專利名稱：具有用于反差成像的活性組分的充氣微囊組件的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組件，這種組件包括作為第一組分的充氣微囊和作為第二組分、能夠與微囊的外表面相結(jié)合，借此改善其物理-化學特性的結(jié)構(gòu)實體，所述第二組分具有導向和/或診斷活性。本發(fā)明還涉及包括所述組件的藥劑、所述藥劑的用途、所述組件和藥劑的制備方法以及包括所述組件的試劑盒。本發(fā)明的組件可用作診斷和/或治療活性藥劑中的活性組分，尤其是用于增強超聲反差成像領(lǐng)域中的成像，這些成像技術(shù)包括定向超聲成像和/或超聲介導給藥及例如分子共振成像(MRI)或核成像的其它成像技術(shù)。
背景技術(shù)：
近年來超聲造影劑的快速發(fā)展產(chǎn)生了許多不同藥劑，這些藥劑可用于人或動物體的器官和組織的超聲成像。將這些藥劑設(shè)計成主要用作與醫(yī)學回波描記設(shè)備結(jié)合使用的靜脈或動脈血管內(nèi)注射劑，所述設(shè)備采用例如B-模式成像(基于反向散射組織特性的空間分布)或多普勒信號處理(基于用來測定血液或液體流動參數(shù)的超聲回聲的連續(xù)波或脈沖多普勒處理)。
可用作超聲造影劑的一類血管注射劑包括分散在含水介質(zhì)中的具有幾微米直徑的氣泡懸浮體。
載體液中的氣泡懸浮液用作有效的超聲反射體，這在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。在早期觀察到水溶液的快速靜脈注射由于形成氣泡能夠?qū)е氯芙鈿怏w從溶液中逸出之后，開發(fā)出微泡懸浮液作為用于增強超聲成像的回波藥物。由于這些血管氣泡與血液在聲阻抗上非常不同，因此發(fā)現(xiàn)它們是極好的超聲反射體。載體液中的氣泡懸浮體注射到活生物體的血流內(nèi)，能夠大大加強超聲回波描記成像，由此增強體內(nèi)器官的可視性。由于器官和深位組織的成像在建立醫(yī)學診斷時是至關(guān)重要的，因此已付出了許多努力以開發(fā)穩(wěn)定的高濃縮氣泡懸浮體，所述氣泡懸浮體必須同時具備制備和施用簡單的優(yōu)點，含有最少的失活物種，并且能夠長期貯存和簡單施用。
然而，對游離氣泡在含水介質(zhì)中的簡單分散體的實際興趣有限，因為這些氣泡的穩(wěn)定性通常不足以用作超聲造影劑。
因此，研究者的興趣已經(jīng)體現(xiàn)在用于回波描記及其它超聲研究的氣泡的穩(wěn)定方法上，所述方法例如利用乳化劑、油、增粘劑或糖，或者將氣體或其前體捕獲或用膠囊包裹在各種系統(tǒng)中。這些穩(wěn)定的氣泡在本領(lǐng)域內(nèi)通常稱作“微囊”，并且可以分成兩個主要類別。
第一類穩(wěn)定氣泡或微囊在本領(lǐng)域內(nèi)通常稱作“微泡”，并且包括含水懸浮體，在懸浮體中，氣泡被包括設(shè)置在氣-液界面的穩(wěn)定兩性材料的非常薄的被膜(膜)界定在氣/液界面上。微泡懸浮體一般是這樣制備的即，使粉末狀的兩性材料(例如凍干的預(yù)制脂質(zhì)體或凍干或噴霧干燥的磷脂溶液)與空氣或其它氣體接觸，然后再與含水載體接觸，同時進行攪拌，從而產(chǎn)生微泡懸浮體。這樣就可以施用了，優(yōu)選在懸浮體制成之后盡快施用。
氣體微泡的含水懸浮體及其制備的實施例如公開在US5,271,928、US 5,445,813、US 5,413,774、US 5,556,610、5,597,549、US 5,827,504和WO 04/069284中，這些參考文獻在此全部引入本文。
第二類微囊在本領(lǐng)域內(nèi)通常稱作“微球”或“微膠囊”，并且包括這樣的懸浮體在該懸浮體內(nèi)，氣泡被脂質(zhì)或天然或合成聚合物固態(tài)材料被膜所包圍。微球及其制備的實施例如公開在US 5,711,933和US 6,333,021中，這些參考文獻在此全部引入本文。
攜帶總凈電荷的微囊也是公知的(例如參見國際專利申請WO97/29783，該參考文獻在此并入本文)；這些微囊的外被膜含有能夠?qū)⑺璧目傠姾少x予最終微囊的離子化合物。
對這些充氣微囊藥劑的進一步興趣最近體現(xiàn)在，對用于改善診斷效果和/或治療目的的充氣微囊藥劑的改進上。
例如，微囊可與特定組分(稱作“靶向配體”)相結(jié)合(例如通過包括在其周邊被膜中)，所述特定組分能夠連接到病人體內(nèi)的確定靶物(例如特定病原部位)上。這些藥劑在本領(lǐng)域內(nèi)通常稱作“定向微囊”。定向微囊、靶向配體及其制備的實施例如公開在國際專利申請WO98/18051中。
另一個改進藥劑的實例是那些治療劑與微囊相結(jié)合的藥劑。當包括微囊的藥劑到達病原部位時，例如通過施加能夠分裂囊泡的受控聲能、由此局部釋放治療劑而有益地釋放藥物。這種技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)通常稱作“超聲介導的藥物釋放”。包含治療劑的微囊藥劑的實例如公開在國際專利申請WO94/28873中。
本領(lǐng)域的進一步開發(fā)集中在組件的制備上，其中微囊與攜帶所需治療劑或靶向化合物的第二組分相結(jié)合。
例如，WO99/39738公開了一種包括充氣微囊和與其相結(jié)合的液體填充的脂質(zhì)體的組件，其中脂質(zhì)體內(nèi)包括治療活性物質(zhì)。脂質(zhì)體通過與微囊簡單混合或者通過共軛偶之間的連接，而結(jié)合到微囊上。在所述共軛偶中，微囊和脂質(zhì)體每個都配有攜帶所述共軛偶(例如生物素和親和素或鏈霉親和素)的兩個相應(yīng)互補部分之一的組分。
WO03/015831公開了一種藥劑，其包括與脂質(zhì)體相結(jié)合的充氣微囊(即該申請中的“微球”)，被稱作微球-脂質(zhì)體組合物。組合物的脂質(zhì)體可包括藥物和/或靶向部分。形成組合物的微囊和脂質(zhì)體用相同的原料制成；組合物是通過以下步驟獲得的制備包含脂質(zhì)混合物的水溶液，然后將所述溶液引入包括所需氣體的密封瓶中，最后攪拌該溶液。如此獲得的組合物因此是一種化學性質(zhì)相同的微囊與脂質(zhì)體的簡單混合物。尤其是，所述參考文獻中沒有公開微囊與脂質(zhì)體之間的具體化學或物理作用。
而且，國際專利申請WO99/53963公開了一種復(fù)合制劑，其包括第一組合物和第二組合物，所述第一組合物包括分散在含水介質(zhì)中并被一種材料穩(wěn)定的充氣微囊，所述第二組合物是包括一種使乳劑穩(wěn)定的材料的水包油乳劑。使微囊和分散的油相穩(wěn)定的表面材料彼此具有親和力。在一個實施方案中，所述親和力是通過采用具有相反電荷的表面材料以使它們彼此發(fā)生靜電相互作用并結(jié)合而獲得的?；蛘呤?，各個表面材料的聯(lián)合可包括通過化學或生物結(jié)合而能夠相互作用的化合物。乳劑的油是能夠在體內(nèi)產(chǎn)生氣體或蒸汽壓并稱作“可分散組分”的物質(zhì)。所述乳化物液滴與微囊的聯(lián)合通過氣體或蒸汽分子從所述物質(zhì)向其內(nèi)分散，能夠確定分散的氣相在微囊中的可控生長。
發(fā)明概述申請人現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種用于藥物活性藥劑的新組件，其包括通過充分的靜電相互作用而與第二組分相結(jié)合的充氣微囊，所述第二組分包括靶向配體、診斷劑或這些物質(zhì)的任意組合。
本發(fā)明一方面涉及一種包括充氣微囊和與所述微囊相結(jié)合的組分的組件，其中所述微囊攜帶第一總凈電荷，所述組分攜帶符號與所述第一凈電荷相反的第二總凈電荷，并包括靶向配體、診斷劑或這些物質(zhì)的任意組合以及生物相容的表面活性劑。
按照一個優(yōu)選實施方案，所述相結(jié)合組分具有300nm或更小的直徑，更優(yōu)選200nm或更小的直徑，甚至更優(yōu)選100nm或更小的直徑。
按照一個優(yōu)選實施方案，所述組件包括含有生物活性劑的相結(jié)合組分。
優(yōu)選地，所述表面活性劑是乳化劑、分散劑或它們的任意組合，尤其優(yōu)選的是兩性材料。
在本說明書以下的描述中，組件的第二組分被稱作微囊相結(jié)合組分(“MAC”)。
按照本發(fā)明的一個實施方案，所述超聲造影劑是分散在藥物可接受的含水載體中的多個所述組件的懸浮體形式。
按照本發(fā)明的一個替換型實施方案，所述超聲造影劑是凍干組合物形式。
本發(fā)明另一方面涉及一種如上所述的組件的制備方法，其包括將具有充氣微囊或其前體的制劑與包含所述第二組分或其前體的制劑進行混合。
鑒于本申請的目的，術(shù)語“充氣微囊的前體”在其含義內(nèi)包括能夠形成充氣微囊懸浮液的任何中間物質(zhì)、組合物、藥劑或結(jié)構(gòu)，例如包括能夠與含水載體重組以形成所述微囊懸浮液的凍干藥劑，或者能夠進行凍于處理以獲得凍干產(chǎn)品、凍干產(chǎn)品然后與含水載體重組以形成所述懸浮液的微乳劑。
同樣，術(shù)語“第二組分的前體”，包括能夠形成所述第二組分的任何中間物質(zhì)、組合物、藥劑或結(jié)構(gòu)，例如包括可重組成包含所述MAC的含水懸浮液的凍干組合物。
按照本發(fā)明的一個實施方案，本發(fā)明的組件可通過以下步驟獲得1)制備包括充氣微囊的第一含水懸浮液；2)制備包括將要與所述充氣微囊相結(jié)合的組分的第二含水懸浮液；3)將所述兩種懸浮液混合，從而獲得包括所述組件的含水懸浮液。
任選地，在制備第一和/或第二懸浮液之后可包括洗滌步驟。也可實施最終懸浮液的任選洗滌步驟。術(shù)語“洗滌步驟”在其含義內(nèi)包括，從所需化合物(例如微囊、MAC或組件)的懸浮液中分離和/或至少部分除去過量的未聯(lián)合材料、組分、顆粒等的任何方法或工藝。合適的分離方法包括例如傾析、離心、超濾或微濾。
按照一個替換型實施方案，本發(fā)明的組件可通過以下步驟獲得1)制備包括充氣微囊的第一含水懸浮液；2)凍干所述懸浮液，從而獲得第一凍干產(chǎn)物；3)制備包括將要與所述充氣微囊相結(jié)合的組分的第二含水懸浮液；4)凍干所述懸浮液，從而獲得第二凍干產(chǎn)物；5)在氣體的存在下，將所述第一和所述第二凍干產(chǎn)物與生理上可接受的含水載體進行重組，從而獲得包括組件的含水懸浮液。
任選地，在制備第一和/或第二懸浮液之后可包括洗滌步驟。也可實施最終懸浮液的任選洗滌步驟。
按照一個優(yōu)選實施方案，制備工藝的最后步驟5)包括以下步驟a)將第二凍干產(chǎn)物與生理上可接受的含水載體進行重組，從而獲得包括將要與充氣微囊相結(jié)合的組分的懸浮液，以及b)在氣體的存在下，將第一凍干產(chǎn)物與所述懸浮液進行重組。
按照進一步優(yōu)選的實施方案，所述組件是作為凍干組合物通過以下步驟獲得的1)制備包括水不混溶的有機溶劑、磷脂和凍干保護劑(lyoprotective)的含水乳劑；2)制備包括將要與充氣微囊相結(jié)合的組分的含水懸浮液；3)將所述含水懸浮液與所述含水乳劑進行混合；以及4)將混合物凍干，以除去水和有機溶劑，從而獲得包括所述組件的凍干產(chǎn)品。
通過在氣體和含水載體的存在下攪拌所述凍干產(chǎn)品，所獲得的凍干產(chǎn)品能夠重組成包括本發(fā)明組件的含水懸浮液。
本發(fā)明另一方面涉及一種超聲診斷成像方法，其包括施用反差增強量的如上定義組件的含水懸浮液。
本發(fā)明另一方面涉及一種治療方法，其包括施用有效治療量的如上定義的包括生物活性劑的組件的含水懸浮液。
本發(fā)明還有另一方面涉及一種藥盒，其包含以下任何形式的所述組件組分a)作為兩個獨立的微囊和MAC懸浮液；b)作為兩個組分的單獨凍干制劑，任選地與用于重組的含水載體在一起；或者c)作為組件的凍干制劑，與用于重組的含水載體在一起。
按照本發(fā)明組件的優(yōu)點是，通過采用一般用于形成微囊被膜的常規(guī)組分、而無需將附加組分或部分引入所述被膜(否則可能削弱微囊的穩(wěn)定性)，可實現(xiàn)微囊與MAC之間的靜電相互作用。
所獲得的組件一旦施用到病人體內(nèi)，能夠有益地改進或調(diào)節(jié)充氣微囊的行為(例如從血流循環(huán)中的廓清率)。例如，包括帶正電荷的微囊和帶負電荷的MAC的組件，可用來施用帶正電荷的微囊制劑，然而所述帶正電荷的微囊制劑一旦進入體內(nèi)，就表現(xiàn)出類似于帶負電荷微囊的行為?；蛘呤?，包括帶負電荷的微囊和帶正電荷的MAC的組件，可用來施用帶負電荷的微囊制劑，然而所述帶負電荷的微囊制劑一旦進入體內(nèi)，就表現(xiàn)出類似于帶正電荷微囊的行為。此外，可使所需的靶向化合物或藥物活性劑與微囊相結(jié)合，而不會減小其穩(wěn)定性(尤其是圍繞氣體的邊界層的穩(wěn)定性)，因為所述靶向化合物或藥物活性劑實際上與組件的第二組分相結(jié)合，其穩(wěn)定性基本上不受所述化合物或活性劑的存在的影響。
本發(fā)明的進一步優(yōu)點是，在為了不同目的制備不同的組件時具有相當大的靈活性。實際上，帶電微囊的一個基本制劑可與不同的帶相反電荷的MAC制劑(如果需要，可同時不止一個)相結(jié)合，這取決于具體的診斷/治療需要。例如，可使攜帶靶向配體(例如用于將組件結(jié)合到特定病原部位)的第一MAC制劑和包括生物活性劑(一旦組件連接到特定病原部位上就可釋放)和/或診斷劑(增強定向部位的成像)的第二MAC制劑與微囊制劑相結(jié)合。
此外，申請人已經(jīng)觀察到，本發(fā)明的組件相對于單獨的微囊表現(xiàn)出更強的耐壓力。
圖1表示出由包括相同材料但不同量的微囊和MAC形成的不同組件的組合物。
圖2和3表示出帶電微囊和具有所帶電荷與微囊相反的MAC的相應(yīng)組件的體內(nèi)行為。
發(fā)明詳述按照本發(fā)明的組件一般包括攜帶總凈電荷的充氣微囊形式的第一組分(也被認做“載體”組分)，和與所述載體組分(MAC)相結(jié)合的第二組分，所述第二組分攜帶符號與第一組分相反的總凈電荷。MAC包含所需的靶向配體、診斷劑或這些物質(zhì)的任意組合、以及至少一種表面活性劑，尤其是乳化劑和/或分散劑，更優(yōu)選的是兩性化合物。任選地，組件中可包括含有生物活性劑的MAC。
微囊相結(jié)合組分(MAC)優(yōu)選是通過聯(lián)合一種或多種表面活性劑的多個分子而形成的穩(wěn)定超分子結(jié)構(gòu)形式。優(yōu)選地，所述超分子結(jié)構(gòu)包括攜帶凈電荷的至少一種表面活性劑，更優(yōu)選的是離子表面活性劑。所述穩(wěn)定超分子結(jié)構(gòu)能夠例如通過所述分子的疏水部分之間的疏水性作用來確定。按照一個特別優(yōu)選的實施方案，MAC是膠束形式的?；蛘呤?，所述MAC可由一個聚合離子表面劑活性分子來形成，所述分子任選地被官能化為包括合適的靶向、生物活性和/或診斷部分。
本發(fā)明的組件可用來制備用于診斷和/或治療方法的藥物活性藥劑。
術(shù)語“藥物活性藥劑”在其含義內(nèi)包括，在按需以有效量施用給病人時能夠發(fā)揮藥效(例如診斷、生物活性和/或治療效果)的任何藥劑或者其前體，包括診斷、生物活性和/或治療活性藥劑。同樣，術(shù)語“藥物活性”在指化合物、試劑或藥盒時，在其含義內(nèi)包括診斷、生物活性和/或治療化合物、試劑或藥盒。
術(shù)語“靶向配體”在其含義內(nèi)包括，具有或者能夠促進本發(fā)明組件的向活體內(nèi)的任何生物或病原部位的靶向活動的任何化合物、部分或殘基。靶向配體可結(jié)合的靶物包括組織例如心肌組織(包括心肌的細胞和心肌細胞(cardiomyocite)、膜組織(包括內(nèi)皮和上皮)、層、結(jié)締組織(包括間質(zhì)組織)或腫瘤；血塊；和受體例如肽激素、神經(jīng)遞質(zhì)、抗原、補體片段和免疫球蛋白的細胞表面受體、以及類固醇激素的胞質(zhì)受體。
術(shù)語“診斷劑”在其含義內(nèi)包括可與診斷方法(包括病人的內(nèi)部區(qū)域的成像和/或診斷病人疾病的存在與否)結(jié)合使用的任何化合物、組合物或顆粒。示范診斷劑包括例如與磁共振成像、X-射線成像(尤其是計算機化X線斷層照相術(shù))、光學成像、核成像或分子成像結(jié)合用于病人的造影劑，包括例如磁鐵礦納米顆粒。
術(shù)語“生物活性劑”在其含義內(nèi)包括，可用于任何治療用途(例如病人的疾病治療方法)的任何物質(zhì)、組合物或顆粒，以及能夠在體外和/或體內(nèi)發(fā)揮或負責發(fā)揮生物效應(yīng)的任何物質(zhì)。生物活性劑的實例是藥物、藥品、蛋白質(zhì)、天然或合成肽(包括寡肽和多肽)、維生素、類固醇和遺傳材料(包括核苷、核苷酸以及多核苷酸)。病人的治療方法或治療法一般包括生物活性劑的使用。
“可生物相容的”或“生理上可接受的”是指，能夠以所選量給病人施用而不會負面影響或?qū)嵸|(zhì)性改變其生物體的健康或正常機能(例如，沒有確定任何的不可接受的毒性狀態(tài)、不會導致任何極端或失控的變態(tài)反應(yīng)或者沒有確定任何異常病理狀況或疾病狀態(tài))的任何化合物、材料或藥劑。
術(shù)語“表面活性劑”是指能夠使通常不混溶材料的混合物穩(wěn)定的任何化合物，所述混合物例如有兩種不混溶液體(例如水和油)的混合物、液體與氣體(例如水中的氣體微泡)的混合物、或液體與不溶性顆粒(例如水中的金屬納米顆粒)的混合物。這些化合物在本領(lǐng)域中通常也稱作“乳化劑”或“分散劑”。優(yōu)選地，所述化合物是“兩親性化合物”，即具有帶親水性極性頭部(例如極性或離子基團)和疏水性有機尾部(例如碳氫鏈)的分子的化合物。表面活性劑、尤其是乳化和/或分散劑的實例有(C2-C10)有機酸、包括(C12-C24)、優(yōu)選(C14-C22)脂族鏈的有機脂肪酸、這些物質(zhì)的藥物可接受的(堿)鹽、以及與聚氧乙烯的相應(yīng)酯，例如棕櫚酸、硬脂酸、花生四烯酸、油酸、十二烷酸鈉、草酸鈉或酒石酸鈉，或聚氧乙烯脂肪酸硬脂酸酯；聚離子(堿性)鹽，例如檸檬酸鈉、聚丙烯酸鈉、磷酸鈉；有機胺、酰胺、四價銨(鹵)鹽，優(yōu)選含有(C8-C22)碳氫鏈，包括它的聚氧乙基化衍生物，例如乙醇胺、三乙醇胺、烷基胺、鏈烷醇酰胺、氯化三甲基烷基胺、聚氧乙基化烷基胺、聚氧乙基化鏈烷醇酰胺；氨基酸；磷脂，例如磷脂酰膽堿、乙基磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸或鞘磷脂的脂肪酸二酯；單-或寡-糖與(C12-C24)、優(yōu)選(C14-C22)有機脂肪酸的酯，例如失水山梨糖醇月桂酸酯；聚合表面活性劑，即包括疏水性和親水性部分的嵌段共聚物，例如環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷嵌段共聚物；有機磺酸酯，例如堿性(例如鈉)(C12-C24)烷基、優(yōu)選(C14-C22)烷基磺酸鹽；全氟有機酸，例如全氟辛酸；以及這些物質(zhì)的混合物。與具有微米級尺寸的微囊相反，由于MAC的優(yōu)選納米級尺寸(300nm或更小)，因此其也被稱作組件的納米組分。微囊的尺寸一般至少為0.5μm，優(yōu)選為0.8μm并至多例如20μm，更優(yōu)選的是約1-8μm；在例如借助于庫爾特計數(shù)器測定的眾多微囊中相應(yīng)的平均直徑(DN)優(yōu)選為至少0.8μm，更優(yōu)選為至少1μm(高達例如約8μm)，并甚至更優(yōu)選的是約1-約5μm。
