能夠與配體偶聯(lián)的單甲基纈氨酸化合物的制作方法

文檔序號(hào)：1093849閱讀：290來源：國知局

導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>醫(yī)藥醫(yī)療技術(shù)的改進(jìn);醫(yī)療器械制造及應(yīng)用技術(shù)

專利名稱：能夠與配體偶聯(lián)的單甲基纈氨酸化合物的制作方法
連續(xù)性本申請要求2003年11月6日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/518,534；2004年3月26日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/557,116；2004年8月4日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/598,899；和2004年10月27日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/622,455的優(yōu)先權(quán)；將其公開內(nèi)容納入本文作為參考。
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及藥物化合物，更具體說，涉及藥物-接頭-配體偶聯(lián)物、藥物-接頭化合物和藥物-配體偶聯(lián)物，涉及包含它們的組合物，以及涉及用它們治療癌癥、自身免疫疾病或傳染病的方法。本發(fā)明也涉及抗體-藥物偶聯(lián)物，涉及包括它的組合物，以及涉及用它治療癌癥、自身免疫疾病或傳染病的方法。本發(fā)明也涉及在體外、原位和體內(nèi)用抗體-藥物偶聯(lián)化合物診斷或治療哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或相關(guān)疾病的方法。
2.發(fā)明背景多年來，大量研究集中在提高藥物或其它制劑向靶細(xì)胞、組織或腫瘤遞送效率以實(shí)現(xiàn)最大療效和最小毒性。雖然為開發(fā)在體內(nèi)和體外將生物活性分子輸入細(xì)胞的有效方法已作出許多努力，但是沒有一種證明是令人完全滿意的。優(yōu)化藥物與其胞內(nèi)靶分子的結(jié)合，同時(shí)最大程度減少藥物的胞內(nèi)再分布(如再分布到鄰近細(xì)胞中)常常是困難或無效的。
目前經(jīng)胃腸道外給予患者的大部分藥物不是靶向的，這導(dǎo)致這種藥物全身遞送給不需要它們的機(jī)體細(xì)胞和組織，常常引起不良反應(yīng)。這可導(dǎo)致藥物的不良副作用，常常限制可給予的藥物劑量(如化療(抗癌)，細(xì)胞毒，酶抑制劑和抗病毒或抗微生物藥物)。比較而言，雖然口服給藥被認(rèn)為是方便和經(jīng)濟(jì)的給藥模式，但一旦該藥物被吸收進(jìn)入全身循環(huán)系統(tǒng)中時(shí)，也可能對未受疾病影響的細(xì)胞產(chǎn)生相同的非特異性毒性問題。其它復(fù)雜情況包括口服生物利用度問題和藥物在內(nèi)臟中滯留問題，這使內(nèi)臟與藥物接觸過久，從而有產(chǎn)生內(nèi)臟毒性的風(fēng)險(xiǎn)。因此，開發(fā)(藥物遞送)方法的主要目標(biāo)是使藥物特異性靶向細(xì)胞和組織。這種治療的益處包括避免將這種藥物不合適地遞送給其它細(xì)胞和組織，如未受感染的細(xì)胞而產(chǎn)生的全身生理效應(yīng)?？赏ㄟ^使生物活性物質(zhì)即活性代謝物在細(xì)胞內(nèi)累積或保留的方法、化合物和制劑實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)靶向。
已建立了能靶向治療癌癥患者、免疫系統(tǒng)疾病患者和新生血管生成疾病患者的單克隆抗體治療方法。
利用抗體-藥物偶聯(lián)物局部遞送細(xì)胞毒性劑或細(xì)胞生長抑制劑，如癌癥治療中殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞的藥物(Syrigos和Epenetos(1999)AntiCancer Research 19605-614；Niculescu-Duvaz和Springer(1997)Adv.Drg.Del.Rev.26151-172；美國專利號(hào)4975278)理論上能使該藥物分子靶向遞送到腫瘤并在腫瘤細(xì)胞內(nèi)累積，而全身給予這些非偶聯(lián)藥物制劑可能對正常細(xì)胞以及要清除的腫瘤細(xì)胞可能產(chǎn)生不可接受水平的毒性(Baldwin等，1986，Lancet(1986年3月15日)第603-05頁；Thorpe，1985，“在癌癥治療中細(xì)胞毒性藥物的抗體運(yùn)載體綜述”(Antibody Carriers Of Cytotoxic AgentsIn Cancer TherapyA Review)，刊于《單克隆抗體′84生物和臨床引用》(MonoclonalAntibodies′84Biological and Clinical Applications)，A.Pinchera等(編)，第475-506頁)。因此，需要設(shè)法在最小毒性的情況下實(shí)現(xiàn)最大療效。據(jù)報(bào)道，多克隆抗體和單克隆抗體可用于這些方案(Rowland等，1986，Cancer Immunol. Immunother.21183-87)。用于這些方法的藥物包括道諾霉素、多柔比星、甲氨蝶呤和長春地辛(Rowland等，1986，上述)。用作抗體-毒素偶聯(lián)物中的毒素包括細(xì)菌毒素如白喉毒素，植物毒素如蓖麻毒蛋白，小分子毒素如格爾德霉素(Kerr等，1997，Bioconjugate Chem.8(6)781-784；Mandler等(2000)Jour.of the Nat.Cancer Inst.92(19)1573-1581；Mandler等(2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters 101025-1028；Mandler等(2002)BioconjugateChem.13786-791)，類美坦西醇(EP 1391213；Liu等，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA938618-8623)和卡奇霉素(Lode等(1998)Cancer Res.582928；Hinman等(1993)CancerRes.533336-3342)。這些毒素可能通過微管蛋白結(jié)合、DNA結(jié)合或拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制等機(jī)制發(fā)揮其細(xì)胞毒性和細(xì)胞抑制效應(yīng)(Meyer，D.L.和Senter，P.D.“用于癌癥治療的抗體藥物偶聯(lián)物的最新進(jìn)展”(Recent Advances in Antibody-Drug Conjugates forCancer Therapy)刊于《藥物化學(xué)年報(bào)》(Annual Reports in Medicinal Chemistry)，第38卷(2003)第23章，229-237)。一些細(xì)胞毒藥物在與大抗體或蛋白受體配體偶聯(lián)時(shí)傾向于失活或活性降低。
ZEVALIN_(伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)，Biogen/Idec)是一種抗體-放射性同位素偶聯(lián)物，含有針對正常和惡性B淋巴細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)的CD20抗原的鼠IgGlκ單克隆抗體和通過硫脲接頭螯合劑連接的111In或90Y放射性同位素(Wiseman等(2000)Eur.Jour.Nucl.Med.27(7)766-77；Wiseman等(2002)Blood 99(12)4336-42；Witzig等(2002)J.Clin.Oncol.20(10)2453-63；Witzig等(2002)J.Clin.Oncol.20(15)3262-69)。雖然ZEVALIN具有抗B-細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)的活性，但在大多數(shù)患者中給藥導(dǎo)致嚴(yán)重的和長時(shí)間的血細(xì)胞減少癥。MYLOTARGTM(吉妥單抗(gemtuzumab ozogamicin)，Wyeth Pharmaceuticals)是一種抗體藥物偶聯(lián)物，含有連接于卡奇霉素的人CD33抗體，在2000年被批準(zhǔn)用于注射治療急性髓細(xì)胞白血病(Drugsof the Future(2000)25(7)686；美國專利號(hào)4970198；5079233；5585089；5606040；5693762；5739116；5767285；5773001)。坎妥單抗(Cantuzumab mertansine)(Immunogen，Inc.)是一種抗體藥物偶聯(lián)物，含有通過二硫鍵接頭SPP連接于類美坦西醇藥物部分DM1的人C242抗體，已進(jìn)入臨床II期試驗(yàn)，用于治療表達(dá)CanAg的癌癥，如結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌等。MLN-2704(Millennium Pharm.，BZL Biologics，Immunogen Inc.)是一種抗體藥物偶聯(lián)物，含有連接于類美坦西醇藥物部分DM1的抗-前列腺特異性膜抗原(PSMA)的單克隆抗體，正在開發(fā)為前列腺腫瘤的可能治療藥物。通過非二硫鍵接頭SMCC將相同的類美坦西醇藥物分子DM1連接于小鼠單克隆抗體TA.1(Chari等(1992)Cancer Research 52127-131)。據(jù)報(bào)道，此偶聯(lián)物的效能比相應(yīng)的二硫鍵接頭偶聯(lián)物低200倍。本文中認(rèn)為SMCC接頭是“不可切割的”。
從海洋軟體動(dòng)物耳狀截尾海兔(Dolabella auricularia)中分離了幾種短肽化合物，發(fā)現(xiàn)它們有生物活性(Pettit等(1993)Tetrahedron 499151；Nakamura等(1995)Tetrahedron Letters 365059-5062；Sone等(1995)Jour.Org Chem.604474)。也制備了這些化合物的類似物，發(fā)現(xiàn)一些有生物活性(綜述參見Pettit等(1998)《抗癌藥物設(shè)計(jì)》(Anti-Cancer Drug Design)13243-277)。例如，耳抑素(auristatin)E(美國專利號(hào)5635483)是海洋天然產(chǎn)物海兔毒肽10的合成類似物，該物質(zhì)通過結(jié)合微管蛋白上的結(jié)構(gòu)域而抑制微管蛋白聚合，其結(jié)合的結(jié)構(gòu)域與抗癌藥長春新堿相同(G.R.Pettit，(1997)Prog.Chem.Org.Nat.Prod.701-79)。海兔毒肽10、耳抑素PE和耳抑素E是具有4個(gè)氨基酸和C-末端酰胺的線性肽，4個(gè)氨基酸中三個(gè)是海兔毒肽類化合物獨(dú)特的。
將耳抑素肽、耳抑素E(AE)和單甲基耳抑素(MMAE)、海兔毒肽的合成類似物偶聯(lián)于(i)嵌合單克隆抗體cBR96(對癌上Lewis Y特異)；(ii)對血液惡性腫瘤上CD30特異的cAC10(Klussman等(2004)，Bioconjugate Chemistry 15(4)765-773；Doronina等(2003)Nature Biotechnology 21(7)778-784；“能夠偶聯(lián)于配體的單甲基纈氨酸化合物”(Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”；Francisco等(2003)Blood 102(4)1458-1465；美國公開專利2004/0018194；(iii)用于治療表達(dá)CD20的癌癥和免疫疾病的抗CD20抗體如利妥昔(RITUXAN)_(WO 04/032828)；(iv)用于治療結(jié)腸直腸癌的抗EphB2抗體2H9和抗IL-8抗體(Mao等(2004)Cancer Research64(3)781-788)；(v)E-選擇蛋白抗體(Bhaskar等(2003)Cancer Res.636387-6394)；和(vi)其它抗CD30抗體(WO 03/043583)。
偶聯(lián)于單克隆抗體的耳抑素E公開于Senter等，《美國癌癥研究協(xié)會(huì)論文集》(Proceedings of the American Association for Cancer Research)，第45卷，摘要號(hào)623，2004年3月28日。
盡管有海兔毒肽類化合物及其類似物的體外研究數(shù)據(jù)，它們在獲得療效所需劑量下具有顯著的全身毒性，這損害了它們在臨床研究中的功效。因此，本領(lǐng)域明顯需要毒性顯著降低但仍有療效的海兔毒肽/耳抑素衍生物。本發(fā)明解決了既往的這些和其它限制問題。
