專利名稱：利用反義iap寡聚物和化療劑治療增生性疾病的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及癌癥及其它增生性疾病的治療。
一種細(xì)胞死亡的方式被稱為凋亡，或程序性細(xì)胞死亡。凋亡通常是發(fā)育和維持健康組織的正常部分。這一過(guò)程可能發(fā)生的很快，以至于難以檢測(cè)到。
現(xiàn)在已經(jīng)知道凋亡路徑在胚胎發(fā)育，病毒致病，癌癥，自身免疫紊亂，神經(jīng)變性疾病和其它疾病中起關(guān)鍵性的作用。凋亡反應(yīng)衰竭牽涉到癌癥，自身免疫紊亂，例如紅斑狼瘡和多發(fā)性硬化的發(fā)展和病毒感染，其中病毒感染包括那些與皰疹病毒，痘病毒和腺病毒相關(guān)的病毒感染。
近年來(lái)，凋亡在癌癥中的重要性已經(jīng)變得明朗。在二十世紀(jì)七十年代后期促生長(zhǎng)致癌基因的鑒定引起了對(duì)細(xì)胞增殖幾乎普遍的聚焦關(guān)注，使細(xì)胞增殖支配癌癥生物學(xué)研究多年。長(zhǎng)期存在的信條一直認(rèn)為，抗癌癥治療應(yīng)優(yōu)先靶向相對(duì)于”正常細(xì)胞″的快速分裂的癌細(xì)胞。這種解釋并不全然令人滿意，因?yàn)橐恍┥L(zhǎng)遲緩的腫瘤容易治療，而許多快速分裂的腫瘤類型卻對(duì)抗癌治療具有極強(qiáng)的抵抗力?，F(xiàn)在癌癥領(lǐng)域的發(fā)展已經(jīng)通向了癌癥生物學(xué)的新模式，在新模式中認(rèn)為不能執(zhí)行正常路徑的程序性細(xì)胞死亡導(dǎo)致了腫瘤形成。正常細(xì)胞可以通過(guò)各種生長(zhǎng)因子從鄰近細(xì)胞接受連續(xù)的反饋，當(dāng)從該環(huán)境中移出時(shí)，正常細(xì)胞會(huì)″自殺″。由于某種原因，癌細(xì)胞會(huì)忽視這些命令，繼續(xù)不適當(dāng)?shù)脑鲋场，F(xiàn)在相信許多癌癥治療，包括放療和許多以前認(rèn)為通過(guò)使細(xì)胞受損起作用的化療，實(shí)際上是通過(guò)觸發(fā)凋亡起作用。
雖然這種抗性的決定因素現(xiàn)在仍在調(diào)查中，但正常細(xì)胞類型和癌細(xì)胞類型都顯示出對(duì)凋亡觸發(fā)信號(hào)廣泛的敏感性。許多正常細(xì)胞對(duì)半數(shù)致死劑(sub-lethal)量的放射線或細(xì)胞毒性化學(xué)制劑的反應(yīng)是出現(xiàn)暫時(shí)的生長(zhǎng)延滯，而附近的癌細(xì)胞此時(shí)則會(huì)發(fā)生凋亡。在給定劑量出現(xiàn)的差異效果為成功的抗癌治療提供了決定性的治療窗。因此，腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡的抗性以癌癥治療失敗的主要原因出現(xiàn)并不令人驚訝。
已經(jīng)鑒定了幾種有效的能抑制凋亡的內(nèi)源性蛋白質(zhì)，包括哺乳動(dòng)物中的Bcl-2和IAP蛋白家族。IAP家族的某些成員可直接抑制終末效應(yīng)器——胱冬酶(caspases)，即參與執(zhí)行細(xì)胞死亡的casp-3和casp-7，以及關(guān)鍵的線粒體起始胱冬酶——casp-9，casp-9對(duì)介導(dǎo)癌癥化療誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡很重要。IAPs是唯一已知的內(nèi)源胱冬酶抑制劑，因此在調(diào)節(jié)凋亡中起重要作用。
已經(jīng)假設(shè)IAPs促進(jìn)了一些癌癥的發(fā)展，而且在MALT淋巴瘤中已經(jīng)鑒定出涉及一個(gè)特別IAP(cIAP2/HIAP1)的假設(shè)的表示原因的染色體易位。近來(lái)在患有急性髓性白血病的患者中已經(jīng)顯示升高的XIAP，預(yù)后差和存活時(shí)間短之間存在相關(guān)性。而且，XIAP在NCI小組的許多腫瘤細(xì)胞系中都呈高度過(guò)量表達(dá)。
因此，需要改進(jìn)的癌癥治療方法，特別是那些能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，并不考慮這種細(xì)胞中提供的抗凋亡信號(hào)的治療方法。
發(fā)明概述通常，本發(fā)明描述了有用的誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)凋亡的方法。本發(fā)明的方法在治療癌癥及其它增生性疾病方面有用。
本發(fā)明描述了一種通過(guò)施用反義IAP核堿基(nucleobase)寡聚物和化療劑治療患有增生性疾病，例如癌癥的患者的方法?？赏瑫r(shí)或在彼此相距28天內(nèi)施用(例如，在21天內(nèi)，14天內(nèi)，7天內(nèi)，1天內(nèi)或1小時(shí)內(nèi))化療劑和反義IAP核堿基寡聚物，施用的總量足以治療患者。反義IAP核堿基寡聚物會(huì)減少產(chǎn)生的IAP蛋白的量，使通常表達(dá)IAP的細(xì)胞發(fā)生凋亡。通過(guò)提供特定地與一種或多種編碼IAP的多核苷酸雜交的核堿基寡聚物就可以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。核堿基寡聚物與IAP多核苷酸(例如RNA，DNA)的特異性雜交會(huì)干擾IAP多核苷酸的正常功能，因此會(huì)降低產(chǎn)生的IAP蛋白的量。通過(guò)特定地與靶目標(biāo)雜交調(diào)整靶核酸功能的核酸分子一般被稱為″反義治療分子″。
可以使用任何能降低IAP表達(dá)水平的反義IAP核堿基寡聚物，一方面，核堿基寡聚物長(zhǎng)度為八到三十個(gè)堿基，并包括選自SEQ ID NOs1-99，143，147，151，163-260，287，289和300-460的序列的至少八個(gè)連續(xù)堿基。
在某些實(shí)施例中，核堿基寡聚物包括選自SEQ ID NOs1-99，143，147，151，163-260，287，289和300-460的序列核堿基寡聚物。希望是由上述的一個(gè)或多個(gè)SEQ ID NOs.組成(或基本由其組成)。例如，核堿基寡聚物可以包括選自SEQ ID NOs 97，98，99，143，147，151，287和289，SEQ IDNOs 300-389，或SEQ ID NOs 390-460的序列。在一個(gè)特別合乎需要的實(shí)施例中，本發(fā)明描述了具有十一個(gè)DNA殘基的核堿基寡聚物，其中在DNA殘基兩側(cè)都側(cè)接了四個(gè)2′-O-甲基RNA殘基，核堿基寡聚物由下列序列中的一個(gè)組成5′-AUUGGTTCCAATGTGUUCU-3′(SEQ ID NO155)；5′-ACACGACCGCTAAGAAACA-3′(SEQ ID NO16)；5′-ACAGGACTACCACTTGGAA-3′(SEQ ID NO157)；5′-UGCCAGTGTTGATGCUGAA-3′(SEQ ID NO27)；5′-GCUGAGTCTCCATATUGCC-3′(SEQ ID NO141)；5′-UCGGGTATATGGTGTCUGA-3′(SEQ ID NO41)；5′-AAGC ACTGCACTTGGUCAC-3′(SEQ ID NO47)；5′-CCGGCCCAAAACAAAGAAG-3′(SEQ ID NO51)；5′-ACCCTGGATACCATTUAGC-3′(SEQ ID NO63)；5′-UGUCAGTACATGTTGGCUC-3′(SEQ ID NO161)和5′-UGCACCCTGGATACCAUUU-3′(SEQ ID NO151)。
在另一個(gè)實(shí)施例中，反義IAP核堿基寡聚物的長(zhǎng)度可達(dá)30堿基，并包括選自SEQ ID NOs461-490的序列的至少八個(gè)連續(xù)堿基。
能夠與化療劑結(jié)合施用的其它反義IAP核堿基寡聚物是那些在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與編碼IAP多肽的多核苷酸雜交的寡聚物，其中IAP多肽選自NAIP(Bircl)，HIAP1(cIAP2，API2，MIHC，hITA)，HIAP2(cIAP1，MIHB)，XIAP(hILP，hILP1，MIHA，API3)，存活蛋白(survivin)(TIAP，MIHD，API4)，livin(KIAP，ML-IAP，cIAP3，HIAP3)和hILP2(Ts-IAP，TIAP)。
在本發(fā)明的方法中使用的核堿基寡聚物可以包括至少一個(gè)修飾鍵(例如硫代磷酸酯，磷酸甲酯，磷酸三酯，二硫代磷酸酯或phosphoselenate連接)，修飾的堿基(例如5-甲基胞嘧啶)，和/或修飾的糖部分(例如2′-氧-甲氧乙基或2′-氧-甲基)。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡聚物是嵌和寡聚物(例如，包含通過(guò)硫磷?；蛄姿岫ユI連接在一起的DNA殘基的寡核苷酸，其中DNA殘基的兩側(cè)都側(cè)接了至少一個(gè)，兩個(gè)，三個(gè)或四個(gè)通過(guò)硫磷酰連接在一起的2′-氧-甲基RNA殘基)。
另一個(gè)方面，本發(fā)明描述了增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)凋亡的方法。這些方法包括同時(shí)或在彼此相距28天內(nèi)給細(xì)胞施用反義IAP核堿基寡聚物和化療劑的步驟，施用的總量足以增強(qiáng)凋亡。細(xì)胞可以在體外(ex vivo)或在活體內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞是癌細(xì)胞(例如人癌細(xì)胞)，淋巴或骨髓來(lái)源的細(xì)胞。
癌癥可以是，例如急性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓細(xì)胞性白血病、急性成髓細(xì)胞性白血病、急性早幼粒細(xì)胞性白血病、急性髓單核細(xì)胞性白血病、急性單核細(xì)胞性白血病、急性紅白血病、慢性白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、骨髓發(fā)育不良綜合征、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、真性紅細(xì)胞增多癥、淋巴瘤、何杰金(Hodgkin’s)病、Waldenstrom氏巨球蛋白血癥、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、Ewing氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎癌、Wilm氏瘤、宮頸癌、子宮癌、睪丸癌、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、腦(脊)膜瘤、黑色素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤或成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤。治療癌癥時(shí)，同時(shí)也施用一種或多種另外的化療劑，生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑和/或化學(xué)致敏劑是可取的。希望的情形是施用核堿基寡聚物的28天內(nèi)施用一種或多種這些制劑。
可以通過(guò)相同或不同的途徑來(lái)施用化療劑和核堿基寡聚物。可以使用任何能使目的位點(diǎn)藥物達(dá)到有效量的給藥途徑，特別可取的途徑是靜脈內(nèi)施用和瘤內(nèi)施用。
另一方面，本發(fā)明描述了包括化療劑和反義IAP核堿基寡聚物的藥物組合物，其中化療劑和反義IAP核堿基寡聚物的總量加在一起足以治療患有增生性疾病(例如癌癥)的患者。如果需要，藥物組合物可以更進(jìn)一步地包括另外的組分(例如膠態(tài)分散系統(tǒng))。
本發(fā)明也描述了通過(guò)給患者施用化療劑和催化RNA分子，或編碼這種催化RNA分子的表達(dá)載體來(lái)治療患有增生性疾病，例如患有癌癥，淋巴組織增生紊亂的患者的方法，其中化療劑和催化RNA分子可同時(shí)施用，或在彼此相距28天內(nèi)施用，它們的總量加在一起足以治療患者。在可取的實(shí)施例中，催化RNA分子包括，在其結(jié)合臂中，至少八個(gè)連續(xù)的相當(dāng)于反義IAP核堿基寡聚物的堿基(例如表2，3，7，8和9中的任何一個(gè)的堿基序列)。希望的RNA分子可以位于錘頭狀基序中，也可以位于發(fā)夾結(jié)構(gòu)，δ肝炎病毒，組I內(nèi)含子，VS RNA或RNaseP RNA基序中。
本發(fā)明也描述了通過(guò)給患者施用化療劑和具有21--29個(gè)核堿基的雙鏈RNA分子來(lái)治療患有癌癥或淋巴組織增生紊亂的患者的方法，其中至少八個(gè)連續(xù)的核堿基相當(dāng)于反義IAP核堿基寡聚物(例如表2，3，7，8和9中的任何一個(gè)的堿基序列)?？赏瑫r(shí)或在彼此相距28天內(nèi)施用化療劑和雙鏈RNA分子，使用的總量加在一起足以治療患者。
另一方面，本發(fā)明也描述了通過(guò)給患者施用化療劑和具有50--70個(gè)堿基的雙鏈RNA分子來(lái)治療患有癌癥或淋巴組織增生紊亂的患者的方法，其中RNA分子具有一個(gè)長(zhǎng)度為21--29個(gè)堿基的第一域，堿基包含相當(dāng)于反義IAP核堿基寡聚物(例如表2，3，7，8和9中的任何一個(gè)的堿基序列)的至少八個(gè)連續(xù)的核堿基；與第一域互補(bǔ)的第二域以及位于第一域和第二域之間，使第一域和第二域能形成雙鏈RNA分子的環(huán)狀域?？赏瑫r(shí)或在彼此相距28天內(nèi)施用化療劑和雙鏈RNA分子，施用的總量加在一起足以治療患者。
本發(fā)明也描述了幾種試劑盒。這種試劑盒包括(i)長(zhǎng)度為八到三十個(gè)核堿基之間的反義IAP核堿基寡聚物；(ii)化療劑；和(iii)給患有增生性疾病的患者施用化療劑和反義IAP核堿基寡聚物的說(shuō)明書，其中化療劑和反義IAP核堿基寡聚物的總量加在一起足以治療增生性疾病。
本發(fā)明的另一個(gè)試劑盒包括(i)長(zhǎng)度為八到三十個(gè)堿基之間的反義IAP核堿基寡聚物；(ii)給患有增生性疾病的患者施用化療劑和反義IAP核堿基寡聚物的說(shuō)明書，其中化療劑和反義IAP核堿基寡聚物的的總量加在一起足以治療增生性疾病。
然而本發(fā)明的另一個(gè)試劑盒包括(i)本發(fā)明的組合物(如上所述)；(ii)給患有增生性疾病的患者施用組合物的說(shuō)明書，其中組合物的量足以治療增生性疾病。
″核堿基寡聚物″指包括至少八個(gè)通過(guò)連接基團(tuán)連接在一起的核堿基形成的鏈的化合物。天然和非天然的寡核苷酸，修飾或未修飾的，以及寡核苷酸模擬物，例如肽核酸(PNA)，鎖核酸(locked nucleic acids)(LNA)和阿拉伯核酸(arabinonucleic acid)(ANA)都包括在該定義的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的核堿基寡聚物中可以使用多種核堿基和連接基團(tuán)，包括下文標(biāo)題為″寡核苷酸及其它核堿基寡聚物″的部分中詳細(xì)描述那些核堿基和連接基團(tuán)。
″蛋白質(zhì)″或″多肽″或″多肽片段″指不論是否發(fā)生了翻譯后修飾(例如糖基化作用或磷酸化作用)的任何超過(guò)兩個(gè)氨基酸的鏈，它構(gòu)成天然多肽或肽的全部或一部分，或者構(gòu)成非天然多肽或肽。
凋亡指細(xì)胞死亡的過(guò)程，在該過(guò)程中，瀕死細(xì)胞顯示出一組容易表征的生物化學(xué)標(biāo)志，包括細(xì)胞膜起泡，細(xì)胞體皺縮，染色質(zhì)凝縮和DNA梯狀條帶(laddering)。
″IAP基因″指具有至少一個(gè)BIR域，通過(guò)其它胞內(nèi)或胞外遞送方法供給時(shí)能調(diào)整(抑制或增強(qiáng))細(xì)胞或組織凋亡的多肽的編碼基因(例如，參見美國(guó)專利No.5,919,912)。在優(yōu)選實(shí)施例中，IAP基因是與人或鼠XIAP，HIAP1或HIAP2(美國(guó)專利No.6,156,535中對(duì)每一個(gè)都進(jìn)行了描述)中的至少一個(gè)具有大約50％或更高核苷酸序列同一性(例如至少85％，90％或95％)的基因。優(yōu)選的測(cè)定同一性的序列區(qū)域是編碼至少一個(gè)BIR域和鋅指域的區(qū)域。哺乳動(dòng)物IAP基因包括分離自任何來(lái)源的哺乳動(dòng)物的核苷酸序列。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物是人。
″IAP蛋白″或″IAP多肽″指IAP基因編碼的多肽或其片段。IAP多肽包括NAIP(Bircl)，HIAP1(cIAP2，API2，MIHC，hITA)，HIAP2(cIAP1，MIHB)，XIAP(hILP，hILP1，MIHA，API3)，存活蛋白(survivin)(TIAP，MIHD，API4)，livin(KIAP，ML-IAP，cIAP3HIAP3)和hILP2(Ts-IAP，TIAP)。
″IAP生物活性″指IAP多肽在體內(nèi)或體外產(chǎn)生的任何活性。
″增強(qiáng)凋亡″指增加給定的細(xì)胞群體(例如癌細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，或任何其它細(xì)胞)中發(fā)生凋亡的細(xì)胞的數(shù)量。應(yīng)理解在一個(gè)給定的測(cè)定方法中，增強(qiáng)凋亡的化合物產(chǎn)生的凋亡增強(qiáng)程度會(huì)發(fā)生變化，但本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的凋亡水平變化，而該變化能鑒定出IAP限制的能增強(qiáng)凋亡的其它核堿基寡聚物。優(yōu)選地，″增強(qiáng)凋亡″指相對(duì)于未施用本發(fā)明的核堿基寡聚物，但其它處理的方式實(shí)質(zhì)上相似的情形，發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)目增加10％，更優(yōu)選增加25％或更多，最優(yōu)選增加至少一倍。監(jiān)測(cè)的樣品優(yōu)選是那些通常凋亡不充分的細(xì)胞樣品(即癌細(xì)胞)。這里描述了檢測(cè)凋亡水平變化(即增強(qiáng)或減弱)的方法。
抑制靶基因(例如，IAP)表達(dá)的核堿基寡聚物指相對(duì)于未處理的對(duì)照組，能減少至少大約5％的靶mRNA的量或靶mRNA編碼的蛋白質(zhì)的量的寡聚物，更優(yōu)選減少至少大約10％，25％，甚至50％。測(cè)量mRNA和蛋白水平的方法為本領(lǐng)域所熟知；在這里描述了示例性方法。
″雜交″指互補(bǔ)堿基之間的氫鍵連結(jié)，可以是Watson-Crick，Hoogsteen或反向Hoogsteen氫鍵連結(jié)。例如腺嘌呤和胸腺嘧啶是通過(guò)氫鍵形成配對(duì)的互補(bǔ)堿基。
″增生性疾病″指由于不適當(dāng)?shù)母咚郊?xì)胞分裂，不適當(dāng)?shù)牡退降蛲龌騼烧咭鸹驅(qū)е碌募膊?。癌癥是增生性疾病的一個(gè)實(shí)例，癌癥的實(shí)例包括但不限于白血病(例如急性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓細(xì)胞性白血病、急性成髓細(xì)胞性白血病、急性早幼粒細(xì)胞性白血病(acutepromyelocytic leukemia)、急性髓單核細(xì)胞性白血病、急性單核細(xì)胞性白血病、急性紅白血病、慢性白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病)、真性紅細(xì)胞增多癥、淋巴瘤(何杰金氏病，非何杰金氏病)、Waldenstrom氏巨球蛋白血癥、重鏈疾病以及實(shí)體瘤，例如肉瘤和癌(如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、Ewing氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰癌(pancreatic cancer)、乳腺癌(breastcancer)、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎癌、Wilm氏瘤、宮頸癌、子宮癌、睪丸癌、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、腦(脊)膜瘤、黑色素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤或成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤)。淋巴組織增生紊亂也被認(rèn)為是增生性疾病。
優(yōu)選地，本發(fā)明的方法中使用的核堿基寡聚物存在于一般不經(jīng)受足夠凋亡的細(xì)胞中時(shí)能夠增強(qiáng)凋亡和/或降低IAP mRNA或蛋白水平。相對(duì)于對(duì)照，增加量?jī)?yōu)選為至少10％，更優(yōu)選為25％，最優(yōu)選為1倍或1倍以上。本發(fā)明的方法中使用的合乎需要的核堿基寡聚物包括大約8--30個(gè)堿基。在某些實(shí)施方案中，至少八個(gè)連續(xù)的堿基來(lái)源于選自SEQ ID NOs1-99，143，147，151，163-260，287，289，300-490的序列。本發(fā)明的核堿基寡聚物也可以包含，例如，與編碼IAP多肽的多核苷酸互補(bǔ)的另外的20，40，60，85，120或更多個(gè)連續(xù)的堿基。核堿基寡聚物(或其一部分)可以包含修飾的骨架。硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，及其它修飾的骨架本領(lǐng)域已經(jīng)公知。核堿基寡聚物也可以包含一個(gè)或多個(gè)非天然連接。
″患者″指任何動(dòng)物(例如人)?？梢岳帽景l(fā)明的方法，組合物和試劑盒進(jìn)行治療的非人患者包括馬、狗、貓、豬、山羊、兔子、倉(cāng)鼠、猴子、豚鼠(guinea pigs)、大鼠、小鼠、蜥蜴(lizard)、蛇、羊、牛、魚和鳥。
″化療劑″指用來(lái)殺死癌細(xì)胞或減慢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的試劑。因此，細(xì)胞毒性劑和細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑都被認(rèn)為是化療劑。示例性化療劑有紫杉烷類(taxanes)(例如，紫杉醇、多西它賽(doxetaxel)、RPR109881A、SB-T-1213、SB-T-1250、SB-T-101187、BMS-275183、BRT 216、DJ-927、MAC-321、IDN5109和IDN5390)、長(zhǎng)春花生物堿(vinca alkaloids)(例如，長(zhǎng)春花新堿(vincristine)、長(zhǎng)春花堿(vinblastine)、脫乙酰長(zhǎng)春花堿(vindesine)、長(zhǎng)春氟寧(vinflunine)、長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine)和脫水長(zhǎng)春堿(anhydrovinblastine))、多拉司它汀(dolastatins)(多拉司它汀-10、多拉司它汀-15、ILX651、T2T-1027、symplostatin1、symplostatin3和LU103793)、隱藻素(cryptophycins)(例如，隱藻素1和隱藻素52)、埃博霉素(epothilones)(例如，埃博霉素A、埃博霉素B、脫氧埃博霉素B和埃博霉素B內(nèi)酰胺)、艾榴素(eleutherobin)、discodermolide、2-epi-discodermolide、2-des-methyldiscodermolide、5-hydroxymethyldiscodermolide、19-des-aminocarbonyldiscodermolide、9(13)-cyclodiscodermolide和laulimalide。其它的化療劑列見下表1。
″生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑″指能促進(jìn)或恢復(fù)免疫系統(tǒng)抵抗病原體能力的試劑。一些，但不是全部的生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑可以減慢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此也被認(rèn)為是化療劑。生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑的實(shí)例有干擾素(α，β，γ)、白細(xì)胞介素-2、利妥昔單抗(rituximab)和曲妥單抗(trastuzumab)。
″化學(xué)致敏劑″指使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療效應(yīng)更敏感的試劑。
″淋巴組織增生紊亂″指淋巴系統(tǒng)的細(xì)胞(例如，T細(xì)胞和B細(xì)胞)出現(xiàn)異常增殖的紊亂。
″核酶″指具有酶活性，對(duì)靶RNA分子具有位點(diǎn)特異性和切割能力的RNA。核酶可用于降低多肽的表達(dá)。例如Turner et al(Adv.Exp.Med.Biol.465303-318，2000)和Norris et al(Adv.Exp.Med.Biol.465293-301，2000)描述了利用核酶降低多肽表達(dá)的方法。
″報(bào)告基因″指編碼表達(dá)可以被測(cè)定的多肽的基因；這種多肽包括但不限于葡糖醛酸酶(GUS)、熒光素酶、氯霉素轉(zhuǎn)乙酰酶(CAT)和β-半乳糖苷酶。
″啟動(dòng)子″指足以指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的多核苷酸。
″操作性連接″指當(dāng)適當(dāng)?shù)姆肿?例如，轉(zhuǎn)錄活化蛋白質(zhì))連接到第二多核苷酸上時(shí)，第一多核苷酸靠近指導(dǎo)第一多核苷酸轉(zhuǎn)錄的第二多核苷酸。
從下文中描述的優(yōu)選實(shí)施例和權(quán)利要求書可以明顯看出本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A-1L是顯示相對(duì)于總蛋白，反義XIAP寡核苷酸對(duì)XIAP蛋白表達(dá)的影響的圖(圖1A、1C、1E、1G、1I和1K)。圖1B、1D、1F、1H、1J和1L是顯示與模擬轉(zhuǎn)染結(jié)果相比較的，用于將上述XIAP蛋白質(zhì)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化的每一個(gè)寡核苷酸轉(zhuǎn)染的總蛋白濃度值的圖。
圖2A-2C是顯示單獨(dú)或聯(lián)合使用的各種反義XIAP寡核苷酸對(duì)XIAPRNA(圖2A)和蛋白質(zhì)(圖2B)的影響的圖。圖2C是顯示與模擬轉(zhuǎn)染結(jié)果相比較的，用于將圖2B中顯示的XIAP蛋白質(zhì)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化的每一個(gè)寡核苷酸轉(zhuǎn)染的總蛋白濃度值的圖。
圖3和4圖是顯示31nM(圖3)或63nM(圖4)的4x4混合骨架(MBO)FG8或E12寡核苷酸的影響的圖。在一天，或連續(xù)兩天或三天里用125nMMBOs和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染H460肺癌細(xì)胞18小時(shí)。在標(biāo)明的時(shí)間處收集用于蛋白質(zhì)印跡分析的樣品。實(shí)施光密度掃描，參照GAPDH將XIAP蛋白水平標(biāo)準(zhǔn)化，并與設(shè)置為100％的模擬對(duì)照進(jìn)行比較。標(biāo)明的百分比表示相對(duì)于特異性混雜(scrambled)對(duì)照的XIAP蛋白質(zhì)下降的百分比。
圖5A-5D是顯示反義XIAP寡核苷酸對(duì)細(xì)胞成活力的影響(圖5A，5C和5D)，以及阿霉素(adriamycin)存在時(shí)的化學(xué)致敏作用的圖(圖5B)。
圖6是顯示寡核苷酸在體外介導(dǎo)H460細(xì)胞中特異性XIAP mRNA下調(diào)的圖。圖中描繪的是單獨(dú)用Lipofectamine 2000(LFA)處理，或用Lipofectamine 2000與1.2O M(μM)的F3、G4、C5、AB6、DE4或D7一起，或用各自的反極性(RP)或混雜的(SC)寡核苷酸對(duì)照處理的H460細(xì)胞的XIAP mRNA水平。在轉(zhuǎn)染6小時(shí)后實(shí)施實(shí)時(shí)RT-PCR，定量檢測(cè)XIAPmRNA的相對(duì)量。顯示的所有數(shù)據(jù)都是從典型實(shí)驗(yàn)中獲得的三重?cái)?shù)據(jù)的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。在相同實(shí)驗(yàn)條件保持的未處理細(xì)胞(對(duì)照)中的XIAPmRNA水平被定為數(shù)值1。
圖7是顯示用各種的PS-XIAP寡核苷酸轉(zhuǎn)染后的H460細(xì)胞中的XIAPRNA水平的圖。用1uM的PS寡核苷酸和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染H460人肺癌細(xì)胞6小時(shí)。然后收集細(xì)胞進(jìn)行Taqman分析。
圖8是顯示用4X4MBOs轉(zhuǎn)染9小時(shí)后的H460細(xì)胞中的XIAP RNA水平的圖。利用62.5nM至1uM的4X4MBOs和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染H460細(xì)胞9小時(shí)。然后收集細(xì)胞進(jìn)行Taqman分析。
圖9是顯示用4X4MBOs轉(zhuǎn)染24小時(shí)后的H460細(xì)胞中的XIAP蛋白質(zhì)knockdown的圖。用1uM的1uM 4X4MBOs和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染H460細(xì)胞24小時(shí)。然后收集細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。實(shí)施光測(cè)密掃描，參照肌動(dòng)蛋白將XIAP蛋白水平標(biāo)準(zhǔn)化，并與設(shè)置為100％的特異混雜(sm、rm)對(duì)照進(jìn)行比較。
圖10A和10B是顯示反義寡核苷酸在體外介導(dǎo)H460細(xì)胞中的XIAP蛋白質(zhì)特異性下調(diào)的簡(jiǎn)圖。其中描述了用Lipofectamine 2000單獨(dú)(LFA)處理的H460細(xì)胞，或者用LFA和1.2uM XIAP寡核苷酸F3，G4或C5，或它們各自的寡核苷酸對(duì)照(RP，SC)處理的H460細(xì)胞中的XIAP蛋白水平。采用免疫印跡來(lái)分析XIAP蛋白水平(圖10A)，采用光密度法對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行定量(圖10B)。參照細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白水平將XIAP水平標(biāo)準(zhǔn)化，并與未處理的對(duì)照(CNT)水平進(jìn)行比較。
圖11A和11B是顯示XIAP寡核苷酸介導(dǎo)的胱冬酶活化效應(yīng)的簡(jiǎn)圖。其中顯示了與對(duì)照與相比，1.2uM的XIAP寡核苷酸F3，G4或C5，或它們各自的RP和SC ODN對(duì)照對(duì)轉(zhuǎn)染的H460細(xì)胞中的前胱冬酶-3，PARP(全長(zhǎng)(116kDa)和加工后的(85kDa))(圖10A)的表達(dá)，以及Bcl-2和Bax蛋白水平(圖10B)的影響。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析(western blotting)蛋白質(zhì)的表達(dá)。參照細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白水平將Bcl-2和Bax蛋白水平標(biāo)準(zhǔn)化，并通過(guò)光密度法進(jìn)行定量。用兩個(gè)或三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)來(lái)顯示Bcl-2/Bax的比值，對(duì)照細(xì)胞(CNT)中的比值設(shè)置為1。
圖12A和12B是顯示XIAP寡核苷酸特異性誘導(dǎo)凋亡的簡(jiǎn)圖。測(cè)量用1.2uM的XIAP G4 AS寡核苷酸，G4 SC寡核苷酸的處理的H460細(xì)胞或未處理的對(duì)照(CNT)中誘導(dǎo)的凋亡。圖12A顯示了用碘化丙啶(propidiumiodide)(PI)染色和流細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定的具有亞-GO/Gl(凋亡的)DNA含量的細(xì)胞的百分比。圖12B顯示了DAPI染色的寡核苷酸處理的H460細(xì)胞的核形態(tài)學(xué)。箭頭表示具有核DNA凝縮或斷裂的特征性凋亡形態(tài)學(xué)的細(xì)胞。
圖13A是顯示XIAP G4 AS寡核苷酸處理對(duì)H460細(xì)胞成活力的影響的圖。用濃度逐漸增加的單獨(dú)的LFA，或LFA與G4 AS寡核苷酸或G4 SC寡核苷酸形成的寡核苷酸復(fù)合物處理細(xì)胞，在處理24小時(shí)后通過(guò)MTT法確定細(xì)胞成活力。數(shù)據(jù)代表三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)±SD。
圖13B是顯示存在或不存在阿霉素(DOX)，紫杉酚，vinorelbine(VNB)或依托撲沙(Etoposide)(Etop)時(shí)，用0.4uM的LFA，以及LFA與G4 AS寡核苷酸或G4 SC寡核苷酸的復(fù)合物處理后通過(guò)MTT法測(cè)定的死亡的H460細(xì)胞的百分比的圖。數(shù)據(jù)代表三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)±SD。
