專(zhuān)利名稱(chēng)：改進(jìn)的胃泌素釋放肽化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用作診斷顯像劑或放射治療劑的新胃泌素釋放肽(GRP)化合物。這些GRP化合物用放射性核素或可通過(guò)體內(nèi)光成像來(lái)檢測(cè)的標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，并包括使用在標(biāo)記和靶向肽之間的新連接基提供改進(jìn)的藥代動(dòng)力學(xué)。
背景技術(shù)：
已知放射性藥物(例如診斷顯像劑、放射治療劑)用于檢測(cè)和治療癌癥的應(yīng)用。近年來(lái)，已發(fā)現(xiàn)許多用于癌癥檢測(cè)和/或治療的部位定向放射性藥物，并這些發(fā)現(xiàn)隨著藥學(xué)專(zhuān)業(yè)更好地評(píng)價(jià)這些化合物的特異性、效力和效用而繼續(xù)增加。
這些較新的放射性藥劑通常由與金屬螯合劑連接的靶向劑組成，它們可以與診斷性金屬放射性核素如锝或銦，或者治療性金屬放射性核素如镥、釔或錸螯合(例如絡(luò)合)。金屬螯合劑的作用是當(dāng)放射性藥劑遞送至目標(biāo)部位時(shí)保留(即螯合)金屬放射性核素。不與金屬放射性核素強(qiáng)結(jié)合的金屬螯合劑將使放射性藥劑對(duì)其目標(biāo)應(yīng)用無(wú)效，因?yàn)榻饘俜派湫院怂匾虼硕荒艿竭_(dá)它的目標(biāo)部位。因此，進(jìn)一步的研發(fā)導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)金屬螯合劑，例如Pollak等人的美國(guó)專(zhuān)利5,662,885報(bào)道(該文獻(xiàn)被引用作為參考)，所述螯合劑表現(xiàn)出對(duì)金屬放射性核素的強(qiáng)結(jié)合親和力和與靶向劑綴合的能力。因此，使用“間隔基”以在金屬螯合劑和靶向劑之間建立物理分隔的概念被進(jìn)一步引入，例如在Pollak等人的美國(guó)專(zhuān)利5,976,495中，所述文獻(xiàn)在此被引入作為參考。
靶向劑由于其對(duì)某些結(jié)合部位的親和力而起到的作用在于將診斷劑，例如包含金屬放射性核素的放射性藥劑導(dǎo)向至檢測(cè)或治療的目標(biāo)部位。典型地，靶向劑可以包括表現(xiàn)出對(duì)給定受體具有特異性親和力的蛋白、肽或其它大分子。其它已知的靶向劑包括單克隆抗體(MAbs)、抗體片段(Fab′s和(Fab)2′s)和受體-親和肽。Donald J.Buchsbaum，″Cancer Therapy with Radiolabeled Antibodies；Pharmacokineticsof Antibodies and Their Radiolabels；ExperimentalRadioimmunotherapy and Methods to Increase Therapeutic Efficacy，″CRC Press，Boca Raton，Chapter 10，pp.115-140，(1995)；Fischman等人，″A Ticket to RidePeptide Radiopharmaceuticals，″The Journal of Nuclear Medicine，vol.34，No.12，(Dec.1993)。這些文獻(xiàn)的內(nèi)容在此被全文引入作為參考。
近幾年來(lái)，已認(rèn)識(shí)到某些癌細(xì)胞包含胃泌素釋放肽(GRP)受體(GRP-R)，其具有多種亞型。具體而言，已表明某些類(lèi)型的癌細(xì)胞具有超表達(dá)或獨(dú)特表達(dá)的GRP受體。由于這個(gè)原因，已完成許多有關(guān)與GRP受體家族結(jié)合的GRP和GRP類(lèi)似物的調(diào)查和研究。一種這樣的類(lèi)似物是蛙皮素(BBN)，一種從蛙皮膚分離的14個(gè)氨基酸的肽(即十四肽)，它類(lèi)似于人GRP，并以高度特異性與GRP受體結(jié)合，并具有類(lèi)似于GRP的親和力。
蛙皮素和GRP類(lèi)似物可以是激動(dòng)劑或拮抗劑的形式。GRP或BBN激動(dòng)劑與GRP受體的結(jié)合增加這些癌細(xì)胞的細(xì)胞分裂速率，且這些激動(dòng)劑被細(xì)胞內(nèi)化，而GRP或BBN拮抗劑的結(jié)合通常不導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)化或增加細(xì)胞分裂速率。這些拮抗劑被設(shè)計(jì)用于競(jìng)爭(zhēng)性抑制與GRP受體的內(nèi)源性GRP結(jié)合，并減小癌細(xì)胞增殖的速率。例如參見(jiàn)Hoffken，K.；Peptides in Oncology II，Somatostatin Analogues and BombesinAntagonists(1993)，pp.87-112。為此原因，大量工作已經(jīng)并正在進(jìn)行，意在研發(fā)作為拮抗劑的BBN或GRP類(lèi)似物。例如Davis等人，Metabolic Stability and Tumor Inhibition of Bombesin/GRPReceptor Antagonists，Peptides，vol.13，pp.401-407，1992。
在設(shè)計(jì)用作癌癥的診斷或治療劑的有效化合物中，藥物具有合適的體內(nèi)靶向和藥代動(dòng)力學(xué)性能是重要的。例如，優(yōu)選放射性藥物、放射性標(biāo)記肽被癌細(xì)胞高度特異性地?cái)z取(例如通過(guò)GRP受體)。此外，還優(yōu)選一旦放射性核素定位在癌部位，則其在那兒保留需要量的時(shí)間以將高度局部化的放射劑量遞送至該部位。
而且，研發(fā)從正常組織有效清除的放射性標(biāo)記肽對(duì)于放射性藥劑來(lái)說(shuō)也是一個(gè)重要的因素。如果給動(dòng)物例如人施用用金屬放射性核素標(biāo)記(通過(guò)螯合物綴合)的生物分子(例如MAb、Fab或肽)，則大量的金屬放射性核素(某些化學(xué)形式)可能“截留”在腎或肝實(shí)質(zhì)中(即沒(méi)有排泄進(jìn)入尿或膽汁)。Duncan等人，Indium-111-Diethylenetriaminepentaacetic Acid-Octreotide Is Delivered in Vivo toPancreatic，Tumor Cell，Renal and Hepatocyte Lysosomes，CancerResearch 57，pp.659-671，(Feb.15，1997)。對(duì)于較小的放射性標(biāo)記的生物分子(即肽或Fab)，主要的活性清除途徑是通過(guò)腎，而腎也可能保留高水平的放射性金屬(即通常＞10-15％的注射劑量)。在腎或肝中保留金屬放射性核素顯然是不期望的。相反，如果需要較長(zhǎng)的診斷成像或放射治療高腫瘤攝入，則通過(guò)腎過(guò)快地從血流中清除放射性藥物也是不期望的。
隨后的工作，例如Hoffinan等人的美國(guó)專(zhuān)利6,200,546和US2002/0054855的工作(所述文獻(xiàn)的內(nèi)容在此被全文引用作為參考)已嘗試通過(guò)形成具有通式X-Y-B的化合物來(lái)克服這個(gè)問(wèn)題，其中X為能夠絡(luò)合金屬的基團(tuán)，Y為間隔基上的共價(jià)鍵，而B(niǎo)為蛙皮素激動(dòng)劑結(jié)合部分。據(jù)報(bào)道這些化合物對(duì)GRP受體具有高結(jié)合親和力，且其放射性在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間地保持。此外，正常小鼠的體內(nèi)研究已表明腎中保留的放射性金屬低于本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)中已知的水平，大部分的放射性排泄進(jìn)入尿。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，具有改進(jìn)的藥代動(dòng)力學(xué)和改進(jìn)的腎排泄(即放射性金屬在腎中較少保留)的新的和改進(jìn)的放射性藥物和其它診斷化合物用于診斷成像和治療應(yīng)用。為進(jìn)行診斷成像，快速腎排泄和低放射性保留水平對(duì)于改進(jìn)成像是關(guān)鍵。為進(jìn)行放射治療應(yīng)用，減緩血液清除率以允許較高的腫瘤攝入和較好的腫瘤靶向以及低腎保留是關(guān)鍵。
發(fā)明概述在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供用于診斷成像或放射治療的新的和改進(jìn)的化合物。所述化合物包括通過(guò)連接基或間隔基與GRP受體靶向肽連接的能夠絡(luò)合藥用金屬離子或放射性核素的化學(xué)部分(金屬螯合劑)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些化合物包括通過(guò)連接基或間隔基連接到GRP受體靶向肽上的光標(biāo)記(optical label)(例如光標(biāo)記(photolabel)或可通過(guò)光成像、光聲成像或光致發(fā)光檢測(cè)的其它標(biāo)記)。
總體而言，本發(fā)明的化合物可以具有下式M-N-O-P-G其中M為金屬螯合劑(與金屬放射性核素絡(luò)合或不絡(luò)合的形式)或光標(biāo)記，N-O-P為連接基，而G為GRP受體靶向肽。
金屬螯合劑M可以是本領(lǐng)域中已知用于與藥用金屬離子或放射性核素絡(luò)合的任何金屬螯合劑。優(yōu)選的螯合劑包括DTPA、DOTA、DO3A、HP-DO3A、EDTA、TETA、EHPG、HBED、NOTA、DOTMA、TETMA、PDTA、TTHA、LICAM、MECAM或肽螯合劑，例如本文討論的螯合劑。所述金屬螯合劑可以與金屬放射性核素絡(luò)合或不絡(luò)合，并可以包括任選存在的間隔基如單一氨基酸。用于閃爍掃描術(shù)或放射治療的優(yōu)選的金屬放射性核素包括99mTc、51Cr、67Ga、68Ga、47Sc、51Cr、167Tm、141Ce、111In、168Yb、175Yb、140La、90Y、88Y、153Sm、166Ho、165Dy、166Dy、62Cu、64Cu、67Cu、97Ru、103Ru、186Re、188Re、203Pb、211Bi、212Bi、213Bi、214Bi、225Ac、105Rh、109Pd、117mSn、149Pm、161Tb、177Lu、198Au和199Au。金屬的選擇根據(jù)目標(biāo)治療或診斷應(yīng)用來(lái)確定。例如，為診斷目的，優(yōu)選的放射性核素包括64Cu、67Ga、68Ga、99mTc和111In，特別優(yōu)選99mTc和111In。為治療目的，優(yōu)選的放射性核素包括64Cu、90Y、105Rh、111In、117mSn、149Pm、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、175Yb、177Lu、186/188Re和199Au，特別優(yōu)選177Lu和90Y。用于本發(fā)明化合物的最優(yōu)選的螯合劑為1-取代的4，7，10-三羧甲基1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷三乙酸(DO3A)。
光標(biāo)記M可以是本領(lǐng)域中已知的多種不同光標(biāo)記中的任何一種。優(yōu)選的標(biāo)記包括但不限于光學(xué)染料，包括有機(jī)發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)，例如花青染料，光吸收化合物、光反射和散射化合物以及生物發(fā)光分子。
在一個(gè)實(shí)施方案中，連接基N-O-P包含至少一個(gè)非α-氨基酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，連接基N-O-P包含至少一個(gè)取代的膽汁酸。
在另一種實(shí)施方案中，連接基N-O-P包含至少一個(gè)具有環(huán)狀基團(tuán)的非α-氨基酸所述GRP受體靶向肽可以是GRP、蛙皮素或其任何衍生物或類(lèi)似物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，GRP受體靶向肽為用作激動(dòng)劑的GRP或蛙皮素類(lèi)似物。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，GRP受體靶向肽為在美國(guó)專(zhuān)利6,200,546和US 2002/0054855中公開(kāi)的蛙皮素激動(dòng)劑結(jié)合部分，所述文獻(xiàn)在此被引入作為參考。
還提供一種使用本發(fā)明的化合物的新成像方法。
在本發(fā)明的一個(gè)例示性實(shí)施方案中，提供一種包含制備本發(fā)明的診斷或治療劑所需的所有組分的單瓶或多瓶試劑盒。
還提供一種用于制備診斷顯像劑的新方法，所述方法包括步驟往可注射成像介質(zhì)加入包含本發(fā)明化合物的物質(zhì)。
還提供一種使用本發(fā)明的化合物進(jìn)行放射治療的新方法，以及一種用于制備放射治療劑的新方法，所述方法包括步驟往可注射治療介質(zhì)加入包含本發(fā)明化合物的物質(zhì)。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1A是實(shí)施例I所述的由A(甲基-(3β，5β)-3-氨基膽烷-24-酸酯)和B((3β，5β)-3-氨基膽烷-24-酸)合成中間產(chǎn)物C((3β，5β)-3-(9H-芴-9-基甲氧基)氨基膽烷-24-酸)的一系列化學(xué)反應(yīng)的圖示。
圖1B是實(shí)施例I所述的合成N-[(3β，5β)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙?；鵠氨基]膽烷-24-基]-L-谷氨酰胺酰基-L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L62)的連續(xù)反應(yīng)的圖示。
圖2A是實(shí)施例II所述的合成N-[4-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙酰基]氨基]苯甲?；鵠-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨酰基-甘氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L70)的連續(xù)反應(yīng)的圖示。
圖2B是實(shí)施例II所述的合成N-[4-[2-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙氧基]苯甲?；鵠-L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨酰基-甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L73)、N-[3-[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]甲基]苯甲酰基]-L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L115)和N-[4-[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]甲基]苯基乙酰基]-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L116)的連續(xù)反應(yīng)的總圖示。
圖2C是在實(shí)施例II所述的合成N-[4-[2-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙氧基]苯甲?；鵠-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L73)的圖2B的合成反應(yīng)中所用的連接基的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖2D是在實(shí)施例II所述的合成N-[3-[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]甲基]苯甲?；鵠-L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L115)的圖2B的合成反應(yīng)中所用的連接基的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖2E是在實(shí)施例II所述的合成N-[4-[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]甲基]苯基乙酰基]-L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨酰基-甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L116)的圖2B的合成反應(yīng)中所用的連接基的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖2F是實(shí)施例II所述的合成N-[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠甘氨?；?4-哌啶羰基-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L74)的連續(xù)反應(yīng)的圖示。
圖3A是實(shí)施例III所述的合成中間產(chǎn)物(3β，5β)-3-[[(9H-芴-9-基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基-12-氧代膽烷-24-酸(C)的一系列化學(xué)反應(yīng)的圖示。
圖3B是實(shí)施例III所述的合成N-[(3β，5β)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙酰基]氨基]-12，24-二氧代膽烷-24-基]-L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺(L67)的連續(xù)反應(yīng)的圖示。
圖3C是實(shí)施例III所述的(3β，5β)-3-氨基-12-氧代膽烷-24-酸(B)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖3D是實(shí)施例III所述的(3β，5β)-3-[[(9H-芴-9-基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基-12-氧代膽烷-24-酸(C)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖3E是實(shí)施例III所述的N-[(3β，5β)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]乙?；鵠氨基]-12，24-二氧代膽烷-24-基]-L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L67)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖4A是實(shí)施例IV所述的獲得中間產(chǎn)物(3β，5β，12α)-3-[[(9H-芴-9-基甲氧基)氨基]乙酰基]氨基-12-羥基膽烷-24-酸(3a)和(3β，5β，7α，12α)-3-[[(9H-芴-9-基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸(3b)的反應(yīng)流程的圖示。
圖4B是實(shí)施例IV所述的合成N-[(3β，5β，12α)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]乙?；鵠氨基]-12-羥基-24-氧代膽烷-24-基]-L-谷氨酰胺酰基-L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L63)的連續(xù)反應(yīng)的圖示。
圖4C是實(shí)施例IV所述的合成N-[(3β，5β，7α，12α)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙?；鵠氨基]-7，12-二羥基-24-氧代膽烷-24-基]-L-谷氨酰胺酰基-L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺(L64)的連續(xù)反應(yīng)的圖示。
圖4D是實(shí)施例IV所述的(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸(2b)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖4E是實(shí)施例IV所述的(3β，5β，12α)-3-[[(9H-芴-9-基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基-12-羥基膽烷-24-酸(3a)的化學(xué)結(jié)構(gòu)；圖4F是實(shí)施例IV所述的(3β，5β，7α，12α)-3-[[(9H-芴-9-基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸(3b)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖4G是實(shí)施例IV所述的N-[(3β，5β，12α)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]乙?；鵠氨基]-12-羥基-24-氧代膽烷-24-基]-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺(L63)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖4H是實(shí)施例IV所述的N-[(3β，5β，7α，12α)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙?；鵠氨基]-7，12-二羥基-24-氧代膽烷-24-基]-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺(L64)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖5A是實(shí)施例V所述的合成4-[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]甲基]苯甲?；?L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨酰基-甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺(L71)和反式-4-[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]甲基]環(huán)己基羰基-L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L72)的連續(xù)反應(yīng)的一般圖示，其中連接基分別來(lái)自圖5B和5C。
圖5B是用于圖5A所示和實(shí)施例V所述的化合物L(fēng)71的連接基的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖5C是用于如圖5A所示和實(shí)施例V所述的化合物L(fēng)72的連接基的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖5D是實(shí)施例V所述的用蛙皮素[7-14](B)官能化的Rink酰胺樹(shù)脂的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖5E是實(shí)施例V所述的反式-4-[[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]甲基]環(huán)己烷甲酸(D)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖6A是實(shí)施例VI所述的合成中間產(chǎn)物連接基2-[[[9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]甲基]苯甲酸(E)的反應(yīng)流程的圖示。
圖6B是如實(shí)施例VI所述的合成中間產(chǎn)物連接基4-[[[9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]甲基]-3-硝基苯甲酸(H)的反應(yīng)流程的圖示。
圖6C是實(shí)施例VI所述的合成N-[2-[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]甲基]苯甲?；鵠-L-谷氨酰胺酰基-L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L75)的圖示。
圖6D是實(shí)施例VI所述的合成N-[4-[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]甲基]-3-硝基苯甲?；鵠-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L76)的圖示。
圖7A是實(shí)施例VII所述的合成中間產(chǎn)物連接基N-[4-[[[9H-芴-9-基甲氧基]羰基]氨基]甲基]苯氧基]乙酸(E)的反應(yīng)流程的圖示。
圖7B是實(shí)施例VII所述的合成N-[[4-[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]甲基]苯氧基]乙?；鵠-L-谷氨酰胺酰基-L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨酰基-甘氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L124)的圖示。
圖7C是實(shí)施例VII所述的N-[[4-[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]甲基]苯氧基]乙酰基]-L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨酰基-甘氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L124)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖8A是實(shí)施例VIII所述的合成中間產(chǎn)物4-[[[9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]甲基]-3-甲氧基苯甲酸(E)的反應(yīng)流程的圖示。
圖8B是實(shí)施例VIII所述的合成N-[4-[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]甲基]-3-甲氧基苯甲?；鵠-L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L125)的圖示。
圖8C是實(shí)施例VIII所述的[4-[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]甲基]-3-甲氧基苯甲?；鵠-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L125)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖9A是實(shí)施例IX所述的合成3-[[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]乙?；鵠氨基苯甲酸(B)的反應(yīng)的圖示。
圖9B是實(shí)施例IX所述的合成6-[[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]乙酰基]氨基萘甲酸(C)的反應(yīng)的圖示。
圖9C是實(shí)施例IX所述的合成4-[[[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]乙?；鵠甲基氨基]苯甲酸(D)的反應(yīng)的圖示。
圖9D是實(shí)施例IX所述的合成N-[4-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙?；鵠氨基]苯基乙酰基]-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺(L146)、N-[3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙?；鵠氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺(L233)、N-[6-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙?；鵠氨基]萘甲?；鵠-L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L234)和N-[4-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙酰基]甲基氨基]苯甲?；鵠-L-谷氨酰胺酰基-L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L235)的反應(yīng)的圖示。
圖10A是實(shí)施例X所述的合成7-[[雙(1，1-二甲基乙氧基)氧膦基]甲基]-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，10-三乙酸4，10-雙(1，1-二甲基乙基)酯H的反應(yīng)的圖示。
圖10B是實(shí)施例X所述的合成N-[4-[[[[[4，10-雙(羧甲基)-7-(二羥基氧膦基)甲基-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙酰基]氨基]苯甲?；鵠-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨酰基-甘氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L237)的反應(yīng)的圖示。
圖11A是實(shí)施例XI所述的合成N，N-二甲基甘氨?；?L-絲氨?；?[S-[(乙?；被?甲基]]-L-半胱氨?；?甘氨?；?4-氨基苯甲酰基-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨酰基-甘氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L238)的反應(yīng)的圖示。
圖11B是實(shí)施例XI所述的合成N，N-二甲基甘氨?；?L-絲氨酰基-[S-[(乙?；被?甲基]]-L-半胱氨?；?甘氨酰基-(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基-24-氧代膽烷-24-基-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺(L239)的反應(yīng)的圖示。
圖12A是實(shí)施例XII所述的合成4-[[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]乙?；鵠氨基-3-甲氧基苯甲酸(A)的反應(yīng)的圖示。
圖12B是實(shí)施例XII所述的合成4-[[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]乙?；鵠氨基-3-氯苯甲酸(D)的反應(yīng)的圖示。
圖12C是實(shí)施例XII所述的合成4-[[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]乙?；鵠氨基-3-甲基苯甲酸(E)的反應(yīng)的圖示。
圖12D是實(shí)施例XII所述的N-[4-[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠甘氨酰基]氨基]-3-甲氧基苯甲?；鵠]-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L240)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖12E是實(shí)施例XII所述的化合物N-[4-[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠甘氨酰基]氨基]3-氯苯甲?；鵠L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L241)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖12F是實(shí)施例XII所述的N-[4-[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠甘氨?；鵠氨基]3-甲基苯甲?；鵠L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L242)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖13A是實(shí)施例XIII所述的合成4-[N，N′-雙[2-[(9-H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基乙基]氨基]-4-氧代丁酸(D)的反應(yīng)的圖示。
圖13B是實(shí)施例XIII所述的合成N-[4-[[4-[雙[2-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙基]氨基-1，4-二氧代丁基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺，(L244)的反應(yīng)的圖示。
圖13C是實(shí)施例XIII所述的化合物L(fēng)244的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖14A和圖14B是實(shí)施例XLIII所述的結(jié)合和競(jìng)爭(zhēng)曲線(xiàn)的圖示。
圖15A是實(shí)施例LV所述的放射治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖示。
圖15B是實(shí)施例LV所述的其它放射治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖示。
圖16是N-[4-[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠甘氨酰基]氨基]-L-賴(lài)氨?；?(3，6，9)-三氧雜十一烷-1，11-二甲酸-3，7-二脫氧-3-氨基膽酸]-L-精氨?；?L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L65)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖17是N-[2-S-[[[[[12α-羥基-17α-(1-甲基-3-羧基丙基)本膽烷-3β-氨基甲?；籽趸已趸已趸阴；鵠-氨基-6-[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]乙?；鵠氨基]己?；?L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L66)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖18A是N-[4-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙酰基]氨基]苯甲?；鵠-L-谷氨酰胺酰基-L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺(L70)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖18B是N-[4-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]-3-羧基丙酰基]氨基]乙?；鵠氨基]苯甲?；鵠-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨酰基-甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L114)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖18C是N-[4-[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]-2-羥基-3-丙氧基]苯甲?；鵠-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L144)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖18D是N-[(3β，5β，7α，12α)-3-[[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙氧基乙氧基]乙酰基]氨基]-7，12-二羥基膽烷-24-基]-L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺(L69)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖18E是N-[4-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]乙?；鵠氨基]苯基乙?；鵠-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨酰基-甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L146)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖19公開(kāi)可以用于制備如實(shí)施例LVI所述的化合物L(fēng)64和L70的中間產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖20是實(shí)施例LVI所述的利用分段偶聯(lián)制備L64的圖示。
圖21是制備(1R(雙{2-[雙(羧甲基)氨基]乙基}氨基)丙烷-3-甲酸-1-羧基-甘氨?；?4-氨基苯甲?；?L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L201)的圖示。
圖22A是用于制備L202的化學(xué)中間產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)的圖示。
圖22B是制備N(xiāo)-[(3β，5β，12α)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙?；鵠氨基]-4-肼基苯甲?；?L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L202)的圖示。
圖23A是用于制備L203的化學(xué)中間產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)的圖示。
圖23B是制備N(xiāo)-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-4-氨基苯甲酰基-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L203)的圖示。
圖24是制備N(xiāo)-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-4-氨基苯甲酰基-甘氨?；?L-谷氨酰胺酰基-L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L204)的圖示。
圖25是制備N(xiāo)-[(3β，5β，12α)-3-[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]-4-氨基苯甲?；?甘氨?；?L-谷氨酰胺酰基-L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L205)的圖示。
圖26A是用于制備L206的化學(xué)中間產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)的圖示。
圖26B是制備N(xiāo)-[(3β，5β，12α)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙?；鵠氨基]-[4′-氨基-2′-甲基聯(lián)苯-4-羧基]-L-谷氨酰胺酰基-L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L206)的圖示。
圖27A是用于制備L207的化學(xué)中間產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)的圖示。
圖27B是制備N(xiāo)-[(3β，5β，12α)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙酰基]氨基]-[3′-氨基-聯(lián)苯-3-羧基]-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺(L207)的圖示。
圖28是制備N(xiāo)-[(3β，5β，12α)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙酰基]氨基]-[1，2-二氨基乙基-對(duì)苯二?；鵠-L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L208)的圖示。
圖29A是用于制備L209的化學(xué)中間產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)的圖示。
圖29B是制備L209的圖示。
圖30A是用于制備L210的化學(xué)中間產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)的圖示。