受體酪氨酸激酶ErbB家族是細(xì)胞生長、分化和存活的重要調(diào)節(jié)者。該受體家族包括4個(gè)不同成員，包括表皮生長因子受體(EGFR、ErbB1、HER1)，HER2(ErbB2或p185neu)，HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。用人乳腺腫瘤細(xì)胞系SKBR3分析了一組抗ErbB2抗體的特征(Hudziak等，(1989)Mol.Cell.Biol.9(3)1165-1172。用稱為4D5的抗體獲得最大抑制，能夠抑制56％細(xì)胞的增殖。該組中其它抗體在此測定中抑制細(xì)胞增殖的程度較低。還發(fā)現(xiàn)抗體4D5能使ErbB2-過表達(dá)乳腺腫瘤細(xì)胞系對TNF-α的細(xì)胞毒作用敏感(美國專利號(hào)5677171)。在Fendly等(1990)CancerResearch 501550-1558；Kotts等(1990)In Vitro 26(3)59A；Sarup等(1991)GrowthRegulation 172-82；Shepard等J.(1991)Clin.Immunol.11(3)117-127；Kumar等(1991)Mol.Cell.Biol.11(2)979-986；Lewis等(1993)Cancer Immunol.Immunother.37255-263；Pietras等(1994)Oncogene 91829-1838；Vitetta等(1994)Cancer Research545301-5309；Sliwkowski等(1994)J.Bio.Chem.269(20)14661-14665；Scott等(1991)J.Bio.Chem.26614300-5；D′souza等Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)9-17202-7206；Lewis等(1996)Cancer Research 561457-1465；和Schaefer等(1997)Oncogene 151385-1394中進(jìn)一步特征分析了Hudziak等討論的抗-ErbB2抗體。
在Tagliabue等Int.J Cancer 47933-937(1991)；McKenzie等Oncogene4543-548(1989)；Maier等Cancer Res.515361-5369(1991)；Bacus等MolecularCarcinogenesis 3350-362(1990)；Stancovski等Proc.Natl.Acad.Sci.USA888691-8695(1991)；Bacus等Cancer Research 522580-2589(1992)；Xu等Int.J.Cancer53401-408(1993)；WO94/00136；Kasprzyk等Cancer Research 522771-2776(1992)；Hancock等(1991)Cancer Res.514575-4580；Shawver等(1994)Cancer Res.541367-1373；Arteaga等(1994)Cancer Res.543758-3765；Harwerth等(1992)J.Bio.Chem.26715160-15167；美國專利號(hào)5783186；和Klapper等(1997)Oncogene142099-2109中描述了具有各種性能的其它抗ErbB2抗體。
同源篩選導(dǎo)致鑒定到兩種其它ErbB受體家族成員；ErbB3(美國專利號(hào)5,183,884；美國專利號(hào)5,480,968；KraU.S.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA869193-9197)和ErbB4(EP 599274；Plowman等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA901746-1750；和Plowman等(1993)Nature 366473-475)。在至少一些乳腺癌細(xì)胞系上這兩種受體都顯示表達(dá)增加。
賀賽汀_(曲妥珠單抗)是一種重組DNA獲得的人源化單克隆抗體，在基于細(xì)胞的試驗(yàn)中，能以高親和力(Kd＝5nM)選擇性結(jié)合于人表皮生長因子受體2蛋白HER2(ErbB2)的胞外結(jié)構(gòu)域(美國專利號(hào)5821337；美國專利號(hào)6054297；美國專利號(hào)6407213；美國專利號(hào)6639055；Coussens L等(1985)Science 2301132-9；Slamon DJ等(1989)Science 244707-12)。曲妥珠單抗是IgGlκ抗體含有人構(gòu)架區(qū)，該區(qū)含有能結(jié)合HER2的鼠抗體(4D5)的互補(bǔ)決定區(qū)。曲妥珠單抗能結(jié)合HER2抗原，從而抑制癌細(xì)胞生長。因?yàn)榍字閱慰故侨嗽椿贵w，所以它在患者中引起的HAMA應(yīng)答很小。用哺乳動(dòng)物細(xì)胞(中國倉鼠卵巢細(xì)胞，CHO)懸浮培養(yǎng)物產(chǎn)生了抗HER2的人源化抗體。HER2(或c-erbB2)原癌基因編碼一種185kDa的跨膜受體蛋白，它與表皮生長因子受體結(jié)構(gòu)相關(guān)。在25％-30％的原發(fā)性乳腺癌中發(fā)現(xiàn)有HER2蛋白過表達(dá)，這可通過固定腫瘤塊的免疫組化評價(jià)來確定(Press MF等(1993)Cancer Res 534960-70。在體外試驗(yàn)和動(dòng)物體中，曲妥珠單抗均顯示出能夠抑制過表達(dá)HER2的人腫瘤細(xì)胞增殖(Hudziak RM等(1989)Mol Cell Biol 91165-72；Lewis GD等(1993)Cancer ImmunolImmunother；37255-63；Baselga J等(1998)Cancer Res.582825-2831)。曲妥珠單抗是抗體依賴性細(xì)胞毒性ADCC的調(diào)節(jié)物(Hotaling TE等(1996)[摘要]。Proc.AnnualMeeting Am Assoc Cancer Res；37471；Pegram MD等(1997)[摘要]。Proc Am AssocCancer Res；38602)。在體外，與不過表達(dá)HER2的癌細(xì)胞相比，已顯示曲妥珠單抗可優(yōu)選對HER2過表達(dá)癌細(xì)胞上介導(dǎo)ADCC。賀賽汀_作為單一藥物，用于治療過表達(dá)HER2蛋白的轉(zhuǎn)移性乳腺癌和為此接受過一種或多種化療方案的患者。賀賽汀_可與紫杉醇聯(lián)用，治療過表達(dá)HER2蛋白的轉(zhuǎn)移性乳腺癌和沒有為此轉(zhuǎn)移性疾病接受化療的患者。賀賽汀_在曾接受過廣泛抗癌治療的過表達(dá)ErbB2的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者有臨床活性(Baselga等，(1996)J.Clin.Oncol.14737-744)。
抗HER2鼠單克隆抗體能抑制以2+和3+(每個(gè)細(xì)胞1-2×106HER2受體)水平過表達(dá)HER2的乳腺癌細(xì)胞系的生長，但對HER2表達(dá)水平較低的細(xì)胞無活性(Lewis等，(1993)Cancer Immunol.Immunother.37255-263)。根據(jù)這一觀察，將抗體4D5人源化(huMAb4D5-8，rhuMAb HER2，美國專利號(hào)5821337；Carter等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 894285-4289)，并在過表達(dá)HER2但經(jīng)常規(guī)化療后沒有進(jìn)展的乳腺癌腫瘤患者中進(jìn)行測試(Cobleigh等，(1999)J.Clin.Oncol.172639-2648)。
雖然賀賽汀是治療之前曾接受過廣泛抗癌治療的過表達(dá)ErbB2的乳腺癌患者的一個(gè)突破，但此人群中一些患者對賀賽汀治療無反應(yīng)或反應(yīng)很差。
因此，臨床上明顯需要進(jìn)一步開發(fā)針對HER2的癌癥治療藥物，用于對賀賽汀治療無反應(yīng)或反應(yīng)差的過表達(dá)HER2的腫瘤患者或與HER2表達(dá)相關(guān)的其它疾病患者。
本申請中引用的任何參考文獻(xiàn)并非意味著承認(rèn)這些參考文獻(xiàn)對本申請來說是現(xiàn)有技術(shù)。
3.發(fā)明概述本發(fā)明一方面提供了具有式Ia的藥物-接頭-配體化合物L(fēng)_Aa-Ww-Yy-D)pIa或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物其中，L-是配體單元；-Aa-Ww-Yy-是接頭單元(LU)，其中該接頭單元包括-A-是拉伸單元(Stretcher unit)，a是0或1，-W-各自獨(dú)立地是氨基酸單元，w是0-12之間的一個(gè)整數(shù)，-Y-是間隔單元，和y是0、1或2；p的范圍是1～約20；和
-D是具有式DE和DF的藥物單元其中，各位置相互獨(dú)立R2選自H和C1-C8烷基；R3選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R4選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R5選自H和甲基；或者R4和R5連接形成碳環(huán)，并具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb獨(dú)立地選自H、C1-C8烷基和C3-C8碳環(huán)，n選自2、3、4、5和6；R6選自H和C1-C8烷基；R7選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R8各自獨(dú)立地選自H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)和O-(C1-C8烷基)；R9選自H和C1-C8烷基；R10選自芳基或C3-C8雜環(huán)；Z是O、S、NH或NR12，其中R12是C1-C8烷基；R11選自H、C1-C20烷基、芳基、C3-C8雜環(huán)、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；m是范圍在1-1000之間的一個(gè)整數(shù)；R13是C2-C8烷基；R14是H或C1-C8烷基；
各個(gè)出現(xiàn)的R15獨(dú)立地是H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R16獨(dú)立地是H、C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；其中n是0-6之間的一個(gè)整數(shù)；和R18選自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8雜環(huán))和-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳環(huán))。
在另一方面，提供了具有式Ib的藥物化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，其中R2選自氫和-C1-C8烷基；R3選自氫、-C1-C8烷基、-C3-C8碳環(huán)、芳基、-C1-C8烷基-芳基、-C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、-C3-C8雜環(huán)和-C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R4選自氫、-C1-C8烷基、-C3-C8碳環(huán)、-芳基、-C1-C8烷基-芳基、-C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、-C3-C8雜環(huán)和-C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))，其中R5選自-H和-甲基；或R4和R5連接具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb獨(dú)立地選自-H、-C1-C8烷基和-C3-C8碳環(huán)，n選自2、3、4、5和6，并與它們連接的碳原子形成環(huán)；R6選自H和-C1-C8烷基；R7選自H、-C1-C8烷基、-C3-C8碳環(huán)、芳基、-C1-C8烷基-芳基、-C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、-C3-C8雜環(huán)和-C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R8各自獨(dú)立地選自H、-OH、-C1-C8烷基、-C3-C8碳環(huán)和-O-(C1-C8烷基)；R9選自H和-C1-C8烷基；R10選自芳基或-C3-C8雜環(huán)；Z是-O-、-S-、-NH-或-NR12-，其中R12是C1-C8烷基；R11選自H、C1-C20烷基、芳基、-C3-C8雜環(huán)、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；m是范圍在1-1000之間的一個(gè)整數(shù)；
R13是-C2-C8烷基；R14是H或-C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R15獨(dú)立地是H、-COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R16獨(dú)立地是H、-C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；和n是0-6之間的一個(gè)整數(shù)。