通常，根據(jù)相應(yīng)的制備方法，微囊和MAC是作為具有或多或少窄的尺寸分布的一個粒子群而獲得的。由此，為了比較不同群體的微囊或MAC，通常采用所述分布的平均值。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，微米/納米顆粒的尺寸及其相應(yīng)的大小分布可以用許多參數(shù)來表征，最常使用的是按數(shù)目計的平均直徑(DN)、按數(shù)目計的中值直徑(DN50)、按體積計的平均直徑(DV)和按體積計的中值直徑(DV50)。雖然按數(shù)目計的直徑指示出顆粒的平均數(shù)尺寸，但是按體積計的直徑提供了顆粒的總體積在整個群體中是如何分布的信息。由于在小體積顆粒群體中極少數(shù)大體積顆粒的存在，可導致相應(yīng)的DV值向高值漂移，因此有時用DV50值評估顆粒群體的分布更便利些。DV50是表示顆粒內(nèi)部體積總數(shù)的一半存在于具有低于DV50直徑的顆粒中的計算值；這使得在大小分布的評估中偶然形成的大體積顆粒的作用減小。為了清楚起見，單一大小的顆粒顯示出相同的DN、DN50、DV和DV50值。另一方面，顆粒分布范圍的增寬將導致具有各自比例的相應(yīng)偏差的這些不同值之間具有更大的差異(例如，DV/DN之比增大)。例如，主要含有小顆粒(例如具有2μm左右直徑的顆粒)和少量大顆粒(例如具有8μm以上直徑的顆粒)的顆粒群，顯示出比DN值更高的DV或DV50值，從而Dv/DN或Dv50/DN之比相應(yīng)更高。
組件的兩個組分之間的靜電相互作用基本上是通過采用攜帶第一凈電荷的第一分子化合物(包括在微囊的被膜中)和攜帶符號與第一凈電荷相反的第二凈電荷的第二分子化合物(包括在MAC結(jié)構(gòu)中)而獲得的。然后具有第一總凈電荷的微囊和具有符號與第一凈電荷符號相反的第二總凈電荷的MAC通過靜電相互作用彼此相結(jié)合，從而獲得按照本發(fā)明的組件。
形成按照本發(fā)明組件的第一組分的充氣微囊，可以是本領(lǐng)域內(nèi)公知的攜帶總凈電荷的任何微囊。微囊的優(yōu)選實例是微泡和微球(或微膠囊)。
微泡合適的充氣微囊的第一實例以下將稱作“充氣微泡”。
可用于制備本發(fā)明組件的充氣微泡通常是分散在含水懸浮液中的氣泡，所述懸浮液被位于氣-液界面、包括兩性(成膜)化合物的(非常薄的)被膜所穩(wěn)定。所述穩(wěn)定被膜(在本領(lǐng)域內(nèi)有時稱作“漸消被膜”)通常具有小于5nm、一般為約2-3nm的厚度，由此經(jīng)常實際上基本為單分子層。包括在被膜中的至少一部分兩性材料是由帶電分子構(gòu)成的，于是將所需的總凈電荷賦予微泡被膜。
包括在微囊被膜中的兩性化合物可以是合成或天然發(fā)現(xiàn)的生物相容化合物，并且可包括例如成膜脂質(zhì)，尤其是磷脂。兩性化合物的實例包括例如磷脂；溶血脂質(zhì)；脂肪酸，例如棕櫚酸、硬脂酸、花生四烯酸或油酸；攜帶聚合物的脂質(zhì)，例如殼質(zhì)、透明質(zhì)酸、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇(PEG)(也稱作“pegylated脂質(zhì)”)；攜帶磺化單-、二-、寡-或多糖的脂質(zhì)；膽固醇、膽固醇硫酸酯或膽固醇半琥珀酸酯；維生素E半琥珀酸酯；具有醚或酯連接的脂肪酸的脂質(zhì)；聚合脂質(zhì)；聯(lián)乙醯磷酸酯；聯(lián)十六烷基磷酸酯；硬脂胺；神經(jīng)酰胺；聚氧乙烯脂肪酸酯(例如聚氧乙烯脂肪酸硬酯酸酯)、聚氧乙烯脂肪醇、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙基化失水山梨糖醇脂肪酸酯、甘油聚乙二醇蓖麻油酸酯、乙氧基化大豆甾醇、乙氧基化蓖麻油或環(huán)氧乙烷(EO)和環(huán)氧丙烷(PO)的嵌段共聚物；甾醇脂族酸酯，包括膽固醇丁酸酯、膽固醇異丁酸酯、膽固醇棕櫚酸酯、膽固醇硬脂酸酯、羊毛甾醇乙酸酯、麥角甾醇棕櫚酸酯或植物甾醇異丁酸酯；糖酸的甾醇酯，包括膽固醇葡糖苷酸、羊毛甾醇葡糖苷酸、7-脫氫膽固醇葡糖苷酸、麥角甾醇葡糖苷酸、膽固醇葡糖酸酯、羊毛甾醇葡糖酸酯或麥角甾醇葡糖酸酯；糖酸和醇的酯，包括月桂基葡糖苷酸、硬脂酰葡糖苷酸、肉豆蔻酰葡糖苷酸、月桂基葡糖酸酯、肉豆蔻酰葡糖酸酯或硬脂酰葡糖酸酯；糖與脂族酸的酯，包括蔗糖月桂酸酯、果糖月桂酸酯、蔗糖棕櫚酸酯、蔗糖硬脂酸酯、葡糖醛酸、葡糖酸或多糖醛酸；皂角苷，包括薩灑皂草配基、菝葜配基、常春配基、齊墩果酸或毛地黃毒苷配基；甘油或甘油酯，包括甘油三棕櫚酸酯、甘油二硬脂酸酯、甘油三硬脂酸酯、甘油二肉豆蔻酸酯、甘油三肉豆蔻酸酯、甘油二月桂酸酯、甘油三月桂酸酯、甘油二棕櫚酸酯；長鏈醇，包括正-癸醇、月桂醇、肉豆蔻醇、十六醇或正-十八醇；6-(5-膽甾-3β-氧)-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷；雙半乳糖二甘油酯；6-(5-膽甾-3β-氧)己基-6-氨基-6-脫氧-1硫代-β-D-吡喃半乳糖苷；6-(5-膽甾-3β-氧)己基-6-氨基-6-脫氧-1-硫代-β-D-吡喃甘露糖苷；12-(((7’-二乙基氨香豆素-3-基)羰基)甲基氨)十八酸；N-[12-(((7’-二乙基氨香豆素-3-基)羰基)甲基氨)十八酰基]-2-氨基棕櫚酸；N-琥珀酰-二油?；字Ｒ掖及罚?，2-二油?；?sn-甘油；1，2-二棕櫚?；?sn-3-琥珀酰甘油；1，3-二棕櫚?；?2-琥珀酰甘油；1-十六烷基-2-棕櫚?；视土滓掖及坊蜃貦磅；甙腚装彼?；包括至少一個(C10-C20)、優(yōu)選(C14-C18)烷基鏈的烷基銨鹽，例如硬脂酰氯化銨、十六烷基氯化銨、二甲基雙十八烷基溴化銨(DDAB)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)；包括一個或優(yōu)選包括兩個(C10-C20)、優(yōu)選(C14-C18)?；?此鏈通過(C3-C6)亞烷基橋連接到N原子上)的三價或四價銨鹽，例如1，2-二硬脂?；?3-三甲基銨-丙烷(DSTAP)、1，2-二棕櫚?；?3-三甲基銨-丙烷(DPTAP)、1，2-二油?；?3-三甲基銨-丙烷(DOTAP)、1，2-二硬脂酰基-3-二甲基銨-丙烷(DSDAP)；以及這些物質(zhì)的混合或組合。
根據(jù)組分的組合以及微泡的制造工藝，以上列出的示范化合物可用作形成微囊被膜的主要化合物或用作簡單的添加劑，因此僅以極小的量存在。
按照一個優(yōu)選實施方案，至少一個形成微囊被膜的化合物是磷脂，并且任選地是與任何其它上述提到的成膜材料的混合物形式。按照本發(fā)明的描述，術(shù)語磷脂意在包含任何兩性磷脂化合物，其分子能夠在最終的微泡懸浮液中的氣-液邊界界面形成穩(wěn)定材料膜(一般是單分子層的形式)。據(jù)此，這些材料在本領(lǐng)域內(nèi)也稱作“成膜磷脂”。
兩性磷脂化合物一般含有至少一個磷酸基和至少一個、優(yōu)選兩個親脂長鏈碳氫基團。
合適磷脂的實例包括甘油和一個或優(yōu)選兩個(等同或不同)脂肪酸殘基的酯以及甘油和磷酸的酯，其中磷酸殘基又與親水基團結(jié)合，例如膽堿(磷脂酰膽堿-PC)、絲氨酸(磷脂酰絲氨酸-PS)、甘油(磷脂酰甘油-PG)、乙醇胺(磷脂酰乙醇胺-PE)、纖維醇(磷脂酰纖維醇)等基團。磷脂與脂肪酸的僅僅一個殘基的酯在本領(lǐng)域內(nèi)通常稱作磷脂的“溶血”形式。存在于磷脂中的脂肪酸殘基通常是長鏈脂族酸，一般含有12-24個、優(yōu)選14-22個碳原子；脂族鏈可含有一個或多個不飽和基團，或者優(yōu)選地完全飽和基團。包括在磷脂中的合適脂肪酸的實例有，例如月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生四烯酸、山萮酸、油酸、亞油酸和亞麻酸。優(yōu)選的是采用例如肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸和花生四烯酸之類的飽和脂肪酸。
磷脂的進一步實例是磷脂酸，即甘油-磷脂酸和脂肪酸的二酯；鞘脂類例如鞘磷脂，即甘油二酯與脂肪酸的殘基被神經(jīng)酰胺鏈取代的那些磷脂酰膽堿類似物；心磷脂，即1，3-二磷脂酰甘油與脂肪酸的酯；糖脂例如神經(jīng)節(jié)苷脂GM1(或GM2)或腦苷脂類；糖脂；硫苷脂和糖鞘脂。
正如此處所用的，術(shù)語磷脂包括能夠單獨使用或作為混合物使用的天然生成的、半合成或合成制備產(chǎn)物。
天然生成的磷脂實例有，天然磷脂酰膽堿(磷脂酰膽堿(PC)衍生物)例如一般為大豆或蛋黃卵磷脂。
半合成磷脂的實例有，天然生成的磷脂酰膽堿的部分或完全氫化衍生物。優(yōu)選的磷脂是磷脂酰膽堿、乙基磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸或鞘磷脂的脂肪酸二酯。
優(yōu)選磷脂的實例如有二月桂?；?磷脂酰膽堿(DLPC)、二肉豆蔻?；?磷脂酰膽堿(DMPC)、二棕櫚?；?磷脂酰膽堿(DPPC)、二花生四烯?；?磷脂酰膽堿(DAPC)、二硬脂酰基-磷脂酰膽堿(DSPC)、二油酰基-磷脂酰膽堿(DOPC)、1，2二硬脂酰基-sn-甘油-3-乙基膽堿磷酸(乙基-DSPC)、雙十五酰-磷脂酰膽堿(DPDPC)、1-肉豆蔻酰-2-棕櫚酰-磷脂酰膽堿(MPPC)、1-棕櫚酰-2-肉豆蔻酰-磷脂酰膽堿(PMPC)、1-棕櫚酰-2-硬脂酰-磷脂酰膽堿(PSPC)、1-硬脂酰-2-棕櫚酰-磷脂酰膽堿(SPPC)、1-棕櫚酰-2-油基磷脂酰膽堿(POPC)、1-油基-2-棕櫚酰-磷脂酰膽堿(OPPC)、二月硅酰-磷脂酰膽堿(DLPC)及其堿金屬鹽、二花生四烯酰基磷脂酰甘油(DLPG)及其堿金屬鹽、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(DMPG)及其堿金屬鹽、二棕櫚?；字８视?DPPG)及其堿金屬鹽、二硬脂?；字８视?DSPG)及其堿金屬鹽、二油?；?磷脂酰甘油(DOPG)及其堿金屬鹽、二肉豆蔻?；字?DMPA)及其堿金屬鹽、二棕櫚?；字?DPPA)及其堿金屬鹽、二硬脂酰基磷脂酸(DSPA)、二花生四烯酰基磷脂酸(DAPA)及其堿金屬鹽、二肉豆蔻?；字Ｒ掖及?DMEC)、二棕櫚?；字Ｒ掖及?DPPE)、二硬脂?；字Ｒ掖及?DSPE)、二油基磷脂乙醇胺(DOPE)、二花生四烯酰基磷脂酰乙醇胺(DAPE)、二亞麻酰基磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰絲氨酸(DMPS)、二花生四烯?；字＝z氨酸(DAPS)、二棕櫚?；字＝z氨酸(DPPS)、二硬脂酰基磷脂酰絲氨酸(DSPS)、二油?；字＝z氨酸(DOPS)、二棕櫚?；柿字?DPSP)和二硬脂酰基鞘磷脂(DSSP)。
術(shù)語磷脂進一步包括改性磷脂，例如親水基又結(jié)合到另一親水基上的磷脂。改性磷脂的實例有，用聚乙二醇(PEG)改性的磷脂酰乙醇胺，即親水的乙醇胺部分連接到不同分子量(例如300-5000道爾頓)的PEG分子上的磷脂酰乙醇胺，例如具有PEG聚合物附著到其上的DPPE-PEG或DSPE-PEG，即DPPE(或DSPE)。例如，DPPE-PEG2000是指具有平均分子量約2000的PEG聚合物附著到其上的DPPE。
特別優(yōu)選的磷脂是DAPC、DSPC、DPPA、DSPA、DMPS、DPPS、DSPS和乙基-DSPC。最優(yōu)選的是DAPC或DSPC。
也可以采用磷脂混合物，例如DPPC、DSPC和/或DAPC與DSPS、DPPS、DSPA、DPPA、DSPG、DPPG、乙基-DSPC和/或乙基-DPPC的混合物。
在一些實施方案中，磷脂是微泡的穩(wěn)定被膜的主要成分，至少占形成充氣微泡被膜的成分總量的50％(w/w)。在一些優(yōu)選實施方案中，基本上被膜全體(即至少為90％，并且高達100％，按重量計)都是由磷脂形成的。
磷脂可便利地以與上述列出的任何兩性化合物混合的形式來使用。由此，例如，磷脂(例如膽固醇、麥角固醇、植物甾醇、谷甾醇、羊膜甾醇、維生素E、丙基五倍子酸酯或棕櫚酸抗壞血酸酯)、脂肪酸例如肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生四烯酸及其衍生物或者丁基化羥基甲苯和/或其它非磷脂化合物，可任選地加入到一種或多種上述磷脂中，所占的比例為0-50％、優(yōu)選高達25％(按重量計)。特別優(yōu)選的是棕櫚酸。
為了將所需的總凈電荷賦予微泡，被膜應(yīng)該包括攜帶總凈電荷的至少一個組分，尤其是帶電的兩性材料，優(yōu)選脂質(zhì)或磷脂。
攜帶總負電荷的磷脂實例是，磷脂酰絲氨酸的衍生物、尤其是它的脂肪酸二酯，例如DMPS、DPPS、DSPS；磷脂酸的衍生物、尤其是它的脂肪酸二酯，例如DMPA、DPPA、DSPA；磷脂酰甘油的衍生物、尤其是它的脂肪酸二酯，例如DMPG、DPPG和DSPG。改性的磷脂、尤其是PEG-改性的磷脂酰乙醇胺例如DMPE-PEG2000、DMPE-PEG3000、DMPE-PEG4000、DPPE-PEG5000、DPPE-PEG2000、DPPE-PEG3000、DPPE-PEG4000、DPPE-PEG5000、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG3000、DSPE-PEG4000、DSPE-PEG5000、DAPE-PEG2000、DAPE-PEG3000、DAPE-PEG4000或DAPE-PEG5000，也可用作帶負電荷的分子。以上提到的磷脂的溶血形式例如溶血磷脂酰絲氨酸衍生物(例如溶血-DMPS、-DPPS或-DSPS)、溶血磷脂酸衍生物(例如溶血-DMPA、-DPPA或-DSPA)和溶血磷脂酰甘油衍生物(例如溶血-DMPG、-DPPG或-DSPG)，也可有益地用作帶負電荷的化合物。帶負電荷的脂質(zhì)的實例是膽汁酸鹽例如膽酸鹽、脫氧膽酸鹽或甘氨膽酸鹽；和(C12-C24)、優(yōu)選(C14-C22)脂肪酸鹽例如棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、1，2-二棕櫚酰-sn-3-琥珀酰甘油鹽或1，3-二棕櫚酰-2-琥珀酰甘油鹽。
優(yōu)選地，帶負電荷的化合物選自以下物質(zhì)DPPA、DPPS、DSPG、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG5000或這些物質(zhì)的混合物。
帶負電荷的組分一般與相應(yīng)的正抗衡離子相結(jié)合，所述抗衡離子可以是單-(例如堿金屬或氨)、二-(例如堿土金屬)或三-價(例如鋁)?？购怆x子優(yōu)選選自于堿金屬陽離子，例如Li+、Na+或K+，更優(yōu)選Na+。
攜帶總正電荷的磷脂實例是，乙基磷脂酰膽堿的衍生物，尤其是乙基磷脂酰膽堿與脂肪酸的酯，例如1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-乙基膽堿磷酸(乙基-DSPC或DSEPC)、1，2-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-乙基膽堿磷酸(乙基-DPPC或DPEPC)。負抗衡離子優(yōu)選鹵族離子，尤其是氯或溴。帶正電荷的脂質(zhì)實例有，包括至少一個(C10-C20)、優(yōu)選(C14-C18)烷基鏈、具有鹵族抗衡離子(例如氯或溴)的烷基銨鹽，例如硬脂酰氯化銨、十六烷基氯化銨、二甲基雙十八烷基溴化銨(DDAB)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)。帶正電荷的脂質(zhì)的進一步實例有，包括一個或優(yōu)選兩個通過(C3-C6)亞烷基橋連接到N原子上的(C10-C20)、優(yōu)選(C14-C18)?；?、具有鹵族抗衡離子(例如氯或溴)的三價或四價銨鹽，例如1，2-二硬脂酰-3-三甲基氨-丙烷(DSTAP)、1，2-二棕櫚酰-3-三甲基氨-丙烷(DPTAP)、1，2-油酰-3-三甲基氨-丙烷(DOTAP)、1，2-二硬脂酰-3-二甲基氨-丙烷(DSDAP)。
優(yōu)選將DSEPC、DPEPC和/或DSTAP用作微囊被膜中的帶正電荷的化合物。
帶正電荷的組分一般與相應(yīng)的負抗衡離子相結(jié)合，所述負抗衡離子可以是單-(例如鹵素)、二-(例如硫酸鹽)或三-價(例如磷酸鹽)?？购怆x子優(yōu)選選自于鹵素離子，例如F-(氟)、Cl-(氯)或Br-(溴)。
為了與MAC發(fā)生有效的靜電相互作用，微囊被膜中的帶電化合物的總量應(yīng)該至少為形成所述被膜的材料總量的1％(按摩爾計)，優(yōu)選至少為5％，甚至更優(yōu)選至少為10％。在微囊和MAC的一些優(yōu)選組合中，已經(jīng)觀察到，帶電化合物在微囊被膜中的量至少為20％、優(yōu)選至少為40％時，能夠使相當高量的MAC結(jié)合到所述微囊中。雖然在一些實施方案中，微囊的全體被膜可由帶電化合物形成，但是已經(jīng)觀察到，有益的是，至少可將微量的中性化合物加入到形成所述被膜的配方中。優(yōu)選地，帶電組分的總量由此等于或低于形成微囊被膜的組分總量的約95％(按摩爾計)，更優(yōu)選等于或低于90％，并且下至等于或低于80％的特別優(yōu)選的量。