圖30B是L210的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖31是N-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]-甘氨?；?甘氨?；?4-氨基苯甲?；?L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺L211的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖32是N-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-甘氨?；?4-氨基苯甲?；?L-谷氨?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺L212的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖33是N-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-甘氨?；?4-氨基苯甲?；?L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?1-甲硫氨酸羧酸酯L213的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖34是N-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]-甘氨?；?4-氨基苯甲酰基-D-苯丙氨?；?L-谷氨酰胺酰基-L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺L214的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖35是N-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]-甘氨?；?4-氨基苯甲?；?L-谷氨酰胺?；?L-精氨酰基-L-亮氨?；?甘氨酰基-L-天冬酰胺?；?L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺L215的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖36是N-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-甘氨?；?4-氨基苯甲?；?L-谷氨酰胺酰基-精氨?；?L-酪氨?；?甘氨?；?L-天冬酰胺?；?L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺L216的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖37是N-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]-甘氨?；?4-氨基苯甲?；?L-谷氨酰胺酰基-L-賴(lài)氨?；?L-酪氨酰基-甘氨?；?L-谷氨酰胺酰基-L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺L217的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖38是L218的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖39是N-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-甘氨?；?4-氨基苯甲?；?D-苯丙氨?；?L-谷氨酰胺酰基-L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨酰基-氨基戊基L219的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖40是N-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-甘氨酰基-4-氨基苯甲?；?L-谷氨酰胺酰基-L-色氨?；?L-絲氨?；?L-纈氨酰基-D-丙氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺L220的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖41是N-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-甘氨?；?4-氨基苯甲?；?D-苯丙氨?；?L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨?；?L-亮氨酸酰胺L221的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖42是N-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-甘氨?；?4-氨基苯甲?；?D-酪氨?；?L-谷氨酰胺酰基-L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?β丙氨?；?L-組氨?；?L-苯丙氨酰基-L-正亮氨酸酰胺L222的化學(xué)結(jié)構(gòu)。。
圖43是N-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-甘氨?；?4-氨基苯甲?；?L-苯丙氨?；?L-谷氨酰胺酰基-L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?β丙氨酰基-L-組氨?；?L-苯丙氨?；?L-正亮氨酸酰胺L223的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖44是N-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-甘氨酰基-4-氨基苯甲?；?L-谷氨酰胺酰基-L-色氨?；?L-丙氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-苯丙氨酰基-L-亮氨酸酰胺L224的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖45是N-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-甘氨?；?4-氨基苯甲?；?L-亮氨?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨酰基-L-絲氨?；?L-苯丙氨?；?L-蛋氨酸酰胺L225的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖46是N-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-甘氨酰基-4-氨基苯甲?；?L-組氨?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺L226的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖47是N-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-甘氨酰基-4-氨基苯甲?；?L-亮氨?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-絲氨酰基-L-苯丙氨?；?L-蛋氨酸酰胺L227的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖48是N-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-甘氨酰基-4-氨基苯甲?；?L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-苯丙氨?；?L-蛋氨酸酰胺L228的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖49A是如實(shí)施例LVII所述合成(3β，5β，7α，12α)-3-(9H-芴-9-基甲氧基)氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸(B)的反應(yīng)的圖示。
圖49B是如實(shí)施例LVII所述合成N-[3β，5β，7α，12α]-3-[[[2-[2-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]-7，12-二羥基-24-氧代膽烷-24-基]-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺(L69)的反應(yīng)的圖示。
圖50是如實(shí)施例LVIII所述合成N-[4-[2-羥基-3-[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]丙氧基]苯甲酰基]-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L144)的反應(yīng)的圖示。
圖51是L300的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖52是25℃下，在DMSO-d6中，Lu-L70的TOCSY光譜。
圖53是25℃下，在DMSO-d6中，Lu-L70的COSY光譜。
圖54是25℃下，在DMSO-d6中，Lu-L70的NOESY光譜。
圖55是25℃下，在DMSO-d6中，Lu-L70的gHSQC光譜。
圖56是25℃下，在DMSO-d6中，Lu-L70的gHMBC光譜。
圖57是25℃下，在DMSO-d6中，Lu-L70的gHSQCTOCSY光譜。
圖58是15℃下，在DMSO-d6中，Lu-L70的普通1H-NMR(下圖)和在3.5ppm的水峰的選擇性均-去偶合。
圖59是25℃下，在DMSO-d6中，175Lu-DO3A-一酰胺-Aoc-QWAVGHLM-NH2的TOCSY光譜。
圖60是L70的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖61是175Lu-DO3A-一酰胺-Aoc-QWAVGHLM-NH2的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖62是含有結(jié)合水分子的175Lu-L70的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖63是L301的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
申請(qǐng)中使用的縮寫(xiě)詞
發(fā)明詳述在以下說(shuō)明書(shū)中，將進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的各方面。為了進(jìn)行解釋?zhuān)o出了特定的結(jié)構(gòu)構(gòu)型和細(xì)節(jié)以使本發(fā)明被全面理解。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以明顯看出可以在不采用特定細(xì)節(jié)的情況下實(shí)施本發(fā)明。而且，可以省略或簡(jiǎn)化已知的特征，其目的在于不使本發(fā)明模糊。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供用于診斷成像或放射治療的新的和改進(jìn)的化合物。所述化合物包括通過(guò)連接基或間隔基連接到GRP受體靶向肽上的光標(biāo)記或能夠絡(luò)合藥用金屬離子或放射性核素的化學(xué)部分(金屬螯合劑)。
一般地，本發(fā)明的化合物可具有下式M-N-O-P-G其中M為金屬螯合劑(與金屬放射性核素絡(luò)合或不絡(luò)合的形式)或光標(biāo)記，N-O-P為連接基，而G為GRP受體靶向肽。在以下討論中描述各金屬螯合劑、光標(biāo)記、連接基和GRP受體靶向肽。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種能夠?qū)⒐鈽?biāo)記或金屬螯合劑連接到GRP受體靶向肽上的新的和改進(jìn)的連接基或間隔基。一般地，本發(fā)明的連接基可以具有以下式N-O-P其中N、O和P中的每一個(gè)在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中定義。
發(fā)現(xiàn)符合這里定義的標(biāo)準(zhǔn)的化合物與本領(lǐng)域中已知的其它GRP受體靶向肽綴合物相比具有改進(jìn)的藥代動(dòng)力學(xué)性能。例如，包含本發(fā)明的連接基的化合物在血流中保留更長(zhǎng)時(shí)間，并因此具有比先前已知的化合物更長(zhǎng)的半衰期。較長(zhǎng)的半衰期在醫(yī)藥上是有益的，因?yàn)樗试S更好的腫瘤靶向，從而用于診斷成像，特別是用于治療應(yīng)用，其中癌細(xì)胞和腫瘤接收更大量的放射性標(biāo)記的肽。此外，本發(fā)明化合物具有比現(xiàn)有技術(shù)的化合物改進(jìn)的組織受體特異性。
1A.金屬螯合劑術(shù)語(yǔ)“金屬螯合劑”指與金屬原子形成絡(luò)合物的分子，其中該絡(luò)合物在生理?xiàng)l件下是穩(wěn)定的。也就是說(shuō)，該金屬將在體內(nèi)與螯合劑骨架保持絡(luò)合。更具體地，金屬螯合劑是與放射性核素金屬絡(luò)合形成在生理?xiàng)l件下穩(wěn)定的金屬絡(luò)合物的分子，并且其還具有至少一個(gè)用于與連接基N-O-P綴合的反應(yīng)官能團(tuán)。該金屬螯合劑M可以是本領(lǐng)域中已知用于絡(luò)合藥用金屬離子或放射性核素的任何金屬螯合劑。該金屬螯合劑可以與金屬放射性核素絡(luò)合或不絡(luò)合。而且，該金屬螯合劑可以包括任選的間隔基，例如單一的氨基酸(例如Gly)，其不與金屬絡(luò)合，但在金屬螯合劑和連接基之間制造物理分隔。
本發(fā)明的金屬螯合劑可以包括，例如，線(xiàn)性、大環(huán)三聯(lián)吡啶和N3S、N2S2或N4螯合劑(還參見(jiàn)U.S.5,367,080、U.S.5,364,613、U.S.5,021,556、U.S.5,075,099、U.S.5,886,142，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容在此被全文引入作為參考)和本領(lǐng)域中已知的其它螯合劑，包括但不限于HYNIC、DTPA、EDTA、DOTA、TETA和雙氨基雙硫醇(BAT)螯合劑(還參見(jiàn)U.S.5,720,934).例如在美國(guó)專(zhuān)利6,143,274、6,093,382、5,608,110、5,665,329、5,656,254和5,688,487中描述了N4螯合劑，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容在此被全文引入作為參考。在PCT/CA94/00395，PCT/CA94/00479、PCT/CA95/00249和美國(guó)專(zhuān)利5,662,885、5,976,495和5,780,006中描述了某些N3S螯合劑，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容在此被全文引入作為參考。該螯合劑還可以包括螯合配體巰基-乙?；?甘氨酰基-甘氨?；?甘氨酸(MAG3)的衍生物，它包含N3S，以及N2S2系統(tǒng)，例如MAMA(一酰胺單胺二硫醇)、DADS(N2S二胺二硫醇)、CODADS等。這些配體系統(tǒng)和多種其它配體在Liu和Edwards，Chem Rev.1999，99，2235-2268及其參考資料中作了描述，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容在此被全文引入作為參考。
該金屬螯合劑還可以包括含有不以四配位基排列供給金屬的配體原子的絡(luò)合物。這些金屬螯合劑包括锝和錸二肟的硼酸加合物，例如在美國(guó)專(zhuān)利5,183,653、5,387,409和5,118,797中所述的那些，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容在此被全文引入作為參考。
優(yōu)選的螯合劑的實(shí)例包括但不限于二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、1，4，7，10-四氮雜環(huán)十四烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)、1-取代的1，4，7-三羧甲基1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷三乙酸(DO3A)、乙二胺四乙酸(EDTA)、4-羰基甲基-10-膦?；谆?1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，7-二乙酸(Cm4pm10d2a)；和1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷-1，4，8，11-四乙酸(TETA)。其它螯合配體為亞乙基雙-(2-羥基-苯基甘氨酸)(EHPG)及其衍生物，包括5-Cl-EHPG、5-Br-EHPG、5-Me-EHPG、5-t-Bu-EHPG和5-sec-Bu-EHPG；苯并二亞乙基三胺五乙酸(苯并-DTPA)及其衍生物，包括二苯并-DTPA、苯基-DTPA、二苯基-DTPA、芐基-DTPA和二芐基-DTPA；雙-2(羥基芐基)-亞乙基-二胺二乙酸(HBED)及其衍生物；包含至少3個(gè)碳原子，更優(yōu)選至少6個(gè)碳原子和至少2個(gè)雜原子(O和/或N)的大環(huán)化合物類(lèi)，所述大環(huán)化合物可以由1個(gè)環(huán)，或者在雜環(huán)元素處結(jié)合在一起的2或3個(gè)環(huán)組成，例如苯并-DOTA、二苯并-DOTA和苯并-NOTA，其中NOTA為1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷N，N′，N″-三乙酸，苯并-TETA、苯并-DOTMA，其中DOTMA為1，4，7，10-四氮雜環(huán)十四烷-1，4，7，10-四(甲基四乙酸)，和苯并-TETMA，其中TETMA為1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷-1，4，8，11-(甲基四乙酸)；1，3-丙二胺四乙酸(PDTA)和三亞乙基四胺六乙酸(TTHA)的衍生物；1，5，10-N，N′，N″-三(2，3-二羥基苯甲?；?-三兒茶酸酯(catecholate)(LICAM)和1，3，5-N，N′，N″-三(2，3-二羥基苯甲酰基)氨基甲基苯(MECAM)的衍生物。本發(fā)明考慮的代表性螯合劑和螯合基的實(shí)例公開(kāi)在以下文獻(xiàn)中WO 98/18496、WO 86/06605、WO 91/03200、WO 95/28179、WO 96/23526、WO 97/36619、PCT/US 98/01473、PCT/US98/20182和U.S.4,899,755、U.S.5,474,756、U.S.5,846,519和U.S.6,143,274，所述各文獻(xiàn)在此被全文引入作為參考。
特別優(yōu)選的金屬螯合劑包括以下所述的式1、2和3的金屬螯合劑(用于111In和放射性鑭系，例如177Lu、90Y、153Sm和166Ho)和式4、5和6的金屬螯合劑(用于放射性99mTc、186Re和188Re)。這些和其它金屬螯合基在美國(guó)專(zhuān)利6,093,382和5,608,110中作了描述，所述文獻(xiàn)在此被全文引入作為參考。此外，式3的螯合基例如在美國(guó)專(zhuān)利6,143,274中作了描述；式5的螯合基例如在美國(guó)專(zhuān)利5,627,286和6,093,382中作了描述，而式6的螯合基例如在美國(guó)專(zhuān)利5,662,885、5,780,006和5,976,495中作了描述，所有這些文獻(xiàn)被引入作為參考。特定的式6的金屬螯合劑包括N，N-二甲基Gly-Ser-Cys、N，N-二甲基Gly-Thr-Cys、N，N-二乙基Gly-Ser-Cys、N，N-二芐基Gly-Ser-Cys；及其其它變體。例如，實(shí)際上不與金屬放射性核素絡(luò)合的間隔基，例如額外的單一氨基酸Gly，可以連接到這些金屬螯合劑(例如N，N-二甲基Gly-Ser-Cys-Gly、N，N-二甲基Gly-Thr-Cys-Gly、N，N-二乙基Gly-Ser-Cys-Gly、N，N-二芐基Gly-Ser-Cys-Gly)。其它有用的金屬螯合劑，例如所有在美國(guó)專(zhuān)利6,334,996中公開(kāi)的金屬螯合劑(也在此被引入作為參考)(例如二甲基gly-L-叔丁基gly-L-Cys-Gly、二甲基gly-D-叔丁基gly-L-Cys-Gly、二甲基gly-L-叔丁基gly-L-Cys等)。
而且，硫保護(hù)基如Acm(乙酰氨基甲基)、三苯甲基或其它已知的烷基、芳基、?；⑼轷；?、芳?；€基?；陀袡C(jī)硫醇基可以連接到這些金屬螯合劑的半胱氨酸氨基酸上。
此外，其它有用的金屬螯合劑包括


在以上式1和2中，R為烷基，優(yōu)選甲基。在以上式5a和5b中，X為CH2或O；Y為C1-C10支鏈或非支鏈烷基、芳基、芳氧基、芳基氨基、芳基氨基酰基、芳基烷基-其中連接到芳基上的烷基為C1-C10支鏈或非支鏈烷基、C1-C10支鏈或非支鏈羥基或多羥基烷基或多烷氧基烷基或多羥基多烷氧基烷基；J是任選的，但如果存在的話(huà)是C(＝O)-、OC(＝O)-、SO2-、NC(＝O)-、NC(＝S)-、N(Y)、NC(＝NCH3)-、NC(＝NH)-、N＝N-、高聚酰胺或雜聚胺，源自合成或天然存在的氨基酸；所有情況下其中n為1-100。這些結(jié)構(gòu)的其它變體例如在美國(guó)專(zhuān)利6,093,382中作了描述。在式6中，基團(tuán)S-NHCOCH3可以被SH或S-Z替換，其中Z為任何已知的硫保護(hù)基，如上述的硫保護(hù)基。式7例示了用作金屬螯合劑的叔丁基化合物的一個(gè)實(shí)施方案。各前述專(zhuān)利、申請(qǐng)和參考資料的內(nèi)容在此被全文引入作為參考。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，金屬螯合劑包括環(huán)狀或非環(huán)狀多氨基羧酸，例如DOTA(1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸)，DTPA(二亞乙基三胺五乙酸)，DTPA-雙甲基酰胺，DTPA-雙嗎啉酰胺，Cm4pml0d2a(1，4-羰基甲基-10-膦?；谆?1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，7-二乙酸)，DO3A N-[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基、HP-DO3A、DO3A-一酰胺及其衍生物。
用于閃爍掃描術(shù)或放射治療優(yōu)選的金屬放射性核素包括99mTc、51Cr、67Ga、68Ga、47Sc、51Cr、167Tm、141Ce、111In、168Yb、175Yb、140La、90Y、88Y、153Sm、166Ho、165Dy、166Dy、62Cu、64Cu、67Cu、97Ru、103Ru、186Re、188Re、203Pb、211Bi、212Bi、213Bi、214Bi、105Rh、109Pd、117mSn、149Pm、161Tb、177Lu、198Au和199Au和它們的氧化物或氮化物。金屬的選擇將基于所需的治療或診斷應(yīng)用而確定。例如，為診斷目的(例如為了診斷和監(jiān)測(cè)原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤的治療進(jìn)展)，優(yōu)選的放射性核素包括64Cu、67Ga、68Ga、99mTc和111In，特別優(yōu)選99mTc和111In。為治療目的(例如為了提供對(duì)與前列腺、乳腺、肺等的癌癥有關(guān)的原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤的放射治療)，優(yōu)選的放射性核素包括64Cu、90Y、105Rh、111In、117mSn、149Pm、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、175Yb、177Lu、186/188Re和199Au，特別優(yōu)選177Lu和90Y。99mTc是特別有用的，并因?yàn)樗牡统杀尽⒖色@得性、成像性能和高特異性活性而優(yōu)選用于診斷性放射性核素。99mTc的核和放射性性能使這種同位素成為理想的閃爍掃描顯像劑。這種同位素的單光子能量為140keV，而放射性半衰期為大約6小時(shí)，并容易從99Mo-99mTc發(fā)生器獲得。例如，99mTc標(biāo)記的肽可以用于診斷和監(jiān)測(cè)原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤的治療進(jìn)展。用117Lu、90Y或其它治療性放射性核素標(biāo)記的肽可以用于提供對(duì)與前列腺、乳腺、肺等的癌癥有關(guān)的原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤的放射治療。
1B.光標(biāo)記在一個(gè)例舉性實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物可以與光標(biāo)記物綴合，例如光染料，包括有機(jī)發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)，其具有廣泛的離域環(huán)系統(tǒng)并且在400-1500nm的范圍內(nèi)具有最大吸收和發(fā)射。本發(fā)明的化合物可以選擇性地用生物發(fā)光分子衍生。光標(biāo)記物的最大吸收的優(yōu)選范圍為600-1000nm以使對(duì)來(lái)自血紅蛋白的信號(hào)的干擾最小化。優(yōu)選光吸收標(biāo)記具有大摩爾吸光系數(shù)，例如＞105cm-1M-1，而熒光光染料具有高量子產(chǎn)額。光染料的實(shí)例包括但不限于在WO 98/18497、WO 98/18496、WO98/18495、WO98/18498、WO98/53857、WO96/17628、WO97/18841、WO 96/23524、WO 98/47538及其中引述的參考資料中描述的那些。例如，光標(biāo)記物可以直接共價(jià)連接到本發(fā)明的化合物，例如包含本發(fā)明的GRP受體靶向肽和連接基的化合物。幾種吸收并發(fā)射光在電磁光譜的可見(jiàn)和近紅外區(qū)的染料由于它們的生物相容性、高摩爾吸光系數(shù)和/或高熒光量子產(chǎn)額而目前被用于許多生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。與作為對(duì)比劑的染料結(jié)合的光形態(tài)的高度敏感性與核醫(yī)學(xué)的相似，并允許在沒(méi)有不期望的電離輻射作用的情況下使器官和組織顯像。在近紅外(NIR)區(qū)具有強(qiáng)烈吸收和發(fā)射的花青染料是特別有用的，因?yàn)樵诖藚^(qū)域生物組織是光學(xué)透明的。例如，在NIR區(qū)吸收和發(fā)射的吲哚花青綠已用于監(jiān)測(cè)心輸出量、肝功能和肝血流，且它的官能化衍生物已用于綴合生物分子以用于診斷目的(R.B.Mujumdar，L.A.Ernst，S.R.Mujumdar等人，Cyanine dye labeling reagentsSulfoindocyanineSuccinimidyl esters.Bioconjugate Chemistry，1993，4(2)，105-111；Linda G.Lee和Sam L.Woo.″N-Heteroaromatic ion andiminium ion substituted cyanine dyes for use as fluorescentlabels″，U.S.Pat.No.5,453,505；EricHohenschuh等人″Lightimaging contrast agents″，WO98/48846；Jonathan Turner等人″Optical diagnostic agents for the diagnosis ofneurodegenerative diseases by means of near infra-redradiation″，WO 98/22146；Kai Licha等人″In-vivo diagnosticprocess by near infrared radiation″，WO96/17628；Robert A.Snow等人，化合物，WO 98/48838。在以下文獻(xiàn)中描述了多種成像技術(shù)和試劑美國(guó)專(zhuān)利6,663,847、6,656,451、6,641,798、6,485,704、6,423,547、6,395,257、6,280,703、6,277,841、6,264,920、6,264,919、6,228,344、6,217,848、6,190,641、6,183,726、6,180,087、6,180,086、6,180,085、6,013,243和公開(kāi)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)2003185756、20031656432、2003158127、2003152577、2003143159、2003105300、2003105299、2003072763、2003036538、2003031627、2003017164、2002169107、2002164287和2002156117。上述所有文獻(xiàn)的內(nèi)容在此被全文引入作為參考。
2A.包含至少一個(gè)非α-氨基酸的連接基在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，連接基N-O-P包含至少一個(gè)非α-氨基酸。因此，在連接基N-O-P的這個(gè)實(shí)施方案中，N為0(其中0意指它不存在)、α或非α-氨基酸或其它連接基；O為α或非α-氨基酸；和P為0、α或非α-氨基酸或其它連接基，其中N、O或P中至少一個(gè)為非α-氨基酸。
因此，在一個(gè)實(shí)例中，N＝Gly，O＝非α-氨基酸，而P＝0。
α-氨基酸在本領(lǐng)域中是已知的，并包括天然存在和合成的氨基酸。
非α-氨基酸在本領(lǐng)域中也是已知的，并包括天然存在或合成的氨基酸。優(yōu)選的非α-氨基酸包括8-氨基-3，6-二氧雜辛酸；N-4-氨基乙基-N-1-乙酸；和具有式NH2-(CH2CH2O)n-CH2CO2H或NH2-(CH2CH2O)n-CH2CH2CO2H的聚乙二醇衍生物，其中n＝2-100。
包含具有至少一個(gè)非α-氨基酸的連接基的具有式M-N-O-P-G的化合物的實(shí)例列于表1。這些化合物可以用本文，特別是實(shí)施例中公開(kāi)的方法，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的類(lèi)似方法制備。
表1
*BBN(7-14)為[SEQ ID NO1]1HPLC方法指HPLC梯度的10分鐘時(shí)間。
2HPLC RT指HPLC中化合物的保留時(shí)間。
3MS指質(zhì)譜，其中分子量由質(zhì)量/單位電荷(m/e)計(jì)算。
4IC50指抑制碘化蛙皮素與細(xì)胞上GRP受體的50％結(jié)合的化合物濃度。
2B.包含至少一個(gè)取代的膽汁酸的連接基在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，連接基N-O-P包含至少一個(gè)取代的膽汁酸。因此，在連接基N-O-P的這個(gè)實(shí)施方案中，N為0(其中0意指它不存在)、α-氨基酸、取代的膽汁酸或其它連接基；O為α-氨基酸或取代的膽汁酸；和P為0、α-氨基酸，取代的膽汁酸或其它連接基，其中N、O或P中至少一個(gè)為取代的酸。
膽汁酸見(jiàn)于膽汁(肝的分泌物)，它是具有羥基和終止于羧基的5個(gè)碳原子側(cè)鏈的甾類(lèi)化合物。在取代的膽汁酸中，膽汁酸的至少一個(gè)原子如氫原子被另一原子、分子或化學(xué)基團(tuán)取代。例如，取代的膽汁酸包括具有3-氨基、24-羧基官能團(tuán)、任選在7和12位被氫、羥基或酮官能團(tuán)取代的那些。
本發(fā)明中其它有用的取代的膽汁酸包括取代的膽酸及其衍生物。特定的取代的膽酸衍生物包括(3β，5β)-3-氨基膽烷-24-酸；(3β，5β，12α)-3-氨基-12-羥基膽烷-24-酸；
(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸；Lys-(3，6，9)-三氧雜十一烷-1，11-二羰基-3，7-二脫氧-3-氨基膽酸)；(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羥基-12-氧代膽烷-24-酸；和(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羥基膽烷-24-酸。
包含具有至少一個(gè)取代的膽汁酸的連接基的具有式M-N-O-P-G的化合物的實(shí)例列于表2。這些化合物可以使用本文公開(kāi)的方法，特別是實(shí)施例公開(kāi)的方法，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的類(lèi)似方法來(lái)制備。
表2
*BBN(7-14)為[SEQ ID NO1]1HPLC方法指HPLC梯度的10分鐘時(shí)間。
2HPLC RT指HPLC中化合物的保留時(shí)間。
3MS指質(zhì)譜，其中分子量由質(zhì)量/單位電荷(m/e)計(jì)算。
4IC50指抑制碘化蛙皮素與細(xì)胞上GRP受體的50％結(jié)合的化合物濃度。
2C.包含至少一個(gè)具有環(huán)狀基團(tuán)的非α-氨基酸的連接基在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，連接基N-O-P包含至少一個(gè)具有環(huán)狀基團(tuán)的非α-氨基酸。因此，在連接基N-O-P的這個(gè)實(shí)施方案中，N為0(其中0意指它不存在)、α-氨基酸、具有環(huán)狀基團(tuán)的非α-氨基酸或其它連接基；O為α-氨基酸或具有環(huán)狀基團(tuán)的非α-氨基酸；和P為0、α-氨基酸、具有環(huán)狀基團(tuán)的非α-氨基酸或其它連接基，其中N、O或P中至少一個(gè)為具有環(huán)狀基團(tuán)的非α-氨基酸。
具有環(huán)狀基團(tuán)的非α-氨基酸包括取代的苯基、聯(lián)苯、環(huán)己基或其它含胺和羧基的環(huán)狀脂族或雜環(huán)部分。這些實(shí)例包括4-氨基苯甲酸(此后在說(shuō)明書(shū)中稱(chēng)作“Abz4”)3-氨基苯甲酸4-氨基甲基苯甲酸8-氨基辛酸反式-4-氨基甲基環(huán)己烷甲酸4-(2-氨基乙氧基)苯甲酸六氫異煙酸2-氨基甲基苯甲酸4-氨基-3-硝基苯甲酸4-(3-羧甲基-2-酮-1-苯并咪唑基-哌啶6-(哌嗪-1-基)-4-(3H)-喹唑啉酮-3-乙酸(2S，5S)-5-氨基-1，2，4，5，6，7-六氫-吖庚因并[3，21-hi]吲哚-4-酮-2-甲酸(4S，7R)-4-氨基-6-氮雜-5-氧代-9-硫雜二環(huán)[4.3.0]壬烷-7-甲酸3-羧甲基-1-苯基-1，3，8-三氮雜螺[4.5]癸烷-4-酮
N1-哌嗪乙酸N-4-氨基乙基-N-1-哌嗪乙酸(3S)-3-氨基-1-羧甲基己內(nèi)酰胺(2S，6S，9)-6-氨基-2-羧甲基-3，8-二氮雜二環(huán)-[4，3，0]-壬烷-1，4-二酮3-氨基-3-脫氧膽酸4-羥基苯甲酸4-氨基苯基乙酸3-羥基-4-氨基苯甲酸3-甲基-4-氨基苯甲酸3-氯-4-氨基苯甲酸3-甲氧基-4-氨基苯甲酸6-氨基萘甲酸N，N′-雙(2-氨基乙基)-琥珀酰胺酸包含具有至少一個(gè)含環(huán)狀基團(tuán)的非α-氨基酸的連接基的具有式M-N-O-P-G的化合物的實(shí)例列于表3。這些化合物可以用本文公開(kāi)的方法，特別是實(shí)施例公開(kāi)的方法，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的類(lèi)似方法制備。
表3
*BBN(7-14)為[SEQ ID NO1]**NT定義為“未測(cè)試”***BOA定義為(1R)-1-(雙{2-[雙(羧甲基)氨基]乙基}氨基)丙烷-1，3-二甲酸。
1HPLC方法指HPLC梯度的10分鐘時(shí)間。
2HPLC RT指HPLC中化合物的保留時(shí)間。
3MS指質(zhì)譜，其中分子量由質(zhì)量/單位電荷(m/e)計(jì)算。
4IC50指抑制碘化蛙皮素與細(xì)胞上GRP受體的50％結(jié)合的化合物濃度。
一小組合有優(yōu)選連接基和多種GRP受體靶向肽的化合物如表4所述。這些化合物可以用本文公開(kāi)的方法，特別是實(shí)施例公開(kāi)的方法，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的類(lèi)似方法制備。
表4
2D.其它連接基可以在連接基N-O-P內(nèi)使用的其它連接基包括用于將GRP受體靶向肽偶聯(lián)至金屬螯合劑或光標(biāo)記上同時(shí)不會(huì)不利地影響GRP受體靶向肽的靶向功能或金屬螯合劑的金屬絡(luò)合功能或光標(biāo)記的檢測(cè)能力的化學(xué)基團(tuán)。適宜的其它連接基包括單獨(dú)的肽(即連接在一起的氨基酸)、非肽基團(tuán)(例如烴鏈)或氨基酸序列和非肽間隔基的組合。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在連接基N-O-P內(nèi)使用的其它連接基包括L-谷氨酰胺和烴鏈或它們的組合。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，在連接基N-O-P內(nèi)使用的其它連接基包括由一系列氨基酸(例如二甘氨酸、三甘氨酸、gly-gly-glu、gly-ser-gly等)組成的純肽連接基團(tuán)，其中聚合鏈中GRP受體靶向肽的N-末端殘基與金屬螯合劑或光標(biāo)記之間的原子總數(shù)為≤12個(gè)原子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，在連接基N-O-P內(nèi)使用的其它連接基還可以包括烴鏈[即R1-(CH2)n-R2]，其中n為0-10，優(yōu)選n＝3-9，R1為可以用作共價(jià)連接配體骨架或預(yù)先形成的金屬螯合劑或金屬絡(luò)合骨架或光標(biāo)記的位點(diǎn)的基團(tuán)(例如H2N-、HS-、-COOH)；而R2為用于共價(jià)偶聯(lián)至GRP受體靶向肽的N-末端NH2-基團(tuán)的基團(tuán)(例如R2為活化的COOH基團(tuán))。多種用于將配體(即螯合劑)或優(yōu)選的金屬螯合物偶聯(lián)至生物分子上的化學(xué)方法已在文獻(xiàn)中作了描述[Wilbur，1992；Parker，1990；Hermanson，1996；Frizberg等人，1995]。一種或多種這些方法可以用于將未絡(luò)合的配體(螯合劑)或放射金屬螯合物或光標(biāo)記連接到連接基或者將連接基連接到GRP受體靶向肽上。這些方法包括形成酸酐、醛、芳基異硫氰酸酯、活化的酯或N-羥基琥珀酰亞胺[Wilbur，1992；Parker，1990；Hermanson，1996；Frizberg等人，1995]。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在連接基N-O-P內(nèi)使用的其它連接基可以由下述的具有親電體或親核體的連接基前體形成LP1在連接基至少2個(gè)位置上具有相同的親電體E1或相同的親核體Nu1的連接基前體；LP2具有親電體E1和在連接基的另一位置的不同親電體E2的連接基前體；LP3具有親核體Nu1和在連接基的另一位置的不同親核體Nu2的連接基前體；或者LP4一個(gè)末端以親電體E1官能化和另一末端以親核體Nu1官能化的連接基前體。
優(yōu)選的親核體Nu1/Nu2包括-OH、-NH、-NR、-SH、-HN-NH2、-RN-NH2和-RN-NHR′，其中R′和R獨(dú)立地選自上述關(guān)于R的定義，除了R′不為H。
優(yōu)選的親電體E1/E2包括-COOH、-CH＝O(醛)、-CR＝OR′(酮)、-RN-C＝S、-RN-C＝O、-S-S-2-吡啶基、-SO2-Y、-CH2C(＝O)Y和
其中Y可以選自以下基團(tuán) Cl，Br，F(xiàn) 3.GRP受體靶向肽GRP受體靶向肽(即式M-N-O-P-G中的G)為任何肽、其等同物、衍生物或類(lèi)似物，它對(duì)GRP受體家族具有結(jié)合親和力。
GRP受體靶向肽可以是激動(dòng)劑或拮抗劑的形式。已知GRP受體靶向肽激動(dòng)劑在以高度親和力結(jié)合之后“激活”細(xì)胞，并可以被細(xì)胞內(nèi)化。相反，已知GRP受體靶向肽拮抗劑僅與細(xì)胞上的GRP受體結(jié)合而不被細(xì)胞內(nèi)化，且不“激活”細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，GRP受體靶向肽為激動(dòng)劑。
在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，GRP激動(dòng)劑為蛙皮素(BBN)類(lèi)似物和/或其衍生物。BBN衍生物或其類(lèi)似物優(yōu)選包含BBN結(jié)合區(qū)的相同一級(jí)結(jié)構(gòu)(即BBN(7-14)[SEQ ID NO1])或類(lèi)似的一級(jí)結(jié)構(gòu)，具有以比單獨(dú)的BBN更好或類(lèi)似的結(jié)合親和力與GRP受體發(fā)生特異性結(jié)合的特定氨基酸置換(即Kd＜25nM)。適宜的化合物包括肽、肽模擬物及其類(lèi)似物和衍生物。BBN-14位L-蛋氨酸(Met)的存在一般將賦予激動(dòng)劑特性，而B(niǎo)BN-14位該殘基的缺乏一般將賦予拮抗劑特性[Hoffken，1994]。某些有用的蛙皮素類(lèi)似物公開(kāi)在美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)2003/0224998中，所述文獻(xiàn)在此被全文引用。
現(xiàn)有技術(shù)已記載在BBN(8-14)結(jié)合區(qū)存在一些和選擇數(shù)目的特異性氨基酸置換(例如D-Ala11置換L-Gly11或D-Trp8置換L-Trp8)，所述置換可以在不減小結(jié)合親和力的情況下完成[Leban等人，1994；Qin等人，1994；Jensen等人，1993]。此外，某些氨基酸鏈或其它基團(tuán)與BBN-8位(即Trp8殘基)的N-末端胺基的連接可以大幅減小BBN類(lèi)似物與GRP受體的結(jié)合親和力[Davis等人，1992；Hoffken，1994；Moody等人，1996；Coy等人，1988；Cai等人，1994]。在少數(shù)情況下，可以附加額外的氨基酸或化學(xué)部分而不減小結(jié)合親和力。
BBN受體靶向肽的類(lèi)似物包括以比BBN更大或相同的親和力靶向GRP受體的分子以及GRP或BBN的突變蛋白質(zhì)、逆肽(retro-peptide)和逆-反向-肽(retro-inverso-peptide)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到這些類(lèi)似物還可以包含修飾，所述修飾包括置換和/或缺失和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，條件是這些修修飾沒(méi)有不利地改變本文所述的肽的生物活性。這些置換可以通過(guò)用它們的同義氨基酸置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸來(lái)完成。一組內(nèi)的同義氨基酸定義為具有充足的物理化學(xué)性能以允許組內(nèi)成員之間進(jìn)行置換而保持分子的生物功能的氨基酸。
氨基酸的缺失或插入也可以引入所定義的序列，條件是它們不改變?cè)撔蛄械纳锕δ堋?yōu)選這些插入或缺失應(yīng)該限于1、2、3、4或5個(gè)氨基酸，且不應(yīng)除去或者物理破壞或替換對(duì)功能構(gòu)象來(lái)說(shuō)重要的氨基酸。本文所述的GRP受體靶向肽的突變蛋白質(zhì)具有與本發(fā)明說(shuō)明書(shū)公開(kāi)的序列同源的序列，其中在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置存在氨基酸置換、缺失或插入。突變蛋白質(zhì)的生物活性至少為本文所述肽的40％，優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選60-70％，最優(yōu)選80-90％。但是，它們還可以具有大于特別例舉的肽的生物活性，并因此不必一定要與所例舉的肽的生物功能完全相同。GRP受體靶向肽的類(lèi)似物還包括將改變引入肽骨架的酰胺鍵，包括硫代酰胺、亞甲基胺和E-烯烴的肽模擬物或假肽。而且基于GRP、BBN的結(jié)構(gòu)的肽或氨基酸被N-取代的肼羰基化合物替換的其肽類(lèi)似物(還已知為氮雜氨基酸)也包括在這里所用的術(shù)語(yǔ)類(lèi)似物中。
取決于所選擇的螯合劑，所述GRP受體靶向肽可以通過(guò)多種不同方法來(lái)制備。通常所述肽可以最方便地通過(guò)肽合成技術(shù)中已建立和已知的技術(shù)來(lái)制備，所述技術(shù)例如固相肽合成(SPPS)方法。固相肽合成(SPPS)包括往與不溶性載體或基質(zhì)如聚苯乙烯連接的生長(zhǎng)的肽鏈上分步加入氨基酸殘基。肽的C末端殘基首先固定于可商購(gòu)得到的載體上，其氨基用N-保護(hù)試劑如叔丁氧羰基(Boc)或芴基甲氧基羰基(Fmoc)保護(hù)。用適宜的脫保護(hù)劑除去氨基保護(hù)基，例如對(duì)于Boc用TFA，對(duì)于Fmoc用哌啶，加入下一個(gè)氨基酸殘基(N-保護(hù)形式)和偶聯(lián)劑如N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或N，N′-二異丙基碳二亞胺(DIC)或2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)。在肽鍵形成后，從載體上洗去試劑。在加入最后的殘基之后，用適宜的試劑如三氟乙酸(TFA)或氟化氫(HF)從載體上裂解肽。
然后可以通過(guò)使GRP受體靶向肽的Trp8殘基的游離氨基與適宜的連接基官能團(tuán)反應(yīng)而偶聯(lián)連接基以形成綴合物。以上討論的螯合劑、連接基和靶向部分的完整構(gòu)建體還可以在樹(shù)脂上裝配，然后通過(guò)適宜的試劑如三氟乙酸或HF裂解。