圖14是顯示用XIAP AS 2x2 MBOs和長(zhǎng)春瑞濱處理的小鼠體內(nèi)H460腫瘤相對(duì)生長(zhǎng)的圖。對(duì)攜帶皮下H460細(xì)胞異種移植的SCID-RAG2小鼠實(shí)施瘤內(nèi)注射寡核苷酸，劑量為50ug/g腫瘤質(zhì)量。將這些治療與施用長(zhǎng)春瑞濱聯(lián)合。
圖15是顯示用XIAP AS PS寡核苷酸進(jìn)行全身治療的小鼠體內(nèi)平均H460細(xì)胞腫瘤大小的圖。相對(duì)于對(duì)照，通過(guò)系統(tǒng)給藥方式(I.P.)(腹膜內(nèi))給皮下植入了H460細(xì)胞異種移植物的SCID-RAG2小鼠施用XIAP AS PS寡核苷酸能降低腫瘤大小。
圖16是顯示用XIAP AS PS寡核苷酸進(jìn)行全身治療的小鼠體內(nèi)的MDA-MB-435/LCC6人乳腺癌細(xì)胞(LCC細(xì)胞)腫瘤大小的圖。相對(duì)于對(duì)照，通過(guò)系統(tǒng)給藥方式(腹膜內(nèi))給乳房脂墊內(nèi)植入了LCC6細(xì)胞異種移植物的雌性SCID-RAG2小鼠施用XIAP AS PS寡核苷酸能降低腫瘤大小。
圖17是顯示G4寡核苷酸對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤XIAP蛋白水平的體內(nèi)影響的簡(jiǎn)圖。顯示了系統(tǒng)施用的裸XIAP G4 AS寡核苷酸或G4 SC寡核苷酸對(duì)雄性SCID-RAG2小鼠體內(nèi)皮下H460細(xì)胞異種移植物生長(zhǎng)的抗腫瘤效力。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±SEM(n＝6只小鼠/組)表示。
圖18A和18B是描述用G4 AS寡核苷酸，G4 SC寡核苷酸或單獨(dú)的載體處理21天后，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析和光密度法定量獲得的SCID-RAG2小鼠體內(nèi)的H460腫瘤異種移植物中的XIAP蛋白質(zhì)表達(dá)水平的簡(jiǎn)圖。參照細(xì)胞肌動(dòng)蛋白水平將XIAP水平標(biāo)準(zhǔn)化。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±SD(n＝3)表示。
圖19A和19B顯示系統(tǒng)施用15mg/kg的XIAP G4 AS寡核苷酸或G4 SC寡核苷酸21天后，G4寡核苷酸對(duì)植入到SCID-RAG2小鼠體內(nèi)的H460腫瘤的病理組織學(xué)的體內(nèi)影響的顯微照片。圖19A描繪了用蘇木精和伊紅染色的腫瘤切片。圖19B是顯示腫瘤切片中的泛素表達(dá)的免疫組織化學(xué)圖片。顯示了有代表性的腫瘤顯微照片。內(nèi)在的比例尺標(biāo)記為100um。
圖20A和20B是顯示長(zhǎng)春瑞濱(VNB)與XIAP寡核苷酸聯(lián)合施用時(shí)，體內(nèi)效力增強(qiáng)的圖。在SCID-RAG2小鼠體內(nèi)確定了有或沒(méi)有XIAP G4 AS寡核苷酸或G4 SC寡核苷酸時(shí)，長(zhǎng)春瑞濱對(duì)H460腫瘤異種移植物的抗腫瘤效力。圖20A描述了單一試劑的抗腫瘤活性，圖20B描述了VNB和G4寡核苷酸聯(lián)合的抗腫瘤活性。用均數(shù)±SEM(n＝6只小鼠/組)表示所有數(shù)據(jù)。
圖21是顯示HIAP1寡核苷酸對(duì)HIAP1 RNA水平的影響的圖。
圖22A和22B是顯示蛋白質(zhì)印跡的密度計(jì)掃描的簡(jiǎn)圖，該圖顯示了HIAP1寡核苷酸對(duì)細(xì)胞阻斷放線菌酮誘導(dǎo)的HIAP1蛋白質(zhì)上調(diào)的能力的影響。
圖23是顯示HIAP1寡核苷酸對(duì)細(xì)胞毒性影響的圖，其中利用總蛋白來(lái)進(jìn)行測(cè)定。
圖24是顯示驗(yàn)證HIAP1寡核苷酸APO 2序列特異性的圖。
圖25是顯示HIAP1寡核苷酸化學(xué)致敏耐藥SF295惡性膠質(zhì)瘤的效應(yīng)的圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明描述了通過(guò)聯(lián)合施用本發(fā)明的堿基(nucleobase)寡聚物和化療劑，例如細(xì)胞毒性劑，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑或生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞凋亡的方法。希望的情形是同時(shí)或彼此相距28天內(nèi)施用兩種試劑。在某些實(shí)施方案中，化療劑是破裂或穩(wěn)定微管的試劑。例如化療劑可以是紫杉烷或長(zhǎng)春花生物堿。如果需要，也可以施用化學(xué)致敏劑(即，使增殖細(xì)胞對(duì)化療更敏感的試劑)。可以用上述試劑的任何組合來(lái)形成藥物組合物。這些藥物組合物可用來(lái)治療增生性疾病，例如癌癥或淋巴組織增生紊亂，或增生性疾病的癥狀。本發(fā)明的核堿基寡聚物/化療劑組合也可以與放療聯(lián)合，用于治療癌癥或其它增生性疾病。
活化癌細(xì)胞的凋亡為改進(jìn)患者對(duì)常規(guī)化療或放療的反應(yīng)提供了可能有用的新途徑。就直接抑制胱冬酶和凋亡的能力來(lái)說(shuō)，XIAP是IAP基因家族中最有效的成員。我們通過(guò)反義(AS)寡核苷酸研究了XIAP下調(diào)對(duì)非小細(xì)胞肺癌(NCI-H460)體外和體內(nèi)生長(zhǎng)的影響。在培養(yǎng)的H460人肺癌細(xì)胞中，寡核苷酸G4 AS被確定為最有效的化合物，通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR和蛋白質(zhì)(western)印跡確定它能有效下調(diào)XIAP mRNA55％，下調(diào)蛋白水平達(dá)60％，濃度為1.2uM時(shí)能誘導(dǎo)60％的細(xì)胞死亡。相反，混雜的對(duì)照G4寡核苷酸幾乎不能導(dǎo)致XIAP損失，引起的細(xì)胞死亡也不到10％。前胱冬酶-3和PARP蛋白質(zhì)的降解，以及顯著的核DNA凝縮和片斷化已經(jīng)顯示用1.2uM的G4 AS處理可導(dǎo)致凋亡。而且，XIAP AS寡核苷酸可以使H460細(xì)胞對(duì)阿霉素，紫杉酚，長(zhǎng)春瑞濱和依托撲沙的細(xì)胞毒性影響敏感。在動(dòng)物模型中，我們證明通過(guò)腹腔內(nèi)給藥進(jìn)行全身治療時(shí)，15mg/kg的G4 AS對(duì)SCID/RAG2免疫缺陷小鼠的異種移植模型中的人H460腫瘤具有顯著的序列特異性生長(zhǎng)抑制效果。系統(tǒng)性施用AS ODN伴隨著腫瘤異種移植物中XIAP蛋白質(zhì)下調(diào)85％。將15mg/kg的G4 AS與5mg/kg的長(zhǎng)春瑞濱結(jié)合能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，效果超過(guò)單獨(dú)施用一種試劑的效果。這些研究表明XIAP的下調(diào)是肺癌細(xì)胞的有效死亡信號(hào)，而且在體外能誘導(dǎo)凋亡，在體內(nèi)能抑制腫瘤生長(zhǎng)。這些研究支持IAPs是治療人非小細(xì)胞肺癌和其它實(shí)體瘤的適宜靶標(biāo)的觀點(diǎn)。
治療可以在通常實(shí)施癌癥治療的任何地方家里，醫(yī)生的辦公室，診所，醫(yī)院的門診部或者醫(yī)院來(lái)提供這種治療。治療通常從醫(yī)院開始，這樣以便醫(yī)生能夠密切觀察治療的效果，并作出任何必須的調(diào)整。治療的持續(xù)時(shí)間取決于待治療的癌癥的種類，患者的年齡和狀況，患者疾病的分期和類型，以及患者的身體對(duì)治療的反應(yīng)?？梢砸圆煌拈g隔(例如每日，每周或每月)來(lái)給藥。為了使患者的身體有構(gòu)建健康新細(xì)胞和恢復(fù)體力的機(jī)會(huì)，可以采用包括間斷期的斷續(xù)周期來(lái)實(shí)施治療。
依據(jù)癌癥的種類和它的發(fā)展階段，治療可用于減慢癌癥的擴(kuò)散，減慢癌癥的生長(zhǎng)，殺死或延滯(arrest)已經(jīng)從原發(fā)腫瘤處擴(kuò)散到身體其它部分的癌細(xì)胞，減輕癌癥引起的癥狀或防止癌癥在第一位點(diǎn)出現(xiàn)。
這里使用的術(shù)語(yǔ)″癌癥″或″贅生物″(neoplasm)或″贅生性細(xì)胞″指以異常方式增殖的細(xì)胞集合。癌癥生長(zhǎng)不受控制，而且呈進(jìn)行性，在通常不引起或?qū)е抡＜?xì)胞增殖停止的情況下會(huì)發(fā)生。
為了給遭受細(xì)胞過(guò)度增殖引起的疾病折磨的患者施用化合物，可以利用常規(guī)的制藥實(shí)踐來(lái)提供適當(dāng)?shù)呐浞交蚪M合物?？梢栽诨颊叱霈F(xiàn)癥狀之前就開始給藥?？梢圆捎萌魏芜m當(dāng)?shù)耐緩絹?lái)給藥，例如可以是腸胃外、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、顱內(nèi)、眶內(nèi)、眼用、心室內(nèi)、肝內(nèi)、囊內(nèi)、鞘內(nèi)、腦池內(nèi)(intracisternal)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、氣溶膠、栓劑或口服給藥。例如治療的劑型可以是液體溶液或懸浮液形式；口服劑型可以是用片劑或膠囊形式；鼻內(nèi)劑型可以是粉劑、滴鼻劑或氣溶膠形式。
例如在″RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy″Ed.A.R.Gennaro，Lippincourt Williams & Wilkins，Philadelphia，PA，2000中已經(jīng)找到本領(lǐng)域制造這些劑型的公知方法。例如腸胃外給藥的劑型可以包含賦形劑，無(wú)菌水或鹽水，聚二醇，例如聚乙二醇，植物油或氫化萘。也可以用生物相容性的可生物降解的丙交酯聚合物，丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物來(lái)控制化合物的釋放。適合于IAP調(diào)節(jié)化合物的其它可能有用的腸胃外藥物遞送系統(tǒng)包括乙烯-醋酸乙烯共聚物顆粒，滲透泵，可植入的浸漬系統(tǒng)和脂質(zhì)體。吸入劑的劑型可以包含賦形劑，例如，乳糖，或者是包含如聚氧乙烯-9-月桂基醚，甘油膽酸鹽和脫氧膽酸鹽的水溶液，或者是適合以滴鼻劑或凝膠形式給藥的油性溶液。
可以給病人施用治療有效量(例如，防止，消除或者減少病理狀況的量)的這些制劑來(lái)提供對(duì)疾病或狀況的治療。本發(fā)明的核堿基寡聚物的優(yōu)選劑量可能取決于象紊亂的類型和程度，特殊患者的總體健康狀態(tài)，化合物賦形劑的組成和給藥途徑這樣的變量。
如上所述，如果愿意，可以將本發(fā)明的核堿基寡聚物治療與治療增生性疾病的治療方法(例如放療、外科手術(shù)或化療)聯(lián)合使用。
上述的任何使用方法中都希望通過(guò)靜脈內(nèi)給藥來(lái)施用本發(fā)明的核堿基寡聚物，或者將本發(fā)明的核堿基寡聚物應(yīng)用到需要凋亡發(fā)生的位點(diǎn)(例如通過(guò)注射)。
寡核苷酸及其它核堿基寡聚物至少兩種寡核苷酸即具有磷酸二酯(PO)或硫代磷酸酯(PS)鍵的多聚脫氧核苷酸會(huì)導(dǎo)致RNase H切割RNA。雖然2′-OMe-RNA序列對(duì)RNA靶呈現(xiàn)出高親合力，但這些序列不是RNase H的底物。可取的寡核苷酸是以包含寡聚脫氧核苷酸缺口的2′修飾寡核苷酸為基礎(chǔ)的寡核苷酸，其中一些或全部核苷酸之間的鍵被改變?yōu)閷?duì)核酸酶具有抗性的硫代磷酸酯。膦酸甲酯修飾的存在增加了寡核苷酸對(duì)靶RNA的親合力，因此降低了IC50。這些修飾也增加了修飾的寡核苷酸對(duì)核酸酶的抗性。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的方法和試劑可以和任何可能發(fā)展的技術(shù)，包括共價(jià)閉合多反義(covalently-closedmultiple antisense)(CMAS)寡核苷酸(Moon et al.，Biochem J.346295-303，2000；PCT公開號(hào)WO 00/61595)，帶狀反義(ribbon-type antisense)(RiAS)寡核苷酸(Moon et al.，J.Biol.Chem.2754647-4653，2000；PCT公開號(hào)WO00/61595)和大量環(huán)狀反義寡核苷酸(美國(guó)專利公開號(hào)US 2002/0168631 A1)聯(lián)合使用。
本領(lǐng)域已經(jīng)公知核苷是核堿基-糖結(jié)合物。核苷的堿基部分通常是雜環(huán)形堿基。這種雜環(huán)堿基中最普通的兩類是嘌呤和嘧啶。核苷酸是進(jìn)一步包括共價(jià)連接到核苷糖部分的磷酸基的核苷。對(duì)于那些包含五呋喃糖(pentofuranosyl sugar)的核苷，磷酸基可以連接到糖的2′，3′或5′羥基部分。在形成寡核苷酸時(shí)，磷酸基共價(jià)連接彼此相鄰的核苷形成線形聚合物。線形聚合體結(jié)構(gòu)的各個(gè)末端可以依次更進(jìn)一步地連接在一起形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)；通常優(yōu)選開放的線形結(jié)構(gòu)。通常認(rèn)為磷酸基在寡核苷酸結(jié)構(gòu)內(nèi)部形成寡核苷酸骨架。RNA和DNA的正常連接或骨架是3′-5′磷酸二酯鍵。
在本發(fā)明中有用的優(yōu)選核堿基寡聚物的具體實(shí)例包括含有修飾的骨架或非天然核苷間連接的寡核苷酸。在說(shuō)明書中已經(jīng)定義，具有修飾骨架的核堿基寡聚物包括那些在骨架中保留磷原子和那些在骨架中不含有磷原子的寡聚物。為了與說(shuō)明書相符合，核苷間骨架中沒(méi)有磷原子的修飾的寡核苷酸也被認(rèn)為是核堿基寡聚物。
具有修飾的寡核苷酸骨架的核堿基寡聚物包括，例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯，氨烷基磷酸三酯、甲基及其它烷基磷酸鹽，包括3′-烯基膦酸鹽和手性膦酸鹽、亞磷酸鹽(phosphinate)、磷酰胺酯(phosphoramidate)，包括3′氨基磷酰胺酯(3′-aminophosphoramidate)和氨烷基磷酰胺酯(aminoalkylphosphoramidates)、硫羧磷酰胺酯(thionophosphoramidates)、硫羧烷基膦酸鹽(thionoalkyphosphonates)、硫羧烷基磷酸三酯(thionoalkylhosphotriesters)、boranophosphates，其具有正常3′-5′鍵和它們的2′-5′連接類似物，以及具有相反極性的寡聚物，在具有相反極性的寡聚物中，采用3′-5′方向連接5′-3′方向或者2′-5′方向連接5′-2′方向的方式連接相鄰的核苷單元對(duì)。也包括各種鹽，混合鹽和游離酸形式的核堿基寡聚物。教導(dǎo)如何制備上述含磷連接的典型的美國(guó)專利包括，但不限于美國(guó)專利3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361和5,625,050，在此將每一篇文獻(xiàn)都引入作為參考。
具有修飾的不包含磷原子的寡核苷酸骨架的核堿基寡聚物具備由短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間連接，混合的雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間連接，或者一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間連接形成的骨架。這些包含那些具有嗎啉代連接(在核苷的糖部分中形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亞砜和砜骨架；formacetyl和thioformacetyl骨架；methylene formacetyl和thioformacetyl骨架；含有烯烴的骨架；氨基磺酸鹽骨架；methyleneimino和methylenehydrazino骨架；磺酸鹽和磺胺骨架；氨化物骨架；以及其它具有混合的N，O，S和CH2組成部分的骨架。教導(dǎo)如何制備上述寡核苷酸的典型的美國(guó)專利有美國(guó)專利5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,521,063；5,506,337；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,677,439；5,698,685和6,365,577，在此將每一篇文獻(xiàn)引入作為參考。
在其它的核堿基寡聚物中，糖和核苷間連接，即骨架都被新基團(tuán)替換。保留堿基(nucleobase)單元用于和IAP雜交。一個(gè)這樣的核堿基寡聚物被稱為肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被含有酰胺的骨架替換，特別地被氨乙基甘氨酸(aminoethylglycine)骨架替換。保留了堿基，而且堿基可直接或間接地與骨架酰胺部分的aza氮原子結(jié)合。例如，在″Peptide Nucleic AcidsProtocols and Applications″Ed.P.E.Nielsen，HorizonPress，Norfolk，United Kingdom，1999中描述了制造和使用這些核堿基寡聚物的方法。教導(dǎo)如何制備PNAs的典型的美國(guó)專利包含，但不限于美國(guó)專利5,539,082；5,714,331和5,719,262，在此將每一篇文獻(xiàn)引入作為參考。在Nielsen et al.，Science，1991，254，1497-1500中能找到對(duì)PNA化合物的更進(jìn)一步的教導(dǎo)。
在本發(fā)明的特別實(shí)施例中，核堿基寡聚物具有硫代磷酸酯骨架和雜原子骨架核苷，特別是CH2-NH-O-CH2-，-CH2-N(CH3)-O-CH2-(被稱為亞甲基(methylimino)或MMI骨架)，-CH2-O-N(CH3)-CH2-，-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-。在其它的實(shí)施例中，寡核苷酸具有美國(guó)專利5,034,506中描述的嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)。
核堿基寡聚物也可能包含一個(gè)或多個(gè)取代的糖部分。核堿基寡聚物在2′位置包括下列中的一個(gè)OH；F；O-，S-或N-烷基；O-，S-或N-烯基；O-，S-或N-炔基(alkynyl)；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可能是取代或未被取代的C1-C10的烷基或C2-C10的烯基和炔基。特別優(yōu)選的是O[(CH2)nO]mCH3，O(CH2)nOCH3，O(CH2)nNH2，O(CH2)nCH3，O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m為1至大約10。其它優(yōu)選的核堿基寡聚物在2′位置包含下列中的一個(gè)C1-C10低分子烷基，取代的低分子烷基，烷芳基，芳烷基，O-烷芳基或O-芳烷基，SH，SCH3，OCN，Cl，Br，CN，CF3，OCF3，SOCH3，SO2CH3，ONO2，NO2，NH2，雜環(huán)烷基(heterocycloalkyl)，雜環(huán)烷芳基(heterocycloalkaryl)，氨烷基氨基(aminoalkylamino)，聚氨烷基(polyalkylamino)，取代的甲硅烷基，RNA切割基團(tuán)，報(bào)告基團(tuán)，插入劑，改進(jìn)核堿基寡聚物藥物代謝動(dòng)力學(xué)性能的基團(tuán)，以及其它具有類似性能的取代基。優(yōu)選的修飾是2′-氧-甲基和2′--甲氧乙氧基)(2′-O-CH2CH2OCH3，也被稱為′-O-(2-甲氧乙基)或2′-MOE)。另一個(gè)可取的修飾是2′-雙甲氨基氧乙氧基(dimethylaminooxyethoxy)(即O(CH2)2ON(CH3)2)，也稱為2′-DMAOE。其它修飾包括2′-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)和2′-氟代(2′-F)。也可以在寡核苷酸或其它核堿基寡聚物上的其它位置進(jìn)行類似的修飾，特別是在3′末端核苷酸上的糖的3′位置，或者在2′-5′連接的寡核苷酸內(nèi)和5′末端核苷酸的5′位置。核堿基寡聚物也可以具有糖模擬物，例如用環(huán)丁基部分代替五呋喃糖(pentofuranosyl)。教導(dǎo)如何制備這種修飾的糖結(jié)構(gòu)的代表性的美國(guó)專利包括，但不限于美國(guó)專利4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633和5,700,920，在此將每一篇文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容引入作為參考。
核堿基寡聚物也可以包含堿基修飾或置換。這里使用的″未修飾的″或″天然的″堿基包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾的堿基包括其它合成的和天然的堿基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羥甲基胞嘧啶，黃嘌呤，次黃嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基及其它烷基衍生物；腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基及其它烷基衍生物；2-硫脲嘧啶(thiouracil)，2-硫胸腺嘧啶(thiothymine)和2-硫胞嘧啶(thiocytosine)；5-halouracil和胞嘧啶；5-丙炔尿嘧啶和胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶和胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫脲嘧啶；8-halo、8-氨基、8-硫醇，8-硫烷基，8-羥基及其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤；5-halo(例如，5-溴基)，5-三氟甲基及其它5-取代的脲嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤；7-去氮雜鳥嘌呤(deazaguanine)和7-去氮雜腺嘌呤(deazaadenine)；3-去氮雜鳥嘌呤(deazaguanine)和3-去氮雜腺嘌呤(deazaadenine)。更進(jìn)一步的堿基包括美國(guó)專利3,687,80中公開的那些堿基，以及The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering，pp.858-859，Kroschwitz，J.I.，Ed.，John Wiley & Sons，1990中公開的堿基，Englisch et al.，Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613中公開的堿基和Sanghvi，Y.S.，Chapter 15，Antisense Research and Applications，pp.289-302，Crooke，S.T.and Lebleu，B.，Ed.，CRC Press，1993中公開的堿基。這些堿基中的某些堿基對(duì)增加本發(fā)明的反義寡核苷酸的結(jié)合親合力特別有用。其中包括5-取代的嘧啶，6-氮雜嘧啶(azapyrimidines)，N-2，N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基嘌呤(aminopropyl adenine)，5-丙炔尿嘧啶(propynyluracil)和5-丙炔胞嘧啶(propynylcytosine)。已經(jīng)顯示5-甲基胞嘧啶置換使核酸二重穩(wěn)定性增加了0.6-1.2℃(degree.C)(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.and Lebleu，B.，eds.，Antisense Research and Applications，CRCPress，Boca Raton，1993，pp.276-278)，因此是合乎需要的堿基替換，特別是與2′-氧-甲氧乙基或2′-氧-甲基糖修飾結(jié)合時(shí)更是如此。教導(dǎo)如何制備上面提到的某些修飾的堿基，以及其它修飾的堿基的代表性的美國(guó)專利包括美國(guó)專利4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,681,941和5,750,692，在此將每一篇文獻(xiàn)引入作為參考。
本發(fā)明的核堿基寡聚物的另一種修飾涉及用化學(xué)方法將增強(qiáng)寡核苷酸活性，增強(qiáng)細(xì)胞分布或細(xì)胞攝取量的一個(gè)或多個(gè)部分或共軛物連接到核堿基寡聚物上。這種部分包括，但不限于脂質(zhì)部分，例如膽固醇部分(Letsingeret al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，866553-6556，1989)，膽酸(Manoharan et al.，Bioorg.Med.Chem.Let，41053-1060，1994)，硫醚，例如己基-S-三苯甲基巰基化合物(tritylthiol)(Manoharan et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，660306-309，1992；Manoharan et al.，Bioorg.Med.Chem.Let.，32765-2770，1993)，硫膽固醇(thiocholesterol)(Oberhauser et al.，Nucl.Acids Res.，20533-5381992)，脂肪鏈，例如十二二醇(dodecandiol)或十一烷基基殘基(Saison-Behmoaras et al.，EMBO J.，101111-1118，1991；Kabanov et al.，F(xiàn)EBS Lett.，259327-330，1990；Svinarchuk et al.，Biochimie，7549-54，1993)，磷脂，例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙銨(triethylammonium)1，2-二-氧-十六烷基-rac-甘油基-3-氫-膦酸鹽(Manoharan et al.，Tetrahedron Lett.，363651-3654，1995；Shea et al.，Nucl.Acids Res.，183777-3783，1990)，多胺或聚乙二醇鏈(Manoharan et al.，Nucleosides & Nucleotides，14969-973，1995)，金剛烷胺乙酸(Manoharan et al.，Tetrahedron Lett.，363651-3654，1995)，棕櫚酰部分(Mishra et al.，Biochim.Biophys.Acta，1264229-237，1995)，十八胺或己氨基-羧基-羥膽固醇部分(Crooke et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.，277923-937，1996)。教導(dǎo)如何制備這種核堿基寡聚物共軛物的代表性的美國(guó)專利有4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,828,979；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,948,882；4,958,013；5,082,830；5,109,124；5,112,963；5,118,802；5,138,045；5,214,136；5,218,105；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,414,077；5,416,203；5,451,463；5,486,603；5,510,475；5,512,439；5,512,667；5,514,785；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,578,717；5,578,718；5,580,731；5,585,481；5,587,371；5,591,584；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928；5,608,046和5,688,941，在此將每一篇文獻(xiàn)引入作為參考。
本發(fā)明也包括是嵌合化合物的核堿基寡聚物?！迩逗系摹搴藟A基寡聚物是包含兩個(gè)或更多個(gè)化學(xué)獨(dú)特區(qū)域的核堿基寡聚物，特別是寡核苷酸，其中每一個(gè)化學(xué)獨(dú)特區(qū)域由至少一個(gè)單體單元組成，當(dāng)核堿基寡聚物是寡核苷酸時(shí)，單體單元是核苷酸。這些核堿基寡聚物典型地包含至少一個(gè)核堿基寡聚物被修飾的區(qū)域，該修飾使核堿基寡聚物對(duì)核酸酶降解的抗性增加，使細(xì)胞對(duì)核堿基寡聚物的攝取量增多，和/或使核堿基寡聚物對(duì)靶核酸的結(jié)合親合力增高。核堿基寡聚物的另外區(qū)域可以作為能切割RNADNA或RNARNA雜交體的酶的底物。舉例來(lái)說(shuō)，RNase H是能切割RNADNA雙鏈體中的RNA的細(xì)胞核酸內(nèi)切酶。因此，激活RNase H可導(dǎo)致RNA靶標(biāo)被切割，從而能大大增強(qiáng)核堿基寡聚物抑制基因表達(dá)的效率。因此，當(dāng)使用嵌合的核堿基寡聚物時(shí)，與和相同目標(biāo)區(qū)雜交的硫代磷酸酯脫氧寡核苷酸相比，用較短的核堿基寡聚物經(jīng)?？梢垣@得可比較的結(jié)果。
兩個(gè)或更多個(gè)如上所述的核堿基寡聚物的復(fù)合結(jié)構(gòu)可以形成本發(fā)明嵌合的核堿基寡聚物。當(dāng)這種核堿基寡聚物是寡核苷酸時(shí)，在本領(lǐng)域也被稱為雜交體或gapmers。教導(dǎo)如何制備這種雜交結(jié)構(gòu)的典型的美國(guó)專利有美國(guó)專利5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356和5,700,922,在此將每一篇文獻(xiàn)全部引入作為參考。
可以利用公知的固相合成方法，象常規(guī)方便地制備出可在本發(fā)明中使用的核堿基寡聚物。幾家供應(yīng)商，包括，例如Applied Biosystems(Foster City，CA)在出售適合于這種合成的設(shè)備。可以另外使用或替換使用任何其它的適合這種合成的工具。已經(jīng)公知可利用類似的方法制備寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基衍生物。
也可以通過(guò)摻合，包封，結(jié)合或其它方式將本發(fā)明的核堿基寡聚物聯(lián)合到其它分子，分子結(jié)構(gòu)或化合物的混合物中，具體實(shí)例有有助于攝取，分布和/或吸收的脂質(zhì)體，受體靶分子，口服劑型，直腸給藥劑型，局部給藥劑型或其它劑型。教導(dǎo)如何制備有助于這種攝取，分布和/或吸收的劑型的代表性的美國(guó)專利有美國(guó)專利5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575和5,595,756，，在此將每一篇文獻(xiàn)引入作為參考。
本發(fā)明的核堿基寡聚物包括任何藥學(xué)上可接受的鹽、酯、或這種酯的鹽、或任何給施用患者時(shí)能夠提供(直接地或間接地)生物學(xué)活性代謝物或其殘留物的其它化合物。相應(yīng)地，公開內(nèi)容也涉及本發(fā)明的化合物的前藥和藥學(xué)上可接受的鹽，這種前藥的藥學(xué)上可接受的鹽及其它生物等效物。
術(shù)語(yǔ)″前藥″指以非活性形式被制備，在體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)通過(guò)內(nèi)源酶或其它的化學(xué)制劑和/或條件的作用能轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问?例如藥物)的治療劑。特別地，可以參照PCT WO93/24510或WO94/26764中公開的方法，將本發(fā)明的前藥形式的寡核苷酸制備成SATE[(S-乙酰-2-硫乙基)磷酸鹽]衍生物。
術(shù)語(yǔ)″藥學(xué)上可接受的鹽″指那些能保留母化合物的希望的生物活性，又不產(chǎn)生不希望的毒理學(xué)影響的鹽。用金屬或胺，例如堿和堿土金屬或有機(jī)胺可以形成藥學(xué)上可接受的堿添加鹽。用作陽(yáng)離子的金屬的實(shí)例有鈉、鉀、鎂、鈣等等。適當(dāng)?shù)陌返膶?shí)例有N，N′-二芐乙烯二胺、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽堿、二乙醇胺、二環(huán)己胺(dicyclohexylamine)、乙二胺茶堿、N-methylglucamine和procaine(例如參見Berge et al.，J.Pharma Sci.，661-19，1977)。用常規(guī)方式使游離酸和足量想要的堿接觸產(chǎn)生鹽制備出酸性化合物的堿添加鹽。按照常規(guī)方式使鹽接觸酸，并分離游離酸可再生游離酸。游離酸在某些物理性能方面，例如極性溶劑中的溶解度不同于它們各自的鹽形式，但在其它方面，對(duì)本發(fā)明的目的來(lái)說(shuō)，鹽相當(dāng)于它們各自的游離酸。這里使用的″藥物添加鹽″包括本發(fā)明的組合物的一種組分的藥學(xué)可接受的酸式鹽。這包括胺的有機(jī)或無(wú)機(jī)酸鹽。優(yōu)選的酸性鹽有鹽酸鹽、醋酸鹽、水楊酸鹽、硝酸鹽和磷酸鹽。其它適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)可接受鹽為本領(lǐng)域技術(shù)人員大家所熟知，包括多種無(wú)機(jī)和有機(jī)體酸的堿式鹽，例如無(wú)機(jī)酸，如鹽酸、氫溴酸、硫酸或磷酸；有機(jī)羧酸、磺酸、磺酸(sulfo)或膦酸或N取代的氨基磺酸、例如乙酸、丙酸、glycolic acid、琥珀酸、馬來(lái)酸、hydroxymaleic acid、甲基馬來(lái)酸、延胡索酸、蘋果酸、酒石酸、乳酸、草酸、葡糖酸、葡萄糖二酸、葡糖醛酸、檸檬酸、安息香酸、肉桂酸、扁桃酸、水楊酸、4-氨基水楊酸、2-苯氧基苯甲酸、2-鄰乙酰氧基苯甲酸、雙羥萘酸(embonic acid)、煙酸或異煙酸；氨基酸，例如自然界中蛋白質(zhì)合成涉及的20個(gè)α氨基酸，例如谷氨酸或天門冬氨酸，以及苯乙酸、甲磺酸、乙磺酸、2-羥基乙磺酸、乙烷-1，2-二磺酸、苯磺酸、4-甲基苯磺酸、萘-2-磺酸、萘-1，5-二磺酸、2-或3-磷酸甘油酸、葡糖-6-磷酸、N-環(huán)己氨磺酸(形成環(huán)己氨磺酸鹽)，或其它的有機(jī)酸化合物，例如抗壞血酸。也可以用藥學(xué)可接受的陽(yáng)離子來(lái)制備化合物的藥學(xué)可接受鹽。適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)可接受的陽(yáng)離子為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，包括堿性、堿土、銨和季銨陽(yáng)離子。碳酸鹽或碳酸氫鹽(hydrogen carbonate)也可以。