式(Ib)化合物可用于治療患者的癌癥，自身免疫病或傳染病或可用作合成具有可切割藥物單元的藥物-接頭、藥物-接頭-配體偶聯(lián)物和藥物-配體偶聯(lián)物的中間體。
在另一方面，本發(fā)明所提供的組合物包括有效量的藥物-接頭-配體偶聯(lián)物和藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或介質(zhì)。
在又一方面，本發(fā)明提供的藥物組合物含有有效量的藥物-接頭化合物和藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或介質(zhì)。
在又一方面，本發(fā)明提供的組合物含有有效量的含有藥物-配體偶聯(lián)物的可切割藥物單元的藥物-配體偶聯(lián)物和藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或介質(zhì)。
在又一方面，本發(fā)明提供殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞增殖的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭化合物給予需要它的患者。
在另一方面，本發(fā)明提供殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞增殖的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭-配體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在另一方面，本發(fā)明提供殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞增殖的方法，該方法包括將有效量的含有藥物-配體偶聯(lián)物的可切割藥物單元的藥物-配體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供治療癌癥的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭化合物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供治療癌癥的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭-配體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供治療癌癥的方法，該方法包括將有效量的含有藥物-配體偶聯(lián)物的可切割藥物單元的藥物-配體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供殺傷或抑制表達(dá)自身免疫抗體的細(xì)胞復(fù)制的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭化合物給予需要它的患者。
在另一方面，本發(fā)明提供殺傷或抑制表達(dá)自身免疫抗體的細(xì)胞復(fù)制的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭-配體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在另一方面，本發(fā)明提供殺傷或抑制表達(dá)自身免疫抗體的細(xì)胞復(fù)制的方法，該方法包括將有效量的含有藥物-配體偶聯(lián)物的可切割藥物單元的藥物-配體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供治療自身免疫病的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭化合物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供治療自身免疫病的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭-配體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供治療自身免疫病的方法，該方法包括將有效量的含有藥物-配體偶聯(lián)物的可切割藥物單元的藥物-配體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供治療傳染病的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭化合物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供治療傳染病的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭-配體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供治療傳染病的方法，該方法包括將有效量的含有藥物-配體偶聯(lián)物的可切割藥物單元的藥物-配體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供預(yù)防腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞增殖的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭化合物給予需要它的患者。
在另一方面，本發(fā)明提供預(yù)防腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞增殖的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭-配體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在另一方面，本發(fā)明提供預(yù)防腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞增殖的方法，該方法包括將有效量的含有藥物-配體偶聯(lián)物的可切割藥物單元的藥物-配體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供預(yù)防癌癥的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭化合物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供預(yù)防癌癥的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭-配體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供預(yù)防癌癥的方法，該方法包括將有效量的含有藥物-配體偶聯(lián)物的可切割藥物單元的藥物-配體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供預(yù)防表達(dá)自身免疫抗體的細(xì)胞增殖的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭化合物給予需要它的患者。
在另一方面，本發(fā)明提供預(yù)防表達(dá)自身免疫抗體的細(xì)胞增殖的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭-配體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在另一方面，本發(fā)明提供預(yù)防表達(dá)自身免疫抗體的細(xì)胞增殖的方法，該方法包括將有效量的含有藥物-配體偶聯(lián)物的可切割藥物單元的藥物-配體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供預(yù)防自身免疫病的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭化合物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供預(yù)防自身免疫病的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭-配體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供預(yù)防自身免疫病的方法，該方法包括將有效量的含有藥物-配體偶聯(lián)物的可切割藥物單元的藥物-配體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供預(yù)防傳染病的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭化合物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供預(yù)防傳染病的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭-配體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供預(yù)防傳染病的方法，該方法包括將有效量的含有藥物-配體偶聯(lián)物的可切割藥物單元的藥物-配體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在另一方面，提供的藥物化合物可用作合成含有藥物-配體偶聯(lián)物的可切割藥物單元的藥物-接頭化合物的中間體。
在另一方面，提供的藥物-接頭化合物可用作合成藥物-接頭-配體偶聯(lián)物的中間體。
在另一方面，提供了具有式Ia’的化合物Ab_Aa-Ww-Yy-D)pIa’或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，其中Ab包括抗體，包括能與CD30、CD40、CD70和Lewis Y抗原結(jié)合的抗體，A是拉伸單元，a是0或1，W各自獨(dú)立地是氨基酸單元，w是0-12之間的一個(gè)整數(shù)，Y是間隔單元，和
y是0、1或2，p的范圍是1～約20，和D是選自式DE和DF的藥物單元其中，各位置相互獨(dú)立R2選自H和C1-C8烷基；R3選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R4選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R5選自H和甲基；或者R4和R5連接形成碳環(huán)，并具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb獨(dú)立地選自H、C1-C8烷基和C3-C8碳環(huán)，n選自2、3、4、5和6；R6選自H和C1-C8烷基；R7選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R8各自獨(dú)立地選自H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)和O-(C1-C8烷基)；R9選自H和C1-C8烷基；R10選自芳基或C3-C8雜環(huán)；Z是O、S、NH或NR12，其中R12是C1-C8烷基；R11選自H、C1-C20烷基、芳基、C3-C8雜環(huán)、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；m是范圍在1-1000之間的一個(gè)整數(shù)；R13是C2-C8烷基；