蛙皮素(7-14)經(jīng)過(guò)體外和體內(nèi)蛋白酶切割而縮短了肽的半衰期。多肽主鏈的酰胺鍵可被取代并保留活性，同時(shí)抵抗蛋白酶切割，這在文獻(xiàn)中是熟知的。例如，為了減少或消除不需要的蛋白水解作用，或使血清穩(wěn)定性減小導(dǎo)致生物活性降低或消失的其它降解途徑，或?yàn)榱讼拗苹蛟黾訕?gòu)象柔性，常常使用模擬現(xiàn)存構(gòu)象或以所需方式改變構(gòu)象的官能團(tuán)取代肽主鏈內(nèi)的酰胺鍵。這種修飾可增加結(jié)合親和性或改善藥動(dòng)學(xué)行為。應(yīng)了解肽合成領(lǐng)域的技術(shù)人員可對(duì)連接兩個(gè)氨基酸的任何酰胺鍵(例如，靶向部分、連接基、螯合劑等中的酰胺鍵)進(jìn)行下列酰胺鍵改變，預(yù)期所得肽可具有相同或更高的活性插入α-N-甲基酰胺或主鏈硫代酰胺，除去羰基以產(chǎn)生關(guān)聯(lián)仲胺，將一個(gè)氨基酸替換為氮雜-氨基酸以產(chǎn)生縮氨基脲衍生物，使用E-烯烴和取代E-烯烴作為酰胺鍵代用品。還可通過(guò)插入不穩(wěn)定酰胺鍵的其中一種氨基酸的D-氨基酸，或通過(guò)α-甲基氨基酸衍生物來(lái)防止水解。還可用雜環(huán)如唑、吡咯烷酮、咪唑以及酮亞甲基(ketomethylene)和氟烯烴替代主鏈酰胺鍵。
在表4a中列出了一些具體的化合物，包括這種酰胺鍵修飾。表4a中所用各種酰胺鍵修飾的縮寫(xiě)詞在下面說(shuō)明
表4A
4.標(biāo)記和施用放射性藥物化合物可以通過(guò)配位化學(xué)技術(shù)中公知的多種方法在放射性藥物綴合物中引入金屬。如果金屬為99mTc-一種優(yōu)選的用于診斷成像的放射性核素，則可以使用以下一般方法形成锝絡(luò)合物。通過(guò)以下方法形成肽-螯合劑綴合物溶液首先將綴合物溶于水、稀酸或醇如乙醇的水溶液。然后任選將溶液脫氣以除去溶解的氧。如果在肽中存在-SH基團(tuán)，則可以任選使用巰基保護(hù)基如Acm(乙酰氨基甲基)、三苯甲基或其它巰基保護(hù)基保護(hù)巰基免于氧化。用適宜的試劑例如氫氧化鈉除去巰基保護(hù)基，然后用有機(jī)酸如乙酸(pH 6.0-6.5)中和。作為可替代的選擇，可以在锝螯合期間原位除去巰基保護(hù)基。在標(biāo)記步驟中，將得自鉬發(fā)生器的高锝酸鈉與足量還原劑如氯化亞錫加到綴合物的溶液以還原锝，并使其在室溫下靜置或加熱。可以例如用C-18 Sep Pak柱[MilliporeCorporation，Waters Chromatography Division，34 Maple Street，Milord，Massachusetts 01757]進(jìn)行色譜處理或使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行HPLC而將標(biāo)記的綴合物與污染物99mTcO4-和膠體99mTcO2分離。
在一個(gè)可替代選擇的方法中，可以通過(guò)轉(zhuǎn)螯合(transchelation)反應(yīng)來(lái)完成標(biāo)記。在此方法中，锝源是锝溶液，它在與所選擇的螯合劑反應(yīng)之前被還原或與不穩(wěn)定的配體絡(luò)合，從而有利于與所選擇的螯合劑進(jìn)行配體交換。用于轉(zhuǎn)螯合的適宜配體的實(shí)例包括酒石酸鹽、檸檬酸鹽、葡萄糖酸鹽和庚葡糖酸鹽。可以認(rèn)識(shí)到所述的綴合物可以用上述的技術(shù)標(biāo)記，或者作為可替代的選擇，螯合劑本身可以標(biāo)記，然后與肽偶聯(lián)形成綴合物一種稱(chēng)為“預(yù)標(biāo)記螯合物”方法的工藝。Re和Tc均在元素周期表的VIIB行，且它們是化學(xué)同族元素。因此在極大程度上，這兩種金屬與在體外和體內(nèi)表現(xiàn)高穩(wěn)定性的配體骨架的絡(luò)合化學(xué)是相同的[Eckelman，1995]，且可以將類(lèi)似的螯合劑和方法用于進(jìn)行Re標(biāo)記。許多用于與肽和蛋白形成穩(wěn)定的放射金屬絡(luò)合物的99mTc或186/188Re絡(luò)合物螯合+5氧化態(tài)的這些金屬[Lister-James等人，1997]。這種氧化態(tài)可以將99mTc-或186/188Re選擇地置于已與生物分子綴合的配體骨架中，這種骨架是由多種不同的99mTc(V)和/或186/188Re(V)弱螯合物構(gòu)建的(例如99mTc-葡庚糖酸鹽、檸檬酸鹽、葡萄糖酸鹽等)[Eckelman，1995；Lister-James等人，1997；Pollak等人，1996]。這些文獻(xiàn)的內(nèi)容在此均被全文引入作為參考。
5.診斷和治療應(yīng)用如果用診斷和/或治療上有用的金屬或光標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，則本發(fā)明的化合物可以用于通過(guò)放射診斷、放射治療和光成像技術(shù)中已建立的方法治療和/或檢測(cè)任何涉及GRP受體(或NMB受體)超表達(dá)的病理。[例如參見(jiàn)Bu shbaum，1995；Fischman等人，1993；Schubiger等人，1996；Lowbertz等人，1994；Krenning等人，1994；光染料的實(shí)例包括但不限于以下文獻(xiàn)公開(kāi)的光染料WO 98/18497、WO 98/18496、WO98/18495、WO 98/18498、WO 98/53857、WO 96/17628、WO 97/18841、WO 96/23524、WO 98/47538及其引述的參考資料，其內(nèi)容在此均被全文引入作為參考。
GRP-R表達(dá)在許多人腫瘤中高度上調(diào)。例如參見(jiàn)WO99/62563。因此，本發(fā)明的化合物可以廣泛地用于治療和診斷癌癥，包括前列腺癌(原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性)、乳腺癌(原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性)、結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、胃泌素瘤、黑素瘤、惡性膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、子宮平滑肌肉瘤、前列腺上皮內(nèi)瘤[PIN]和卵巢癌。此外，本發(fā)明的化合物可以用于區(qū)分其中GRP受體上調(diào)和沒(méi)有上調(diào)的病癥(例如分別為慢性胰腺炎和胰腺導(dǎo)管癌)。
在實(shí)施例中更為詳細(xì)說(shuō)明的本發(fā)明的化合物在體內(nèi)比不具有本文公開(kāi)的新連接基的化合物表現(xiàn)出更大的特異性和更高的腫瘤攝取，對(duì)表達(dá)GRP受體的腫瘤表現(xiàn)出改進(jìn)的靶向能力，并因此用于對(duì)這些組織成像或遞送放射治療。實(shí)際上，如實(shí)施例所示，使用本發(fā)明的化合物進(jìn)行的放射治療更為有效(且存活時(shí)間增加)。
這些化合物的診斷應(yīng)用可以是作為利用閃爍、光學(xué)、聲致發(fā)光或光聲成像進(jìn)行的腫瘤細(xì)胞存在的一線(xiàn)診斷篩選，或者作為在放射免疫指導(dǎo)的外科手術(shù)(RIGS)領(lǐng)域利用手持放射檢測(cè)儀器靶向腫瘤組織的活性劑，作為一種在施用配對(duì)的放射治療化合物之前獲得放射量測(cè)定數(shù)據(jù)的手段，以及作為評(píng)價(jià)GRP受體群體作為治療對(duì)時(shí)間的函數(shù)的方法。
這些化合物的治療應(yīng)用可以定義為一種用作癌癥治療中的一線(xiàn)治療的藥劑，作為可以將這些藥劑與輔助化學(xué)治療聯(lián)合使用的聯(lián)合治療，和/或作為配對(duì)的治療劑。配對(duì)的概念指可以根據(jù)已選擇用于與適宜的螯合物結(jié)合的放射金屬而定既可充當(dāng)診斷劑又可充當(dāng)治療劑的單一的未金屬化化合物。如果該螯合劑不能適應(yīng)需要的金屬，則可以進(jìn)行適宜的取代以適應(yīng)不同的金屬，同時(shí)保持藥理學(xué)，使得診斷化合物的體內(nèi)表現(xiàn)可以用于預(yù)測(cè)放射治療化合物的表現(xiàn)。如果與輔助化學(xué)治療聯(lián)合使用，則可以使用任何適宜的化學(xué)治療劑，例如包括抗腫瘤藥如鉑化合物(例如螺鉑、順鉑和卡波鉑)、氨甲蝶呤、阿霉素、絲裂霉素、柄型菌素、博來(lái)霉素、胞嘧啶、阿糖胞苷、阿糖腺苷、巰基聚賴(lài)氨酸、長(zhǎng)春新堿、白消安、苯丁酸氮芥、美法侖(例如PAM、a、L-PAM或苯丙氨酸氮芥)、巰基嘌呤、米托坦、鹽酸丙卡巴肼、放線(xiàn)菌素(放線(xiàn)菌素D)、鹽酸柔紅霉素、鹽酸阿霉素、紫杉酚、絲裂霉素、普卡霉素(光輝霉素)、氨基格魯米特、雌莫司汀磷酸鈉、氟他米特、乙酸亮丙瑞林、乙酸甲地孕酮、檸檬酸它莫西芬、睪內(nèi)酯、曲洛司坦、安吖啶(m-AMSA)、天冬酰胺酶(L-天冬酰胺酶)、Erwina天冬酰胺酶、依托泊苷-(VP-16)、干擾素α-2a、干擾素α-2b、替尼泊苷(VM-26)、硫酸長(zhǎng)春堿(VLB)和阿拉伯糖基。在某些實(shí)施方案中，治療劑可以是單克隆抗體，例如能夠與黑素瘤抗原結(jié)合的單克隆抗體。
可以通過(guò)在可藥用的載體和/或溶液，例如鹽溶液如等滲鹽水中進(jìn)行例如靜脈內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)注射而將用放射性核素金屬，例如99mTc標(biāo)記的綴合物施用于哺乳動(dòng)物，包括人患者或受試者。本發(fā)明提供的放射性標(biāo)記的閃爍顯像劑具有適宜的放射性量。在形成99mTc放射性絡(luò)合物過(guò)程中，一般優(yōu)選形成包含放射性濃度為大約0.01毫居里(mCi)-100mCi/mL的放射性絡(luò)合物溶液。一般地，待施用的單位劑量的放射性為大約0.01mCi至大約100mCi，優(yōu)選1mCi至30mCi。以單位劑量待注射的溶液為大約0.01mL到大約10mL。適于施用的標(biāo)記的綴合物的數(shù)量取決于選擇的綴合物的分布曲線(xiàn)，其含義是快速清除的綴合物可能需要以比清除較慢的綴合物更高的劑量施用?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)閃爍技術(shù)在施用后的適宜時(shí)間追蹤體內(nèi)分布和定位；所述時(shí)間取決于在靶部位的蓄積速率相對(duì)于在非靶組織的清除率，一般為30分鐘至180分鐘。例如，在給患者注射診斷性放射性核素標(biāo)記的本發(fā)明的化合物之后，可以將針對(duì)在顯像劑中引入的核素的γ-射線(xiàn)能量進(jìn)行校準(zhǔn)的γ-照相機(jī)用于對(duì)藥劑攝入?yún)^(qū)域進(jìn)行成像，并對(duì)該部位存在的放射性量進(jìn)行定量。體內(nèi)部位成像可以在數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生。但是，如果需要的話(huà)，成像可以在放射性標(biāo)記的肽注入患者之后數(shù)小時(shí)或甚至更長(zhǎng)時(shí)間發(fā)生。在大部分的情況下，足量的施用劑量將在大約0.1小時(shí)內(nèi)在待成像的區(qū)域蓄積以允許拍攝閃爍照相圖。
可以將本發(fā)明的化合物單獨(dú)或作為包含其它組分如賦形劑、稀釋劑、自由基清除劑、穩(wěn)定劑和載體的組合物的一部分施用于患者，所有上述的組分在本領(lǐng)域中是已知的?？梢詫⒃摶衔锝?jīng)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用于患者。
本發(fā)明具有許多優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明制備的化合物形成穩(wěn)定、清楚限定的99mTc或186/188Re標(biāo)記的化合物。類(lèi)似的本發(fā)明的化合物也可以通過(guò)使用對(duì)各種放射性金屬的適宜螯合劑骨架來(lái)制備，以形成穩(wěn)定、清楚限定的153Sm、90Y、166Ho、105Rh、199Au、149Pm、177Lu、111In或其它放射性金屬標(biāo)記的產(chǎn)物。放射性標(biāo)記的GRP受體靶向肽與表達(dá)GRP受體的腫瘤細(xì)胞選擇性結(jié)合，并且如果使用激動(dòng)劑的話(huà)，被內(nèi)化并在腫瘤細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期保留。未到達(dá)(即不結(jié)合)癌細(xì)胞的放射性物質(zhì)優(yōu)選有效地排泄進(jìn)入尿液，放射金屬在腎臟中保留極少。
6.光成像、聲致發(fā)光、光聲成像和光治療根據(jù)本發(fā)明，可以將許多光學(xué)參數(shù)用于在給患者注射光標(biāo)記的本發(fā)明化合物之后用體內(nèi)光成像來(lái)確定靶體的位置。在圖像制備中待檢測(cè)的光參數(shù)可以包括傳送的輻射、吸收、熒光或磷光發(fā)射、光反射、吸收幅度或最大值的改變和彈性散射輻射。例如，生物組織對(duì)波長(zhǎng)范圍為650-1000nm的近紅外(NIR)光相對(duì)透光。NIR照射可以穿透組織達(dá)數(shù)厘米，允許使用本發(fā)明化合物對(duì)含靶體的組織進(jìn)行體內(nèi)成像?？梢?jiàn)和近紅外(NIR)光在臨床實(shí)踐中的使用迅速增長(zhǎng)。在電磁波譜的可見(jiàn)、NIR或長(zhǎng)波長(zhǎng)(UV-A，＞350nm)區(qū)吸收或發(fā)射的化合物可能用于光學(xué)斷層照相成像、內(nèi)窺鏡可視化和光治療。
生物醫(yī)學(xué)光學(xué)的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是它的治療潛能。已證明光治療是一種用于治療多種表面損傷(外傷和內(nèi)傷)的安全和有效的方法。染料對(duì)于增強(qiáng)信號(hào)檢測(cè)和/或使組織在光成像和光治療中具有感光性是重要的。先前的研究已表明，某些染料可以定位在腫瘤，并用作檢測(cè)和治療小癌的強(qiáng)有力探針(D.A.Bellnier等人，Murinepharmacokinetics and antitumor efficacy of the photodynamicsensitizer 2-[1-hexyloxyethyl]-2-devinyl pyropheophorbide-a，J.Photochem.Photobiol.，1993，20，pp.55-61；G.A.Wagnieres等人，In vivo fluorescence spectroscopy and imaging foroncological applications，Photochem.Photobiol.，1998，68，pp.603-632；J.S.Reynolds等人，Imaging of spontaneous caninemammary tumors using fluorescent contrast agents，Photochem.Photobiol.，1999，70，pp.87-94)。所有這些所列文獻(xiàn)的內(nèi)容在此均被全文引入作為參考。但是，這些染料不優(yōu)先定位在惡性組織中。
在一個(gè)例舉性實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物可以與光標(biāo)記物綴合，所述光標(biāo)記物例如光染料，包括有機(jī)發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)，具有廣泛的離域環(huán)系統(tǒng)且吸收或發(fā)射最大值范圍為400-1500nm。本發(fā)明的化合物可選擇性地用生物發(fā)光分子衍生。對(duì)光標(biāo)記物的優(yōu)選的最大吸收范圍為600-1000nm以使對(duì)來(lái)自血紅蛋白的信號(hào)的干擾最小。優(yōu)選光吸收標(biāo)記具有大摩爾吸光系數(shù)，例如＞105cm-1M-1，而熒光性光染料具有高量子產(chǎn)額。光染料的實(shí)例包括但不限于在US 6,641,798，WO 98/18497、WO 98/18496、WO 98/18495、WO 98/18498、WO 98/53857、WO 96/17628、WO 97/18841、WO 96/23524、WO 98/47538及其引述的參考資料所述的光染料，這些文獻(xiàn)的內(nèi)容在此均被全文引入作為參考。例如，光標(biāo)記物可以直接共價(jià)連接到本發(fā)明的化合物，例如包含GRP受體靶向肽和本發(fā)明的連接基的化合物。許多在電磁光譜的可見(jiàn)和近紅外區(qū)吸收和發(fā)射光的染料由于它們的生物相容性、高摩爾吸光系數(shù)和/或高熒光量子產(chǎn)額目前正被用于多種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。與作為對(duì)比劑的染料結(jié)合的光形態(tài)的高度敏感性與核醫(yī)學(xué)的類(lèi)似，并允許在無(wú)不期望的電離輻射作用的情況下使器官和組織可見(jiàn)。在近紅外(NIR)區(qū)具有強(qiáng)烈吸收和發(fā)射的花青染料是特別有用的，因?yàn)樯锝M織在該區(qū)透光(B.C.Wilson，Optical properties of tissues.Encyclopedia of HumanBiology，1991，5，587-597)。例如，在NIR區(qū)吸收和發(fā)射的吲哚花青綠已用于監(jiān)測(cè)心輸出量、肝功能和肝血流(Y-L.He，H.Tanigami，H.Ueyama，T.Mashimo，andI.Yoshiya，Measurement of blood volumeusing indocyanine green measured with pulse-spectrometryItsreproducibility and reliability.Critical Care Medicine，1998，26(8)，1446-1451；J.Caesar，S.Shaldon，L.Chiandussi，etal.，The use of Indocyanine green in the measurement of hepaticblood flow and as a test of hepatic function.Clin.Sci.1961，21，43-57)，且它的官能化衍生物已用于綴合生物分子以用于診斷目的(R.B.Mujumdar，L.A.Ernst，S.R.Mujumdar等人，Cyanine dyelabeling reagentsSulfoindocyanine Succinimidyl esters.Bioconjugate Chemistry，1993，4(2)，105-111；Linda G.Lee and SamL.Woo.″N-Heteroaromaticion and iminium ion substituted cyaninedyes for use as fluorescent labels″，U.S.Pat.No.5,453,505；Eric Hohenschuh等人″Light imaging contrast agents″，WO98/48846；Jonathan Turner等人″Optical diagnostic agents for thediagnosis of neurodegenerative diseases by means of nearinfra-red radiation″，WO98/22146；Kai Licha等人″In-vivodiagnostic process by near infrared radiation″，WO96/17628；Robert A.Snow等人，Compounds，WO 98/48838，US 6,641,798。所有這些所列文獻(xiàn)的內(nèi)容在此均被全文引入作為參考。
在注射光標(biāo)記化合物之后，用適于在藥劑中所用的光標(biāo)記的波長(zhǎng)范圍的一個(gè)或多個(gè)光源(例如激光)掃描患者。所用的光可以是單色或多色的和連續(xù)或脈沖的。通過(guò)調(diào)至一個(gè)或多個(gè)波長(zhǎng)的光檢測(cè)器檢測(cè)透射、散射或反射的光以確定對(duì)象中含靶的組織(例如含GRP的組織)的位置?？梢噪S時(shí)間監(jiān)測(cè)光參數(shù)的改變以檢測(cè)靶部位(例如腫瘤或其它具有GRP受體的部位)光標(biāo)記的試劑的蓄積。可以將標(biāo)準(zhǔn)圖像加工和檢測(cè)設(shè)備與本發(fā)明的光成像試劑聯(lián)合使用。
上述的光成像試劑還可以用于采用光標(biāo)記的顯像劑進(jìn)行的聲-光或聲致發(fā)光成像(參見(jiàn)U.S.5,171,298、WO 98/57666及其參考資料)。在聲-光成像中，將超聲照射應(yīng)用于受試者，并影響透射、發(fā)射或反射光的光參數(shù)。在聲致發(fā)光成像中，所用的超聲實(shí)際上產(chǎn)生被檢測(cè)的光。使用這些技術(shù)的適宜的成像方法在WO 98/57666中作了描述。
在以下文獻(xiàn)中描述了各種成像技術(shù)和試劑美國(guó)專(zhuān)利6,663,847、6,656,451、6,641,798、6,485,704、6,423,547、6,395,257、6,280,703、6,277,841、6,264,920、6,264,919、6,228,344、6,217,848、6,190,641、6,183,726、6,180,087、6,180,086、6,180,085、6,013,243和公開(kāi)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)2003185756、20031656432、2003158127、2003152577、2003143159、2003105300、2003105299、2003072763、2003036538、2003031627、2003017164、2002169107、2002164287和2002156117，所有這些文獻(xiàn)在此均被引入作為參考。
7.放射治療放射性同位素治療包括施用足量的放射性標(biāo)記的化合物以損傷或破壞靶向的組織。在施用化合物(例如通過(guò)靜脈內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)注射)之后，放射性標(biāo)記的藥物優(yōu)先定位在病患部位(在此情況下為表達(dá)GRP受體的腫瘤組織或其它組織)。一旦定位，該放射性標(biāo)記的化合物就以在所施用的同位素的放射性衰減期間釋放的能量損壞或破壞病患組織。如本文討論，本發(fā)明還包括聯(lián)合使用放射治療和輔助化學(xué)治療(或者與任何其它適宜的治療劑聯(lián)用)。
成功的放射治療的設(shè)計(jì)涉及若干關(guān)鍵因素1.選擇適宜的靶向基團(tuán)以遞送放射性至病患部位；2.選擇釋放足夠能量以破壞病患部位的適宜的放射性核素，并基本上不破壞相鄰的正常組織；和3.選擇適宜的靶向基團(tuán)與放射性核素的組合，不會(huì)不利地影響這種綴合物在病患部位定位的能力。對(duì)于放射性金屬而言，這通常涉及這樣的螯合基團(tuán)這種基團(tuán)與放射性核素緊密地配位，結(jié)合將該螯合物偶聯(lián)至靶向基團(tuán)的連接基，且這種基團(tuán)影響化合物的總生物分布以使靶組織的攝入最大化，并使正常、非靶器官的攝入最小化。
本發(fā)明通過(guò)適宜地選擇靶向基團(tuán)、放射性核素、金屬螯合物和連接基而提供滿(mǎn)足以上全部三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的放射治療劑。
放射治療劑可以包含來(lái)自已知為鑭系元素類(lèi)(原子序數(shù)57-71的元素)的螯合的3+金屬離子和它們的類(lèi)似物(即M3+金屬如釔和銦)。在此種類(lèi)中典型的放射性金屬包括同位素90-釔、111-銦、149-钷、153-釤、166-鏑、166-鈥、175-鐿和177-镥。所有這些金屬(和鑭系中的其它金屬)具有非常類(lèi)似的化學(xué)，它們保持+3氧化態(tài)，并優(yōu)選與含有硬(氧/氮)供體原子的配體螯合，典型的為已知螯合物DTPA(二亞乙基三胺五乙酸)的衍生物和多氮雜-多羧酸大環(huán)如DOTA(1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N′，N″，N-四乙酸及其相近的類(lèi)似物。這些完全去質(zhì)子化形式的螯合配體的結(jié)構(gòu)如以下所示。
這些螯合配體通過(guò)多個(gè)氮和氧原子與放射金屬結(jié)合而將其包封，從而防止游離(未結(jié)合)的放射金屬釋放進(jìn)入體內(nèi)。這是重要的，因?yàn)?+放射金屬由其螯合物的體內(nèi)解離可以導(dǎo)致在肝、骨和脾中放射金屬的攝取[Brechbiel MW，Gansow OA，″Backbone-substituted DTPAligands for90Y radioimmunotherapy″，Bioconj.Chem.1991；2187-194；Li，WP，Ma DS，Higginbotham C，Hoffman T，Ketring AR，Cutler CS，Jurisson，SS，″Development of an in vitro model forassessing the in vivo stabilityof lanthanide chelates.″Nucl.Med.Biol.2001；28(2)145-154；Kasokat T，Urich K，Arzneim.-Forsch，″Quantification of dechelation ofgadopentetate dimeglumine in rats″，1992；42(6)869-76]。除非配體特異性地靶向于這些器官，這些非特異性攝取是非常不期望的，因?yàn)樗鼘?dǎo)致非靶組織的非特異性照射，從而可能導(dǎo)致諸如由于骨髓照射造成的造血抑制的問(wèn)題。
關(guān)于放射治療應(yīng)用，可以使用本文公開(kāi)的任何治療性放射性核素的螯合劑。但是，DOTA螯合物形式[Tweedle MF，Gaughan GT，HaganJT，″1-Substituted-1，4，7-triscarboxymethyl-1，4，7，10-teraazacyclodecane and analogs.″美國(guó)專(zhuān)利4,885,363，Dec.5，1989]是特別優(yōu)選的，因?yàn)镈OTA螯合物預(yù)期在體內(nèi)比DTPA或其它線(xiàn)性螯合物較少去螯合。化合物L(fēng)64和L70(當(dāng)用適宜的治療性放射性核素標(biāo)記時(shí))特別優(yōu)選用于放射治療。
通過(guò)連接基將DOTA型大環(huán)偶聯(lián)至靶向基團(tuán)的方法(例如通過(guò)活化DOTA的羧酸之一以形成活性酯，然后使其與連接基上的氨基反應(yīng)以形成穩(wěn)定的酰胺鍵)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的(例如參見(jiàn)Tweedle等人，美國(guó)專(zhuān)利4,885,363)。還可以對(duì)在多氮雜環(huán)骨架上修飾的DOTA型大環(huán)進(jìn)行偶聯(lián)。
用于特定的放射治療應(yīng)用的適當(dāng)核素的選擇取決于多種因素，包括a.物理半衰期-它應(yīng)該足夠長(zhǎng)以允許從放射金屬和綴合物合成并純化放射治療構(gòu)建體，并將該構(gòu)建體遞送至注射部位，并在注射前無(wú)明顯的放射性衰減。優(yōu)選放射性核素應(yīng)該具有大約0.5-8天的物理半衰期。
b.放射性核素發(fā)射的能量-作為粒子發(fā)射體(例如α-發(fā)射體、β-發(fā)射體和Auger電子發(fā)射體)的放射性核素是特別有用的，因?yàn)樗鼈儼l(fā)射在短距離內(nèi)蓄積其能量從而產(chǎn)生高度局部化的破壞的高能粒子。β-發(fā)射放射性核素是特別優(yōu)選的，因?yàn)閬?lái)自這些同位素的β-粒子發(fā)射的能量在5至大約150個(gè)細(xì)胞直徑內(nèi)蓄積。由這些核素制備的放射治療劑能夠殺死與它們的定位部位相對(duì)接近的病患細(xì)胞，但不能長(zhǎng)距離行進(jìn)以破壞相鄰正常組織如骨髓。
c.比活性(即放射性/放射性核素質(zhì)量)-具有高比活性的放射性核素(例如發(fā)生器產(chǎn)生的90-Y、111-In、177-Lu)是特別優(yōu)選的。放射性核素的比活性由它的生產(chǎn)方法、用于生產(chǎn)它的特定靶體和所討論的同位素的特性來(lái)決定。
許多鑭系元素包括具有使它們適于用作放射治療劑的核特性的放射性同位素，因?yàn)樗鼈儼l(fā)射β-粒子。這些當(dāng)中的一些列于下表。
Pm钷，Sm釤，Dy鏑，Ho鈥，Yb鐿，Lu镥，Y釔，In銦放射金屬如β-發(fā)射鑭系放射性同位素的制備方法在本領(lǐng)域中是已知的，并已在其它地方公開(kāi)[例如Cutler CS，Smith CJ，Ehrhardt GJ.；Tyler TT，Jurisson SS，Deutsch E.″Current and potentialtherapeutic uses of lanthanide radioisotopes.″Cancer Biother.Radiopharm.2000；15(6)531-545]。許多這些同位素可以高產(chǎn)率和較低成本地產(chǎn)生，且許多(例如90-Y、149-Pm、177-Lu)可以以接近無(wú)載體的比活性產(chǎn)生(即大部分的原子是放射性的)。由于非放射性原子可以與它們的放射性類(lèi)似物競(jìng)爭(zhēng)與靶組織上的受體結(jié)合，因此使用具有高比活性的放射性同位素是重要的，以允許遞送盡可能高劑量的放射性至靶組織。
含有β-發(fā)射同位素錸(186-Re和188-Re)的本發(fā)明的放射治療衍生物也是特別優(yōu)選的。
8.劑量和添加劑本發(fā)明化合物的適宜劑量方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。該化合物可以用許多方法施用，所述方法包括但不限于單一或多次IV或IP注射。對(duì)于放射性藥物，施用的放射性的量足以允許成像或在放射治療的情況下導(dǎo)致破壞或除去含靶向的GRP-R的組織，但不至于造成非靶體(正常部位)發(fā)生實(shí)質(zhì)性損傷。閃爍成像所需的量和劑量在上文作了討論。放射治療所需的量和劑量對(duì)于不同的構(gòu)建體也是不同的，它取決于所用的同位素的能量和半衰期、體內(nèi)試劑的攝取和清除程度以及腫瘤的質(zhì)量。一般地，劑量范圍可以從大約30-50mCi的單一劑量至高達(dá)大約3居里的累積劑量。
對(duì)于光成像化合物而言，足以獲得所需像增強(qiáng)的劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的且可根據(jù)所用染料或其它化合物、待成像的器官或組織、所用成像設(shè)備等而廣泛變化。
本發(fā)明的組合物可以包括生理學(xué)上可接受的緩沖劑，并可能需要照射穩(wěn)定劑以防止在注射前化合物發(fā)生輻射分解破壞。放射穩(wěn)定劑對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的，并可以包括例如對(duì)氨基苯甲酸、抗壞血酸、龍膽酸等。
包含制備本發(fā)明的診斷或治療劑所需的所有組分的單瓶或多瓶試劑盒是本發(fā)明的一個(gè)組成部分。在放射性藥物的情況下，這些試劑盒通常包括除了放射性核素之外的所有必需的成分。
例如，用于制備本發(fā)明的放射性藥物的單瓶試劑盒優(yōu)選包含式M-N-O-P-G的螯合劑/連接基/靶向肽綴合物，一種亞錫鹽來(lái)源(如果需要還原，例如在使用锝的時(shí)候)或其它可藥用的還原劑，并用可藥用的酸或堿適宜地緩沖以調(diào)節(jié)pH至大約3至大約9的值。所用的還原劑的數(shù)量和類(lèi)型將高度取決于待形成的交換絡(luò)合物的性質(zhì)。適宜的條件對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。優(yōu)選試劑盒內(nèi)容物為凍干形式。這種單瓶試劑盒可以任選包含不穩(wěn)定或交換配體，例如葡糖庚酸鹽、葡萄糖酸鹽、甘露醇、蘋(píng)果酸鹽、檸檬酸或酒石酸，并還可以包含反應(yīng)修飾劑如二亞乙基三胺-五乙酸(DPTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)，或者α、β或γ-環(huán)糊精，用于改善最終產(chǎn)物的放射化學(xué)純度和穩(wěn)定性。該試劑盒還可以包含穩(wěn)定劑、膨脹劑如甘露醇，它們?cè)O(shè)計(jì)用于輔助凍干工藝，和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它添加劑。
多瓶試劑盒優(yōu)選包含相同的常規(guī)組分，但使用多于一個(gè)的小瓶以重組放射性藥物。例如，一個(gè)小瓶可以包含所有在加入高锝酸鹽時(shí)形成不穩(wěn)定的Tc(V)絡(luò)合物所需的成分(例如亞錫源或其它還原劑)。將高锝酸鹽加到此小瓶，并在等待適宜的時(shí)間之后將此小瓶的內(nèi)容物加到包含螯合劑和靶向肽以及適于將pH調(diào)節(jié)至其最佳值的緩沖劑的第二小瓶。在大約5至60分鐘的反應(yīng)時(shí)間之后，形成本發(fā)明的絡(luò)合物。有利的是此多瓶試劑盒的兩個(gè)小瓶的內(nèi)容物均被凍干。如上所述，反應(yīng)修飾劑、交換配體、穩(wěn)定劑、膨脹劑等可以存在于任一個(gè)或兩個(gè)小瓶中。
化合物的一般制備取決于所選擇的螯合劑，本發(fā)明的化合物可以通過(guò)多種方法制備。化合物的肽部分可以最為便利地由肽合成技術(shù)中已建立和已知的技術(shù)，例如固相肽合成(SPPS)方法來(lái)制備。因?yàn)橐M(jìn)行固相合成，因此使用交替FMOC保護(hù)和脫保護(hù)是優(yōu)選的制備短肽的方法。重組DNA技術(shù)優(yōu)選用于生產(chǎn)蛋白和它的長(zhǎng)片段。
固相肽合成(SPPS)包括往與不溶性載體或基質(zhì)如聚苯乙烯連接的生長(zhǎng)的肽鏈上分步加入氨基酸殘基。所述肽的C末端殘基首先固定于可商購(gòu)得到的載體上，其氨基用N-保護(hù)劑如叔丁氧羰基(Boc)或芴基甲氧基羰基(Fmoc)保護(hù)。用適宜的脫保護(hù)劑除去氨基保護(hù)基，對(duì)于Boc為T(mén)FA，或?qū)τ贔moc為哌啶，并加入下一個(gè)氨基酸殘基(N-保護(hù)形式)和偶聯(lián)劑如二異丙基碳二亞胺(DIC)。在肽鍵形成后，從載體上洗去試劑。在加入最后的殘基之后，用適宜的試劑如三氟乙酸(TFA)或氟化氫(HF)從載體上裂解肽。
通過(guò)分段偶聯(lián)可替代選擇地制備化合物本發(fā)明的化合物還可以通過(guò)本領(lǐng)域中稱(chēng)為分段偶聯(lián)(segmentcoupling)或片段縮合的方法來(lái)制備(Barlos，K.和Gatos，D.；2002″Convergent Peptide Synthesis″in Fmoc Solid Phase Synthesis-APractical Approach；Eds.Chan，W.C.和White，P.D.；OxfordUniversity Press，New York；Chap.9，pp 215-228)。在此方法中，通過(guò)液相合成或固相合成或這兩種方法的組合分別制備通常為側(cè)鏈保護(hù)形式的肽的片段。片段的選擇是關(guān)鍵的，且用可以提供易處理數(shù)目的片段的分割策略來(lái)進(jìn)行選擇，所述片段的C-末端殘基和N-末端殘基設(shè)計(jì)用于提供肽合成中最干凈利落的偶聯(lián)。最好片段的C-末端殘基缺少手性α碳(甘氨酸或其它部分，在偶聯(lián)步驟中在待活化的羧基的碳∝處為非手性)，或者包含在活化和偶聯(lián)期間的外消旋化傾向是可能選擇中最低的氨基酸。各片段的N-末端氨基酸的選擇基于將活化的?；虚g產(chǎn)物偶聯(lián)至氨基的容易程度。一旦選擇分割策略，則根據(jù)所需的中間產(chǎn)物的合成可達(dá)性和所得產(chǎn)物的處理和純化(如果需要的話(huà))的相對(duì)容易性來(lái)選擇各片段的偶聯(lián)方法。然后將片段偶聯(lián)在一起，所述片段都在溶液中，或者一個(gè)在固體相而另一個(gè)在溶液中，從而制備完全或部分保護(hù)形式的最終結(jié)構(gòu)。
然后除去受保護(hù)的目標(biāo)化合物的保護(hù)基，純化，并分離得到最終期望的產(chǎn)物。分段偶聯(lián)方法的優(yōu)點(diǎn)是各個(gè)片段可以分別純化，允許除去副產(chǎn)物，如由不完全偶聯(lián)得到的刪除序列，或者衍生自反應(yīng)如偶聯(lián)步驟中側(cè)鏈酰胺脫水，或在Fmoc基團(tuán)脫保護(hù)期間將側(cè)鏈(如Gln的側(cè)鏈)內(nèi)環(huán)化至α-氨基。這些副產(chǎn)物都會(huì)存在于常規(guī)的基于樹(shù)脂的“直通”肽鏈裝配的最終產(chǎn)物中，如果需要的話(huà)可以在分段偶聯(lián)策略的許多階段除去這些物質(zhì)。分段偶聯(lián)策略的另一個(gè)重要的優(yōu)點(diǎn)是可以應(yīng)用不同的溶劑、試劑和條件以將各片段的合成最優(yōu)化至高純度和產(chǎn)率，導(dǎo)致最終產(chǎn)物的純度和產(chǎn)率得到提高。其它意識(shí)到的優(yōu)點(diǎn)是試劑消耗減少和成本降低。
實(shí)施例提供以下實(shí)施例作為可以用于制備本發(fā)明多種化合物的不同方法的實(shí)例。在各個(gè)實(shí)施例中，存在用單一黑體大寫(xiě)字母(例如A、B、C)標(biāo)識(shí)的化合物，其與在圖中相同標(biāo)記的對(duì)應(yīng)化合物相關(guān)。
一般實(shí)驗(yàn)A.所用其它縮寫(xiě)詞的定義在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中使用以下常用縮寫(xiě)1，1-二甲基乙氧基羰基(Boc或Boc)；9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)；烯丙氧基羰基(Aloc)；1-羥基苯并三唑(HOBt或HOBT)；N，N′-二異丙基碳二亞胺(DIC)；N-甲基吡咯烷酮(NMP)；乙酸酐(Ac2O)；(4，4-二甲基-2，6-二氧代亞環(huán)己-1-基)-3-甲基丁基(iv-Dde)；三氟乙酸(TFA)；試劑B(TFA∶H2O∶苯酚∶三異丙基硅烷，88∶5∶5∶2)；二異丙基乙胺(DIEA)；O-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)；O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽(HATU)；N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)；固相肽合成(SPPS)；二甲亞砜(DMSO)；二氯甲烷(DCM)；
二甲基甲酰胺(DMF)；二甲基乙酰胺(DMA)；1，4，7，10-四氮雜環(huán)十四烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)；三異丙基硅烷(TIPS)；1，4，7，10-四氮雜環(huán)十四烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)(1R)-1-[1，4，7，10-四氮雜-4，7，10-三(羧甲基)環(huán)十二烷基]乙烷-1，2-二甲酸(CMDOTA)；胎牛血清(FBS)；人血清白蛋白(HSA)；人前列腺癌細(xì)胞系(PC3)；氯甲酸異丁酯(IBCF)；三丁基胺(TBA)；放射化學(xué)純度(RCP)；和高效液相色譜(HPLC)。
B.材料所用的Fmoc-保護(hù)的氨基酸購(gòu)自Nova-Biochem(San Diego，CA，USA)，Advanced Chem Tech(Louisville，KY.，USA)、Chem-ImpexInternational(Wood Dale Ill.，USA)和Multiple PeptideSystems(San Diego，CA.，USA)。合成中所需的其它化學(xué)物質(zhì)、試劑和吸附劑購(gòu)自Aldrich Chemical Co.(Milwaukee，WI，USA)和VWRScientific Products(Bridgeport，NJ.，USA)。用于肽合成的溶劑購(gòu)自Pharmco Co.(Brookfield CT.，USA)。用于HPLC分析和純化的柱購(gòu)自Waters Co.(Milford，MA.，USA)。以下給出非商購(gòu)的物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)。
C.肽合成的儀器使用Advanced ChemTech 496Ω MOS合成儀，Advanced ChemTech357FBS合成儀和/或通過(guò)人工肽合成來(lái)制備肽。但是，所用的反復(fù)脫保護(hù)和鏈延伸的方案對(duì)于所有方法來(lái)說(shuō)是相同的。
D.采用Symphony儀器(Rainin制造)的自動(dòng)合成用Protein Technologies Inc.提供的Symphony(Version 3)進(jìn)行合成。使用置換率為0.25mmol/g的Novagel TGR樹(shù)脂，各孔包含0.2g樹(shù)脂(50μmol)。將氨基酸溶于NMP，其濃度為0.25M。制備0.25M在DMF中的HBTU和N-甲基嗎啉的溶液，并將其用于偶聯(lián)。所有的偶聯(lián)進(jìn)行2.0小時(shí)。裂解在機(jī)器外通過(guò)將樹(shù)脂轉(zhuǎn)移至另一反應(yīng)容器并使用如在人工合成中使用的試劑B完成。
E.用于分析和純化的儀器使用Shimadzu-LC-10A雙泵梯度分析LC系統(tǒng)，采用用于系統(tǒng)控制、數(shù)據(jù)獲取和運(yùn)行后處理的Shimadzu-ClassVP軟件4.1版完成分析HPLC。在Hewlett-Packard Series 1100 MSD質(zhì)譜儀上獲得質(zhì)譜，其接口為Hewlett-Packard Series 1100雙泵梯度HPLC系統(tǒng)，配備Agilent Technologies 1100 series自動(dòng)取樣器，適于直接流式注射或注射至Waters Associates XTerra MS C18柱(4.6mm×50mm，5μ顆粒，120孔)上。此儀器通過(guò)HP Kayak工作站，使用用于樣品提交的′MSD Anyone′軟件和用于儀器控制和數(shù)據(jù)獲取的HP Chemstation軟件來(lái)驅(qū)動(dòng)。在大部分的情況下，通過(guò)使用注射5μL濃度為1mg/mL的樣品溶液進(jìn)行直接注射來(lái)引入樣品，并使用陽(yáng)離子電噴霧進(jìn)行分析以得到用于確證結(jié)構(gòu)的m/e和m/z(帶多個(gè)電荷)離子。在VarianInnova波譜儀上于500MHz獲得1H-NMR光譜。在相同的儀器上，于125.73MHz獲得13C-NMR光譜。通常將殘余的1H吸收，或者在13C-NMR的情況下所用溶劑的13C吸收用作內(nèi)標(biāo)；在其它情況下采用四甲基硅烷(δ＝0.00ppm)。以δ單位給出共振值。從Quantitative TechnologiesInc.Whitehouse NJ獲得Micro分析數(shù)據(jù)。用Shimadzu-LC-8A雙泵梯度制備HPLC系統(tǒng)，使用用于系統(tǒng)控制、數(shù)據(jù)獲取、級(jí)分收集和運(yùn)行后處理的Shimadzu-ClassVP軟件4.3版完成制備HPLC。
F.用于肽合成的一般方法將Rink酰胺-Novagel HL樹(shù)脂(0.6mmol/g)用作固體載體。
G.偶聯(lián)操作在典型實(shí)驗(yàn)中，將第一氨基酸裝載至0.1g樹(shù)脂(0.06mmol)。將在NMP中的適宜的Fmoc-氨基酸(0.25M溶液；0.960mL)加到樹(shù)脂，然后加入N-羥基苯并三唑(0.5M，在NMP中；0.48mL)，并將反應(yīng)區(qū)(block)(在自動(dòng)肽合成的情況下)或各反應(yīng)容器(在人工肽合成的情況下)振蕩大約2分鐘。往以上混合物加入二異丙基碳二亞胺(0.5M，在NMP中；0.48mL)，并將反應(yīng)混合物在室溫下振蕩4小時(shí)。然后通過(guò)應(yīng)用干氮?dú)庹龎毫?lái)清洗反應(yīng)區(qū)或單獨(dú)的反應(yīng)容器內(nèi)的反應(yīng)物。
H.清洗操作給反應(yīng)區(qū)的每孔裝填1.2mL NMP，并將該區(qū)振蕩5分鐘。在氮正壓下排出溶液。重復(fù)此操作三次。在使用單獨(dú)的容器進(jìn)行人工合成的情況下使用相同的方法和適宜體積的NMP。
I.除去Fmoc保護(hù)基團(tuán)用1.5mL在DMF中的20％哌啶(v/v)處理帶有Fmoc-保護(hù)的氨基酸的樹(shù)脂，并將該反應(yīng)區(qū)或單獨(dú)的人工合成容器振蕩15分鐘。從樹(shù)脂中排出溶液。重復(fù)此過(guò)程一次，并用上述的清洗方法洗樹(shù)脂。