對(duì)于寡核苷酸及其它的核堿基寡聚物，適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)可接受鹽包括(i)由陽(yáng)離子，例如鈉、鉀、銨、鎂、鈣、多胺，例如精胺和亞精胺等等形成的鹽；(ii)由無(wú)機(jī)酸，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等等形成的酸添加鹽；(iii)由有機(jī)酸，例如，乙酸、草酸、酒石酸、丁二酸、馬來(lái)酸、延胡索酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、安息香酸、鞣酸、棕櫚酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、p-甲苯磺酸、萘二磺酸、多聚半乳糖醛酸等等；和(iv)由基本的陰離子，例如氯、溴和碘形成的鹽。
本發(fā)明也包括含有本發(fā)明的核堿基寡聚物的藥物組合物和劑型?？梢圆捎枚喾N方法施用本發(fā)明的藥物組合物，給藥方法取決于需要局部治療還是全身治療，以及待治療的區(qū)域。給藥可以是局部給藥(包括眼給藥和粘膜給藥，粘膜給藥包括陰道給藥和直腸給藥)，肺給藥，例如包括通過(guò)噴霧器吸入或吹入粉劑或氣溶膠，氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、表皮和經(jīng)皮給藥)、口服，或腸胃外給藥。腸胃外給藥包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)注射，浸漬給藥，或顱內(nèi)，例如鞘內(nèi)或心室內(nèi)給藥。
鎖核酸鎖(locked)核酸(LNAs)是能用于本發(fā)明的核堿基寡聚物。LNAs包含限制核苷酸類似物的呋喃核糖環(huán)的柔韌性的2′-O，4′-C亞甲橋，因此能將核苷酸類似物鎖定為剛性二環(huán)N型構(gòu)象。LNAs對(duì)某些外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶顯示出改進(jìn)的抗性，而且能活化RNAse H，可以合并到幾乎任何核堿基寡聚物中。而且，可以利用標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酰胺合成規(guī)程來(lái)制備包含LNA的核堿基寡聚物。在PCT WO99/14226和公開號(hào)為US2002/0094555 A1美國(guó)專利申請(qǐng)中可以找到關(guān)于LNAs的其它附加細(xì)節(jié)，在此將每一篇文獻(xiàn)引入作為參考。
阿拉伯核酸(Arabinonucleic acid)阿拉伯核酸(ANAs)也可以用于本發(fā)明的方法和試劑中。ANAs是以D-阿拉伯糖代替天然的D-2′-脫氧核糖為基礎(chǔ)的核堿基寡聚物。未衍生化的ANA類似物對(duì)RNA具有和硫代磷酸酯類似的結(jié)合親合力。當(dāng)用氟衍生阿拉伯糖(2′F-ANA)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致結(jié)合親合力的增強(qiáng)，形成的ANA/RNA和F-ANA/RNA雙鏈體中的結(jié)合RNA能高效發(fā)生選擇性水解。利用單純的L糖在這些類似物的末端進(jìn)行衍生作用可以使它們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)基中保持穩(wěn)定。例如在Damha et al.，Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids 20429-440，2001中討論了ANAs用于治療的用途。
核堿基寡聚物的遞送我們?cè)谶@里證明裸寡核苷酸能進(jìn)入腫瘤細(xì)胞并抑制IAP表達(dá)。但是，所希望的可能是利用有助于將寡核苷酸或其它核堿基寡聚物遞送到細(xì)胞的劑型(例如參見美國(guó)專利5,656,611，5,753613，5,785,992，6,120,798，6,221,959，6,346,613和6,353,055，在此將每一篇文獻(xiàn)引入作為參考)。
核酶包括本發(fā)明的反義IAP序列的催化RNA分子或核酶可用于抑制活體內(nèi)IAP多核苷酸的表達(dá)。將核酶序列包含在反義RNAs內(nèi)使它們具備了切割RNA的活性，因此增加了構(gòu)建物的活性。在Haseloff et al.，Nature 334585-591，1988和公開號(hào)為2003/0003469 A1的美國(guó)專利申請(qǐng)中描述了靶RNA特異的核酶的設(shè)計(jì)和使用，在此將每一篇文獻(xiàn)引入作為參考。
因此，本發(fā)明也描述了那些在結(jié)合臂中含有反義RNA的催化性RNA分子，其中反義RNA具有相當(dāng)于表1，2，6和7中所列出的任何一個(gè)序列的八至十九個(gè)連續(xù)堿基。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，催化核酸分子是在錘頭狀或發(fā)夾式基序中形成的，但也可以在δ肝炎病毒，組I內(nèi)含子或RNasePRNA(與RNA引導(dǎo)序列相關(guān))或脈孢菌VS RNA的基序中形成。Rossi et alAIDS Research和Human Retroviruses，8183，1992中描述了這種錘頭狀基序的實(shí)例。美國(guó)專利5,527,895；5,856,188和6,221,661中，以及Hampel and Tritz，Biochemistry，284929，1989和Hampel et al，Nucleic Acids Research，18299，1990中都描述了發(fā)夾式基序的實(shí)例。Perrotta and Been，Biochemistry，3116，1992中描述了δ肝炎病毒基序的實(shí)例。Guerrier-Takada et al，Cell，35849，1983中描述了RNaseP基序。Collins et al(Saville and Collins，Cell 61685-696，1990；Saville and Collins，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888826-8830，1991；Collins and Olive，Biochemistry 322795-2799，1993)描述了脈孢菌(Neurospora)VS RNA核酶基序。這些特異的基序并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到在本發(fā)明的酶核酸分子中重要的所有基序是那些具有與靶基因RNA的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域互補(bǔ)的特異性底物結(jié)合部位的基序，以及那些具有位于底物結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)或底物結(jié)合位點(diǎn)周圍，能賦予該分子RNA切割活性的的核苷酸序列的基序。
RNA干擾本發(fā)明的核堿基寡聚物可以用在雙鏈RNAs中來(lái)實(shí)施RNA干擾(RNAi)介導(dǎo)的IAP表達(dá)下調(diào)(knock-down)。RNAi是降低細(xì)胞的特定目的蛋白質(zhì)表達(dá)的方法(Tuschl，Chembiochem 2239-245，2001；Sharp，Genes & Devel.15485-490，2000；Hutvagner and Zamore，Curr.Opin.Genet.Devel.12225-232，2002和Hannon，Nature 418244-251，2002中進(jìn)行了綜述)。在RNAi中，典型的情形是在轉(zhuǎn)錄后通過(guò)細(xì)胞中雙鏈RNA(dsRNA)的存在來(lái)觸發(fā)基因沉默。這些dsRNA在細(xì)胞內(nèi)被處理成較短的被稱為小干擾RNAs(siRNAs)的片段。通過(guò)dsRNAs轉(zhuǎn)染或通過(guò)采用基于質(zhì)粒的表達(dá)系統(tǒng)的siRNAs表達(dá)將siRNAs引入細(xì)胞內(nèi)正逐漸地被用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生功能缺失表型。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，制備了包含發(fā)明核堿基寡聚物的八至十九個(gè)連續(xù)堿基的雙鏈RNA(dsRNA)分子。dsRNA可以是形成雙鏈的兩條分離的RNA鏈，或者是能自身形成雙鏈(小發(fā)夾式(sh)RNA)的單一RNA鏈。典型地，dsRNAs長(zhǎng)大約21或22個(gè)堿基對(duì)，但如果需要也可以更短些或更長(zhǎng)些(達(dá)到大約29個(gè)堿基)。利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如化學(xué)合成或體外轉(zhuǎn)錄)可以制備dsRNA。例如，從Ambion(Austin，TX)和Epicentre(Madison，WI)可以獲得試劑盒。在Brummelkamp et al.Science 296550-553，2002；Paddison et al.Genes & Devel.16948-958，2002；Paul et al.Nature Biotechnol.20505-508，2002；Sui et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 995515-5520，2002；Yu et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 996047-6052，2002；Miyagishi et al.Nature Biotechnol.20497-500，2002和Lee et al.Nature Biotechnol.20500-505，2002中描述了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)dsRNA的方法，在此將每一篇文獻(xiàn)引入作為參考。
小發(fā)夾式RNAs由具有任選的3′UU突出部分的莖環(huán)結(jié)構(gòu)組成。但也可以有一些變化，莖可以在21-31bp之間變化(希望的是在25-29bp之間)，環(huán)可以在4-30bp之間變化(希望的是在4-23bp之間)。為了在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)shRNAs，可以使用包含聚合酶III H1-RNA，tRNA或U6啟動(dòng)子，供莖-環(huán)RNA插入的克隆位點(diǎn)和4-5胸腺嘧啶轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的質(zhì)粒載體。聚合酶III啟動(dòng)子通常具有界限清楚的起始和中止位點(diǎn)，它們的轉(zhuǎn)錄物缺少聚(A)尾。通過(guò)聚胸腺嘧啶區(qū)域來(lái)定義這些啟動(dòng)子的終止信號(hào)，典型地轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在第二尿嘧啶核苷之后被切割。這個(gè)位點(diǎn)的切割在表達(dá)的shRNA中產(chǎn)生與合成的siRNAs的3′突出部分相似的3′UU突出部分。在上面引用的參考文獻(xiàn)中描述了另外的在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)shRNA的方法。
化療劑在治療癌癥及其它贅生物時(shí)，將核堿基寡聚物與一種或多種破裂或穩(wěn)定微管的化療劑結(jié)合使用特別有效。在下文中將更詳細(xì)地描述微管破裂劑(例如，長(zhǎng)春花生物堿)和微管穩(wěn)定劑(例如，紫杉烷類)。
長(zhǎng)春花生物堿和相關(guān)化合物能夠與本發(fā)明的核堿基寡聚物聯(lián)合，用于治療癌癥及其它贅生物的長(zhǎng)春花生物堿包括長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春酰胺、長(zhǎng)春氟寧、長(zhǎng)春瑞濱和無(wú)水長(zhǎng)春堿。
多拉司它汀(dolastatins)是主要在長(zhǎng)春花堿結(jié)合域干擾微管蛋白的寡肽。這些化合物也可以與本發(fā)明的核堿基寡聚物聯(lián)合用于治療癌癥及其它贅生物。多拉司它汀包括多拉司它汀-10(NCS 376128)、多拉司它汀-15、ILX651、TZT-1027、symplostatin 1、symplostatin 3和LU103793(西馬多丁)。
隱藻素(cryptophycins)(例如，隱藻素1和隱藻素52)(LY355703)在長(zhǎng)春花堿結(jié)合域內(nèi)結(jié)合微管蛋白并誘導(dǎo)G2/M延滯和凋亡。這些化合物中的任何一種可以與本發(fā)明的核堿基寡聚物聯(lián)合用于治療癌癥及其它贅生物。
在美國(guó)專利6,458,765；6,433,187；6,323,315；6,258,841；6,143,721；6,127,377；6,103,698；6,023,626；5,985,837；5,965,537；5,955,423；5,952,298；5,939,527；5,886,025；5,831,002；5,741,892；5,665,860；5,654,399；5,635,483；5,599,902；5,530,097；5,521,284；5,504,191；4,879,278和4,816,444中，以及公開號(hào)為2003/0153505 A1；2003/0083263 A1和2003/0055002 A1的美國(guó)專利中描述了其它的可與本發(fā)明的核堿基寡聚物聯(lián)合用于治療癌癥及其它贅生物的破裂微管的化合物，在此將每一篇文獻(xiàn)引入作為參考。
紫杉烷類及其它穩(wěn)定微管的化合物紫杉烷類，例如紫杉醇、多西它賽(doxetaxel)、RPR109881A、SB-T-1213、SB-T-1250、SB-T-101187、BMS-275183、BRT 216、DJ-927、MAC-321、IDN5109和IDN5390可以與本發(fā)明的核堿基寡聚物聯(lián)合用于治療癌癥及其它贅生物。在本發(fā)明的方法和組合物中也可以使用紫杉烷類似物(例如，BMS-184476、BMS-188797)和功能上相關(guān)的非紫杉烷類(例如，埃博霉素(epothilones)(例如，埃博霉素A、埃博霉素B(EP0906)、脫氧埃博霉素B和埃博霉素B內(nèi)酰胺(BMS-247550))、艾榴素(eleutherobin)、discodermolide、2-epi-discodermol、2-des-methyldiscodermolide、5-hydroxymethyldiscodermolide、19-des-aminocarbonyldiscodermolide、9(13)-cyclodiscodermolide和laulimalide)。
在美國(guó)專利6,624,317；6,610,736；6,605,599；6,589,968；6,583,290；6,576,658；6,515,017；6,531,497；6,500,858；6,498,257；6,495,594；6,489,314；6,458,976；6,441,186；6,441,025；6,414,015；6,387,927；6,380,395；6,380,394；6,362,217；6,359,140；6,306,893；6,302,838；6,300,355；6,291,690；6,291,684；6,268,381；6,262,107；6,262,094；6,147,234；6,136,808；6,127,406；6,100,411；6,096,909；6,025,385；6,011,056；5,965,718；5,955,489；5,919,815；5,912,263；5,840,750；5,821,263；5,767,297；5,728,725；5,721,268；5,719,177；5,714,513；5,587,489；5,473,057；5,407,674；5,250,722；5,010,099和4,939,168中，以及公開號(hào)為2003/0186965 A1；2003/0176710 Al；2003/0176473 A1；2003/0144523 A1；2003/0134883 A1；2003/0087888 A1；2003/0060623 A1；2003/0045711 A1；2003/0023082 A1；2002/0198256 A1；2002/0193361 A1；2002/0188014 A1；2002/0165257 A1；2002/0156110 A1；2002/0128471 A1；2002/0045609 A1；2002/0022651 A1；2002/0016356 A1；2002/0002292 A1的美國(guó)專利中描述了其它的可與本發(fā)明的核堿基寡聚物聯(lián)合用于治療癌癥及其它贅生物的穩(wěn)定微管的化合物，在此將每一篇文獻(xiàn)引入作為參考。
其它可以與反義IAP堿基化合物一起施用的化療劑如表1。
表1
下列實(shí)施例用于舉例說(shuō)明本發(fā)明。無(wú)論如何，無(wú)意用它們限制本發(fā)明。
實(shí)施例1核堿基寡聚物的選擇根據(jù)下列的選擇標(biāo)準(zhǔn)，我們選擇了大部分不相重疊的分別針對(duì)人XIAP和HIAP1的長(zhǎng)度為19個(gè)堿基的96個(gè)和98個(gè)序列。對(duì)于XIAP，我們從cDNA序列上起始密碼子上游大約1kb處至終止密碼子下游大約1kb處之間的區(qū)域選擇了96個(gè)序列(每一個(gè)長(zhǎng)度為19個(gè)堿基)(SEQ ID NOs1-96，表2)。這覆蓋了編碼區(qū)的大約50％，而且也接近5′和3′UTR序列(即96個(gè)19堿基(19-mers)長(zhǎng)的序列跨越了1.8kb的序列，而目標(biāo)區(qū)的長(zhǎng)度是大約3.5kb，它包括1.5kb的編碼區(qū)，及編碼區(qū)兩側(cè)1kb的UTR序列)。
表2
應(yīng)注意在上述的任何核堿基寡聚物，或任何此處描述的其它核堿基寡聚物中，每個(gè)堿基可以獨(dú)立地是DNA殘基或RNA殘基，例如2′-氧-甲基或2′-氧-甲氧乙基RNA殘基。例如，SEQ ID NO3的堿基序列可以是5′-CAGATATATATGTAACACT-3′，5′-CAGATATATATGTAACACU-3′或5′-mCmAGATATATATGTAACAmCmU-3′(其中mX代表2′-氧-甲基X殘基)。其它附加的修飾堿基本領(lǐng)域已經(jīng)公知。連接可以是磷酸二酯(PO)、硫代磷酸酯(PS)或膦酸甲酯(MP)鍵，或者具有混合骨架(MB)。骨架可以是允許核堿基寡聚物與靶IAP多核苷酸雜交的任何適當(dāng)?shù)墓羌?。在這里描述了一些示例性的骨架。在其它的實(shí)施例中，核堿基寡聚物包含吖啶保護(hù)鍵、膽甾醇基或補(bǔ)骨脂素組分、C5-propynyl嘧啶或C5-甲基嘧啶。對(duì)本發(fā)明的核堿基寡聚物的適當(dāng)?shù)男揎棸切┤缟纤龅男揎?，以及在此引入作為參考的公開號(hào)為US2002/0128216 A1的美國(guó)專利申請(qǐng)中的那些修飾。
在下面的表3中列出了核堿基寡聚物的實(shí)例(其中mX代表2′-氧-甲基X RNA殘基)。

在PCT專利申請(qǐng)F(tuán)R91/00444中描述了介導(dǎo)核堿基寡聚物進(jìn)入細(xì)胞的Penetratin和其用途。
采用類似的鑒定方法來(lái)設(shè)計(jì)針對(duì)HIAP1的核堿基寡聚物。最初，選擇了98個(gè)長(zhǎng)度為19個(gè)堿基(19-mer)的核堿基寡聚物(SEQ ID NOs163-260，表4)。從這98個(gè)靶向HIAP1序列的核堿基寡聚物中選出十五個(gè)序列(SEQID NOs163-170，173，179，202，222，223，247和259)作更進(jìn)一步的評(píng)價(jià)。這十五個(gè)候選的核堿基寡聚物包括四個(gè)靶向編碼區(qū)的核堿基寡聚物(SEQ ID NOs202，222，223和247)、一個(gè)靶向3′UTR的核堿基寡聚物(SEQ ID NO259)、七個(gè)靶向5′UTR的核堿基寡聚物(SEQ ID NOs166-170，173和179；這七個(gè)核堿基寡聚物中的一個(gè)與起始密碼子交疊)，以及三個(gè)經(jīng)設(shè)計(jì)靶向5′UTR的內(nèi)含子部分的其它寡核苷酸(SEQ ID NOs163-165)。
表4
核堿基寡聚物選擇標(biāo)準(zhǔn)利用計(jì)算機(jī)程序OLIGO(以前由National Biosciences Inc分配的)，基于下列標(biāo)準(zhǔn)來(lái)選擇候選的核堿基寡聚物1)GC含量不超過(guò)75％；AT含量不超過(guò)75％；2)優(yōu)選不具有四個(gè)或四個(gè)以上連續(xù)的G殘基的核堿基寡聚物(雖然挑選了一個(gè)作為毒性對(duì)照，但因?yàn)橐褕?bào)告有毒性影響)；3)不選擇能形成穩(wěn)定的二聚物或發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核堿基寡聚物；以及4)圍繞翻譯起始位點(diǎn)的序列是優(yōu)選區(qū)。
另外，借助于RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)折疊程序MFOLD(M.Zuker，D.H.Mathews& D.H.Turner，Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary StructurePredictionA Practical Guide.InRNA Biochemistry and Biotechnology，J.Barciszewski & B.F.C.Clark，Ed.，NATO ASI Series，Kluwer AcademicPublishers，(1999))預(yù)測(cè)靶mRNA的可進(jìn)入的區(qū)域。利用200個(gè)堿基的窗口已經(jīng)預(yù)測(cè)出自由能數(shù)值在預(yù)計(jì)的最穩(wěn)定的mRNA折疊5％以內(nèi)的亞最佳折疊，其中200個(gè)堿基中的殘基能找到互補(bǔ)的堿基形成堿基對(duì)連接。和每個(gè)亞最佳折疊一起總計(jì)不形成堿基對(duì)的開放區(qū)，認(rèn)為那些始終被預(yù)言為開放的區(qū)域更容易與核堿基寡聚物結(jié)合。如果只能部分滿足上述一些選擇標(biāo)準(zhǔn)的附加核堿基寡聚物能識(shí)別預(yù)測(cè)的靶mRNA開放區(qū)，也可以選擇它們作為可能的候選物。
實(shí)施例2寡核苷酸合成利用寡核苷酸作為示范的核堿基寡聚物對(duì)核堿基寡聚物抑制IAP表達(dá)的能力進(jìn)行了測(cè)試。利用IDT(Integrated DNA Technologies，USA)合成的寡核苷酸是嵌合的第二代寡核苷酸，它們由在一側(cè)側(cè)接了兩個(gè)2′-氧-甲基RNA殘基的磷酸二酯DNA殘基核心組成，其中側(cè)接的RNA殘基之間有硫代磷酸酯鍵。提供的最少量的寡核苷酸在96孔板和相配的管中，當(dāng)檢測(cè)方法是靈敏的方法，例如是TaqMan定量PCR或ELISA時(shí)，最少量為12ODs的核堿基寡聚物提供了豐富的轉(zhuǎn)染材料(大于96孔板測(cè)定模式的一百次測(cè)定)。一旦鑒定呈陽(yáng)性(見下文)，再合成寡核苷酸時(shí)用三個(gè)側(cè)接的RNA殘基替換兩個(gè)側(cè)接的RNA殘基以進(jìn)一步增強(qiáng)其穩(wěn)定性/核酶抗性。另外，為了證實(shí)結(jié)果有效，針對(duì)一些產(chǎn)生最高活性的靶合成了適當(dāng)?shù)膶?duì)照物(例如混雜的，4-堿基錯(cuò)配和反極性寡核苷酸)。
實(shí)施例3核堿基寡聚物的篩選和優(yōu)化我們鑒定能抑制IAP表達(dá)的核堿基寡聚物的方法是為了篩選上述的寡核苷酸庫(kù)，以選擇能特異性降低(降低(knock-down))被靶向的特異IAP基因的RNA和/或蛋白質(zhì)的寡聚物。可以使用任意數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的RNA和蛋白水平。例如可以利用標(biāo)準(zhǔn)northern印跡分析或RT-PCR技術(shù)來(lái)測(cè)量RNA水平。例如可以利用標(biāo)準(zhǔn)的western印跡分析或免測(cè)沉淀法技術(shù)測(cè)量蛋白水平。換句話說(shuō)，可以參照這里引入的作為參考的美國(guó)專利5,919,912，6,156,535和6,133,437中描述的方法來(lái)檢查施用了反義IAP核酸的細(xì)胞的成活力。
我們利用TaqMan定量PCR(如下所述)來(lái)測(cè)定寡核苷酸處理后mRNA水平的變化。我們利用ELISA來(lái)確定XIAP蛋白水平，利用western印跡來(lái)確定HIAP1蛋白水平。利用來(lái)自XIAP的跨越起始密碼子的熒光素標(biāo)記的正義寡核苷酸(5′-mGmAGAAGATGACTGGTAAmCmA-3′；SEQ ID NO261)作為對(duì)照，用Lipofectamine plus或Lipofectamine 2000(Life Technologies，Canada)來(lái)優(yōu)化T24膀胱癌細(xì)胞或H460非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)染條件，用lipofectin來(lái)優(yōu)化SF-295惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染條件。通過(guò)表面-熒光顯微術(shù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行目測(cè)檢驗(yàn)和精確計(jì)量。基于已公開的寡核苷酸下調(diào)存活蛋白表達(dá)的能力，對(duì)T24細(xì)胞的轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行更進(jìn)一步的優(yōu)化(Li et al.，Nat.CellBiol.1461-466，1999)(5′-U/TGTGCTATTCTGTGAAU/TU/T-3′；SEQ ID NO262)。我們基于用下文詳細(xì)描術(shù)的PCR引物和熒光探針檢測(cè)出的存活蛋白R(shí)NA降低的TaqMan結(jié)果，對(duì)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞攝取寡核苷酸的最優(yōu)條件是940nM寡核苷酸，4uL PLUS試劑以及0.8uL Lipofectamine，共70uL，作用三小時(shí)。然后我們施加這些條件來(lái)篩選寡核苷酸庫(kù)中使T24細(xì)胞XIAP蛋白質(zhì)降低的寡核苷酸。
在SF-295細(xì)胞中研究HIAP1降低，因?yàn)檫@些細(xì)胞具有容易檢測(cè)和辨別的70kDa的HIAP1蛋-白質(zhì)，而許多細(xì)胞系并不表達(dá)高水平的這種蛋白質(zhì)，或者表達(dá)的蛋白質(zhì)不能與大量的類似大小的68kDa的HIAP2蛋白質(zhì)相區(qū)別。
實(shí)時(shí)PCR從溶解在RLT緩沖液(QIAGEN，Valencia，CA)中的細(xì)胞抽提RNA，用QIAGEN Rneasy柱/試劑盒進(jìn)行純化。在Perkin-Elmer ABI 7700 Prism PCR儀上運(yùn)行實(shí)時(shí)定量PCR。利用設(shè)計(jì)的能特異地識(shí)別XIAP，HIAP1，存活蛋白或GAPDH的引物和探針，參照PE生物系統(tǒng)的TaqMan通用PCR標(biāo)準(zhǔn)混合規(guī)程(TaqMan Universal PCR Master Mix protocol of PE Biosystems)逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增RNA。人存活蛋白的正向引物為5′-TCTGCTTCAAGGAGCTGGAA-3′(SEQ ID NO263)，反向引物為5′-GAAAGGAAAGCGCAACCG-3′(SEQ ID NO264)，探針為5′-(FAM)AGCCAGATGACGACCCCATAGAGGAACATA(TAMRA)-3′(SEQ ID NO265)。人HIAP1的正向引物為5′-TGGAGATGATCCATGGGTTCA-3′(SEQ IDNO266)，反向引物為5′-GAACTCCTGTCCTTTAATTCTTATCAAGT-3′(SEQID NO267)，探針為5′-(FAM)CTCACACCTTGGAAACCACTTGGCATG(TAMRA)-3′(SEQ ID NO268)。人XIAP的正向引物為5′-GGTGATAAAGTA AAGTGCTTTCACTGT-3′(SEQ IDNO269)，反向引物為5′-TCAGTAGTTCTTACCAGACACTCCTCAA-3′(SEQID NO270)，探針為5′-(FAM)CAACATGCTAAATGGTATCCAGGGTGCAAATATC(TAMRA)-3′(SEQ IDNO271)。人GAPDH的正向引物為5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′(SEQID NO272)，反向引物為5′-GAAGATGGTGATGGGATTC-3′(SEQ ID NO273)，探針為5′-(JOE)CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC(TAMRA)-3′(SEQ IDNO274)。FAM是6-羧基熒光素，JOE是6-羧基-4，5-二氯-2，7-二甲氧基熒光素，TAMRA是6-羧基-N，N，N′，N′-四甲基羅丹明。FAM和JOE是5′報(bào)告染料，而TAMRA是3′淬滅染料。
利用GAPDH作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)，按照PE生物系統(tǒng)手冊(cè)(PE Biosystems manual)中的描述對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量。利用比較Ct(循環(huán)閾值)的方法將IAP mRNA水平與GAPDH mRNA水平相比較，對(duì)IAP mRNA水平進(jìn)行相對(duì)定量。簡(jiǎn)而言之就是在每個(gè)PCR循環(huán)都進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光測(cè)量，通過(guò)確定熒光超過(guò)基線標(biāo)準(zhǔn)偏差30倍的閾極限點(diǎn)，計(jì)算出每個(gè)樣品的閾循環(huán)(Ct)值。利用開始于第三個(gè)循環(huán)的基線值和中止于信號(hào)開始按指數(shù)規(guī)律上升之前的三個(gè)循環(huán)的基線值計(jì)算平均基線值和基線SD。為了減少擴(kuò)增和檢出基因組DNA污染物的可能性，設(shè)計(jì)的IAPs的特異的PCR引物和/或探針跨越至少一個(gè)被1kb或更長(zhǎng)基因組DNA分開的外顯子-內(nèi)含子邊界。通過(guò)在實(shí)行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)步驟前用DNase或RNase處理一些RNA樣品來(lái)驗(yàn)證信號(hào)的特異性和由DNA引起的可能污染。
XIAP ELISA和HIAP1蛋白質(zhì)免疫印跡利用親合純化的抗鼠XIAP的兔多克隆抗體作為第一抗體實(shí)行標(biāo)準(zhǔn)的比色XIAP ELISA測(cè)定，利用XIAP單克隆抗體(MBL，Japan)，生物素化的抗-鼠Ig抗體，辣根過(guò)氧化酶結(jié)合的抗生物素蛋白鏈菌素，以及TMB底物進(jìn)行檢測(cè)。另外，也可以分別利用多克隆XIAP或HIAP1抗體來(lái)測(cè)量XIAP或HIAP1蛋白水平。
在蛋白免疫印跡時(shí)利用親合純化的抗鼠HIAP1兔多克隆抗體作為第一抗體來(lái)檢測(cè)HIAP1，在X線膠片上時(shí)，利用二抗——結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶的抗兔Ig抗體和化學(xué)熒光底物通過(guò)ECL來(lái)檢測(cè)HIAP1。收集針對(duì)鼠HIAP1的GST融合物的抗HIAP1多克隆抗體。這種抗體會(huì)與人和鼠兩者的HIAP1，HIAP2發(fā)生交叉反應(yīng)。
實(shí)施例4反義XIAP寡核苷酸減少XIAP RNA和多肽表達(dá)首先篩選XIAP合成庫(kù)的96個(gè)反義寡核苷酸，以選出能降低XIAP蛋白水平的寡核苷酸。具體地，在第1天將T24細(xì)胞(1.5×104細(xì)胞/孔)接種在96孔培養(yǎng)板的孔中，在不含抗菌素的McCoy′s培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)。第2天，用如上所述的XIAP反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞(依照寡核苷酸在培養(yǎng)板中的位置對(duì)它們進(jìn)行標(biāo)記，即A1到H12，包括含有凍干的粘到密封膜上的DNA小丸的兩個(gè)重復(fù)——A13和B13)。簡(jiǎn)而言之就是將核堿基寡聚物稀釋在10ul/孔的無(wú)血清及抗菌素的McCoy′s培養(yǎng)基中，然后添加PLUS試劑。Lipofectamine被稀釋在10ul/孔的無(wú)血清及抗菌素的McCoy′s培養(yǎng)基中，在室溫下孵育這兩種混合物15分鐘。然后聯(lián)合混合物，在室溫下孵育15分鐘。
