多肽結(jié)合結(jié)果概要顯示了圖示的HMGB1表位，其可被不同HMGB1 mAbs(例如，2G7 HMGB1 mAb，6E6 HMGB1mAb，2G5 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb)識(shí)別。
例156E6 HMGB1 mAb的質(zhì)譜分析6E6 HMGB1 mAb的質(zhì)量通過(guò)質(zhì)譜分析測(cè)定。6E6 HMGB1mAb被送至Novatia，LLC(Princeton，NJ)進(jìn)行LC/MS分析。簡(jiǎn)要地，抗體，無(wú)論是原始的或經(jīng)DTT處理(分離重鏈和輕鏈)，用RLRP-s 4000A反相HPLC柱(HPLC/ESI-MS系統(tǒng))和質(zhì)譜分析(Rinnigan TSQ7000質(zhì)譜分析)進(jìn)行分析。蛋白的質(zhì)量精確性通常為±0.01％，此精確性可通過(guò)測(cè)定6E6輕鏈質(zhì)量進(jìn)行(例如，2Da/23917 Da*100％＝0.008％)。
圖27A-27D顯示了這項(xiàng)分析的結(jié)果，其顯示了質(zhì)譜圖。6E6HMGB1 mAb的總質(zhì)量為146.5kDa(土27A；顯示原始6E6HMGB1 mAb的質(zhì)譜)。6E6 HMGB1 mAb輕鏈和重鏈的質(zhì)量經(jīng)測(cè)定分別為23.9kDa(土27B和27C)及4934kDa(圖27B和27D)。根據(jù)氨基酸分子量計(jì)算的輕鏈和重鏈的質(zhì)量預(yù)測(cè)值，分別為23.9kDa和47.9kDa。
例16單劑量2G7 HMGB1 mAb治療增加了膿血癥小鼠的存活率如上述進(jìn)行小鼠的盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)(CLP)。在一項(xiàng)試驗(yàn)中，手術(shù)后24小時(shí)，小鼠按0.004mg/kg，0.04mg/kg，0.4mg/kg的2G7 HMGB1 mAb每天進(jìn)行腹腔內(nèi)注射治療。在第二中試驗(yàn)中，手術(shù)后24小時(shí)，小鼠按0.04mg/kg的2G7 HMGB1 mAb或0.4mg/kg對(duì)照IgG(IgG對(duì)照)每天進(jìn)行腹腔內(nèi)注射治療。兩組試驗(yàn)小鼠的存活率均監(jiān)視14天。兩組試驗(yàn)的合并和結(jié)果顯示在圖28中。以0.4mg/kg的2G7 HMGB1 mAb治療的小鼠在CLP14天后的存活率約為85％，而相對(duì)以IgG對(duì)照治療的小鼠其在CLP14天后的存活率約為40％(圖28)。此外，圖28顯示，分別以0.04mg/kg和0.004mg/kg 2G7 HMGB1 mAb治療其CLP14天后的存活率分別約為60％和50％。
圖29是用不同劑量(4mg/kg，0.4mg/kg，0.04mg/kg，0.004mg/kg)，或?qū)φ誌gG治療小鼠，其CLP存活百分率的比較圖表。如圖29所示，小鼠一日內(nèi)進(jìn)行四次腹腔內(nèi)注射。結(jié)果顯示以0.4mg/kg6E6 HMGB1 mAb或2G7 HMGB1 mAb治療，CLP14天后膿血癥小鼠的存活率大于80％，相比較，以對(duì)照IgG治療的小鼠CLP14天后膿血癥小鼠的存活率僅為40％。
例17抗-HMGB1單克隆抗體已知TNF的釋放如例5，特異HMGB1單克隆抗體抑制TNF釋放的能力被測(cè)試。圖32和33顯示了此研究的結(jié)果，柱狀圖標(biāo)示RAW 24607細(xì)胞經(jīng)HMGB1(黑柱)，或HMGB1加上特異HMGB1單克隆抗體處理后TNF的釋放情況。圖32顯示了1A9 HMGB1 mAb(1A9)；2E11 HMGB1 mAb(2E11)；2G5 HMGB1 mAb(2G5)；2G7HMGB1 mAb(2G7)；3G8 HMGB1 mAb(3G8)；4H11 HMGB1mAb(4H11)；5A6 HMGB1 mAb(5A6)；6E6 HMGB1 mAb(6E6)；9G2 HMGB1 mAb(9G2)；4C9 HMGB1 mAb(4C9)和6H9 HMGB1mAb(6H9)對(duì)HMGB1-介導(dǎo)的TNF釋放的抑制結(jié)果。圖33顯示了7H3 HMGB1 mAb(7H3)；9H3 HMGB1 mAb(9H3)；10D4HMGB1 mAb(10D4)；1C3 HMGB1 mAb(1C3)；3E10 HMGB1mAb(3E10)；4A10 HMGB1 mAb(4A10)；5C12 HMGB1mAb(5C12)；HMGB1 mAb(7G8)對(duì)HMGB1-介導(dǎo)的TNF釋放的抑制結(jié)果。
如圖32和33所示，以及例5中所示的結(jié)果，特異HMGB1單克隆抗體(例如2E11 HMGB1 mAb，4H11 HMGB1 mAb，6H9HMGB1 mAb和10D4 HMGB1 mAb)抑制TNF的釋放，表明這些抗體可以用于調(diào)節(jié)HMGB1的一種或多種功能(例如，如此所述)。例如，這些阻抑抗體可以中和HMGB1的生物學(xué)活性(例如，HMGB1-介導(dǎo)的細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)活性)。
雖然本發(fā)明已經(jīng)參考最佳實(shí)施方案被具體地顯示和描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該可以理解的是，在不超出權(quán)利要求書(shū)的發(fā)明范圍的條件下，可以進(jìn)行形式和細(xì)節(jié)方面的不同的變化。
序列表<110>鑒定醫(yī)療有限公司沃特·紐曼秦世欣特麗薩·奧基夫羅伯特·奧巴<120>拮抗HMGB1的單克隆抗體130>3258.1033-003<140>PCT/US2004/029527<141>2004-09-10<150>60/502,568<151>2003-09-11<160>76<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>216<212>PRT<213>智人<400>1Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Thr Gly Lys Met Ser Ser Tyr1 5 10 15Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro20 25 30Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg35 40 45Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala50 55 60Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro65 70 75 80Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys85 90 95