J.配體(DOTA和CMDOTA)的最終偶聯(lián)將樹(shù)脂結(jié)合的肽連接基構(gòu)建體的N-末端氨基去封閉，并洗滌樹(shù)脂。制備0.25M在NMP中的目標(biāo)配體和HBTU的溶液，并用兩倍當(dāng)量的DIEA進(jìn)行處理。將所得的激活配體的溶液加到樹(shù)脂(1.972mL；0.48mmol)，并將反應(yīng)混合物在室溫下振蕩24-30小時(shí)。排出溶液并洗滌樹(shù)脂。用1.5mL二氯甲烷(3X)完成樹(shù)脂的最終洗滌。
K.最終肽的脫保護(hù)和純化將試劑B的溶液(2mL；88∶5∶5∶2-TFA∶苯酚∶水∶TIPS)加到樹(shù)脂，并將反應(yīng)區(qū)或單獨(dú)的容器于室溫下振蕩4.5小時(shí)。將所得的包含脫保護(hù)肽的溶液排出至小瓶中。使用1mL試劑B再重復(fù)此過(guò)程2次。用Genevac HT-12 series II離心濃縮器減壓濃縮合并的濾液。然后將各小瓶中殘余物與2mL Et2O一起研磨，并棄去上清液。重復(fù)此方法兩次以得到肽，為無(wú)色固體。將該粗肽溶于水/乙腈，并用WatersXTerra MS C18制備HPLC柱(50mm×19mm，5微米粒徑，120孔徑)或Waters-YMC C18 ODS柱(250mm×30mm i.d.，10微米粒徑.120孔徑)純化。收集含產(chǎn)物的級(jí)分，并用HPLC分析。收集＞95％純度的級(jí)分，并通過(guò)凍干分離肽。
制備型HPLC的條件(Waters XTerra柱)洗脫速率50mL/分檢測(cè)UV，λ＝220nm洗脫劑A0.1％TFA水溶液；洗脫劑B乙腈(0.1％TFA)。
HPLC分析的條件柱Waters XTerra(Waters Co.；4.6×50mm；MS C18；5微米粒子，120孔)。
洗脫速率3mL/分；檢測(cè)UV，λ＝220nm。
洗脫劑A0.1％TFA水溶液；洗脫劑B乙腈(0.1％TFA)。
實(shí)施例I-圖1A-B合成L62概述如圖1A-B所示，用以下步驟制備L62用NaOH水解(3β，5β)-3-氨基膽烷-24-酸甲酯A得到對(duì)應(yīng)的酸B，然后與Fmoc-Cl反應(yīng)得到中間產(chǎn)物C。使用八肽Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2(BBN[7-14][SEQ ID NO1])官能化的Rink酰胺樹(shù)脂依次與C、Fmoc-甘氨酸和DOTA三叔丁酯反應(yīng)。在用試劑B裂解和脫保護(hù)之后，用制備HPLC純化粗品得到L62?？偖a(chǎn)率2.5％。以下提供更多的細(xì)節(jié)A.用蛙皮素[7-14]官能化的Rink酰胺樹(shù)脂，(A)在固相肽合成容器(見(jiàn)附件No.1)中，將Fmoc-氨基酸(24mmol)、N-羥基苯并三唑(HOBt)(3.67g；24mmol)和N，N′-二異丙基碳二亞胺(DIC)(3.75mL；24mmol)依次加到在DMF(45mL)中的Rink酰胺NovaGelTM樹(shù)脂(10g；6.0mmol)A的懸浮液。將混合物于室溫下使用臺(tái)式振蕩器振蕩3小時(shí)，然后排空溶液，并用DMF(5×45mL)洗滌樹(shù)脂。將樹(shù)脂與在DMF(45mL)中的25％哌啶一起振蕩4分鐘，倒空溶液，并加入新鮮的在DMF(45mL)中的25％哌啶。將該懸浮液振蕩10分鐘，然后倒空溶液，并用DMF(5×45mL)洗滌樹(shù)脂。
將此方法依次用于以下氨基酸N-α-Fmoc-L-蛋氨酸、N-α-Fmoc-L-亮氨酸、N-α-Fmoc-Nim-三苯甲基-L-組氨酸、N-α-Fmoc-甘氨酸、N-α-Fmoc-L-纈氨酸、N-α-Fmoc-L-丙氨酸、N-α-Fmoc-Nin-Boc-L-色氨酸。
在最后的偶聯(lián)反應(yīng)中，將N-α-Fmoc-N-γ-三苯甲基-L-谷氨酰胺(14.6g；24mmol)、HOBt(3.67g；24mmol)和DIC(3.75mL；24mmol)加到在DMF(45mL)中的樹(shù)脂。將該混合物于室溫下振蕩3小時(shí)，倒空溶液，并用DMF(5×45mL)、CH2Cl2(5×45mL)洗滌樹(shù)脂，并進(jìn)行真空干燥。
B.制備中間產(chǎn)物B和C(圖1A)1.合成(3β，5β)-3-氨基膽烷-24-酸(B)45℃下將1M NaOH溶液(16.6mL；16.6mmol)滴加到在MeOH(65mL)中的(3β，5β)-3-氨基膽烷-24-酸甲酯(5.0g；12.8mmol)的溶液。45℃下攪拌3小時(shí)后，將混合物濃縮至25mL，并加入H2O(40mL)和1MHCl(22mL)。將沉淀的固體過(guò)濾，用H2O(2×50mL)洗滌并真空干燥得到B，為一種白色固體(5.0g；13.3mmol)。產(chǎn)率80％。
2.合成(3β，5β)-3-(9H-芴-9-基甲氧基)氨基膽烷-24-酸(C)將在1，4-二烷(9mL)中的9-芴基甲氧基羰基氯(0.76g；2.93mmol)的溶液滴加到在0℃下攪拌的在10％Na2CO3水溶液(16mL)和1，4-二烷(9mL)中的(3β，5β)-3-氨基膽烷-24-酸B(1.0g；2.66mmol)的懸浮液。室溫下攪拌6小時(shí)后，加入H2O(90mL)，用Et2O(2×90mL)洗滌水相，然后加入2M HCl(15mL)(最終pH1.5)。用EtOAc(2×100mL)萃取水相，用Na2SO4干燥有機(jī)相并蒸發(fā)。用快速色譜法純化粗品得到C，為一種白色固體(1.2g；2.0mmol)。產(chǎn)率69％。
C.合成L62(N-[(3β，5β)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙?；鵠氨基]-膽烷-24-基]-L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨酰基-甘氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺)(圖1B)將樹(shù)脂A(0.5g；0.3mmol)在固相肽合成容器中與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液并加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。將該懸浮液振蕩20分鐘，然后倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將(3β，5β)-3-(9H-芴-9-基甲氧基)氨基膽烷-24-酸C(0.72g；1.2mmol)、N-羥基苯并三唑(HOBT)(0.18g；1.2mmol)、N，N′-二異丙基碳二亞胺(DIC)(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物于室溫下振蕩24小時(shí)，倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉，并將混合物再振蕩20分鐘。倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將N-α-Fmoc-甘氨酸(0.79g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂。將混合物于室溫下振蕩3小時(shí)，倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉，將混合物再振蕩20分鐘。倒空溶液，用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂，然后將1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸三(1，1-二甲基乙基)酯與NaCl的加合物(0.79g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL1.2mmol)、DIEA(0.40mL；2.4mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂。將混合物在室溫下振蕩24小時(shí)，倒空溶液，用DMA(5×7mL)和CH2Cl2(5×7mL)洗滌樹(shù)脂，并真空干燥。將樹(shù)脂在燒瓶中與試劑B(25mL)一起振蕩4.5小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾，并在減壓下蒸發(fā)溶液得到一種油狀粗品，將其與Et2O(20mL)一起研磨得到一種沉淀。離心收集沉淀，并用Et2O(3×20mL)洗滌，然后用HPLC分析，并用制備HPLC純化。將含產(chǎn)物的級(jí)分凍干得到L62(6.6mg；3.8×10-3mmol)，為一種白色固體。產(chǎn)率4.5％。
實(shí)施例II-圖2A-F合成L70、L73、L74、L115和L116概述通過(guò)以下方法獲得產(chǎn)物將擔(dān)載在Rink酰胺樹(shù)脂上的八肽Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2(BBN[7-14][SEQ ID NO1])(具有適宜的側(cè)鏈保護(hù))與不同的連接基偶聯(lián)，然后用DOTA三叔丁酯官能化。在用試劑B裂解和脫保護(hù)之后，通過(guò)制備HPLC純化最終產(chǎn)物?？偖a(chǎn)率3-9％。
A.合成L70(圖2A)將樹(shù)脂A(0.5g；0.3mmol)在固相肽合成容器中與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液并加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。將懸浮液攪拌20分鐘，然后倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將Fmoc-4-氨基苯甲酸(0.43g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物在室溫下振蕩3小時(shí)，倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉，并將混合物振蕩20分鐘。倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將Fmoc-甘氨酸(0.36g；1.2mmol)、HATU(0.46g；1.2mmol)和DIEA(0.40mL；2.4mmol)在DMA(7mL)中攪拌15分鐘，然后將溶液加到樹(shù)脂，將混合物于室溫下振蕩2小時(shí)，倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉，并將混合物振蕩20分鐘。倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸三(1，1-二甲基乙基)酯與NaCl的加合物(0.79g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL1.2mmol)、DIEA(0.40mL；2.4mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂。將混合物于室溫下振蕩24小時(shí)。倒空溶液，用DMA(5×7mL)、CH2Cl2(5×7mL)洗滌樹(shù)脂并真空干燥。將樹(shù)脂在燒瓶中與試劑B(25mL)一起振蕩4小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾，并在減壓下蒸發(fā)濾液得到一種油狀粗品，將其與Et2O(5mL)一起研磨。離心收集沉淀。并用Et2O(5×5mL)洗滌，然后用HPLC分析并用制備HPLC純化。將包含產(chǎn)物的級(jí)分凍干得到L70，為一種白色絨毛狀固體(6.8mg；0.005mmol)。產(chǎn)率3％。
B.合成L73、L115和L116(圖2B-2E)將樹(shù)脂A(0.5g；0.3mmol)在固相肽合成容器中與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液并加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。將懸浮液攪拌20分鐘，然后倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將Fmoc-連接基-OH(1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物于室溫下振蕩3小時(shí)，倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉，并將混合物振蕩20分鐘。倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸三(1，1-二甲基乙基)酯與NaCl的加合物(0.79g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL1.2mmol)、DIEA(0.40mL；2.4mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂。將混合物在室溫下振蕩24小時(shí)，倒空溶液并用DMA(5×7mL)、CH2Cl2(5×7mL)洗滌樹(shù)脂并真空干燥。將樹(shù)脂在燒瓶中與試劑B(25mL)一起振蕩4小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾，并在減壓下蒸發(fā)溶液得到一種油狀粗品，將其與Et2O(5mL)一起研磨。離心收集沉淀，并用Et2O(5×5mL)洗滌，然后用HPLC分析并用制備HPLC純化。將包含產(chǎn)物的級(jí)分凍干。
C.合成L74(圖2F)將樹(shù)脂A(0.5g；0.3mmol)在固相肽合成容器中與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液并加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。將懸浮液攪拌20分鐘，然后倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將Fmoc-六氫異煙酸(0.42g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物于室溫下振蕩3小時(shí)，倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉，并將混合物振蕩20分鐘。倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將Fmoc-甘氨酸(0.36g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物于室溫下振蕩3小時(shí)，倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉，并將混合物振蕩20分鐘。倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸三(1，1-二甲基乙基)酯與NaCl的加合物(0.79g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL1.2mmol)、DIEA(0.40mL；2.4mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂。將混合物在室溫下振蕩24小時(shí)，倒空溶液，用DMA(5×7mL)、CH2Cl2(5×7mL)洗滌樹(shù)脂，并真空干燥。將樹(shù)脂在燒瓶中與試劑B(25mL)一起振蕩4小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾，并在減壓下蒸發(fā)溶液得到一種油狀粗品，將其與Et2O(5mL)一起研磨。離心收集沉淀并用Et2O(5×5mL)洗滌，然后用HPLC分析，并用HPPLC純化。將包含產(chǎn)物的級(jí)分凍干得到L74，為一種白色絨毛狀固體(18.0mg；0.012mmol)。產(chǎn)率8％。
實(shí)施例III-圖3A-E合成L67概述用NaOH水解(3β，5β)-3-氨基-12-氧代膽烷-24-酸甲酯A得到對(duì)應(yīng)的酸B，然后使其與Fmoc-甘氨酸反應(yīng)得到中間產(chǎn)物C。使用八肽Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2(BBN[7-14][SEQ ID NO1])官能化的Rink酰胺樹(shù)脂依次與C和DOTA三叔丁酯反應(yīng)。在用試劑B裂解和脫保護(hù)之后，用制備HPLC純化粗品，得到L67。總產(chǎn)率5.2％。
A.合成(3β，5β)-3-氨基-12-氧代膽烷-24-酸，(B)(圖3A)在45℃下將1M NaOH溶液(6.6mL；6.6mmol)滴加到在MeOH(15mL)中的(3β，5β)-3-氨基-12-氧代膽烷-24-酸甲酯A(2.1g；5.1mmol)的溶液。45℃下攪拌3小時(shí)后，將混合物濃縮至25mL，然后加入H2O(25mL)和1M HCl(8mL)。將沉淀的固體過(guò)濾，用H2O(2×30mL)洗滌，并真空干燥得到B，為一種白色固體(1.7g；4.4mmol)。產(chǎn)率88％。
B.合成(3β，5β)-3-[[(9H-芴-9-基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基-12-氧代膽烷-24-酸(C)(圖3A)將三丁基胺(0.7mL；3.1mmol)滴加到在0℃下攪拌的在THF(25mL)中的N-α-Fmoc-甘氨酸(0.9g；3.1mmol)的溶液。隨后加入氯甲酸異丁酯(0.4mL；3.1mmol)，并在10分鐘后于1小時(shí)內(nèi)將在DMF(30mL)中的三丁基胺(0.6mL；2.6mmol)和(3β，5β)-3-氨基-12-氧代膽烷-24-酸B(1.0g；2.6mmol)的懸浮液滴加到冷卻的溶液。使混合物升溫，并在6小時(shí)后將溶液濃縮至40mL，然后加入H2O(50mL)和1NHCl(10mL)(最終pH1.5)。將沉淀的固體過(guò)濾，用H2O(2×50mL)洗滌，真空干燥，并用快速色譜法純化得到C，為一種白色固體(1.1g；1.7mmol)。產(chǎn)率66％。
C.合成L67(N-[(3β，5β)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]乙?；鵠氨基]-12，24-二氧代膽烷-24-基]-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨酰基-甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺)(圖3B和3E)。
將樹(shù)脂D(0.5g；0.3mmol)在固相肽合成容器中與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液并加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。將懸浮液攪拌20分鐘，然后倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將(3β，5β)-3-[[(9H-芴-9-基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基]-12-氧代膽烷-24-酸C(0.80g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物在室溫下振蕩24小時(shí)，倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉，并將混合物振蕩20分鐘。倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸三(1，1-二甲基乙基)酯與NaCl的加合物(0.79g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL1.2mmol)、DIEA(0.40mL；2.4mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂。將混合物在室溫下振蕩24小時(shí)，倒空溶液，用DMA(5×7mL)、CH2Cl2(5×7mL)洗滌樹(shù)脂并真空干燥。將樹(shù)脂在燒瓶中與試劑B(25mL)一起振蕩4.5小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾，并在減壓下蒸發(fā)溶液得到一種油狀粗品，將其與Et2O(20mL)一起研磨。
實(shí)施例IV-圖4A-H合成L63和L64
概述用NaOH水解(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸甲酯1b得到中間產(chǎn)物2b，然后使其與Fmoc-甘氨酸反應(yīng)得到3b。使用八肽Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2(BBN[7-14][SEQID NO1])官能化的Rink酰胺樹(shù)脂與3b反應(yīng)，然后與DOTA三叔丁酯反應(yīng)。在用試劑B裂解和脫保護(hù)之后，用制備HPLC純化粗品得到L64。從已經(jīng)獲得的中間產(chǎn)物2a開(kāi)始重復(fù)相同的過(guò)程得到L63。總產(chǎn)率分別為9和4％。
A.合成(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸，(2b)(圖4A)將1M NaOH溶液(130mL；0.13mol)滴加到在45℃下加熱的在MeOH(300mL)中的(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸甲酯1b(42.1g；0.10mol)的溶液。45℃下攪拌3小時(shí)后，將混合物濃縮至150mL，并加入H2O(350mL)。在用CH2Cl2(2×100mL)萃取之后，將水溶液濃縮到200mL并加入1M HCl(150mL)。將沉淀的固體過(guò)濾，用H2O(2×100mL)洗滌，并真空干燥得到2b，為一種白色固體(34.8g；0.08mol)。產(chǎn)率80％。
B.合成(3β，5β，12α)-3-[[(9H-芴-9-基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基-12-羥基膽烷-24-酸，(3a)(圖4A)將三丁基胺(4.8mL；20.2mmol)滴加到在0℃下攪拌的在THF(120mL)中的N-α-Fmoc-甘氨酸(6.0g；20.2mmol)的溶液。隨后加入氯甲酸異丁酯(2.6mL；20.2mmol)，并在10分鐘后于1小時(shí)內(nèi)將在DMF(120mL)中的三丁基胺(3.9mL；16.8mmol)和(3β，5β，12α)-3-氨基-12-羥基膽烷-24-酸2a(6.6g；16.8mmol)的懸浮液滴加到冷卻的溶液。使混合物升溫，并在6小時(shí)后將溶液濃縮至150mL，然后加入H2O(250mL)和1N HCl(40mL)(最終pH1.5)。將沉淀的固體過(guò)濾，用H2O(2×100mL)洗滌，真空干燥，并用快速色譜法純化得到3a，為一種白色固體(3.5g；5.2mmol)。產(chǎn)率31％。
C.合成(3β，5β，7α，12α)-3-[[(9H-芴-9-基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸，(3b)(圖4A)將三丁基胺(3.2mL；13.5mmol)滴加到在0℃下攪拌的在THF(80mL)中的N-α-Fmoc-甘氨酸(4.0g；13.5mmol)的溶液。然后加入氯甲酸異丁酯(1.7mL；13.5mmol)，并在10分鐘后于1小時(shí)內(nèi)將在DMF(80mL)中的三丁基胺(2.6mL；11.2mmol)和(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸3a(4.5g；11.2mmol)的懸浮液滴加到冷卻的溶液。使混合物升溫，并在6小時(shí)后將溶液濃縮至120mL，然后加入H2O(180mL)和1N HCl(30mL)(最終pH1.5)。將沉淀的固體過(guò)濾，用H2O(2×100mL)洗滌，真空干燥，并用快速色譜法純化得到3a，為一種白色固體(1.9g；2.8mmol)。產(chǎn)率25％。
在一個(gè)可替代選擇的方法中，(3β，5β，7α，12α)-3-[[(9H-芴-9-基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸，(3b)可以如下制備將N-羥基琥珀酰亞胺(1.70g，14.77mmol)和DIC(1.87g，14.77mmol)依次加到在二氯甲烷(15mL)中的Fmoc-Gly-OH(4.0g，13.45mmol)的攪拌溶液；將所得的混合物于室溫下攪拌4小時(shí)。通過(guò)過(guò)濾除去形成的N，N′-二異丙基脲，并用乙醚(20mL)洗滌固體。除去揮發(fā)物，并用乙醚(3×20mL)洗滌形成的固體Fmoc-Gly-琥珀酰亞胺酯。然后將Fmoc-Gly-琥珀酰亞胺酯再溶于無(wú)水DMF(15mL)，并將3-氨基脫氧膽酸(5.21g，12.78mmol)加到該澄清的溶液。將反應(yīng)混合物于室溫下攪拌4小時(shí)，加入水(200mL)并將沉淀的固體過(guò)濾，用水洗滌，干燥并用硅膠色譜法(TLC(二氧化硅)(Rf0.50，硅膠，CH2Cl2/CH3OH，9∶1)(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH(9∶1))純化得到(3β，5β，7α，12α)-3-[[(9H-芴-9-基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸，為一種無(wú)色固體。產(chǎn)率7.46g(85％)。
D.合成L63(N-[(3β，5β，12α)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]乙?；鵠氨基]-12-羥基-24-氧代膽烷-24-基]-L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨酰基-甘氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺)(圖4B)將樹(shù)脂A(0.5g；0.3mmol)在固相肽合成容器中與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液并加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。將懸浮液攪拌20分鐘，然后倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將(3β，5β，12α)-3-[[(9H-芴-9-基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基-12-羥基膽烷-24-酸3a(0.82g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物在室溫下振蕩24小時(shí)，倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉，并將混合物振蕩20分鐘。倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸三(1，1-二甲基乙基)酯與NaCl的加合物(0.79g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL1.2mmol)、DIEA(0.40mL；2.4mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂。將混合物在室溫下振蕩24小時(shí)，倒空溶液并用DMA(5×7mL)、CH2Cl2(5×7mL)洗滌樹(shù)脂，并真空干燥。將樹(shù)脂在燒瓶中與試劑B(25mL)一起振蕩4小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾，并在減壓下蒸發(fā)溶液得到一種油狀粗品，用Et2O(5mL)處理后得到一種沉淀。離心收集沉淀并用Et2O(5×5mL)洗滌，然后用HPLC分析和純化。將包含產(chǎn)物的級(jí)分凍干得到L63，為一種白色絨毛狀固體(12.8mg；0.0073mmol)。產(chǎn)率9％。
E.合成L64(N-[(3β，5β，7α，12α)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙?；鵠氨基]-7，12-二羥基-24-氧代膽烷-24-基]]-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺)(圖4C)
將樹(shù)脂A(0.5g；0.3mmol)在固相肽合成容器中與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液并加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。將懸浮液攪拌20分鐘，倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將(3β，5β，7α，12α)-3-[[(9H-芴-9-基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸3b(0.81g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物在室溫下振蕩24小時(shí)，倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉，并將混合物振蕩20分鐘。倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸三(1，1-二甲基乙基)酯與NaCl的加合物(0.79g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL1.2mmol)、DIEA(0.40mL；2.4mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂。將混合物在室溫下振蕩24小時(shí)，倒空溶液，用DMA(5×7mL)、CH2Cl2(5×7mL)洗滌樹(shù)脂，并真空干燥.將樹(shù)脂在燒瓶中與試劑B(25mL)一起振蕩4小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾，并在減壓下蒸發(fā)溶液得到一種油狀粗品，將其與Et2O(5mL)一起研磨。離心收集沉淀，并用Et2O(5×5mL)洗滌。然后將其溶于H2O(20mL)，并加入Na2CO3(0.10g；0.70mmol)；將所得的混合物在室溫下攪拌4小時(shí)。用HPLC純化此溶液，將包含產(chǎn)物的級(jí)分凍干得到L64，為一種白色絨毛狀固體(3.6mg；0.0021mmol)。產(chǎn)率4％。
實(shí)施例V-圖5A-E合成L71和L72概述分兩步得到產(chǎn)物。第一步是在上文討論的Rink酰胺樹(shù)脂上固相合成八肽Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2(BBN[7-14][SEQ ID NO1])(具有適宜的側(cè)鏈保護(hù)基)。第二步是與不同的連接基偶聯(lián)，然后用DOTA三叔丁酯官能化。在用試劑B裂解和脫保護(hù)之后，通過(guò)制備HPLC純化最終產(chǎn)物?？偖a(chǎn)率3-9％。
A.蛙皮素[7-14]官能化和裂解方法(圖5A和5D)將樹(shù)脂B(0.5g；0.3mmol)在固相肽合成容器中與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，并加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。將懸浮液攪拌20分鐘，然后倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂.將Fmoc-連接基-OH(1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂。將混合物在室溫下振蕩3小時(shí)，倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉，并將混合物振蕩20分鐘。倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸三(1，1-二甲基乙基)酯與NaCl的加合物C(0.79g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL1.2mmol)、DIEA(0.40mL；2.4mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂。將混合物于室溫下振蕩24小時(shí)。倒空溶液，并用DMA(5×7mL)、CH2Cl2(5×7mL)洗滌樹(shù)脂，并真空干燥。將樹(shù)脂在燒瓶中與試劑B(25mL)一起振蕩4小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾，并在減壓下蒸發(fā)濾液得到一種油狀粗品，將其與乙醚(5mL)一起研磨。離心收集沉淀，并用乙醚(5×5mL)洗滌，然后用分析HPLC分析，并用制備HPLC純化。將包含產(chǎn)物的級(jí)分凍干。
B.產(chǎn)物1.L71(4-[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]甲基]苯甲酰基-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺)得到產(chǎn)物，為一種白色絨毛狀固體(7.3mg；0.005mmol)。產(chǎn)率7.5％。
2.L72(反式-4-[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]甲基]環(huán)己基羰基-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺)得到產(chǎn)物，為一種白色絨毛狀固體(7.0mg；0.005mmol)。產(chǎn)率4.8％。
C.反式-4-[[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]甲基]環(huán)己烷甲酸，(D)(圖5E)將在1，4-二烷(40mL)中的N-(9-芴基甲氧基羰基氧)琥珀酰亞胺(4.4g；14.0mmol)的溶液滴加到冷卻至0℃的在10％Na2CO3(30mL)中的反式-4-(氨基甲基)環(huán)己烷甲酸(2.0g；12.7mmol)的溶液。然后使混合物溫至室溫，并在室溫下攪拌1小時(shí)后用1N HCl(32mL)處理直至最終pH為2。用n-BuOH(100mL)萃取所得的溶液；除去揮發(fā)物，并用快速色譜法純化粗殘余物，得到D，為一種白色固體(1.6g；4.2mmol)。產(chǎn)率33％。
實(shí)施例VI-圖6A-F合成L75和L76概述通過(guò)以下方法得到兩種產(chǎn)物將擔(dān)載在Rink酰胺樹(shù)脂上的八肽Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2(BBN[7-14][SEQ IDNO1])(A)與兩種連接基E和H偶聯(lián)，然后用DOTA三叔丁酯官能化。在用試劑B裂解和脫保護(hù)之后，通過(guò)制備HPLC純化最終產(chǎn)物?？偖a(chǎn)率8.5％(L75)和5.6％(L76)。
A.2-[(1，3-二氫-1，3-二氧代-2H-異吲哚-2-基)甲基]苯甲酸，(C)(圖6A)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法(Bornstein，J；Drummon，P.E.；Bedell，S.F.Org Synth.Coll.Vol.IV 1963，810-812)合成產(chǎn)物。
B.2-(氨基甲基)苯甲酸，(D)(圖6A)將40％甲基胺溶液(6.14mL；7.1mmol)加到2-[(1，3-二氫-1，3-二氧代-2H-異吲哚-2-基)甲基]苯甲酸C(2g；7.1mmol)，然后加入EtOH(30mL)。室溫下攪拌5分鐘后在50℃下加熱反應(yīng)混合物。2.5小時(shí)后，將混合物冷卻，并在減壓下蒸發(fā)溶劑。將粗產(chǎn)物懸浮在50mL無(wú)水乙醇中，并在室溫下將懸浮液攪拌1小時(shí)。將固體過(guò)濾，并用EtOH洗滌得到2-(氨基甲基)苯甲酸D(0.87g；5.8mmol)。產(chǎn)率81％。
C.2-[[[9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]甲基]苯甲酸，(E)(圖6A)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法(Sun，J-H.；Deneker，W.F.Synth.Commun.1998，28，4525-4530)合成產(chǎn)物。
D.4-(氨基甲基)-3-硝基苯甲酸，(G)(圖6B)將4-(溴甲基)-3-硝基苯甲酸(3.2g；12.3mmol)溶于在EtOH(300mL)中的8％NH3，并將所得的溶液于室溫下攪拌。22小時(shí)后蒸發(fā)溶液，并將殘余物懸浮在H2O(70mL)中。將懸浮液攪拌15分鐘并過(guò)濾。將收集的固體懸浮在H2O(40mL)中，并通過(guò)加入數(shù)滴25％NH4OH水溶液(pH 12)來(lái)溶解，然后通過(guò)加入6N HCl調(diào)節(jié)溶液的pH至6。將沉淀的固體過(guò)濾，依次用MeOH(3×5mL)和Et2O(10mL)洗滌，并真空干燥(1.3kPa；P2O5)得到4-(氨基甲基)-3-硝基苯甲酸，為一種灰褐色固體(1.65g；8.4mmol)。產(chǎn)率68％。
E.4-[[[9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]甲基]-3-硝基苯甲酸，(H)(圖6B)將4-(氨基甲基)-3-硝基苯甲酸G(0.8g；4mmol)溶于10％Na2CO3水溶液(25mL)和1，4-二烷(10mL)，并將溶液冷卻至0℃。滴加在1，4-二烷(10mL)中的9-芴基甲基氯甲酸酯(Fmoc-Cl)(1.06g；4mmol)的溶液20分鐘。在0-5℃下2小時(shí)和10℃下1小時(shí)后，將反應(yīng)混合物過(guò)濾，并通過(guò)加入1N HCl將溶液酸化至pH 5。將沉淀過(guò)濾，用H2O(2×2mL)洗滌，真空干燥(1.3kPa；P2O5)得到4-[[[9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]甲基]-3-硝基苯甲酸，為一種白色固體(1.6g；3.7mmol)。產(chǎn)率92％。
F.L75(N-[2-[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]甲基]苯甲?；鵠-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺)(圖6C)將樹(shù)脂A(0.5g；0.3mmol)在固相肽合成容器中與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，并加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉，將懸浮液攪拌20分鐘，然后倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將2-[[[9H-芴-9-基甲氧基]羰基]氨基]甲基]苯甲E(0.45g；1.2mmol)、N-羥基苯并三唑(HOBT)(0.18g；1.2mmol)、N，N′-二異丙基碳二亞胺(DIC)(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物于室溫下振蕩24小時(shí)，倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉，并將混合物振蕩20分鐘。倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸三(1，1-二甲基乙基)酯與NaCl的加合物(DOTA三叔丁酯)(0.79g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)、DIEA(0.40mL；2.4mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂。將混合物在室溫下振蕩24小時(shí)，倒空溶液，用DMA(5×7mL)、CH2Cl2(5×7mL)洗滌樹(shù)脂并真空干燥。將樹(shù)脂在燒瓶中與試劑B(25mL)一起振蕩4.5小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾，并在減壓下蒸發(fā)濾液得到一種油狀粗品，在用Et2O(20mL)處理后得到一種沉淀。通過(guò)離心收集所得的沉淀，并用Et2O(3×20mL)洗滌得到L75(190mg；0.13mmol)，為一種白色固體。產(chǎn)率44％。
G.L76(N-[4-[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]甲基]-3-硝基苯甲?；鵠-L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?1-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺)(圖6D)將樹(shù)脂A(0.5g；0.3mmol)在固相肽合成容器中與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液并加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。將懸浮液攪拌20分鐘，然后倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將4-[[[9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]甲基]-3-硝基苯甲酸H(0.50g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物于室溫下振蕩24小時(shí)，倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉，并將混合物振蕩20分鐘。倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將DOTA三叔丁酯(0.79g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL1.2mmol)、DIEA(0.40mL；2.4mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂。將混合物在室溫下振蕩24小時(shí)，倒空溶液，并用DMA(5×7mL)、CH2Cl2(5×7mL)洗滌樹(shù)脂，并真空干燥。將樹(shù)脂在燒瓶中與試劑B(25mL)一起振蕩4.5小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾，并在減壓下蒸發(fā)溶液得到一種油狀粗品，將其與Et2O(20mL)一起研磨。離心收集沉淀，并用Et2O(3×20mL)洗滌得到一種固體(141mg)，用HPLC對(duì)其進(jìn)行分析。用制備HPLC純化37mg部分粗品。將包含產(chǎn)物的級(jí)分凍干得到L76(10.8mg；7.2×10-3mmol)，為一種白色固體。產(chǎn)率9％。
實(shí)施例VII-圖7A-C合成L124概述使4-氰基苯酚A與溴乙酸乙酯和K2CO3在丙酮中反應(yīng)得到中間產(chǎn)物B，用NaOH水解得到對(duì)應(yīng)的酸C。用H2和PtO2，在355kPa下，在EtOH/CHCl3中對(duì)C進(jìn)行連續(xù)氫化得到對(duì)應(yīng)的氨基酸D，直接用FmocOSu保護(hù)得到E。使用八肽Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2(BBN[7-14][SEQ ID NO1])官能化的Rink酰胺樹(shù)脂與E反應(yīng)，然后與DOTA三叔丁酯反應(yīng)。在用試劑B裂解和脫保護(hù)之后，通過(guò)制備HPLC純化粗品得到L124?？偖a(chǎn)率1.3％A.合成(4-氰基苯氧基)乙酸乙酯，(B)(圖7A)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法(Archimbault，P.；LeClerc，G.；Strosberg，A.D.；Pietri-Rouxel，F(xiàn).PCT Int.Appl.WO 980005，1998)合成產(chǎn)物。
B.合成(4-氰基苯氧基)乙酸(C)(圖7A)將1N NaOH溶液(7.6mL；7.6mmol)滴加到在MeOH(15mL)中的(4-氰基苯氧基)乙酸乙酯B(1.55g；7.6mmol)的溶液。1小時(shí)后用1N HCl(7.6mL；7.6mmol)酸化溶液并蒸發(fā)。將殘余物吸收于水(20mL)，并用CHCl3(2×30mL)萃取。蒸發(fā)有機(jī)相，并用快速色譜法純化粗品得到(4-氰基苯氧基)乙酸C(0.97g；5.5mmol)，為一種白色固體。產(chǎn)率72％。