同時(shí)，除去培養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)基，以50ul/孔給細(xì)胞添加無(wú)血清及抗菌素的培養(yǎng)基。向孔中加入轉(zhuǎn)染混合物，孵育細(xì)胞三小時(shí)。然后向每孔中加入30ul/孔的無(wú)血清及抗菌素的培養(yǎng)基和100ul/孔的包含20％胎牛血清的無(wú)抗菌素的完全培養(yǎng)基。
在第3天，利用如上所述的實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)測(cè)量XIAP RNA水平。在第4天，用ELISA測(cè)量XIAP蛋白水平(圖1A，1C，1E，1G，1I和1K)，用生物化學(xué)技術(shù)測(cè)量總細(xì)胞蛋白質(zhì)(圖1B，1D，1F，1H，1J和1L，用來(lái)使XIAP蛋白水平標(biāo)準(zhǔn)化)。將結(jié)果與模擬轉(zhuǎn)染樣品(用轉(zhuǎn)染試劑處理，但沒(méi)有添加寡核苷酸DNA，接下來(lái)按照處理其它樣品的方法進(jìn)行處理)的結(jié)果進(jìn)行比較。時(shí)間過(guò)程實(shí)驗(yàn)確定蛋白質(zhì)降低的最佳時(shí)機(jī)大約為12-24小時(shí)。
也在適當(dāng)?shù)淖罴褧r(shí)間利用如上所述的引物和探針，用TaqMan特異的PCR引物和熒光探針對(duì)寡核苷酸庫(kù)進(jìn)行了篩選，以選擇能降低RNA水平的寡核苷酸。時(shí)間過(guò)程實(shí)驗(yàn)確定mRNA在6-9小時(shí)出現(xiàn)最佳減少。這些結(jié)果與蛋白質(zhì)的結(jié)果一致。
第一個(gè)篩選(雖然在可能由于非轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)使XIAP水平恢復(fù)正常的亞最佳時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行)從測(cè)試的96個(gè)核堿基寡聚物中鑒定出16個(gè)反義寡核苷酸(表1C2，E2，E3，F(xiàn)3，C4，D4，E4，F(xiàn)4，G4，C5，D5，B6，F(xiàn)6，D7，D8，F(xiàn)8)，與模擬(沒(méi)有核堿基寡聚物)轉(zhuǎn)染水平(圖1A，1C，1E，1G，1I和1K)相比，這16個(gè)反義寡核苷酸使相對(duì)于總蛋白的XIAP蛋白水平顯示出一些下降。這16個(gè)核堿基寡聚物中的每一個(gè)都導(dǎo)致總蛋白降低，這表明這些核堿基寡聚物具有毒性或抑制細(xì)胞效應(yīng)(圖1B，1D，1F，1H，1J，1L)。核堿基寡聚物B9和C9顯示出清楚的總蛋白降低，但沒(méi)有出現(xiàn)XIAP蛋白水平的相對(duì)下降。
基于上述的時(shí)間過(guò)程研究(圖2B)，在更合適的時(shí)間點(diǎn)(12小時(shí))對(duì)這16個(gè)使相對(duì)XIAP蛋白水平與模擬轉(zhuǎn)染相比顯示出一些下降的反義核堿基寡聚物的降低XIAP蛋白質(zhì)的能力進(jìn)行了單獨(dú)的或聯(lián)合的再測(cè)試，其中測(cè)試包括一個(gè)對(duì)照核堿基寡聚物(D2)。也檢測(cè)了這些核堿基寡聚物在12小時(shí)降低XIAP mRNA水平的能力，其中用GAPDH水平將XIAP mRNA水平標(biāo)準(zhǔn)化，并與模擬轉(zhuǎn)染的結(jié)果相比較。也確定了12小時(shí)時(shí)的總蛋白濃度(圖2C)。
核堿基寡聚物降低XIAP蛋白水平的能力(圖2B)和它降低XIAP mRNA水平的能力(圖2A)之間有很好的相關(guān)性。另外，在這個(gè)早期時(shí)間點(diǎn)，也沒(méi)有出現(xiàn)較多的總蛋白損失，在晚些的時(shí)間點(diǎn)可以看到XIAP mRNA和蛋白質(zhì)的下降出現(xiàn)在總蛋白的下降之前。確定單獨(dú)或兩個(gè)以1∶1聯(lián)合形式添加的能顯示出大于50％的XIAP蛋白質(zhì)或mRNA水平損失的核堿基寡聚物為最好的核堿基寡聚物，并進(jìn)行更進(jìn)一步地證實(shí)。依據(jù)使用的轉(zhuǎn)染條件，或以聯(lián)合形式使用時(shí)(如C5和G4)，在這16個(gè)寡核苷酸中的十個(gè)(E2，E3，F(xiàn)3，E4，F(xiàn)4，G4，C5，B6，D7，F(xiàn)8)顯示出一致的降低XIAP蛋白質(zhì)或RNA水平超過(guò)50％的能力。而且，這些顯示出反義活性的16個(gè)寡核苷酸簇生在XIAP mRNA的四個(gè)不同的目標(biāo)區(qū)，其中目標(biāo)區(qū)相鄰的核堿基寡聚物顯示出一些降低的活性。用靶向這些區(qū)域之間的序列的核堿基寡聚物或敏感性的島狀物幾乎沒(méi)有觀察到反義活性。推測(cè)這些區(qū)域代表細(xì)胞內(nèi)部核堿基寡聚物能到達(dá)的mRNA上的開放區(qū)。兩個(gè)核堿基寡聚物E3和F3靶向正好位于起始密碼子上游，在IRES和翻譯起始位點(diǎn)之間的過(guò)渡區(qū)內(nèi)的XIAP區(qū)，與IRES元件的末端重疊。C2，D2和E2靶向最小IRES元件上游的XIAP區(qū)域，為最小IRES區(qū)域是活體內(nèi)核堿基寡聚物不易到達(dá)的RNA的高度組織區(qū)域提供了更進(jìn)一步的證據(jù)。所有其它的核堿基寡聚物與編碼區(qū)域的一部分互補(bǔ)，包括一串在XIAP序列的856-916位置(E4，F(xiàn)4和G4)和較小的分開區(qū)域的寡聚物，例如，如核堿基寡聚物C5和D5所示。
轉(zhuǎn)染后9小時(shí)，在NCI-H460細(xì)胞中，再次篩選了表2中描述的96個(gè)核堿基寡聚物中的一部分寡聚物降低XIAP mRNA的能力。數(shù)據(jù)概括在下表5中。
表5
我們也確定了4X4 MBOs(全部PS，DNA殘基兩例都側(cè)接了四個(gè)2′-氧-甲基RNA殘基)是否能夠降低H460細(xì)胞內(nèi)XIAP蛋白質(zhì)。如圖3和4所示，在量低到31nM時(shí)，E12和另一個(gè)寡核苷酸FG8的4X4 MBs仍有效。
實(shí)施例5XIAP反義核堿基寡聚物增加細(xì)胞毒性和化學(xué)致敏性我們對(duì)XIAP反義核堿基寡聚物是否可以使高度耐藥的T24細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)的化療劑，例如阿霉素或順鉑敏感進(jìn)行了研究。選擇能代表一些不同XIAP目標(biāo)區(qū)的反義寡核苷酸，對(duì)它們單獨(dú)的或與其它的寡核苷酸或藥物聯(lián)合的細(xì)胞毒性影響進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試了五個(gè)XIAP反義寡核苷酸殺死或化學(xué)致敏T24膀胱癌細(xì)胞的能力，并與三個(gè)對(duì)應(yīng)的混雜對(duì)照寡核苷酸的效果進(jìn)行了比較。
用XIAP反義寡核苷酸，混雜的寡核苷酸，無(wú)寡核苷酸(模擬轉(zhuǎn)染)轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞，或不處理T24細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染20小時(shí)之后(除未處理對(duì)照外)，利用WST-1四唑染料測(cè)定方法測(cè)試細(xì)胞成活力，其中在測(cè)試中WST-1四唑染料在代謝活性細(xì)胞中被還原成著色甲月替產(chǎn)物(圖5A)。
通過(guò)察看未處理的，模擬轉(zhuǎn)染的，用E4，用E4混雜對(duì)照，E4反極性或E4錯(cuò)配寡核苷酸轉(zhuǎn)染的T24細(xì)胞，研究了寡核苷酸E4引起的細(xì)胞毒性事件。在轉(zhuǎn)染二十小時(shí)之后，檢查細(xì)胞形態(tài)(圖5D)。只有用反義E4寡核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示出毒性征象。
為了研究核堿基寡聚物化學(xué)致敏T24細(xì)胞，使其對(duì)順鉑或阿霉素敏感的效果，在固定劑量的阿霉素(0.5ug/ml)存在時(shí)，對(duì)寡核苷酸更進(jìn)一步地殺死T24細(xì)胞的能力進(jìn)行了測(cè)試。首先用寡核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后在另外的20小時(shí)添加阿霉素。在20小時(shí)的藥物治療結(jié)束時(shí)，用WST-1測(cè)量成活力(圖5B)。用與單獨(dú)核堿基寡聚物治療相比較的百分比成活力將結(jié)果顯示在圖5C中。
與模擬(沒(méi)有寡核苷酸)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，或用三個(gè)對(duì)應(yīng)于F3(5′-mCmAmGAGATTTCATTTAAmCmGmU-3′；SEQ ID NO275)，E4(5′-mCmUmACGCTCGCCATCGTmUmCmA-3′；SEQ ID NO276)和C5(5′-mUmGmCCCAAGAATACTAGmUmCmA-3′；SEQ ID NO277)的混雜對(duì)照相比，所有測(cè)試的五個(gè)核堿基寡聚物(F3，E4，G4，C5，D7)，E4+C5和G4+C5組合在24小時(shí)之后都能殺死T24細(xì)胞，只留下10-15％的存活細(xì)胞(圖5A和5C)。因此，毒性對(duì)那些降低XIAP水平的核堿基寡聚物來(lái)說(shuō)是序列特異的，沒(méi)有因?yàn)楹藟A基寡聚物的一般化學(xué)作用而出現(xiàn)非序列特異的毒性。這些細(xì)胞毒性可能是由XIAP蛋白質(zhì)的降低(和通過(guò)XIAP提供的抗凋亡預(yù)期損耗)和轉(zhuǎn)染本身的毒性的綜合效應(yīng)引起的。
在三個(gè)小時(shí)轉(zhuǎn)染周期結(jié)束時(shí)，添加固定劑量的阿霉素或順鉑會(huì)導(dǎo)致一些測(cè)試的寡核苷酸引起更進(jìn)一步的存活率下降，在20小時(shí)之后，核堿基寡聚物F3，D7和G4+C5組合(圖5B)引起的存活率與它們對(duì)應(yīng)的寡核苷酸治療值相比，更進(jìn)一步地下降了40％(圖5C)。將圖5B中的數(shù)值(寡核苷酸加藥物)與圖5C中單獨(dú)用寡核苷酸的數(shù)值相比較，在圖5C中每一個(gè)ODN被設(shè)置為100％。只顯示了對(duì)阿霉素化學(xué)致敏的結(jié)果；當(dāng)用順鉑化學(xué)致敏細(xì)胞時(shí)可獲得類似的結(jié)果。在使用固定劑量時(shí)，當(dāng)用阿霉素處理時(shí)，模擬和混雜對(duì)照轉(zhuǎn)染不顯示任何增加的存活率損失(圖5B)。只有當(dāng)XIAP水平被特異的反義寡核苷酸降低時(shí)才能見到化學(xué)致敏。
實(shí)施例6反義寡核苷酸對(duì)H460細(xì)胞的XIAP mRNA的下調(diào)效果通過(guò)利用實(shí)時(shí)PCR研究了反義寡核苷酸(2x2MBO，由在任意一側(cè)以硫代磷酸酯鍵側(cè)接的兩個(gè)2′-氧-甲基RNA殘基和15個(gè)磷酸二酯DNA殘基中心核組成)對(duì)H460細(xì)胞XIAP mRNA的影響。在這種構(gòu)型中，與未處理的對(duì)照相比，核堿基寡聚物F3，G4，C5，AB6和DE4降低mRNA水平達(dá)50-70％，而D7 AS核堿基寡聚物降低mRNA水平30％(圖6)。相反，對(duì)照核堿基寡聚物和單獨(dú)的轉(zhuǎn)染試劑(LFA)只能降低少于未處理對(duì)照20％的mRNA水平(圖6)。選擇核堿基寡聚物F3，G4和C5進(jìn)行進(jìn)一步的體外和體內(nèi)研究。圖7和8中描述了通過(guò)TaqMan分析觀察到的另外的XIAPmRNA降低。
實(shí)施例7反義寡核苷酸對(duì)XIAP蛋白質(zhì)的下調(diào)效果我們通過(guò)蛋白印跡分析描繪了寡核苷酸構(gòu)型中的核堿基寡聚物F3，G4和C5影響XIAP蛋白質(zhì)表達(dá)效能的特征(圖9，10A和10B)。G4 AS寡核苷酸對(duì)XIAP蛋白質(zhì)顯示出最強(qiáng)的下調(diào)作用，1.2uM的濃度在轉(zhuǎn)染結(jié)束后24小時(shí)能降低XIAP蛋白水平62％(圖10A和10B)。F3AS寡核苷酸在1.2uM能降低XIAP蛋白水平50％，而與對(duì)照相比，C5 AS寡核苷酸不顯示序列特異效應(yīng)(圖10B)。在另外的研究中，E12和FG8 AS寡核苷酸能顯著降低XIAP蛋白水平(圖9)。
實(shí)施例8XIAP AS寡核苷酸誘導(dǎo)凋亡在已經(jīng)顯示XIAP AS核堿基寡聚物能夠降低H460細(xì)胞和T24膀胱癌細(xì)胞的成活力之后，我們對(duì)是否因?yàn)檎T導(dǎo)凋亡引起觀察到的細(xì)胞死亡進(jìn)行了測(cè)定。如圖11A所示，用1.2uM的F3或G4 AS寡核苷酸處理H460細(xì)胞能活化和降低前胱冬酶-3蛋白質(zhì)，降低量與未處理的對(duì)照細(xì)胞相比，分別為蛋白水平的40％或60％。PARP也是預(yù)計(jì)的胱冬酶-3產(chǎn)生的片斷(圖11A)。相反，1.2uM的F3和G4 SC寡核苷酸對(duì)照對(duì)胱冬酶-3或PARP蛋白質(zhì)表達(dá)不產(chǎn)生任何影響(圖11A)。用1.2uM的F3和G4 AS寡核苷酸，以及它們各自的對(duì)照處理的H460細(xì)胞中的Bcl-2∶Bax比例未改變。利用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法來(lái)檢測(cè)用G4 AS寡核苷酸處理，用PI染色的H460細(xì)胞中的亞二倍體DNA含量(圖12A)。與未處理對(duì)照細(xì)胞的16.6％相比，當(dāng)用1.2uM的G4 AS寡核苷酸或混雜對(duì)照寡核苷酸處理H460細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞的亞(hypo)二倍體DNA含量分別是40.8和22.1％。用DAPI染色來(lái)檢測(cè)用1.2uM的G4 AS寡核苷酸或混雜對(duì)照寡核苷酸處理的H460細(xì)胞的核形態(tài)變化。如圖12B所示，用G4 AS寡核苷酸處理的細(xì)胞經(jīng)受了凋亡特有的形態(tài)變化，包括染色質(zhì)凝縮和核DNA斷裂。在G4 SC處理的對(duì)照細(xì)胞中，幾乎沒(méi)有細(xì)胞顯示出這些形態(tài)變化。
實(shí)施例9通過(guò)AS寡核苷酸抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，使H460細(xì)胞對(duì)抗癌劑致敏為了分析與下調(diào)XIAP表達(dá)和凋亡有關(guān)的核堿基寡聚物的生物效應(yīng)，通過(guò)MTT測(cè)定對(duì)G4 AS寡核苷酸處理的H460細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)行了研究。在轉(zhuǎn)染后四十八小時(shí)，G4 AS寡核苷酸已經(jīng)以劑量依賴方式降低了H460細(xì)胞的生長(zhǎng)，在1.2uM時(shí)，相對(duì)于未處理的對(duì)照水平顯示出55％的降低(圖13A)。相反，G4 SC寡核苷酸或單獨(dú)的轉(zhuǎn)染試劑的生長(zhǎng)抑制效果相當(dāng)?shù)?，不及它們的未處理?duì)照的10％。
為了研究XIAP表達(dá)的下調(diào)是否具有使H460細(xì)胞對(duì)化療敏感的潛能，利用G4 AS寡核苷酸和下列抗癌藥中的一種實(shí)施了組合治療阿霉素(DOX)、紫杉酚、長(zhǎng)春瑞濱(VNB)和依托撲沙(Etop)。圖13B顯示與單獨(dú)用G4 AS寡核苷酸或抗癌藥相比，每一個(gè)組合對(duì)細(xì)胞死亡都產(chǎn)生至少一種附加的細(xì)胞毒素影響。
實(shí)施例10G4 AS寡核苷酸對(duì)H460和LCC6腫瘤異種移植物的抗腫瘤效力我們首先確定瘤內(nèi)注射XIAP反義2x2-MBOs到攜帶皮下H460人肺癌異種移植物的SCID-RAG2小鼠體內(nèi)是否會(huì)降低腫瘤生長(zhǎng)量。在腫瘤細(xì)胞接種(s.c.，肩注射106細(xì)胞)14天后，通過(guò)注射MBOs(50ug2′-氧-甲基RNA寡核苷酸/克腫瘤)到可觸知的腫瘤塊內(nèi)開始治療，每周注射三次，持續(xù)兩周。在第17和24天，注射長(zhǎng)春瑞濱(VNB，也被稱為諾維本(NVB)，(15mg/kg，腹膜內(nèi)注射)。每周用測(cè)徑器測(cè)量腫瘤大小三次。在治療周期結(jié)束時(shí)(第24天)，與用混雜對(duì)照MBOs和VNB處理的那些小鼠相比，用C5+G4 AS MBOs和VNB聯(lián)合處理的小鼠的平均相對(duì)腫瘤生長(zhǎng)降低了～70％。與混雜對(duì)照相比，用C5AS MBO和VNB治療導(dǎo)致腫瘤大小減少了～60％(圖14)。
設(shè)計(jì)的初始系統(tǒng)性PS寡核苷酸研究沒(méi)有任何化療劑。給SCID-RAG2小鼠接種H460人肺癌細(xì)胞(s.c.，肩注射106細(xì)胞)，在腫瘤接種后三天開始用G4和F3 AS PS寡核苷酸，以及混雜對(duì)照進(jìn)行治療。以12.5mg/kg的劑量腹膜內(nèi)注射施用核堿基寡聚物注射劑，一周注射三次，持續(xù)三周。在治療周期結(jié)束時(shí)，G4或F3 AS寡核苷酸處理組的平均腫瘤大小比混雜對(duì)照寡核苷酸處理組的平均腫瘤大小小～50％(圖15)。對(duì)正位接種了MDA-MB-435/LCC6人乳腺癌細(xì)胞的雌性SCID-RAG2小鼠進(jìn)行了相同治療規(guī)程的測(cè)試。最后一次治療兩周后(第35天)，用F3，C5或G4 AS寡核苷酸處理的小鼠的腫瘤體積分別小于載體對(duì)照組的腫瘤體積70％，60％和45％(圖16)。
我們?cè)诮邮芷は轮踩際460人非小細(xì)胞肺腫瘤異種移植物的SCID-RAG2小鼠體內(nèi)對(duì)G4 AS寡核苷酸的抗腫瘤效果進(jìn)行了附加研究。鹽水治療的對(duì)照腫瘤在大約24天內(nèi)可繁殖生長(zhǎng)到0.75cm3大小(圖17)。在腫瘤細(xì)胞接種之后三天開始寡核苷酸治療。依據(jù)在第3-7，10-14和17-21天每天一次腹膜內(nèi)注射的治療時(shí)間表施用G4 AS寡核苷酸(5-15mg/kg)。用5或15mg/kg G4 AS寡核苷酸治療能大大延遲腫瘤生長(zhǎng)在第24天，對(duì)照組，5和15mg/kg治療組的平均腫瘤大小分別是0.75，0.45和0.29cm3(圖18A)。腫瘤生長(zhǎng)抑制呈劑量依賴性。用15mg/kg G4 AS寡核苷酸治療的小鼠體內(nèi)的腫瘤大小顯著地小于對(duì)照組，是對(duì)照組平均腫瘤大小的39％。相反，施用15mg/kg的G4 SC寡核苷酸沒(méi)有產(chǎn)生治療活性(圖17)。寡核苷酸處理的小鼠都沒(méi)有表現(xiàn)出任何毒性跡象，能很好地耐受兩個(gè)劑量的寡核苷酸。選擇15mg/kg的劑量用于將來(lái)與抗癌藥進(jìn)行組合治療。
實(shí)施例11用G4 AS寡核苷酸處理的H460腫瘤中XIAP表達(dá)降低為了將G4 AS寡核苷酸的腫瘤生長(zhǎng)抑制效果與XIAP蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)聯(lián)，在15mg/kg的G4 AS和SC寡核苷酸體內(nèi)治療結(jié)束時(shí)，我們研究了XIAP表達(dá)的變化。在腫瘤接種后21天或24天，當(dāng)腫瘤達(dá)到1cm3大小(圖17)時(shí)，收獲腫瘤，用取自腫瘤勻漿的溶胞產(chǎn)物進(jìn)行蛋白印跡分析。使用了針對(duì)人蛋白質(zhì)的XIAP和β-肌動(dòng)蛋白抗體，要考慮到確定從腫瘤細(xì)胞樣品中獲得人XIAP水平?jīng)]有受來(lái)源于小鼠細(xì)胞的XIAP的污染。用G4 AS寡核苷酸處理的腫瘤內(nèi)的XIAP蛋白水平被顯著地降低為對(duì)照組的大約85％(P＜0.005)(圖18A和18B)。用G4 SC寡核苷酸處理的腫瘤的大小降低量為對(duì)照腫瘤的24％。這些結(jié)果表明G4 AS寡核苷酸抑制H460腫瘤生長(zhǎng)與XIAP蛋白質(zhì)的表達(dá)下調(diào)相關(guān)聯(lián)。
實(shí)施例12腫瘤樣品的病理組織學(xué)為了評(píng)估XIAP AS寡核苷酸給藥是否能導(dǎo)致直接殺死腫瘤細(xì)胞，我們?cè)谥委熀笱芯苛四[瘤的組織結(jié)構(gòu)，以了解其形態(tài)和泛素免疫染色情形(圖19A和19B)。在腫瘤接種后21天或24天，切除用15mg/kg的G4AS寡核苷酸，SC寡核苷酸或鹽水對(duì)照處理的腫瘤，并制成切片，用蘇木精和伊紅染色。結(jié)果表明施用給定XIAP AS寡核苷酸進(jìn)行治療的動(dòng)物體內(nèi)的腫瘤包含數(shù)量增加的，通過(guò)無(wú)定形形狀和凝縮的核質(zhì)從形態(tài)學(xué)上被鑒定的死細(xì)胞(圖19A)。
蛋白質(zhì)降解主要是泛素蛋白酶體依賴性的；在凋亡期間已經(jīng)觀察到泛素表達(dá)增加。因此，我們研究了用于蘇木素伊紅染色的腫瘤切片的泛素表達(dá)。如圖19B所示，相對(duì)于對(duì)照或SC ODN治療小鼠體內(nèi)的腫瘤，施用了XIAP AS寡核苷酸的小鼠體內(nèi)的腫瘤表現(xiàn)出更強(qiáng)烈的免疫組織化學(xué)的染色。這些數(shù)據(jù)表明XIAP AS堿基寡核苷酸治療的腫瘤細(xì)胞中有比對(duì)照腫瘤更多的游離泛素和/或泛素化蛋白質(zhì)。
實(shí)施例13G4 AS寡核苷酸和長(zhǎng)春瑞濱的聯(lián)合治療為了評(píng)估G4 AS寡核苷酸和一種用于治療肺癌的化療劑-長(zhǎng)春瑞濱(VNB)的聯(lián)合治療是否可以產(chǎn)生任何協(xié)同效應(yīng)，我們比較了存在和不存在G4 AS寡核苷酸或G4 SC寡核苷酸時(shí)VNB的治療效能。在腫瘤接種之后第3天開始治療。圖20A顯示了給負(fù)載了H460腫瘤的小鼠施用5mg/kg和10mg/kg劑量的VNB時(shí)產(chǎn)生的體內(nèi)效力，并與鹽水對(duì)照組進(jìn)行了比較。兩種給藥方法都以劑量依賴方式導(dǎo)致顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制，沒(méi)有顯示出明顯的不良毒性征兆(即，體重減輕)。當(dāng)聯(lián)合施用G4 AS寡核苷酸(15mg/kg)和VNB(5mg/kg)治療H460腫瘤時(shí)，能觀察到與單獨(dú)施用任何一種物質(zhì)相比更顯著的H460腫瘤生長(zhǎng)遲滯(圖20B)。而且，小鼠不顯示出任何明顯的毒性征兆(即，體重減輕)。在第29天，將存在或不存在G4 AS或SC寡核苷酸時(shí)，用5mg/kg VNB治療的小鼠體內(nèi)的平均腫瘤大小進(jìn)行了比較(圖20A和20B)。VNB和G4 AS寡核苷酸治療組的平均腫瘤大小是0.22±0.03cm3，這顯著小于5mg/kg VNB單獨(dú)治療或5mg/kg VNB與G4 SC寡核苷酸聯(lián)合治療的動(dòng)物體內(nèi)的平均腫瘤大小(分別是0.59±0.04和0.48±0.05cm3)。
方法利用下列方法獲得實(shí)施例5-13中得到的結(jié)果。
寡核苷酸合成合成96個(gè)以上不相重疊的嵌合的或骨架混合的(MBO)的長(zhǎng)度為19個(gè)堿基的反義寡核苷酸作為2x2 MBO，其中2x2 MBO由在任意一側(cè)以硫代磷酸酯鍵側(cè)接的兩個(gè)2′-氧-甲基RNA殘基和15個(gè)磷酸二酯DNA殘基中心核組成。用SephadexG-25色譜儀(IDT Inc.，Coralville，IA)除去每一個(gè)最終產(chǎn)物的鹽分。這種嵌合的wingmer構(gòu)型，以及硫代磷酸酯和磷酸二酯鍵(稱為2x2PS/PO)的混合提供了足夠的穩(wěn)定性，同時(shí)也降低了與硫代磷酸酯殘基有關(guān)的非特異毒性。用Trilink Biotech合成供體內(nèi)和體外試驗(yàn)的完全硫代磷酸酯化的非嵌合(DNA)反義寡核苷酸，用RP-HPLC進(jìn)行純化。
反義寡核苷酸的篩選為了確定每個(gè)寡核苷酸下調(diào)XIAP蛋白質(zhì)的能力，對(duì)1-1.2uM寡核苷酸-lipofectin復(fù)合物轉(zhuǎn)染24-48小時(shí)的T24膀胱癌細(xì)胞進(jìn)行了評(píng)價(jià)。在T24膀胱癌細(xì)胞和H460肺癌細(xì)胞中，(i)通過(guò)western分析再次證實(shí)陽(yáng)性寡核苷酸在轉(zhuǎn)染12-18小時(shí)降低XIAP蛋白水平的能力，和(ii)通過(guò)定量RT-PCR(見下文)再次證實(shí)陽(yáng)性寡核苷酸在轉(zhuǎn)染6-9小時(shí)降低XIAP mRNA水平的能力。更進(jìn)一步地鑒定和測(cè)試候選的寡核苷酸。在6-9小時(shí)，鑒定的2x2PS/PO嵌合寡核苷酸在400-1200nM的濃度范圍內(nèi)顯示出劑量依賴性的降低XIAP mRNA水平的能力。示例的寡核苷酸顯示在表6中。
表6
粗體殘基＝具有硫代磷酸酯鍵的DNA殘基，帶下劃線的殘基＝2′-氧-甲基RNA堿基，普通類型＝磷酸二酯DNA殘基。
腫瘤細(xì)胞系和異種移植動(dòng)物模型從ATCC獲得人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(大細(xì)胞類型)NCI-H460(H460)，37℃在包含5％CO2的濕潤(rùn)空氣中將細(xì)胞維持在補(bǔ)充了10％FCS的RPMI1640中。使用指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，體外傳代最大可達(dá)25代。從英國(guó)哥侖比亞省癌癥機(jī)構(gòu)聯(lián)合的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室繁殖地(British Columbia British ColumbiaCancer Agency Joint Animal Facility breeding colony)獲得雄性SCID-RAG2小鼠(7-9周大，23-26g)，飼養(yǎng)在無(wú)菌環(huán)境中。通過(guò)在小鼠背部皮下植入1×106的NCI-H460細(xì)胞在SCID-RAG2小鼠中建立NCI-H460細(xì)胞的腫瘤模型。
用反義核酸和抗癌藥處理細(xì)胞轉(zhuǎn)染前一天，將H460細(xì)胞平鋪在6孔或96孔組織培養(yǎng)皿中。用Lipofectamine 2000(Life Technologies)以脂質(zhì)體-寡核苷酸復(fù)合物的形式將硫代磷酸酯反義寡核苷酸遞送到細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染4.5或6小時(shí)后，用包含10％FBS的RPMI培養(yǎng)基替換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，再孵育細(xì)胞24或48小時(shí)。
實(shí)時(shí)定量RT-PCR利用RNeasy微型離心法柱和DNase處理(QIAGEN Valencia，CA)立即從脂質(zhì)體-寡核苷酸復(fù)合物處理6小時(shí)的H460細(xì)胞中分離總RNA。用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法測(cè)量特異的XIAP mRNA。設(shè)計(jì)的XIAP正反向引物(600nM)和探針(200nM)(5′-GGTGATAAAGTAAAGTGCTTTCACTGT-3′(SEQ ID NO 293)，6FAM-CAACATGCTAAATGGTTCCAGGGTGCAAATATC-TAMRA(SEQ ID NO294)和5′-TCAGTAGTTCTTACCAGACACTCCTCAA-3′(SEQ ID NO295)跨越了外顯子3-4和4-5的結(jié)合點(diǎn)。為阻止檢測(cè)出任何可能的基因組DNA污染物，其中的一個(gè)引物和探針被設(shè)計(jì)成重疊內(nèi)含子-外顯子邊界的形式。利用TaqMan EZ RT-PCR試劑盒(PE/ABI，F(xiàn)oster City，CA)在ABI棱鏡7700序列檢測(cè)系統(tǒng)(ABI prism 7700 Sequence Detection System)(PE/ABI)中反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增RNA。RT步驟的熱循環(huán)條件是50℃2分鐘，60℃30分鐘，95℃5分鐘，然后進(jìn)行45個(gè)PCR循環(huán)(每個(gè)循環(huán)94℃20秒，60℃1分鐘)。相對(duì)于未處理的對(duì)照細(xì)胞計(jì)算每個(gè)樣品的XIAP mRNA水平。利用基線SD30X的閾值，用PE/ABI提供的引物和探針通過(guò)循環(huán)閾方法(Ct)確定XIAPmRNA水平，參照GAPDH含量將XIAP水平標(biāo)準(zhǔn)化。
蛋白印跡分析用冰冷的包含蛋白酶抑制劑(完全的微型蛋白酶抑制片劑；BoehringerMannheim GmBH，曼海姆，德國(guó))的溶解緩沖液(50mM Tris，150mM NaCl，2.5mM EDTA，0.1％SDS，0.5％脫氧膽酸鈉，1％NP-40，0.02％疊氮化鈉)溶解細(xì)胞或腫瘤組織樣品。在冰上孵育30分鐘后，以10,000rpm將樣品離心15分鐘，保存在-20℃。利用去污劑-相容的Bio-Rad測(cè)定(Bio-Rad Labs，Hercules，CA)確定溶解的提取物中的蛋白含量。在12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠或4-15％的梯度SDS-聚丙烯酰胺預(yù)制凝膠(Bio-Rad)上分離等量的蛋白質(zhì)(40ug/泳道)，并將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維薄膜上。使用了針對(duì)XIAP，Bcl-2(DAKO，Glostrup，丹麥)，Bax(Sigma，St.Louis，MO)，β-肌動(dòng)蛋白(Sigma)，胱冬酶-3(BD PharMingen San Diego，CA)和PARP(BD PharMingen)的第一抗體。第二抗體是適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合辣根的抗小鼠或抗兔IgG(Promega，Madison，WI)。利用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL；Amersham Pharmacia Biotech，Buckinghamshire，英國(guó))來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)，曝光到Kodak放射自顯影薄膜后進(jìn)行目測(cè)檢驗(yàn)。實(shí)施光密度掃描(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)，通過(guò)體積/面積積分來(lái)量化條帶的強(qiáng)度。在剝離和再探查時(shí)，用各自泳道的β-肌動(dòng)蛋白水平將細(xì)胞內(nèi)的XIAP，胱冬酶-3，Bcl-2和Bax標(biāo)準(zhǔn)化。
細(xì)胞生長(zhǎng)以及成活或死亡測(cè)量通過(guò)比色MTT細(xì)胞成活力/增殖測(cè)定來(lái)確定H640細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制。簡(jiǎn)而言之就是用脂質(zhì)體-寡核苷酸復(fù)合物處理細(xì)胞4.5小時(shí)，然后在存在或不存在抗癌藥的條件下，37℃在沒(méi)有轉(zhuǎn)染試劑或寡核苷酸的培養(yǎng)基中再孵育48小時(shí)。向每孔中加入MTT(25ug/孔)，在37℃孵育平皿3小時(shí)。孵育步驟后，加入200ul DMSO溶解著色甲月替產(chǎn)物。利用微量滴定板讀數(shù)器(Dynex Technologies Inc.，Chantilly，VA)在570nm波長(zhǎng)處讀出平皿讀數(shù)。參照未處理的對(duì)照，將寡核苷酸處理孔中的成活細(xì)胞的百分比標(biāo)準(zhǔn)化。所有測(cè)定都以一式三份方式實(shí)施。
凋亡的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定用脂質(zhì)體-寡核苷酸復(fù)合物處理細(xì)胞4.5小時(shí)，37℃在沒(méi)有轉(zhuǎn)染試劑或寡核苷酸的培養(yǎng)基中再孵育48小時(shí)細(xì)胞。孵育后，收獲細(xì)胞，用樣品緩沖液(存在于不含Ca++和Mg++的PBS中的0.5％的葡萄糖)洗滌細(xì)胞兩次，4℃在70％冷乙醇中固定至少18小時(shí)。以3000rpm離心樣品10分鐘，然后再將樣品懸浮在含有50ug/ml碘化丙啶(PI)和400U/ml RNase的樣品緩沖液中。室溫下和冰上各孵育樣品30分鐘，接下來(lái)進(jìn)行流細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。用EXPO軟件(Applied Cytometry Systems，Sacramento，CA)形成直方圖，直方圖被用來(lái)確定排除碎片之后的細(xì)胞周期相分布。認(rèn)為亞Gl/GO細(xì)胞分?jǐn)?shù)代表凋亡細(xì)胞。