中性及帶電磷脂和/或帶電脂質(zhì)的混合物，能夠令人滿意地用來形成本發(fā)明組件的微囊。優(yōu)選地采用兩種或多種脂質(zhì)或磷脂的混合物，其中至少一種帶有中性電荷，至少一種帶有總凈電荷。更優(yōu)選的是，采用兩種或更多種脂質(zhì)或磷脂的混合物，其中至少一種是中性的，至少一種帶有正電荷，以便獲得具有總正電荷的微囊。帶電脂質(zhì)或磷脂的量占脂質(zhì)和磷脂總量的約95％-約1％(按摩爾計)，優(yōu)選為80％-20％(按摩爾計)。
中性磷脂和帶電脂質(zhì)或磷脂的優(yōu)選混合物是，例如DPPG/DSPC、DSTAP/DAPC、DPPS/DSPC、DPPS/DAPC、DSPA/DAPC、DSPA/DSPC和DSPG/DSPC。
其它賦性劑或添加劑可存在于干配方中，或者與用于重組的含水載體一起加入，而不必包括(或僅部分包括)在微囊的穩(wěn)定被膜形成中。這些包括pH調(diào)節(jié)劑、滲透壓調(diào)劑劑、增粘劑、乳化劑、填充劑等，并且可以常規(guī)量來使用。例如，可采用類似于聚丙二醇和聚乙二醇的化合物以及它們的共聚物。增粘劑或穩(wěn)定劑的實例是選自以下物質(zhì)的化合物線性及交聯(lián)的多-和寡-糖、蔗糖、類似于聚乙二醇的親水性聚合物。
由于充氣微囊的制備可包括凍干或噴霧干燥步驟，因此有益的是，在配方中包括一種或多種具有冷凍保護和/或凍干保護作用的試劑和/或一種或多種填充劑，例如氨基酸例如氨基乙酸；碳水化合物，例如糖(例如蔗糖、甘露醇、麥芽糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖或環(huán)糊精)，或者多糖(例如葡聚糖)；或聚二元醇(例如聚乙二醇)。
可用于本發(fā)明組件的微泡能夠按照本領(lǐng)域內(nèi)任何公知的方法來生產(chǎn)。一般，制造方法包括含有如上所述的兩性材料的干粉末狀材料的制備，優(yōu)選地通過對包括所述材料的含水或有機懸浮液進行凍干(冷凍干燥)來制備。
例如，如WO91/15244中所述，成膜兩性化合物首先利用任何脂質(zhì)體形成方法轉(zhuǎn)化成層狀形式。例如，包含成膜脂質(zhì)并且任選地包括其它添加劑(例如增粘劑、非成膜表面活性劑、電介質(zhì)等)的水溶液可接受高速機械勻化或者在聲頻或超聲頻率下接受聲處理，然后凍干形成游離的可流動的粉末，然后將粉末在氣體的存在下貯存起來。在凍干之前可實施任選的洗滌步驟(如US 5,597,549中所公開的)。
按照一個替換型實施方案(例如在上述的US 5,597,549中有所描述)，成膜化合物及親水性穩(wěn)定劑(例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、乙二醇酸、蘋果酸或麥芽糖醇)能夠溶解在有機溶劑中(例如叔丁醇、2-甲基-2-丁醇或C2Cl4F2)，然后將該溶液凍干形成干粉。
或者是，如以上提到的WO 04/069284中所公開的，磷脂(選自于以上提到的那些，并包括以上鑒定的帶電磷脂中的至少一種)和凍干保護劑(例如前面列出的那些，尤其是碳水化合物、糖醇、聚乙二醇以及這些物質(zhì)的混合物)可分散在具有水不混溶的有機溶劑(例如支鏈或直鏈烷烴、烯烴、環(huán)烷烴、芳香烴、烷基醚、酮、鹵化烴、全氟化烴或這些物質(zhì)的混合物)的水乳液中。然后將如此獲得的含有被磷脂材料(并任選地被其它兩性成膜化合物)包圍和穩(wěn)定的溶劑微滴的乳液，按照常規(guī)技術(shù)進行凍干，從而獲得凍干材料，然后將凍干材料貯存起來(例如在合適氣體的存在下貯存在瓶中)，并可與含水載體重組，從而最終獲得充氣微泡懸浮液。
制備充氣微泡的進一步工藝包括如下制備氣體微泡分散體在所需氣體的存在下使包含磷脂(以及任選地包括其它兩性成膜化合物和/或添加劑)的含水介質(zhì)接受受控的高攪拌能量(例如借助于轉(zhuǎn)子定子混合器)，并將所獲得的分散體凍干，從而產(chǎn)生干燥的重組產(chǎn)品。此工藝的一個實例如在WO97/29782中給出，該文獻在此處作為參考并入本文。
噴霧干燥技術(shù)(如US 5,605,673中所公開的)也可用來獲得含有本發(fā)明組件的微囊的干燥粉末。
用以上任一技術(shù)獲得的干燥或凍干產(chǎn)品通常是粉末或餅狀形式的，并與所需氣體接觸(例如在瓶內(nèi))貯存。產(chǎn)品在合適的含水液態(tài)載體(是生理上可接受的、無菌的并且可注射的)內(nèi)容易重組，從而形成充氣微囊。合適的液態(tài)載體是水、含水溶液例如鹽水(它有益的是平衡的，從而最終的注射產(chǎn)品不是低滲的)，或一種或多種張力調(diào)節(jié)物(例如鹽或糖、糖醇、乙二醇或其它非離子多羥基化合物材料(例如葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、乙二醇、聚乙二醇、丙二醇等)的溶液。
微球適用于按照本發(fā)明組件的其它充氣微囊在本領(lǐng)域內(nèi)被稱作“微球”。通常，這些充氣微囊具有材料被膜，被膜的厚度大于微泡穩(wěn)定膜-被膜的厚度。根據(jù)形成所述被膜的材料(它可以是例如聚合的、蛋白質(zhì)的、水不溶性的脂質(zhì)、或者這些形式的任意組合)，所述厚度通常為至少50nm，一般為至少100nm，甚至高達幾百納米(例如300nm)。
在對超聲的聲響應(yīng)方面，微球通常也不同于微泡。雖然微泡的超聲行為事實上更接近于“游離”氣泡的行為，但是微球(可能是因為更高的被膜硬度)在低水平的聲壓能量(例如在約0.1的機械指數(shù))輻射時通常反應(yīng)極差(在所反射的回聲信號的強度方面)。
可用于制備本發(fā)明組件的微球?qū)嵗齼?yōu)選是具有聚合被膜(優(yōu)選包括可生物降解的聚合物)或基于可生物降解的水不溶性脂質(zhì)的被膜(例如US 5,711,933和US 6,333,021中描述的那些，這些文獻在此作為參考全部并入本文)的微球。也可采用具有蛋白質(zhì)被膜的微球，即用例如US-A-4,276,885或EP-A-0324938中描述的那些天然蛋白質(zhì)(白蛋白、血紅蛋白)制成的被膜。
形成可注射微球被膜的聚合物優(yōu)選是親水性、可生物降解的生理上相容的聚合物。這些聚合物(可以是天然的或合成的)的實例是基本上不溶的多糖(例如脫乙酰殼多糖或殼質(zhì))、聚氰基丙烯酸酯、聚交酯和聚乙交酯以及它們的共聚物、交酯和內(nèi)酯(例如γ-己內(nèi)酯或δ-戊內(nèi)酯)的共聚物、環(huán)氧乙烷和交酯的共聚物、聚乙烯亞胺、多肽和蛋白質(zhì)(例如明膠、膠原、球蛋白或白蛋白)。在上述US 5,711,933中提到的其它合適的聚合物包括聚-(原)酯、聚乳酸和聚乙醇酸以及它們的共聚物(例如DEXON、Davis & Geck，Montreal，Canada)；聚(DL-交酯-co-γ-己內(nèi)酯)、聚(DL-交酯-co-δ-戊內(nèi)酯)、聚(DL-交酯-co-γ-丁內(nèi)酯)、聚烷基氰基丙烯酸酯；聚酰胺、聚羥基丁酯；聚二噁酮；聚-β-氨基酮；聚磷腈；和聚酐。也可采用聚氨基酸(例如聚谷氨酸和聚天冬氨酸)以及它們的衍生物，例如與低級醇或二醇的部分酯。還可采用與其它氨基酸(例如蛋氨酸、亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸等)的共聚物。也可采用具有受控的生物降解性的聚谷氨酸和聚天冬氨酸的衍生物(例如WO87/03891、US4,888,398或EP 130935中描述的那些，這些文獻在此作為參考全部并入本文)。這些聚合物(以及與其它氨基酸的共聚物)具有如下類型的分子式(NH-CHA-CO)W-(NH-CHX-CO)Y-，其中X代表氨基酸殘基的側(cè)鏈(例如甲基、異丙基、異丁基或芐基)；A是以下分子式基團-(CH2)nCOOR1R2-OCOR、-(CH2)nCOO-CHR1COOR、-(CH2)nCO(NH-CHX-CO)mNH-CH(COOH)-(CH2)PCOOH，或者它們的相應(yīng)酸酐，其中R1和R2代表H或低級烷基，R代表烷基或芳基；或者R和R1由取代或未取代的連接成員連接在一起，從而提供5-或6-元環(huán)；n、m和p是不超過5的小整數(shù)；以及w和y是為了具有不低于5000的分子量而選擇的整數(shù)。
非生物降解的聚合物(例如用于制備在消化道使用的微球)可選自于最不溶于水的生理上可接受的生物抗性聚合物，包括聚烯烴(聚苯乙烯)、丙烯酸類樹脂(聚丙烯酸酯、聚丙烯腈)、聚酯(聚碳酸酯)、聚氨酯、聚脲和它們的共聚物。ABS(丙烯酰基-丁二烯-苯乙烯)是優(yōu)選的共聚物。
用于形成本發(fā)明組件的微球的可生物降解的水不溶性脂質(zhì)包括例如固態(tài)水不溶性單-、二-、三-甘油酯、脂肪酸、脂肪酸酯、甾醇例如膽固醇、石蠟以及它們的混合物。單-、二-、三-甘油酯主要包括單-、二-、三-月桂精化合物以及相應(yīng)的-肉豆蔻酸酯、-棕櫚酸酯、-硬脂酸酯、-花生四烯酸酯和-山萮酸酯衍生物。特別有用的是單-、二-、三-肉豆蔻酸酯、-棕櫚酸酯、-硬脂酸酯以及混合的三甘油酯例如二棕櫚一油酸三甘油酯；三棕櫚酸甘油酯和三硬脂酸甘油酯是優(yōu)選的。脂肪酸包括具有12個碳原子或更多碳原子的固態(tài)(在室溫下，約18-25℃)脂肪酸(優(yōu)選是飽和的)，包括例如月桂酸、花生四烯酸、山萮酸、棕櫚酸、硬脂酸、癸二酸、肉豆蔻酸、蠟酸、蜂花酸和芥酸以及它們的脂肪酸酯。優(yōu)選地，脂肪酸和它們的酯用于和其它甘油酯進行混合。
甾醇優(yōu)選地用于和其它甘油酯和/或脂肪酸進行混合，并選自于膽固醇、植物甾醇、羊毛甾醇、麥角甾醇等以及甾醇與上述脂肪酸的酯；然而，膽固醇是優(yōu)選的。
優(yōu)選的可生物降解的脂質(zhì)是三甘油酯例如三棕櫚精、三硬脂精或上述三甘油酯的混合物。
任選地，高達70％(按重量計)的可生物降解的聚合物(例如前面提到的那些)，可與形成微球被膜的可生物降解的水不溶性脂質(zhì)混合在一起。有益的是，也可采用離子聚合物(即其結(jié)構(gòu)中攜帶離子部分的聚合物)、優(yōu)選可生物降解的離子聚合物，以形成微球的穩(wěn)定被膜，由此將所需的總凈電荷賦予其上。離子聚合物可用作穩(wěn)定被膜的主成分，或者以不同的量(例如2-80％，按重量計)與非離子聚合物進行混合。合適的離子聚合物是例如包括季銨化氮原子的聚合物(例如季銨化胺)，或包括羧基、硫酸根、磺酸根或磷酸根部分的聚合物。合適的離子聚合物的實例包括(不限于)聚氮丙啶、聚(二烯丙基二甲基氯化銨)、聚{雙(2-氯乙基)醚-alt-1，3-雙[3-(二甲基氨)丙基]脲}季銨化(Polyquaternium-2)、聚(4-乙烯基吡啶三溴化物)、羥乙基纖維素乙氧基化物季銨化(Polyquaternium-4)、聚(p-二甲苯四氫噻吩氯化物)、聚(L-賴氨酸)、殼質(zhì)、二乙烯氨乙基葡聚糖、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚(苯乙烯-alt-馬來酸)、聚(氨基酸)、褐藻酸、聚(尿苷酸)、透明質(zhì)酸即聚(β-葡糖醛酸-alt-β-N-乙酰葡糖胺(clucosamide))、聚(半乳糖醛酸)、聚(乙酸乙烯酯-co-巴豆酸)、DNA、聚(3，3’4，4’-二苯甲酮四酸二酐-co-4，4’-氧聯(lián)二苯胺)、聚(異戊二烯-graft-馬來酸單甲基酯)、谷氨酸(glutammic acid)和烷基谷氨酸的共聚物、肝素、聚(苯乙烯磺酸酯)、磺化聚(異鄰苯二甲酸)、聚(乙烯基磺酸酯、鉀鹽)、聚(乙烯基硫酸酯、鉀鹽)、硫酸軟骨素A、葡聚糖硫酸鹽、巖藻依聚糖、聚磷酸、磷酸鈉、聚乙烯基磷酸鈉、聚-L-lisine氫溴化物、聚氨基葡糖、聚氨基葡糖硫酸酯、褐藻酸鈉、褐藻酸以及木素磺酸鹽。
常規(guī)添加劑也可并入微球被膜內(nèi)，以改進其物理特性例如分散性、彈性和水滲透性。尤其是，將有效量的兩性材料加入到為生產(chǎn)所述微球而制備的乳劑中，以便增大其穩(wěn)定性。所述材料可有益地在本說明書前面提到的那些兩性化合物(例如脂質(zhì)、磷脂和改性磷脂)中選擇。
所加入的兩性材料有益地是攜帶總凈電荷的化合物。優(yōu)選的帶電脂質(zhì)、磷脂和改性磷脂是前面提到的那些。
為了與MAC發(fā)生有效的靜電相互作用，微球被膜中帶電添加劑的總量應(yīng)該至少為形成所述被膜的材料總量的1％(按摩爾計)。然而，帶電組分的總量優(yōu)選低于形成微球被膜的材料總量的70％(按摩爾計)。帶電化合物的量優(yōu)選是2％-40％。
其它賦性劑或添加劑、尤其是用于制備微球的賦性劑和添加劑(例如再分散劑或增粘劑)，可并入被膜內(nèi)。
含有微球的可生物降解的聚合物可按照例如US 5,711,933中公開的工藝來制備，該文獻在此處引入作為參考，此工藝包括(a)將疏水性有機相乳化到水相，以便獲得所述疏水相液滴作為所述水相中的水包油乳劑；(b)將不溶于水相的揮發(fā)性溶劑中的至少一種聚合物溶液加入到所述乳劑中，從而所述聚合物形成圍繞所述液滴的一個層；(c)蒸發(fā)所述揮發(fā)性溶劑，以便聚合物通過圍繞液滴的界面沉淀而發(fā)生沉積，液滴然后形成具有由所述聚合物膜包裹的所述疏水相核心的珠，所述珠懸浮在所述水相中；(d)通過使所述懸浮液承受減小的壓力進行蒸發(fā)而除去所述包裹的疏水相；以及(e)用合適的氣體代替所述包裹的疏水相。
含有微球的可生物降解的脂質(zhì)能夠按照例如US 6,333,021中公開的工藝來制備(該文獻在此處引入作為參考)，即分散溶解在水相載體中的有機溶劑內(nèi)的微囊被膜的一種或多種固態(tài)組分的混合物。乳劑水相可含有有效量的用來穩(wěn)定乳劑的兩性材料。
一定量的再分散劑和/或防凍劑或凍干保護劑(例如前面提到的那些)然后在-30℃以下冷凍之前，加入到水相中的有機溶液微滴乳劑中。任何常規(guī)的再分散劑都可采用；選自以下物質(zhì)的再分散劑是優(yōu)選的糖、白蛋白、明膠、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)和環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷嵌段共聚物(例如Pluronic或Synperonic)或者它們的混合物。當微囊是非凝聚的、干燥和立即分散的粉末形式時，為了避免顆粒凝聚而加入的再分散劑尤其有用。冷凍乳劑然后承受減小的壓力，以便有效地凍干，即通過將有機溶劑從載體相液滴和水中升華出來而去除，然后使冷凍-干燥產(chǎn)品與干燥氣體接觸。
生物相容的氣體任何生物相容的氣體、氣體前體或它們的混合物都可用來填充上述微囊，氣體是根據(jù)所選形態(tài)選擇的。
氣體包括例如空氣；氮氣；氧氣；二氧化碳；氫氣；一氧化二氮；惰性氣體例如氦、氬、氙或氪；放射性氣體例如Xe133或Kr81；超極化惰性氣體例如超極化氦、超極化氙或超極化氖；低分子量烴(例如含有高達7個碳原子)，例如烷烴(例如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、異丁烷、戊烷或異戊烷)、環(huán)烷烴(例如環(huán)丁烷或環(huán)戊烷)、烯烴(例如丙烯、丁烯或異丁烯)或炔烴(例如乙炔)；醚；酮；酯；鹵化氣體，優(yōu)選氟化氣體，例如鹵化、氟化或全氟化低分子量烴(例如含有高達7個碳原子)；或任意這些前述物質(zhì)的混合物。當使用鹵化烴時，優(yōu)選所述化合物中的至少一些、更優(yōu)選所有鹵素原子是氟原子。
氟化氣體是優(yōu)選的，尤其是全氟化氣體，特別是在超聲成像領(lǐng)域中。氟化氣體包括含有至少一個氟原子的材料，例如氟化烴(含有一個或多個碳原子和氟的有機化合物)；六氟化硫；氟化、優(yōu)選全氟化酮例如全氟化丙酮；和氟化、優(yōu)選全氟化醚例如全氟化乙醚。優(yōu)選化合物是全氟化氣體，例如SF6或全氟化碳(全氟化烴)，即所有氫原子都被氟原子取代的烴，已知是為了形成特別穩(wěn)定的微泡懸浮液，如EP 0554 213中公開的，該文獻在此作為參考并入本文。
術(shù)語全氟碳包括飽和的、不飽和的以及環(huán)化全氟碳。生物相容的生理上可接受的全氟碳的實例是全氟烷烴，例如全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷(例如全氟-n-丁烷，任選地是與其它異構(gòu)體例如全氟-異丁烷的混合物形式)、全氟戊烷、全氟己烷或全氟庚烷；全氟烯烴，例如全氟丙烯、全氟丁烯(全氟丁-2烯)或者全氟丁二烯；全氟炔烴(例如全氟丁-2-炔)；以及全氟環(huán)烷烴(例如全氟環(huán)丁烷、全氟甲基環(huán)丁烷、全氟二甲基環(huán)丁烷、全氟三甲基環(huán)丁烷、全氟環(huán)戊烷、全氟甲基環(huán)戊烷、全氟二甲基環(huán)戊烷、全氟環(huán)己烷、全氟甲基環(huán)己烷和全氟環(huán)庚烷)。優(yōu)選的飽和全氟碳具有以下分子式CnFn+2，其中n為1-12，優(yōu)選2-10，更優(yōu)選3-8，甚至更優(yōu)選3-6。合適的全氟碳包括例如CF4、C2F6、C3F8、C4F8、C4F10、C5F12、C6F12、C6F14、C7F14、C7F16、C8F18和C9F20。
特別優(yōu)選的氣體是SF6或者選自以下物質(zhì)的全氟碳CF4、C2F6、C3F8、C4F8、C4F10或它們的混合物；SF6、C3F8或C4F10是特別優(yōu)選的。
還有益的是采用任何比例的任意上述氣體的混合物。例如，混合物可包括常規(guī)氣體(例如氮氣、空氣或二氧化碳)和形成穩(wěn)定微泡懸浮液的氣體(例如六氟化硫或如上所述的全氟碳)。合適氣體混合物的實例如在WO 94/09829中發(fā)現(xiàn)，該文獻在此作為參考并入本文。以下組合是特別優(yōu)選的氣體(A)和(B)的混合物，其中氣體(B)是氟化氣體，優(yōu)選選自SF6、CF4、C2F6、C3F6、C3F8、C4F6、C4F8、C4F10、C5F10、C5F12、或它們的混合物，(A)選自空氣、氧氣、氮氣、二氧化碳或它們的混合物。氣體(B)的量為混合物總量的0.5％-95％，優(yōu)選約5％-80％。