Arg Leu Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys100 105 110Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys115 120 125Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr130 135 140Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala145 150 155 160Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val165 170 175Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu180 185 190Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Asp195 200 205Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu210 215<210>2<211>85<212>PRT<213>智人<400>2Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Thr Gly Lys Met Ser Ser Tyr1 5 10 15Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro20 25 30Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg35 40 45Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala50 55 60Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro65 70 75 80Pro Lys Gly Glu Thr85<210>3<211>74<212>PRT<213>智人
<400>3Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Leu Pro Ser Ala Phe Phe Leu1 5 10 15Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu20 25 30Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr35 40 45Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys50 55 60Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr65 70<210>4<211>755<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>69<223>n＝A，T，C or G<223>CBP-Rat HMGB1<400>4atgaagcgac gatggaaaaa gaatttcata gccgtctcag cagccaaccg ctttaagaaa 60atctcatcnt ccggggcact tctggttccg cgtggatcca tcgagggaag gatgggcaaa 120ggagatccta agaagccgag aggcaaaatg tcctcatatg cattctttgt gcaaacctgc 180cgggaggagc acaagaagaa gcacccggat gcttctgtca acttctcaga gttctccaag 240aagtgctcag agaggtggaa gaccatgtct gctaaagaaa aggggaaatt tgaagatatg 300gcaaaggctg acaaggctcg ttatgaaaga gaaatgaaaa cctacatccc ccccaaaggg 360gagaccaaaa agaagttcaa ggaccccaat gcccccaaga ggcctccttc ggccttcttc 420ttgttctgtt ctgagtaccg cccaaaaatc aaaggcgagc atcctggctt atccattggt 480gatgttgcga agaaactagg agagatgtgg aacaacactg ctgcggatga caagcagccc 540tatgaaaaga aggccgccaa gctgaaggag aagtatgaga aggatattgc tgcctacaga 600gctaaaggaa aacctgatgc agcgaaaaag ggggtggtca aggctgagaa gagcaagaaa 660aagaaggaag aggaagacga cgaggaggat gaagaggatg aggaagagga ggaagaagag 720gaagatgaag atgaagaaga agatgatgat gatga 755
<210>5<211>252<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CBP-Rat HMGB1<400>5Met Lys Arg Arg Trp Lys Lys Asn Phe Ile Ala Val Ser Ala Ala Asn1 5 10 15Arg Phe Lys Lys Ile Ser Ser Ser Gly Ala Leu Leu Val Pro Arg Gly20 25 30Ser Ile Glu Gly Arg Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly35 40 45Lys Met Ser Ser Tyr Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His50 55 60Lys Lys Lys His Pro Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys65 70 75 80Lys Cys Ser Glu Arg Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys85 90 95Phe Glu Asp Met Ala Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met100 105 110Lys Thr Tyr Ile Pro Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp115 120 125Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser130 135 140Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly145 150 155 160Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp165 170 175Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr180 185 190Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala195 200 205Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu210 215 220Glu Asp Asp Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu225 230 235 240Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu245 250