R14是H或C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R15獨(dú)立地是H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R16獨(dú)立地是H、C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；R18選自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8雜環(huán))和-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳環(huán))；和n是0-6之間的一個(gè)整數(shù)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，Ab不是能與ErbB受體結(jié)合的或受體(1)-(35)中一種或多種結(jié)合的抗體(1)BMPR1B(骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體-IB型，Genbank登錄號(hào)NM_001203)；(2)E16(LAT1，SLC7A5，Genbank登錄號(hào)NM_003486)；(3)STEAP1(六次跨膜的前列腺上皮抗原，Genbank登錄號(hào)NM_012449)；(4)0772P(CA125、MUC16，Genbank登錄號(hào)AF361486)；(5)MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核細(xì)胞強(qiáng)化因子、間皮素(mesothelin)，Genbank登錄號(hào)NM_005823)；(6)Napi3b(NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶質(zhì)運(yùn)載體家族34(磷酸鈉)、成員2、II型鈉依賴性磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3b，Genbank登錄號(hào)NM_006424)；(7)Sema 5b(FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、腦信號(hào)蛋白(semaphorin)5b Hlog、sema結(jié)構(gòu)域、七個(gè)血小板反應(yīng)蛋白重復(fù)序列(1型和1型樣)、跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)和短胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、(腦信號(hào)蛋白)5B，Genbank登錄號(hào)AB040878)；(8)PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKEN cDNA 2700050C12、RIKEN cDNA 2700050C12基因，Genbank登錄號(hào)AY358628)；(9)ETBR(內(nèi)皮縮血管肽B型受體，Genbank登錄號(hào)AY275463)；(10)MSG783(RNF124，假擬蛋白FLJ20315，Genbank登錄號(hào)NM_017763)；(11)STEAP2(HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前列腺癌相關(guān)基因1、前列腺癌相關(guān)蛋白1、六次跨膜的前列腺上皮抗原2、六次跨膜的前列腺蛋白，Genbank登錄號(hào)AF455138)；(12)TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬時(shí)受體電勢陽離子通道、亞家族M、成員4，Genbank登錄號(hào)NM_017636)；(13)CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎癌衍生生長因子，Genbank登錄號(hào)NP_003203或NM_003212)；
(14)CD21(CR2(補(bǔ)體受體2)或C3DR(C3d/EB病毒受體)或Hs.73792，Genbank登錄號(hào)M26004)；(15)CD79b(IGb(免疫球蛋白-相關(guān)β)、B29，Genbank登錄號(hào)NM_000626)；(16)FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(含有磷酸酶錨定蛋白1a的SH2結(jié)構(gòu)域)、SPAP1B、SPAP1C，Genbank登錄號(hào)NM_030764)；(17)HER2(Genbank登錄號(hào)M11730)；(18)NCA(Genbank登錄號(hào)M18728)；(19)MDP(Genbank登錄號(hào)BC017023)；(20)IL20Rα(Genbank登錄號(hào)AF184971)；(21)短小蛋白聚糖(Genbank登錄號(hào)AF229053)；(22)Ephb2R(Genbank登錄號(hào)NM_004442)；(23)ASLG659(Genbank登錄號(hào)AX092328)；(24)PSCA(Genbank登錄號(hào)AJ297436)；(25)GEDA(Genbank登錄號(hào)AY260763)；(26)BAFF-R(Genbank登錄號(hào)NP_443177.1)；(27)CD22(Genbank登錄號(hào)NP-001762.1)；(28)CD79a(CD79A，CD79α，免疫球蛋白相關(guān)α，與Igβ(CD79B)發(fā)生共價(jià)作用并在表面與IgM分子形成復(fù)合物、轉(zhuǎn)導(dǎo)參與B細(xì)胞分化信號(hào)的B細(xì)胞特異性蛋白，Genbank登錄號(hào)NP_001774.1)；(29)CXCR5(伯基特淋巴瘤受體1，受CXCL13趨化因子活化的G蛋白偶聯(lián)受體，在淋巴細(xì)胞遷移和體液防御中起作用，在HIV-2感染中、也可能在AIDS、淋巴瘤、骨髓瘤和白血病的發(fā)展中起作用，Genbank登錄號(hào)NP_001707.1)；(30)HLA-DOB(能與肽結(jié)合并將肽提呈給CD4+T淋巴細(xì)胞的II型MHC分子的β亞基(Ia抗原)，Genbank登錄號(hào)NP_002111.1)；(31)P2X5(嘌呤能受體P2X配體-門控離子通道5，由胞外ATP門控的離子通道，可能參與突觸傳遞和神經(jīng)發(fā)生，其缺陷可造成特發(fā)性逼尿肌不穩(wěn)定性的生理病變，Genbank登錄號(hào)NP_002552.2)；(32)CD72(B細(xì)胞分化抗原CD72，Lyb-2，Genbank登錄號(hào)NP_001773.1)；(33)LY64(淋巴細(xì)胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRR)家族的I型膜蛋白，調(diào)節(jié)B細(xì)胞活化和凋亡，其功能缺失與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的疾病活動(dòng)升高相關(guān)，Genbank登錄號(hào)NP_005573.1)；
(34)FCRH1(Fc受體樣蛋白1，推測為含有C2型Ig樣和ITAM結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的受體，可能在B-淋巴細(xì)胞分化中起作用，Genbank登錄號(hào)NP_443170.1)；或(35)IRTA2(免疫球蛋白超家族受體易位相關(guān)2，推測在B細(xì)胞發(fā)育和淋巴瘤發(fā)生中可能起作用的免疫受體；在一些B細(xì)胞惡性腫瘤中發(fā)生易位使該基因失調(diào)，Genbank登錄號(hào)NP_112571.1)。
在又一方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，該組合物含有有效量的藥物-接頭-抗體偶聯(lián)物和藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或介質(zhì)。
在又一方面，本發(fā)明提供了組合物，該組合物含有有效量的含有藥物-抗體偶聯(lián)物的可切割藥物單元(部分)的藥物-抗體偶聯(lián)物和藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或介質(zhì)。
在另一方面，本發(fā)明提供殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞增殖的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭-抗體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在另一方面，本發(fā)明提供殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞增殖的方法，該方法包括將有效量的含有藥物-抗體偶聯(lián)物的可切割藥物單元的藥物-抗體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供治療癌癥的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭-抗體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供治療癌癥的方法，該方法包括將有效量的含有藥物-抗體偶聯(lián)物的可切割藥物單元的藥物-抗體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在另一方面，本發(fā)明提供殺傷或抑制表達(dá)自身免疫抗體的細(xì)胞復(fù)制的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭-抗體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在另一方面，本發(fā)明提供殺傷或抑制表達(dá)自身免疫抗體的細(xì)胞復(fù)制的方法，該方法包括將有效量的含有藥物-抗體偶聯(lián)物的可切割藥物單元的藥物-抗體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供治療自身免疫病的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭-抗體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供治療自身免疫病的方法，該方法包括將有效量的含有藥物-抗體偶聯(lián)物的可切割藥物單元的藥物-抗體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供治療傳染病的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭-抗體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供治療傳染病的方法，該方法包括將有效量的含有藥物-抗體偶聯(lián)物的可切割藥物單元的藥物-抗體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在另一方面，本發(fā)明提供預(yù)防腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞增殖的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭-抗體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在另一方面，本發(fā)明提供預(yù)防腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞增殖的方法，該方法包括將有效量的含有藥物-抗體偶聯(lián)物的可切割藥物單元的藥物-抗體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供預(yù)防癌癥的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭-抗體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供預(yù)防癌癥的方法，該方法包括將有效量的含有藥物-抗體偶聯(lián)物的可切割藥物單元的藥物-抗體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在另一方面，本發(fā)明提供預(yù)防表達(dá)自身免疫抗體的細(xì)胞增殖的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭-抗體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在另一方面，本發(fā)明提供預(yù)防表達(dá)自身免疫抗體的細(xì)胞增殖的方法，該方法包括將有效量的含有藥物-抗體偶聯(lián)物的可切割藥物單元的藥物-抗體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供預(yù)防自身免疫病的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭-抗體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供預(yù)防自身免疫病的方法，該方法包括將有效量的含有藥物-抗體偶聯(lián)物的可切割藥物單元的藥物-抗體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供預(yù)防傳染病的方法，該方法包括將有效量的藥物-接頭-抗體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在又一方面，本發(fā)明提供預(yù)防傳染病的方法，該方法包括將有效量的含有藥物-抗體偶聯(lián)物的可切割藥物單元的藥物-抗體偶聯(lián)物給予需要它的患者。
在另一方面，提供的藥物化合物可用作合成含有藥物-抗體偶聯(lián)物的可切割藥物單元的藥物-接頭化合物的中間體。
在另一方面，提供的藥物-接頭化合物可用作合成藥物-接頭-抗體偶聯(lián)物的中間體。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供具有式Ic的藥物-接頭-抗體偶聯(lián)物(也稱為抗體-藥物偶聯(lián)物)