在某些環(huán)境中，期望包括氣態(tài)物質(zhì)的前體(即能夠在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成氣體的材料)。優(yōu)選地，氣體的前體及其衍生的氣體是生理上可接受的。氣體的前體可以是pH激活的、光激活的、溫度激活的等。例如，某些全氟碳可用作溫度激活的氣體前體。這些全氟碳(例如全氟戊烷和全氟己烷)具有室溫(或者試劑制備或貯存溫度)以上但體溫以下的液態(tài)/氣態(tài)轉(zhuǎn)變溫度；由此，它們發(fā)生液相/氣相轉(zhuǎn)變，并在人體內(nèi)轉(zhuǎn)變成氣體。
對于超聲回波掃描術(shù)，生物相容氣體或氣體混合物優(yōu)選地選自空氣、氮氣、二氧化碳、氦氣、氪氣、氙氣、氬氣、甲烷、鹵化烴(包括氟化氣體例如全氟碳和六氟化硫)或它們的混合物。有益的是，可采用全氟碳(特別是C4F10或C3F8、)或SF6、任選地是與空氣或氮氣的混合物形式。
為了在MRI中使用組件，微囊優(yōu)選包含超極化惰性氣體例如超極化氖、超極化氦、超極化氙或它們的混合物，任選地是與空氣、CO2、氧氣、氮氣、氦氣、氙氣或如上所述的任何鹵化烴的混合物形式。
對于閃爍掃描術(shù)，按照本發(fā)明的微囊優(yōu)選包含放射性氣體例如Xe133或Kr81或它們的混合物、任選地是與空氣、CO2、氧氣、氮氣、氦氣、氪或如上所述的任何鹵化烴的混合物形式。
微囊相結(jié)合組分(MAC)與微囊相結(jié)合的組件的第二組分(MAC)可以是包括攜帶總凈電荷的生物相容性表面活性劑的任何結(jié)構(gòu)實體。特別是，所述結(jié)構(gòu)實體優(yōu)選是通過多個(優(yōu)選兩性)分子的聯(lián)合而形成的超分子結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，所述帶電化合物與中性的其它表面活性劑和/或添加劑混合。根據(jù)組件的具體應(yīng)用，MAC還包括所需的靶向配體和/或診斷劑，并且任選地包括生物活性劑。適合制備按照本發(fā)明組件的MAC的生物相容性表面活性劑可選自前面列出的那些化合物，例如(C2-C10)有機酸、包括(C12-C24)、優(yōu)選(C14-C22)脂族鏈的有機脂肪酸、這些物質(zhì)的藥物可接受的(堿性)鹽、以及與聚氧乙烯的相應(yīng)酯，例如棕櫚酸、硬脂酸、花生四烯酸、油酸、十二烷酸鈉、草酸鈉或酒石酸鈉或聚氧乙烯脂肪酸硬脂酸鹽；聚離子(堿性)鹽，例如檸檬酸鈉、聚丙烯酸鈉、磷酸鈉；有機胺、酰氨、四價銨(鹵)鹽，優(yōu)選含有(C8-C22)碳氫鏈，包括它的聚氧乙基化衍生物，例如乙醇胺、三乙醇胺、烷基胺、鏈烷醇酰胺、氯化三甲基烷基胺、聚氧乙基化烷基胺、聚氧乙基化鏈烷醇酰胺；氨基酸；磷脂，例如磷脂酰膽堿、乙基磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸或鞘磷脂的脂肪酸二酯；單-或寡-糖與(C12-C24)、優(yōu)選(C14-C22)有機脂肪酸的酯，例如失水山梨糖醇月桂酸酯；聚合表面活性劑，即包括疏水性和親水性部分的嵌段共聚物，例如環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物；有機磺酸酯，例如堿性(例如鈉)(C12-C24)烷基、優(yōu)選(C14-C22)烷基磺酸鹽；全氟有機酸，例如全氟辛酸；以及這些物質(zhì)的混合物。優(yōu)選化合物是前面列在微泡的合適組分中的那些中性或帶電兩性材料，包括脂質(zhì)、磷脂和改性磷脂。優(yōu)選的MAC是膠束形式的。
MAC的制備可按照常規(guī)技術(shù)來實現(xiàn)，例如將形成MAC的相關(guān)組分分散在含水載體中并任選地洗滌所獲得的懸浮液，以便除去過量材料。
所述第二組分優(yōu)選是納米組分，即它們的相對尺寸約300nm或更小，優(yōu)選約200nm或更小，更優(yōu)選約100nm或更小，例如50nm或更小。MAC的尺寸、尤其是其按個數(shù)計的平均直徑，可按照常規(guī)技術(shù)(例如光子相干譜)來測定。例如，可采用ZetaSizer 3000Hsa(MalvernInstruments Gmbh)。MAC的尺寸優(yōu)選至少0.1nm，更優(yōu)選1nm。
優(yōu)選地，MAC具有比MAC相結(jié)合的微囊的平均尺寸至少小10倍或更小，更優(yōu)選的是至少小50倍或更小的平均尺寸。所述的平均尺寸通常不低于1000倍，優(yōu)選不低于500倍。
正如所理解的，由于MAC比充氣微囊的尺寸小得多，因此可將相當大量的MAC聯(lián)合到微囊上。由此，就使組件結(jié)合更多的靶向部分和/或增大并入其內(nèi)的可釋放治療劑或診斷劑的量而言，增加了組件的效力。此外，MAC的所述相當小的尺寸允許獲得可與微囊尺寸類似的尺寸的組件。事實上優(yōu)選的是，按照本發(fā)明組件的按個數(shù)計的平均直徑不高于在裝配之前測定的微囊的平均直徑的30％，更優(yōu)選的是不高于20％，甚至更優(yōu)選的是不高于10％。
在本發(fā)明的一些實施方案中，帶電材料可形成基本上MAC全體，即90％或更多(按摩爾計)。在一些其它實施方案中，優(yōu)選的是，形成所述MAC結(jié)構(gòu)的帶電分子不代表形成所述結(jié)構(gòu)的化合物全體，由此與一定量的中性化合物混合。所述帶電分子由此代表小于形成所述MAC的材料總量的90％(按摩爾計)。另一方面，申請人已經(jīng)觀察到，MAC中的帶電分子的量優(yōu)選至少是形成所述被膜的材料總量的0.5％(按摩爾計)，以便與帶電微囊有效作用。優(yōu)選地，所述量至少為1％，更優(yōu)選至少為2％(按摩爾計)。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案中，形成MAC結(jié)構(gòu)的帶電分子的量優(yōu)選約50％或更低，更優(yōu)選約20％或更低。
膠束如前所述，與本發(fā)明組件中的微囊相結(jié)合的優(yōu)選組分是膠束。如本文所用的術(shù)語“膠束”，包括膠束和混合膠束，在此處，術(shù)語混合膠束是指由兩種或更多種不同化合物的混合物形成的膠束結(jié)構(gòu)，其中至少一種化合物是能夠形成膠束結(jié)構(gòu)的兩性化合物。術(shù)語混合膠束由此在其含義內(nèi)也包括由至少一種化合物(優(yōu)選兩性化合物)形成的膠束，該化合物在如此分散到含水載體中時不能形成膠束結(jié)構(gòu)，但是在與適量的膠束形成兩性化合物結(jié)合使用時能夠形成所述結(jié)構(gòu)。混合膠束的實例是由未改性磷脂(在作為單一材料分散到含水載體中時通常不能形成膠束)和膠束形成化合物(例如，PEG改性的磷脂或脂肪酸鹽)形成的膠束。正如本領(lǐng)域內(nèi)公知的，當兩性分子的濃度超過被稱作CMC(臨界膠束濃度)的預(yù)定值時，分散在水中的兩性分子就形成膠束。在低于CMC的濃度，分子通常作為單一分子分散在水溶液中。在CMC之上，兩性分子傾向于在超分子結(jié)構(gòu)中有機化，從而與溶液中的游離分子平衡，所述超分子結(jié)構(gòu)的特征是，分子的疏水性(脂質(zhì))尾部向結(jié)構(gòu)的內(nèi)部定位，而分子的親水性(極性或離子)頭部位于結(jié)構(gòu)的外部上。兩性分子的CMC可以利用本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)標準在實驗上測定。例如，表面活性劑的CMC是通過將特性作為表面活性劑的濃度函數(shù)作圖而確定的。該特性經(jīng)常隨著表面活性劑濃度的增大(高達CMC)而呈線性變化，并且在此濃度之后，曲線(或特性)變成非線性的。能夠用于確定CMC的合適特性包括折射系數(shù)、光散射、表面張力、電導率、滲透壓等。為了本發(fā)明的目的，優(yōu)選的膠束形成材料是具有相當?shù)虲MC(例如約10mM或更低)的那些材料。
膠束一般有約0.1nm-約100nm，優(yōu)選的是約1nm-約50nm的尺寸。按個數(shù)計的平均直徑(DN)為約50nm或更小，優(yōu)選約20nm或更小，甚至更優(yōu)選10nm或更小，甚至下至例如1nm，優(yōu)選約2nm。
有關(guān)膠束、膠束系統(tǒng)及其制備方法的綜述可以在例如以下參考書中找到“藥物傳送中的表面活性劑和聚合物”(“Surfactants andPolymers in Drug Delivery”，by M.Malmsten，Ch.2，pp.19-50，Marcel dekker Inc.Ed.，2002)。
可用于形成與本發(fā)明組件中的微囊相結(jié)合的膠束的合適材料可選自前面列出的脂質(zhì)和磷脂材料。
膠束形成化合物的實例是PEG改性的磷脂，具體包括PEG改性的磷脂酰乙醇胺，例如DMPE-PEG2000、DMPE-PEG3000、DMPE-PEG4000、DPPE-PEG5000、DPPE-PEG2000、DPPE-PEG3000、DPPE-PEG4000、DPPE-PEG5000、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG3000、DSPE-PEG4000、DSPE-PEG5000、DAPE-PEG2000、DAPE-PEG3000、DAPE-PEG4000或DAPE-PEG5000；包括至少一個(C10-C20)、優(yōu)選(C14-C18)烷基鏈的烷基銨鹽，例如硬脂酰氯化銨、十六烷基氯化銨、二甲基雙十八烷基溴化銨(DDAB)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)；包括一個或優(yōu)選兩個通過(C3-C6)亞烷基橋連接到N原子上的(C10-C20)、優(yōu)選(C14-C18)?；湹娜齼r或四價銨鹽，例如1，2-二硬脂酰-3-三甲基氨-丙烷(DSTAP)、1，2-二棕櫚酰-3-三甲基氨-丙烷(DPTAP)、1，2-二油酰-3-三甲基氨-丙烷(DOTAP)、1，2-二硬脂酰-3-二甲基氨-丙烷(DSDAP)；脂肪酸鹽，優(yōu)選堿性的，特別是鈉鹽，例如棕櫚酸鈉、硬脂酸鈉、油酸鈉、亞油酸鈉、十二酸鈉、1，2-二棕櫚酰-sn-3-琥珀酰甘油鈉鹽或1，3-二棕櫚酰-2-琥珀酰甘油鈉鹽。
其內(nèi)包括疏水性部分和親水性部分的聚合物(也稱作“聚合表面活性劑”)也可用來制備膠束懸浮液。合適的聚合表面活性劑的實例包括但不限于聚環(huán)氧乙烷(PEO)、例如(C8-C16)n-烷基PEO單醚、(C8-C10)n-烷基苯基PEO、四甲基丁苯基PEO、PEO聚山梨酸酯、這些PEO在出售時的商品名為Brij、Lubrol、Triton、Nonidet或Tween；嵌段共聚物例如環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷嵌段共聚物(例如Pluronic或Synperonic)，優(yōu)選具有約3000-20000道爾頓的MW，更優(yōu)選5000-15000道爾頓的MW；糖衍生物，例如(C6-C10)n烷基-β-D-吡喃葡糖苷、(C8-C12)n烷基-β-D-麥芽糖苷；(C8-C16)烷基二甲基氨丙烷-磺酸鹽；和膽汁酸及其衍生物，例如膽酸鈉或脫氧膽酸鈉。
用于制備包括在本發(fā)明組件中的膠束的另外的脂質(zhì)包括例如未改性的磷脂，例如前面提到的磷脂酰膽堿、乙基磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸或鞘磷脂的脂肪酸二酯。由于這些未改性的磷脂在分散到含水載體中時通常不能形成膠束結(jié)構(gòu)(因為這些化合物在分散到水溶液中時傾向于作為脂質(zhì)體來聯(lián)合)，因此所述未改性的磷脂優(yōu)選以與前面提到的任何膠束形成化合物的混合物形式來使用。尤其是，它們的量應(yīng)該優(yōu)選為小于形成膠束結(jié)構(gòu)的化合物的混合物總重量的約80％，更優(yōu)選約70％或更小。按照一個優(yōu)選實施方案，膠束組分是用包括約30％-70％、優(yōu)選約40％-60％(按重量計)未改性磷脂的混合物形成的。混合物的剩余物可以是以上提到的任何膠束形成表面活性劑。
所需的總凈電荷由前面提到的任何帶負電荷或正電荷的化合物(尤其是脂質(zhì)或磷脂，包括改性磷脂)賦予膠束。
由此，適合將總負電荷賦予膠束的磷脂實例是磷脂酰絲氨酸衍生物，例如DMPS、DPPS、DSPS；磷脂酸衍生物，例如DMPA、DPPA、DSPA；磷脂酰甘油衍生物，例如DMPG、DPPG和DSPG。也可有益地采用改性磷脂，尤其是PEG改性的磷脂酰乙醇胺，例如DMPE-PEG750、-PEG1000、-PEG2000、-PEG3000或-PEG5000；DPPE-PEG750、-PEG1000、PEG2000、-PEG3000或-PEG5000；DSPE-PEG750、-PEG1000、PEG2000、-PEG3000或-PEG5000；DAPE-PEG750、-PEG1000、PEG2000、-PEG3000或-PEG5000；和上述磷脂的相應(yīng)溶血形式，例如溶血磷脂酰絲氨酸衍生物、溶血磷脂酸衍生物(例如溶血-DMPA、-DPPA或-DSPA)和溶血磷脂酰甘油衍生物(例如溶血-DMPG、-DPPG或-DSPG)。帶負電荷磷脂的實例是膽汁酸鹽例如膽酸鹽、脫氧膽酸鹽或甘氨膽酸鹽；和脂肪酸例如棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、1，2-二棕櫚酰-sn-3-琥珀酰甘油鹽或1，3-二棕櫚酰-2-琥珀酰甘油鹽。
優(yōu)選地，帶負電荷的化合物選自DPPA、DPPS、DSPG、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG5000或它們的混合物。
帶負電荷的組分一般與相應(yīng)的正抗衡離子相結(jié)合，所述抗衡離子可以是單-(例如堿金屬)、二-(例如堿土金屬)或三-價(例如鋁)?？购怆x子優(yōu)選地選自堿金屬陽離子例如Li+、Na+或K+，更優(yōu)選Na+。
適合將總正電荷電荷賦予膠束的磷脂實例是磷脂酰膽堿的酯，例如1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-乙基膽堿磷酸(乙基-DSPC)、1，2-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-乙基膽堿磷酸(乙基-DPPC)。負抗衡離子優(yōu)選鹵族離子，尤其是氯或溴。帶正電荷的脂質(zhì)實例有，包括至少一個(C10-C20)、優(yōu)選(C14-C18)烷基鏈的烷基銨鹽，或包括一個或優(yōu)選兩個通過(C3-C6)亞烷基橋連接到N原子上的(C10-C20)、優(yōu)選(C14-C18)?；湹娜齼r或四價銨鹽，例如前面列出的那些。
優(yōu)選將乙基-DPPC、乙基-DSPC、DSTAP或它們的混合物用作帶正電荷的化合物。
帶正電荷的組分一般與相應(yīng)的正抗衡離子相結(jié)合，所述抗衡離子可以是單-(例如鹵素)、二-(例如硫酸鹽)或三-價(例如磷酸鹽)。抗衡離子優(yōu)選選自鹵素離子，例如F-(氟)、Cl-(氯)或Br-(溴)。
而且，例如在前面微球形成材料部分中列出的那些離子聚合物可有益地用來形成具有總(負或正)凈電荷的膠束。
如上所述，帶電分子在一些實施方案中有益地與中性兩性化合物例如前面列出的那些兩性化合物(包括中性磷脂)混合，以形成所需的膠束結(jié)構(gòu)。與上述帶電化合物混合的優(yōu)選中性化合物是聚合表面活性劑，例如環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷嵌段共聚物例如Pluronic F68、Pluronic F108、Pluronic F-127(Sigma Aldrich，Missouri，USA)；聚氧乙基化烷基醚例如Brij78(Sigma Aldrich，Missouri，USA)；聚氧乙烯脂肪酸酯例如Myrj53或Myrj59(Sigma Aldrich，Missouri，USA)；聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯例如Tween60(Sigma Aldrich，Missouri，USA)；聚乙二醇叔-辛苯基醚例如TritonX-100(SigmaAldrich，Missouri，USA)；十二烷基硫酸鈉(SDS)。按照本發(fā)明的一個實施方案，膠束是用帶電兩性化合物與中性磷脂以及一種或多種上述中性化合物的混合物形成的。
在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案中，帶電表面活性劑的這個量形成基本上膠束全體(即膠束形成材料總重量的至少80％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選100％)。在一些其它優(yōu)選實施方案中，尤其是當形成膠束的至少一種化合物是未改性磷脂時，形成膠束的帶電表面活性劑的總量優(yōu)選約1％-80％，更優(yōu)選2％-50％。
膠束如本領(lǐng)域所公知的那樣是通過將上述化合物分散在含水液態(tài)載體中并任選地攪拌該混合物而制備的。合適液態(tài)載體的實例是水、鹽水溶液(0.9％的氯化鈉)、磷酸緩沖鹽水(10mM，pH7.4)、HEPES緩沖液(20mM，pH 7.4)、5％w/w的葡萄糖水溶液。例如，以上化合物可以約1-100mg/ml的濃度分散在含水液體中并借助于攪拌或超聲進行溶解。
膠束然后在與含有微囊的懸浮液混合或(如說明書的后面所詳細解釋的)分散到制備微囊的含水有機乳劑中之前，作為含水分散體(例如在用于其制備的含水載體中)貯存起來?；蛘呤?，微囊懸浮液按照常規(guī)技術(shù)凍干，以便消除液體并貯存最終的凍干產(chǎn)品，以便之后使用。