核形態(tài)用脂質(zhì)體-寡核苷酸復(fù)合物處理細(xì)胞4.5小時(shí)，37℃在沒(méi)有轉(zhuǎn)染試劑或寡核苷酸的培養(yǎng)基中再孵育細(xì)胞48小時(shí)。收獲細(xì)胞，用0.10ug/ml DAPI(4′，6二脒基-2-2-苯吲哚)(4′，6-diamidino-2-2-phenylindole)在室溫下染色30分鐘。將細(xì)胞放置在玻片，細(xì)胞離心涂片(cytospun)上，用Leica顯微鏡和40X物鏡在UV熒光照明下進(jìn)行觀察。利用Imagedatabase V4.01軟件(Leica，德國(guó))捕獲數(shù)字圖像。
體內(nèi)抗腫瘤活性在負(fù)載NCI-H460腫瘤的雄性RAG2免疫缺陷小鼠或負(fù)載LCC6腫瘤的雌性RAG2小鼠體內(nèi)進(jìn)行效力實(shí)驗(yàn)。在腫瘤接種之后第3天開始治療。每天腹膜內(nèi)注射施用鹽水(對(duì)照)、G4AS寡核苷酸(5或15mg/kg)或G4 SC寡核苷酸(5或15mg/kg)，每周注射5劑，持續(xù)三周。在腫瘤接種之后第3，7，11和17天，由尾靜脈通過(guò)靜脈內(nèi)施用長(zhǎng)春瑞濱(VNB，5或10mg/kg)，可單獨(dú)施用或與寡核苷酸聯(lián)合一起施用。當(dāng)與VNB結(jié)合施用寡核苷酸時(shí)，在ODN處理之后四小時(shí)實(shí)施藥物治療。
每天觀察小鼠。用體重測(cè)量和應(yīng)激征象(例如昏睡、波紋表皮、共濟(jì)失調(diào))來(lái)檢測(cè)可能的毒性。腫瘤形成潰瘍或腫瘤體積達(dá)1cm3或更大時(shí)動(dòng)物被殺死。利用公式1/2[長(zhǎng)(cm)]×[寬(cm)]2將腫瘤的數(shù)字測(cè)徑器測(cè)量值轉(zhuǎn)變?yōu)槠骄[瘤大小(cm3)。利用從每組的至少兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)獲得的每只小鼠的平均腫瘤大小來(lái)計(jì)算組平均腫瘤大小±SE(n＝6只小鼠)。
腫瘤和組織處理在腫瘤接種和處理后第21或第24天收集小鼠腫瘤。一部分腫瘤組織固定在福爾馬林中。將石蠟包埋組織切片，利用蘇木素伊紅染色進(jìn)行大體病理組織學(xué)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究泛素表達(dá)。在溶解緩沖液中將腫瘤的另一部分勻漿用于蛋白印跡分析(參見上面)。
統(tǒng)計(jì)分析利用學(xué)生t檢驗(yàn)來(lái)測(cè)定兩個(gè)處理組間的統(tǒng)計(jì)顯著性。利用單向ANOVA(方差分析)，以及通過(guò)Shelle檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(Statistica release 4.5，StatSoft Inc.Tulsa，OK)比較不同處理組的post-hoc測(cè)試來(lái)進(jìn)行多重比較。P＜0.05時(shí)，認(rèn)為數(shù)據(jù)有意義。
實(shí)施例14反義HIAP1寡核苷酸減少HIAP1 RNA和多肽表達(dá)在兩個(gè)不同的條件下，利用上述實(shí)施例3中描述的引物和探針，通過(guò)蛋白印跡分析從作為寡核苷酸的15個(gè)HIAP1反義核堿基寡聚物組成的庫(kù)中篩選能下調(diào)蛋白質(zhì)的寡聚物，通過(guò)TaqMan從庫(kù)中篩選能下調(diào)RNA的寡聚物?？梢岳脴?biāo)準(zhǔn)northern印跡分析或RT-PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)HIAP1 RNA水平。在基礎(chǔ)條件下或在放線菌酮誘導(dǎo)(用亞中毒劑量處理24小時(shí))條件下給細(xì)胞施用反義寡核苷酸。放線菌酮(CHX)可以導(dǎo)致誘導(dǎo)出10-200倍的HIAP1 mRNA，具體值取決于處理的細(xì)胞系。這將依次導(dǎo)致HIAP蛋白質(zhì)增加，在蛋白印跡中能看到這一點(diǎn)(70kda的條帶)。CHX的這些效果是由兩個(gè)不同的作用機(jī)理引起的。首先，CHX通過(guò)阻斷NFkB的抑制劑——一種不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)IkB的從頭合成而活化NFkB，NFkB是一種已知的HIAP1翻譯誘導(dǎo)物。另一種蛋白質(zhì)合成抑制劑嘌呤霉素，以及誘導(dǎo)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的TNF-α可模擬該效果，其中信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致產(chǎn)生磷酸化，ubiquination和IkB降解。只有CHX導(dǎo)致更進(jìn)一步地穩(wěn)定HIAP1 mRNA，從阻擋從頭轉(zhuǎn)錄的放線菌素D和CHX存在時(shí)，HIAP1信使的消失速率降低能看出這一點(diǎn)，當(dāng)放線菌素D和嘌呤霉素或TNF-α聯(lián)合時(shí)結(jié)果則相反。
用lipofectin和寡核苷酸(混雜的存活蛋白，無(wú)寡核苷酸，反義APO 1到APO 15)轉(zhuǎn)染SF295惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞或不處理細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染之后六小時(shí)從細(xì)胞中分離RNA，利用定量PCR(TaqMan分析)測(cè)定HIAP1 mRNA的水平，參照GAPDH mRNA將結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，其中混雜的存活蛋白寡核苷酸轉(zhuǎn)染后的值設(shè)置為1.0。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，即編纂的三個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在圖21中。混雜的存活蛋白寡核苷酸，模擬轉(zhuǎn)染和未處理的(未轉(zhuǎn)染)細(xì)胞都顯示出類似的HIAP1 mRNA水平。與模擬轉(zhuǎn)染或存活蛋白混雜對(duì)照寡核苷酸轉(zhuǎn)染(5′-mUmAmAGCTGTTCTATGTGmUmUmC-3′；SEQ ID NO296)相比，這15個(gè)反義寡核苷酸中的七個(gè)(APO 1，2，7，8，9，12，15)顯示出幾乎50％的降低(圖21)。一些寡核苷酸導(dǎo)致誘導(dǎo)HIAP1 mRNA，這可能是對(duì)非特異中毒寡核苷酸的應(yīng)激反應(yīng)。如果寡核苷酸能干擾翻譯過(guò)程，那么即使信使RNA增加，反義寡核苷酸可能仍能有效降低HIAP1蛋白水平。
在誘導(dǎo)表達(dá)HIAP1的細(xì)胞中，也研究了HIAP1反義核堿基寡聚物對(duì)HIAP1蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)的影響。用寡核苷酸轉(zhuǎn)染或模擬轉(zhuǎn)染SF295細(xì)胞。然后用10ug/ml的放線菌酮處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時(shí)以誘導(dǎo)70kDa HIAP1mRNA和蛋白質(zhì)。用抗-HIAPI多克隆抗體，通過(guò)蛋白印跡分析測(cè)定蛋白水平，在相同印跡的探察中，參照肌動(dòng)蛋白將蛋白水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。蛋白印跡結(jié)果的掃描顯示在圖22A中。在圖22B中畫出了相對(duì)于模擬結(jié)果(設(shè)置為100％)的光密度掃描結(jié)果圖。在50％處畫線很容易鑒定出最有效的反義寡核苷酸。與未處理樣品相比，轉(zhuǎn)染過(guò)程本身(例如，模擬或混雜的存活蛋白)會(huì)誘導(dǎo)HIAP 1蛋白質(zhì)，western免疫印跡中已經(jīng)顯示這一點(diǎn)。
這15個(gè)測(cè)試核堿基寡聚物中的六個(gè)(APO 1，2，7，8，12，15)顯示出高活性，或在蛋白質(zhì)和mRNA測(cè)定中都具有顯著活性，而且不導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的HIAP1 mRNA增加，但APO 4，6，11，13，14和APO 2的對(duì)照寡核苷酸(錯(cuò)配或反極性，見下文和圖23，24)都導(dǎo)致HIAP1 mRNA增加(圖21)。注意，APO 6也顯示出毒性跡象，從總蛋白的廣泛下降能看出這一點(diǎn)(圖23)。
為了更進(jìn)一步地研究在放線菌酮誘導(dǎo)條件下HIAP 1反義寡核苷酸的效力，在APO 2轉(zhuǎn)染之后6小時(shí)用TaqMan實(shí)時(shí)PCR測(cè)定HIAP1 mRNA的變化，其中APO 2靶向HIAP1內(nèi)含子內(nèi)的Alu重復(fù)，能最大程度地阻斷CHX誘導(dǎo)的HIAP1 mRNA和蛋白質(zhì)上調(diào)。這實(shí)驗(yàn)的對(duì)照是針對(duì)APO 2的三個(gè)寡核苷酸一個(gè)混雜序列(除了順序隨機(jī)外，堿基組成相同，5′-AAGGGCGGCGGAGTGAGAC-3′；SEQ ID NO297)，一個(gè)反極性序列(除了方向相反外，堿基組成相同，序列順序相同5′-AGAGGACGGAGTCGGAGGC-3′；SEQ ID NO298)，和一個(gè)錯(cuò)配序列(在19個(gè)堿基中包含四個(gè)錯(cuò)配，5′-CGGAGCGTGAGGATGAGA-3′；SEQ IDNO299)。
與混雜的存活蛋白對(duì)照相比，APO 2反義轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致mRNA降低50％，與蛋白質(zhì)結(jié)果完全相配，而APO 2的混雜對(duì)照(圖24中的H1 sc apo2)根本不改變HIAP1 mRNA水平(這里重復(fù)兩次，在兩個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行)。然而，結(jié)果卻顯示錯(cuò)配對(duì)照ODN(H1 mm apo 2)和反極性對(duì)照寡核苷酸(H1 RV apo 2)6小時(shí)時(shí)誘導(dǎo)6-7倍的HIAP1 mRNA。正如所料，這些寡核苷酸不再靶向HIAP1，但仍可以因?yàn)楹?jiǎn)并性和這些序列的重復(fù)性靶向Alu重復(fù)。因此，這兩個(gè)對(duì)照對(duì)細(xì)胞有毒性，會(huì)產(chǎn)生導(dǎo)致HIAP1被誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)是可能的。反義APO 2寡核苷酸也可能產(chǎn)生該影響，但在這種情況下，APO 2也會(huì)使誘導(dǎo)的HIAP1 mRNA降解，與混雜的存活蛋白對(duì)照相比，最終導(dǎo)致HIAP1 mRNA的相對(duì)降低，而且與混雜的存活蛋白對(duì)照相比，在轉(zhuǎn)染和CHX處理之后會(huì)降低HIAP1蛋白質(zhì)的相對(duì)誘導(dǎo)倍數(shù)。
這六個(gè)反義HIAP1核堿基寡聚物包括兩個(gè)非常有效的針對(duì)內(nèi)含子序列的寡核苷酸(APO 1和APO 2，APO 2顯示出更好的活性)。在治療上這些寡核苷酸能用于癌癥或自身免疫紊亂的治療。針對(duì)內(nèi)含子序列的寡核苷酸可能只靶向前mRNA(存在時(shí)間非常短的靶標(biāo))，不靶向加工成熟形式的HIAP1。除非想通過(guò)靶向內(nèi)含子-外顯子界線或分支點(diǎn)改變拼接，否則典型地，反義核酸不靶向內(nèi)含子。這通常導(dǎo)致遺漏外顯子，而不是導(dǎo)致RNase介導(dǎo)的信使RNA的降解。兩種機(jī)理可能都有利于增強(qiáng)凋亡，因?yàn)檫z漏將導(dǎo)致編碼HIAP1的頭兩個(gè)重要BIR域的外顯子缺失。APO 2反義ODN也通過(guò)靶向19個(gè)堿基中的18個(gè)連續(xù)的堿基而靶向存活蛋白的內(nèi)含子，但我們沒(méi)有看到存活蛋白蛋白質(zhì)的任何損失；在寡核苷酸治療之后只有HIAP1被降低了，這表明了HIAP1反義寡核苷酸的特異性。這些反義寡核苷酸擊中HIAP1內(nèi)含子中的Alu序列以及許多其它基因中可能的Alu序列，誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡(見下文)，這可能是HIAP1和一些其它重要基因下調(diào)的結(jié)果，因此，如果對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有太大毒性就具有治療價(jià)值。
據(jù)報(bào)道癌細(xì)胞具有更多含有Alu的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，因此可能對(duì)用靶向Alu的核堿基寡聚物誘導(dǎo)凋亡更敏感。此外，核堿基寡聚物APO 1和APO 2的殺死效果可能是由于靶向Alu的序列和HIAP1同時(shí)作用的綜合效應(yīng)引起的。當(dāng)細(xì)胞暴露于某些毒性劑中時(shí)，這一雙重效應(yīng)將成為能有效防止由NFkB途徑誘導(dǎo)的HIAP1正常應(yīng)激反應(yīng)的方法。應(yīng)激反應(yīng)很可能癌細(xì)胞抗凋亡程序的一部分。通過(guò)阻斷HIAP1表達(dá)，我們計(jì)算了這種抗凋亡應(yīng)激反應(yīng)，因此預(yù)計(jì)了癌細(xì)胞的死亡。
實(shí)施例15HIAP1反義寡核苷酸增加細(xì)胞毒性和化學(xué)致敏性也對(duì)HIAP1反義核堿基寡聚物化學(xué)致敏SF295細(xì)胞的效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。用三個(gè)不同的反義寡核苷酸(APO 7，APO 15和SCAPO 2(對(duì)照))中的一個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。寡核苷酸轉(zhuǎn)染后二十四小時(shí)，將細(xì)胞與阿霉素一起再孵育24小時(shí)，其中孵育在通過(guò)測(cè)定WST-1確定細(xì)胞存活率之前進(jìn)行。
圖25顯示了用上述HIAP1寡核苷酸轉(zhuǎn)染，然后用濃度增加的阿霉素處理的SF295細(xì)胞的WST-1存活曲線。用阿霉素處理時(shí)，與用不能降低HIAP1mRNA水平的寡核苷酸處理的細(xì)胞相比，導(dǎo)致HIAP1 mRNA降低的兩個(gè)寡核苷酸也顯示存活率下降。因此，通過(guò)反義或其它方式降低HIAP1可以化學(xué)致敏對(duì)許多化學(xué)療藥的細(xì)胞毒素作用具有高度抵抗力的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。
表7中顯示了能夠用于本發(fā)明的方法中的另外89個(gè)HIAP1反義序列。黑體是在人HIAP1和人HIAP2之間100％相同或具有一個(gè)或兩個(gè)錯(cuò)配的序列。
表7
為了尋找合適的可用作反義核堿基寡聚物的序列，我們也分析人HIAP2。鑒定的序列顯示在表8中。
表8
下文的表9也提供了其它的反義IAP核堿基寡聚物，包括在美國(guó)專利No.6,087,173的表2中描述的那些寡聚物。
表9
在美國(guó)專利6,355,194；6,165,788；6,077,709；5,958,772；5,958,771，公開號(hào)為2003/0125287 A1和2002/0137708美國(guó)專利申請(qǐng)，以及Carter et al.，″Regulation and targeting of antiapoptotic XIAP in acute myeloid leukemia″(Leukemia advance online publication 11 September 2003；doi10.1038/sj.leu.2403113)和Bilim et al.，Int.J.Cancer 10329-37(2003)中描述了在本發(fā)明的方法中有用的反義IAP核堿基寡聚物的其它序列。
其它實(shí)施方案象具體和個(gè)別指出的合并作為參考的每份獨(dú)立的出版物或?qū)＠暾?qǐng)的一樣，在說(shuō)明書中提到的所有出版物和專利申請(qǐng)?jiān)谶@里被合并作為參考。
已經(jīng)采用與具體實(shí)施方案有關(guān)的方式描述了本發(fā)明，應(yīng)理解它能作更進(jìn)一步的修改，該申請(qǐng)含蓋遵循本發(fā)明的原則，以及包含與本發(fā)明公開內(nèi)容相偏離的內(nèi)容的發(fā)明的任何變化，應(yīng)用或修改，其中偏離的屬于本發(fā)明所屬領(lǐng)域的已知或常規(guī)操作的范圍，可作為在上文中列出的必要特征亦在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
序列表<110>艾吉拉醫(yī)療股份有限公司(AEGERA Therapeutics，Inc.et al)<120>利用反義IAP寡聚物和化療劑治療增生性疾病<130>07891/039WO2<150>60/516,263<151>2003-10-30<160>490<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，6，8，12，16<223>n＝T或U<400>1aaaanncnaa gnaccngca19<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，3，10，14<223>n＝T或U<400>2ncnagagggn ggcncagga19<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物
<221>misc_feature<222>5，7，9，11，13，19<223>n＝T或U<400>3cagananana ngnaacacn19<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，10，11，12，13，14，15，16，18，19<223>n＝T或U<400>4ngagagcccn nnnnnngnn19<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，5，10，12，13，14，16，19<223>n＝T或U<400>5agnangaaan annncngan19<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，3，6，7，12，14，16，17，19<223>n＝T或U<400>6annggnncca angngnncn19
<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，2，10，12，14，15，16，17<223>n＝T或U<400>7nnagcaaaan angnnnnaa19<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，5，6，9，10，11，12，13，16，18<223>n＝T或U<400>8ngaannaann nnnaananc19<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，3，11，17，18<223>n＝T或U<400>9anncaaggca ncaaagnng19<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物
<221>misc_feature<222>2，7，10，11，14，15<223>n＝T或U<400>10gncaaancan naannagga19<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，5，7，12，14，17<223>n＝T或U<400>11aanangnaaa cngngangc19<210>12<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>7，13，16，19<223>n＝T或U<400>12gcagaanaaa acnaanaan19<210>13<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>6，9，11，12，13<223>n＝T或U<400>13gaaagnaana nnnaagcag19
<210>14<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，2，9，12，13，18<223>n＝T或U<400>14nnaccacanc anncaagnc19<210>15<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，6，9，14，15<223>n＝T或U<400>15cnaaanacna gagnncgac19<210>16<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>11<223>n＝T或U<400>16acacgaccgc naagaaaca19<210>17<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，3，8，9，11，16<223>n＝T或U<400>17nanccacnna ngacanaaa19<210>18<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，3，5，12，19<223>n＝T或U<400>18gnnanaggag cnaacaaan19<210>19<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，5<223>n＝T或U<400>19aangngaaac acaagcaac19<210>20<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，5，7，9，10，17<223>n＝T或U<400>20
acannanann aggaaancc19<210>21<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，3，5，11，12，13，14，16<223>n＝T或U<400>21cnngnccacc nnnncnaaa19<210>22<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，4，5，7，9，10，16<223>n＝T或U<400>22ancnncncnn gaaaanagg19<210>23<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，4，11，13，14<223>n＝T或U<400>23ccnncaaaac ngnnaa aag 19<210>24<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，4，6，12<223>n＝T或U<400>24angncngcag gnacacaag19<210>25<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，4，6，7，12，14，15，17<223>n＝T或U<400>25ancnannaaa cncnncnac19<210>26<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>8，14，15<223>n＝T或U<400>26acaggacnac cacnnggaa19<210>27<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，7，9，10，13，16<223>n＝T或U
<400>27ngccagngnn gangcngaa19<210>28<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，4，15，18<223>n＝T或U<400>28gnanaaagaa acccngcnc19<210>29<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>8，10，12，15，16<223>n＝T或U<400>29cgcacggnan cnccnncac19<210>30<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，8，12，19<223>n＝T或U<400>30cnacagcngc angacaacn19<210>31<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，7，9，13，15，16<223>n＝T或U<400>31gcngagncnc cananngcc19<210>32<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，5，6，7，10，12，14，16，17<223>n＝T或U<400>32anacnnnccn gngncnncc19<210>33<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，7，9，14，15，16<223>n＝T或U<400>33ganaaancng caannnggg19<210>34<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，2，4，9，13，19<223>n＝T或U
<400>34nngnagacng cgnggcacn19<210>35<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，6，8，12<223>n＝T或U<400>35accanncngg anaccagaa19<210>36<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，4，5，6，11，12，13，15，18<223>n＝T或U<400>36agnnnncaac nnngnacng19<210>37<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，5，7，9，12，13<223>n＝T或U<400>37angancncng cnncccaga19<210>38<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，9，11，13<223>n＝T或U<400>38aganggccng ncnaaggca19<210>39<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，4，6，14，17，19<223>n＝T或U<400>39agnncncaaa aganagncn19<210>40<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，4，6，9，11，13，15<223>n＝T或U<400>40gngncngana nancnacaa19<210>41<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，6，8，10，13，15，17
<223>n＝T或U<400>41ncgggnanan ggngncnga19<210>42<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>6，7，10，15，17，19<223>n＝T或U<400>42cagggnnccn cgggnanan19<210>43<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，4，6，7，13，17<223>n＝T或U<400>43gcnncnncac aanacangg19<210>44<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>7，8，10，19<223>n＝T或U<400>44ggccagnncn gaaaggacn19<210>45<211>19<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，7，9，11，12，17，18<223>n＝T或U<400>45gcnaacncnc nnggggnna19<210>46<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，4，7，12<223>n＝T或U<400>46gngnagnaga gnccagcac19<210>47<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>7，12，13，16<223>n＝T或U<400>47aagcacngca cnnggncac19<210>48<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature
<222>1，2，6，7，8，9<223>n＝T或U<400>48nncagnnnnc caccacaac19<210>49<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，13，14<223>n＝T或U<400>49acgancacaa ggnncccaa19<210>50<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，6，8，10，11，13<223>n＝T或U<400>50ncgccngngn ncngaccag19<210>51<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<400>51ccggcccaaa acaaagaag19<210>52<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，4，8，9，14，16，17<223>n＝T或U<400>52ganncacnnc gaanannaa 19<210>53<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，3，10，18<223>n＝T或U<400>53nancagaacn cacagcanc 19<210>54<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>7，8，9，11，12，16，17，18<223>n＝T或U<400>54ggaagannng nngaannng 19<210>55<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，3，8，12，16，17，18<223>n＝T或U
<400>55ncngccangg anggannnc19<210>56<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，10，14，17，18<223>n＝T或U<400>56aagnaaagan ccgngcnnc19<210>57<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，6，8，10，14，16<223>n＝T或U<400>57cngagnanan ccangnccc19<210>58<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>7，10，13，14，16，17<223>n＝T或U<400>58gcaagcngcn ccnngnnaa19<210>59<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>7，12，18<223>n＝T或U<400>59aaagcanaaa anccagcnc19<210>60<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>9，10，11，14，15，16，18<223>n＝T或U<400>60gaaagcacnn nacnnnanc19<210>61<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，8，9，14，18，19<223>n＝T或U<400>61acngggcnnc caancagnn19<210>62<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，3，5，6，15，17，18<223>n＝T或U
<400>62gnngnnccca agggncnnc19<210>63<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，9，14，15，16<223>n＝T或U<400>63acccnggana ccannnagc19<210>64<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，3，4，6，13，15，16，17<223>n＝T或U<400>64ngnncnaaca ganannngc19<210>65<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，3，5，7，8，10，11，13，17，18<223>n＝T或U<400>65nanananncn ngncccnnc19<210>66<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，4，8，12，14，15，17，18，19<223>n＝T或U<400>66agnnaaanga ananngnnn19<210>67<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>6，9，14，18<223>n＝T或U<400>67gacacnccnc aagngaang19<210>68<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，2，3，5，9，12，13，15，16<223>n＝T或U<400>68nnncncagna gnncnnacc19<210>69<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，3，6，9，12，14，15，16，17，19