Ab_Aa-Ww-Yy-D)pIc或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，其中Ab是能與抗原(1)-(35)中一種或多種結(jié)合的抗體(1)BMPR1B(骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體-IB型，Genbank登錄號(hào)NM_001203)；(2)E16(LAT1，SLC7A5，Genbank登錄號(hào)NM_003486)；(3)STEAP1(六次跨膜的前列腺上皮抗原，Genbank登錄號(hào)NM_012449)；(4)0772P(CA125、MUC16，Genbank登錄號(hào)AF361486)；(5)MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核細(xì)胞強(qiáng)化因子、間皮素，Genbank登錄號(hào)NM_005823)；(6)Napi3b(NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶質(zhì)運(yùn)載體家族34(磷酸鈉)、成員2、II型鈉依賴性磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3b，Genbank登錄號(hào)NM_006424)；(7)Sema 5b(FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、腦信號(hào)蛋白5b Hlog、sema結(jié)構(gòu)域、七個(gè)血小板反應(yīng)蛋白重復(fù)序列(1型和1型樣)、跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)和短胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、(腦信號(hào)蛋白)5B，Genbank登錄號(hào)AB040878)；(8)PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKEN cDNA 2700050C12、RIKEN cDNA 2700050C12基因，Genbank登錄號(hào)AY358628)；(9)ETBR(內(nèi)皮縮血管肽B型受體，Genbank登錄號(hào)AY275463)；(10)MSG783(RNF124，假擬蛋白FLJ20315，Genbank登錄號(hào)NM_017763)；(11)STEAP2(HGNC 8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前列腺癌相關(guān)基因1、前列腺癌相關(guān)蛋白1、六次跨膜的前列腺上皮抗原2、六次跨膜的前列腺蛋白，Genbank登錄號(hào)AF455138)；(12)TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬時(shí)受體電勢陽離子通道、亞家族M、成員4，Genbank登錄號(hào)NM_017636)；(13)CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎癌衍生生長因子，Genbank登錄號(hào)NP_003203或NM_003212)；(14)CD21(CR2(補(bǔ)體受體2)或C3DR(C3d/EB病毒受體)或Hs.73792，Genbank登錄號(hào)M26004)；(15)CD79b(IGb(免疫球蛋白-相關(guān)β)、B29，Genbank登錄號(hào)NM_000626)；(16)FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(含有磷酸酶錨定蛋白1a的SH2結(jié)構(gòu)域)、SPAP1B、SPAP1C，Genbank登錄號(hào)NM_030764)；
(17)HER2(Genbank登錄號(hào)M11730)；(18)NCA(Genbank登錄號(hào)M18728)；(19)MDP(Genbank登錄號(hào)BC017023)；(20)IL20Rα(Genbank登錄號(hào)AF184971)；(21)短小蛋白聚糖(Genbank登錄號(hào)AF229053)；(22)Ephb2R(Genbank登錄號(hào)NM_004442)；(23)ASLG659(Genbank登錄號(hào)AX092328)；(24)PSCA(Genbank登錄號(hào)AJ297436)；(25)GEDA(Genbank登錄號(hào)AY260763)；(26)BAFF-R(Genbank登錄號(hào)NP_443177.1)；(27)CD22(Genbank登錄號(hào)NP-001762.1)；(28)CD79a(CD79A，CD79α，免疫球蛋白相關(guān)α，與Igβ(CD79B)發(fā)生共價(jià)作用并在表面與IgM分子形成復(fù)合物、轉(zhuǎn)導(dǎo)參與B細(xì)胞分化信號(hào)的B細(xì)胞特異性蛋白，Genbank登錄號(hào)NP_001774.1)；(29)CXCR5(伯基特淋巴瘤受體1，受CXCL13趨化因子活化的G蛋白偶聯(lián)受體，在淋巴細(xì)胞遷移和體液防御中起作用，在HIV-2感染中、也可能在AIDS、淋巴瘤、骨髓瘤和白血病的發(fā)展中起作用，Genbank登錄號(hào)NP_001707.1)；(30)HLA-DOB(能與肽結(jié)合并將肽提呈給CD4+T淋巴細(xì)胞的II型MHC分子的β亞基(Ia抗原)，Genbank登錄號(hào)NP_002111.1)；(31)P2X5(嘌呤能受體P2X配體-門控離子通道5，由胞外ATP門控的離子通道，可能參與突觸傳遞和神經(jīng)發(fā)生，其缺陷可造成特發(fā)性逼尿肌不穩(wěn)定性的生理病變，Genbank登錄號(hào)NP_02552.2)；(32)CD72(B細(xì)胞分化抗原CD72，Lyb-2，Genbank登錄號(hào)NP_001773.1)；(33)LY64(淋巴細(xì)胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRR)家族的I型膜蛋白，調(diào)節(jié)B細(xì)胞活化和凋亡，其功能缺失與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的疾病活動(dòng)升高相關(guān)，Genbank登錄號(hào)NP_005573.1)；(34)FCRH1(Fc受體樣蛋白1，推測為含有C2型Ig樣和ITAM結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的受體，可能在B-淋巴細(xì)胞分化中起作用，Genbank登錄號(hào)NP_443170.1)；或
(35)IRTA2(免疫球蛋白超家族受體易位相關(guān)2，推測在B細(xì)胞發(fā)育和淋巴瘤發(fā)生中可能起作用的免疫受體；在一些B細(xì)胞惡性腫瘤中發(fā)生易位使該基因失調(diào)，Genbank登錄號(hào)NP_112571.1)；A是拉伸單元，a是0或1，W各自獨(dú)立地是氨基酸單元，w是0-12之間的一個(gè)整數(shù)，Y是間隔單元，和y是0、1或2，p的范圍是1～約20，和D是選自式DE和DF的藥物部分其中，DE和DF的波浪線表示與A、W或Y的共價(jià)連接位點(diǎn)，各位置相互獨(dú)立R2選自H和C1-C8烷基；R3選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R4選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R5選自H和甲基；或者R4和R5連接形成碳環(huán)，并具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb獨(dú)立地選自H、C1-C8烷基和C3-C8碳環(huán)，n選自2、3、4、5和6；R6選自H和C1-C8烷基；
R7選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R8各自獨(dú)立地選自H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)和O-(C1-C8烷基)；R9選自H和C1-C8烷基；R10選自芳基或C3-C8雜環(huán)；Z是O、S、NH或NR12，其中R12是C1-C8烷基；R11選自H、C1-C20烷基、芳基、C3-C8雜環(huán)、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；m是范圍在1-1000之間的一個(gè)整數(shù)；R13是C2-C8烷基；R14是H或C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R15獨(dú)立地是H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R16獨(dú)立地是H、C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；R18選自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8雜環(huán))和-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳環(huán))；和n是0-6之間的一個(gè)整數(shù)。
在另一方面，本發(fā)明抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)中的抗體能與ErbB2基因編碼的受體特異性結(jié)合。
在另一方面，該抗體-藥物偶聯(lián)物中的抗體是人源化抗體，選自huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(曲妥珠單抗)。
在另一方面，本發(fā)明包括含有本發(fā)明抗體-藥物偶聯(lián)化合物的制品；容器；說明該化合物可用于治療特征是過表達(dá)ErbB2受體的癌癥的藥品說明書或標(biāo)簽。
在另一方面，本發(fā)明包括在哺乳動(dòng)物中治療癌癥的方法，所述癌癥的特征是過表達(dá)ErbB2受體，并對抗ErbB2抗體治療無反應(yīng)或反應(yīng)差，該方法包括將治療有效量的本發(fā)明抗體-藥物偶聯(lián)化合物給予該哺乳動(dòng)物。
在另一方面，直到該抗體-藥物偶聯(lián)化合物進(jìn)入具有該抗體-藥物偶聯(lián)物中抗體的特異性細(xì)胞表面受體的細(xì)胞，才將基本上所有藥物部分與該抗體切開；當(dāng)該抗體-藥物偶聯(lián)物進(jìn)入細(xì)胞時(shí)將藥物部分與抗體切開。
在另一方面，當(dāng)與含有該抗體-藥物偶聯(lián)化合物中藥物部分的藥物化合物相比，或當(dāng)與不含藥物部分的該化合物類似物相比，該抗體-藥物偶聯(lián)化合物或該化合物在哺乳動(dòng)物中的胞內(nèi)代謝物的生物利用度得到改善。
在另一方面，在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞內(nèi)該化合物或其胞內(nèi)代謝物中的所述藥物部分與抗體被切開。
在另一方面，本發(fā)明包括一種藥物組合物，該組合物含有有效量的本發(fā)明抗體-藥物偶聯(lián)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、運(yùn)載體或賦形劑。該組合物還可包含治療有效量的化療藥如微管蛋白形成抑制劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑和DNA結(jié)合劑。
在另一方面，本發(fā)明包括殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞增殖的方法，該方法包括用一定量的本發(fā)明抗體-藥物偶聯(lián)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物處理腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞，有效殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞的增殖。
在另一方面，本發(fā)明包括抑制細(xì)胞增殖的方法，該方法包括使細(xì)胞培養(yǎng)基中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞接觸本發(fā)明的抗體-藥物偶聯(lián)物化合物，所述抗體-藥物偶聯(lián)物化合物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，將藥物與抗體-藥物偶聯(lián)物化合物的其余部分切開；從而抑制細(xì)胞增殖。。
在另一方面，本發(fā)明包括治療癌癥的方法，該方法包括將本發(fā)明的抗體-藥物偶聯(lián)化合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、運(yùn)載體或賦形劑的制劑給予患者。
在另一方面，本發(fā)明包括檢測癌細(xì)胞的試驗(yàn)，該試驗(yàn)包括(a)使細(xì)胞接觸本發(fā)明的抗體-藥物偶聯(lián)化合物；和(b)測定所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物與細(xì)胞的結(jié)合程度。
通過結(jié)合本文所附圖形、圖片和方案參考以下示范性實(shí)施方式的詳述，將最好地理解本發(fā)明。以下討論是描述性、說明性和示范性的，不應(yīng)認(rèn)為是限制所附權(quán)利要求所限定的范圍。
附圖簡要說明