脂質(zhì)體作為MAC與按照本發(fā)明組件的微囊相結(jié)合的其它超分子結(jié)構(gòu)是脂質(zhì)體。術(shù)語脂質(zhì)體包括基本上為球形的包括脂質(zhì)化合物的兩性化合物凝聚體，一般是一個或多個同心層形式。它們一般是在含水懸浮液中形成的，并包含至少一個兩性化合物雙層。形成雙層的外層的兩性化合物的親水頭部指向球形結(jié)構(gòu)的外部，而形成雙層的內(nèi)層的兩性化合物的親水頭部指向所述球形結(jié)構(gòu)的內(nèi)部。脂質(zhì)體的球形結(jié)構(gòu)的內(nèi)部通常填充有相同的含水懸浮液的液體，其任選地含有不存在于(或存在的量較少)外部含水懸浮液中的附加化合物。
用于制備脂質(zhì)體的優(yōu)選材料是磷脂，例如前面列出的那些，其任選地是與前面列出的任何其它兩性化合物的混合物形式。
用作按照本發(fā)明組件中的MAC的優(yōu)選脂質(zhì)體是小單層囊泡(SUV)脂質(zhì)體。
例如，可如下獲得脂質(zhì)體(例如多層囊泡MLV-脂質(zhì)體)將磷脂溶解在有機溶劑中，然后在真空下蒸發(fā)該有機溶劑，從而獲得磷脂膜，最后在高于磷脂轉(zhuǎn)變溫度的溫度下將該膜水合。
SUV脂質(zhì)體可按照常規(guī)技術(shù)來形成，例如通過適當處理MLV(多層大囊泡)懸浮液、例如通過超聲、擠出或微流化。如上所述獲得的MLV由此暴露到超聲輻射中，從而獲得所需的SUV脂質(zhì)體。或者是，MLV可通過具有孔徑漸減(例如1.0、0.8、0.6、0.4和0.2μm)的多個膜(例如聚碳酸酯膜)擠出，然后通過具有更小孔徑的擠出機(例如LIPEX Biomembranes，Canada)，從而獲得最終的SUV。另一種替換的SUV制備工藝是，MLV可以在微流化機(例如來自MicrofluidicsCorporation)中于高壓下進行勻化，以便將脂質(zhì)體尺寸減小到約100nm或更小，這取決于脂質(zhì)體在微流化機中再循環(huán)的量。SUV的這些及其它制備方法例如公開在參考書“脂質(zhì)體，一種實踐方法”(“Liposomes，a practical approach”，Roger R.C.New編輯，牛津大學出版社，1989)中。
SUV脂質(zhì)體的尺寸一般為約25nm-約100nm，優(yōu)選約30nm-約100nm。按數(shù)目計的平均直徑可在約30nm-60nm，優(yōu)選約30-約50nm之間變化。
脂質(zhì)體及其制備方法的綜述也在上面提到的參考書中給出，即“藥物傳送中的表面活性以及聚合物”(“Surfactants and Polymers inDrug Delivery”，M.Malmsten著，第4章，第87-131頁，MarcelDekker Inc.Ed.，2002)。
作為MAC與本發(fā)明組件中的微囊相結(jié)合的其它結(jié)構(gòu)包括膠體納米顆粒，例如膠體金納米顆粒。這些納米顆粒一般通過如下步驟獲得將合適的分散劑加入到包括基本上不溶的固態(tài)納米顆粒的水溶液中，由此形成膠體納米顆粒的含水懸浮液(即用分散劑包被的固態(tài)納米顆粒)。例如，通過將具有檸檬酸鈉的金納米顆粒(具有約2-50nm的直徑)分散到水溶液中，而獲得膠體金納米顆粒(參見例如Grabar，“金膠體單層的制備和表征(Preparation and Characterization ofAu colloid monolayers)”，分析化學，第67卷，第735卷，1995)。與充氣微囊相結(jié)合的膠體金納米顆?？捎脕碓谖⒛曳至?例如由受控的高能超聲輻射所誘發(fā))時增大在所選組織中的滲透深度。由此，包括膠體金納米顆粒的組件例如能夠與包括生物活性劑的其它MAC相結(jié)合，以便增大所述生物活性劑在所選組織內(nèi)的滲透深度，由此提高療效。
其它MAC可以用固態(tài)聚合納米顆粒形成。這些固態(tài)聚合納米顆粒是用前面有關(guān)充氣微球的制備部分中列出的任意聚合材料形成的，因此包括可生物降解的生理上可接受的聚合物，例如基本上水不溶的多糖(例如脫乙酰殼多糖或殼質(zhì))、聚氰基丙烯酸酯、聚交酯和聚乙交脂以及它們的共聚物、交酯和內(nèi)酯(例如γ-己內(nèi)酯或δ-戊內(nèi)酯)的共聚物、環(huán)氧乙烷和交酯的共聚物、聚乙烯亞胺、多肽和蛋白質(zhì)(例如明膠、膠原、球蛋白或白蛋白)。其它合適的聚合物是在上述US5,711,933中提到的那些聚合物以及前面列出的那些聚合物。也可采用非生物降解的聚合物，尤其是水不溶的生理上可接受的生物耐受性聚合物，并且優(yōu)選以與任何以上生物降解聚合物的混合物形式來使用。所述聚合物可以是例如聚烯烴(例如聚苯乙烯)、丙烯酸樹脂(例如聚丙烯腈的聚丙烯酸酯)、聚酯(例如聚碳酸酯)、聚氨酯、聚脲以及它們的共聚物。ABS(丙烯酰-丁二烯-苯乙烯)是優(yōu)選的共聚物。
靶向配體和生物活性/診斷劑包括在MAC中的靶向配體可以是合成、半合成或天然生成的?？捎米靼邢蚺潴w的材料或物質(zhì)包括例如(但不限于)蛋白質(zhì)，包括抗體、抗體片段、受體分子、受體結(jié)合分子、糖蛋白和植物凝集素；肽，包括寡肽和多肽；肽模擬物；糖，包括單糖和多糖；維生素；類固醇、類固醇類似物、激素、輔因子、生物活性劑和遺傳材料，包括核苷、核苷酸和多核苷酸。
合適的靶物和靶向配體的實例如公開在US 6,139,819中，該文獻作為參考在此并入本文。
靶向配體本身可以是與包括在MAC最終結(jié)構(gòu)中的MAC組合物的其它組分混合的化合物，或者是結(jié)合到用于MAC形成的兩性化合物上的化合物。
在一個優(yōu)選實施方案中，靶向配體可以通過共價鍵結(jié)合到MAC的兩性分子上。在這樣的情況下，需要存在于兩性分子上的特異性反應(yīng)部分將取決于結(jié)合到其上的特定靶向配體。例如，如果靶向配體可通過氨基連接到兩性分子上，那么兩性分子的合適反應(yīng)性部分可以是異硫氰基(將形成硫脲鍵)、活性酯(用于形成酰氨鍵)、醛基(用于形成被還原為烷基胺鍵的亞胺鍵)等；如果靶向配體可通過硫羥基連接到兩性分子上，那么兩性分子的合適互補反應(yīng)部分包括鹵乙?；苌锘蝰R來酰亞胺(用于形成硫醚鍵)；以及如果靶向配體可通過羧基連接到兩性分子上，那么兩性分子的合適反應(yīng)部分可能是胺和酰肼(用于形成酰胺或烷基酰胺鍵)。為了共價結(jié)合所需的靶向配體，形成MAC的至少部分兩性化合物由此應(yīng)該含有合適的反應(yīng)部分，并且含有互補官能部分的靶向配體將按照公知技術(shù)，例如通過將其加入到包括MAC的兩性組分的含水分散體中而連接到其上。兩性化合物可以在制備MAC之前與所需的靶向配體合并，如此獲得的組合可用于MAC的制備工藝中?；蛘呤?，靶向配體在MAC的制備工藝過程中可連接到各自的兩性化合物上，或者可直接連接到已經(jīng)在膠束結(jié)構(gòu)中的兩性化合物上。
按照一個替換型實施方案，靶向配體也可以經(jīng)由物理和/或靜電相互作用適當聯(lián)合到MAC上。例如，對互補部分具有高親和力和選擇性的官能部分可以引入到兩性分子中，而互補部分將連接到靶向配體上。例如，親和素(或鏈霉親和素)部分(對生物素具有高親和力)可共價連接到磷脂上，而互補的生物素部分可以并入合適的靶向配體(例如肽或抗體)中。生物素標記的靶向配體由此將借助于親和素-生物素偶合系統(tǒng)聯(lián)合到MAC的親和素標記的磷脂上?；蛘呤?，磷脂和靶向配體都配有生物素部分，然后借助于親和素(是能夠橋接這兩個生物素部分的雙官能組分)彼此偶合。磷脂和肽的生物素/親和素偶合實例也公開在上述US 6,139,819中。或者是，范德華作用、靜電相互作用及其它相關(guān)方法可以將靶向配體聯(lián)合或結(jié)合到兩性分子上。
按照一個替換型實施方案，靶向配體可以是與形成MAC的組分混合以便最終并入MAC結(jié)構(gòu)的化合物，例如國際專利申請WO 98/18501或99/55383中公開的脂肽，這兩篇文獻作為參考在此并入本文。
或者是，首先制備MAC，其包括具有能夠與靶向配體的相應(yīng)互補部分作用的合適部分的化合物；此后，將所需的靶向配體加入到MAC懸浮液中，以便結(jié)合到MAC上的相應(yīng)互補部分上。另一替換形式是，可制備組件，其包括具有能夠與靶向配體的相應(yīng)互補部分相互作用的合適部分的化合物的MAC；此后，將所需的靶向配體加入到組件懸浮液中，以便結(jié)合到MAC的相應(yīng)部分上。
組件所指向的合適特異性靶物實例是例如纖維蛋白和激活血小板上的GPIIbIIa結(jié)合受體。纖維蛋白和血小板事實上通常以“血栓”的形式存在，即可以在血流中形成并導致血管阻塞的凝固物。合適的結(jié)合肽例如公開在上述US 6,139,819中。專門靶向纖維蛋白的其它結(jié)合肽例如公開在國際專利申請WO 02/055544中，該文獻作為參考在此并入本文。
重要靶物的其它實例包括易致病斑中的受體和腫瘤特異性受體，例如激酶活動域(KDR)和VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)/KDR復(fù)合物。適用于KDR或VEGF/KDR復(fù)合物的結(jié)合肽例如公開在國際專利申請WO03/74005或WO 03/084574中，這兩篇文獻作為參考在此并入本文。
并入本發(fā)明組件的MAC中或與其相結(jié)合的診斷劑可以是使與診斷技術(shù)有關(guān)的成像增強的任何化合物、組合物或顆粒，所述診斷技術(shù)包括磁共振成像、X-射線(尤其是計算機化X線斷層照相術(shù))、光學成像、核成像或分子成像。合適診斷劑的實例如是磁鐵礦納米顆粒、碘化化合物(例如Iomeprol)或順磁離子復(fù)合物(例如疏水釓復(fù)合物)。例如，磁鐵礦納米顆粒能夠與例如前面提到的那些帶負電荷的兩性材料(以及任選地還有中性材料)混合，以便穩(wěn)定所述顆粒并保持其分散在含水溶液中。US 5,545,395(該文獻作為參考在此引入本文)給出制備所述穩(wěn)定化磁鐵礦顆粒的一些實例，例如通過采用用于穩(wěn)定所述顆粒的DPPA和Pluronic的混合物?；蛘呤牵弿?fù)合物可與適當?shù)哪z束形成化合物(例如歐洲專利EP 804 251中公開的那些，該文獻作為參考在此引入本文)混合，以形成含有釓的MAC。
本發(fā)明的組件還可包括含有生物活性劑、與其相結(jié)合的組分。所述組分可含有如上定義的靶向配體和/或診斷劑，或者是包括生物活性劑的單獨組分。可任選地包括在本發(fā)明組件的MAC中的生物活性劑包括能夠用于病人的任何病理狀態(tài)(包括疾病、痛苦、疾病傷害或損傷)治療(包括包括診斷、抑制、緩解、減輕疼痛或治愈)的任何化合物或材料。生物活性劑的實例是前面列出的那些。在這些物質(zhì)中，藥物或藥品是優(yōu)選的，尤其是包括基本上是疏水的或者含有基本上疏水的相關(guān)部分的有機分子(一般是合成分子)的那些藥物。這些分子事實上可相當容易地并入MAC的結(jié)構(gòu)中，尤其是膠束的結(jié)構(gòu)中，因為它們與形成MAC的兩性材料的親脂(或疏水)部分具有親和力。例如，有機分子能夠分散在含有形成MAC、尤其是膠束的兩性材料的含水載體中，在此處其通過親和摻入到MAC的疏水部分中?；蛘呤牵H水藥物或有機分子也可并入MAC，尤其是在后者是脂質(zhì)體形式的時候。在這種情況中，所述親水化合物優(yōu)選地包含在脂質(zhì)體的內(nèi)部含水部分中。
可并入或聯(lián)合到MAC結(jié)構(gòu)上的藥物實例是例如上述WO 99/53963中提到的那些，因此包括抗癌劑例如長春新堿、長春花堿、長春地辛、白消安、瘤可寧、螺鉑、順鉑、碳鉑、甲氨蝶呤、阿霉素、絲裂霉素、爭光霉素、阿糖胞苷、阿拉伯糖腺嘌呤、巰嘌呤、氯苯二氯乙烷、丙卡巴肼、放線菌素D、(antinomycin D)、柔紅霉素、鹽酸阿霉素、紫杉酚、光輝霉素、氨魯米特、癌腺治、氟他胺、亮丙瑞林、醋酸甲地孕酮、他莫西芬、去氫睪內(nèi)酯、曲洛司坦、安丫啶(m-AMSA)、門冬酰胺酶(Lasparagiase)、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷、干擾素a-2a和2b、血液產(chǎn)品例如血卟啉或前述物質(zhì)的衍生物；生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑例如胞壁酰肽；抗真菌劑例如酮康唑、制霉菌素、灰黃霉素、氟胞嘧啶、咪康唑或兩性霉素B；激素或激素類似物例如生長激素、促黑激素、雌二醇、雙丙酸倍氯米松、倍他米松、醋酸可的松、地塞米松、氟尼縮松、氫化可的松、甲強龍、醋酸帕拉米松、氫化潑尼松、潑尼松、曲安西龍或醋酸氟氫可的松；維生素例如維生素B12或維生素A；酶例如堿性磷酸酶或超氧化錳岐化酶；抗過敏劑例如amelexanox；抗凝劑例如華法令、苯丙香豆素或肝素；抗血栓劑；循環(huán)藥物例如普奈洛爾；代謝增強劑例如谷胱甘肽；抗結(jié)核藥例如p-氨基水楊酸、異煙肼、硫酸卷曲霉素、cyclosexine、乙胺丁醇、乙硫異煙肼、吡嗪酰胺、利復(fù)平或硫酸鏈霉素；抗病毒劑例如阿昔洛韋、金剛烷胺、疊氮胸苷、利巴韋林或阿糖腺苷；血管擴張劑例如地爾硫桌、硝苯地平、異博定、四硝赤醇、硝酸異山梨酯、硝酸甘油或硝酸戊四醇酯；抗生素例如氨苯砜、氯霉素、新霉素、頭孢克羅、頭孢羥氨卞、先鋒霉素IV、頭孢拉定、紅霉素、氟林肯霉素、林可霉素、阿莫西林、氨卞青霉素、巴氨西林、羧芐西林、雙氯西林、環(huán)西林、picloxacillin、表縮酮氨卞青霉素、二甲氧基苯青霉素、乙氧奈胺青霉素、青霉素或四環(huán)素；消炎藥例如氟苯水楊酸、布洛芬、吲哚美辛、meclefenamate、甲芬那酸、萘普生、保泰松、炎痛喜康、托美汀、乙酰水楊酸或水楊酸鹽；抗原蟲劑例如氯喹、甲硝唑、奎寧或銻酸葡胺；抗類風濕藥例如青霉胺；麻醉藥例如復(fù)方樟腦酊；鴉片類例如可待因、嗎啡或阿片；強心苷例如西地蘭、洋地黃毒苷、地高辛、洋地黃苷或洋地黃；神經(jīng)肌肉阻斷劑例如甲磺酸阿曲庫銨、加拉碘胺、溴化己芴胺、碘二甲箭毒、溴化潘侃朗寧、氯化琥珀酰膽堿、氯化筒箭毒堿或維庫溴胺；鎮(zhèn)靜劑例如阿米妥、阿米妥鈉、阿魯賴特、仲丁比妥鈉、水合氯醛、乙氯戊炔醇、炔己蟻胺、鹽酸氟西洋、導眠能、鹽酸甲氧異丁嗪、諾盧達、鹽酸咪達唑侖、副醛、戊巴比妥、司可巴比妥鈉、塔布布妥、替馬西洋或三唑侖；局部麻醉劑例如左布比卡因、氯普魯卡因、依替卡因、利多卡因、甲哌卡因、普魯卡因或丁卡因；全身麻醉劑例如氟哌利多、依托咪脂、具有氟哌利多的枸櫞酸芬太尼、鹽酸氯胺酮、美索比妥鈉或硫噴妥以及藥物可接受的鹽(例如，例如鹽酸或氫溴酸類的酸加成鹽，或者例如鈉、鈣或鎂鹽之類的堿鹽)或其衍生物(例如醋酸鹽)；和放射性化學物質(zhì)例如包括α-、β-或γ-發(fā)射劑例如177Lu、90Y或131I。尤其重要的是抗血栓劑例如肝素和具有肝素樣活性的藥劑，例如抗凝血酶III、雙肽肝素和依諾肝素；血小板凝集抑制劑例如噻氯匹定、乙酰水楊酸、雙嘧達莫、伊洛前列素和阿昔單抗；以及溶栓酶例如鏈激酶和纖維蛋白溶解酶原激活素。生物活性劑的其它實例包括遺傳材料例如核酸、天然或合成來源的RNA和和DNA(包括重組RNA和DNA)。正如以上專利中提到的，編碼某些蛋白質(zhì)的DNA可用于治療許多不同種類的疾病。例如可提供腫瘤壞死因子或白介素-2以治療晚期癌癥；胸苷激酶治療卵巢癌或腦腫瘤；白介素-2治療成神經(jīng)細胞瘤、惡性黑素瘤或腎癌；以及白介素-4可治療癌癥。
組件為了評估本發(fā)明組件的相對組成，申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，微囊和MAC中的帶電化合物的量(表示為“電荷當量”)和微囊及組件懸浮液的ζ-電勢是有用的。
術(shù)語“電荷當量”(EC)，表示每摩爾所述化合物的電荷數(shù)。由此，一摩爾一價離子化合物含有一個EC，一摩爾二價離子化合物含有2個EC等。
ζ-電勢(零電勢)，也稱作動電勢，是膠體顆粒相對于長距離的塊介質(zhì)電勢的電勢。按照常規(guī)的微型電穿孔分析方法、例如通過利用激光-多普勒-風力測定法測定驅(qū)動電場中的顆粒速度，來測定ζ-電勢。例如，可有益地采用ZetaSizer 3000Hsa(Malvern InstrumentGmbH)。實踐中，首先測定微囊的初始懸浮液的ζ-電勢，該電勢可具有正值或負值，這取決于微囊是含有帶正電荷的化合物還是含有帶負電荷的化合物。然后，測定含有組件的最終懸浮液的ζ-電勢(即，在用于去除可能的未結(jié)合MAC的必需洗滌步驟之后)。通常，與微囊符號相反的MAC的加入，決定懸浮液的ζ-電勢絕對值或多或少地減小。具體地說，包括帶正電荷的微囊的懸浮液將顯示在加入帶負電荷的MAC懸浮液后ζ-電勢減小，而包括帶負電荷的微囊的懸浮液將顯示，在加入帶正電荷的MAC懸浮液后ζ-電勢相對增大(即絕對值減小)。正如申請人所觀察的，優(yōu)選的組件是顯示絕對值相對于初始微囊懸浮液的ζ-電勢明顯減小，即至少減小所述初始值的50％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少90％的那些懸浮液。特別優(yōu)選的組件懸浮液是顯示基本上中性ζ-電勢(即0±10mV，對應(yīng)于微囊懸浮液的初始電勢絕對減小約100％)或符號與初始微囊懸浮液的ζ-電勢相反的ζ-電勢的那些懸浮液。正如申請人所觀察的，當組件懸浮液的ζ-電勢相對于初始微囊懸浮液的ζ-電勢絕對減小不超過50％時，這表示沒有足夠數(shù)目的MAC聯(lián)合到微囊上。
按照一個優(yōu)選實施方案，組件中的帶電MAC的量如此將基本上中性的ζ-電勢賦予所述組件，或者將符號與微囊的ζ-電勢相反的ζ-電勢賦予組件。正如申請人所觀察的，為了獲得所述中性或符號與組件的ζ-電勢相反的ζ-電勢，組件不必包含來自MAC的過量電荷當量。事實上，已經(jīng)觀察到，包括正微囊和負MAC并具有約1∶5(即，微囊上的正電荷過量5倍)的、MAC的EC與微囊中相反電荷當量之比的組件，仍然顯示基本上中性或負的ζ-電勢。雖然不希望界定于任何具體的理論，但是猜測，包括在MAC中的(負)電荷位于組件的外表面上；如果與微囊相結(jié)合的MAC的數(shù)目足夠高，那么微囊上過量的(正)相反電荷可導致至少部分被所述MAC掩蔽。由此，因為在顆粒上測定的ζ-電勢受存在于所述顆粒外邊界上的電荷的強烈影響，所以，如果帶(負)電荷的MAC的量足以部分掩蔽微囊的(正)電荷的話，甚至具有派生于微囊的過量電荷(正)當量的組件也可顯示負ζ-電勢。以上所有內(nèi)容當然也可應(yīng)用于由帶負電荷的微囊和帶正電荷的MAC形成的組件。