<223>n＝T或U<400>69gnnagngang gngnnnncn19<210>70<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，7，9，12，16，17，19<223>n＝T或U<400>70aganggnanc ancaanncn19<210>71<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，3，8，13，14，15，16<223>n＝T或U<400>71ngnaccanag gannnngga19<210>72<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>6，7，10，12，16，17，19<223>n＝T或U<400>72ccccanncgn anagcnncn19<210>73<211>19<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，3，5，6，7，8，10，11，14，16，19<223>n＝T或U<400>73annannnncn naangnccn19<210>74<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，8，9，10，12，15，16，19<223>n＝T或U<400>74caagngannn anagnngcn19<210>75<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，5，7<223>n＝T或U<400>75nagancngca accagaacc19<210>76<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature
<222>3，5，6，10，13，15，17，18，19<223>n＝T或U<400>76cancnngcan acngncnnn19<210>77<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，4，8，11，13，14，18<223>n＝T或U<400>77ccnnagcngc ncnncagna19<210>78<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，6，8，11，13，14<223>n＝T或U<400>78aagcnncncc ncnngcagg19<210>79<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，4，5，6，8，10，14<223>n＝T或U<400>79anannncnan ccanacaga19<210>80<211>19
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，6，8<223>n＝T或U<400>80cnagangncc acaaggaac19<210>81<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>7，8，10，11，12，18<223>n＝T或U<400>81agcacanngn nnacaagng19<210>82<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>7，15，16，18<223>n＝T或U<400>82agcacanggg acacnngnc19<210>83<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物
<221>misc_feature<222>2，3，9，12，16，18<223>n＝T或U<400>83cnngaaagna angacngng19<210>84<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，6，8，13，14，18，19<223>n＝T或U<400>84ccnacnanag agnnagann19<210>85<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，3，7，13，16<223>n＝T或U<400>85anncaancag ggnaanaag19<210>86<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，8，9，14<223>n＝T或U<400>86aagncagnnc acancacac19<210>87
<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，13，17<223>n＝T或U<400>87cagnaaaa aaaangganaa19<210>88<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，2，6，7，9，12，14，17<223>n＝T或U<400>88nncagnnana gnangangc19<210>89<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，6，7，13，14，18<223>n＝T或U<400>89nacacnnaga aannaaanc19<210>90<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物
<221>misc_feature<222>1，3，5，7，9，10，11<223>n＝T或U<400>90ncncnancnn nccaccagc19<210>91<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，8<223>n＝T或U<400>91agaanccnaa aacacaaca19<210>92<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，3，12，16，18，19<223>n＝T或U<400>92anncgcacaa gnacgngnn19<210>93<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，3，7，11，13，14，18<223>n＝T或U<400>93ngncagnaca ngnnggcnc19
<210>94<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，7，9，10，11，12，18，19<223>n＝T或U<400>94acanagngnn nngccacnn19<210>95<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，3，4，7，9，13，19<223>n＝T或U<400>95cnnngancng gcncagacn19<210>96<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>10，11，12，18，19<223>n＝T或U<400>96gaaaccacan nnaacagnn19<210>97<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物
<221>misc_feature<222>3，5，7，10，11，18<223>n＝T或U<400>97ggnancnccn ncaccagna19<210>98<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，9，10，13，15，17<223>n＝T或U<400>98angaccacnn ccncnangg19<210>99<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，11，12，13，15<223>n＝T或U<400>99ganaccagaa nnngn15<210>100<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，3，4，5，13<223>n＝T或U<400>100ngnnnaagac canag15
<210>101<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，7，9，13，16<223>n＝T或U<400>101gcngagncnc canacngcc19<210>102<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，6，8，15，19<223>n＝T或U<400>102ggcncncngc ccacngaan19<210>103<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，4，5，7，9，10，16<223>n＝T或U<400>103ancnncncnn gaaaanagg19<210>104<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>7，8，9，12，13，14，19<223>n＝T或U<400>104cagagannnc annnaacgn19<210>105<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，4，5，9，10，13，14，16<223>n＝T或U<400>105ancnngacnn gannanagg19<210>106<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，10，11，13，15，16，18<223>n＝T或U<400>106gganaaaagn ncncnncna19<210>107<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>8，10，12，15，16<223>n＝T或U<400>107
cgcacggnan cnccnncac19<210>108<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，7，13，16，17<223>n＝T或U<400>108cnacgcncgc cancgnnca19<210>109<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，5，8，10，12<223>n＝T或U<400>109cacnnccncn anggcacgc19<210>110<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>8，10，12，15，16<223>n＝T或U<400>110cgcacccnan cnggnncac19<210>111<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，7，9，13，15，16<223>n＝T或U<400>111gcngagncnc cananngcc19<210>112<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，6，7，8，15，19<223>n＝T或U<400>112ggcncnnncg ccacngaan19<210>113<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，5，7，11，13，17<223>n＝T或U<400>113ccgnnanacc ncngagncg19<210>114<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，9，14，15，16<223>n＝T或U
<400>114gcngacacnc caannngcc19<210>115<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，6，8，11<223>n＝T或U<400>115accanncngg naaccagaa19<210>116<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，11，14，17<223>n＝T或U<400>116ngcccaagaa nacnagnca19<210>117<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，8，12，13<223>n＝T或U<400>117accanagngg anngcagaa19<210>118<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>8，12，14，15<223>n＝T或U<400>118aagaccanag gncnnacca19<210>119<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，4，8，9，11，12，17，19，20<223>n＝T或U<400>119ganncacnnc nncgaanann aa22<210>120<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，6，8，12，15，17，18<223>n＝T或U<400>120ngaaangnaa ancancnnc19<210>121<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，4，6，8，9，13，16，17<223>n＝T或U
<400>121ganncngnnc ganaannaa19<210>122<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，4，6，11，12，16，17<223>n＝T或U<400>122aannanaagc nncacnnag19<210>123<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，7，9，13，15，16<223>n＝T或U<400>123gcngagncnc cananngcc19<210>124<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，6，7，8，15，19<223>n＝T或U<400>124ggcncnnngc ccacngaan19<210>125<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，6，8，12<223>n＝T或U<400>125accanncngg anaccagaa19<210>126<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>8，12，14，15<223>n＝T或U<400>126aagaccanag gncnnacca19<210>127<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，4，5，7，9，10，16<223>n＝T或U<400>127ancnncncnn gaaaanagg19<210>128<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，10，11，13，15，16，18
<223>n＝T或U<400>128gganaaaagn ncncnncna19<210>129<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，5，7，10，11，18<223>n＝T或U<400>129ggnancnccn ncaccagna19<210>130<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，9，10，13，15，17<223>n＝T或U<400>130angaccacnn ccncnangg19<210>131<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>基于人(Homo sapiens)
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<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，5，7，10，12，13，14，15<223>n＝T或U<400>189acngncnccn cnnnnccag19<210>190<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，2，3，4，6，9，10，11，12，16<223>n＝T或U<400>190nnnnangcnn nncagnagg19<210>191<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>6，8，14，19<223>n＝T或U<400>191acgaancngc agcnaggan19<210>192<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，6，8，9，17，18，19<223>n＝T或U<400>192caagnngnna acggaannn19<210>193<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，6，13，17，18<223>n＝T或U<400>193naggcngaga ggnagcnnc19<210>194<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，3，6<223>n＝T或U<400>194
gnnacngaag aaggaaaag19<210>195<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，8，10，12，17，19<223>n＝T或U<400>195gaangagngn gnggaangn19<210>196<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，3，4，5，6，8，10<223>n＝T或U<400>196ngnnnncngn acccggaag19<210>197<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>13，15<223>n＝T或U<400>197gagccacgga aananccac19<210>198<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，4，11，12，13，17<223>n＝T或U<400>198nganggagag nnngaanaa19<210>199<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，4，5，8，10，15，16，17<223>n＝T或U<400>199gannngcncn ggagnnnac19<210>200<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>10，11，13，14，17，18，19<223>n＝T或U<400>200ggcagaaaan ncnngannn19<210>201<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>10，17，18<223>n＝T或U
<400>201ggacaggggn aggaacnnc19<210>202<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，5，6，7，10，11，13，14，17，18<223>n＝T或U<400>202gcannnncgn nanncanng19<210>203<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，9，13，16，18<223>n＝T或U<400>203cngaaaagna agnaancng19<210>204<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>14，18<223>n＝T或U<400>204ggcgacagaa aagncaang19<210>205<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，7，9，11，17<223>n＝T或U<400>205ccacncngnc nccaggncc19<210>206<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<400>206ccaccacagg caaagcaag19<210>207<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，2，6，7，13，14，17<223>n＝T或U<400>207nncggnnccc aanngcnca19<210>208<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，2，4，9，14，15，17<223>n＝T或U<400>208nncngacana gcannancc19
<210>209<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，9，11，13，18<223>n＝T或U<400>209ngggaaaang ncncaggng19<210>210<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，3，7，13，14，15<223>n＝T或U<400>210nanaaanggg cannnggga19<210>211<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，3，5，6，12，15，16，17，18<223>n＝T或U<400>211ngncnngaag cngannnnc19<210>212<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物
<221>misc_feature<222>6，8，10，12，14，15<223>n＝T或U<400>212gaaacngngn ancnngaag19<210>213<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，3，5，9，12，17，18<223>n＝T或U<400>213ngncngcang cncaganna19<210>214<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，6，7，8，9，19<223>n＝T或U<400>214gaangnnnna aagcgggcn19<210>215<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，15，16<223>n＝T或U<400>215cacnagaggg ccagnnaaa19
<210>216<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>7，8，15，18<223>n＝T或U<400>216ccgcacnngc aagcngcnc19<210>217<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，6，10，12，13<223>n＝T或U<400>217cancancacn gnnacccac19<210>218<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>7<223>n＝T或U<400>218ccaccancac agcaaaagc19<210>219<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，7，8，18<223>n＝T或U<400>219nccaganncc caacaccng19<210>220<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，9，12，14<223>n＝T或U<400>220cccangganc ancnccaga19<210>221<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>7，8，13，15，16<223>n＝T或U<400>221aaccacnngg cangnngaa19<210>222<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，8，15，16<223>n＝T或U<400>222
caagnacnca caccnngga19<210>223<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，5，8，9，10，13，14，16，17，19<223>n＝T或U<400>223ccngnccnnn aanncnnan19<210>224<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，6，7，14，19<223>n＝T或U<400>224ngaacnngac ggangaacn19<210>225<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，5，11，15，19<223>n＝T或U<400>225nagangaggg naacnggcn19<210>226<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，5，12，14，15<223>n＝T或U<400>226ngganagcag cngnncaag19<210>227<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，5，8，9，12，16，18<223>n＝T或U<400>228ngganaanng angacncng19<210>229<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，4，5，7，13，14<223>n＝T或U
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<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，3，4，7，10，13，14，18<223>n＝T或U<400>230nanncancan ganngcanc19<210>231<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，4，5，17，18<223>n＝T或U<400>231cannnccacg gcagcanna19<210>232<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>7，8，10，13<223>n＝T或U<400>232ccaggcnncn acnaaagcc19<210>233<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_featpre<222>3，8，9，10，11，12，14，16<223>n＝T或U<400>233gcnaggannn nncncngaa19<210>234<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>9，12，13，17<223>n＝T或U<400>235acacaaganc anngacnag19<210>236<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，3，7，8，12，16，18<223>n＝T或U
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<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，6，8，10，11，13，14<223>n＝T或U<400>239gccanncnan ncnnccgga19<210>240<211>19<212>DNA<213>人工序列
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<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，9，11，12，13，16，17，18，19<223>n＝T或U<400>247ggcngcaana nnnccnnnn19<210>248<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>6，7，8，10，14，19<223>n＝T或U<400>248gagagnnncn gaanacagn19<210>249<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>6，7，12，13，15，16<223>n＝T或U<400>249acagcnncag cnncnngca19<210>250<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature
<222>4，8，11，14，16<223>n＝T或U<400>250aaanaaangc ncananaac19<210>251<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>7，9，10，12，14<223>n＝T或U<400>251gaaacancnn cngngggaa19<210>252<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，3，5，6，11，14，18<223>n＝T或U<400>252gnncnnccac nggnaganc19<210>253<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，3，5，6，8，11，13<223>n＝T或U<400>253cnncnngnag ncnccgcaa19<210>254<211>19
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，2，4，8，15，16，17<223>n＝T或U<400>254nngnccanac acacnnnac19<210>255<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>8，9，14<223>n＝T或U<400>255aaccaaanna gganaaaag19<210>256<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，4，5，8，10，13，14，15，19<223>n＝T或U<400>256angnncanan ggnnnagan19<210>257<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物
<221>misc_feature<222>1，5，6，7，8，11，12，16，17<223>n＝T或U<400>257naagnnnnac nncacnnac19<210>258<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，4，5，11，13，14，17<223>n＝T或U<400>258angnncccgg nannagnac19<210>259<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，10，13，14，16，18，19<223>n＝T或U<400>259gggcncaagn aanncncnn19<210>260<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>9，13，14<223>n＝T或U<400>260gcccaggang ganncaaac19<210>261
<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)DNA/RNA雜交<400>261gagaagatga ctggtaaca19<210>262<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)DNA/RNA雜交<221>misc_feature<222>1，17，18<223>n＝T或U<400>262ngtgctattc tgtgaann18<210>263<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<400>263tctgcttcaa ggagctggaa20<210>264<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<400>264gaaaggaaag cgcaaccg 18<210>265<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<400>265agccagatga cgaccccata gaggaacata 30
<210>266<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<400>266tggagatgat ccatgggttc a21<210>267<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<400>267gaactcctgt cctttaattc ttatcaagt29<210>268<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<400>268ctcacacctt ggaaaccact tggcatg 27<210>269<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<400>269ggtgataaag taaagtgctt teactgt 27<210>270<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<400>270tcagtagttc ttaccagaca ctcctcaa 28<210>271<211>34<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<400>271caacatgcta aatggtatcc agggtgcaaa tatc34<210>272<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<400>272gaaggtgaag gtcggagtc 19<210>273<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<400>273gaagatggtg atgggattc 19<210>274<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<400>274caagcttccc gttctcagcc20<210>275<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基是部分的脫氧核糖核苷酸，或核糖核苷酸<400>275cagagatttc atttaacgu19<210>276<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的脫氧核糖核苷酸，或核糖核苷酸<400>276cuacgctcgc catcgtuca19<210>277<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基是部分的脫氧核糖核苷酸，或核糖核苷酸<400>277ugcccaagaa tactaguca19<210>278<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，4，5，7，9，10，16<223>n＝T或U<400>278ancnncncnn gaaaanagg19<210>279<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，4，5，7，9，10，16<223>n＝T或U<400>279ancnncncnn gaaaanagg19<210>280<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，10，11，13，15，16，18<223>n＝T或U<400>280gganaaaagn ncncnncna19<210>281<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，7，9，13，15，16<223>n＝T或U<400>281gcngagncnc cananngcc19<210>282<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，7，9，13，15，16<223>n＝T或U<400>282gcngagncnc cananngcc19<210>283<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，6，7，8，15，19<223>n＝T或U<400>283