C.合成[4-[[[9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]甲基]苯氧基]乙酸，(E)(圖7A)將PtO2(150mg)加到在EtOH(147mL)和CHCl3(3mL)中的(4-氰基苯氧基)乙酸C(1.05g；5.9mmol)的溶液。將懸浮液在氫氣氛(355kPa；20℃)下攪拌30小時(shí)。用C鹽襯墊過(guò)濾混合物，并將溶液真空蒸發(fā)。用快速色譜法純化殘余物得到酸D(0.7g)，0℃下將其溶于H2O(10mL)、MeCN(2mL)和Et3N(0.6mL)，然后滴加在MeCN(22mL)中的N-(9-芴基甲氧基羰基氧)琥珀酰亞胺(1.3g；3.9mmol)的溶液。室溫下攪拌16小時(shí)后，將反應(yīng)混合物過(guò)濾，并在真空下除去揮發(fā)物。用1N HCl(10mL)處理殘余物，將沉淀的固體過(guò)濾，并用快速色譜法純化得到[4-[[[9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]甲基]苯氧基]乙酸E(0.56g；1.4mmol)，為一種白色固體.總產(chǎn)率24％。
D.合成L124(N-[[4-[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]甲基]苯氧基]乙酰基]-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺)(圖7B)將樹(shù)脂A(480mg；0.29mmol)在固相肽合成容器中與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，并加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。將懸浮液攪拌20分鐘，倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將[4-[[[9H-芴-9-基甲氧基]羰基]氨基]甲基]苯氧基]乙酸E(480mg；1.19mmol)、N-羥基苯并三唑(HOBT)(182mg；1.19mmol)、N，N′-二異丙基碳二亞胺(DIC)(185μL；1.19mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物在室溫下振蕩24小時(shí)，倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(6mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(6mL)中的50％嗎啉，并將混合物振蕩20分鐘。倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸三(1，1-二甲基乙基)酯與NaCl的加合物(750mg；1.19mmol)、HOBT(182mg；1.19mmol)、DIEA(404μL；2.36mmol)、DIC(185μL；1.19mmol)和DMA(6mL)加到樹(shù)脂。將混合物在室溫下振蕩24小時(shí)，倒空溶液，用DMA(2×7mL)、CH2Cl2(5×7mL)洗滌樹(shù)脂，并真空干燥。將樹(shù)脂在燒瓶中與試劑B(25mL)一起振蕩4小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾，并在減壓下蒸發(fā)濾液得到一種油狀粗品，將其與Et2O(5mL)一起研磨。離心收集沉淀，并用Et2O(5×5mL)洗滌得到一種固體(148mg)，用HPLC分析。用制備HPLC純化65mg部分粗品。將包含產(chǎn)物的級(jí)分凍干得到L124(圖7C)，為一種白色固體(15mg；0.01mmol)。產(chǎn)率7.9％。
實(shí)施例VIII-圖8A-C合成L125
概述使4-(溴甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯A與在DMF中的NaN3反應(yīng)得到中間產(chǎn)物疊氮化物B，然后用Ph3P和H2O還原成胺C。用NaOH水解C得到酸D，直接用FmocOSu保護(hù)得到E。使用八肽Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2(BBN[7-14][SEQ ID NO1])(A)官能化的Rink酰胺樹(shù)脂與E反應(yīng)，然后與DOTA三叔丁酯反應(yīng)。在用試劑B裂解和脫保護(hù)之后，通過(guò)制備HPLC純化粗品得到L125?？偖a(chǎn)率0.2％。
A.合成4-(疊氮基甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯，(B)(圖8A)將在DMF(90mL)中的4-(溴甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(8g；31mmol)和NaN3(2g；31mmol)的溶液于室溫下攪拌過(guò)夜。在真空下除去揮發(fā)物，并將粗產(chǎn)物溶于EtOAc(50mL)。用水(2×50mL)洗滌溶液并干燥。將揮發(fā)物蒸發(fā)得到4-(疊氮基甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(6.68g；30mmol)。產(chǎn)率97％。
B.4-(氨基甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯，(C)(圖8A)將三苯膦(6.06g；23mmol)加到在THF(50mL)中的(4-疊氮基甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯B(5g；22mmol)的溶液觀察到產(chǎn)生氫和形成白色固體。將混合物在氮?dú)夥蘸褪覝叵聰嚢琛?4小時(shí)后再加入三苯膦(0.6g；2.3mmol)。24小時(shí)后疊氮化物被消耗，并加入H2O(10mL)。4小時(shí)后白色固體消失。將混合物于45℃下加熱3小時(shí)，并在室溫下攪拌過(guò)夜。將溶液蒸發(fā)至干，并用快速色譜法純化粗品得到4-(氨基甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯C(1.2g；6.1mmol)。產(chǎn)率28％。
C.4-[[[9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]甲基]-3-甲氧基苯甲酸，(E)(圖8A)將1N NaOH溶液(6.15mL；6.14mmol)滴加到在40℃下加熱的在MeOH(25mL)中的4-(氨基甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯C(1.2g；6.14mmol)的溶液。45℃下攪拌8小時(shí)后，將溶液于室溫下攪拌過(guò)夜。加入1N NaOH溶液(0.6mL；0.6mmol)，并將混合物在40℃下加熱4小時(shí)。濃縮溶液，用1N HCl(8mL；8mmol)酸化，用EtOAc(2×10mL)萃取，然后將水層濃縮至15mL。將此溶液(pH4.5)于0℃下冷卻，并加入Et3N(936μL；6.75mmol)(pH 11)。滴加在MeCN(30mL)中的N-(9-芴基甲氧基羰基氧)琥珀酰亞胺(3.04g；9mmol)的溶液(最終pH 9)，沉淀出白色固體。室溫下攪拌1小時(shí)后將固體過(guò)濾，懸浮在1N HCl(15mL)中，并將懸浮液攪拌30分鐘。將固體過(guò)濾得到4-[[[9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]甲基]-3-甲氧基苯甲酸E，為一種白色固體(275mg；0.7mmol)。將濾液真空蒸發(fā)，并將所得的白色殘余物懸浮在1N HCl(20mL)中，并攪拌30分鐘。將固體過(guò)濾，并用快速色譜法純化得到更多的酸E(198mg；0.5mmol).總產(chǎn)率20％。
D.L125(N-[4-[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]甲基]-3-甲氧基苯甲酰基]-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺)(圖8B)將樹(shù)脂A(410mg；0.24mmol)在固相肽合成容器中與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，并加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。將懸浮液攪拌20分鐘，然后倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將4-[[[9H-芴-9-基甲氧基]羰基]氨基]甲基]-3-甲氧基苯甲酸E(398mg；0.98mmol)、HOBT(151mg；0.98mmol)、DIC(154μL；0.98mmol)和DMA(6mL)加到樹(shù)脂；將混合物在室溫下振蕩24小時(shí)，倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將樹(shù)脂與在DMA(6mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(6mL)中的50％嗎啉，將混合物振蕩20分鐘。倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸三(1，1-二甲基乙基)酯與NaCl的加合物(618mg；0.98mmol)、HOBT(151mg；0.98mmol)、DIC(154μL；0.98mmol)、DIEA(333μL；1.96mmol)和DMA(6mL)加到樹(shù)脂。將混合物在室溫下振蕩24小時(shí)，倒空溶液，用DMA(5×7mL)、CH2Cl2(5×7mL)洗滌樹(shù)脂并真空干燥。將樹(shù)脂在燒瓶中與試劑B(25mL)一起振蕩4小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾，并在減壓下蒸發(fā)溶液得到一種油狀粗品，將其與Et2O(5mL)一起研磨。用Et2O(5×5mL)洗滌通過(guò)離心收集所得的沉淀，用HPLC分析，并用制備HPLC純化。將包含產(chǎn)物的級(jí)分凍干得到L125(圖8C)，為一種白色固體(15.8mg；0.011mmol)。產(chǎn)率4.4％。
實(shí)施例IX-圖9A-9D合成L146、L233、L234和L235概述分幾步從擔(dān)載在Rink酰胺樹(shù)脂上的八肽Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2(BBN[7-14])(A)開(kāi)始獲得產(chǎn)物。在最后用試劑B裂解和脫保護(hù)之后，用制備HPLC純化粗品得到L146、L233、L234和L235。總產(chǎn)率分別為10％、11％、4.5％、5.7％。
A.3-[[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]乙?；鵠氨基苯甲酸，B(圖9A)將在THF(20mL)中的3-氨基苯甲酸(0.5g；3.8mmol)和N-乙基二異丙基胺(DIEA)(0.64mL；3.8mmol)的溶液滴加到在THF(10mL)和CH2Cl2(10mL)中的Fmoc-甘氨酸氯化物(1.2g；4.0mmol)(3)的溶液。室溫下攪拌24小時(shí)后，加入1M HCl(50mL)(最終pH1.5)。將沉淀過(guò)濾，用H2O(2×100mL)洗滌，真空干燥并用CHCl3/CH3OH(1∶1)結(jié)晶得到B，為一種白色固體(0.7g；1.6mmol)。產(chǎn)率43％。
B.N-[3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙酰基]氨基]苯甲?；鵠-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺，L233(圖9D)將樹(shù)脂A(0.5g；0.3mmol)在固相肽合成容器中與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，并加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。
將懸浮液再攪拌20分鐘，然后倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將3-[[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]乙?；鵠氨基苯甲酸B(0.50g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物于室溫下振蕩6小時(shí)，倒空，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉，將混合物再振蕩20分鐘。倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將DOTA三叔丁酯與NaCl2的加合物(0.79g；1.2mmol)(5)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL1.2mmol)、DIEA(0.40mL；2.4mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂。將混合物在室溫下振蕩24小時(shí)，倒空，用DMA(5×7mL)、CH2Cl2(5×7mL)洗滌樹(shù)脂，并真空干燥。將該樹(shù)脂在燒瓶中與試劑B(25mL)一起振蕩4.5小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾，并在減壓下蒸發(fā)溶液得到一種油狀粗品，用Et2O(20mL)進(jìn)行處理后得到一種沉淀。離心收集沉淀，并用Et2O(3×20mL)洗滌得到一種固體(152mg)，用HPLC分析。用制備HPLC純化一定量的粗品(50mg)。將包含產(chǎn)物的級(jí)分凍干得到L233(17.0mg；11.3×10-3mmol)，為一種白色固體。產(chǎn)率11％。
C.N-[4-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙?；鵠氨基]苯基乙?；鵠-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺，L146(圖9D)將樹(shù)脂A(0.5g；0.3mmol)在固相肽合成容器中與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，過(guò)濾溶液，并加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。將該懸浮液再攪拌20分鐘，然后過(guò)濾溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將Fmoc-4-氨基苯基乙酸(0.45g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物在室溫下振蕩6小時(shí)，過(guò)濾并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，將溶液過(guò)濾，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉，并將混合物再振蕩20分鐘。過(guò)濾溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將Fmoc-甘氨酸(0.36g；1.2mmol)、HATU(0.46g；1.2mmol)和DIEA(0.40mL；2.4mmol)在DMA(7mL)中攪拌15分鐘，然后將溶液加到樹(shù)脂，將混合物于室溫下振蕩2小時(shí)，過(guò)濾并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，將溶液過(guò)濾，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉，并將混合物再振蕩20分鐘。過(guò)濾溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將DOTA三叔丁酯與NaCl的加合物(0.79g；1.2mmol)、HOBt(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)、DIEA(0.40mL；2.4mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂。將混合物于室溫下振蕩24小時(shí)，過(guò)濾，并用DMA(5×7mL)、CH2Cl2(5×7mL)洗滌樹(shù)脂并真空干燥。將樹(shù)脂在燒瓶中與試劑B(25mL)一起振蕩4.5小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾，并在減壓下蒸發(fā)溶液得到一種油狀粗品，用Et2O(20mL)處理后得到一種沉淀。離心收集沉淀，并用Et2O(3×20mL)洗滌得到一種固體(203mg)，對(duì)其用HPLC分析。通過(guò)制備HPLC純化一定量的粗品(50mg)。將包含產(chǎn)物的級(jí)分凍干得到L146(11.2mg；7.4×10-3mmol)，為一種白色固體。產(chǎn)率10％。
D.6-[[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]乙?；鵠氨基萘甲酸，C(圖9B)將在THF(20mL)中的6-氨基萘甲酸(500mg；2.41mmol)和DIEA(410μL 2.41mmol)的溶液滴加到在CH2Cl2/THF 1∶1(10mL)中的Fmoc-甘氨酸氯化物(760mg；2.41mmol)的溶液，并在室溫下攪拌。24小時(shí)后，將溶劑真空蒸發(fā)。用0.5N HCl(50mL)吸收殘余物，并攪拌1小時(shí)。將沉淀的白色固體過(guò)濾并干燥。將白色固體懸浮在甲醇(30mL)，并煮沸5分鐘，然后過(guò)濾得到產(chǎn)物C(690mg；1.48mmol)。產(chǎn)率62％。
E.N-[6-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙?；鵠氨基]萘甲?；鵠-L-谷氨酰胺酰基-L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨酰基-甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺，L234將樹(shù)脂A(500mg；0.3mmol)在固相肽合成容器中與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，并加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。將懸浮液再攪拌20分鐘，然后倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將6-[[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]乙?；鵠氨基萘甲酸C(560mg；1.2mmol)、HOBT(184mg；1.2mmol)、DIC(187μL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物在室溫下振蕩6小時(shí)，倒空并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(6L)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉，將混合物再振蕩20分鐘。倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將DOTA三叔丁酯與NaCl的加合物(757mg；1.2mmol)、HOBT(184mg；1.2mmol)、DIC(187uL；1.2mmol)和DIEA(537uL；2.4mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂。將混合物在燒瓶中振蕩，倒空，用DMA(2×7mL)、CH2Cl2(5×7mL)洗滌樹(shù)脂，并真空干燥。將樹(shù)脂在燒瓶中與試劑B(25mL)一起振蕩4.5小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾，并在減壓下蒸發(fā)溶液得到一種油粗品，將其用Et2O(20mL)處理之后得到一種沉淀。離心收集沉淀，并用Et2O(3×20mL)洗滌得到一種固體(144mg)，對(duì)其用HPLC進(jìn)行分析。通過(guò)制備HPLC純化一定量的粗品(54mg)。將包含產(chǎn)物的級(jí)分凍干得到L234(8mg；5.1×10-3mmol)，為一種白色固體。產(chǎn)率4.5％。
F.4-[[[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]乙?；鵠甲基氨基]苯甲酸，D(圖9C)將在THF(20mL)中的4-N-甲基氨基萘甲酸(500mg；3.3mmol)和DIEA(562uL 3.3mmol)的溶液加到在CH2Cl2/THF 1∶1(10mL)中的Fmoc-甘氨酸氯化物(1.04g；3.3mmol)的溶液，并在室溫下攪拌。24小時(shí)后，在真空下蒸發(fā)溶劑。用0.5N HCl(30mL)吸收殘余物，并在0℃下攪拌3小時(shí)。將沉淀的白色固體過(guò)濾并干燥。用快速色譜法純化粗品得到化合物D(350mg；0.81mmol)。產(chǎn)率25％。
G.N-[4-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙?；鵠甲基氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺，L235(圖9D)將樹(shù)脂A(500mg；0.3mmol)在固相肽合成容器中與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，并加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。將懸浮液再攪拌20分鐘，然后倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將4-[[[[9H-芴-9-基甲氧基]羰基]氨基]乙?；鵠-N-甲基]氨基-苯甲酸D(510mg；1.2mmol)、HOBT(184mg；1.2mmol)、DIC(187μL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物在室溫下振蕩6小時(shí)，倒空，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉，并將混合物再振蕩20分鐘。倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將DOTA三叔丁酯與NaCl的加合物(757mg；1.2mmol)、HOBT(184mg；1.2mmol)、DIC(187μL；1.2mmol)和DIEA(537μL，2.4mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂.將混合物在燒瓶中振蕩，倒空，用DMA(2×7mL)、CH2Cl2(5×7mL)洗滌樹(shù)脂，并真空干燥.將樹(shù)脂在燒瓶中與試劑B(25mL)一起振蕩4.5小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾，并在減壓下蒸發(fā)溶液得到一種油粗品，對(duì)其用Et2O(20mL)處理后得到一種沉淀。通過(guò)離心收集沉淀，并用Et2O(3×20mL)洗滌得到一種固體(126mg)，用HPLC對(duì)其進(jìn)行分析。用制備HPLC純化一定量的粗品(53mg)。將包含產(chǎn)物的級(jí)分凍干得到L235(11mg；7.2×10-3mmol)，為一種白色固體。產(chǎn)率5.7％。
實(shí)施例X-圖10A-B合成L237概述在pH 3下用氯甲酸芐酯選擇性保護(hù)1-甲?；?1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷(A)以得到B，用溴乙酸叔丁酯將其烷基化，并用羥胺鹽酸鹽將其去甲?；玫紻。與P(OtBu)3和低聚甲醛反應(yīng)得到E，通過(guò)氫化去保護(hù)和用溴乙酸芐酯進(jìn)行烷基化以得到G，最終將其氫化成H。使用八肽Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2(BBN[7-14])官能化的Rink酰胺樹(shù)脂(A)依次與Fmoc-4-氨基苯甲酸、Fmoc-甘氨酸和H反應(yīng)。在用試劑B裂解和脫保護(hù)之后，用制備HPLC純化粗品得到L237?？偖a(chǎn)率0.21％。
A.7-甲?；?1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-甲酸苯基甲酯二鹽酸鹽，B(圖10A)將1-甲?；?1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷A(14g；69.9mmol)溶于H2O(100mL)，并加入12N HCl(11mL)直至pH 3，然后加入1，4-二烷(220mL)。在3.5小時(shí)內(nèi)緩慢滴加在1，4-二烷(15mL)中的氯甲酸芐酯(13.8g；77mmol)的溶液，通過(guò)用pH恒穩(wěn)儀器連續(xù)加入2NNaOH(68.4mL)來(lái)恒定保持反應(yīng)混合物于pH 3。在加入結(jié)束時(shí)，將反應(yīng)物攪拌1小時(shí)，然后用正己烷(4×100mL)和iPr2O(4×100mL)洗滌。通過(guò)加入10N NaOH(6.1mL)使水相為pH 13，并用CHCl3(4×100mL)萃取。用鹽水(100mL)洗滌有機(jī)相，干燥(Na2SO4)，過(guò)濾并蒸發(fā)。將油狀殘余物溶于丙酮(200mL)，并加入6N HCl(26mL)。將沉淀的固體過(guò)濾，用丙酮(2×50mL)洗滌，并真空干燥得到化合物B(23.6g；58mmol)，為一種白色結(jié)晶固體。產(chǎn)率83％。
B.4-(苯基甲氧基)羰基-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，7-二乙酸雙(1，1-二甲基乙基)酯D(圖10A)將在H2O(450mL)和1N NaOH(74mL；74mmol)中的B(14.4g；35.3mmol)的溶液攪拌20分鐘，然后用CHCl3(4×200mL)萃取。蒸發(fā)有機(jī)層得到一種油狀殘余物(12.3g)，將其溶于CH3CN(180mL)和N-乙基二異丙基胺(DIEA)(15mL；88.25mmol)。在2.5小時(shí)內(nèi)將在CH3CN(15mL)中的溴乙酸叔丁酯(16.8g；86.1mmol)的溶液滴加到前面的溶液。室溫下20小時(shí)后，蒸發(fā)溶劑，將油狀殘余物溶于CHCl3(150mL)，并用H2O(5×100mL)洗滌。將有機(jī)層干燥(Na2SO4)，過(guò)濾并蒸發(fā)至干得到C，為一種黃色油。將粗品C(22g)溶于EtOH(250mL)，加入NH2OH·HCl(2.93g；42.2mmol)，并將溶液加熱回流。48小時(shí)后蒸發(fā)溶液，并將殘余物溶于CH2Cl2(250mL)，用H2O(3×250mL)洗滌，然后用鹽水(3×250mL)洗滌。將有機(jī)層干燥(Na2SO4)，過(guò)濾并蒸發(fā)。用快速色譜法純化油狀殘余物(18.85g)。收集合產(chǎn)物的級(jí)分，并蒸發(fā)得到一種玻璃狀白色固體(17.62g)，將其溶于H2O(600mL)和1N NaOH(90mL；90mmol)，并用CHCl3(3×250ml)萃取。將有機(jī)層干燥(Na2SO4)，并蒸發(fā)至干得到D(16.6g；31mmol)，為一種油。產(chǎn)率88％。
C.4-(苯基甲氧基)羰基-10-[[雙(1，1-二甲基乙氧基)氧膦基]甲基]-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，7-二乙酸雙(1，1-二甲基乙基)酯，E(圖10A)將化合物D(13.87g；26mmol)、P(OtBu)3(7.6g；28.6mmol)(10)和低聚甲醛(0.9g；30mmol)的混合物在60℃下加熱。16小時(shí)后，再加入P(OtBu)3(1g；3.76mmol)和低聚甲醛(0.1g；3.33mmol)。將反應(yīng)物于60℃下再加熱20小時(shí)，然后在80℃和真空下加熱8小時(shí)以除去揮發(fā)性雜質(zhì)。用快速色譜法純化粗品得到E(9.33g；8mmol)，為一種油。產(chǎn)率31％。
D.7-[[雙(1，1-二甲基乙氧基)氧膦基]甲基]-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，10-三乙酸1-苯基甲基4，10-雙(1，1-二甲基乙基)酯，G(圖10A)往在CH3OH(160mL)中的E(6.5g；5.53mmol)的溶液加入5％Pd/C(1g；0.52mmol)，并將該混合物在氫氣氛和室溫下攪拌。4小時(shí)后(消耗H2165mL；6.7mmol)用Millipore濾器(FT 0.45μm)過(guò)濾混合物，并減壓蒸發(fā)溶液。用快速色譜法純化粗品(5.9g)得到F(4.2g)，為一種油。在1小時(shí)內(nèi)將溶于CH3CN(8mL)的溴乙酸芐酯(1.9g；8.3mmol)滴加到在CH3CN(40mL)和DIEA(1.5mL；8.72mmol)中的F(4.2g)的溶液。室溫下36小時(shí)后，蒸發(fā)溶劑，并將殘余物(5.76g)溶于CHCl3(100mL)，用H2O(2×100mL)洗滌，然后用鹽水(2×70mL)洗滌。干燥有機(jī)層(Na2SO4)，過(guò)濾并蒸發(fā)。用快速色譜法純化粗品(5.5g)兩次，收集級(jí)分并蒸發(fā)至干得到G(1.12g；1.48mmol)，為一種油。產(chǎn)率27％。
E.7-[[雙(1，1-二甲基乙氧基)氧膦基]甲基]-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，10-三乙酸4，10-雙(1，1-二甲基乙基)酯，H(圖10A)將5％Pd/C(0.2g；0.087mmol)加到在CH3OH(27mL)中的G(1.12g；1.48mmol)的溶液，并將混合物于氫氣氛和室溫下攪拌。2小時(shí)后(消耗H235mL；1.43mmol)，用Millipore濾器(FT 0.45μm)過(guò)濾混合物，并將溶液蒸發(fā)至干，得到H(0.94g；1.41mmol)，為一種灰黃色油。產(chǎn)率97％。
F.N-[4-[[[[[4，10-雙(羧甲基)-7-(二羥基氧膦基)甲基-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙?；鵠氨基]苯甲?；鵠-L-谷氨酰胺酰基-L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺，L237(圖10B)將樹(shù)脂A(330mg；0.20mmol)(17)在固相肽合成容器中與在DMA(5mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，并加入新鮮的在DMA(5mL)中的50％嗎啉。將懸浮液再攪拌20分鐘，然后倒空溶液，并用DMA(5×5mL)洗滌樹(shù)脂。將Fmoc-4-氨基苯甲酸(290mg，0.80mmol)、HOBT(120mg；0.80mmol)、DIC(130μL；0.80mmol)和DMA(5mL)加到樹(shù)脂，將混合物在室溫下振蕩3小時(shí)，倒空，并用DMA(5×5mL)洗滌樹(shù)脂。將樹(shù)脂與在DMA(5mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(5mL)中的50％嗎啉，并將混合物再振蕩20分鐘。倒空溶液，并用DMA(5×5mL)洗滌樹(shù)脂。將Fmoc-甘氨酸(240mg；0.8mmol)、HATU(310mg；0.8mmol)和DIEA(260μL；1.6mmol)在DMA(5mL)中攪拌15分鐘，然后將溶液加到樹(shù)脂，將混合物于室溫下振蕩2小時(shí)，倒空，并用DMA(5×5mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(5mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(5mL)中的50％嗎啉，并將混合物再振蕩20分鐘。倒空溶液，并用DMA(5×5mL)洗滌樹(shù)脂。將H(532mg；0.80mmol)、HOBT(120mg；0.80mmol)、DIC(130μL；0.80mmol)和DIEA(260μL；1.6mmol)和DMA(5mL)加到樹(shù)脂。將混合物在燒瓶中于室溫下振蕩40小時(shí)，倒空，用DMA(5×5mL)、CH2Cl2(5×5mL)洗滌樹(shù)脂，并真空干燥。將樹(shù)脂在燒瓶中與試劑B(25mL)一起振蕩4小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾，并在減壓下蒸發(fā)溶液得到一種油狀粗品，用Et2O(20mL)對(duì)其處理后得到一種沉淀。離心收集沉淀，并用Et2O(3×20mL)洗滌得到一種固體(90mg)，用HPLC對(duì)其進(jìn)行分析。用制備HPLC純化一定量的粗品(50mg)。將包含產(chǎn)物的級(jí)分凍干得到L237(6mg；3.9×10-3mmol)，為一種白色固體。產(chǎn)率3.5％。
實(shí)施例XI-圖11A-B合成L238和L239概述從擔(dān)載在Rink酰胺樹(shù)脂上的八肽Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2(BBN[7-14])(A)開(kāi)始分幾步獲得產(chǎn)物。在用試劑B裂解和脫保護(hù)之后，用制備HPLC純化粗品得到L238和L239?？偖a(chǎn)率分別為14和9％。
A.N，N-二甲基甘氨?；?L-絲氨酰基-[S-[(乙?；被?甲基]]-L-半胱氨?；?甘氨酰基-4-氨基苯甲?；?L-谷氨酰胺酰基-L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺，L238(圖11A)
將樹(shù)脂A(0.5g；0.3mmol)在固相肽合成容器中與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液并加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。將懸浮液再攪拌20分鐘，然后倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將Fmoc-4-氨基苯甲酸(0.43g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物在室溫下振蕩3小時(shí)，倒空，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉和將混合物再振蕩20分鐘。倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將Fmoc-甘氨酸(0.36g；1.2mmol)、HATU(0.46g；1.2mmol)和N-乙基二異丙基胺(0.40mL；2.4mmol)在DMA(7mL)中攪拌15分鐘，然后將溶液加到樹(shù)脂，將混合物于室溫下振蕩2小時(shí)，然后將溶液加到樹(shù)脂，將混合物于室溫下振蕩2小時(shí)，倒空，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉和將混合物再振蕩20分鐘。倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將N-α-Fmoc-S-乙酰氨基甲基-L-半胱氨酸(0.50g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物在室溫下振蕩3小時(shí)，倒空并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉和將混合物再振蕩20分鐘。倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將N-α-Fmoc-O-叔丁基-L-絲氨酸(0.46g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物于室溫下振蕩3小時(shí)，倒空和用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉，并將混合物再振蕩20分鐘。
倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將N，N-二甲基甘氨酸(0.12g；1.2mmol)、HATU(0.46g；1.2mmol)和N-乙基二異丙基胺(0.40mL；2.4mmol)在DMA(7mL)中攪拌15分鐘，然后將溶液加到樹(shù)脂。將混合物于室溫下振蕩2小時(shí)，倒空，用DMA(5×7mL)、CH2Cl2(5×7mL)洗滌樹(shù)脂，并真空干燥。將樹(shù)脂在燒瓶中與試劑B(25mL)一起振蕩4.5小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾，并在減壓下蒸發(fā)溶液得到一種油狀粗品，用Et2O(20mL)處理之后得到一種沉淀。離心收集沉淀，并用Et2O(3×20mL)洗滌得到一種固體(169mg)，用HPLC對(duì)其進(jìn)行分析。用制備HPLC純化一定量的粗品(60mg)。將包含產(chǎn)物的級(jí)分凍干得到L238(22.0mg；0.015mmol)，為一種白色固體。產(chǎn)率14％。
B.N，N-二甲基甘氨酰基-L-絲氨?；?[S-[(乙酰基氨基)甲基]]-L-半胱氨?；?甘氨?；?(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基-24-氧代膽烷-24-基-L-谷氨酰胺酰基-L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨酰基-甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺，L239(圖11B)將樹(shù)脂A(0.5g；0.3mmol)在固相肽合成容器中與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液并加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。將懸浮液再攪拌20分鐘，然后倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將(3β，5β，7α，12α)-3-[[(9H-芴-9-基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸B(0.82g；1.2mmol)(7)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物于室溫下振蕩24小時(shí)，倒空，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉和將混合物再振蕩20分鐘。倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將N-α-Fmoc-S-乙酰氨基甲基-L-半胱氨酸(0.50g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物于室溫下振蕩3小時(shí)，倒空，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉，并將混合物再振蕩20分鐘。倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將N-α-Fmoc-O-叔丁基-L-絲氨酸(0.46g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物于室溫下振蕩3小時(shí)，倒空并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉，并將混合物再振蕩20分鐘。倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將N，N-二甲基甘氨酸(0.12g；1.2mmol)、HATU(0.46g；1.2mmol)和N-乙基二異丙基胺(0.40mL；2.4mmol)在DMA(7mL)中攪拌15分鐘，然后將溶液加到樹(shù)脂。
將樹(shù)脂A(0.5g；0.3mmol)在固相肽合成容器中與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，并加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。將懸浮液再攪拌20分鐘，然后倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將(3β，5β，7α，12α)-3-[[(9H-芴-9-基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸B(0.82g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物于室溫下振蕩24小時(shí)，倒空，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉，并將混合物再振蕩20分鐘。倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將N-a-Fmoc-S-乙酰氨基甲基-L-半胱氨酸(0.50g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物于室溫下振蕩3小時(shí)，倒空并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉和將混合物再振蕩20分鐘。倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將N-α-Fmoc-O-叔丁基-L-絲氨酸(0.46g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物于室溫下振蕩3小時(shí)，倒空并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉和將混合物再振蕩20分鐘。倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將N，N-二甲基甘氨酸(0.12g；1.2mmol)、HATU(0.46g；1.2mmol)和N-乙基二異丙基胺(0.40mL；2.4mmol)在DMA(7mL)中攪拌15分鐘，然后將溶液加到樹(shù)脂。
實(shí)施例XII-圖12A-F合成L240、L241、L242概述從擔(dān)載在Rink酰胺樹(shù)脂上的八肽Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2(BBN[7-14])(A)開(kāi)始分幾步獲得產(chǎn)物。在用試劑B裂解并脫保護(hù)之后，用制備HPLC純化粗品得到L240、L241和L242?？偖a(chǎn)率分別為7.4、3.2、1.3％。
A.4-[[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]乙?；鵠氨基-3-甲氧基苯甲酸A(圖12A)將在THF(20mL)中的4-氨基-3-甲氧基苯甲酸(1.0g；5.9mmol)和N-乙基二異丙基胺(1.02mL 5.9mmol)的溶液滴加到在CH2Cl2/THF1∶1(20mL)中的Fmoc-甘氨酰氯(1.88g；5.9mmol)的溶液，并在室溫和N2下攪拌。3小時(shí)后，真空蒸發(fā)溶劑。用0.5N HCl(50mL)吸收殘余物，在0℃下攪拌1小時(shí)，然后過(guò)濾并干燥。將白色固體懸浮在MeOH(30mL)中，并攪拌1小時(shí)，然后過(guò)濾，并懸浮在CHCl3/己烷1∶4(75mL)的溶液中。將懸浮液過(guò)濾得到化合物A，為一種白色固體(1.02g；2.28mmol)。產(chǎn)率39％。