通常，在組件的最終懸浮液中微囊上的EC與MAC上的電荷EC之比，可以在約10∶1-約1∶10之間變化。按照一個優(yōu)選實施方案，在所形成的組件中微囊/MAC的EC之比優(yōu)選約3∶1或更小，更優(yōu)選約2∶1或更小，甚至更優(yōu)選約3∶2或更小。根據(jù)形成微囊和MAC的帶電化合物的量，所述比例當然更低，例如約1∶1，并且下至例如約1∶4或更小。
鑒于MAC的尺寸相當小，因此組件的尺寸(按數(shù)目計的平均直徑)一般為約10μm或更低，并且通常為約1μm或更高。按照本發(fā)明組件的優(yōu)選尺寸是約1μm-約8μm，更優(yōu)選約2μm-約5μm。
按照本發(fā)明的另一實施方案，多層組件可通過使具有交替電荷的充氣微囊與多層組分相結(jié)合而形成。由此，例如，有可能使具有正電荷的第一層組分(例如膠束)與帶負電荷的微囊相結(jié)合；然后可以使具有負電荷的第二層組分(例如還是膠束或者脂質(zhì)體)與此組件相結(jié)合等等。雖然第一層組分與微囊的聯(lián)合導致ζ-電勢的絕對值(相對于在單一微囊懸浮液上測定的ζ-電勢)減小，但是第二層組分(具有與第一組分相反的電荷)的進一步聯(lián)合將導致ζ-電勢再次向更接近于單一微囊懸浮液的值變化。
按照第一種制備方法，可通過將包括微囊的含水懸浮液(按照以上提到的任何制造方法獲得)與包括組件的第二組分的含水懸浮液(按照以上提到的任何制造方法獲得)進行混合，而獲得組件。
任選地，如此獲得的混合物可進行一個或多個洗滌步驟，以便除去過量的未聯(lián)合組分。洗滌可通過利用合適的洗滌溶液(例如蒸餾水、磷酸鹽緩沖鹽水、Tris/甘油緩沖液、鹽水或5％的葡萄糖溶液)、按照任何常規(guī)洗滌技術(shù)來實施。由此使包括本發(fā)明組件的被洗混合物相(通常是上層相)分開并收集起來；任選地，將回收的含有組件的懸浮液在使用之前，用例如以上提到的任何生理上可接受的載體進行最后稀釋。
包括本發(fā)明組件的懸浮液在形成之后可以貯存起來，以便隨后施用，或者直接施用。如果需要的話，可去除懸浮液的液態(tài)載體(例如通過凍干)，從而獲得干粉形式的組件，組件在重組之前能夠貯存相當長的時間(優(yōu)選地是在適合重組之后形成充氣微囊的氣體的存在下)。
或者是，組件的兩個組分可作為干燥形式(例如凍干)的單獨組分貯存，并在施用之前重組為懸浮液。為了貯存，干燥組分優(yōu)選地保持在與水重組之后將形成微囊的氣體環(huán)境中。與含水液態(tài)載體的重組可單獨發(fā)生在包括組件的各自組分的兩個干燥組合物上，由此獲得兩個單獨的懸浮液，隨后將這兩個懸浮液進行混合，從而獲得所需的組件懸浮液?；蛘呤牵@兩個干燥組合物可以混合在一起，然后與含水液態(tài)載體重組為一個懸浮液。在后一種情形中，組件的混合組分是在與含水液態(tài)載體重組之后將形成微囊的氣體的存在下貯存的。按照一個優(yōu)選實施方案，干燥的MAC組合物首先與生理上可接受的含水載體重組，所獲得的懸浮液然后用于重組干燥的微囊組合物，從而最終獲得組件懸浮液。
以上任何制備方法也可用于制備如上所述的多層組件，即首先將帶電充氣微囊與具有相反電荷的第一組分混合，然后將所形成的組件與具有與微囊相同電荷的第二組分混合。
為了用兩個單獨的微囊和MAC制劑制備組件，有益的是，相對于最終組件中所需的MAC的相對量加入過量的MAC，這具體是因為一定量的所述MAC可以在組件懸浮液的任選洗滌步驟過程中去除。通常，優(yōu)選的是，用于制備MAC的組合物中的EC量至少基本上等于用于制備微囊的組合物中的EC(即EC之比為大約1∶1)。優(yōu)選地，所述EC之比大約為2∶1或更高，更優(yōu)選至少大約3∶1或更高，甚至高達例如30∶1。
按照一個優(yōu)選實施方案，將MAC(特別是如上定義的膠束)的含水懸浮液加入到包括磷脂和凍干保護劑、按照以上提到的WO04/069284中公開的方法制備的含水/有機乳劑中。在這種情況中，帶電MAC將與包圍乳劑微滴的兩性材料的相反電荷層相結(jié)合。MAC通常以這樣的量加入即，使MAC中的電荷當量與懸浮液微囊中的EC之比至少為大約1∶2或更高，優(yōu)選2∶3或更高，甚至更優(yōu)選至少1∶1或更高，甚至高達例如10∶1。同樣，MAC的含水懸浮液可加入到氣體微泡分散體中，所述分散體是通過在所需氣體的存在下使包括磷脂(以及任選地還包括其它兩性成膜化合物和/或添加劑)的含水介質(zhì)承受受控的高攪拌能量而獲得的(如前所述)。
混合物的冷凍干燥使得所需組件成為凍干粉末，將該粉末與所需氣體接觸貯存，隨后通過加入含水載體而重組為生理懸浮液。
與貯存的凍干產(chǎn)品(組件、微囊和/或MAC)接觸的氣體可存在于基本上為大氣壓(例如約1020mbar+/-5％)或低于大氣壓的壓力(例如900mbar或更低)下的貯存容器中，如歐洲專利申請EP 1228770中所公開的。
凍干造影劑重組之后的可注射組合物，應(yīng)該盡可能地與血液等滲。因此，在注射之前，少量的等滲劑也可以加入到包括本發(fā)明組件的懸浮液中。等滲劑是藥物中通用的生理溶液，例如含水鹽溶液(0.9％的NaCl)、2.6％的甘油溶液或5％的葡萄糖溶液。含水懸浮液的重組通常是通過將氣體貯存的干燥成膜表面活性劑簡單溶解并平緩攪拌而獲得的。
重組液的體積和濃度可按需平衡，從而獲得的備用藥劑基本上等滲。因此，重組流體的體積和濃度的選擇將取決于存在于凍干產(chǎn)品中的穩(wěn)定劑(以及其它填充劑)的種類和用量。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，按照本發(fā)明的組件在制備用于不同目的的不同組件時具有相當大的靈活性。事實上，用于超聲診斷/治療方法的基本載體組分的結(jié)構(gòu)(即微囊)無需進行任何具體修改，由此避免了所述組分穩(wěn)定性方面的缺陷。這樣的組分僅需要在其被膜上具有總凈電荷，而且通過利用通常用于形成所述被膜的常規(guī)材料可容易地獲得該結(jié)果。事實上，微囊與MAC之間的靜電相互作用使得兩個組分之間有效聯(lián)合，而無需修改微囊的結(jié)構(gòu)。另一方面，組件的第二組分，即其穩(wěn)定性對其組成的改變非常不敏感的組分，通過聯(lián)合所需的靶向配體和/或生物活性化合物于其上，能夠容易地適合組件所要求的具體目的。而且，由于MAC相對于微囊的尺寸相當小，因此可將相當多的MAC聯(lián)合到每個微囊上，由此提高系統(tǒng)的效率。
此外，組件的微囊可容易地與多種不同的納米組分相結(jié)合，由此獲得“多用途”或“混合物”組件。具體地說，帶電微囊(例如帶正電荷)的單一制劑可用作與任何所需類型的攜帶相反電荷(例如負電荷)的MAC相結(jié)合的載體?；蛘呤?，通過制備如前所述的多層組件(其中帶相反電荷的不同組分是作為交替層圍繞微囊設(shè)置的)，也可獲得多用途組件。與微囊相結(jié)合的不同MAC在其化學組成或超分子結(jié)構(gòu)(例如膠束-脂質(zhì)體)方面，以及在包含在其內(nèi)的靶向配體、診斷劑和/或生物活性劑方面可以是不同的。有益的是，多用途組件將包含這些方面的任意組合。例如，微囊組分可與在其結(jié)構(gòu)中包括至少一種靶向配體(能夠連接到與病理狀態(tài)或疾病有關(guān)的特定受體上)的第一納米組分(例如膠束形式的)合并，以及與包括第二靶向配體或生物活性化合物(例如用于治療所述病理狀態(tài)或疾病的治療化合物)的第二納米組分(例如膠束形式或脂質(zhì)體形式)合并。當采用包括“靶向配體攜帶組分”和“生物活性化合物攜帶組分”的組合的組件時，尤其是在制備“多層組件”時，攜帶靶向配體的組分作為最后組分優(yōu)選單獨與充氣微囊相結(jié)合，以便使組件具有有效的靶向活性。多用途組件的一個實例如是這樣的組件該組件包括充氣微囊、包括結(jié)合到腫瘤特異性受體上的膠束形式的第一組分和包括用于治療腫瘤的放射性化學物質(zhì)(結(jié)合到膠束形成化合物上或者并入脂質(zhì)體內(nèi))的第二組分。
本發(fā)明的組件由此可用于各種診斷和/或治療方法。
例如，包括具有合適靶向配體的MAC的組件可用來靶向特定器官或組織，然后，按照常規(guī)的超聲成像技術(shù)對所述器官或組織有選擇地進行成像，因為結(jié)合到所述器官或組織上的充氣微囊使得成像增強。如果診斷劑(例如用于MRI)也包括在組件中，那么可利用綜合診斷技術(shù)。而且，如果生物活性劑包括在組件中(例如包括在脂質(zhì)體中)，那么通過應(yīng)用能夠損壞充氣微囊的受控聲功率，可促使所述生物活性劑超聲介導釋放在所選靶物(例如靶向配體結(jié)合在此處)上，這正如例如WO 99/39738中所公開的，該文獻作為參考在此并入本文。
當然，本發(fā)明的組件還可一起含有攜帶靶向配體或藥物活性劑的組分和不含所述化合物、用于例如平衡組件的總電荷的組分。
如前所述，還觀察到，為了形成按照本發(fā)明的組件，組分、尤其是多個膠束與充氣微囊的聯(lián)合，將導致所述微囊的抗壓性增強。例如，觀察到，顯示約500mm Hg的PC50(即，使微囊群中的50％以上微囊損壞的臨界壓力)的微囊，當聯(lián)合到不同種類的膠束上以形成本發(fā)明的組件時，可將PC50值增大到至少600mm Hg，甚至高達約800mm Hg。
試劑盒本發(fā)明另一方面涉及一種診斷試劑盒，該試劑盒包括本發(fā)明的組件或者其各自的單獨組分，任選地還包括含水液態(tài)載體。
按照第一實施方案，所述試劑盒是包括本發(fā)明的組件同時包括含水液態(tài)載體的二組分試劑盒。所述二組分試劑盒能夠包括兩個單獨的容器或雙室容器。
在前一種情形中，第一容器優(yōu)選是常規(guī)的隔膜密封瓶，其中包含作為與所需氣體接觸的凍干殘余物的組件(按照上述任何方法獲得)的小瓶，用隔膜密封，載體液體可通過該隔膜進行注射，以便重組充氣微囊/MAC組件懸浮液。載體液體包含在優(yōu)選采取注射器形式的第二容器內(nèi)。注射器優(yōu)選地用重組懸浮液重新填充，并且隨后通過注射用來施用造影劑。與所形成的組件不同的是，第一容器也可含有單獨凍干的MAC和微囊組合物的混合物，進而在用含水載體重組之后將形成所需的組件。雖然通常手搖容器能夠提供重組懸浮液所需的能量，但是可配備用于直接或允許將足夠的能量用于容器的裝置(例如Vortex混合器)，以便確保組件懸浮液進行適當重組。雙室容器優(yōu)選是雙室注射器，其中組分例如借助于可去除的隔膜保持隔離，并且一旦凍干物通過平緩搖動而發(fā)生重組，容器就可直接用于注射造影劑。與前面一樣，可配備用于直接或允許將足夠的能量用于容器的裝置。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，能夠以無菌方式將干粉與含水溶液合并的其它二室重組系統(tǒng)也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在這些系統(tǒng)中，特別有益的是，如果將含水相置于水不溶性氣體與環(huán)境之間，可以延長產(chǎn)品的有效期。
按照另一實施方案，本發(fā)明的試劑盒是包括MAC組合物、微囊組合物并任選地包括含水載體的至少二組分試劑盒。
這些優(yōu)選地是作為至少兩個單獨容器存在的，第一個含有凍干微囊組合物(例如與所需氣體接觸)，第二個含有所需的凍干MAC組合物(任選地與所需氣體接觸或者在真空下)。有益的是，試劑盒中可包括含有用于重組的含水載體的第三任選容器。如果需要的話，試劑盒中可包括含有其它凍干MAC組合物的附加容器。為了施用，MAC懸浮液首先在含水載體中重組，然后，所獲得的懸浮液用于重組微囊組合物，由此形成所需的組件懸浮液。
不需要特殊容器瓶或連接系統(tǒng)，本發(fā)明可采用常規(guī)容器、瓶或適配器。僅要求塞子與容器之間良好密封。因此，密封質(zhì)量是首要的關(guān)注因素；密封完整性的任何退化都能夠使不需要的物質(zhì)進入瓶內(nèi)。除了確保無菌之外，真空保持度對于在周圍環(huán)境或減小的壓力下塞好的產(chǎn)品也是至關(guān)重要的，以確保安全、合適的重組。形成容器氣密封接的塞子材料優(yōu)選是彈性化合物或基于彈性體(例如聚(異丁烯)或丁基橡膠)的多組分藥劑?？杀憷厥褂脕碜訢aiko Seiko Itd.的丁基橡膠塞。
具體實施例方式
實施例在這些實施例中用到以下材料PBS 磷酸鹽緩沖鹽水10mM的磷酸鈉，0.9w/w NaCl，pH＝7.4Tris緩沖液 Tris緩沖鹽水10mM的Tris(羥甲基)氨甲烷，0.9w/w NaCl，pH＝7.4
HEPES緩沖液 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙基磺酸(20mM)和NaCl(150mM)，pH＝7.4Tris甘油緩沖液 Tris(羥甲基)氨甲烷1g/l和0.3M甘油，pH＝7.2DIO18標記物 3，3’-雙十八烷基噁羰花青(Molecular Probes Inc.，U.S.A.)Gd-DTPA-(SE)2釓-二乙烯三胺五乙酸復(fù)合物的二硬脂酸酯(按照以下文獻制備G.W.Kabalka等人，Magnetic Resonance in Medicine8(1998)，89-95)DSPG二硬脂酰磷脂酰甘油鈉鹽(Genzyme)IUPAC1，2-二硬脂酰-sn-甘油酰-3-[磷-rac-(1-甘油)]DAPC二花生四烯?；字Ｄ憠A(Avanti polar Lipids)IUPAC1，2-二花生四烯酰-sn-甘油酰-3-膽堿磷酸DSTAP 1，2-二硬脂酰-3-三甲基氨基-丙烷氯化物(Avantipolar Lipids)DSPC二硬脂酰磷脂酰膽堿Genzyme)IUPAC1，2-二硬脂酰-sn-甘油酰-3-膽堿磷酸DPPG二棕櫚酰磷脂酰甘油鈉鹽(Genzyme)IUPAC1，2-二棕櫚酰-sn-甘油酰-3-[磷-rac-(1-甘油)]DPPA二棕櫚酰磷脂酸鈉鹽(Genzyme)IUPAC1，2-二棕櫚酰-sn-甘油酰-3-磷酸鹽DPPC二棕櫚酰磷脂酰膽堿(Genzyme)IUPAC1，2-二棕櫚酰-sn-甘油酰-3-膽堿磷酸DSEPC 二硬脂酰乙基磷脂酰膽堿(Avanti polar Lipids)IUPAC1，2-二硬脂酰-sn-甘油酰-3-乙基膽堿磷酸NaDOC 脫氧膽酸鈉(Fluka)DSPE-PEG2000用PEG2000改性的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺鈉鹽(Nektar Therapeutics)乙基-SPC3 大豆乙基膽堿磷酸乙基-DSPC和乙基-DPPC的4∶1(w/w)混合物DPPE-cap-生物素1，2-二棕櫚酰-sn-甘油酰-3-磷酸乙醇胺-N-(帽生物素基)鈉鹽(Avanti Polar Lipids)PEG4000聚乙二醇，MW＝4000(Fluka)Pluronic 68環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷嵌段共聚物(Fluka)C4F10全氟丁烷微囊的尺寸和濃度利用庫爾特計數(shù)Multisizer(孔徑30μm)來測定。
微囊懸浮液的ζ-電勢利用1mM NaCl中的Malvern Zetasizer3000Hsa來測定。
膠束制劑的尺寸用Malvern Zetasizer 3000Hsa來測定。
實施例1帶正電荷的微球的制備將三棕櫚精(60mg)溶解在40℃的環(huán)己烷(0.6ml)中。將此有機相保持在40℃，直到乳化為止。將40mg的乙基-SPC3(陽離子磷脂)在65℃的30ml蒸餾水中分散15分鐘，然后將分散體冷卻到40℃。
利用Polytron均化器PT3000(10000轉(zhuǎn)，1分鐘)，將有機相乳化在含水相中。該乳劑然后用5ml PVA(200mg，Mw＝9000，來自Aldrich)的蒸餾水溶液進行稀釋，隨后冷卻到5℃，在-45℃冷凍10分鐘，然后凍干(0.2mbar，24小時)。
在空氣的存在下將凍干物重新分散在蒸餾水(20ml)中，利用磷酸鹽緩沖鹽水和最終的微球懸浮液(20ml)，通過離心(600g，10分鐘)將微球洗滌兩次。此制劑的大小特征如下DV50＝2.54μm；DN＝1.57μm。
實施例1a熒光標記的帶正電荷的微球的制備通過在有機相中加入5％(按重量計)(相對于三棕櫚精的總量而言)的親脂熒光探針DIO18以便熒光標記微球，而重復(fù)實施例1。此制劑的大小特征如下DV50＝2.38μm；DN＝1.45μm。
實施例2a-2e含有DSTAP的帶正電荷的微泡的制備將15mg DAPC和陽離子脂質(zhì)DSTAP(參見表1中的相對比例)的混合物以及985mg PEG4000溶解在50℃的叔-丁醇(10ml)中。溶液是在10ml的小瓶(每個小瓶中有50mg的干物)中取樣的，然后在Christ Epsilon 2-12DS冷凍干器中凍干(-30℃，0.56mbar，24小時)。在額外干燥(25℃，0.1mbar，5小時)之后，用彈性塞塞好小瓶，并用鋁箔進行密封。
將所獲得的凍干物暴露于所需氣體中(50∶50v/v的C4F10/N2)，然后重新分散在5ml PBS緩沖液中，由此獲得帶正電荷的微泡懸浮液。懸浮微泡的大小特征在表1中列出。
表1含有DSTAP的微泡
實施例3a-3c帶負電荷的微泡的制備通過用相同總量(15mg)、不同相對量(如表2所示)的DPPG/DSPC混合物取代DAPC/DSTAP混合物，來重復(fù)實施例2a-2e的制備過程。懸浮微泡的大小特征在表2中列出。
表2含有DPPG的微泡
實施例4帶正電荷的微泡的制備將DSTAP(200mg)在80℃、100ml含有5.4％(w/w)的丙二醇與甘油(3∶10w/w)混合物的水中分散5分鐘，然后冷卻到室溫。
將分散體轉(zhuǎn)移到C4F10大氣下的反應(yīng)器中，并且以20000轉(zhuǎn)(Polytron PT3000)勻化10分鐘，保持轉(zhuǎn)子定子混合桿，以使開口稍稍在液體表面之上。所獲得的微泡用水、通過離心洗滌兩次，然后重新分散在7.5％的葡萄糖溶液中。
懸浮液是在10ml的小瓶(每個小瓶中有2ml)中取樣的。將小瓶冷卻到-45℃，并凍干24小時，然后塞好、密封并保持在室溫下。重新懸浮在蒸餾水中的微泡的大小特征如下DV＝4.04；DN＝1.75。