圖1顯示cAC10-mcMMAF對皮下Karpas-299 ALCL異種移植瘤的單劑量體內(nèi)藥效試驗(yàn)。
圖2顯示cAC10-mcMMAF對皮下L540cy的單劑量體內(nèi)藥效試驗(yàn)。此研究中，未治療組有4只小鼠，治療組各有10只。
圖3a和3b顯示cBR96-mcMMAF對皮下L2987的體內(nèi)藥效。圖3a中的實(shí)心三角和圖3b中的箭頭指示治療天數(shù)。
圖4a和4b顯示cAC10-抗體-藥物偶聯(lián)物對CD30+細(xì)胞系的體外活性。
圖5a和5b顯示cBR96-抗體-藥物偶聯(lián)物對Ley+細(xì)胞系的體外活性。
圖6a和6b顯示c1F6-抗體-藥物偶聯(lián)物對CD70+腎細(xì)胞癌細(xì)胞系的體外活性。
圖7顯示用抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)處理SK-BR-3細(xì)胞的體外細(xì)胞增殖試驗(yàn)-●-曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAF，3.8MMAF/抗體，-o-曲妥珠單抗-MC-MMAF，4.1MMAF/抗體，-Δ-曲妥珠單抗-MC-MMAF，4.8 MMAF/抗體，以相對熒光單位(RLU)與μg/ml ADC濃度表示。H＝曲妥珠單抗，H通過半胱氨酸[cys]連接。
圖8顯示用ADC處理BT-474的體外細(xì)胞增殖試驗(yàn)-●-曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAF，3.8MMAF/抗體，-o-曲妥珠單抗-MC-MMAF，4.1MMAF/抗體，-Δ-曲妥珠單抗-MC-MMAF，4.8MMAF/Ab。
圖9顯示用ADC處理MCF-7細(xì)胞的體外細(xì)胞增殖試驗(yàn)-●-曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAF，3.8MMAF/抗體，-o-曲妥珠單抗-MC-(N-Me)vc-PAB-MMAF，3.9MMAF/抗體，-Δ-曲妥珠單抗-MC-MMAF，4.1MMAF/Ab。
圖10顯示用ADC處理MDA-MB-468細(xì)胞的體外細(xì)胞增殖試驗(yàn)-●-曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAE，4.1MMAE/抗體，-o-曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAE，3.3MMAE/抗體，-Δ-曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAF，3.7MMAF/Ab。
圖11顯示將H-MC-vc-PAB-MMAF-TEG和H-MC-vc-PAB-MMAF給予Sprague-Dawley大鼠后的血漿濃度清除率研究給藥劑量為每千克大鼠體重2mgADC。測定隨時(shí)間推移的總抗體濃度和ADC濃度。(H＝曲妥珠單抗)。
圖12顯示將0.5、1.5、2.5和3.0mg/kg劑量的H-MC-vc-MMAE給予食蟹猴后第1天和第21天血漿濃度清除率研究。測定隨時(shí)間推移的總抗體濃度和ADC濃度。(H＝曲妥珠單抗)。
圖13顯示對移植了MMTV-HER2 Fo5乳腺腫瘤同種異體移植物的無胸腺裸小鼠，第0天給予運(yùn)載體、曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAE(1250μg/m2)和曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAF(555μg/m2)后，平均腫瘤體積隨時(shí)間的改變。(H＝曲妥珠單抗)。
圖14顯示對移植了MMTV-HER2 Fo5乳腺腫瘤同種異體移植物的無胸腺裸小鼠，第0天給予10mg/kg(660μg/m2)曲妥珠單抗-MC-MMAE和1250μg/m2曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAE后，平均腫瘤體積隨時(shí)間的改變。
圖15顯示對移植了MMTV-HER2 Fo5乳腺腫瘤同種異體移植物的無胸腺裸小鼠，第0天給予運(yùn)載體和650μg/m2曲妥珠單抗-MC-MMAF后，平均腫瘤體積隨時(shí)間的改變。
圖16顯示對移植了MMTV-HER2 Fo5乳腺腫瘤同種異體移植物的無胸腺裸小鼠，第0天給予運(yùn)載體和350μg/m2的MMAF/曲妥珠單抗(H)之比為2、4、5.9和6的四種曲妥珠單抗-MC-MMAF偶聯(lián)物后，平均腫瘤體積隨時(shí)間的改變。
圖17顯示給予運(yùn)載體、曲妥珠單抗-MC-val-cit-MMAF、曲妥珠單抗-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF、曲妥珠單抗-MC-MMAF和曲妥珠單抗-MC-val-cit-PAB-MMAF后，動(dòng)物(大鼠)體重(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)的組平均值改變(加誤差線)。
圖18顯示給予9.94mg/kg H-MC-vc-MMAF、24.90mg/kg H-MC-vc-MMAF、10.69mg/kg H-MC(Me)-vc-PAB-MMAF、26.78mg/kg H-MC(Me)-vc-PAB-MMAF、10.17mg/kg H-MC-MMAF、25.50mg/kg H-MC-MMAF和21.85mg/kgH-MC-vc-PAB-MMAF后，動(dòng)物(大鼠)體重(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)的組平均值改變(加誤差線)。H＝曲妥珠單抗。各偶聯(lián)物中MC接頭通過曲妥珠單抗的半胱氨酸相連接。
圖19顯示以2105、3158和4210μg/m2的劑量給予曲妥珠單抗(H)-MC-MMAF后，Sprague Dawley大鼠體重(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)的組平均值改變(加誤差線)。各偶聯(lián)物中MC接頭通過曲妥珠單抗的半胱氨酸相連接。
4.示范性實(shí)施方式詳述4.1定義和縮寫除非另有說明，本文所用以下術(shù)語和短語的涵義如下當(dāng)本文中使用商品名時(shí)，申請人旨在各自包括該商品名產(chǎn)品的制劑、該商品名產(chǎn)品的非專利藥和活性藥物成分。
本文所用術(shù)語“抗體”在最廣義上，和具體含義上包括完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們具有所需生物學(xué)活性。抗體是免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的能夠識(shí)別和結(jié)合特定抗原的蛋白。就其結(jié)構(gòu)而言，抗體一般是由四條氨基酸鏈(兩條重鏈兩條輕鏈)組成的Y形蛋白。各抗體主要具有兩個(gè)區(qū)域可變區(qū)和恒定區(qū)。可變區(qū)位于Y臂的兩末端，能與靶抗原結(jié)合和相互作用。可變區(qū)包括能識(shí)別和結(jié)合具體抗原特異性結(jié)合位點(diǎn)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。恒定區(qū)位于Y的尾部，可為免疫系統(tǒng)識(shí)別并相互作用(Janeway，C.，Travers，P.，Walport，M.，Shlomchik(2001)Immuno Biology，第5版，Garland Publishing，New York)。靶抗原通常具有數(shù)個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，也稱為表位，可被多種抗體的CDR識(shí)別。與不同表位特異性結(jié)合的各抗體具有不同結(jié)構(gòu)。因此，一種抗原可能具有一種以上的對應(yīng)抗體。
本文所用術(shù)語“抗體”也指全長免疫球蛋白分子或全長免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有與感興趣靶抗原或其一部分免疫特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子，這些靶包括但不限于，癌細(xì)胞或產(chǎn)生與自身免疫病相關(guān)的自身免疫性抗體的細(xì)胞。本文所述的免疫球蛋白可以是任何類型的免疫球蛋白分子(如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、或其亞型(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。免疫球蛋白可獲自任何動(dòng)物。然而，在一個(gè)方面，所述免疫球蛋白是人、鼠或兔源的。在另一方面，所述抗體是多克隆、單克隆、雙特異性、人、人源化或嵌合抗體、單鏈抗體、Fv、Fab片段、F(ab’)片段、F(ab’)2片段、Fab表達(dá)文庫產(chǎn)生的片段、抗獨(dú)特型(抗Id)抗體、CDR和上述與癌細(xì)胞抗原、病毒抗原或微生物抗原免疫特異性結(jié)合的抗體的表位結(jié)合片段。
本文所用術(shù)語“單克隆抗體”指獲自基本均一抗體群的抗體，即，群體中所含的單個(gè)抗體相同，除了可能存在的少量天然突變產(chǎn)生的外。單克隆抗體具有高度特異性，只針對一個(gè)抗原位點(diǎn)。而與包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑相反，各單克隆抗體只針對抗原上的一個(gè)決定簇。除它們的特異性之外，單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)在于它們的合成可不污染其它抗體。修飾詞“單克隆”指該抗體的特征是獲自基本均一的抗體群，且不應(yīng)認(rèn)為需要用任何特定方法來產(chǎn)生該抗體。例如，可用如Kohler等(1975)Nature 256495首先描述的雜交瘤方法制備用于本發(fā)明的單克隆抗體，或可用重組DNA方法制備(參見美國專利號(hào)4816567)。也可用Clackson等(1991)Nature，352624-628和Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222581-597所述技術(shù)從噬菌體抗體文庫中分離“單克隆抗體”。
本文中單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體，其重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自某特定動(dòng)物的相應(yīng)序列相同或同源或?qū)儆谀程囟贵w類型或亞型，而二鏈其余部分與衍生自另一種動(dòng)物的相應(yīng)序列相同或同源或者屬于另一抗體類型或亞型的抗體以及其片段，只要它們具有所需生物學(xué)活性(美國專利mp/4816567；和Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855)。
已采用了各種方法來產(chǎn)生單克隆抗體(MAb)。雜交瘤技術(shù)指產(chǎn)生單一類型抗體的克隆細(xì)胞系，該技術(shù)采用各種動(dòng)物的細(xì)胞，包括小鼠(鼠)、倉鼠、大鼠和人。制備MAb的另一方法是采用遺傳工程技術(shù)，包括重組DNA技術(shù)。由這些技術(shù)制備的單克隆抗體包括嵌合抗體和人源化抗體等。嵌合抗體中組合了一種以上動(dòng)物的DNA編碼區(qū)。例如，嵌合抗體可從小鼠獲得可變區(qū)，從人獲得恒定區(qū)。人源化抗體主要部分來自人，盡管它含有非人部分。就像嵌合抗體一樣，人源化抗體可包含完整的人恒定區(qū)。但不像嵌合抗體，其可變區(qū)可部分來源于人。人源化抗體的非人合成部分常常來自鼠抗體中的CDR。在任何情況下，這些(CDR)區(qū)域?qū)τ诳贵w識(shí)別和結(jié)合特異性抗原都是關(guān)鍵的。
如上所述，可使用鼠抗體。雖然可用于診斷和短期治療。但不可能將鼠抗體長期給予人而不增加發(fā)生有害免疫原應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)。這種稱為人抗鼠抗體(HAMA)的應(yīng)答反應(yīng)，在人免疫系統(tǒng)將鼠抗體識(shí)別為外來者并進(jìn)行攻擊時(shí)發(fā)生。HAMA反應(yīng)可引起中毒性休克，甚至死亡。
嵌合和人源化抗體通過最大程度減少所給予抗體的非人部分而降低發(fā)生HAMA反應(yīng)的可能性。而且，嵌合和人源化抗體具有激活繼發(fā)性人免疫應(yīng)答反應(yīng)，如抗體依賴性細(xì)胞毒性的額外好處。
“抗體片段”含有完整抗體的一部分，優(yōu)選含有完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；雙抗體(diabody)；線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。
“完整”的抗體是含有抗原結(jié)合可變區(qū)以及輕鏈恒定區(qū)(CL)和重鏈恒定區(qū)CH1、CH2和CH3的抗體。恒定區(qū)可以是天然序列的恒定區(qū)(如人天然序列的恒定區(qū))或其氨基酸序列變體。