B.N-[4-[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠甘氨?；鵠氨基]-3-甲氧基苯甲?；鵠-L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨酰基-甘氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺L240將樹(shù)脂A(0.5g；0.3mmol)在固相肽合成容器中與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液并加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。將懸浮液再攪拌20分鐘，然后倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將4-[[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]乙?；鵠氨基-3-甲氧基苯甲酸A(0.50g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物于室溫下振蕩5小時(shí)，倒空，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉和將混合物再振蕩20分鐘。倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸三(1，1-二甲基乙基)酯與NaCl的加合物(0.79g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL1.2mmol)，N-乙基二異丙基胺(0.40mL；2.4mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂。將混合物在室溫下振蕩24小時(shí)，倒空，用DMA(5×7mL)、CH2Cl2(5×7mL)洗滌樹(shù)脂，并真空干燥。將樹(shù)脂在燒瓶中與試劑B(25mL)一起振蕩4.5小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾，并在減壓下蒸發(fā)溶液得到油殘余物，用Et2O(20mL)對(duì)其進(jìn)行處理之后得到一種沉淀。離心收集沉淀，并用Et2O(5×20mL)洗滌得到一種固體(152mg)，用HPLC對(duì)其進(jìn)行分析。用制備HPLC純化一定量的粗品(52mg)。將包含產(chǎn)物的級(jí)分凍干得到L240(12.0mg；7.8×10-3mmol)，為一種白色固體。產(chǎn)率7.4％。
C.4-氨基-3-氯苯甲酸C(圖12B)45℃下將1N NaOH(11mL；11mmol)加到在MeOH(20mL)中的4-氨基-3-氯苯甲酸甲酯(2g；10.8mmol)的溶液。將反應(yīng)混合物于45℃下攪拌5小時(shí)，并在室溫下攪拌過(guò)夜。再次加入1N NaOH(5mL；5mmol)，并將反應(yīng)物于45℃下攪拌2小時(shí)。濃縮溶劑后加入1NHCl(10mL)。過(guò)濾固體沉淀，并干燥得到4-氨基-3-氯苯甲酸，C，為一種白色固體(1,75g；10.2mmol)。產(chǎn)率94.6％。
D.4-[[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]乙?；鵠氨基-3-氯苯甲酸，D(圖12B)將在THF(50mL)中的4-氨基-3-氯苯甲酸(1.5g；8.75mmol)和N-乙基二異丙基胺(1.46mL 8.75mmol)的溶液滴加到在CH2Cl2/THF 1∶1(30mL)中的Fmoc-甘氨酰氯(2.76g；8.75mmol)的溶液，并在室溫和N2氣氛下攪拌。3小時(shí)后，真空蒸發(fā)溶劑。用0.5N HCl(50mL)吸收殘余物，過(guò)濾并干燥。將白色固體懸浮在MeOH(30mL)中，并攪拌1小時(shí)，然后過(guò)濾，并干燥得到4-[[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]乙?；鵠氨基-3-氯苯甲酸(2.95g；6.5mmol)。產(chǎn)率75％。
E.N-[4-[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]甘氨?；鵠氨基]3-氯苯甲?；鵠L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺L241(圖12E)將樹(shù)脂A(0.5g；0.3mmol)在固相肽合成容器中與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液并加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。將懸浮液再攪拌20分鐘，然后倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將4-[[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]乙?；鵠氨基-3-氯苯甲酸，D(0.54g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物于室溫下振蕩5小時(shí)，倒空，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。
然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉和將混合物再振蕩20分鐘。倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸三(1，1-二甲基乙基)酯與NaCl的加合物(0.79g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL.1.2mmol)，N-乙基二異丙基胺(0.40mL；2.4mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂。將混合物于室溫下振蕩40小時(shí)，倒空，用DMA(5×7mL)、CH2Cl2(5×7mL)洗滌樹(shù)脂，并真空干燥。將樹(shù)脂在燒瓶中與試劑B(25mL)一起振蕩4.5小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾，并在減壓下蒸發(fā)溶液得到一種油粗品，在用Et2O(20mL)處理后得到一種沉淀。離心收集沉淀，并用Et2O(5×20mL)洗滌得到一種固體(151mg)，用HPLC對(duì)其進(jìn)行分析。用制備HPLC純化一定量的粗品(56mg)。將包含產(chǎn)物的級(jí)分凍干得到L241(5.6mg；3.6×10-3mmol)，為一種白色固體。產(chǎn)率3.2％。
F.4-[[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]乙?；鵠氨基-3-甲基苯甲酸，E(圖12C)將在THF(30mL)中的4-氨基-3-甲基苯甲酸(0.81g；5.35mmol)和N-乙基二異丙基胺(0.9mL 5.35mmol)的溶液滴加到在CH2Cl2/THF 1∶1(20mL)中的Fmoc-甘氨酰氯(1.69g；5.35mmol)的溶液，并在室溫和N2氣氛下攪拌。3小時(shí)后在真空下蒸發(fā)溶劑。用HCl 0.5N(50mL)吸收殘余物，并在0℃下攪拌3小時(shí)。然后過(guò)濾并干燥。將白色固體懸浮在MeOH(50mL)中，并攪拌1小時(shí)，然后過(guò)濾并干燥得到化合物E(1.69g；3.9mmol)。產(chǎn)率73％。
G.N-[4-[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠甘氨?；鵠氨基]3-甲基苯甲?；鵠L-谷氨酰胺酰基-L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨酰基-甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺L242(圖12F)將樹(shù)脂A(0.5g；0.3mmol)在固相肽合成容器中與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液并加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。將懸浮液再攪拌20分鐘，然后倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將4-[[(9H-芴-9-基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基-3-甲基苯甲酸E(0.52g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物于室溫下振蕩5小時(shí)，倒空，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉和將混合物再振蕩20分鐘。倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸三(1，1-二甲基乙基)酯與NaCl的加合物(0.76g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)、N-乙基二異丙基胺(0.40mL；2.4mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂。
將混合物于室溫下振蕩40小時(shí)，倒空，用DMA(5×7mL)、CH2Cl2(5×7mL)洗滌樹(shù)脂，并真空干燥。將樹(shù)脂在燒瓶中與試劑B(25mL)一起振蕩4.5小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾，并在減壓下蒸發(fā)溶液得到一種油粗品，用Et2O(20mL)對(duì)其進(jìn)行處理之后得到一種沉淀。離心收集沉淀，并用Et2O(5×20mL)洗滌得到一種固體(134mg)，用HPLC對(duì)其進(jìn)行分析。用制備HPLC純化一定量的粗品(103mg)。將包含產(chǎn)物的級(jí)分凍干得到L242(4.5mg；2.9×10-3mmol)，為一種白色固體。產(chǎn)率1.3％。
實(shí)施例XIII-圖13A-C合成L244概述從擔(dān)載在Rink酰胺樹(shù)脂上的八肽Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2(BBN[7-14])(A)開(kāi)始分幾步得到產(chǎn)物。在對(duì)連接基-蛙皮素[7-14]用試劑B裂解和脫保護(hù)之后在液相完成與DOTA三叔丁酯的最后偶聯(lián)步驟。用制備HPLC純化粗品得到L244?？偖a(chǎn)率0.4％。
A.N，N′-(亞氨基二-2，1-乙烷二基)雙[2，2，2-三氟乙酰胺]，A(圖13A)0℃下在1小時(shí)內(nèi)將三氟乙酸乙基酯(50g；0.35mol)滴入在THF(180mL)中的二亞乙基三胺(18g；0.175mol)的溶液。室溫下20小時(shí)后，將混合物蒸發(fā)至一種油狀殘余物(54g)。用Et2O(50mL)結(jié)晶該油，過(guò)濾，用冷Et2O(2×30mL)洗滌，并干燥得到A，為一種白色固體(46g；0.156mol)。產(chǎn)率89％。
B.4-[N，N′-雙[2-(三氟乙?；?氨基乙基]氨基]-4-氧代丁酸，B(圖13A)室溫下將琥珀酸酐(0.34g；3.4mmol)加入在THF(5mL)中的A(1g；3.4mmol)的溶液。28小時(shí)后將粗品濃縮得到殘余物(1.59g)，用EtOAc(2×10mL)和1N HCl(2×15mL)洗滌。用Na2SO4干燥有機(jī)層，過(guò)濾并蒸發(fā)得到一種油狀殘余物(1.3g)，用快速色譜法(5)將其純化得到B，為一種油(0.85g；2.15mmol)。產(chǎn)率63％。
C.4-[N，N′-雙[2-[(9-H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基乙基]氨基]-4-氧代丁酸，D(圖13A)室溫下將琥珀酸酐(2g；20mmol)加入在THF(25mL)中的A(5g；16.94mmol)的溶液。28小時(shí)后將粗品濃縮至殘余物(7g)，在乙酸乙酯(100mL)和1N HCl(2×50mL)中洗滌。用Na2SO4干燥有機(jī)層，過(guò)濾并蒸發(fā)得到粗品B，為一種油狀殘余物(6.53g)。將2N NaOH(25mL)加到在EtOH(35mL)中的粗品B(5g)的懸浮液，并在室溫下1小時(shí)后得到一種完全溶液。20小時(shí)后將溶劑蒸發(fā)得到C，為一種油(8.48g)。0℃下1小時(shí)內(nèi)將在1，4-二烷(30mL)中的9-芴基甲基氯甲酸酯(6.54g，25.3mmol)的溶液滴入在10％Na2CO3水溶液(30mL)中的C的溶液。室溫下20小時(shí)后得到一種膠狀懸浮液，過(guò)濾得到一種白色固體(3.5g)和一種黃色溶液。蒸發(fā)溶液，用H2O(150mL)稀釋剩余的水溶液，并用EtOAc(70mL)萃取。將新鮮的EtOAc(200mL)加到水相，得到一種懸浮液，將其冷卻至0℃，并用濃HCl酸化至pH 2。用H2O(5×200mL)洗滌有機(jī)層至中性pH，然后干燥得到一種玻璃狀固體(6.16g)。將該化合物懸浮在沸騰的正己烷(60mL)中持續(xù)1小時(shí)，過(guò)濾得到D，為一種白色固體(5.53g，8.54mmol)?？偖a(chǎn)率50％。
D.N-[4-[[4-[雙[2-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙基]氨基-1，4-二氧代丁基]氨基]苯甲?；鵠-L-谷氨酰胺酰基-L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺，L244(圖13B)將樹(shù)脂A(0.5g；0.3mmol)在固相肽合成容器中與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液并加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。將懸浮液再攪拌20分鐘，然后倒空溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將4-[N，N′-雙[2-[(9-H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基乙基]氨基]-4-氧代丁酸(777.3mg；1.2mmol)、HOBT(184mg；1.2mmol)、DIC(187μL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物于室溫下振蕩40小時(shí)，倒空和用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉，并將混合物振蕩20分鐘。倒空溶液，用DMA(2×7mL)洗滌樹(shù)脂，并用CH2Cl2(5×7mL)洗滌樹(shù)脂，然后將其在燒瓶中與試劑B(25mL)一起振蕩4.5小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾，并在減壓下蒸發(fā)溶液得到一種油狀粗品，用Et2O(20mL)對(duì)其進(jìn)行處理后得到一種沉淀。離心收集沉淀，并用Et2O(5×20mL)洗滌，得到F，為一種白色固體(140mg)。將DOTA三叔丁酯(112mg；0.178mmol)、HATU(70mg；0.178mmol)和DIEA(60μL；0.356mmol)加到在DMA(3mL)和CH2Cl2(2mL)中的F(50mg；0.0445mmol)的溶液，并在室溫下攪拌24小時(shí)。將粗品蒸發(fā)至減小的體積(1mL)，并與試劑B(25mL)一起振蕩4.5小時(shí)。蒸發(fā)溶劑后，用Et2O(20mL)處理殘余物得到一種沉淀。離心收集沉淀，并用Et2O(5×20mL)洗滌得到一種淡棕色固體(132mg)，用HPLC對(duì)其進(jìn)行分析。用制備HPLC純化一定量的粗品(100mg)。將包含產(chǎn)物的級(jí)分凍干得到L244(圖13C)(3.5mg；1.84×10-3mmol)，為一種白色固體。產(chǎn)率0.8％。
實(shí)施例XIV-實(shí)施例XLII的總體實(shí)驗(yàn)L201-L228A.人工偶聯(lián)用各6.0當(dāng)量的HOBT和DIC處理6.0當(dāng)量的適宜保護(hù)的氨基酸，并在反應(yīng)容器之外活化。然后將在NMP中的活化的羧酸轉(zhuǎn)移至含胺的樹(shù)脂，使反應(yīng)進(jìn)行4-6小時(shí)，然后排干樹(shù)脂并洗滌。
B.Fmoc-Gly-OH與4-氨基苯甲酸和氨基聯(lián)苯羧酸酰胺的特殊偶聯(lián)用在NMP(10mL NMP用于1克氨基酸，按重量計(jì))中的HATU(10.0當(dāng)量)和DIEA(20.0當(dāng)量)處理Fmoc-Gly-OH(10.0當(dāng)量)，并將溶液于RT下攪拌10-15分鐘，然后轉(zhuǎn)移至含有載胺樹(shù)脂的容器。使對(duì)于每克樹(shù)脂的溶液體積為15.0ml。在RT下繼續(xù)偶聯(lián)20小時(shí)，并從樹(shù)脂上排出所有的反應(yīng)物。再重復(fù)此過(guò)程一次，然后用NMP洗滌，隨后繼續(xù)下一步驟。
C.制備DO3A一酰胺將8.0當(dāng)量DOTA一酸溶于NMP，并用8.0當(dāng)量的HBTU和16.0當(dāng)量的DIEA處理。將此溶液于RT下攪拌15分鐘，然后轉(zhuǎn)至擔(dān)載在樹(shù)脂上的胺，并在RT下繼續(xù)偶聯(lián)24小時(shí)。然后排干樹(shù)脂，洗滌，隨后將肽裂解并純化。
D.從樹(shù)脂上裂解粗肽并純化將樹(shù)脂懸浮在試劑B(15.0ml/g)中并在RT下振蕩4小時(shí)。然后排干樹(shù)脂，再次用2×5mL試劑B洗滌，并與前面的濾液合并。然后在RT下將濾液減壓濃縮成糊/液體，并與25.0mL無(wú)水乙醚一起研磨(對(duì)于每克所用的樹(shù)脂)。然后將懸浮液離心，并傾析醚層。再重復(fù)此過(guò)程兩次，用制備HPLC純化乙醚洗滌后的無(wú)色沉淀。
實(shí)施例XIV-圖21合成L201使用0.5g Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-M-樹(shù)脂(0.4mmol/g，0.5g，0.2mmol)(樹(shù)脂A)。如在一般方法所述加入其余的氨基酸單元以制備(1R)-1-(雙{2-[雙(羧甲基)氨基]乙基}氨基)丙烷-3-甲酸-1-羧基-甘氨?；?4-氨基苯甲?；?L-谷氨酰胺酰基-L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨酰基-甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺(L201)，產(chǎn)率17.0mg(5.4％)。
實(shí)施例XV-圖22A和22B合成L202A.4-Fmoc-肼基苯甲酸(圖22A)用碳酸銫(21.5g，66.0mmol)處理在水(100ml)中的4-肼基苯甲酸(5.0g，32.9mmol)的懸浮液。在1小時(shí)內(nèi)將在THF(25mL)中的Fmoc-Cl(9.1g，35.0mmol)滴加到以上溶液，同時(shí)攪拌。加入后將溶液再攪拌4小時(shí)，將反應(yīng)混合物濃縮至大約75mL，并用乙醚(2×100mL)萃取。棄去醚層，并用2N HCl酸化水層。將分離的固體過(guò)濾，用水(5×100mL)洗滌，然后用乙腈重結(jié)晶得到產(chǎn)物(化合物B)，為一種無(wú)色固體。產(chǎn)率11.0g(89％)。1H NMR(DMSO-d6)d 4.5(m，1H，Ar-CH2-CH)，4.45(m，2H，Ar-CH2)6.6(bs，1H，Ar-H)，7.4-7.9(m，9，Ar-H和Ar-CH2)，8.3(s，2H，Ar-H)，9.6(s，2H，Ar-H).M.S.-m/z373.2[M-H]使用0.5g Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-M-樹(shù)脂(0.4mmol/g，0.5g，0.2mmol)(樹(shù)脂A)。如一般方法所述加入氨基酸單元，包括化合物B，以制備N(xiāo)-[(3β，5β，12α)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙?；鵠氨基]-4-肼基苯甲酰基-L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺(L202)(圖22B)，產(chǎn)率25.0mg(8.3％)實(shí)施例XVI-圖23A和圖23B合成L203A.制備4-Boc-氨基芐基苯甲酸酯化合物B(圖23A)用粉末碳酸銫(1.3g，4.0mmol)處理在無(wú)水乙腈(10.0mL)中的4-boc-氨基苯甲酸(0.95g，4.0mmol)的懸浮液，并在氮?dú)夥障聞×覕嚢?。加入芐基溴(0.75g，4.4mmol)，并在氮?dú)夥障聦⒎磻?yīng)混合物回流20小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物傾入冰冷的水(200mL)，過(guò)濾分離的固體，并用水(5×50mL)洗滌。然后用甲醇水溶液重結(jié)晶粗物質(zhì)以得到產(chǎn)物，為一種無(wú)色固體(化合物B)。產(chǎn)率0.8g(61％).1HNMR(CDCl3)d 1.5(s，9H，叔甲基)，5.4(s，2H，Ar-CH2)，7.4(m，7H，Ar-H)和8.0(m，2H，Ar-H).M.S.-m/z 326.1[M+H]。
B.4-氨基芐基苯甲酸酯化合物C(圖23A)將4-Boc-氨基芐基苯甲酸酯(0.8g，2.5mmol)溶于含TFA(25％體積)的DCM(20mL)，并在RT攪拌2小時(shí)。將反應(yīng)混合物傾入100.0g碎冰，并用飽和碳酸氫鈉溶液中和，直至pH到達(dá)大約8.5。分離有機(jī)層，用DCM(3×20mL)萃取水層，并合并所有的有機(jī)層。然后用1×50mL飽和碳酸氫鈉、水(2×50mL)洗滌DCM層，并干燥(硫酸鈉)。除去溶劑得到一種無(wú)色固體(化合物C)，將此固體用于下一步而不進(jìn)行進(jìn)一步純化。產(chǎn)率0.51g(91％)。1H NMR(CDCl3)d 5.3(s，2H，Ar-CH2)，6.6(d，2H，Ar-H，j＝1.0Hz)，7.4(m，5H，Ar-H，J＝1.0Hz)和7.9(d，2H，Ar-H，J＝1.0Hz)。
C.4-(2-氯乙?；?氨基芐基苯甲酸酯化合物D(圖23A)將胺(0.51g，2.2mmol)溶于無(wú)水二甲基乙酰胺(5.0mL)，并在冰中冷卻。通過(guò)注射器滴加氯乙酰氯(0.28g，2.5mmol)，使溶液變?yōu)镽T，并攪拌2小時(shí)。再加入2.5mmol氯乙酰氯，并再繼續(xù)攪拌2小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物傾入冰冷的水(100mL)。將沉淀的固體過(guò)濾，用水洗滌，然后用己烷/乙醚重結(jié)晶得到一種無(wú)色固體(化合物D)。產(chǎn)率0.38g(56％)。1H NMR(CDCl3)d 4.25(s，2H，CH2-Cl)，5.4(s，2H，Ar-H)，7.4(m，5H，Ar-H)，7.6(d，2H，Ar-H)，8.2(d，2H，Ar-H)和8.4(s，1H，-CONH)。
2-{1，4，7，10-四氮雜-7，10-雙{[(叔丁基)氧基羰基]甲基}-4-[(N-{4-[芐氧基羰基]苯基}氨基甲?；鵠環(huán)十二基}乙酸叔丁酯，化合物E圖23A將DO3A-三叔丁酯.HCl(5.24g，9.5mmol)懸浮在30.0mL無(wú)水乙腈，加入無(wú)水碳酸鉀(2.76g，20mmol)，并攪拌30分鐘。然后將在無(wú)水乙腈(20.0mL)中的氯乙酰胺D(2.8g，9.2mmol)滴加到以上混合物10分鐘。然后將反應(yīng)混合物攪拌過(guò)夜。將溶液過(guò)濾，然后減壓濃縮至糊。將該糊溶于大約200.0mL水，并用5×50mL乙酸乙酯萃取。用水(2×100mL)洗滌合并的有機(jī)層，并干燥(硫酸鈉)。將溶液過(guò)濾并減壓蒸發(fā)至糊，并用快速硅膠(600.0g)對(duì)糊進(jìn)行色譜處理。用在DCM中的5％甲醇洗脫產(chǎn)物。收集在TLC上均一的所有級(jí)分，并蒸發(fā)得到一種無(wú)色膠。用異丙醚和DCM重結(jié)晶該膠以制備化合物E。產(chǎn)率4.1g(55％)。1H NMR(CDCl3)d 1.5(s，27H，甲基)，2.0-3.75(m，24H，NCH2s)，5.25(d，2H，Ar-CH2)，7.3(m，5H，Ar-H)，7.8(d，2H，Ar-H)和7.95(d，2H，Ar-H).M.S.-m/z 804.3[M+H]。
D.還原以上的酸E以制備化合物F，(圖23A)將以上的芐基酯E(1.0g，1.24mmol)溶于甲醇-水混合物(10.0mL，95∶5)，并加入擔(dān)載在碳上的鈀(10％，0.2g)。然后用Parr儀器在50.0psi下將溶液氫化8小時(shí)。從溶液中濾出催化劑，然后減壓濃縮得到一種無(wú)色絨毛狀固體F。未對(duì)它進(jìn)行進(jìn)一步純化，而將其立即置于下一步驟。MSm/z 714.3[M+Na]。
E.制備L203(圖23B)使用上述的標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)方法使以上的酸F偶聯(lián)至樹(shù)脂[H-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-L-M-樹(shù)脂]上的胺，樹(shù)脂A和來(lái)自以上的F。0.5g(0.2mmol)樹(shù)脂產(chǎn)生31.5mg最終純化的肽(10.9％)N-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-4-氨基苯甲?；?L-谷氨酰胺酰基-L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺(L203)(圖23B)。
實(shí)施例XVII-圖24合成L204使用Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-L-M-樹(shù)脂(0.5g，0.2mmol)(樹(shù)脂A)。使用標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)條件，首先裝載Fmoc-Gly-OH，然后裝載來(lái)自以上方法(圖23A)的F。產(chǎn)率24.5mg(8.16％)的N-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]-4-氨基苯甲?；?甘氨?；?L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L204)(圖24)。
實(shí)施例XVIII-圖25合成L205如文獻(xiàn)所述制備Fmoc-6-氨基煙酸1(″Synthesis ofdiacylhydrazine compiounds for therapeutic use″.Hoelzemann，G.；Goodman，S.(Merck Patent G.m.b.H..，Germany).Ger.Offen.2000，16 pp.CODENGWXXBX DE 19831710 A1 20000120)，并與預(yù)裝載的Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-L-M-樹(shù)脂(0.5g，0.2mmol)樹(shù)脂A偶聯(lián)，然后與如上述的其它氨基偶聯(lián)以制備N(xiāo)-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-4-氨基苯甲?；?甘氨?；?L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L205)產(chǎn)率1.28mg(0.4％)。
實(shí)施例XIX-圖26A和26B合成L206A.4′-Fmoc-氨基-3′-甲基聯(lián)苯-4-甲酸B將氨基酸(0.41g，1.8mmol)溶于在10.0mL水中的碳酸銫(0.98g，3.0mmol)的溶液。參見(jiàn)″Rational Design of Diflunisal Analogueswith Reduced Affinity for Human Serum Albumin″Mao，H.等人，J.Am.Chem.Soc.，2001，123(43)，10429-10435。將此溶液在冰浴中冷卻，滴加在THF(10.0mL)中的Fmoc-Cl(0.52g，2.0mmol)的溶液，并劇烈攪拌。加入后，將反應(yīng)混合物于RT下攪拌20小時(shí)。然后用2NHCl酸化溶液。將沉淀的固體過(guò)濾，用水(3×20mL)洗滌并風(fēng)干。然后用乙腈重結(jié)晶粗固體以得到一種無(wú)色絨毛狀固體B圖26A。產(chǎn)率0.66g(75％).1H NMR(DMSO-d6)d 2.2(s，Ar-Me)，4.25(t，1H，Ar-CH，j＝5Hz)，4.5(d，2H，O-CH2，j＝5.0Hz)，7.1(bs，1H，CONH)，7.4-8.0(m，8H，Ar-H)和9.75(bs，1H，-COOH).M.S.m/z472.0[M-H]。
使用標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)條件將以上的酸B與Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-L-M-樹(shù)脂(0.2g，0.08mmol)樹(shù)脂A偶聯(lián)。如上述加入附加的基團(tuán)以制備N(xiāo)-[(3β，5β，12α)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙酰基]氨基]-[4′-氨基-2′-甲基聯(lián)苯-4-羧基]-L-谷氨酰胺基-L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺(L206)。產(chǎn)率30.5mg(24％)實(shí)施例XX-圖27A-B合成L207使用上述的方法由對(duì)應(yīng)的胺制備3′-Fmoc-氨基-聯(lián)苯-3-甲酸。參見(jiàn)″Synthesis of 3′-methyl-4-′nitrobiphenylcarboxylic acids bythe reaction of 3-methyl-4-nitrobenzenenediazonium acetatewith methyl benzoate″，Boyland，E.和Gorrod，J.，J.Chem.Soc.，Abstracts(1962)，2209-11。0.7G胺產(chǎn)生0.81g Fmoc-衍生物(58％)(化合物B，圖27A)。1H NMR(DMSO-d6)d 4.3(t，1H，Ar-CH)，4.5(d，2H，O-CH2)，7.25-8.25(m，16H，Ar-H)和9.9(s，1H，-COOH).M.S.-m/z434[M-H]將Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-L-M-樹(shù)脂(0.2g，0.08mmol)樹(shù)脂A與以上的酸B和上述其它基團(tuán)偶聯(lián)(圖27B)。制備29.0mgN-[(3β，5β，12α)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]乙?；鵠氨基]-[3′-氨基-聯(lián)苯-3-羧基1]-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨酰基-甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L207)(23％)。
實(shí)施例XXI-圖28合成L208
將Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-L-M-樹(shù)脂(0.2g，0.08mmol)A解封，并使用HATU作為偶聯(lián)劑與對(duì)苯二酸偶聯(lián)。用DIC和NHS活化所得的擔(dān)載在樹(shù)脂上的酸，然后與乙二胺偶聯(lián)。最后將DOTA-一酸與擔(dān)載在樹(shù)脂上的胺偶聯(lián)。制備N(xiāo)-[(3β，5β，12α)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙?；鵠氨基]-[1，2-二氨基乙基-對(duì)苯二?；鵠-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺(L208)，產(chǎn)率為17.5mg(14％)實(shí)施例XXII-圖29A-B合成L209A.Boc-Glu(G-OBn)-G-OBn將Boc-谷氨酸(5.0g，20.2mol)溶于THF(50.0mL)，并在冰浴中冷卻至0℃。加入HATU(15.61g，41.0mmol)，然后加入DIEA(6.5g，50.0mmol)。將反應(yīng)混合物于0℃下攪拌30分鐘。加入在THF(25.0mL)中的甘氨酸的芐基酯[8.45g，50mmol，通過(guò)用碳酸鈉中和芐基甘氨酸鹽酸鹽，用DCM萃取并除去溶劑來(lái)產(chǎn)生]。將反應(yīng)混合物變至RT，并在RT下攪拌20小時(shí)。在減壓下除去所有的揮發(fā)物。用飽和碳酸鈉溶液(100mL)處理殘余物，并用乙酸乙酯(3×100mL)萃取。合并有機(jī)層，用1N HCl(2×100mL)和水(2×100mL)洗滌，并干燥(硫酸鈉)。將溶液過(guò)濾，并在減壓下除去溶劑以得到一種糊，用快速硅膠(500.0g)對(duì)該糊進(jìn)行色譜處理。用在DCM中的2％甲醇洗脫得到產(chǎn)物，為一種無(wú)色的糊(化合物B，圖29A)。產(chǎn)率8.5g(74.5％).1H NMR(CDCl3)d1.4(s，9H，-CH3s)，2.0-2.5(m，4H，-CH-CH2和CO-CH)，4.2(m，5H，N-CH2-CO)，5.15(s，4H，Ar-CH2)，5.45(bs，1H，Boc-NH)，7.3(m，10H，Ar-H)和7.6(2bs，2H，CONH).M.S.-m/z 564.1[M+H]。分析HPLC保留時(shí)間-8.29分(＞97％純，20-65％B，經(jīng)過(guò)15分鐘)。
B.H-Glu(G-OBn)-G-OBn
將以上的完全受保護(hù)的谷氨酸衍生物(1.7g，3.2mmol)B溶于DCM/TFA(4∶1，20mL)，并攪拌直至在TLC上原料消失(2小時(shí))。將反應(yīng)混合物傾入冰冷的飽和碳酸氫鈉溶液(200mL)，分離有機(jī)層，用2×50mL DCM萃取水層，并與有機(jī)層合并。用飽和碳酸氫鈉(2×100mL)、水(2×100mL)洗滌DCM層，并干燥(硫酸鈉)。將溶液過(guò)濾，減壓蒸發(fā)，并在真空下干燥殘余物以得到一種玻璃(化合物C，圖29A)，將其帶入下一步驟而不進(jìn)行進(jìn)一步的純化。產(chǎn)率0.72g(95％)。M.S.-m/z442.2[M+H]。
C.(DOTA-三叔丁基)-Glu-(G-OBn)-G-OBn將在無(wú)水DCM(10.0mL)中的以上的胺C(1.33g，3mmol)加到活化的DOTA-三叔丁酯的溶液[2.27g，3.6mmol，用HBTU 1.36g，3.6mmol和DIEA 1.04g，8mmol處理，并在RT下在25mL無(wú)水DCM中攪拌30分鐘]并在RT下攪拌20小時(shí)]。用200mL DCM稀釋反應(yīng)混合物，用飽和碳酸鈉(2×150mL)洗滌，并干燥(硫酸鈉)。將溶液過(guò)濾，并在減壓下除去溶劑以得到一種褐色糊。用快速硅膠(500.0g)對(duì)粗產(chǎn)物作色譜處理。用在DCM中的2％甲醇洗脫得到產(chǎn)物，為一種無(wú)色膠(化合物D，圖29A)。產(chǎn)率1.7g(56.8％).1H NMR(CDCl3)d 1.3和1.4(2s，9H，三個(gè)甲基，各自來(lái)自游離堿和DOTA的鈉加合物)，2.0-3.5(m，20H，N-CH2s和-CH-CH2和CO-CH2)，3.75-4.5(m，13H，N-CH2-CO)，5.2(m，4H，Ar-CH2)和7.25(m，10H，Ar-H).M.S.m/z-1018.3[M+Na]和996.5[M+H]和546.3[M+Na+H]/2。HPLC-保留時(shí)間11.24分(＞90％，20-80％B，經(jīng)過(guò)30分鐘)。
D.(DOTA-三叔丁基)-Glu-(G-OH)-G-OH將以上的雙芐基酯(0.2g，0.2mmol)D溶于甲醇-水(20mL，9∶1)，并在50psi下在10％Pd/C催化劑(0.4g，50％wt.水)存在下氫化。在HPLC和TLC上原料消失后(4小時(shí))，濾出溶液中的催化劑，在減壓下除去溶劑，并在高度真空下干燥殘余物大約20小時(shí)(＜0.1mm)以得到產(chǎn)物，為一種無(wú)色泡沫(化合物E，圖29A)。產(chǎn)率0.12g(73.5％)。1HNMR(DMSO-d6)d 1.3和1.4(2s，9H，對(duì)應(yīng)于游離堿和DOTA的鈉加合物的甲基)，1.8-4.7(m，33H，NCH2s，COCH2和CH-CH2和NH-CH-CO)，8.1，8.2和8.4(3bs，NHCO).M.S.m/z-816.3[M+H]和838.3[M+Na].HPLC保留時(shí)間3.52分(20-80％B，經(jīng)過(guò)30分，＞95％純)。
E.H-8-氨基-3，6-二氧雜辛酰基-8-氨基-3，6-二氧雜辛?；?Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2將Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-L-M-樹(shù)脂(0.5g，0.2mmol)A解封，并依次與8-氨基-3，6-二氧雜辛酸偶聯(lián)兩次以在制備HPLC純化之后得到以上脫保護(hù)的肽(化合物F，圖29B)。產(chǎn)率91.0mg(37％)。
HPLC保留時(shí)間8.98分(＞95％純度，10-40％B，經(jīng)過(guò)10分鐘).M.S.m/z-1230.6[M+H]，615.9[M+2H]/2。
F.液相偶聯(lián)以上的雙酸E和胺F(圖29B)將雙酸(13.5mg，0.0166mmol)E溶于100μL無(wú)水乙腈，用NHS(4.0mg，0.035mmol)和DIC(5.05mg，0.04mmol)處理，并在RT下攪拌24小時(shí)。往以上活化的酸加入游離胺F(51.0mg，0.41mmol)[通過(guò)以下方法產(chǎn)生用飽和碳酸氫鈉處理TFA鹽并凍干溶液得到絨毛狀固體的胺]，然后加入100μL NMP，并在RT下繼續(xù)攪拌40小時(shí)。用無(wú)水乙醚(10mL)稀釋溶液，離心收集沉淀，并再次用2×10mL無(wú)水乙醚洗滌。然后用制備HPLC純化粗固體以得到產(chǎn)物，為一種無(wú)色絨毛狀固體L209，如在圖29B所示，產(chǎn)率為7.5mg(14.7％)。
實(shí)施例XXIII-圖30A-B合成L210A.H-8-氨基辛?；?8-氨基辛?；?Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2此化合物也完全以與化合物F(圖29B)的情況相同的方式制備，但使用1-氨基辛酸，并用制備HPLC純化胺(化合物B，圖30A)。產(chǎn)率95.0mg(38.9％)。HPLC保留時(shí)間7.49分(＞95％純度；10-40％B，經(jīng)過(guò)10.0分鐘).M.S.m/z-1222.7[M+H]，611.8[M+2H]/2。
如在L209的情況下那樣在100μL乙腈中將(DOTA-三叔丁基)-Glu-(G-OH)-G-OH(0.0163g，0.02mmol)轉(zhuǎn)化成它的雙NHS酯，用在100μL NMP中的游離堿-化合物B(60.0mg，0.05mmol)處理，并繼續(xù)反應(yīng)40小時(shí)，然后進(jìn)行處理，并如上述純化以制備L210(圖30B)，產(chǎn)率為11.0mg(18％)。
實(shí)施例XXIV-圖31合成L211使用標(biāo)準(zhǔn)方案由0.2g Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-L-M-樹(shù)脂(0.08mmol)制備。制備N(xiāo)-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-甘氨?；?甘氨?；?4-氨基苯甲?；?L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺L211，產(chǎn)率為4.7mg(3.7％)(圖31)。
實(shí)施例XXV-圖32合成L212使用標(biāo)準(zhǔn)方案由Rink酰胺Novagel樹(shù)脂(0.47mmol/g，0.2g，0.094mmol)通過(guò)在樹(shù)脂上構(gòu)建序列來(lái)制備。制備N(xiāo)-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-甘氨酰基-4-氨基苯甲?；?L-谷氨?；?L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺L212，產(chǎn)率為25.0mg(17.7％)(圖32)。
實(shí)施例XXVI-圖33合成L213由Fmoc-Met-2-氯三苯甲基氯化物樹(shù)脂(NovaBioChem，0.78mmol/g，0.26g，0.2mmol)制備，而序列的其余部分使用標(biāo)準(zhǔn)方法構(gòu)建。制備N(xiāo)-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]-甘氨?；?4-氨基苯甲?；?L-谷氨酰胺酰基-L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-甲硫氨酸L213，產(chǎn)率為49.05mg(16.4％)(圖33)。
實(shí)施例XXVII-圖34合成L214使用標(biāo)準(zhǔn)條件用Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-L-M-樹(shù)脂(0.2g，0.08mmol)A制備N(xiāo)-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]-甘氨?；?4-氨基苯甲酰基-D-苯丙氨?；?L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺L214。得到8.5mg產(chǎn)物(6.4％)(圖34)。
實(shí)施例XXVIII-圖35合成L215用Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-L-M-樹(shù)脂(0.2g，0.08mmol)A制備N(xiāo)-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-甘氨酰基-4-氨基苯甲?；?L-谷氨酰胺?；?L-精氨?；?L-亮氨?；?甘氨酰基-L-天冬酰胺?；?L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨酰基-甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺L215。得到9.2mg(5.5％)(圖35)。
實(shí)施例XXIX-圖36合成L216用Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-L-M-樹(shù)脂(0.2g，0.08mmol)A制備N(xiāo)[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-甘氨?；?4-氨基苯甲酰基-L-谷氨酰胺?；?精氨酰基-L-酪氨?；?甘氨?；?L-天冬酰胺酰基-L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨酰基-甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺L216。得到25.0mg(14.7％)(圖36)。
實(shí)施例XXX-圖37合成L217用Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-L-M-樹(shù)脂A(0.2g，0.08mmol)制備N(xiāo)-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]-甘氨?；?4-氨基苯甲酰基-L-谷氨酰胺?；?L-賴(lài)氨酰基-L-酪氨酰基-甘氨?；?L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺L217。得到58.0mg(34.7％)(圖37)。
實(shí)施例XXXI-圖38合成L218使用Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-L-M-樹(shù)脂A(0.2g，0.08mmol)。將Fmoc-Lys(ivDde)用于引入賴(lài)氨酸。在完成線(xiàn)性序列之后，用在DMF中的10％肼除去賴(lài)氨酸的保護(hù)基(2×10mL；每次10分鐘，然后洗滌)。然后用“總述”部分所述的方法引入其余的氨基酸以完成所需的肽序列。圖38中的L218獲得的產(chǎn)率為40.0mg(23.2％)。