實施例5a-5d帶負電荷的膠束的制備利用安裝在Branson 250超聲波降解器(輸出30％，10分鐘)上的3mm超聲探針，將50mg的Gd-DTPA-(SE)2(含有痕量的放射性153Gd)和10mg的NaDOC分散在5％的含水葡萄糖(10ml)中，從而獲得陰離子膠束的含水懸浮液。通過將不同量的不同化合物分散在相同體積的葡萄糖水溶液中(如下表3所示)，來重復(fù)相同的制備過程。
表3帶負電荷的膠束
實施例6a-6f含有DPPA的帶負電荷的膠束的制備利用3mm的超聲探針(Branson 250超聲波降解器，輸出30％，10分鐘)，將不同量的陰離子磷脂DPPA和中性磷脂DPPC(如表4所示)與16mg Pluronic F68一起分散在10ml的PBS中。將少量的DPPC-H3(對于10ml的最終懸浮液，約2.5μCi)作為放射性標記物加入到膠束制劑中。
超聲降解之后，使溶液通過0.2μm的濾器(Millipore)進行過濾。在冷卻到室溫之后，利用Malvern Zetasizer 3000HSA測定膠束的大小，利用稀釋在10ml LSC cocktail Hionic Fluor(PackardBioscience)中的50μl溶液，測定具體的放射活性，并在Tricarb2200A液體閃爍分析儀(Packard Bioscience)中進行計數(shù)。
表4含有DPPA的帶負電荷的膠束
實施例7a-7b含有DSPE-PEG的帶負電荷的膠束的制備將20mg的DSPE-PEG2000溶解在圓底燒瓶中的1ml、60℃的氯仿/乙醇(1/1，v/v)中，并在真空下將溶劑蒸發(fā)掉，從而在燒瓶內(nèi)壁上留下一層薄膜。此膜進一步在真空室中干燥過夜。然后在60℃用10ml的Hepes緩沖液將脂質(zhì)膜水合30分鐘。隨后將溶液在0.2μm的濾器上進行過濾，并在表征之前冷卻到室溫。將濾液在水中稀釋(稀釋比1∶3)，并用Malvern Zetasizer 3000HSA分析尺寸分布。按照上述過程的兩個不同制備結(jié)果總結(jié)在表5中。
表5
實施例8含有乙基-SPC3的帶正電荷的膠束的制備利用安裝在Branson 250超聲波降解器(輸出30％，10分鐘)上的3mm超聲探針，將16mg的乙基-SPC3和16mg的pluronic F68分散在5％的含水葡萄糖(10ml)中，從而獲得陽離子膠束的含水懸浮液。
實施例9a-9e含有DSTAP的帶正電荷的膠束的制備通過用帶正電荷的DSTAP代替帶負電荷的DPPA來重復(fù)實施例6a-6f的制備。不同制備過程的脂質(zhì)和磷脂的相對量在表6中示出。
表6含有DSTAP的帶正電荷的膠束
實施例10a-10b具有陽離子微球和陰離子膠束的組件的制備使實施例1的微球懸浮液(1ml)分別與不同體積(在表7中示出)的實施例5a或?qū)嵤├?b的膠束制劑混合。1小時之后，用PBS通過離心(600g，5分鐘)將懸浮液洗滌兩次，并重新分散在PBS(1.2ml)中。通過利用Cobra IIγ-射線自動儀(Packard Bioscience)測定懸浮液的Gd153放射活性(γ計數(shù))，來確定結(jié)合膠束的量(被表達成，所測定的組件懸浮液放射活性占所測定的初始膠束制劑放射活性的百分比)。結(jié)果在表7中給出。
表7
正如從上表推出的，雖然結(jié)合膠束的相對量(即，結(jié)合膠束占所加入的膠束總量的百分比)隨著加入到微囊懸浮液中的膠束總量(即膠束懸浮液的體積)的增大而減小，但是結(jié)合膠束的絕對量(由表7中的第一欄和最后一欄的產(chǎn)品給出)卻是增大的。
通過制備分別帶有實施例1的微球和實施例5c或5d的膠束制劑的組件，而獲得基本上類似的結(jié)果。
實施例11實施例10a-10b的組件的結(jié)合活性的測定為了測試實施例10a和10b(10μl和100μl的每個膠束懸浮液制劑)的組件的結(jié)合活性，如下制備中性親和素包被的表面向十二孔板(NuncTM)的每個孔中加入碳酸鹽緩沖液(pH9.5，300μl)和NeutrAvidinTM(Pierce，1mg/ml，50μl)。溫育(-4℃，過夜)之后，所述孔用含有0.1％Tween 20的PBS洗滌兩次，用PBS洗滌兩次。加入牛血清白蛋白(2％的PBS溶液，350μl)并且在溫育(25℃，1小時)之后，用含有0.1％Tween 20的PBS洗滌兩次，用PBS洗滌兩次。
將按照實施例10a和10b制備的2×108個組件加入到每個孔中，然后所述孔用PBS填充，進行密封，并轉(zhuǎn)動板。反相溫育(2小時，-25℃)之后，所述孔用PBS洗滌兩次，并通過具有40倍放大倍數(shù)的透鏡的光學顯微鏡觀察表面。含有生物素化膠束、來自實施例10b的組件對中性親和素包被的表面表現(xiàn)出親和力，100μl/ml的制劑比10μl/ml的制劑具有更高的表面覆蓋度。實施例10a的相應(yīng)未生物素化制劑表現(xiàn)出對中性親和素包被的表面沒有結(jié)合活性。
通過將包括實施例1的微球和實施例5c的未生物素化膠束的組件的結(jié)合活性與包括實施例1的微球和實施例5d的生物素化膠束的相應(yīng)組件進行比較，而獲得基本上類似的結(jié)果。
實施例12a-12b
具有陽離子微泡和陰離子膠束的組件的制備使實施例2d的微球懸浮液(1ml)分別與不同體積(在表8中示出)的實施例5a或?qū)嵤├?b的膠束制劑混合。將懸浮液輕輕攪拌1小時，然后用Tris甘油緩沖液通過離心(180g，5分鐘)洗滌兩次。將infranatant棄掉，并將殘余物分散在Tris甘油緩沖液(1ml)中。所獲得的組件的大小、濃度和ζ-電勢在表8中給出。
表8
在這兩種情況中，膠束懸浮液的體積增大決定所獲得的相應(yīng)組件懸浮液的ζ-電勢減小。
通過分別用實施例2c或2e的微泡懸浮液代替實施例2d的微泡懸浮液，或者用實施例5c和5d的膠束制劑代替實施例5a和5b的膠束制劑，而獲得基本上類似的結(jié)果。
實施例13實施例12a-12b的組件的結(jié)合活性的測定為了測試實施例12a-12b的組件的結(jié)合活性，如實施例11中所述制備中性親和素包被的表面，并用不同量(300、100、30和10μl)的實施例12a和12b的制劑進行測試。
在光學顯微鏡上觀察100μl/ml和300μl/ml的實施例12b的制劑的標記結(jié)合活性。在30μl/ml的制劑中觀察到較低的結(jié)合，而在10μl/ml的混合物中觀察到較差的結(jié)合。實施例12a的所有組件(不包含生物素化膠束)都顯示沒有結(jié)合活性。
實施例14a-14b具有陽離子微泡和陰離子膠束的組件的制備將按照實施例4獲得的小瓶中的凍干內(nèi)容物暴露于C4F10中，并重新分散在2ml的蒸餾水中。懸浮液用PBS通過離心(180g，10分鐘)洗滌兩次，并重新分散在2ml的PBS中。
加入50μl、分別按照實施例5a或5b制備的膠束制劑，在C4F10環(huán)境中用旋轉(zhuǎn)攪拌器將混合物攪拌過夜，然后通過離心(180g，10分鐘)用PBS洗滌兩次，最后重新分散在2ml的PBS中。
表9提供了實施例14a和14b的組件的特征。
表9
正如從上表中推出的，基本上全體膠束都與所形成的組件中的微泡相結(jié)合，所述組件具有基本上與初始微泡相同的平均直徑。
實施例15具有陰離子微泡和陽離子膠束的組件的制備使按照實施例3b制備的微泡懸浮液(1ml)與不同體積(在表10中示出)的實施例8的膠束制劑混合。將懸浮液輕輕攪拌1小時，然后用Tris甘油緩沖液通過離心(180g，5分鐘)洗滌兩次。將infranatant棄掉，并將獲得的組件分散在Tris甘油緩沖液(1ml)中。組件的一些特征在表10中給出。
表10
可觀察到，利用能夠決定微泡懸浮液的初始ζ-電勢的符號反轉(zhuǎn)的一定量膠束，組件的平均尺寸變得更接近初始微泡的尺寸。
實施例16確定結(jié)合膠束的量作為包括陽離子微泡和陰離子膠束的組件制劑中的帶電化合物的量的函數(shù)為了獲得總計30個組件制劑，通過在5ml的玻璃管中將300μl、按照實施例6a-6f制備的膠束溶液混合到1ml、按照實施例2a-2e制備的微泡的PBS懸浮液中，來制備不同的組件懸浮液。將混合的懸浮液輕輕攪拌30分鐘，然后通過離心(180g，10分鐘)洗滌兩次，以去除未結(jié)合的材料。通過添加并入膠束內(nèi)的放射性標記分子DPPC-3H，來評估結(jié)合到微泡上的膠束中的脂質(zhì)分子的量。
圖1表示出包括按照實施例2a-2e制備的各個微囊的組件的測定結(jié)果，其中線A-E代表作為所述膠束中的帶電化合物的量的函數(shù)、結(jié)合到微囊上的膠束的量。
從所述附圖中可注意到，對于包括實施例6a(無帶電表面活性劑)的膠束的組件制劑，基本上沒有觀察到結(jié)合膠束。而且，結(jié)合到微囊上的膠束的量隨著包括在微囊中的帶電化合物的量的增加而增加。最后，對于膠束/微囊組件的這個特定組合，可觀察到，當膠束中的帶電化合物的相對量為總量的約1％-5％(w/w)時，有更高量的膠束結(jié)合到微囊上。
實施例17確定結(jié)合膠束的量作為包括陰離子微泡和陽離子膠束的組件制劑中的帶電化合物的量的函數(shù)為了獲得總計15個組件制劑，通過在5ml的玻璃管中分別將300μl、按照實施例9a-9e制備的每個膠束溶液混合到1ml、按照實施例3a-3c制備的每個微泡懸浮液中，來制備不同的組件懸浮液。將混合的懸浮液輕輕攪拌30分鐘，然后通過離心(180g，10分鐘)洗滌兩次，以去除未結(jié)合的材料。通過添加并入膠束內(nèi)的放射性標記分子DPPC-3H，來評估結(jié)合到微泡上的膠束中的脂質(zhì)分子的量。
可觀察到與實施例16的組件制劑類似的結(jié)果，即，通過增加包括在微囊中的帶電化合物的量，可增加結(jié)合到微囊上的膠束的量，并且尤其是對于微囊含有更低量的帶電化合物的組件而言，當膠束中的帶電化合物的相對量為約1％-5％(w/w)時，有更高量的膠束結(jié)合到微囊上。
實施例18確定結(jié)合膠束的量作為加入到包括不同量帶電化合物的微泡懸浮液中的膠束的量的函數(shù)為了獲得總計12個組件制劑，將不同量(50、100、250和500μl)的、按照實施例7a或7b制備的膠束制劑與1ml、按照實施例2b、2d和2e制備的微泡制劑合并(尤其是2b和2d與7a合并，2d與7b合并)。將混合物輕輕攪拌30分鐘，用水通過離心(180g/10分鐘)洗滌兩次，以去除未結(jié)合的材料。
通過用庫爾特計數(shù)器測定大小分布以及用Malvern Zetasizer測定ζ-電勢，來表征所生成的懸浮液。將一部分樣品在0.2mbar凍干24小時，并利用HPLC分析凍干物，以便測定組件(μg PE-PEG/ml的泡)中的DSPE-PEG的量。結(jié)果匯總在下表11中，該表示出了包括在用于形成組件的混合物中的DSPE-PEG的初始量、組件中DSPE-PEG的最終量(對應(yīng)于結(jié)合膠束的量)、最終組件中的正、負電荷之間的比例(表示成電荷當量)以及最終懸浮液中的各自ζ-電勢。
表11陽離子微泡和陰離子膠束
從上表中觀察到，通常，微囊中的帶電化合物的量越高，最終組件中的結(jié)合膠束的量就越高。此外，就同一微泡制劑而言，結(jié)合DSPE-PEG的量越高，EC比例就越高，各自的ζ-電勢值就越低。
實施例19陽離子微囊與陰離子膠束的組件以及陰離子微囊與陰離子膠束的對照混合物稱量20mg的DSPE-PEG2000，并溶解在圓底燒瓶中60℃的氯仿/甲醇(1/1，v/v)中，然后在真空中蒸發(fā)溶劑混合物，從而在燒瓶內(nèi)壁上沉積一層薄膜。此膜在真空室中進一步干燥過夜。
脂質(zhì)膜用60℃、10ml的5％葡萄糖水合30分鐘，溶液在0.2μm濾器上進行過濾，然后在表征之前冷卻到室溫。
將上述制備過程重復(fù)兩次。
通過利用50/50(w/w)的DAPC與DSTAP混合物或50/50(w/w)的DSPC與DPPG混合物，如實施例2e(帶正電荷)和3b(帶負電荷)中所述來制備微泡。在重組之前將小瓶暴露于50/50(v/v)的C4F10/N2中。
將2.5ml的膠束溶液用2.5ml的5％葡萄糖進行稀釋。利用膠束的稀釋溶液將凍干微泡進行重組，并渦旋2分鐘，然后輕輕混合30分鐘。
所獲得的懸浮液用5％葡萄糖(通過離心，180g/10分鐘)洗滌兩次，并將上清液重新分散在2.5ml的5％葡萄糖中。利用MalvernZetasizer 3000Hsa(50μl/10ml NaCl 1mM)測定每個懸浮液的ζ-電勢。利用HPLC測定每個懸浮液中的DSPE-PEG2000的量。結(jié)果在下表12中給出。
表12陰離子膠束與陰離子或陽離子微泡的混合物
從上表中觀察到，在陰離子微泡上基本上沒有獲得陰離子膠束的結(jié)合，即，在最終混合物中僅發(fā)現(xiàn)可忽略量的DSPE-PEG，而ζ-電勢仍舊基本上為負的。
實施例20陽離子微球-膠體金組件按照實施例1制備的陽離子微球懸浮液與用檸檬酸鈉(Polysciences，60nm)穩(wěn)定的金顆粒膠體懸浮液，以不同比例(表示為金顆粒數(shù)/微球數(shù)，參見表13)進行混合。2小時之后，將飄浮的顆粒分出并重新分散在蒸餾水中。表13表示出，ζ-電勢的中性值是在約200的金顆粒/微球的比例時獲得的。
表13
實施例21陽離子微泡-磁鐵礦組件按照US 5,545,395制備用DPPA/Pluronic F108(FE/DPPA/Pluronic F108的比例為3/15/15，按mg/ml計)包被的磁鐵礦。用Tris(1g/l)/甘油(0.3M)緩沖液(pH7.05)將溶液稀釋100倍。在SF6大氣下用5ml的磁鐵礦溶液將陽離子微泡(按照實施例2d制備，只是所用的氣體是SF6，而不是C4F10/N2混合物)重新分散。渦旋2分鐘之后，將懸浮液輕輕混合1小時。然后用Tris/甘油緩沖液、通過離心(180g/10分鐘)將飄浮的顆粒洗滌兩次。用庫爾特計數(shù)Multisizer測定大小和濃度。用Malvern Zetasizer 3000Hsa(稀釋50μl/10ml水)測定ζ-電勢。用馳豫時間(T2)測定法(BrueckerMinispec MQ20)測定磁鐵礦的結(jié)合，并與在相同的沒有磁鐵礦顆粒的微泡制劑上完成的對照實驗進行比較。結(jié)果在表14中給出。
表14
正如從上表中看到的，隨著ζ-電勢相對于對照懸浮液的進一步減小，觀察到T2大幅減小，從而證實含有磁鐵礦的膠束基本上結(jié)合到微泡上。
實施例22在體內(nèi)施用中帶相反電荷的膠束對帶電微泡表面的作用利用80/20(w/w)的DAPC與DSTPA混合物、如實施例2d中所述來制備帶正電荷的微泡。利用50/50(w/w)的DSPC與DPPG混合物、如實施例3b中所述來制備帶負電荷的微泡。小瓶在用Tris/甘油緩沖液(5ml)重組之前暴露于50/50(v/v)的C4F10/N2中。
按照實施例6f(帶負電荷)和實施例8(帶正電荷)制備膠束。然后，制備微泡或組件的以下懸浮液懸浮液A將600μl的Tris/甘油緩沖液與2ml的微泡(實施例2d-帶正電荷)混合，并輕輕混合30分鐘。
懸浮液B將600μl的按照實施例6g的膠束(帶負電荷)與2ml的微泡(實施例2d-帶正電荷)混合，并輕輕混合30分鐘。
懸浮液C將600μl的Tris/甘油緩沖液與2ml的微泡(實施例3b-帶負電荷)混合，并輕輕混合30分鐘。
懸浮液D將600μl的按照實施例8的膠束(帶正電荷)與2ml的微泡(實施例3b-帶負電荷)混合，并輕輕混合30分鐘。
所有懸浮液用Tris/甘油緩沖液(通過離心，180g/10分鐘)洗滌兩次，并將上清夜重新分散在2ml的緩沖液中。利用庫爾特計數(shù)器測定大小和濃度。用Malvern Zetasizer 3000Hsa(50μl/10ml NaCl 1mM)測定每個懸浮液的ζ-電勢，并在下表15中示出。
表15
以每kg體重5E+06微泡的劑量將懸浮液注射到兔耳靜脈中。利用配有間歇成像(二幀/秒)的4C1-S轉(zhuǎn)換器和高機械指數(shù)(MI)的AcusonSequoia 512在相干反差成像(CCI)中實施二維回波描記術(shù)。將腎的圖像在錄像機上記錄3分鐘，并分析此序列，以便測定在皮層(圖2和3)選擇的感興趣區(qū)域(ROI)中作為時間函數(shù)的平均象素強度。
正如在附圖上看到的，在微泡上添加帶相反電荷的膠束，這顯著地改變了微泡的體內(nèi)行為。由此，在腎皮質(zhì)上幾乎檢測不到帶正電荷的泡(懸浮液A)。然而，與帶負電荷的膠束溫育之后，相同的微泡(懸浮液B)在ROI顯示出更強的信號。類似的帶負電荷的微泡(懸浮液C)在腎臟顯示出強信號。然而，與帶正電荷的膠束混合之后，在ROI中幾乎沒有檢測到信號。
實施例23陽離子微泡與包括藥物的陰離子膠束的組件如下表16所示，使2ml的微泡懸浮液(按照實施例2a制備，分散在PBS中)與不同量的Fungizone溶液(兩性霉素B與脫氧膽酸鈉在PBS中的膠束懸浮液)混合。將懸浮液輕輕攪拌1小時，然后用PBS緩沖液、通過離心(180g/5分鐘)洗滌兩次。將infranatant棄掉，并將獲得的組件分散在緩沖液(1ml)中。用庫爾特計數(shù)Multisizer(孔徑30μm，50μl/100ml NaCl 0.9％)測定大小和濃度。用MalvernZetasizer 3000Hsa(50μl/10ml蒸餾水)測定ζ-電勢。用分光光度計(409nm，50μl的、2ml CHCl3/MeOH 1/1中的組件)測定微泡上兩性霉素B的量，并與Fungizone的校正曲線進行比較。下表16中示出的結(jié)果表明，通過增大所加入的膠束的量，組件中可包括增加量的藥物。
表16-具有藥物的組件
實施例24具有雙層膠束的組件實施例24a帶負電荷的泡的制備利用與US 5,830,435的實施例3中所述相似的方法制備含有DPPC/DPPS的微泡。簡言之，通過將59.2mg的DPPC和40.8mg的DPPS分散在含有1g丙二醇的100ml蒸餾水中，而獲得多層脂質(zhì)體(MLV)。將脂質(zhì)體在攪拌下于70℃溫育30分鐘。脂質(zhì)體的平均直徑為DN＝約1.4μm，DV＝約2.7μm。