完整抗體可具有一個(gè)或多個(gè)“效應(yīng)器功能”，效應(yīng)器功能指歸因于抗體Fc區(qū)(天然序列的Fc區(qū)或氨基酸序列變體的Fc區(qū))的生物學(xué)活性。抗體效應(yīng)器功能的例子包括Clq結(jié)合；補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細(xì)胞表面受體(如B細(xì)胞受體；BCR)的下調(diào)等。
根據(jù)它們重鏈的恒定區(qū)的氨基酸序列，完整抗體可分為不同“型”。完整抗體主要有五種型IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中幾型可再分為“亞型”(同種型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。對應(yīng)于不同抗體型的重鏈恒定區(qū)分別稱為α、δ、ε、γ和μ。不同型的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是熟知的。
在本文中，表述“ErbB2”和“HER2”可互換使用，指人HER2蛋白，如Semba等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，826497-6501(1985)和Yamamoto等，(1986)Nature，319230-234(Genebank登錄號(hào)X03363)中所述。術(shù)語“erbB2”指編碼人ErbB2的基因，“neu”指編碼rat p185neu的基因。ErbB2優(yōu)選是天然序列的人ErbB2。
可從許多公司購得ErbB受體的抗體，包括例如Santa Cruz Biotechnology，Inc.，California，USA。
“ErbB配體”指結(jié)合和/或激活ErbB受體的多肽。ErbB配體可以是天然序列的人ErbB配體，如表皮生長因子(EGF)(Savage等(1972)J.Biol.Chem.，2477612-7621)；轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)(Marquardt等(1984)Science 2231079-1082)；雙調(diào)蛋白也稱為施萬細(xì)胞瘤或角質(zhì)形成細(xì)胞自分泌生長因子(Shoyab等(1989)Science 2431074-1076；Kimura等，Nature，348257-260(1990)；和Cook等，Mol.Cell.Biol.，112547-2557(1991))；β動(dòng)物纖維素(Shing等，Science，2591604-1607(1993)；和Sasada等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1901173(1993))；肝素結(jié)合性表皮生長因子(HB-EGF)(Higashiyama等，Science，251936-939(1991))；表皮調(diào)節(jié)蛋白(epiregulin)(Toyoda等，J.Biol.Chem.，2707495-7500(1995)；和Komurasaki等，Oncogene，152841-2848(1997))；調(diào)蛋白(見下)；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-2(NRG-2)(Carraway等，Nature，387512-516(1997))；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-3(NRG-3)(Zhang等，Proc.Natl.Acad.Sci.，949562-9567(1997))；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-4(NRG-4)(Harari等，Oncogene，182681-89(1999))或cripto(CR-1)(Kannan等，J.Biol.Chem.，272(6)3330-3335(1997))。結(jié)合EGFR的ErbB配體包括EGF、TGF-α、雙調(diào)蛋白、β動(dòng)物纖維素、HB-EGF和表皮調(diào)節(jié)蛋白。結(jié)合ErbB3的ErbB配體包括調(diào)蛋白。能夠結(jié)合ErbB4的ErbB配體包括β動(dòng)物纖維素、表皮調(diào)節(jié)蛋白、HB-EGF、NRG-2、NRG-3、NRG-4和調(diào)蛋白。ErbB配體也可以是合成的ErbB配體。合成配體可以對特定ErbB受體具有特異性，或可以識(shí)別特定的ErbB受體復(fù)合物。合成配體的一個(gè)例子是合成的調(diào)蛋白/EGF嵌合雙調(diào)蛋白(biregulin)(參見例如，Jones等，(1999)FEBS Letters，447227-231，納入作為參考)。
“調(diào)蛋白”(HRG)指由調(diào)蛋白基因產(chǎn)物編碼的多肽，如美國專利號(hào)5641869或Marchionni等，Nature，362312-318(1993)所述。調(diào)蛋白的例子包括調(diào)蛋白-α、調(diào)蛋白-β1、調(diào)蛋白-β2和調(diào)蛋白-β3(Holmes等，Science，2561205-1210(1992)；和美國專利號(hào)5641869)；神經(jīng)分化因子(NDF)(Peles等，Cell69205-216(1992))；乙酰膽堿能受體-誘導(dǎo)的活性(ARIA)(Falls等(1993)Cell 72801-815)；神經(jīng)膠質(zhì)生長因子(GGFs)(Marchionni等，Nature，362312-318(1993))；感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元衍生因子(SMDF)(Ho等，J.Biol.Chem.，27014523-14532(1995))；γ-調(diào)蛋白(Schaefer等，Oncogene，151385-1394(1997))。該術(shù)語包括天然序列HRG多肽的生物活性片段和/或氨基酸序列變體，如其EGF樣結(jié)構(gòu)域片段(如HRGβ1177-244)。
“ErbB異質(zhì)寡聚物”是含有至少兩種不同ErbB受體的非共價(jià)結(jié)合的寡聚物?！癊rbB二聚體”是含有兩種不同ErbB受體的非共價(jià)結(jié)合的寡聚物。當(dāng)表達(dá)兩種或多種ErbB受體的細(xì)胞接觸ErbB配體時(shí)可形成這種復(fù)合物。ErbB寡聚物，如ErbB二聚物可用免疫沉淀分離并用SDS-PAGE分析，如Sliwkowski等，J.Biol.Chem.，269(20)14661-14665(1994)所述。這種ErbB異質(zhì)寡聚物的例子包括EGFR-ErbB2(也稱為HER1/HER2)、ErbB2-ErbB3(HER2/HER3)和ErbB3-ErbB4(HER3/HER4)復(fù)合物。而且，ErbB異質(zhì)寡聚物可含有兩種或多種與不同ErbB受體如ErbB3、ErbB4或EGFR(ErbB1)組合的ErbB2受體。該異質(zhì)寡聚物可包括其它蛋白如細(xì)胞因子受體亞基(如gp130)。
“天然序列”多肽是具有的氨基酸序列與天然多肽如腫瘤相關(guān)抗原受體相同的多肽。這種天然序列多肽可分離自天然產(chǎn)生的或可重組或合成方法產(chǎn)生的。因此，天然序列多肽可具有天然存在的人多肽、鼠多肽或其它哺乳動(dòng)物物種的多肽的氨基酸序列。
術(shù)語“氨基酸序列變體”指氨基酸序列在某種程度上與天然序列多肽不同的多肽。通常，氨基酸序列變體與天然配體的至少一個(gè)受體結(jié)合域，或與天然受體如腫瘤相關(guān)抗原的至少一個(gè)配體結(jié)合域的同源性至少約70％，它們與所述受體或配體結(jié)合域的同源性優(yōu)選至少約80％，更優(yōu)選至少約90％。氨基酸序列變體在天然氨基酸序列的某些位置上具有取代、缺失和/或插入。
“序列相同性”的定義是兩條序列比對和按需引入空隙以獲得最大序列相同性百分?jǐn)?shù)后，氨基酸序列變體中相同的殘基百分?jǐn)?shù)。用于比對的方法和計(jì)算機(jī)程序是本領(lǐng)域熟知的。這種計(jì)算機(jī)程序之一是“比對2”，出版者是Genentech，Inc.，1991年12月10日將其用戶文件說明提交給美國著作權(quán)局，Washington，DC20559。
“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒”和“ADCC”指細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體(FcRs)(如自然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)的非特異性細(xì)胞毒細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體，然后引起靶細(xì)胞裂解。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞即NK細(xì)胞僅表達(dá)FcγRIII，而單核細(xì)胞表達(dá)FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet，(1991)Annu.Rev.Immunol，9457-92第464頁的表3中小結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。為評價(jià)感興趣分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC試驗(yàn)，如美國專利號(hào)5500362或5821337所述。用于這些試驗(yàn)的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細(xì)胞?；蛘?，或此外，可在體內(nèi)，如動(dòng)物模型中評價(jià)感興趣分子的ADCC活性，如Clynes等，Prco.Natl.Acad.Sci.USA，95652-656(1998)所述。
術(shù)語“Fc受體”或“FcR”用于描述與抗體的Fc區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列的人FcR。而且，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的FcR(γ受體)，包括受體FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞型，包括這些受體的等位基因變體和交替剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(“激活性受體”)和FcγRIIB(“抑制性受體”)，它們具有相似的氨基酸序列，主要是其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域不同。激活性受體FcγRIIA的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域含有基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制性受體FcγRIIB的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域含有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(參見綜述M.in Daёron，Annu.Rev.Immunol.，15203-234(1997))。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9457-92(1991)；Capel等，Immunomethods，425-34(1994)；和de Haas等，J.Lab.Clin.Med.，126330-41(1995)對FcR進(jìn)行了綜述。本文中的術(shù)語“FcR”包括其它FcR，包括將來鑒定的FcR。該術(shù)語也包括新生兒受體FcRn，它負(fù)責(zé)將母親的IgG轉(zhuǎn)運(yùn)給胎兒。(Guyer等，J.Immunol.，117587(1976)和Kim等，J.Immunol.，24249(1994))。
“補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒”或“CDC”指某分子在補(bǔ)體的存在下裂解靶細(xì)胞的能力。當(dāng)補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(C1q)與相關(guān)抗原形成復(fù)合物的某分子(如抗體)結(jié)合時(shí)能啟動(dòng)補(bǔ)體激活途徑。為評價(jià)補(bǔ)體激活，可進(jìn)行CDC試驗(yàn)，如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods，202163(1996)所述。