ggcncnnngc ccacngaan19<210>284<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，6，8，12<223>n＝T或U<400>284accanncngg anaccagaa19<210>285<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，6，8，12<223>n＝T或U<400>285accanncngg anaccagaa19<210>286<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>8，12，14，15<223>n＝T或U<400>286aagaccanag gncnnacca19<210>287<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，5，8，13，15，17<223>n＝T或U<400>287gggnnccncg ggnanangg19<210>288<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，5，7，12，15，16<223>n＝T或U<400>288ggnananggc gnccnnggg19<210>289<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，5，7，10，11，18<223>n＝T或U<400>289ggnancnccn ncaccagna19<210>290<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，9，10，13，15，17<223>n＝T或U
<400>290angaccacnn ccncnangg19<210>291<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，4，8，9，14，16，17<223>n＝T或U<400>291ganncacnnc gaanannaa19<210>292<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，4，6，11，12，16，17<223>n＝T或U<400>292aannanaacg nncacnnag19<210>293<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<400>293ggtgataaag taaagtgctt tcactgt 27<210>294<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<400>294caacatgc taaatggttcca gggtgcaaat atc33
<210>295<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<400>295tcagtagttc ttaccagaca ctcctcaa28<210>296<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)DNA/RNA雜交<400>296uaagctgttc tatgtguuc19<210>297<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<400>297aagggcggcg gagtgagac19<210>298<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<400>298agaggacgga gtcggaggc19<210>299<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<400>299cggagcgtga ggatggaga19<210>300<211>19<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>18<223>n＝T或U<400>300agcaaggaca agcccagnc19<210>301<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，3，9，12<223>n＝T或U<400>301ngnaaaccng cngcccaga19<210>302<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>6，9，10，11，12，15，18，19<223>n＝T或U<400>302agaagncgnn nnccnccnn19<210>303<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature
<222>7，8，13，17<223>n＝T或U<400>303ccgagannag acnaagncc19<210>304<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，4，5，6，9，10，11，13，14，15<223>n＝T或U<400>304acnnnnccnn nannnccac19<210>305<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，14，17，19<223>n＝T或U<400>305ncccaaacac aggnacnan19<210>306<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，4，6，13<223>n＝T或U<400>306canncncagc ggnaacagc19<210>307<211>19
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，8，9，11，14，17<223>n＝T或U<400>307accancannc ncanccnca19<210>308<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，5，10，11，18<223>n＝T或U<400>308aangnaaccn ncaaccanc19<210>309<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，2，3，5，7，8，11，15，17<223>n＝T或U<400>309nnngnannca ncacngnc18<210>310<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物
<221>misc_feature<222>1，6，8，11，12<223>n＝T或U<400>310ncacancnca nnaccaac 18<210>311<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>6<223>n＝T或U<400>311ccaggnggca ggagaaaca19<210>312<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，8，9，13，16，17，18<223>n＝T或U<400>312ngcagacnnc aangcnnng19<210>313<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，9，13，15，19<223>n＝T或U<400>313naagcaagnc acngnggcn19<210>314
<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，6，10，13，16<223>n＝T或U<400>314cngagncgan aanacnagc19<210>315<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，9，10，13<223>n＝T或U<400>315acnagccann agnaaagag19<210>316<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>15，16，18<223>n＝T或U<400>316caacagcaga gaccnngnc19<210>317<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物
<221>misc_feature<222>2，7，11，12<223>n＝T或U<400>317anagcanacc nngaaccag19<210>318<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，5，7，12，17<223>n＝T或U<400>318cancngnagg cnaagangg19<210>319<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，4，11，16，18<223>n＝T或U<400>319agnnaccaga ngccancng19<210>320<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，5，8，10，13，16<223>n＝T或U<400>320aancnacncn ganagngga19
<210>321<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，3，4，6，17<223>n＝T或U<400>321gnnncngaag ccaacanca19<210>322<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，6，7，9，14，17<223>n＝T或U<400>322ncaacnnanc accnccnga19<210>323<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>7，12，13，15<223>n＝T或U<400>323aagaacnaac anngnagag19<210>324<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物
<221>misc_feature<222>2，13，16<223>n＝T或U<400>324gnagacaaca ggngcngca19<210>325<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，4，7，9，11，14，15，17<223>n＝T或U<400>325angnccncng naannangg19<210>326<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，4，5，9，16<223>n＝T或U<400>326nacnnggcna gaacangga19<210>327<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>9，13，15，16<223>n＝T或U<400>327gaagcaacnc aangnnaag19
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<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，2，3，6，8，9，10，11，16<223>n＝T或U<400>328nnnggncnnn nggacncag19<210>329<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，8，11，18<223>n＝T或U<400>329ccanaganca ncaggaana19<210>330<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>7，11，18<223>n＝T或U<400>330caggacnggc naacacanc19<210>331<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，2，3，6，15，17<223>n＝T或U<400>331nnnaanggca ggcancncc19<210>332<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，2，9，15<223>n＝T或U<400>332nnaagccanc aggangcca19<210>333<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，10，15，17，19<223>n＝T或U<400>333gcnacagagn aagcngngn19<210>334<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，4，12，15，16，17，18<223>n＝T或U<400>334
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<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，5，10，17<223>n＝T或U<400>336cagnncacan gacaagncg19<210>337<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，7，8，9，11<223>n＝T或U<400>337gacnccnnnc ngagacagg19<210>338<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，3，12，14，17<223>n＝T或U<400>338anncacacca gngnaanag19<210>339<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，5，8，17，19<223>n＝T或U<400>361gcannaanca caggggnan19<210>362<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，7，9，16，17<223>n＝T或U<400>370gnagacnanc cagganngg19<210>371<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，3，5，6，7，9，13<223>n＝T或U<400>377cnncnnngnc canacacac19<210>378<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，12，14<223>n＝T或U<400>378ggaanaaaca cnanggaca19<210>379<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，6，9，13<223>n＝T或U<400>379canacnacna gangaccac19
<210>380<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，3，8，9，12，13，15，18<223>n＝T或U<400>380ngnacccnng anngnacnc19<210>381<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，7，14，16<223>n＝T或U<400>381gaaangnacg aacngnacc19<210>382<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，5，6，7，8，11，12，14，15，17，18<223>n＝T或U<400>382gangnnnngg nncnncnnc19<210>383<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物
<221>misc_feature<222>2，4，7，8，10，12，13，16，17，18<223>n＝T或U<400>383cnancanncn cnnagnnnc19<210>384<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>6，10，11，14，16，17<223>n＝T或U<400>384acaccnggcn ncangnncc19<210>385<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，14<223>n＝T或U<400>385gacnacaggc acanaccac19<210>386<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，5，11，17<223>n＝T或U<400>386ngccncagcc ngggacnac19
<210>387<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，9，10，16，19<223>n＝T或U<400>387agganggann caaacnccn19<210>388<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>7，9，11，15，18<223>n＝T或U<400>388gagaaangng ncccnggng19<210>389<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>16，17，18<223>n＝T或U<400>389gccacaacag aagcannng19<210>390<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，2，4，11，13，14，18<223>n＝T或U<400>390nncngaaaac ncnncaang19<210>391<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，3，8，13，15，19<223>n＝T或U<400>391cnnagcanaa agnancagn19<210>392<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>9，12，15，16<223>n＝T或U<400>392caaaaaagna cngcnnagc19<210>393<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>6，12，13，15，18，19<223>n＝T或U<400>393
caaganaaaa cnngnccnn19<210>394<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，3，7，10，12，13，15<223>n＝T或U<400>394nancagncan gnngnaaac19<210>395<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，6，11，13，14，17<223>n＝T或U<400>395cnaaanaacc ngnncanca19<210>396<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>8，9，10，11，12，17<223>n＝T或U<400>396agcacacnnn nnacacngc19<210>397<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>6，8，9，11，12，14，15，18<223>n＝T或U<400>397accacnanna nncnnganc19<210>398<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，3，5，6，7，9，10，11，15，16，17<223>n＝T或U<400>398ngnannngnn nccannncc19<210>399<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，5，10，12，14，16，17，18<223>n＝T或U<400>399acngnaaacn cnancnnng19<210>400<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，3，7，12，16，17<223>n＝T或U
<400>400cnnaagnggg cnaaannac19<210>401<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，4，7，9，12，18<223>n＝T或U<400>401ccnncanang gncacacna19<210>402<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，4，11，13<223>n＝T或U<400>402ggnnacaagc nangaagcc19<210>403<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，10，12，17<223>n＝T或U<400>403cnaagcaacn anagaanac19<210>404<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，4，5，8，9，10，11，12<223>n＝T或U<400>404nccnngannn nncacagag19<210>405<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，5，9，10，18<223>n＝T或U<400>405anacnaacnn aaagcccng19<210>406<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，5，7，10，14，16，17，18<223>n＝T或U<400>406gggnngnagn aacncnnnc19<210>407<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，12，14，15，16<223>n＝T或U
<400>407nagaacacaa cncnnnggg19<210>408<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，4，8，9，10，17<223>n＝T或U<400>408cncngaannn ccaaganac19<210>409<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，2，3，6，10，11，12，14，16<223>n＝T或U<400>409nnnacnggan nnancncag19<210>410<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，5，9，15，18<223>n＝T或U<400>410ngagnaggng acagngcng19<210>411<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapieng)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>9，10，11，12，14，18<223>n＝T或U<400>411ggaggcagnn nngngcang19<210>412<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，4，6，7，11，12，14，17，19<223>n＝T或U<400>412cnancnncca nnanacncn19<210>413<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，2，4，5，6，8，9，12，14，15，16，18<223>n＝T或U<400>413nngnnngnng cngnnngnc19<210>414<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，4，5，6，8
<223>n＝T或U<400>414nccnnncnga gacaggcac19<210>415<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>18<223>n＝T或U<400>415accagcacga gcaagacnc19<210>416<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，6，7，9，16<223>n＝T或U<400>417nccagnnanc cagcancag19<210>418<211>19<212>DNA
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<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，4，5，6，10，16，18<223>n＝T或U<400>418gcnnnngaan aggacngnc19<210>419<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，7，9，10，15，18<223>n＝T或U<400>419gagangncnn caacngcnc19<210>420<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，6，9，12，16<223>n＝T或U<400>420ggggnnagnc cncgangaa19<210>421<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature
<222>1，4，5，9，13，15<223>n＝T或U<400>421ncanngcana acngnaggg19<210>422<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，5，6，12，13，15，18<223>n＝T或U<400>422gcncnngcca anncngang19<210>423<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，7，9，15，18<223>n＝T或U<400>423acccnancnc caggnccna19<210>424<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>16<223>n＝T或U<400>424acaggcaaag caggcnacc19<210>425<211>19
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，3，5，10，15，18<223>n＝T或U<400>425gnncngacan agcancanc19<210>426<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，8，9，10，12，19<223>n＝T或U<400>426cncagagnnn cnagagaan19<210>427<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，4，5，7，10，11，17<223>n＝T或U<400>427angnncncan ncgagcngc19<210>428<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物
<221>misc_feature<222>1，6，14，18<223>n＝T或U<400>428ngaacnggaa cacnagang19<210>429<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，9，14<223>n＝T或U<400>429gcncaggcng aacnggaac19<210>430<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，2，7，10，13，14<223>n＝T或U<400>430nngacancan canngcgac19<210>431<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，19<223>n＝T或U<400>431accancacaa caaaagcan19<210>432
<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，6，11，13，14，16<223>n＝T或U<400>432ccacnnggca ngnncnacc19<210>433<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，4，6，14<223>n＝T或U<400>433ncgnancaag aacncacac19<210>434<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，5，7，12，13<223>n＝T或U<400>434ggnancngaa gnngacaac19<210>435<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物
<221>misc_feature<222>1，2，3，5，6，8，13，16，18<223>n＝T或U<400>435nnncnncncc agnggnanc19<210>436<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，2，4，10，17<223>n＝T或U<400>436nncnccaggn ccaaaanga19<210>437<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>7，9，10，12<223>n＝T或U<400>437acagcancnn cngaagaac19<210>438<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>7，9，11，12，15，18<223>n＝T或U<400>438cacaggngna nncancang19
<210>439<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>6，8，10，12，13<223>n＝T或U<400>439ccaggncncn annaaagcc19<210>440<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，2，4，6，11，12，14<223>n＝T或U<400>440nncncnccag nngncagga19<210>441<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，8，16，18<223>n＝T或U<400>441gaagngcnga cacaananc19<210>442<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物
<221>misc_feature<222>1，2，3，4，7，8，10，13，16，18<223>n＝T或U<400>442nnnnccnncn ccnccncnc19<210>443<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，5，8，13，14，15，17，18<223>n＝T或U<400>443cancngangc cannncnnc19<210>444<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>6，7，9，11，12，14，15<223>n＝T或U<400>444agccanncng nncnnccga19<210>445<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>7<223>n＝T或U<400>445ccagganagg aagcacaca19
<210>446<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，5，7，11，15，16，18<223>n＝T或U<400>446anggnancaa ncagnncnc19<210>447<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>9，10，11，14，15，16<223>n＝T或U<400>447ccgcagcann nccnnnaac19<210>448<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，5，6，7，8，14，16，17<223>n＝T或U<400>448cagnnnnnga agangnngg19<210>449<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，11，18<223>n＝T或U<400>449gngacagacc ngaaacanc19<210>450<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>6，7，8，9，11，12<223>n＝T或U<400>450gggcannnnc nnagagaag19<210>451<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>3，8，9，12，13，15<223>n＝T或U<400>451agnacccnng annanaccc19<210>452<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>5，7，16<223>n＝T或U<400>452