<210>6<211>336<212>DNA<213>Mouse<400>6gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgcactgggt gaagcagagg 120cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggtaa tactaaatat 180gacccgaagt tccagggcaa ggccactata acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc taggggcgct 300tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgca336<210>7<211>112<212>PRT<213>Mouse<400>7Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr20 25 30Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala100 105 110<210>8<211>333<212>DNA<213>Mouse
<400>8gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct 180gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccattc 300acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaa 333<210>9<211>111<212>PRT<213>Mouse<400>9Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp20 25 30Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His65 70 75 80Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn85 90 95Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110<210>10<211>345<212>DNA<213>Mouse<400>10caggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaggc ctgggacttc agtgaagata 60tcctgcaaga cttctggcta taccttcctc acctactgga tgaactgggt gaagcagagg 120cctggacagg gccttgagtg gattggacag atttttcctg caagtgataa tacttactac 180aatgagatgt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240attcatctca gcagcctgac atctgaggac actgctgtct atttctgtgc aagagaggac 300tctatggact actggggtca gggaacctca gtcaccgtca gctca 345
<210>11<211>115<212>PRT<213>Mouse<400>11Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Leu Thr Tyr20 25 30Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gln Ile Phe Pro Ala Ser Asp Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Met Phe50 55 60Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Ile His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Glu Asp Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr100 105 110Val Ser Ser115<210>12<211>321<212>DNA<213>Mouse<400>12gatattcaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60gtcagttgca gtgcaagtcg gggcattaac aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120gatggaactg ttaaattcct gatctattac acatcaagtt tacactcagg agtcccatca 180aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctca ccatcagcaa cctggaacct 240gaagatattg ccacttacta ttgtcagcag tatagtaagc ttccttggac gttcggtgga 300ggcaccaagc tggaattcaa a321<210>13<211>107<212>PRT<213>Mouse