實(shí)施例XXXII-圖39合成L219使用4-氨磺酰丁?；鵄M Novagel樹(shù)脂(1.1mmol/g；0.5g；0.55mmol)。-20℃下將第一氨基酸裝載到此樹(shù)脂上20小時(shí)。用普通偶聯(lián)方法完成其余的序列。洗滌后，用20.0當(dāng)量的碘乙腈和10.0當(dāng)量的DIEA將樹(shù)脂烷基化20小時(shí)。然后排干樹(shù)脂的液體，洗滌，隨后用2.0當(dāng)量的在5.0mL THF中的戊胺裂解20小時(shí)。隨后用2×5.0mL的THF洗滌樹(shù)脂，并合并所有的濾液。然后在減壓下蒸發(fā)THF，用10.0mL的試劑B 將殘余物解封，并如前述純化肽N-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-甘氨酰基-4-氨基苯甲?；?D-苯丙氨?；?L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?氨基戊基，L219。得到28.0mg(2.8％)(圖39)實(shí)施例XXXIII-圖40合成L220用NovaSyn TGR(0.25mmol/g；0.15g，0.05mmol)樹(shù)脂A制備N(xiāo)-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]-甘氨?；?4-氨基苯甲酰基-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?D-丙氨?；?L-組氨酰基-L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺，L220。得到31.5mg(41.4％)(圖40)。
實(shí)施例XXXIV-圖41合成L221用NovaSyn TGR(0.25mmol/g；0.15g，0.05mmol)樹(shù)脂A制備N(xiāo)-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-甘氨?；?4-氨基苯甲?；?D-苯丙氨酰基-L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?L-亮氨酸酰胺，L221。得到28.0mg(34.3％)(圖41)。
實(shí)施例XXXV-圖42合成L222用NovaSyn TGR(0.25mmol/g；0.15g，0.05mmol)樹(shù)脂A制備N(xiāo)-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]-甘氨?；?4-氨基苯甲酰基-D-酪氨?；?L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨?；?β丙氨酰基-L-組氨?；?L-苯丙氨?；?L-正亮氨酸酰胺，L222。得到34.0mg(40.0％)(圖42)。
實(shí)施例XXXVI-圖43合成L223用NovaSyn TGR(0.25mmol/g；0.15g，0.05mmol)樹(shù)脂A制備N(xiāo)-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-甘氨?；?4-氨基苯甲?；?L-苯丙氨酰基-L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨?；?β丙氨?；?L-組氨酰基-L-苯丙氨?；?L-正亮氨酸酰胺，L223。得到31.2mg(37.1％)(圖43)。
實(shí)施例XXXVII-圖44合成L224用NovaSyn TGR(0.25mmol/g；0.15g，0.05mmol)樹(shù)脂A制備N(xiāo)-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]-甘氨?；?4-氨基苯甲?；?L-谷氨酰胺?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-苯丙氨酰基-L-亮氨酸酰胺，L224。得到30.0mg(42.2％)(圖44)。
實(shí)施例XXXVIII-圖45合成L225用NovaSyn TGR(0.25mmol/g；0.15g，0.05mmol)樹(shù)脂A制備N(xiāo)-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-甘氨?；?4-氨基苯甲?；?L-亮氨?；?L-色氨酰基-L-丙氨?；?L-纈氨酰基-甘氨?；?L-絲氨?；?L-苯丙氨?；?L-蛋氨酸酰胺，L225。得到15.0mg(20.4％)(圖45)。
實(shí)施例XXXIX-圖46合成L226用NovaSyn TGR(0.25mmol/g；0.15g，0.05mmol)樹(shù)脂A制備N(xiāo)-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-甘氨?；?4-氨基苯甲酰基-L-組氨?；?L-色氨?；?L-丙氨?；?L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺，L226。得到40.0mg(52.9％)(圖46)。
實(shí)施例XL-圖47合成L227用NovaSyn TGR(0.25mmol/g；0.15g，0.05mmol)樹(shù)脂A制備N(xiāo)-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]-甘氨酰基-4-氨基苯甲?；?L-亮氨酰基-L-色氨?；?L-丙氨?；?L-蘇氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-苯丙氨酰基-L-蛋氨酸酰胺L227。得到28.0mg(36.7％)(圖47)。
實(shí)施例XLI-圖48合成L228用NovaSyn TGR(0.25mmol/g；0.15g，0.05mmol)樹(shù)脂A制備N(xiāo)-[(3β，5β，12α)-3-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]-甘氨?；?4-氨基苯甲酰基-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨酰基-L-組氨?；?L-苯丙氨?；?L-蛋氨酸酰胺，L228。得到26.0mg(33.8％)(圖48)。
實(shí)施例XLII-合成其它GRP化合物A.用于制備4，4′-氨基甲基聯(lián)苯羧酸(B2)和3，3′-氨基甲基聯(lián)苯羧酸(B3)的一般方法1.甲基-羥基甲基聯(lián)苯羧酸酯
將商購(gòu)得到的(Aldrich Chemical Co.)4-羥基甲基苯基硼酸或3-羥基甲基苯基硼酸(1.0g，6.58mmol)和異丙醇(10mL)及2M碳酸鈉(16mL)一起攪拌直至溶液變均一。通過(guò)使氮通過(guò)溶液而使溶液脫氣，然后用固體甲基-3-溴苯甲酸酯或甲基-4-溴苯甲酸酯(1.35g，6.3mmol)處理，隨后用Pd(O)催化劑{[(C6H5)3P]4Pd；0.023g，0.003mmol}處理。將反應(yīng)混合物在氮?dú)夥障卤３只亓鳎敝镣ㄟ^(guò)TLC分析確定原料溴苯甲酸酯用完(2-3小時(shí))。然后用250mL水稀釋反應(yīng)混合物，并用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。合并有機(jī)層，用飽和碳酸氫鈉溶液(2×50mL)洗滌，并干燥(Na2SO4)。在減壓下除去溶劑，并用快速硅膠(100g)色譜處理殘余物。用在己烷中的40％乙酸乙酯洗脫得到產(chǎn)物，為一種固體或油。
產(chǎn)率B2-0.45g(31％)；m.p.-170-171℃。
B3-0.69g(62％)；油。
1H NMR(CDCl3)d B2-3.94(s，3H，-COOCH3)，4.73(s，2H，-CH2-Ph)，7.475(d，2H，J＝5Hz)，7.6(d，2H，J＝10Hz)，7.65(d，2H，J＝5Hz)和8.09(d，2H，J＝10Hz)。
M.S.-m/e-243.0[M+H]B3-3.94(s，3H，-COOCH3)，4.76(s，2H，-CH2-Ph)，7.50(m，4H)，7.62(s，1H)，7.77(s，1H)，8.00(s，1H)和8.27(s，1H)。
M.S.-m/e-243.2[M+H]2.疊氮基甲基聯(lián)苯羧酸酯在冰中冷卻在無(wú)水二氯甲烷(10mL)中的以上聯(lián)苯醇(2.0mmol)，用二苯基磷酰基疊氮化物(2.2mol)和DBU(2.0mmol)處理，并在氮?dú)夥障聰嚢?4小時(shí)。用水稀釋反應(yīng)混合物，并用乙酸乙酯(2×25mL)萃取。合并有機(jī)層，相繼用0.5M檸檬酸溶液(2×25mL)、水(2×25mL)洗滌，并干燥(Na2SO4)。將溶液過(guò)濾，并在減壓下蒸發(fā)得到粗產(chǎn)物。用己烷/乙醚結(jié)晶4，4′-異構(gòu)體，并將3，3′-異構(gòu)體與異丙醚一起研磨以除去所有的雜質(zhì)；進(jìn)行TLC分析確定產(chǎn)物是均一的，不需要作進(jìn)一步純化。
產(chǎn)率甲基-4-疊氮基甲基-4-聯(lián)苯羧酸酯-0.245g(46％)；m.p.-106-108℃。
甲基-4-疊氮基甲基-4-聯(lián)苯羧酸酯-0.36g(59％，油)1H NMR(CDCl3)d-4，4′-異構(gòu)體-3.95(s，3H，-COOCH3)，4.41(s，2H，-CH2N3)，7.42(d，2H，J＝5Hz)，7.66(m，4H)和8.11(d，2H，J＝5Hz)3，3′-異構(gòu)體-3.94(s，3H，-COOCH3)，4.41(s，2H，-CH2N3)，7.26-7.6(m，5H)，7.76(d，1H，J＝10Hz)，8.02(d，1H，J＝5Hz)和8.27(s，1H)。
3.水解聯(lián)苯羧酸的甲酯用20mL 2M氫氧化鋰溶液處理大約4mmol甲酯，并攪拌至溶液均一(20-24小時(shí))。用2×50mL乙醚萃取水層，并棄去有機(jī)層。然后用0.5M檸檬酸酸化水層，將沉淀的固體過(guò)濾并干燥。不需要進(jìn)行其它純化，并將酸帶至下一步驟。
產(chǎn)率4，4′-異構(gòu)體-0.87甲酯產(chǎn)生0.754g酸(86.6％)；m.p.-205-210℃3，3′-異構(gòu)體-0.48g甲酯提供0.34g酸(63.6％)；m.p.-102-105℃。
1H NMR(DMSO-d6)d4，4′-異構(gòu)體-4.52(s，2H，-CH2N3)，7.50(d，2H，J＝5Hz)，7.9(m，4H)和8.03(d，2H，J＝10Hz)3，3′-異構(gòu)體-4.54(s，2H，-CH2N3)，7.4(d，1H，J＝10Hz)，7.5-7.7(m，4H)，7.92(ABq，2H)和8.19(s，1H)。
4.將疊氮化物還原成胺此還原在固相完成，并且不分離胺。用標(biāo)準(zhǔn)肽偶聯(lián)方案將疊氮基羧酸裝載在樹(shù)脂上。洗滌后，將含疊氮化物的樹(shù)脂與20當(dāng)量的三苯膦在THF/水(95∶5)中一起振蕩24小時(shí)。在氮正壓下排干溶液，然后用標(biāo)準(zhǔn)洗滌方法洗滌。將所得的胺用于下一步偶聯(lián)。
5.(3β，5β，7α，12α)-3-[{(9H-芴-9-基甲氧基)氨基]乙?；鶀氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸將三丁基胺(3.2mL；13.5mmol)滴加到在0℃下攪拌的在THF(80mL)中的Fmoc-甘氨酸(4.0g，13.5mmol)的溶液。然后加入氯甲酸異丁酯(1.7mL；13.5mmol)，并在10分鐘后在1小時(shí)內(nèi)將在DMF(80mL)中的三丁基胺(2.6mL；11.2mmol)和(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸(4.5g；11.2mmol)的懸浮液滴加到冷卻的溶液。使混合物升溫至室溫，并在6小時(shí)后將溶液濃縮至120mL，然后加入水(180mL)和1N HCl(30mL)(最終pH 1.5)。將沉淀的固體過(guò)濾，用水(2×100mL)洗滌，真空干燥，并用快速色譜法純化。用氯仿/甲醇(8∶2)洗脫得到產(chǎn)物，為一種無(wú)色固體。
產(chǎn)率1.9g(25％)。TLCRf0.30(CHCl3/MeOH/NH4OH-6∶3∶1)。
化合物的體外和體內(nèi)測(cè)試實(shí)施例XLIII在PC3細(xì)胞系中對(duì)GRP受體的體外結(jié)合試驗(yàn)圖14A-B為鑒定潛在的先導(dǎo)化合物，使用一種鑒定對(duì)GRP-R具有高親和力的化合物的體外試驗(yàn)。由于已知來(lái)自人前列腺癌的PC3細(xì)胞系表現(xiàn)出在細(xì)胞表面高表達(dá)GRP-R，因此開(kāi)發(fā)出96孔平板格式的放射配體結(jié)合試驗(yàn)，并使其有效用于測(cè)定125I-BBN與GRP-R陽(yáng)性PC3細(xì)胞的結(jié)合和本發(fā)明化合物抑制這種結(jié)合的能力。用此試驗(yàn)測(cè)定RP527配體、DO3A-一酰胺-Aoc-QWAVGHLM-NH2(對(duì)照)和抑制125I-BBN與GRP-R結(jié)合的本發(fā)明化合物的IC50。(RP527＝N，N-二甲基甘氨酸-Ser-Cys(Acm)-Gly-5-氨基戊酸-BBN(7-14)[SEQ.ID.NO1]，它具有MS＝1442.6和IC50-0.84)。Van de Wiele C，Dumont F等人，Technetium-99m RP527，a GRPanalogue for visualization of GRP receptor-expressingmalignanciesa feasibility study.Eur.J.Nucl.Med.，(2000)27；1694-1699；DO3A-一酰胺-Aoc-QWAVGHLM-NH2也稱(chēng)作DO3A-一酰胺-8-氨基-辛酸-BBN(7-14)[SEQ.ID.NO1]，它具有MS＝1467.0。DO3A一酰胺-氨基辛基-BBN[7-14]。
使放射配體結(jié)合平板試驗(yàn)有效用于BBN和BBN類(lèi)似物(包括可商購(gòu)得到的BBN和L1)，且還使用99mTc RP527作為放射配體。
A.材料和方法1.細(xì)胞培養(yǎng)從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)獲得PC3(人前列腺癌細(xì)胞系)，并在組織培養(yǎng)瓶(Corning)中在RPMI1640(ATCC)內(nèi)培養(yǎng)。此生長(zhǎng)培養(yǎng)基補(bǔ)充有10％熱滅活FBS(Hyclone，SH30070.03)、10mM HEPES(GibcoBRL，15630-080)和抗生素/抗真菌劑(GibcoBRL，15240-062)得到最終濃度的青霉素-鏈霉素(100單位/mL)和兩性霉素B(0.25μg/mL)。將所有的培養(yǎng)物保持在含5％CO2/95％空氣的增濕氣氛和37℃下，按指示用0.05％胰蛋白酶/EDTA(GibcoBRL25300-054)進(jìn)行常規(guī)傳代。在96孔白色/透明底微滴平板(FalconOptilux-1)或96孔黑色/透明膠原I cellware平板(BecktonDickinson Biocoat)中以2.0×104/孔的濃度接種培養(yǎng)用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞。在接種后第1或2天將平板用于結(jié)合研究。
2.結(jié)合緩沖液補(bǔ)充20mM HEPES、0.1％BSA(w/v)、0.5mM PMSF(AEBSF)、桿菌肽(50mg/500ml)，pH 7.4的RPMI 1640(ATCC)。從Perkin-Elmer獲得125I-BBN(不帶載體，2200Ci/mmole)。
B.與125I-BBN對(duì)PC3細(xì)胞中的GRP-R的競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)用96孔平板試驗(yàn)測(cè)定本發(fā)明各種化合物抑制125I-BBN與人GRP-R結(jié)合的IC50。采用以下的一般方法將所有受試化合物溶于結(jié)合緩沖液，并在結(jié)合緩沖液中完成適宜的稀釋。在96-孔白色/透明底微滴平板(Falcon Optilux-I)或96孔黑色/透明膠原I cellware平板(Beckton Dickinson Biocoat)中以2.0×104/孔的濃度接種用于試驗(yàn)的PC3細(xì)胞(人前列腺癌細(xì)胞系)。在接種后第1或2天將平板用于結(jié)合研究。在試驗(yàn)前檢查平板的匯合(＞90％匯合)。對(duì)于此試驗(yàn)，將濃度范圍為1.25×10-9M-5×10-9M的RP527或DO3A-一酰胺-Aoc-QWAVGHLM-NH2配體(對(duì)照)或本發(fā)明化合物與125I-BBN(25,000cpm/well)一起溫育。以75μL/孔的體積進(jìn)行這些研究。將一式三份的孔用于各數(shù)據(jù)點(diǎn)。在加入適宜的溶液之后，將平板在4℃下培養(yǎng)1小時(shí)以防止配體-受體復(fù)合物內(nèi)化。通過(guò)加入200μL冰冷的培養(yǎng)緩沖液來(lái)終止培養(yǎng)。將平板洗滌5次，并吸干。用LKBCompuGamma計(jì)數(shù)器或微板閃爍計(jì)數(shù)檢測(cè)放射性。
RP527(對(duì)照)和L70-本發(fā)明化合物的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合曲線(xiàn)可以見(jiàn)于圖14A-B。這些數(shù)據(jù)表明RP527對(duì)照的IC50為2.5nM，而L70-本發(fā)明的化合物的IC50為5nM。DO3A-一酰胺-Aoc-QWAVGHLM-NH2對(duì)照的IC50為5nM。受試的本發(fā)明化合物的IC50值可以見(jiàn)于以上表1-3，表明它們與對(duì)照的值相當(dāng)，從而可以預(yù)期其對(duì)受體具有充足的親和力，以允許在體內(nèi)被帶受體的細(xì)胞攝取。
C.內(nèi)化&流出試驗(yàn)在96孔平板上進(jìn)行這些試驗(yàn)。在洗滌除去血清蛋白之后，將PC3細(xì)胞與125I-BBN、177Lu-DO3A-一酰胺-Aoc-QWAVGHLM-NH2或放射性標(biāo)記的本發(fā)明的化合物一起在37℃下培養(yǎng)40分鐘。通過(guò)加入200μL冰冷的結(jié)合緩沖液來(lái)終止培養(yǎng)。用結(jié)合緩沖液將平板洗滌兩次。為除去表面結(jié)合的放射配體，將細(xì)胞與0.2M乙酸(在鹽水中)，pH 2.8一起培養(yǎng)2分鐘。將平板離心，并收集酸洗滌培養(yǎng)基以測(cè)定未被內(nèi)化的放射性的量。收集細(xì)胞以測(cè)定內(nèi)化的125I-BBN的數(shù)量，并在γ-計(jì)數(shù)器中分析所有的樣品。通過(guò)將不同時(shí)間點(diǎn)獲得的計(jì)數(shù)與在最后時(shí)間點(diǎn)(T40分鐘)獲得的計(jì)數(shù)進(jìn)行比較而將內(nèi)化試驗(yàn)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。
對(duì)于流出研究，在37℃下對(duì)PC3細(xì)胞負(fù)載125I-BBN或放射性標(biāo)記的本發(fā)明化合物40分鐘后，洗去未結(jié)合的物質(zhì)，并如上述測(cè)定內(nèi)化％。然后在37℃下將細(xì)胞重懸在結(jié)合緩沖液中達(dá)3小時(shí)。在0.5、1、2或3小時(shí)，如上所述測(cè)定相對(duì)于最初負(fù)荷水平保持內(nèi)化的量，并將其用于計(jì)算流出百分比，記錄于表5。
表5125I-BBN以及DO3A-一酰胺-Aoc-QWAVGHLM-NH2(對(duì)照)和本發(fā)明化合物的Lu-177絡(luò)合物的內(nèi)化和流出
這些數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的化合物被PC3細(xì)胞內(nèi)化和保留的程度與對(duì)照物類(lèi)似。
實(shí)施例XLIV-制備Tc-標(biāo)記的GRP化合物制備在0.1％TFA水溶液中濃度為1mg/mL的表6鑒定的本發(fā)明化合物的肽溶液。通過(guò)將SnCl2.2H2O(20mg/mL)溶于1N HCl而制備氯化亞錫溶液。通過(guò)將等分試樣的SnCl2溶液(10μL)加到葡萄糖酸鈉溶液來(lái)制備包含20μg SnCl2.2H2O/100μL的葡萄糖酸亞錫溶液，所述葡萄糖酸鈉溶液通過(guò)將13mg的葡萄糖酸鈉溶于水來(lái)制備。通過(guò)將50mg HP-γ-CD溶于1mL水來(lái)制備羥丙基γ-環(huán)糊精[HP-γ-CD]溶液。
通過(guò)混合20μl未標(biāo)記化合物(20μg)的溶液，50μL HP-γ-CD溶液，100μL Sn-葡萄糖酸鹽溶液和20-50μL99mTc高锝酸鹽(5-8mCi，Syncor)來(lái)制備以下鑒定的99mTc標(biāo)記的化合物。最終的體積大約為200μL，而最終pH為4.5-5。將反應(yīng)混合物在100℃下加熱15-20分鐘，然后通過(guò)反相HPLC分析以測(cè)定放射化學(xué)純度(RCP)。通過(guò)HPLC分離目標(biāo)產(chǎn)物峰，收集至含有5mg/mL抗壞血酸、16mg/mL HP-γ-CD和50mM磷酸鹽緩沖液，pH 4.5的穩(wěn)定緩沖液中，并用加速真空濃縮以除去乙腈。用于分析和純化的HPLC系統(tǒng)如下C18 Vydac柱，4.6×250mm，水相在水中的0.1％TFA，有機(jī)相在乙腈中的0.085％TFA。流速1mL/分。取決于各肽的性質(zhì)，使用20％-25％乙腈/0.085％TFA的恒溶劑洗脫。
標(biāo)記結(jié)果總結(jié)在表6中。
表6
n.d.＝未檢測(cè)1所有化合物與N，N′-二甲基甘氨酰-Ser-Cys-Gly金屬螯合劑綴合。使用Acm保護(hù)形式的配體。因此，用于制備L2的99mTc絡(luò)合物的配體為N，N′-二甲基甘氨酰-Ser-Cys(Acm)-Gly-RJQWAVGHLM-NH2。在與Tc螯合期間除去Acm基團(tuán)。
2在序列中，″J″指8-氨基-3，6-二氧雜辛酸，而″a ″指D-丙氨酸。
3加熱后和HPLC純化前即刻進(jìn)行最初RCP測(cè)定。
4在HPLC分離和通過(guò)加速真空除去乙腈之后測(cè)定RCP。
實(shí)施例XLV-制備用于細(xì)胞結(jié)合和生物分布研究的177Lu-L64
通過(guò)在90℃下將10μg L64配體(10μL 1mg/mL水溶液)、100μL乙酸銨緩沖液(0.2M，pH 5.2)和～1-2mCi在0.05N HCl中的177LuCl3(MURR)溫育15分鐘來(lái)合成此化合物。通過(guò)加入20μL1％Na2EDTA·2H2O(Aldrich)水溶液來(lái)清除游離177Lu。所得的放射化學(xué)純度(RCP)為～95％。通過(guò)HPLC，使用YMC Basic C8柱[4.6×150mm]，30℃的柱溫和1mL/分的流速，以及30分鐘內(nèi)68％A/32％B-66％A/34％B的梯度，將放射性標(biāo)記的產(chǎn)物與未標(biāo)記的配體和其它雜質(zhì)分離，其中A為檸檬酸鹽緩沖液(0.02M，pH 3.0)，而B(niǎo)為80％CH3CN/20％CH3OH。分離的化合物的RCP為～100％，而HPLC保留時(shí)間為23.4分鐘。
通過(guò)將目標(biāo)HPLC峰收集至1000μL檸檬酸鹽緩沖液(0.05M，pH5.3，含1％抗壞血酸和0.1％HSA)來(lái)制備用于生物分布和細(xì)胞結(jié)合研究的樣品。通過(guò)離心濃縮30分鐘來(lái)除去收集的洗脫物中的有機(jī)洗脫劑。對(duì)于細(xì)胞結(jié)合研究，在體外研究30分鐘內(nèi)用細(xì)胞結(jié)合培養(yǎng)基稀釋純化的樣品至濃度為1.5μCi/mL。關(guān)于生物分布研究，在體內(nèi)研究30分鐘內(nèi)將樣品用檸檬酸鹽緩沖液(0.05M，pH 5.3，含1％抗壞血酸鈉和0.1％HSA)稀釋至最終濃度為50μCi/mL。
實(shí)施例XLVI-制備用于放射治療研究的177Lu-L64通過(guò)于85℃下將70μg L64配體(70μL 1mg/mL水溶液)、200μL乙酸銨緩沖液(0.2M，pH 5.2)和～30-40mCi在0.05N HCl中的177LuCl3(MURR)溫育10分鐘來(lái)合成此化合物。在冷卻至室溫后，通過(guò)加入20μL 2％Na2EDTA·2H2O(Aldrich)水溶液清除游離177Lu。所得的放射化學(xué)純度(RCP)為～95％。通過(guò)HPLC，用300VHP陰離子交換柱(7.5×50mm)(Vydac)從未標(biāo)記的配體和其它雜質(zhì)中分離放射性標(biāo)記的產(chǎn)物，所述的柱用水、50％乙腈/水，然后用1g/L乙酸銨水溶液以1mL/分的流速依次洗脫。用50％CH3CN從柱中洗脫目標(biāo)化合物，并將其與～1mL含5％抗壞血酸、0.2％HSA和0.9％(v∶v)芐醇的檸檬酸鹽緩沖液(0.05M，pH 5.3)混合。通過(guò)旋轉(zhuǎn)真空40分鐘除去分離級(jí)分中的有機(jī)部分，并在體內(nèi)研究30分鐘內(nèi)用含5％抗壞血酸、0.2％HSA和0.9％(v∶v)芐基醇的檸檬酸鹽緩沖液(0.05M，pH 5.3)將該濃縮的溶液(～20-25mCi)調(diào)節(jié)至濃度為7.5mCi/mL。所得的化合物的RCP＞95％。
實(shí)施例XLVII-制備111In-L64通過(guò)在85℃下在0.05N HCl(80μL)和155μL乙酸鈉緩沖液(0.5M，pH 4.5)中將10μg L64配體(5μL在0.01N HCl中的2mg/mL溶液)、60μL乙醇、1.12mCi111InCl3溫育30分鐘來(lái)合成此化合物。通過(guò)加入20μL 1％Na2EDTA.2H2O(Aldrich)水溶液來(lái)清除游離111In。所得的放射化學(xué)純度(RCP)為87％。通過(guò)HPLC，使用Vydac C18柱[4.6×250mm]，50℃的柱溫和1.5mL/分的流速，以及20分鐘內(nèi)75％A/25％B-65％A/35％B的梯度，從未標(biāo)記的配體和其它雜質(zhì)中分離放射性標(biāo)記的產(chǎn)物，其中A為0.1％TFA水溶液，而B(niǎo)為在乙腈中的0.085％TFA。以此系統(tǒng)，111In-L64的保留時(shí)間為15.7分鐘。分離的化合物RCP為96.7％。
實(shí)施例XLVIII-制備177Lu-DO3A-一酰胺-Aoc-QWAVGHLM-NH2(對(duì)照)通過(guò)將DO3A-一酰胺-Aoc-QWAVGHLM-NH2配體(如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)2002/0054855和WO 02/87637所述制備，二者被引用作為參考)溶于0.01N HCl至濃度為1mg/mL來(lái)制備肽的儲(chǔ)備液。以所示的順序混合以下試劑來(lái)制備177Lu-DO3A-一酰胺-Aoc-QWAVGHLM-NH20.2M NH4OAc，pH 6.8 100μl肽儲(chǔ)備液，1mg/mL，在0.01N HCl中5μL177LuCl3(MURR)，在0.05M HCl中 1.2μl(1.4mCi)將反應(yīng)混合物在85℃下保溫10分鐘。在水浴中冷卻至室溫后，加入20μL 1％EDTA溶液和20μL EtOH。通過(guò)HPLC，使用C18柱(VYDAC Cat#；218TP54)分析化合物，用20分鐘內(nèi)21-25％B的梯度以1mL/min的流速洗脫，其中A為0.1％TFA/H2O，而B(niǎo)為0.1％TFA/CH3CN)。形成97.1％產(chǎn)率(RCP)的177Lu-DO3A-一酰胺-Aoc-QWAVGHLM-NH2，其在此系統(tǒng)中的保留時(shí)間為～16.1分鐘。
實(shí)施例XLIX-制備177Lu-L63如關(guān)于177Lu-DO3A-一酰胺-Aoc-QWAVGHLM-NH2所述制備此化合物。通過(guò)HPLC，使用C18柱(VYDAC Cat#，218TP54)分析化合物，以1mL/分的流速和20分鐘內(nèi)30-34％B的梯度洗脫(其中溶劑為A.0.1％TFA/H2O，而B(niǎo)為0.1％TFA/CH3CN)。形成的177Lu-L63的RCP為97.8％，在此系統(tǒng)中的保留時(shí)間為～14.2分鐘。
實(shí)施例L-制備用于細(xì)胞結(jié)合和生物分布研究的177Lu-L70根據(jù)上述的方法制備此化合物，但換成L70(實(shí)施例II的配體)。用YMC Basic C8柱(4.6×150mm)進(jìn)行純化，柱溫為30℃，流速為1mL/分，而梯度為40分鐘內(nèi)80％A/20％B至75％A/25％B，其中A為檸檬酸鹽緩沖液(0.02M，pH 4.5)，而B(niǎo)為80％CH3CN/20％CH3OH。分離的化合物的RCP為～100％，而HPLC保留時(shí)間為25.4min。
實(shí)施例LI-制備用于放射治療研究的177Lu-L70如以上關(guān)于L64所述制備此化合物。
實(shí)施例LII-制備用于細(xì)胞結(jié)合和生物分布研究的111In-L70通過(guò)在85℃下將10μg L70配體(10μL在0.01N HCl中的1mg/mL溶液)、180μL乙酸銨緩沖液(0.2M，pH 5.3)、在0.05N HCl中的1.1mCi111InCl3(61μL，Mallinckrodt)和50μL鹽水保溫30分鐘來(lái)合成此化合物。通過(guò)加入20μL 1％Na2EDTA·2H2O(Aldrich)水溶液來(lái)清除游離的111In。所得的放射化學(xué)純度(RCP)為86％。通過(guò)HPLC，使用與Vydac強(qiáng)陰離子交換柱[7.5×50mm]相連的Waters XTerra C18柱，從未標(biāo)記的配體和其它雜質(zhì)中分離放射性標(biāo)記的產(chǎn)物，柱溫為30℃，流速為1mL/分，且梯度如下表列出，其中A為0.1mM NaOH水溶液，pH 10.0，B為1g/L乙酸銨水溶液，pH 6.7，而C為乙腈。利用此系統(tǒng)，111In-L70的保留時(shí)間為15分鐘，而L70配體的保留時(shí)間為27-28分鐘。分離的化合物的RCP為96％。
通過(guò)收集目標(biāo)HPLC峰至500μL檸檬酸鹽緩沖液(0.05M，pH 5.3，含有5％抗壞血酸、1mg/mL L-蛋氨酸和0.2％HSA)來(lái)制備用于生物分布和細(xì)胞結(jié)合研究的樣品。通過(guò)旋轉(zhuǎn)真空30分鐘來(lái)除去收集物中的有機(jī)部分。關(guān)于細(xì)胞結(jié)合研究，在體外研究30分鐘內(nèi)使用純化、濃縮的樣品。關(guān)于生物分布研究，在體內(nèi)研究30分鐘內(nèi)用檸檬酸鹽緩沖液(0.05M，pH 5.3，包含5％抗壞血酸鈉和0.2％HSA)將樣品稀釋至終濃度為10uCi/mL。
實(shí)施例LIII-體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究A.示蹤劑量生物分布用以下鑒定的本發(fā)明化合物在荷有異種移植的PC3腫瘤的裸鼠([Ncrl-Foxnl<nu>)中進(jìn)行低劑量藥代動(dòng)力學(xué)研究(例如生物分布研究)。在所有的研究中，以200μCi/kg給小鼠靜脈內(nèi)施用100μL177Lu-標(biāo)記的受試化合物，且每組(n＝3-4)的停留時(shí)間為1和24小時(shí)。在LKB1282 CompuGamma計(jì)數(shù)器中以適宜的標(biāo)準(zhǔn)分析組織。
表7在1和24小時(shí)在負(fù)荷PC3腫瘤的裸鼠中進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)比較(200μCi/kg；值為％ID/g)177Lu-177標(biāo)記的本發(fā)明化合物與對(duì)照比較
在L64和L70注射之后血液、肝臟和腎中的放射性的分布與對(duì)照化合物DO3A-一酰胺-Aoc-QWAVGHLM-NH2的類(lèi)似，而L64和L70在腫瘤中的攝取在1和24小時(shí)則高得多。L63也表現(xiàn)高腫瘤攝取，雖然早期血液和肝臟值有所增加。小鼠胰腺-已知具有GRP受體的正常器官對(duì)L64、L70和L63的攝取大大高于對(duì)照化合物DO3A-一酰胺-Aoc-QWAVGHLM-NH2。
實(shí)施例LIV-受體亞型特異性目前，已知GRP受體家族的四種哺乳動(dòng)物成員GRP-偏好受體(GRP-R)、神經(jīng)調(diào)節(jié)肽-B偏好受體(NMB-R)、蛙皮素受體亞型3(BB3-R)和蛙皮素受體亞型4(BB4-R)。研究177Lu-L70的受體亞型特異性。結(jié)果表明，177Lu-L70與GRP-R和NMB-R特異性結(jié)合，并且對(duì)BB3-R的親和力小。
通過(guò)體外受體放射自顯影術(shù)，使用Reubi等人，″BombesinReceptor Subtypes in Human Cancers Detection with the UniversalRadioligand125I-[D-Tyr6，beta-Ala，Phe13，Nle14]″，Clin.CancerRes.81139-1146(2002)所述的方法和先前發(fā)現(xiàn)僅表達(dá)一種GRP受體亞型的組織樣品，以及包括正常胰腺和結(jié)腸及慢性胰腺炎的非-腫瘤組織確定L70的镥絡(luò)合物[這里稱(chēng)為177Lu-L70](如上述制備)的亞型特異性(在下面表8a中表示)。將人回腸類(lèi)癌組織用作NMB-R的來(lái)源，將人前列腺癌用作GRP-R的來(lái)源，而將人支氣管類(lèi)癌用作BB3-R亞型受體的來(lái)源。為了進(jìn)行比較，還使用其它蛙皮素放射性配體，如125I-Tyr4-蛙皮素，或已知為通用配體的化合物，125I-[DTyr6，βAla11，Phe13，Nle14]-BBN(6-14)(其與GRP-R的所有三個(gè)亞型結(jié)合)，對(duì)相鄰組織切片進(jìn)行受體放射自顯影。進(jìn)一步討論見(jiàn)Fleischmann等人“BombesinReceptors in Distinct Tissue Compartments of Human PancreaticDisease，”Lab.Invest.801807-1817(2000)；Markwalder等人，“Gastin-Releasing Peptide Receptors in the HumanProstateRelation to Neoplastic Transformation，”Cancer Res.591152-1159(1999)；Gugger等人，“GRP Receptors inNon-Neoplastic and Neoplastic Human Breast，”Am.J.Pathol.1552067-2076(1999)。
表8A使用不同放射性配體檢測(cè)各種人類(lèi)組織中的蛙皮素受體亞型
*125I-[DTyr6，βAla11，Phe13，Nle14]-BBN(6-14)和125I-Tyr4-BBN
從表8a可以看出，也可使用177Lu-L70體外顯現(xiàn)使用已建立的放射性配體鑒定的所有表達(dá)GRP-R的腫瘤，如前列腺、乳腺和腎細(xì)胞癌。如表8a所示，由于敏感性更好，可使用177Lu-L70(但不能使用125I-Tyr4-BBN)鑒定所選擇的具有較低GRP-R水平的腫瘤。所有用已建立的放射性配體鑒定的表達(dá)NMB-R的腫瘤也可用177Lu-L70顯現(xiàn)。相反，不能用177Lu-L70檢測(cè)BB3腫瘤。人們不應(yīng)對(duì)在表8a所列各種類(lèi)型腫瘤中受體表達(dá)的天然發(fā)生率作出任何結(jié)論，因?yàn)樗囼?yàn)例子被選擇為在絕大多數(shù)情況下受體-陽(yáng)性，僅有少數(shù)選擇陰性對(duì)照。正常的人類(lèi)胰腺不被177Lu-L70標(biāo)記，而在相同條件下小鼠胰腺被強(qiáng)標(biāo)記。雖然正常胰腺是一種可非常迅速降解的組織，不能完全排除蛋白包括受體的降解，表明人類(lèi)胰腺數(shù)據(jù)確實(shí)為陰性的因素包括相似條件下小鼠胰腺的陽(yáng)性對(duì)照和在相應(yīng)人類(lèi)胰島中發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)標(biāo)記的BB3，其代表所研究的人類(lèi)胰腺質(zhì)量的陽(yáng)性對(duì)照。此外，在病理學(xué)改變(慢性胰腺炎)的胰腺組織中檢測(cè)到GRP-R表明GRP-R當(dāng)存在時(shí)可在所選擇的實(shí)驗(yàn)條件下在該組織中被鑒定。事實(shí)上，177Lu-L70以較之125I-Tyr4-BBN更高的敏感性鑒定慢性胰腺炎中的這些GRP-R。胰腺癌均不含可測(cè)出量的GRP-R，少數(shù)結(jié)腸癌顯示用177Lu-L70測(cè)量的低密度的非均勻分布的GRP受體(表8a)。還應(yīng)進(jìn)一步注意到結(jié)腸平滑肌表達(dá)GRP-R且用177Lu-L70及已建立的蛙皮素配體在體外檢測(cè)到。
表8B175Lu-L70與在人類(lèi)癌癥中表達(dá)的3種蛙皮素受體亞型的結(jié)合親和性。數(shù)據(jù)以nM IC50(平均值±SEM.n＝圓括號(hào)中的實(shí)驗(yàn)數(shù))表示。
如表8b所示，冷標(biāo)記的175Lu-L70對(duì)在人類(lèi)組織中表達(dá)的人GRP和NMB受體具有非常高的親和性，而對(duì)BB3受體僅有低親和性。這些實(shí)驗(yàn)使用125I-[DTyr6，βAla11，Phe13，Nle14]-BBN(6-14)作為放射性示蹤劑。使用177Lu-標(biāo)記的L70作為放射性示蹤劑，上述數(shù)據(jù)由此被證實(shí)和擴(kuò)展。所有表達(dá)GRP-R的人類(lèi)癌癥都被177Lu-L70強(qiáng)標(biāo)記。對(duì)所有NMB-R-陽(yáng)性腫瘤也同樣。相反，沒(méi)有顯現(xiàn)BB3腫瘤。177Lu-L70的敏感性似乎好于125I-Tyr4-BBN或125I-標(biāo)記的通用蛙皮素類(lèi)似物。因此，可使用177Lu-L70很容易地鑒定少數(shù)表達(dá)低密度GRP-R的腫瘤，而使用125I-Tyr4-BBN時(shí)，它們不是陽(yáng)性的。177Lu-L70的結(jié)合特性還可在非-腫瘤組織中加以證實(shí)。盡管作為對(duì)照的小鼠胰腺顯示出表達(dá)非常高密度的GRP-R，正常人類(lèi)胰腺腺泡全無(wú)GRP-R。然而，在慢性胰腺炎的狀況下，可在腺泡(如Fleischmann等人先前報(bào)道，“Bombesin Receptorsin Distinct Tissue Compartments of Human Pancreatic Diseases，”Lab.Invest.801807-1817(2000))和組織中鑒定出GRP-R，且使用177Lu-L70較之使用125I-Tyr4-BBN再次具有更好的敏感性。相反，表達(dá)BB3的胰島不被177Lu-L70檢測(cè)出，而它們被通用配體強(qiáng)標(biāo)記，如先前Fleischmann等人，“Bombesin Recptors in Distinct tissueCompartments of Human Pancreatic Disease，”Lab.Invest.801807-1817(2000)所報(bào)道的。少數(shù)結(jié)腸癌具有GRP-R，通常密度非常低且不均勻分布，正常結(jié)腸平滑肌表達(dá)高密度GRP-R。
表8a和8b的結(jié)果表明預(yù)期Lu標(biāo)記的L70衍生物可很好地結(jié)合主要表達(dá)GRP-R的人類(lèi)前列腺癌。它們還表明預(yù)期Lu標(biāo)記的L70衍生物不會(huì)很好地結(jié)合正常的人類(lèi)胰腺(其主要表達(dá)BB3-R受體)，或主要表達(dá)BB3-R受體亞型的癌。
實(shí)施例LV-放射治療研究A.效力研究使用負(fù)荷PC3腫瘤的裸鼠模型進(jìn)行放射治療研究。在短期效力研究中，將177Lu標(biāo)記的本發(fā)明的化合物L(fēng)64、L70、L63和治療對(duì)照化合物DO3A-一酰胺-Aoc-QWAVGHLM-NH2與未治療的對(duì)照組作比較。(每個(gè)治療組的n＝12，長(zhǎng)達(dá)30天，而合并的未治療的對(duì)照組的n＝36，長(zhǎng)達(dá)31天)。對(duì)于所有效力研究而言，在無(wú)菌條件下給小鼠靜脈內(nèi)或皮下施用100μL 30mCi/kg177Lu-標(biāo)記的本發(fā)明的化合物。在研究持續(xù)期間將受試者籠養(yǎng)在柵欄環(huán)境中。在整個(gè)研究期間每周對(duì)每只受試動(dòng)物進(jìn)行3次體重和腫瘤大小(用卡尺測(cè)量)收集。提前終止的指標(biāo)包括死亡；總體重(TBW)下降等于或大于20％；腫瘤大小等于或大于2cm3。短期效力研究的結(jié)果在圖15A中顯示。這些結(jié)果表明用L70、L64或L63治療的動(dòng)物與不給予治療的動(dòng)物和給予相同劑量DO3A-一酰胺-Aoc-QWAVGHLM-NH2對(duì)照的動(dòng)物相比存活提高。
用L64和L70，使用與前述相同的劑量，但每種化合物使用更多動(dòng)物(n＝46)并追蹤長(zhǎng)達(dá)120天，來(lái)進(jìn)行長(zhǎng)期效力研究。長(zhǎng)期效力研究的結(jié)果表示在圖15B中。相對(duì)于與前面相同的對(duì)照(n＝36)，L64和L70治療均明顯增加存活(p＜0.0001)，且L70好于L64，雖然彼此沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.067)。
實(shí)施例LVI使用分段偶聯(lián)對(duì)L64和L70的可替代選擇的制備可以使用由A-D(圖19)概括表示的中間產(chǎn)物的集合體來(lái)制備化合物L(fēng)64和L70，所述中間產(chǎn)物本身可以由固相和液相肽合成領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)方法制備(Synthetic Peptides-A User′s Guide 1992，Grant，G.，Ed.WH.Freeman Co.，NY，Chap 3和Chap 4pp 77-258；Chan，W.C.和White，P.D.Basic Procedures in Fmoc Solid Phase PeptideSynthesis-A Practical Approach 2002，Chan，W.C.和White，P.D.Eds Oxford University Press，New York，Chap.3pp 41-76；Barlos，K和Gatos，G.Convergent Peptide Synthesisin Fmoc SolidPhase Peptide Synthesis-A Practical Approach 2002，Chan，W.C.和White，P.D.Eds Oxford University Press，New York，Chap.9pp216-228.)，所述文獻(xiàn)在此被引用以供參考。
這些方法包括基于Aloc、Boc、Fmoc或芐氧基羰基的肽合成策略，或者審慎選擇的那些固相或溶液方法的組合。用于特定步驟的中間體根據(jù)分子中每個(gè)位置的適宜保護(hù)基的選擇來(lái)選擇，所述保護(hù)基可以選自圖1所示的基團(tuán)清單。本領(lǐng)域技術(shù)人員還理解，還可以使用可與肽合成方法相容、包含可替代選擇的保護(hù)基的中間體，而以上所示的保護(hù)基的羅列選項(xiàng)用作例示而不是包括性的，且這些可替代的選擇在本領(lǐng)域中是已知的。
這在概述這種方法的圖20中作了詳細(xì)例示。當(dāng)應(yīng)用相同的合成策略時(shí)，用中間產(chǎn)物C2替換在合成L64中所示的C1而得到L70。
實(shí)施例LVII-圖49A和49B合成L69概述(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸A與Fmoc-Cl反應(yīng)得到中間產(chǎn)物B。使用八肽Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2(BBN[7-14])官能化的Rink酰胺樹(shù)脂(A)依次與B、Fmoc-8-氨基-3，6-二氧雜辛酸和DOTA三叔丁酯反應(yīng)。在用試劑B裂解和脫保護(hù)之后，用制備HPLC純化粗品，得到L230?？偖a(chǎn)率4.2％。
A.(3β，5β，7α，12α)-3-(9H-芴-9-基甲氧基)氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸，B(圖49)將在1，4-二烷(18mL)中的9-芴基甲氧基羰基氯(1.4g；5.4mmol)的溶液滴加到在0℃下攪拌的在10％Na2CO3水溶液(30mL)和1，4-二烷(18mL)中的(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸A(2.0g；4.9mmol)(3)的懸浮液。室溫下攪拌6小時(shí)后加入H2O(100mL)，用Et2O(2×90mL)洗滌水相，然后加入2M HCl(15mL)(最終pH1.5)。將沉淀的固體過(guò)濾，用H2O(3×100mL)洗滌，真空干燥，然后用快速色譜法純化得到B，為一種白色固體(2.2g；3.5mmol)。產(chǎn)率71％。