gaaangnacg aacagnacc19<210>453<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>1，9，12，15，16<223>n＝T或U<400>453ngaaaaacnc anaannccc19<210>454<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>4，6，7，8，9<223>n＝T或U<400>454ccancnnnnc agaaacaag19<210>455<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，4，7，8，10，12，17，18<223>n＝T或U<400>455cnanaanncn cnccagnng19<210>456<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，6，7，11，17<223>n＝T或U<400>456cncccnnagg nacacanac19<210>457<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>9，15，18<223>n＝T或U<400>457acaagcagng acacnacnc19<210>458<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>2，6，9，14，17<223>n＝T或U<400>458gnaacnccng aaangangc19<210>459<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>8，13，17<223>n＝T或U
<400>459caacaaancc agnaacncc19<210>460<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)每個(gè)核堿基可以是部分的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，或核苷酸類似物<221>misc_feature<222>6，10，12，15<223>n＝T或U<400>460caccanaacn cngangaac19<210>461<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>1，7，8，10，16，17，18，19<223>n＝A，T，C or G<400>461naggacnngn ccaccnnnnc20<210>462<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>1，2，8，14，15，17<223>n＝A，T，C或G<400>462nngaaaanag gacnngncca20<210>463<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature
<222>1，3，4，6，8，9，15<223>n＝A，T，C或G<400>463ncnncncnng aaaanaggac20<210>464<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>3，5，6，8，10，11，17<223>n＝A，T，C或G<400>464cancnncncn ngaaaanagg20<210>465<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>2，5，7，8，10，12，13，19<223>n＝A，T，C或G<400>465gncancnncn cnngaaaana20<210>466<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>4，7，9，10，12，14，15<223>n＝A，T，C或G<400>466aagncancnn cncnngaaaa20<210>467<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
<221>misc_feature<222>6，9，11，12，14，16，17<223>n＝A，T，C或G<400>467aaaagncanc nncncnngaa20<210>468<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>1，2，8，11，13，14，16，18，19<223>n＝A，T，C或G<400>468nnaaaagnca ncnncncnng20<210>469<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>1，3，4，10，13，15，16，18，20<223>n＝A，T，C或G<400>469ngnnaaaagn cancnncncn20<210>470<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>3，5，6，12，15，17，18，20<223>n＝A，T，C或G<400>470acngnnaaaa gncancnncn20<210>471<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
<221>misc_feature<222>5，7，8，14，17，19，20<223>n＝A，T，C或G<400>471aaacngnnaa aagncancnn20<210>472<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>7，9，10，16，19<223>n＝A，T，C或G<400>472caaaacngnn aaaagncanc20<210>473<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>1，2，9，11，12，18<223>n＝A，T，C或G<400>473nncaaaacng nnaaaagnca20<210>474<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>3，5，7，13<223>n＝A，T，C或G<400>474gangncngca ggnacacaag20<210>475<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>1，10，11，12，13，14，17，19<223>n＝A，T，C或G<400>475nagcaaaagn nnnnaancna20<210>476<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>4，11<223>n＝A，T，C或G<400>476gcangacaac naaagcaccg20<210>477<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>3，5，10，11，12，18<223>n＝A，T，C或G<400>477aancngcaan nngggganac20<210>478<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>1，2，4，7，13，14，16，20<223>n＝A，T，C或G<400>478nngnacngac canncnggan20<210>479<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>1，3，7，9，11，13，18<223>n＝A，T，C或G<400>479ncngcangng ncncagangg20<210>480<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>5，9，17，18<223>n＝A，T，C或G<400>480acaanacang gcagggnncc20<210>481<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>1，5，8，10，15，16，20<223>n＝A，T，C或G<400>481ngccnacnan agagnnagan20<210>482<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>1，4，9，10，14，17，20<223>n＝A，T，C或G<400>482naanggaann caanccngan20<210>483<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>5，13，18，20<223>n＝A，T，C或G<400>483caacnaaaac acngccangn20<210>484<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>1，3，6，9，10，12，13，15，16，18，19<223>n＝A，T，C或G<400>484nangangcnn cnnanncnna20<210>485<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>2，3，4，6，7，13，15，17<223>n＝A，T，C或G<400>485annngnnaag ccnancngaa20<210>486<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>1，11，19，20<223>n＝A，T，C或G<400>486nccaccagca nggaacaann20<210>487<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>7，16，19<223>n＝A，T，C或G<400>487agaaaangga cagaanccna20<210>488<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>2，4，7，8，12，17，18，19<223>n＝A，T，C或G<400>488cnancannaa anacgcnnnc20<210>489<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>1，3，4，12，16，19，20<223>n＝A，T，C或G<400>489nannaacaac anacanacnn20<210>490<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于人(Homo sapiens)<221>misc_feature<222>3，4，8，9，12，15，17，18<223>n＝A，T，C或G<400>490ggnnaggnna cngangnnag20
權(quán)利要求
1.一種治療患有增生性疾病的患者的方法，所述方法包括給所述患者施用(i)長(zhǎng)度為八到三十個(gè)核堿基之間的反義IAP核堿基寡聚物；和(ii)化療劑，兩者總量加在一起足以治療患者。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中在彼此相距28天內(nèi)施用所述的反義IAP核堿基寡聚物和所述的化療劑。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中在彼此相距24小時(shí)內(nèi)施用所述的反義IAP核堿基寡聚物和所述的化療劑。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中在彼此相距1小時(shí)內(nèi)施用所述的反義IAP核堿基寡聚物和所述的化療劑。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中同時(shí)施用所述的反義IAP核堿基寡聚物和所述的化療劑。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的核堿基寡聚物包含從SEQID NOs1-99，143，147，151，163-260，287，289和300-460組成的群組中選擇出來(lái)的序列的至少八個(gè)連續(xù)核堿基。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的核堿基寡聚物包含從SEQ IDNOs97，98，99，143，147，151，287，289和300-460組成的群組中選擇出來(lái)的序列的至少八個(gè)連續(xù)核堿基。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的核堿基寡聚物基本上由從SEQ IDNOs97，98，99，143，147，151，287，289和300-460組成的群組中選擇出來(lái)的序列組成。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的核堿基寡聚物由從SEQ ID NOs97，98，99，143，147，151，287，289和300-460組成的群組中選擇出來(lái)的序列組成。
10.權(quán)利要求1-9任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述核堿基寡聚物是寡核苷酸。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的寡核苷酸包含至少一個(gè)修飾鍵。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的修飾鍵選自由硫代磷酸酯，磷酸甲酯，磷酸三酯，二硫代磷酸酯和phosphoselenate鍵組成的組。
13.權(quán)利要求1-9任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述核堿基寡聚物包含至少一個(gè)修飾的糖部分。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中修飾的糖部分是2′-氧-甲基或2′-氧-甲氧乙基。
15.權(quán)利要求1-9任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述核堿基寡聚物包含至少一個(gè)修飾的堿基。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的修飾的核堿基是5-甲基胞嘧啶。
17.權(quán)利要求1-9任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述核堿基寡聚物是嵌合的核堿基寡聚物。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的核堿基寡聚物包含通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接在一起的DNA殘基，其中所述的DNA殘基的每側(cè)側(cè)接了至少一個(gè)2′-氧-甲基或2′-氧-甲氧乙基RNA殘基。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的DNA殘基的兩側(cè)都側(cè)接了至少三個(gè)2′-氧-甲基或2′-氧-甲氧乙基RNA殘基。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的DNA殘基的兩側(cè)都側(cè)接了四個(gè)2′-氧-甲基或2′-氧-甲氧乙基RNA殘基。
21.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的RNA殘基通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接在一起，而且所述的RNA殘基通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接到所述DNA殘基上。
22.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的核堿基寡聚物包含通過(guò)磷酸二酯鍵連接在一起的DNA殘基，其中所述的DNA殘基的兩側(cè)分別側(cè)接了至少兩個(gè)通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接在一起的2′-氧-甲基或2′-氧-甲氧乙基RNA殘基。
23.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的DNA殘基的兩側(cè)都側(cè)接了至少三個(gè)2′-氧-甲基或2′-氧-甲氧乙基RNA殘基。
24.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的核堿基寡聚物包含十一個(gè)DNA殘基，DNA殘基兩側(cè)都側(cè)接了四個(gè)2′-氧-甲基RNA殘基，所述核堿基寡聚物由下列序列中的一個(gè)組成5′-AUUGGTTCCAATGTGUUCU-3′(SEQ ID NO155)；5′-ACACGACCGCTAAGAAACA-3′(SEQ ID NO16)；5′-ACAGGACTACCACTTGGAA-3′(SEQ ID NO157)；5′-UGCCAGTGTTGATGCUGAA-3′(SEQ ID NO27)；5′-GCUGAGTCTCCATATUGCC-3′(SEQ ID NO141)；5′-UCGGGTATATGGTGTCUGA-3′(SEQ ID NO41)；5′-AAGCACTGCACTTGGUCAC-3′(SEQ ID NO47)；5′-CCGGCCCAAAACAAAGAAG-3′(SEQ ID NO51)；5′-ACCCTGGATACCATTUAGC-3′(SEQ ID NO63)；5′-UGUCAGTACATGTTGGCUC-3′(SEQ ID NO161)；和5′-UGCACCCTGGATACCAUUU-3′(SEQ ID NO151)，所述殘基通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接在一起。
25.權(quán)利要求1-24任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述化療劑破壞微管。
26.權(quán)利要求1-24任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述化療劑穩(wěn)定微管。
27.權(quán)利要求1-24任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述化療劑是紫杉烷。
28.權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的紫杉烷是紫杉醇、多西它賽(doxetaxel)、RPR109881A、SB-T-1213、SB-T-1250、SB-T-101187、BMS-275183、BRT 216、DJ-927、MAC-321、IDN5109或IDN5390。
29.權(quán)利要求1-24任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述化療劑是長(zhǎng)春花生物堿。
30.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述的長(zhǎng)春花生物堿是長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿、脫乙酰長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春氟寧、長(zhǎng)春瑞濱和脫水長(zhǎng)春花堿。
31.權(quán)利要求1-24任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述化療劑是多拉司它汀(dolastatain)。
32.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述的多拉司它汀是多拉司它汀-10、多拉司它汀-15、ILX651、TZT-1027、symplostatin 1、symplostatin 3或西馬多丁(cemadotin)。
33.權(quán)利要求1-24任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述化療劑是隱藻素(cryptophycin)。
34.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述隱藻素是隱藻素1或隱藻素52。
35.權(quán)利要求1-25任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述化療劑是埃博霉素(epothilone)。
36.權(quán)利要求35所述的方法，其中所述埃博霉素是埃博霉素A、埃博霉素B、脫氧埃博霉素B或埃博霉素B內(nèi)酰胺。
37.權(quán)利要求1-24任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述化療劑是艾榴素(eleutherobin)、discodermolide、2-epi-discodermolide、2-des-methyldiscodermolide、5-hydroxymethyldiscodermolide、19-des-aminocarbonyldiscodermolide、9(13)-cyclodiscodermolide或laulimalide。
38.權(quán)利要求1-24任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述化療劑是一種選自表1的藥物。
39.權(quán)利要求1-38任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述增生性疾病是癌癥。
40.權(quán)利要求39所述的方法，其中所述癌癥是急性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓細(xì)胞性白血病、急性成髓細(xì)胞性白血病、急性早幼粒細(xì)胞性白血病、急性髓單核細(xì)胞性白血病、急性單核細(xì)胞性白血病、急性紅白血病、慢性白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、骨髓發(fā)育不良綜合征、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、真性紅細(xì)胞增多癥、淋巴瘤、何杰金氏病、Waldenstrom氏巨球蛋白血癥、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、Ewing氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎癌、Wilm氏瘤、宮頸癌、子宮癌、睪丸癌、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、腦(脊)膜瘤、黑色素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤或成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤。
41.權(quán)利要求1-40任何一項(xiàng)所述的方法，更進(jìn)一步地包含給所述患者施用化學(xué)致敏劑。
42.權(quán)利要求1-41任何一項(xiàng)所述的方法，更進(jìn)一步地包含給所述患者施用生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑。
43.權(quán)利1-42任何一項(xiàng)所述的方法，更進(jìn)一步地包含給所述患者施用第二化療劑。
44.一種組合物，包含(i)長(zhǎng)度為八到三十個(gè)堿基之間的反義IAP核堿基寡聚物；和(ii)化療劑，兩者總量加在一起足以治療患有增生性疾病的患者。
45.權(quán)利要求44所述的組合物，其中所述的核堿基寡聚物包含從SEQ IDNOs1-99，143，147，151，163-260，287，289，和300-460組成的群組中選擇出來(lái)的序列的至少八個(gè)連續(xù)堿基。
46.權(quán)利要求45所述的組合物，其中所述的核堿基寡聚物包含從SEQ IDNOs97，98，99，143，147，151，287，289和300-460組成的群組中選擇出來(lái)的序列的至少八個(gè)連續(xù)堿基。
47.權(quán)利要求46所述的組合物，其中所述的核堿基寡聚物基本上由從SEQ IDNOs97，98，99，143，147，151，287，289和300-460組成的群組中選擇出來(lái)的序列組成。
48.權(quán)利要求47所述的組合物，其中所述的核堿基寡聚物由從SEQ IDNOs97，98，99，143，147，151，287，289和300-460組成的群組中選擇出來(lái)的序列組成。
49.權(quán)利要求44-48任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述核堿基寡聚物是寡核苷酸。
50.權(quán)利要求49所述的組合物，其中所述的寡核苷酸包含至少一個(gè)修飾鍵。
51.權(quán)利要求50所述的組合物，其中所述的修飾鍵選自硫代磷酸酯，膦酸甲酯，磷酸三酯，二硫代磷酸酯和phosphoselenate鍵組成的組。
52.權(quán)利要求44-48任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述核堿基寡聚物包含至少一個(gè)修飾的糖部分。
53.權(quán)利要求52所述的組合物，其中修飾的糖部分是2′-氧-甲基或2′-氧-甲氧乙基。
54.權(quán)利要求44-48任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述核堿基寡聚物包含至少一個(gè)修飾的堿基。
55.權(quán)利要求54所述的組合物，其中所述的修飾的堿基是5-甲基胞嘧啶。
56.權(quán)利要求44-48任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述核堿基寡聚物是嵌合的核堿基寡聚物。
57.權(quán)利要求56所述的組合物，其中所述的核堿基寡聚物包含通過(guò)1硫代磷酸酯鍵連接在一起的DNA殘基，所述的DNA殘基的兩側(cè)分別側(cè)接了至少一個(gè)2′-氧-甲基或2′-氧-甲氧乙基RNA殘基。
58.權(quán)利要求57所述的組合物，其中所述的DNA殘基的兩側(cè)都側(cè)接了至少三個(gè)2′-氧-甲基或2′-氧-甲氧乙基RNA殘基。
59.權(quán)利要求58所述的組合物，其中所述的DNA殘基的兩側(cè)都側(cè)接了四個(gè)2′-氧-甲基或2′-氧-甲氧乙基RNA殘基。
60.權(quán)利要求57所述的組合物，其中所述的RNA殘基通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接在一起，而且所述的RNA殘基通過(guò)硫磷酰鍵連接到所述DNA殘基上。
61.權(quán)利要求57所述的組合物，其中所述的核堿基寡聚物包含通過(guò)磷酸二酯鍵連接在一起的DNA殘基，其中所述的DNA殘基的兩側(cè)分別側(cè)接了至少兩個(gè)通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接在一起的2′-氧-甲基或2′-氧-甲氧乙基RNA殘基。
62.權(quán)利要求61所述的組合物，其中所述的DNA殘基的兩側(cè)都側(cè)接了至少三個(gè)2′-氧-甲基或2′-氧-甲氧乙基RNA殘基。
63.權(quán)利要求44所述的組合物，其中所述的核堿基寡聚物包含十一個(gè)DNA殘基，DNA殘基兩側(cè)都側(cè)接了四個(gè)2′-氧-甲基RNA殘基，所述核堿基寡聚物由下列序列中的一個(gè)組成5′-AUUGGTTCCAATGTGUUCU-3′(SEQ ID NO155)；5′-ACACGACCGCTAAGAAACA-3′(SEQ ID NO16)；5′-ACAGGACTACCACTTGGAA-3′(SEQ ID NO157)；5′-UGCCAGTGTTGATGCUGAA-3′(SEQ ID NO27)；5′-GCUGAGTCTCCATATUGCC-3′(SEQ ID NO141)；5′-UCGGGTATATGGTGTCUGA-3′(SEQ ID NO41)；5′-AAGCACTGCACTTGGUCAC-3′(SEQ ID NO47)；5′-CCGGCCCAAAACAAAGAAG-3′(SEQ ID NO51)；5′-ACCCTGGATACCATTUAGC-3′(SEQ ID NO63)；5′-UGUCAGTACATGTTGGCUC-3′(SEQ ID NO161)；和5′-UGCACCCTGGATACCAUUU-3′(SEQ ID NO151)，所述殘基通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接在一起。
64.權(quán)利要求44-63任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述化療劑破壞微管。
65.權(quán)利要求44-63任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述化療劑穩(wěn)定微管。
66.權(quán)利要求44-63任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述化療劑是紫杉烷。
67.權(quán)利要求66所述的組合物，其中所述的紫杉烷是紫杉醇、多西它賽(doxetaxel)、RPR109881A、SB-T-1213、SB-T-1250、SB-T-101187、BMS-275183、BRT216、DJ-927、MAC-321、IDN5109或IDN5390。
68.權(quán)利要求44-63任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述化療劑是長(zhǎng)春花生物堿。
69.權(quán)利要求68所述的組合物，其中所述的長(zhǎng)春花生物堿是長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿、脫乙酰長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春氟寧、長(zhǎng)春瑞濱和脫水長(zhǎng)春花堿。
70.權(quán)利要求44-63任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述化療劑是多拉司它汀(dolastatin)。
71.權(quán)利要求70所述的組合物，其中所述的多拉司它汀是多拉司它汀-10、多拉司它汀-15、ILX651、TZT-1027、symplostatin 1、symplostatin 3或西馬多丁(cemadotin)。
72.權(quán)利要求44-63任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述化療劑是隱藻素(cryptophycin)。
73.權(quán)利要求72所述的組合物，其中所述隱藻素是隱藻素1或隱藻素52。
74.權(quán)利要求44-63任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述化療劑是埃博霉素(epothilone)。
75.權(quán)利要求74所述的組合物，其中所述埃博霉素是埃博霉素A、埃博霉素B、脫氧埃博霉素B或埃博霉素B內(nèi)酰胺。
76.權(quán)利要求44-63任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述化療劑是艾榴素(eleutherobin)、discodermolide、2-epi-discodermolide、2-des-methyldiscodermolide、5-hydroxymethyldiscodermolide、19-des-aminocarbonyldiscodermolide、9(13)-cyclodiscodermolide或laulimalide。
77.權(quán)利要求44-63任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述化療劑是一種選自表1的藥物。
78.一種增強(qiáng)細(xì)胞凋亡的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞與權(quán)利要求44-77任何一項(xiàng)所述的組合物接觸。
79.權(quán)利要求78所述的方法，其中所述細(xì)胞在活體內(nèi)。
80.權(quán)利要求78所述的方法，其中所述細(xì)胞是在活體外。
81.權(quán)利要求78-80所述的方法，其中所述細(xì)胞是癌細(xì)胞。
82.權(quán)利要求81所述的方法，其中所述癌細(xì)胞是人癌細(xì)胞。
83.一種試劑盒，包括(i)長(zhǎng)度為八到三十個(gè)堿基之間的反義IAP核堿基寡聚物；(ii)化療劑，和(iii)給患有增生性疾病的患者施用所述反義IAP核堿基寡聚物和所述化療劑的說(shuō)明，施用劑量足以治療所述的增生性疾病。
84.一種試劑盒，包括(i)長(zhǎng)度為八到三十個(gè)堿基之間的反義IAP核堿基寡聚物；和(ii)給患有增生性疾病的患者施用所述反義IAP核堿基寡聚物和所述化療劑的說(shuō)明，施用劑量足以治療所述的增生性疾病。
85.一種試劑盒，包括(i)權(quán)利要求44-77任何一項(xiàng)所述的組合物；和(ii)給患有增生性疾病的患者施用所述組合物的說(shuō)明，施用劑量足以治療所述的增生性疾病。
全文摘要
本發(fā)明描述了針對(duì)XIAP，HIAP－1或HIAP－2的反義寡聚物和化療劑，以及包含它們的組合物和試劑盒用于治療增生性疾病的用途。
文檔編號(hào)A61K31/4745GK1901939SQ200480039601
公開日2007年1月24日 申請(qǐng)日期2004年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月30日
發(fā)明者埃里克·拉卡西, 丹尼爾·麥克馬納斯, 喬恩·P·德金 申請(qǐng)人:艾吉拉醫(yī)療股份有限公司