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<400>64Pro Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Leu Val1 5 10 15Arg Gly Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Gln Phe Glu Ala Met20 25 30Ala Arg Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile35 40 45Pro Pro Lys Gly Glu Thr50<210>65<211>54<212>PRT<213>智人<400>65Leu Asp Ala Ser Val Ser Phe Ser Glu Phe Ser Asn Lys Cys Ser Glu1 5 10 15Arg Trp Lys Thr Met Ser Val Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met20 25 30Ala Lys Ala Asp Lys Ala Cys Tyr Glu Arg Glu Met Lys Ile Tyr Pro35 40 45Tyr Leu Lys Gly Arg Gln50<210>66<211>84<212>PRT<213>智人<400>66Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr Ala1 5 10 15Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro Asp20 25 30Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg Trp35 40 45Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala Lys50 55 60
Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro Pro65 70 75 80Lys Gly Glu Thr<210>67<211>74<212>PRT<213>智人<400>67Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu1 5 10 15Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu20 25 30Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr35 40 45Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys50 55 60Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr65 70<210>68<211>74<212>PRT<213>智人<400>68Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu1 5 10 15Phe Cys Ser Glu His Arg Pro Lys Ile Lys Ser Glu His Pro Gly Leu20 25 30Ser Ile Gly Asp Thr Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Ser Glu Gln35 40 45Ser Ala Lys Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Gln Lys Ala Ala Lys Leu Lys50 55 60Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr65 70
<210>69<211>74<212>PRT<213>智人<400>69Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Leu Pro Ser Ala Phe Phe Leu1 5 10 15Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu20 25 30Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr35 40 45Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys50 55 60Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr65 70<210>70<211>74<212>PRT<213>智人<400>70Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu1 5 10 15Phe Cys Ser Glu Tyr His Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu20 25 30Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr35 40 45Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Gly Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys50 55 60Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr65 70<210>71<211>74<212>PRT<213>智人
<400>71Phe Lys Asp Ser Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Leu Leu1 5 10 15Phe Cys Ser Glu Tyr Cys Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu20 25 30Pro Ile Ser Asp Val Ala Lys Lys Leu Val Glu Met Trp Asn Asn Thr35 40 45Phe Ala Asp Asp Lys Gln Leu Cys Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys50 55 60Glu Lys Tyr Lys Lys Asp Thr Ala Thr Tyr65 70<210>72<211>74<212>PRT<213>智人<400>72Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu1 5 10 15Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu20 25 30Ser Ile Gly Asp Val Val Lys Lys Leu Ala Gly Met Trp Asn Asn Thr35 40 45Ala Ala Ala Asp Lys Gln Phe Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys50 55 60Glu Lys Tyr Lys Lys Asp Ile Ala Ala Tyr65 70<210>73<211>92<212>PRT<213>智人<400>73Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu1 5 10 15Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu20 25 30Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr35 40 45
Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys50 55 60Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro65 70 75 80Asp Ala Ala Lys Lys Gl y Val Val Lys Ala Glu Lys85 90<210>74<211>215<212>PRT<213>智人<400>74Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr1 5 10 15Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro20 25 30Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg35 40 45Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala50 55 60Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro65 70 75 80Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys85 90 95Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys100 105 110Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys115 120 125Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr130 135 140Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala145 150 155 160Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val165 170 175Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu180 185 190Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Asp Glu195 200 205Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu210 215
<210>75<211>77<212>PRT<213>智人<400>75Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg1 5 10 15Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu20 25 30Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu35 40 45Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu50 55 60Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro Pro Lys Gly Glu Thr65 70 75<210>76<211>74<212>PRT<213>智人<400>76Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu1 5 10 15Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu20 25 30Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr35 40 45Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys50 55 60Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr65 70
權(quán)利要求
1.一種特異地結(jié)合脊椎動(dòng)物高遷移率族匣(HMGB)A匣，但并不特異地結(jié)合非-A匣HMGB表位的抗體或其抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段抑制經(jīng)高遷移率族蛋白處理的脊椎動(dòng)物細(xì)胞中促炎癥細(xì)胞因子的釋放。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述的脊椎動(dòng)物高遷移率族匣(HMGB)A匣是一種哺乳動(dòng)物HMGB A匣。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述的哺乳動(dòng)物高遷移率族匣(HMGB)A box是一種人HMGB A box。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的抗體或抗原-結(jié)合片段，這里所述的哺乳動(dòng)物高遷移率族匣(HMGB)A匣是一種HMGB1 A匣。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段是從包括Fab片段，F(xiàn)ab’片段，F(xiàn)(ab’)2片段和Fv片段的組中選擇的抗原-結(jié)合片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段是單克隆抗體或其抗原-結(jié)合片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段是從6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb和10D4 HMGB1 mAb組中選擇的。
8.根據(jù)權(quán)利要求4的抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述的結(jié)合高遷移率族匣(HMGB)A匣的抗體或抗原-結(jié)合片段能被從6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb和10D4 HMGB1 mAb組中選擇的抗體抑制。
9.根據(jù)權(quán)利要求4的抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段具有6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb和/或4 HMGB1 mAb的特定表位。
10.根據(jù)權(quán)利要求4的抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段具有6H9 HMGB1 mAb的特定表位。
11.由鼠雜交瘤6E6 HMGB1 mAb制備的抗體或抗原-結(jié)合片段，保存于ATCC，編碼號(hào)PTA-5433。
12.由鼠雜交瘤6H9 HMGB1 mAb制備的抗體或抗原-結(jié)合片段，保存于ATCC，編碼號(hào)PTA-5434。