B.N-[3β，5β，7α，12α)-3-[[[2-[2-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]-7，12-二羥基-24-氧代膽烷-24-基]-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨酰基-L-蛋氨酸酰胺，L69(圖50)將樹(shù)脂A(0.5g；0.3mmol)在固相肽合成容器中與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘。過(guò)濾溶液，并加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。將懸浮液再攪拌20分鐘，然后過(guò)濾溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將(3β，5β，7α，12α)-3-(9H-芴-9-基甲氧基)氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸B(0.75g；1.2mmol)、N-羥基苯并三唑(HOBt)(0.18g；1.2mmol)、N，N′-二異丙基碳二亞胺(DIC)(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂，將混合物于室溫下振蕩24小時(shí)，倒空，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，倒空溶液加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉，并將混合物再振蕩20分鐘。倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將Fmoc-8-氨基-3，6-二氧雜辛酸(0.79g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂。將混合物于室溫下振蕩3小時(shí)，倒空并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。然后將樹(shù)脂與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，過(guò)濾溶液，加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉，并將混合物再振蕩20分鐘。過(guò)濾溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸三(1，1-二甲基乙基)酯與NaCl的加合物(0.79g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL1.2mmol)、N-乙基二異丙基胺(0.40mL；2.4mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂。將混合物在室溫下振蕩24小時(shí)，過(guò)濾并用DMA(5×7mL)、CH2Cl2(5×7mL)洗滌樹(shù)脂，并真空干燥。將樹(shù)脂在燒瓶中與試劑B(25mL)(2)一起振蕩4.5小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾，并在減壓下蒸發(fā)溶液得到一種油狀粗品，用Et2O(20mL)對(duì)其進(jìn)行處理后得到一種沉淀。離心收集沉淀，并用Et2O(3×20mL)洗滌得到一種固體(248mg)，對(duì)其用HPLC分析。用制備HPLC純化一定量的粗品(50mg)。將包含產(chǎn)物的級(jí)分凍干得到L69(6.5mg；3.5×10-3mmol)(圖49B)，為一種白色固體。產(chǎn)率5.8％。
實(shí)施例LVIII-圖50合成L144概述使用八肽Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2(BBN[7-14])官能化的Rink酰胺樹(shù)脂(A)與4-[2-羥基-3-[4，7，10-三[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]丙氧基]苯甲酸反應(yīng)。在用試劑B(2)裂解并脫保護(hù)之后，用制備HPLC純化粗品得到L144。總產(chǎn)率12％。
A.N-[4-[2-羥基-3-[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]丙氧基]苯甲?；鵠-L-谷氨酰胺?；?L-色氨?；?L-丙氨酰基-L-纈氨?；?甘氨?；?L-組氨?；?L-亮氨?；?L-蛋氨酸酰胺，L144(圖50)將樹(shù)脂A(0.4g；0.24mmol)在固相肽合成容器中與在DMA(7mL)中的50％嗎啉一起振蕩10分鐘，過(guò)濾溶液，并加入新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。將懸浮液再攪拌20分鐘，然后過(guò)濾溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹(shù)脂。將4-[2-羥基-3-[4，7，10-三[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]丙氧基]苯甲酸B(0.5g；0.7mmol)、HOBT(0.11g；0.7mmol)、DIC(0.11mL；0.7mmol))、N-乙基二異丙基胺(0.24mL；1.4mmol)和DMA(7mL)加到樹(shù)脂。將混合物在室溫下振蕩24小時(shí)，倒空，用DMA(5×7mL)、CH2Cl2(5×7mL)洗滌樹(shù)脂，并真空干燥。將樹(shù)脂在燒瓶中與試劑B(25mL)(2)一起振蕩4.5小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾，并在減壓下蒸發(fā)溶液得到一種油狀粗品，用Et2O(20mL)對(duì)其處理后得到一種沉淀。離心收集沉淀，并用Et2O(3×20mL)洗滌得到一種固體(240mg)，用HPLC對(duì)其進(jìn)行分析。用制備HPLC純化一定量的粗品(60mg)。將包含產(chǎn)物的級(jí)分凍干得到L144(10.5mg；7.2×10-3mmol)，為一種白色固體。產(chǎn)率12％。
實(shí)施例LIX制備L300和177Lu-L300從0.2g Rink酰胺Novagel樹(shù)脂(0.63mmol/g，0.126mmol)，在制備型柱色譜之后，得到L300(0.033g，17％)。保留時(shí)間為6.66分鐘。分子式為C72H99N19O18。計(jì)算的分子量為1518.71；觀察到1519.6。序列為DO3A-Gly-Abz4-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe-Leu-NH2。L300的結(jié)構(gòu)在圖51中顯示。
將L300(13.9μg溶于13.9μL 0.2M pH 4.8的醋酸鈉緩沖液中)與150μL 0.2M pH 4.8醋酸鈉緩沖液和4μL177LuCl3(1.136mCi，MissouriResearch Reactor)混合。100℃下10分鐘后，放射化學(xué)純度(RCP)為95％。將產(chǎn)物在Vydac C18肽柱(4.6×250mm，5μm孔徑)上純化，使用0.1％TFA水溶液(A)和0.085％TFA乙腈溶液(B)的含水/有機(jī)梯度，以1mL/分鐘的流速洗脫。使用下列梯度等度洗脫22％B 30分鐘，5分鐘內(nèi)至60％B，保持在60％B 5分鐘。將以18.8分鐘保留時(shí)間洗脫的該化合物收集到1mL 0.8％人血清白蛋白溶液中，其是通過(guò)將HSA加入到生理鹽水與注射用抗壞血酸的9∶1混合物中而制備的。使用SpeedVacuum(Savant)除去乙腈。純化后，該化合物具有100％的RCP。
實(shí)施例LX-對(duì)于GRP受體亞型的連接基特異性的表征在本測(cè)定中，使用兩種細(xì)胞系C6，一種表達(dá)NMB-R的嚙齒動(dòng)物成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系，和PC3，一種表達(dá)GRP-R的人前列腺癌細(xì)胞系。通過(guò)測(cè)量其競(jìng)爭(zhēng)125I-NMB或125I-BBN與在C6和PC3細(xì)胞中其相應(yīng)受體結(jié)合的能力，間接測(cè)定了多種未標(biāo)記的化合物對(duì)各受體亞型(NMB-R和GRP-R)的親和性。
A.材料和方法1.細(xì)胞培養(yǎng)C6細(xì)胞從ATCC(CCL-107)獲得并在補(bǔ)充了2mM L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氫鈉、15％馬血清和2.5％FBS的F12K培養(yǎng)基(ATCC)中培養(yǎng)。將用于測(cè)定的細(xì)胞以9.6×104/孔的濃度平板接種在48孔聚-賴(lài)氨酸涂覆的平板(Beckton Dickinson Biocoat)中。PC3從ATCC(CRL-1435)獲得并在補(bǔ)充了2mM L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氫鈉、10mM HEPES和10％FBS的RPMI 1640(ATCC)中培養(yǎng)。兩種培養(yǎng)物均維持在37℃下，含5％CO2/95％空氣的濕潤(rùn)大氣中。將用于測(cè)定的PC3細(xì)胞以2.0×104個(gè)細(xì)胞/孔的濃度平板接種在96-孔白色/透明底平板(Falcon Optilux-I)中。在接種后第2天，平板用于進(jìn)行測(cè)定。
2.結(jié)合緩沖液，和放射性-配體RPMI 1640(ATCC)含25mM HEPES、0.2％BSA級(jí)分V、1.0mMAEBSF(CAS#3087-99-7)和0.1％桿菌肽(CAS#1405-87-4)，pH 7.4。
使用定制的125I-[Tyr0]NMB，＞2.0Ci/μmole(Amersham LifeScience)[125I-NMB]和商業(yè)得到的125I-[Tyr4]BBN，＞2.0Ci/μmole(Perkin Elmer Life Science)[125I-BBN]作為放射性配體。
B.體外測(cè)定法使用48-孔平板測(cè)定系統(tǒng)(用于C6研究)，用125I-NMB進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。所有PC3研究均是按照實(shí)施例XLIII所述，使用125I-BBN進(jìn)行的?；谶B接基亞型選擇進(jìn)行測(cè)定的化合物。結(jié)果在表9中表示。
表9用于測(cè)定所選的化合物數(shù)和它們的連接基
使用GraphPad Prism單-位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)非-線(xiàn)形回歸分析分析由該研究獲得的結(jié)合參數(shù)。將各種化合物對(duì)C6細(xì)胞中NMB-R的相對(duì)親和性與使用商業(yè)得到的[Tyr4]-BBN和[Tyr0]-NMB獲得的進(jìn)行比較。為了區(qū)分GRP-R偏好化合物與NMB-R加GRP-R偏好化合物，將從各化合物獲得的IC50值與在C6細(xì)胞上從[Tyr0]-BBN和125I-NMB獲得的進(jìn)行比較。將兩類(lèi)化合物之間的截?cái)帱c(diǎn)取為10X[Tyr4]-BBN的IC50。在所試驗(yàn)化合物中，8種化合物偏好結(jié)合GRP-R(如表10所示)而32種化合物以相似的親和性結(jié)合GRP-R和NMB-R，有兩種顯示偏好NMB-R。
表10使用125I-NMB和125I-BBN進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)獲得的IC50值
在上表中，“na”表示“不適用的”(例如，該化合物不含本發(fā)明的連接基且因此沒(méi)有指定L#)。
基于上面所述，觀察到若干結(jié)果。單獨(dú)的受體結(jié)合區(qū)(BBN7-14或BBN8-14)沒(méi)有顯示出對(duì)GRP-R或NMB-R的任何偏好。向受體結(jié)合區(qū)加入單獨(dú)的螯合劑不有助于肽對(duì)GRP-R或NMB-R的親和(DO3A-一酰胺-QWAVGHLM-NH2)。螯合劑通過(guò)連接基與肽偶合確實(shí)導(dǎo)致肽對(duì)受體的親和。然而，根據(jù)連接基類(lèi)型的不同，該親和性從雙重(偏好NMB-R和GRP-R)到GRP-R(偏好GRP-R)變化。
所試驗(yàn)的ω-氨基鏈烷酸(175Lu-DO3A-一酰胺-Aoc-QWAVGHLM-HN2和DO3A-一酰胺-Aoc-QWAVGHL-Nle-NH2中的8-氨基辛酸，DO3A-一酰胺-Apa3-QWAVGHLM-NH2中的3-氨基丙酸和DO3A-一酰胺-Abu4-QWAVGHLM-NH2中的4-氨基丁酸)作為連接基，賦予肽對(duì)GRP-R和NMB-R的雙重親和性。用‘Nle’替換175Lu-DOTA-Aoc-QWAVGHLM-NH2中的‘Met’不改變肽的這種雙重親和性。
含膽酸的連接基(L64中的3-氨基膽酸、L63中的3-氨基-12-羥基膽烷酸和L67中的3-氨基-12-酮膽烷酸)賦予肽對(duì)GRP-R和NMB-R的雙重親和性。含環(huán)烷基和芳香取代的丙氨酸的連接基(DO3A-一酰胺-Cha-Cha-QWAVGHLM-NH2中的3-環(huán)己基丙氨酸、DO3A-一酰胺-Cha-Nal1-QWAVGHLM-NH2中的1-萘基丙氨酸、DO3A-一酰胺-Nal1-Bpa4-QWAVGHLM-NH2中的4-苯甲?；奖彼岷虳O3A-一酰胺-Nal1-Bip-QWAVGHLM-NH2中的聯(lián)苯基丙氨酸)使肽對(duì)GRP-R具有選擇親和性。僅含4-(2-氨乙基哌嗪)-1的連接基也使肽具有GRP-R選擇性(L89)。
向NMB序列中引入G-4-氨基苯甲酸連接基可使化合物除了其固有的NMB-R親和性外，還對(duì)GRP-R具有親和性(L227 vs GNLWATGHFM-NH2)。圍繞連接基移動(dòng)Gly的位置將L70的親和性從其雙重親和性改變?yōu)閷?duì)NMB-R的選擇親和性(L204)。L70中4-氨基苯甲酸中的3-甲氧基取代(如L240)將雙重親和性改變?yōu)閷?duì)GRP-R的選擇親和性。
根據(jù)前面的數(shù)據(jù)可明顯看出連接基對(duì)受體亞型的特異性具有顯著影響。可鑒定三組化合物◆對(duì)GRP-R有活性的那些這些化合物提供體外和體內(nèi)對(duì)該受體特異性的信息，其可用于診斷目的。當(dāng)用治療性放射性核素放射性標(biāo)記這些化合物時(shí)，可對(duì)僅含該受體的組織進(jìn)行治療，而不影響含NMB-R的那些組織。
◆對(duì)NMB-R有活性的那些這些化合物提供體外和體內(nèi)對(duì)該受體特異性的信息，其可用于診斷目的。當(dāng)用治療性放射性核素放射性標(biāo)記時(shí)，可對(duì)僅含該受體的組織進(jìn)行治療，而不影響含GRP-R的那些組織。
◆對(duì)GRP-R和NMB-R均有活性的那些這些化合物提供有關(guān)體外和體內(nèi)這兩種受體亞型聯(lián)合存在的信息，其可用于診斷目的。以特異性為代價(jià)，靶向兩種受體可增加檢測(cè)的敏感性。當(dāng)用治療性放射性核素放射性標(biāo)記這些化合物時(shí)，可對(duì)含兩種受體的組織進(jìn)行治療，其可增加遞送到所需組織的劑量。
實(shí)施例LXI-125I-BBN與經(jīng)修飾的蛙皮素(BBN)類(lèi)似物對(duì)人前列腺癌(PC3)細(xì)胞中GRP-R的競(jìng)爭(zhēng)研究為了測(cè)定替換BBN7-14類(lèi)似物中特定氨基酸的效應(yīng)，制備靶向部分中被修飾的肽，并測(cè)定與人前列腺癌(PC3)細(xì)胞中GRP-R的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。所有這些肽具有與金屬螯合部分綴合的通用連接基(DOTA-Gly-Abz4-)。結(jié)合數(shù)據(jù)(IC50nM)在下面表13中表示。
A.材料和方法1.細(xì)胞培養(yǎng)PC3細(xì)胞系從ATCC(CRL-1435)獲得并在補(bǔ)充了2mM L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氫鈉、10mM HEPES和10％FBS的RPMI 1640(ATCC)中培養(yǎng)。培養(yǎng)物維持在37℃，含5％CO2/95％空氣的濕潤(rùn)大氣中。將用于測(cè)定的PC3細(xì)胞以2.0×104個(gè)細(xì)胞/孔的濃度平板接種在96-孔白色/透明底平板(Falcon Optilux-I)中。在接種后第2天，平板用于進(jìn)行測(cè)定。
2.結(jié)合緩沖液RPMI 1640(ATCC)含25mM HEPES、0.2％BSA級(jí)分V、1.0mMAEBSF(CAS#3087-99-7)和0.1％桿菌肽(CAS#1405-87-4)，pH 7.4。
3.125I-Tyr4-蛙皮素[125I-BBN]125I-BBN(Cat#NEX258)從PerkinElmer Life Sciences獲得。
C.體外測(cè)定法與125I-BBN對(duì)PC3細(xì)胞中GRP-R的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定將所有試驗(yàn)的化合物均溶于結(jié)合緩沖液中，并在結(jié)合緩沖液中進(jìn)行適當(dāng)稀釋。以2.0×104/孔的濃度將用于測(cè)定的PC3細(xì)胞接種在96-孔黑色/透明I型膠原cellware平板(Beckton Dickinson Biocoat)中。在平板接種后第2天，平板用于結(jié)合研究。在測(cè)定前檢查該平板的匯合(＞90％匯合)。進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定時(shí)，將1.25×10-9M-500×10-9M濃度的N，N-二甲基甘氨酰基-Ser-Cys(Acm)-Gly-Ava5-QWAVGHLM-NH2(對(duì)照)或其它競(jìng)爭(zhēng)劑與125I-BBN(25,000cpm/孔)共同培養(yǎng)。以75μl/孔測(cè)定體積進(jìn)行研究。各數(shù)據(jù)點(diǎn)使用一式三個(gè)孔。加入適宜溶液后，4℃溫育平板1小時(shí)。通過(guò)加入200μl冰冷的溫育緩沖液而終止溫育。將平板洗5次并吸干。使用LKB CompuGamma計(jì)數(shù)器或微量平板閃爍計(jì)數(shù)器檢測(cè)放射性。將125I-BBN的結(jié)合放射性相對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)劑的抑制濃度繪制曲線(xiàn)，并根據(jù)結(jié)合曲線(xiàn)獲得125I-BBN結(jié)合被抑制50％(IC50)的濃度。
表13與125I-BBN對(duì)PC3細(xì)胞中GRP-R的競(jìng)爭(zhēng)研究
結(jié)果/結(jié)論靶向部分被修飾的各種肽的結(jié)合結(jié)果分析表明神經(jīng)調(diào)節(jié)肽類(lèi)似物(GNLWATGHFM-NH2、yGNLWATGHFM-NH2)不能競(jìng)爭(zhēng)GRP-R，除非與DO3A-一酰胺-G-Abz4綴合(L227)。然而，它們是有效的NMB競(jìng)爭(zhēng)劑。這與QWAVGHLM-NH2、DO3A-一酰胺-QWAVGHLM-NH2&L70中反映的對(duì)蛙皮素序列氨基末端的衍生要求相類(lèi)似。組氨酸的替換(L225)降低了在GRP-R的競(jìng)爭(zhēng)。
L70中兩個(gè)連接基組分的反轉(zhuǎn)產(chǎn)生L204，這改變了亞型特異性至偏好NMB亞型。蛙皮素序列中L13F置換維持了GRP-R活性(L228)。
表14
在此可見(jiàn)，L228中F13M14向F13L14的置換產(chǎn)生對(duì)GRP-R具有高活性的化合物(L300)。除去甲硫氨酸有益，因?yàn)樗醒趸膬A向。如果不同時(shí)進(jìn)行L13F置換，不會(huì)產(chǎn)生該益處(L221)。如在L224中所見(jiàn)，除去V10導(dǎo)致結(jié)合完全喪失。
表15
表16如表16所見(jiàn)，在BBN2-6區(qū)允許多種置換(L214-L217，L226)。
表17正如所預(yù)期的，表17的結(jié)果表明通用激動(dòng)劑(L222&L223)以～50nM水平相當(dāng)好地競(jìng)爭(zhēng)。
實(shí)施例LXI-175Lu-L70和175Lu-DO3A-一酰胺-Aoc-QWAVGHLM-NH2的NMR結(jié)構(gòu)比較該NMR研究的目的是提供Lu-L70的完整結(jié)構(gòu)表征并將它與175Lu-DOTA-Aoc-QWAVGHLM的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。L70和175Lu-DOTA-Aoc-QWAVGHLM都是蛙皮素類(lèi)似物(見(jiàn)圖60和61)，區(qū)別僅在于螯合基團(tuán)與靶向肽之間的連接基。L70中存在甘氨?；?4-氨基苯甲酰基，而175Lu-DOTA-Aoc-QWAVGHLM中存在8-氨基辛酰基。然而，這兩個(gè)化合物的生物學(xué)數(shù)據(jù)明顯不同。進(jìn)行詳細(xì)的NMR研究以解釋這種差異。
A.實(shí)驗(yàn)1.材料將5mg175Lu-DO3A-一酰胺-Aoc-QWAVGHLM-NH2溶于225μLDMSO-d6(Aldrich 100％原子％D)中。將5mg175Lu-L70溶于225μLDMSO-d6(Aldrich 100％原子％D)中。
2.NMR數(shù)據(jù)的獲取所有NMR實(shí)驗(yàn)都是在裝有3mm寬譜帶反向(z-軸梯度)探針的Varian Inova-500傅里葉變換NMR波譜儀上進(jìn)行的。化學(xué)位移參照DMSO-d6的殘余CH峰，對(duì)于質(zhì)子在2.50ppm，對(duì)于13C在40.19ppm。通過(guò)Varian數(shù)字溫度控制器控制樣品溫度。使用NMRPipe、VNMR、PROSA和VNMRJ軟件在Sun Blade 2000 Unix計(jì)算機(jī)上處理數(shù)據(jù)并使用NMRView和SPARKY軟件在Linux計(jì)算機(jī)上分析。使用CYANA軟件在Linux計(jì)算機(jī)上進(jìn)行肽的建模，并使用MOLMOL軟件在Compaq DeskproWorkstation上進(jìn)一步分析。
B.結(jié)果和討論175Lu-L70的質(zhì)子化學(xué)位移確定如下。1D波譜中甲基區(qū)(0.5-2.5ppm)的迅速測(cè)量鑒定出2.02ppm的尖銳單峰為甲硫氨酸的甲基峰。在TOCSY波譜的同一區(qū)中，與4.32ppm唯一一個(gè)峰相關(guān)的1.16ppm化學(xué)位移表明它們屬于丙氨酸。與1.98和4.12ppm的兩個(gè)峰相關(guān)的0.84和0.85ppm的甲基峰必定屬于纈氨酸。與1.60、1.48和4.23ppm的峰相關(guān)的0.84和0.88ppm的剩余甲基峰屬于亮氨酸。這些化學(xué)位移和其它氨基酸的化學(xué)位移也存在于“指紋”區(qū)(見(jiàn)Wuthrich，K.“NMR ofProteins and Nucleic acid，”John Wiley & Sons，1986)-TOCSY波譜的主鏈NH-aH區(qū)(見(jiàn)圖52)。屬于氨基酸自旋系統(tǒng)的所有化學(xué)位移本身將垂直排列。仔細(xì)檢測(cè)波譜后，確定所有化學(xué)位移。通過(guò)檢查其它波譜如COSY(見(jiàn)圖53)和NOESY(見(jiàn)圖54)進(jìn)一步證實(shí)化學(xué)位移。確定質(zhì)子化學(xué)位移后，通過(guò)gHSQC波譜鑒定它們的碳化學(xué)位移(見(jiàn)圖55)并通過(guò)檢查gHMBC(圖56)和gHSQCTOCSY(見(jiàn)圖57)波譜進(jìn)一步證實(shí)。Lu-L70的化學(xué)位移在表19中列出(原子編號(hào)參照?qǐng)D60)。
有趣的是，在175Lu-L70的TOCSY波譜中，14.15ppm的NH質(zhì)子的化學(xué)位移顯示出與組氨酸環(huán)的兩個(gè)其它峰的強(qiáng)相關(guān)性，且也與水分子強(qiáng)相關(guān)。該水分子不是自由交換的且在NMR時(shí)幀中清晰可見(jiàn)。為了了解組氨酸的哪個(gè)質(zhì)子與該水分子更強(qiáng)烈地相互作用，15℃下對(duì)175Lu-L70進(jìn)行選擇性均-去偶合實(shí)驗(yàn)。當(dāng)以低能量選擇性飽和水峰時(shí)，在14.16和14.23ppm的組氨酸NH峰的強(qiáng)度顯著降低，而組氨酸在7.32和8.90ppm的兩個(gè)剩余峰的強(qiáng)度部分降低(見(jiàn)圖58)。對(duì)NMR時(shí)間標(biāo)度上的水質(zhì)子的觀察提示剛性構(gòu)象。
含水分子的175Lu-L70的草擬化學(xué)結(jié)構(gòu)可在圖62中見(jiàn)到。水分子通過(guò)覆蓋由配位氧描述的方形平面而占據(jù)第9個(gè)配位位點(diǎn)。這具有其它先例。在X-射線(xiàn)結(jié)構(gòu)中觀察到水在Na[Lu(DOTA)H2O]·4H2O中Lu的第9個(gè)位點(diǎn)配位，如Aime等人，Inorg.Chim.Acta 1996，246，423-429所示，其引入此處作為參考。
相比之下，在175Lu-DO3A-一酰胺-Aoc-QWAVGHLM-NH2的TOCSY波譜中，NH質(zhì)子的化學(xué)位移僅顯示與組氨酸環(huán)的兩個(gè)其它峰緊密相關(guān)，但與水分子無(wú)關(guān)(見(jiàn)圖59)。這表明沒(méi)有水分子同時(shí)與175Lu和175Lu-DO3A-一酰胺-Aoc-QWAVGHLM-NH2中的His-NH配位。因此，兩個(gè)分子之間的差異是顯著的。在175Lu-L70中，通過(guò)結(jié)合的水分子穩(wěn)定肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，且這可引起體內(nèi)穩(wěn)定性增加。
表19-25℃下，DMSO-d6中，175Lu-L70的化學(xué)位移(ppm)
權(quán)利要求
1.選自下列的化合物DO3A-一酰胺-Gly-(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸-QWAVaHLM-NH2DO3A-一酰胺-Gly-(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸-f-QWAVGHLM-NH2DO3A-一酰胺-Gly-(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸-f-WAVGHLL-NH2DO3A-一酰胺-Gly-(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸-f-QWAVGHL-NH-戊基DO3A-一酰胺-Gly-(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸-y-QWAV-Bala-H-F-Nle-NH2DO3A-一酰胺-Gly-(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸-f-QWAV-Bala-H-F-Nle-NH2DO3A-一酰胺-Gly-(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸-QWAVGHFL-NH2DO3A-一酰胺-Gly-(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸-QWAVGNMeH-L-M-NH2DO3A-一酰胺-Gly-(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸-LWAVGSF-M-NH2DO3A-一酰胺-Gly-(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸-HWAVGHLM-NH2DO3A-一酰胺-Gly-(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸-LWAGHFM-NH2DO3A-一酰胺-Gly-(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸-QWAVGHFM-NH2DO3A-一酰胺-Gly-(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸-QRLGNQWAVGHLM-NH2DO3A-一酰胺-Gly-(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸-QRYGNQWAVGHLM-NH2DO3A-一酰胺-Gly-(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸-QKYGNQWAVGHLM-NH2Pglu-Q-Lys(DO3A-一酰胺)-Gly-(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸-LGNQWAVGHLM-NH2DO3A-一酰胺-Gly-3-氨基-3-脫氧膽酸-QRLGNQWAVGHLM-NH2DO3A-一酰胺-Gly-3-氨基-3-脫氧膽酸-QRYGNQWAVGHLM-NH2DO3A-一酰胺-Gly-3-氨基-3-脫氧膽酸-QKYGNQWAVGHLM-NH2；和Pglu-Q-Lys(DO3A-一酰胺-G-3-氨基-3-脫氧膽酸)-LGNQWAVGHLM-NH2。
2.選自下列的化合物DO3A-一酰胺-G-4-氨基苯甲酸-QWAVGHFL-NH2DO3A-一酰胺-4-氨甲基苯甲酸-L-1-萘基丙氨酸-QWAVGHLM-NH2和DO3A-一酰胺-G-4-氨基苯甲酸-QWAVGNMeHisLM-NH2。
3.以下通式的化合物M-N-O-P-G其中M為DO3A，任選與放射性核素絡(luò)合；N為0、α或非α-氨基酸或其它連接基；O為α或非α-氨基酸；P為0、α或非α-氨基酸或其它連接基；且G為GRP受體靶向肽，其中N、O或P中至少一個(gè)為8-氨基-3，6-二氧雜辛酸；且其中GRP受體靶向肽選自QWAVGHLM-NH2、QWAVGNMeHLM-NH2、QWAVGHFL-NH2、LWATGSFM-NH2和QWAVaHLM-NH2。
4.以下通式的化合物M-N-O-P-G其中M為DO3A，任選與放射性核素絡(luò)合；N為0、α或非α-氨基酸或其它連接基；O為α或非α-氨基酸；P為0、α或非α-氨基酸或其它連接基；且G為GRP受體靶向肽，其中N、O或P中至少一個(gè)為(3β，5β，12α)-3-氨基-12-羥基膽烷-24-酸；且其中GRP受體靶向肽選自QWAVGHLM-NH2、QWAVGNMeHLM-NH2、QWAVGHFL-NH2、LWATGSFM-NH2和QWAVaHLM-NH2。
5.以下通式的化合物M-N-O-P-G其中M為DO3A，任選與放射性核素絡(luò)合；N為0、α或非α-氨基酸或其它連接基；O為α或非α-氨基酸；P為0、α或非α-氨基酸或其它連接基；且G為GRP受體靶向肽，其中N、O或P中至少一個(gè)為4-氨基苯甲酸；且其中GRP受體靶向肽選自QWAVGHLM-NH2、QWAVGNMeHLM-NH2、QWAVGHFL-NH2、LWATGSFM-NH2、QWAVaHLM-NH2、Nme-QWAVGHLM-NH2、Q-Ψ[CSNH]WAVGHLM-NH2、Q-Ψ[CH2NH]WAVGHLM-NH2、Q-Ψ[CH＝CH]WAVGHLM-NH2、α-MeQWAVGHLM-NH2、QNme-WAVGHLM-NH2、QW-Ψ[CSNH]-AVGHLM-NH2、QW-Ψ[CH2NH]-AVGHLM-NH2、QW-Ψ[CH＝CH]-AVGHLM-NH2、Q-α-Me-WAVGHLM-NH2、QW-Nme-AVGHLM-NH2、QWA＝Ψ[CSNH]-VGHLM-NH2、QWA-Ψ[CH2NH]-VGHLM-NH2、QW-Aib-VGHLM-NH2、QWAV-Sar-HLM-NH2、QWAVG-Ψ[CSNH]-HLM-NH2、QWAVG-Ψ[CH＝CH]-HLM-NH2、QWAV-Dala-HLM-NH2、QWAVG-Nme-His-LM-NH2、QWAVG-H-Ψ[CSNH]-L-M-NH2、QWAVG-H-Ψ[CH2NH]-LM-NH2、QWAVGH-Ψ[CH＝CH]-LM-NH2、QWAVG-α-Me-HLM-NH2、QWAVGH-Nme-LM-NH2、QWAVGH-α-MeLM-NH2、QWAVGHF-L-NH2和QWAVGHLM-NH2。
6.選自下列的化合物DO3A-一酰胺-G-4-氨基苯甲酸-QWAVaHLM-NH2，DO3A-一酰胺-G-4-氨基苯甲酸-fQWAVGHLM-NH2，DO3A-一酰胺-G-4-氨基苯甲酸-fQWAVGHLL-NH2，DO3A-一酰胺-G-4-氨基苯甲酸-fQWAVGHL-NH-戊基，DO3A-一酰胺-G-4-氨基苯甲酸-yQWAV-Bala-HFNle-NH2，DO3A-一酰胺-G-4-氨基苯甲酸-fQWAV-Bala-HFNle-NH2，DO3A-一酰胺-G-4-氨基苯甲酸-QWAVGHFL-NH2，DO3A-一酰胺-G-4-氨基苯甲酸-QWAVGNMeHisLM-NH2，DO3A-一酰胺-G-4-氨基苯甲酸-LWAVGSFM-NH2，DO3A-一酰胺-G-4-氨基苯甲酸-HWAVGHLM-NH2，DO3A-一酰胺-G-4-氨基苯甲酸-LWATGHFM-NH2，DO3A-一酰胺-G-4-氨基苯甲酸-QWAVGHFM-NH2，DO3A-一酰胺-G-4-氨基苯甲酸-QRLGNQWAVGHLM-NH2，DO3A-一酰胺-G-4-氨基苯甲酸-QRYGNQWAVGHLM-NH2，DO3A-一酰胺-G-4-氨基苯甲酸-QKYGNQWAVGHLM-NH2，Pglu-Q-Lys(DO3A-一酰胺-G-4-氨基苯甲酸)-LGNQWAVGHLM-NH2，DO3A-一酰胺-G-3-氨基-3-脫氧膽酸-QWAVaHLM-NH2，DO3A-一酰胺-G-3-氨基-3-脫氧膽酸-fQWAVGHLM-NH2，DO3A-一酰胺-G-3-氨基-3-脫氧膽酸-fQWAVGHLL-NH2，DO3A-一酰胺-G-3-氨基-3-脫氧膽酸-fQWAVGHL-NH-戊基，DO3A-一酰胺-G-3-氨基-3-脫氧膽酸-yQWAV-Bala-HFNle-NH2，DO3A-一酰胺-G-3-氨基-3-脫氧膽酸-fQWAV-Bala-HFNle-NH2，DO3A-一酰胺-G-3-氨基-3-脫氧膽酸-QWAVGHFL-NH2，DO3A-一酰胺-G-3-氨基-3-脫氧膽酸-QWAVGNMeHLM-NH2，DO3A-一酰胺-G-3-氨基-3-脫氧膽酸-LWAVGSFM-NH2，DO3A-一酰胺-G-3-氨基-3-脫氧膽酸-HWAVGHLM-NH2，DO3A-一酰胺-G-3-氨基-3-脫氧膽酸-LWATGHFM-NH2，DO3A-一酰胺-G-3-氨基-3-脫氧膽酸-QWAVGHFM-NH2，DO3A-一酰胺-G-3-氨基-3-脫氧膽酸-QRLGNQWAVGlyHLM-NH2，DO3A-一酰胺-G-3-氨基-3-脫氧膽酸-QRYGNQWAVGHLM-NH2，DO3A-一酰胺-G-3-氨基-3-脫氧膽酸-QKYGNQWAVGHLM-NH2，和Pglu-Q-Lys(DO3A-一酰胺-G-3-氨基-3-脫氧膽酸)-LGNQWAVGHLM-NH2。
7.以下通式的化合物M-N-O-P-G其中M為DO3A，任選與放射性核素絡(luò)合；N為0、α或非α-氨基酸或其它連接基；O為α或非α-氨基酸；P為0、α或非α-氨基酸或其它連接基；且G為GRP受體靶向肽，其中N、O或P中至少一個(gè)為8-氨基-3，6-二氧雜辛酸或(3β，5β，12α)-3-氨基-12-羥基膽烷-24-酸；且其中G選自Nme-QWAVGHLM-NH2、Q-Ψ[CSNH]WAVGHLM-NH2、Q-Ψ[CH2NH]-WAVGHLM-NH2、Q-Ψ[CH＝CH]WAVGHLM-NH2、α-MeQWAVGHLM-NH2、QNme-WAVGHLM-NH2、QW-Ψ[CSNH]-AVGHLM-NH2、QW-Ψ[CH2NH]-AVGHLM-NH2、QW-Ψ[CH＝CH]-AVGHLM-NH2、Q-α-Me-WAVGHLM-NH2、QW-Nme-AVGHLM-NH2、QWA＝Ψ[CSNH]-VGHLM-NH2、QWA-Ψ[CH2NH]-VGHLM-NH2、QW-Aib-VGHLM-NH2、QWAV-Sar-HLM-NH2、QWAVG-Ψ[CSNH]-HLM-NH2、QWAVG-Ψ[CH＝CH]-HLM-NH2、QWAV-Dala-HLM-NH2、QWAVG-Nme-His-LM-NH2、QWAVG-H-Ψ[CSNH]-L-M-NH2、QWAVG-H-Ψ[CH2NH]-LM-NH2、QWAVGH-Ψ[CH＝CH]-LM-NH2、QWAVG-α-Me-HLM-NH2、QWAVGH-Nme-LM-NH2、QWAVGH-α-MeLM-NH2、QWAVGHF-L-NH2和QWAVGHLM-NH2。
8.一種靶向胃泌素釋放肽受體(GRP-R)和神經(jīng)調(diào)節(jié)肽-B受體(NMB-R)的方法，所述方法包括給予以下通式的化合物M-N-O-P-G其中M為光標(biāo)記或金屬螯合劑，任選與放射性核素絡(luò)合；N為0、α或非α-氨基酸或其它連接基；O為α或非α-氨基酸；P為0、α或非α-氨基酸或其它連接基；G為GRP受體靶向肽；且其中N、O或P中至少一個(gè)為非α-氨基酸。
9.權(quán)利要求8的方法，其中N、O或P中至少一個(gè)為含環(huán)狀基團(tuán)的非α-氨基酸。
10.權(quán)利要求9的方法，其中N為Gly，O為4-氨基苯甲酸且P為0。
11.一種靶向GRP-R和NMB-R的方法，所述方法包括給予以下通式的化合物M-N-O-P-G其中M為光標(biāo)記或金屬螯合劑，任選與放射性核素絡(luò)合；N為0、α氨基酸、取代膽汁酸或其它連接基；O為α氨基酸或取代膽汁酸；P為0、α氨基酸、取代膽汁酸或其它連接基；G為GRP受體靶向肽；且其中N、O或P中至少一個(gè)為取代膽汁酸。
12.權(quán)利要求11的方法，其中N為Gly，O為(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸，且P為0。
13.權(quán)利要求8、9或12任何一項(xiàng)的方法，其中GRP受體靶向肽選自Nme-QWAVGHLM-NH2，Q-Ψ[CSNH]WAVGHLM-NH2，Q-Ψ[CH2NH]WAVGHLM-NH2，Q-Ψ[CH＝CH]WAVGHLM-NH2，α-MeQWAVGHLM-NH2，QNme-WAVGHLM-NH2，QW-Ψ[CSNH]-AVGHLM-NH2，QW-Ψ[CH2NH]-AVGHLM-NH2，QW-Ψ[CH＝CH]-AVGHLM-NH2，Q-α-Me-WAVGHLM-NH2，QW-Nme-AVGHLM-NH2，QWA＝Ψ[CSNH]-VGHLM-NH2，QWA-Ψ[CH2NH]-VGHLM-NH2，QW-Aib-VGHLM-NH2，QWAV-Sar-HLM-NH2，QWAVG-Ψ[CSNH]-HLM-NH2，QWAVG-Ψ[CH＝CH]-HLM-NH2，QWAV-Dala-HLM-NH2，QWAVG-Nme-His-LM-NH2，QWAVG-H-Ψ[CSNH]-L-M-NH2，QWAVG-H-Ψ[CH2NH]-LM-NH2，QWAVGH-Ψ[CH＝CH]-LM-NH2，QWAVG-α-Me-HLM-NH2，QWAVGH-Nme-LM-NH2，和QWAVGH-α-MeLM-NH2。
14.一種提高權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)的化合物的體內(nèi)活性的方法，包括修飾GRP受體靶向肽從而減少所述肽蛋白酶切割的步驟。
15.權(quán)利要求14的方法，其中該修飾的GRP-R靶向肽是激動(dòng)劑。
16.一種減少權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)的胃泌素釋放肽(GRP)類(lèi)似物的蛋白酶切割的方法，所述方法包括修飾GRP-R靶向部分中肽鍵的步驟。
17.權(quán)利要求16的方法，其中該修飾的GRP-R靶向肽是激動(dòng)劑。
18.一種減少為激動(dòng)劑的具有胃泌素釋放肽受體(GRP-R)靶向部分的胃泌素釋放肽(GRP)類(lèi)似物的蛋白酶切割的方法，所述方法包括修飾GRP-R靶向部分中肽鍵的步驟。
19.權(quán)利要求14、16或18任何一項(xiàng)的方法，其中該GRP-R靶向部分選自Nme-QWAVGHLM-NH2，Q-Ψ[CSNH]WAVGHLM-NH2，Q-Ψ[CH2NH]WAVGHLM-NH2，Q-Ψ[CH＝CH]WAVGHLM-NH2，α-MeQWAVGHLM-NH2，QNme-WAVGHLM-NH2，QW-Ψ[CSNH]-AVGHLM-NH2，QW-Ψ[CH2NH]-AVGHLM-NH2，QW-Ψ[CH＝CH]-AVGHLM-NH2，Q-α-Me-WAVGHLM-NH2，QW-Nme-AVGHLM-NH2，QWA＝Ψ[CSNH]-VGHLM-NH2，QWA-Ψ[CH2NH]-VGHLM-NH2，QW-Aib-VGHLM-NH2，QWAV-Sar-HLM-NH2，QWAVG-Ψ[CSNH]-HLM-NH2，QWAVG-Ψ[CH＝CH]-HLM-NH2，QWAV-Dala-HLM-NH2，QWAVG-Nme-His-LM-NH2，QWAVG-H-Ψ[CSNH]-L-M-NH2，QWAVG-H-Ψ[CH2NH]-LM-NH2，QWAVGH-Ψ[CH＝CH]-LM-NH2，QWAVG-α-Me-HLM-NH2，QWAVGH-Nme-LM-NH2，和QWAVGH-α-MeLM-NH2。
20.權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)的化合物，其中G為已被修飾從而減少蛋白酶切割的GRP受體靶向肽。
21.一種賦予包含光標(biāo)記或任選與放射性核素絡(luò)合的金屬螯合劑和GRP-R靶向肽的化合物對(duì)GRP-R和/或NMB-R的特異性的方法，包括在這類(lèi)化合物中包括以下通式的連接基N-O-P其中N為0、α或非α-氨基酸或其它連接基；O為α或非α-氨基酸；P為0、α或非α-氨基酸或其它連接基；且其中N、O或P中至少一個(gè)為非α-氨基酸。
22.一種賦予包含光標(biāo)記或任選與放射性核素絡(luò)合的金屬螯合劑和GRP-R靶向肽的化合物對(duì)GRP-R和/或NMB-R的特異性的方法，包括在這類(lèi)化合物中包括以下通式的連接基N-O-P其中N為0、α氨基酸、取代膽汁酸或其它連接基；O為α-氨基酸或取代膽汁酸；P為0、α-氨基酸、取代膽汁酸或其它連接基；且其中N、O或P中至少一個(gè)為取代膽汁酸。
23.一種賦予包含光標(biāo)記或任選與放射性核素絡(luò)合的金屬螯合劑和GRP-R靶向肽的化合物對(duì)GRP-R和/或NMB-R的特異性的方法，包括在這類(lèi)化合物中包括以下通式的連接基N-O-P其中N為0、α氨基酸、具有環(huán)狀基團(tuán)的非α-氨基酸或其它連接基；O為α氨基酸或具有環(huán)狀基團(tuán)的非α-氨基酸；P為0、α氨基酸、具有環(huán)狀基團(tuán)的非α-氨基酸或其它連接基；且其中N、O或P中至少一個(gè)為具有環(huán)狀基團(tuán)的非α-氨基酸。
24.一種提高包含光標(biāo)記或任選與放射性核素絡(luò)合的金屬螯合劑和GRP-R靶向肽的化合物的體內(nèi)活性的方法，包括在這類(lèi)化合物中包括以下通式的連接基N-O-P其中N為0、α或非α-氨基酸或其它連接基；O為α或非α-氨基酸；P為0、α或非α-氨基酸或其它連接基；且其中N、O或P中至少一個(gè)為非α-氨基酸。
25.一種提高包含光標(biāo)記或任選與放射性核素絡(luò)合的金屬螯合劑和GRP-R靶向肽的化合物的體內(nèi)活性的方法，包括在這類(lèi)化合物中包括以下通式的連接基N-O-P其中N為0、α氨基酸、取代膽汁酸或其它連接基；O為α-氨基酸或取代膽汁酸；P為0、α-氨基酸、取代膽汁酸或其它連接基；且其中N、O或P中至少一個(gè)為取代膽汁酸。
26.一種提高包含光標(biāo)記或任選與放射性核素絡(luò)合的金屬螯合劑和GRP-R靶向肽的化合物的體內(nèi)穩(wěn)定性的方法，包括在這類(lèi)化合物中包括以下通式的連接基N-O-P其中N為0、α氨基酸、具有環(huán)狀基團(tuán)的非α-氨基酸或其它連接基；O為α氨基酸或具有環(huán)狀基團(tuán)的非α-氨基酸；P為0、α氨基酸、具有環(huán)狀基團(tuán)的非α-氨基酸或其它連接基；且其中N、O或P中至少一個(gè)為具有環(huán)狀基團(tuán)的非α-氨基酸。
27.具有以下結(jié)構(gòu)的化合物
全文摘要
具有式M－N－O－P－G的用于診斷成像或治療的新的和改進(jìn)的化合物，其中M為光標(biāo)記或金屬螯合劑(與金屬放射性核素絡(luò)合或不絡(luò)合的形式)，N－O－P為連接基，G為GRP受體靶向肽。還提供用本發(fā)明的化合物對(duì)患者成像和/或?qū)颊咛峁┓派渲委熁蚬庵委煹姆椒?。還提供由所述化合物制備診斷顯像劑的方法和試劑盒。還提供用于制備放射治療劑的方法和試劑盒。
文檔編號(hào)A61M36/14GK1897980SQ200480038653
公開(kāi)日2007年1月17日 申請(qǐng)日期2004年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月24日
發(fā)明者E·卡佩勒蒂, L·拉圖塔, K·E·林德, E·馬里奈利, P·南加潘, N·拉尤, R·E·斯文森, M·推德?tīng)? K·拉邁林加姆 申請(qǐng)人:伯拉考成像股份公司