將脂質(zhì)體懸浮液引入配備高速機械乳化器(Megatron MT3000，Kinematica，Switzerland)的氣密玻璃反應(yīng)器中。將含有C4F10的氣袋與乳化器的混合室相連。勻化(10,000轉(zhuǎn)，1分鐘)之后，獲得微泡的乳狀懸浮液。通過傾析去除infranatant(約90ml，含有大部分脂質(zhì)體)。將上清夜(含有微泡)回收并重新懸浮在蒸餾水中，至總體積達100ml。重復(fù)傾析步驟，并將最終的微泡懸浮液重新懸浮在10％的麥芽糖中。將幾個等分的懸浮液收集在10ml玻璃瓶內(nèi)(每個瓶中1ml懸浮液)，將樣品在-45℃冷凍，并凍干。
凍干之后，將瓶用橡膠塞封閉，抽成真空并用含有1∶1(v/v)的C4F10與空氣混合物的氣體混合物和填充。通過塞子將2ml的蒸餾水注入瓶內(nèi)并手搖，從而產(chǎn)生微泡。
實施例24b陽離子和陰離子膠束的制備實施例24b1
用3.73mg/ml的DSPE-PTE020(多臂PEG-磷脂，NOF Corporation，Japan)和1.27mg的陽離子磷脂DPEPC(二棕櫚酰甘油酰-3-乙基膽堿磷酸，AvantiPolar Lipids，Inc.USA)制備陽離子膠束。
實施例24b2用4.1mg/ml的DSPE-PEG2000和0.9mg的GPIIbIIIa結(jié)合脂肽(DPPE-PEG2000-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val，按照US 6,139,819的實施例3制備的)制備陰離子、官能化膠束。
在5％的葡萄糖溶液中制備帶正電荷及帶負電荷的膠束。
實施例24c具有帶負電荷的泡和帶有相反電荷的多MAC層的組件的制備將50μl和500μl的按照實施例24b1制備的陽離子膠束分別加入到含有約1×109的按照實施例24a制備的帶負電荷的微泡的兩個制劑中。將混合物輕輕攪拌30分鐘，然后通過離心(10’/1000轉(zhuǎn))洗滌兩次，并重新懸浮在5％的葡萄糖溶液中。將獲得的組件的大小和ζ-電勢(如所測定的)列在以下的表17中(“組件1”行)。結(jié)果表明，在用一層陽離子膠束包被帶負電荷的微泡之后，所測定的組件懸浮液的ζ-電勢變成正的。
然后，將100μl和250μl的陰離子膠束懸浮液(按照實施例24b2制備)分別加入到含有50μl陽離子膠束的組件和含有500μl陽離子膠束的組件中。將兩種混合物輕輕攪拌30分鐘，然后通過離心(10’/1000轉(zhuǎn))洗滌兩次，并重新懸浮在5％的葡萄糖溶液中。將獲得的雙層組件的直徑和ζ-電勢列在以下的表17中(“組件2”行)；第二層帶負電荷的膠束的存在決定ζ-電勢的相應(yīng)負值。
表17
包括多個交替帶電層的類似組件也能夠用其它種類的MAC(例如脂質(zhì)體和納米顆粒)來制造。例如，帶負電荷的微泡可用陽離子和含有藥物的脂質(zhì)體來包被，然后用攜帶靶向部分的第二層陰離子膠束來包被。
實施例25用乳劑制備組件將含有DAPC和DSTAP(80∶20，2mg/ml)的50ml蒸餾水在70℃加熱30分鐘，然后冷卻到室溫。利用高速勻化器(Polytron，10,000轉(zhuǎn)，1分鐘)將4ml的全氟己烷乳化在此含水相中。正如用MalvernMastersizer所測定的，生成的乳劑顯示以體積計的中值直徑為DV50＝5.0μm，以數(shù)目計的平均直徑DN＝2.7μm。通過離心洗滌乳劑，并將其重新懸浮在水中。將不同量的按照實施例24b2制備的陰離子膠束分別加入到三個等分的以上陽離子乳劑中，對于每ml乳劑其各自的濃度為135μl、270μl和540μl。在溫育(在輕輕攪拌下于室溫中30分鐘)并通過離心除去過量的膠束之后，將膠束包被的乳劑重新分散在20％(w/w)含水PEG4000溶液中。將乳劑-膠束組件分布在瓶中(2ml/瓶)，然后在瓶中進行冷凍和凍干。用C4F10疏散和取代凍干物瓶中的空氣。用2ml的5％葡萄糖溶液重組之后，獲得乳狀微泡-膠束組件懸浮液。庫爾特計數(shù)器和ζ-電勢的分析結(jié)果收集在以下的表18中。
表18
陰離子膠束的量增大的制劑，導致微泡的量增大。而且，表面電荷特性也能夠按需進行調(diào)整(ζ-電勢值從正變到負)。
實施例26用氣體乳劑制備組件利用C4F10作為氣相、DPPS作為磷脂(2mg/ml)以穩(wěn)定微泡、按照實施例24a獲得帶負電荷的微泡。在通過DPPS脂質(zhì)體的高速機械乳化(MegatronMT3000Kinematica，Switzerland)生成泡之后，利用1μl的聚碳酸酯膜(Nuclepore)通過滲濾30分鐘來洗滌微泡，以除去泡懸浮液中過量的磷脂。將含有綴合到特異于P-選擇蛋白(70∶30摩爾比，5mg/ml)的兔抗-鼠單克隆IgG1上的DPEPC和DSPE-PEG2000的陽離子膠束，加入到泡懸浮液(50μl膠束用于1ml的微泡中，即約5×109個泡/ml)中。將混合物于室溫中輕輕攪拌30分鐘并進行離心。將組件(上清夜)重新懸浮在10％的麥芽糖溶液中，冷凍并凍干(2ml/瓶)。凍干之后，凍干物用C4F10氣化，并且用2ml的蒸餾水進行重組。計數(shù)器分析顯示，在凍干之后，超過90％的微泡-膠束組件仍然是完整的。這些微泡顯示出Dn＝1.3μm，Dv＝2.9μm。流式細胞術(shù)測定證實，組件表面上存在生化活性的IgG1抗體。
權(quán)利要求
1.一種組件，包括攜帶第一總凈電荷的充氣微囊和與所述微囊相結(jié)合的組分，其中所述組分攜帶符號與所述第一凈電荷相反的第二總凈電荷，并包括靶向配體、診斷劑或這兩種物質(zhì)的任意組合以及生物相容的表面活性劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組件，其特征在于，所述靶向配體選自蛋白質(zhì)、抗體、抗體片段、受體分子、受體結(jié)合分子、糖蛋白、凝集素、肽、寡肽、多肽、肽模擬物、糖、多糖、維生素、類固醇、類固醇類似物、激素、輔因子、生物活性劑、遺傳材料、核苷、核苷酸和多核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組件，其特征在于，所述診斷劑選自磁鐵礦納米顆粒、碘化的化合物和順磁離子化合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組件，其特征在于，與所述充氣微囊相結(jié)合的所述組分還包括生物活性劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組件，其特征在于，還包括至少第二組分，所述第二組分具有符號與所述第一凈電荷相反的第二總凈電荷，并包括生物活性劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組件，其特征在于，還包括至少第二組分，所述第二組分具有符號與所述微囊的電荷相同的總凈電荷。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組件，其特征在于，所述第二組分包括靶向配體、診斷劑、生物活性劑或這些物質(zhì)的任意組合。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的組件，其特征在于，與所述充氣微囊相結(jié)合的所述組分具有300nm或更小的直徑。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組件，其特征在于，所述生物相容的表面活性劑是乳化劑、分散劑或這些物質(zhì)的混合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組件，其特征在于，所述生物相容的表面活性劑是兩性材料。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組件，其特征在于，所述生物相容的表面活性劑選自(C2-C10)有機酸、包括(C12-C24)脂族鏈的有機脂肪酸、這些物質(zhì)的藥物可接受的鹽以及與聚氧乙烯的相應(yīng)酯；聚離子(堿性)鹽；有機胺；酰胺；四價銨鹽；氨基酸；磷脂；單-或寡-糖與(C12-C24)有機脂肪酸的酯；有機磺酸酯；全氟有機酸；聚合表面活性劑；以及上述這些物質(zhì)的混合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組件，其特征在于，每摩爾微囊的電荷數(shù)與每摩爾第二組分的電荷數(shù)之比，為大約10∶1-大約1∶10。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組件，其特征在于，所述比例為大約3∶1或更小。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組件，其特征在于，所述比例為大約2∶1或更小。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組件，其特征在于，所述比例為大約3∶2或更小。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組件，其特征在于，所述微囊是用包括兩性成膜化合物的被膜所穩(wěn)定的微泡，或具有材料被膜的微球。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的組件，其特征在于，包括在使所述微泡穩(wěn)定的被膜中的所述兩性成膜化合物是磷脂。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組件，其特征在于，所述被膜包括攜帶正或負凈電荷的磷脂或脂質(zhì)。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組件，其特征在于，所述微球的材料被膜包括聚合材料、蛋白質(zhì)材料、水不溶性脂質(zhì)或其任意組合。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組件，其特征在于，所述微球的材料被膜包括離子生物降解聚合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組件，其特征在于，所述微球的材料被膜還包括攜帶正或負凈電荷的磷脂或脂質(zhì)。
22.根據(jù)權(quán)利要求18或21所述的組件，其特征在于，所述磷脂或脂質(zhì)選自磷脂酰絲氨酸衍生物、磷脂酸衍生物、磷脂酰甘油衍生物、聚乙二醇改性的磷脂酰乙醇胺、乙基磷脂酰膽堿衍生物和各自的溶血形式；膽汁酸鹽；脫氧膽汁酸鹽；甘氨膽酸鹽；這些物質(zhì)的(C12-C24)脂肪酸鹽；包括至少一個(C10-C20)烷基鏈的烷基銨鹽；包括至少一個通過(C3-C6)亞烷基橋連接到氮原子上的(C10-C20)?；湹娜齼r或四價銨鹽；以及上述這些物質(zhì)的混合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求1、4、5、6或7所述的組件，其特征在于，與所述微囊相結(jié)合的所述組分是膠束。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組件，其特征在于，所述膠束包括聚乙二醇改性的磷脂；包括至少一個(C10-C20)烷基鏈的烷基銨鹽；包括至少一個通過(C3-C6)亞烷基橋連接到氮原子上的(C10-C20)?；湹娜齼r或四價銨鹽；(C12-C24)脂肪酸鹽；聚合表面活性劑；或上述這些物質(zhì)的混合物。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組件，其特征在于，所述膠束包括磷脂酰膽堿、乙基磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸或鞘磷脂的(C12-C24)脂肪酸二酯。
26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組件，其特征在于，所述膠束包括攜帶正或負凈電荷的磷脂，或聚合離子表面活性劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組件，其特征在于，所述磷脂或脂質(zhì)選自磷脂酰絲氨酸衍生物、磷脂酸衍生物、磷脂酰甘油衍生物、聚乙二醇改性的磷脂酰乙醇胺、乙基磷脂酰膽堿衍生物和各自的溶血形式；膽汁酸鹽；脫氧膽汁酸鹽；甘氨膽酸鹽；這些物質(zhì)的(C12-C24)脂肪酸鹽；包括至少一個(C10-C20)烷基鏈的烷基銨鹽；包括至少一個通過(C3-C6)亞烷基橋連接到氮原子上的(C10-C20)?；湹娜齼r或四價銨鹽；以及上述這些物質(zhì)的混合物。
28.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組件，其特征在于，與所述微囊相結(jié)合的所述組分是膠體納米顆粒。
29.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組件，其特征在于，與所述微囊相結(jié)合的所述組分是固態(tài)聚合納米顆粒。
30.一種包括根據(jù)權(quán)利要求1-29任一項所述的組件的生理上可接受的液體的含水懸浮液。
31.根據(jù)權(quán)利要求1-29任一項所述的組件，其特征在于，藥物可接受的載體中的所述組件的含水懸浮液顯示出ζ-電勢，所述ζ-電勢相對于形成所述組件的充氣微囊的相同載體中的含水懸浮液的ζ-電勢，其絕對值至少減小50％。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的組件，其特征在于，所述ζ-電勢的絕對值至少減小75％。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的組件，其特征在于，所述ζ-電勢的絕對值減小約100％或更多。
34.一種藥盒，單獨地包括a)作為第一組分、攜帶第一總凈電荷的充氣微囊或其前體；b)與所述微囊相結(jié)合的第二組分或其前體，所述第二組分或其前體攜帶符號與所述第一凈電荷相反的第二總凈電荷，所述相結(jié)合的組分包括靶向配體、診斷劑或這些物質(zhì)的任意組合。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的藥盒，其特征在于，還包括藥物可接受的液態(tài)載體。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的藥盒，其特征在于，所述第一和第二組分是單獨的凍干制劑形式。
37.一種藥盒，包括a)作為第一組分、攜帶第一總凈電荷的充氣微囊或其前體；b)與所述微囊相結(jié)合的第二組分或其前體，所述第二組分或其前體攜帶符號與所述第一凈電荷相反的第二總凈電荷，所述相結(jié)合的組分包括靶向配體、診斷劑或這些物質(zhì)的任意組合，以及生物相容的表面活性劑。
38.根據(jù)權(quán)利要求1-26任一項所述組件的制備方法，包括將包含充氣微囊或其前體的制劑與包含待與所述微囊相結(jié)合的組分或其前體的制劑進行混合。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，包括1)制備包括充氣微囊的第一含水懸浮液；2)制備包括將要與所述充氣微囊相結(jié)合的組分的第二含水懸浮液；3)將所述兩個懸浮液混合，從而獲得包括所述組件的含水懸浮液。
40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，包括1)制備包括充氣微囊的第一含水懸浮液；2)凍干所述懸浮液，從而獲得第一凍干產(chǎn)物；3)制備包括將要與所述充氣微囊相結(jié)合的組分的第二含水懸浮液；4)凍干所述懸浮液，從而獲得第二凍干產(chǎn)物；5)在氣體的存在下，將所述第一和所述第二凍干產(chǎn)物與生理上可接受的含水載體進行重組，從而獲得包括所述組件的含水懸浮液。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所述步驟5)包括以下步驟a)將第二凍干產(chǎn)物與生理上可接受的含水載體進行重組，從而獲得包括將要與充氣微囊相結(jié)合的組分的懸浮液，以及b)在氣體的存在下，將第一凍干產(chǎn)物與所述懸浮液進行重組。
42.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，包括1)制備包括有機溶劑、磷脂和凍干保護劑的含水乳劑；2)制備包括將要與充氣微囊相結(jié)合的組分的含水懸浮液；3)將所述含水懸浮液與所述含水乳劑進行混合；以及4)將混合物凍干，以除去水和有機溶劑，從而獲得包括所述組件的凍干產(chǎn)品。
43.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的組件的制備方法，其特征在于，包括將攜帶符號與充氣微囊的符號相同的總凈電荷的第二組分，混合到按照權(quán)利要求38-42任一項獲得的組件中。
44.根據(jù)權(quán)利要求1-29任一項所述的組件制備藥物活性藥劑的用途。
45.一種超聲診斷成像方法，包括施用反差增強劑量的根據(jù)權(quán)利要求1-29任一項的組件的含水懸浮液。
46.一種治療方法，包括施用治療有效量的如權(quán)利要求4或5所限定組件的含水懸浮液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種組件，這種組件包括充氣微囊和能夠通過靜電相互作用與所述微囊的外表面相結(jié)合的結(jié)構(gòu)實體(微囊相結(jié)合組分MAC)，借此改善其物理－化學特性。所述MAC包括靶向配體、診斷劑或它們的任意組合。生物活性劑任選地與MAC相結(jié)合。本發(fā)明的組件是用充氣微泡或微球以及優(yōu)選地具有納米尺寸(例如膠束)的MAC形成的，并且在診斷和/或治療活性藥劑中用作活性組分，尤其是用于增強超聲反差成像領(lǐng)域中的成像，這些成像技術(shù)包括定向超聲成像和/或超聲介導給藥及其它成像技術(shù)，例如分子共振成像(MRI)或核成像。
文檔編號A61K51/12GK1897978SQ200480038618
公開日2007年1月17日 申請日期2004年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月22日
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