13.由鼠雜交瘤10D4 HMGB1 mAb制備的抗體或抗原-結(jié)合片段，保存于ATCC，編碼號(hào)PTA-5435。
14.鼠雜交瘤6E6 HMGB1 mAb，保存于ATCC，編碼號(hào)PTA-5433。
15.鼠雜交瘤6H9 HMGB1 mAb，保存于ATCC，編碼號(hào)PTA-5434。
16.鼠雜交瘤10D4 HMGB1 mAb，保存于ATCC，編碼號(hào)PTA-5435。
17.根據(jù)權(quán)利要求4的抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段是從人抗體，人源抗體，嵌合抗體和任何抗原-結(jié)合片段的組中選擇的。
18.一種分離的細(xì)胞，其產(chǎn)生特異結(jié)合脊椎動(dòng)物高遷移率族匣(HMGB)A匣，但并不特異地結(jié)合非-A匣HMGB表位的抗體或其抗原-結(jié)合片段。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的分離細(xì)胞，其中所述的脊椎動(dòng)物高遷移率族匣(HMGB)A匣是一種哺乳動(dòng)物HMGB A匣。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的分離細(xì)胞，其中所述的哺乳動(dòng)物高遷移率族匣(HMGB)A匣是一種人HMGB A匣。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的分離細(xì)胞，其中所述的哺乳動(dòng)物高遷移率族匣(HMGB)A匣是一種哺乳動(dòng)物HMGB1 A匣。
22.根據(jù)權(quán)利要求18的分離細(xì)胞，其中所述的分離細(xì)胞是從包括永生B細(xì)胞，雜交瘤和包括一種或更多編碼所述抗體或其抗原-結(jié)合片段的外源核酸的重組細(xì)胞組中選擇的。
23.根據(jù)權(quán)利要求18的分離細(xì)胞，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段是單克隆抗體或其抗原-結(jié)合片段。
24.根據(jù)權(quán)利要求18的分離細(xì)胞，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段是從6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb和10D4HMGB1 mAb組中選擇的。
25.根據(jù)權(quán)利要求18的分離細(xì)胞，其產(chǎn)生抗體或其抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段與高遷移率族匣(HMGB)A匣的結(jié)合能被從6E6H MGB1 mAb，6H9 HMGB1mAb和10D4 HMGB1 mAb組中選擇的抗體抑制。
26.根據(jù)權(quán)利要求18的分離細(xì)胞，其產(chǎn)生抗體或其抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段有從6E6 HMGB1mAb，6H9 HMGB1 mAb和10D4 HMGB1 mAb組中選擇的抗體的特定表位。
27.由鼠雜交瘤2E11 HMGB 1mAb產(chǎn)生的抗體或其抗原-結(jié)合片段，保存于ATCC，編碼號(hào)PTA-5431。
28.一種抗體或其抗原-結(jié)合片段，其中所述的結(jié)合高遷移率族匣(HMGB)蛋白的抗體或抗原-結(jié)合片段能被2E11 HMGB1mAb抑印制。29.一種抗體或其抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段有2E11 HMGB1 mAb的特定表位。
30.鼠雜交瘤2E11 HMGB1 mAb，保存于ATCC，編碼號(hào)PTA-5431。
31.一種分離的細(xì)胞，其產(chǎn)生2E11 HMGB1 mAb。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的分離細(xì)胞，其中所述的分離細(xì)胞是從包括永生B細(xì)胞，雜交瘤和包括一種或更多編碼所述抗體或其抗原-結(jié)合片段的外源核酸的重組細(xì)胞組中選擇的。
33.一種分離的細(xì)胞，其產(chǎn)生抗體或其抗原-結(jié)合片段，其中所述的結(jié)合高遷移率族匣(HMGB)蛋白的抗體或抗原-結(jié)合片段能被2E11 HMGB1 mAb抑制。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的分離細(xì)胞，其中所述的分離細(xì)胞是從包括一種永生B細(xì)胞，一種雜交瘤和包括一種或更多編碼所述抗體或其抗原-結(jié)合片段的外源核酸的重組細(xì)胞組中選擇的。
35.一種分離細(xì)胞，其產(chǎn)生抗體或其抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段有2E11 HMGNB1 mAb的特定表位。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的分離細(xì)胞，其中所述的分離細(xì)胞是從包括一種永生B細(xì)胞，一種雜交瘤和包括一種或更多編碼所述抗體或其抗原-結(jié)合片段的外源核酸的重組細(xì)胞組中選擇的。
37.由鼠雜交瘤2G7 HMGB1 mAb產(chǎn)生的抗體或其抗原-結(jié)合片段，保存于ATCC，編碼號(hào)PTA-5432。
38.一種抗體或其抗原-結(jié)合片段，這里所述的結(jié)合高遷移率族匣(HMGB)蛋白的抗體或抗原-結(jié)合片段能被抑制。
39.一種抗體或其抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段有2G7 HMGB1 mAb的特定表位。
40.鼠雜交瘤2G7 HMGB1 mAb，保存于ATCC，編碼號(hào)PTA-5432。
41.一種分離細(xì)胞，其產(chǎn)生2G7 HMGB1 mAb。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的分離細(xì)胞，其中所述的分離細(xì)胞是從包括一種永生B細(xì)胞，一種雜交瘤和包括一種或更多編碼所述抗體或其抗原-結(jié)合片段的外源核酸的重組細(xì)胞組中選擇的。
43.一種分離細(xì)胞，其產(chǎn)生抗體或其抗原-結(jié)合片段，其中所述的結(jié)合高遷移率族匣(HMGB)蛋白的抗體或抗原-結(jié)合片段能被2G7 HMGB1 mAb抑制。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的分離細(xì)胞，其中所述的分離細(xì)胞是從包括一種永生B細(xì)胞，一種雜交瘤和包括一種或更多編碼所述抗體或其抗原-結(jié)合片段的外源核酸的重組細(xì)胞組中選擇的。
45.一種分離細(xì)胞，其產(chǎn)生抗體或其抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段有2G7 HMGB1 mAb的特定表位。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的分離細(xì)胞，其中所述的分離細(xì)胞是從包括一種永生B細(xì)胞，一種雜交瘤和包括一種或更多編碼所述抗體或其抗原-結(jié)合片段的外源核酸的重組細(xì)胞組中選擇的。
47.一種抗體或抗原-結(jié)合片段，其結(jié)合SEQ ID NO1的151-168氨基酸殘基。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段是一種單克隆抗體或其抗原-結(jié)合片段。
49.一種抗體或抗原-結(jié)合片段，其結(jié)合SEQ ID NO1的156-161氨基酸殘基。
50.一種抗體或抗原-結(jié)合片段，其結(jié)合的多肽從下列組中選擇SEQ ID NO1的155-161氨基酸殘基；SEQ ID NO1的155-162氨基酸殘基；SEQ ID NO1的156-162氨基酸殘基；SEQ ID NO1的156-163氨基酸殘基。
51.一種抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段結(jié)合SEQ ID NO1的151-168氨基酸殘基能被2E11HMGB1 mAb抑制。
52.一種抗體或抗原-結(jié)合片段，其結(jié)合SEQ ID NO1的61-78氨基酸殘基。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段是單克隆抗體或抗原-結(jié)合片段。
54.一種抗體或抗原-結(jié)合片段，其結(jié)合SEQ ID NO1的67-78氨基酸殘基。
55.一種抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段與SEQ ID NO1的61-78氨基酸殘基的結(jié)合能被從6E6HMGB1 mAb和6H9 HMGB1 mAb組中選擇的抗體抑制。
56.一種抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段與SEQ ID NO1的67-78氨基酸殘基結(jié)合能被6E6HMGB1 mAb抑制。
57.一種抗體或抗原-結(jié)合片段，其結(jié)合SEQ ID NO1的46-63氨基酸殘基。
58.根據(jù)權(quán)利要求57的抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體不結(jié)合SEQ ID NO54的46-63氨基酸殘基。
59.根據(jù)權(quán)利要求57的抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段是單克隆抗體或抗原-結(jié)合片段。
60.一種抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段與SEQ ID NO1的46-63氨基酸殘基的結(jié)合能被2G7HMGB1 mAb抑制。
61.一種抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或片段包括從6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1mAb，10D4 HMGB1 mAb和2G7 HMGB1 mAb組中選擇的抗體的輕鏈CDRs(CDR1，CDR2，CDR3)和重鏈CDRs(CDR1，CDR2，CDR3)。
62.根據(jù)權(quán)利要求61的抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段進(jìn)一步包括一種人框架區(qū)。
63.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段是從包括Fab片段，F(xiàn)ab’片段，F(xiàn)(ab’)2片段和Fv片段組中選擇的抗原-結(jié)合片段。
64.一種組合物，其包括權(quán)利要求1的抗體或抗原-結(jié)合片段和制藥學(xué)上可接受的賦形劑。
65.一種組合物，其包括抗體或其抗原-結(jié)合片段和制藥學(xué)上可接受的賦形劑，其中所述的抗體或其抗原-結(jié)合片段是從6E6HMGB 1mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1 mAb，10D4HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb和任何抗原-結(jié)合片段的組中選擇的。
66.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段是從人抗體，人源抗體，嵌合抗體和任何抗原-結(jié)合片段的組中選擇的。
67.一種抗體或其抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或其抗原-結(jié)合片段是從下列組中選擇的a)6E6 HMGB1 mAb；b)6H9 HMGB1 mAb；c)2G7 HMGB1 mAb；d)10D4 HMGB1 mAb；e)2E11 HMGB1 mAb；f)有6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb的表位特異性的抗體；g)能與6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb競(jìng)爭(zhēng)與脊椎動(dòng)物高遷移率族匣(HMGB)多肽結(jié)合的抗體；h)一種a)，b)，c)，d)，e)，f)，或g)的抗原-結(jié)合片段。
68.根據(jù)權(quán)利要求67的抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段是從包括人抗體，人源抗體，嵌合抗體和任何抗原-結(jié)合片段的組中選擇的。
69.一種檢測(cè)和/或鑒定結(jié)合脊椎動(dòng)物高遷移率族匣(HMGB)多肽試劑的方法，該方法包括，結(jié)合i)能結(jié)合HMGB的抗體或抗原-結(jié)合片段；ii)測(cè)試試劑；和iii)包括脊椎動(dòng)物HMGB多肽的組合物；和檢測(cè)或測(cè)定在所述的抗體或抗原-結(jié)合片段和所述的HMGB多肽之間的組合物構(gòu)成，其中相對(duì)于合適對(duì)照的所述組合物構(gòu)成的減少，表示所述的試劑結(jié)合所述的HMGB多肽，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段是從下列組中選擇的a)6E6 HMGB1 mAb；b)6H9 HMGB1 mAb；c)2G7 HMGB1 mAb；d)10D4 HMGB1 mAb；e)2E11 HMGB1 mAb；f)有6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb的表位特異性的抗體；g)能與6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb競(jìng)爭(zhēng)同脊椎動(dòng)物高遷移率族匣(HMGB)多肽相結(jié)合的抗體；h)一種a)，b)，c)，d)，e)，f)或g)的抗原-結(jié)合片段。
70.一種治療病人情況的方法，該情況以炎癥因子的級(jí)聯(lián)活性為特征，包括給予病人抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段是從下列組中選擇的a)6E6 HMGB1 mAb；b)6H9 HMGB1 mAb；c)2G7 HMGB1 mAb；d)10D4 HMGB1 mAb；e)2E11 HMGB1 mAb；f)有6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1mAb，10D4H MGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb的表位特異性的抗體；g)能與6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb競(jìng)爭(zhēng)同脊椎動(dòng)物高遷移率族匣(HMGB)多肽相結(jié)合的抗體；h)一種a)，b)，c)，d)，e)，f)或g)的抗原-結(jié)合片段。
71.根據(jù)權(quán)利要求70的方法，這里所述的情況是從包括膿血癥，同種異體移植物抑制，關(guān)節(jié)炎，哮喘，狼瘡，成人呼吸窘迫綜合征，銀屑癬，胰腺炎，腹膜炎，燒傷，缺血，Behcet’s疾病，移植物抗宿主病，炎癥性腸疾病，多重硬化癥和惡疾的組中選擇的。
72.一種治療病人膿血癥的方法，包括給予病人抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段是從下列組中選擇的a)6E6 HMGB1 mAb；b)6H9 HMGB1 mAb；c)2G7 HMGB1 mAb；d)10D4 HMGB1 mAb；e)2E11 HMGB1 mAb；f)有6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb的表位特異生的抗體；g)能與6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合脊椎動(dòng)物高遷移率族匣(HMGB)多肽的抗體；h)一種a)，b)，c)，d)，e)，f)或g)的抗原-結(jié)合片段。
73.一種治療病人關(guān)節(jié)炎的方法，包括給予病人抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段是從下列組中選擇的a)6E6 HMGB1 mAb；b)6H9 HMGB1 mAb；c)2G7 HMGB1 mAb；d)10D4 HMGB1 mAb；e)2E11 HMGB1 mAb；f)有6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb的表位特異性的抗體；g)能與6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合脊椎動(dòng)物高遷移率族匣(HMGB)多肽的抗體；h)一種a)，b)，c)，d)，e)，f)或g)的抗原-結(jié)合片段。
74.一種治療病人狼瘡的方法，包括給予病人抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段是從下列組中選擇的a)6E6 HMGB1 mAb；b)6H9 HMGB1 mAb；c)2G7 HMGB1 mAb；d)10D4 HMGB1 mAb；e)2E11 HMGB1 mAb；f)有6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7 HMGB1mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb的表位特異性的抗體；g)能與6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合脊椎動(dòng)物高遷移率族匣(HMGB)多肽的抗體；h)一種a)，b)，c)，d)，e)，f)或g)的抗原-結(jié)合片段。
75.一種檢測(cè)樣本中脊髓動(dòng)物高遷移率族匣(HMGB)多肽的方法，包括a)將樣本與權(quán)利要求62的抗體或抗原-結(jié)合片段接觸，在合適的條件下，使所述的抗體或抗原-結(jié)合片段與所述樣本中的所述的HMGB多肽結(jié)合；b)檢測(cè)抗體-HMGB組合物或抗原-結(jié)合片段-HMGB復(fù)合物，其中檢測(cè)到所述的抗體-HMGB復(fù)合物或抗原-結(jié)合片段-HMGB復(fù)合物即表示所述樣本中存在HMGB多肽。
76.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，其中所述的抗體或其抗原-結(jié)合片段是從包括6E6 HMGB1 mAb，6H9 HMGB1 mAb，2G7HMGB1 mAb，10D4 HMGB1 mAb，2E11 HMGB1 mAb和任何上述抗原-結(jié)合片段的組中選擇的。
77.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，其中所述的抗體或抗原-結(jié)合片段包括可檢測(cè)的標(biāo)簽。
78.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，其中所述的抗體-HMGB復(fù)合物或抗原-結(jié)合片段-HMGB復(fù)合物的檢測(cè)是通過(guò)免疫測(cè)定進(jìn)行的。
79.根據(jù)權(quán)利要求78的方法，其中所述的免疫測(cè)定是ELISA。
80.一種試劑盒，用于檢測(cè)樣本中脊髓動(dòng)物高遷移率族匣(HMGB)多肽或其蛋白是否存在，包括a)權(quán)利要求62的抗體或抗原-結(jié)合片段；b)一種或更多種適合檢測(cè)在所述的抗體或抗原-結(jié)合片段與所述HMGB多肽或其蛋白質(zhì)之間的復(fù)合物是否存在的輔助試劑。
全文摘要
在不同的實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)注于結(jié)合脊椎動(dòng)物高遷移率族匣(HMGB)多肽的抗體或其抗原片段，測(cè)定和/或鑒定結(jié)合HMGB多肽的藥劑的方法，對(duì)以炎癥因子級(jí)聯(lián)放大活性為特征的病人情況給予治療的方法和測(cè)定樣本中HMGB多肽的方法。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1878793SQ200480033217
公開(kāi)日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2004年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月11日
發(fā)明者沃特·紐曼, 秦世欣, 特麗薩·奧基夫, 羅伯特·奧巴 申請(qǐng)人:鑒定醫(yī)療有限公司