術(shù)語“可變”指抗體可變區(qū)某些部分的序列大不相同的情況，這些序列是各特定抗體用于對其特定抗原相結(jié)合和特異性的序列。然而，在抗體的整個(gè)可變區(qū)中，可變性不是均勻分布的。在輕鏈和重鏈可變區(qū)中，可變性集中在三個(gè)稱為超變區(qū)的節(jié)段中?？勺儏^(qū)中保守程度較高的部分稱為構(gòu)架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各自包含四個(gè)FR，大部分采用β-片層構(gòu)型，由形成環(huán)狀連接的和在一些情況下形成β-片層結(jié)構(gòu)部分的三個(gè)超變區(qū)連接。各鏈的超變區(qū)與另一條鏈的超變區(qū)通過FR緊密地靠在一起形成了抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見Kabat等(1991)，《免疫學(xué)感興趣蛋白的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，Public Health Service，國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)，Bethesda，MD)。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但具有各種效應(yīng)器功能，如參與抗體的抗體依賴性細(xì)胞毒(ADCC)。
本文所用術(shù)語“超變區(qū)”指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。超變區(qū)通常包括“互補(bǔ)性決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(如輕鏈可變區(qū)中的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重鏈可變區(qū)中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，同上)和/或“超變環(huán)”的殘基(如輕鏈可變區(qū)中的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重鏈可變區(qū)中的26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.，196901-917)?！皹?gòu)架區(qū)”或“FR”殘基是除了本文所定義的超變區(qū)殘基之外的可變區(qū)殘基。
木瓜酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱為“Fab”片段，各片段具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，和一個(gè)殘留的“Fc”片段，其名稱反映出它易結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的F(ab’)2片段，仍能夠交聯(lián)抗原。
“Fv”是含有完整抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。該區(qū)域由一條重鏈和一條輕鏈的可變區(qū)通過緊密的非共價(jià)連接組成二聚體。在此構(gòu)型中，各可變區(qū)的三個(gè)超變區(qū)互相作用確定了VH-VL二聚體表面上的抗原結(jié)合位點(diǎn)?？傊沁@六個(gè)超變區(qū)賦予了抗體的抗原結(jié)合特異性。然而，即使一個(gè)可變區(qū)(或僅含有抗原特異性三個(gè)超變區(qū)的Fv的一半)就能夠識(shí)別和結(jié)合抗原，但是親和力低于完整的結(jié)合位點(diǎn)。
Fab片段也含有輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(CH1)。Fab’片段與Fab片段的不同之處是重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端加入了幾個(gè)殘基，包括抗體絞鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。本文中Fab’-SH指Fab’恒定區(qū)的半胱氨酸殘基帶有至少一個(gè)游離的巰基。最初產(chǎn)生的F(ab’)2抗體片段是一對Fab’片段，二片段之間含有絞鏈區(qū)半胱氨酸?？贵w片段的其它化學(xué)偶聯(lián)方式也是已知的。
根據(jù)恒定區(qū)的氨基酸序列可將脊椎動(dòng)物的抗體“輕鏈”分為兩種有明顯區(qū)別的類型，稱為κ和λ。
“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段含有抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈中。Fv多肽優(yōu)選在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間還含有多肽接頭，使scFv形成用于結(jié)合抗原所需的結(jié)構(gòu)。scFv的綜述參見Plückthun，《單克隆抗體的藥理學(xué)》(ThePharmacology of monoclonal Antibodies)，第113卷，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，New York，第269-315頁(1994)。
術(shù)語“雙抗體”指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，該片段在同一多肽鏈中含有連接的輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)(VH-VL)。用一個(gè)短接頭使同一鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對，而迫使這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對，從而產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。在例如EP 404,097、WO 93/11161和Hollinger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448中更全面地描述了雙抗體。
非人(如嚙齒類)抗體的“人源化”形式是含有衍生自非人免疫球蛋白最小序列的嵌合抗體。人源化抗體大部分是人免疫球蛋白(受體抗體)，但受體抗體超變區(qū)的殘基被具有所需特異性、親和力和容量的非人動(dòng)物(供體抗體)如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類的超變區(qū)的殘基所取代。在一些情況下，用相應(yīng)非人殘基取代人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)(FR)殘基。而且，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步精制抗體的性能。通常，人源化抗體基本上含有所有可變區(qū)的至少一個(gè)，一般是兩個(gè)，可變區(qū)中所有或基本上所有超變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白，所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體也任選地包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，一般是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。詳細(xì)內(nèi)容參見Jones等(1986)Nature，321522-525；Riechmann等(1988)Nature 332323-329；和Presta，(1992)Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596。
人源化抗ErbB2抗體包括huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(賀賽汀_)，如美國專利號(hào)5821337的表3所述，特別將其納入本文作為參考；人源化520C9(WO 93/21319)和人源化2C4抗體如下所述。
“分離”抗體是從抗體天然環(huán)境的成分中鑒定和分離和/或回收的抗體。抗體天然環(huán)境的污染成分是可能干擾該抗體的診斷或治療應(yīng)用的物質(zhì)，可包括酶、激素和其它蛋白性或非蛋白性溶質(zhì)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，純化抗體至(1)使抗體占重量的95％以上，如Lowry法測定，最優(yōu)選占重量99％以上，(2)達(dá)到用離心杯序列分析儀足以獲得N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個(gè)殘基的程度，或(3)使得用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選用銀染色在還原或非還原條件下SDS-PAGE檢測為均一性。分離的抗體包括重組細(xì)胞中的原位抗體，因?yàn)樵摽贵w的天然環(huán)境的至少一種成分不存在。然而，通常用至少一個(gè)純化步驟來制備分離的抗體。
“結(jié)合”某感興趣抗原的抗體是能夠以足夠親和力結(jié)合該抗原，從而該抗體可用于靶向表達(dá)該抗原的細(xì)胞。
“誘導(dǎo)凋亡”的抗體是能誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的抗體，如通過膜聯(lián)蛋白V結(jié)合、DNA片段化、細(xì)胞皺縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹、細(xì)胞片段化和/或形成膜小泡(稱為凋亡小體)來測定。所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，如乳腺、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、結(jié)腸、甲狀腺、胰腺或膀胱腫瘤細(xì)胞?？捎酶鞣N方法評價(jià)伴隨凋亡的細(xì)胞變化。例如，可通過膜聯(lián)蛋白結(jié)合測定磷脂酰絲氨酸(PS)易位；通過DNA成梯評價(jià)DNA片段化；用亞二倍體細(xì)胞的增加來評價(jià)伴有DNA片段化的核/染色質(zhì)濃縮。
“疾病”是會(huì)從本發(fā)明治療中獲益的任何狀況，包括慢性和急性失調(diào)或疾病，包括使哺乳動(dòng)物易患所述失調(diào)的病理狀況。本發(fā)明治療的疾病的非限制性例子包括良性和惡性腫瘤；白血病和淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤，具體是乳腺癌、卵巢癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、前列腺癌或膀胱癌；神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、星形膠質(zhì)細(xì)胞、下丘腦和其它腺體、巨噬細(xì)胞、上皮、基質(zhì)和囊胚腔疾?。灰约把装Y、新生血管生成和免疫系統(tǒng)疾病。
術(shù)語“治療有效量”指在哺乳動(dòng)物中能有效治療疾病或失調(diào)的藥物用量。在癌癥的情況下，治療有效量的藥物可減少癌細(xì)胞數(shù)量；縮小腫瘤體積；抑制(即減慢到某種程度，優(yōu)選停止)癌細(xì)胞浸潤到周圍器官中；抑制(即減慢到某種程度，優(yōu)選停止)腫瘤轉(zhuǎn)移；抑制腫瘤生長至某種程度；和/或緩解癌癥伴隨的一種或多種癥狀至某種程度。藥物可防止癌細(xì)胞生長和/或殺傷現(xiàn)有癌細(xì)胞至某種程度，可以是細(xì)胞生長抑制性和/或細(xì)胞毒性藥物。對于癌癥治療而言，例如，可通過評價(jià)疾病發(fā)展的時(shí)間(TTP)和/或測定反應(yīng)速率(RR)來衡量藥效。
術(shù)語“大量”指多數(shù)，即群體中、集合中或樣品中的＞50％。
術(shù)語“胞內(nèi)代謝物”指細(xì)胞內(nèi)對抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)代謝加工或反應(yīng)所產(chǎn)生的化合物。這種代謝加工或反應(yīng)可以是酶加工如蛋白水解切下ADC的肽接頭，或水解官能團(tuán)如腙、酯或酰胺。胞內(nèi)代謝物包括但不限于進(jìn)入、擴(kuò)散、攝取或轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞后受到胞內(nèi)切割的抗體和游離藥物。
術(shù)語“胞內(nèi)切割”指細(xì)胞內(nèi)對藥物-配體偶聯(lián)物、藥物-接頭-配體偶聯(lián)物、抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)等進(jìn)行的代謝加工或反應(yīng)，從而使藥物部分(D)和抗體(Ab)之間的接頭的共價(jià)連接斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離藥物與抗體解離。因此，藥物-配體偶聯(lián)物、藥物-接頭-配體偶聯(lián)物或ADC的切下部分是胞內(nèi)代謝物。
術(shù)語″生物利用度″指給予患者的給定量藥物的全身利用度(即血液/血漿水平)。生物利用度是一種絕對術(shù)語，表示對藥物從給藥劑型到達(dá)全身循環(huán)的時(shí)間(速率)和總量(程度)的衡量結(jié)果。
術(shù)語“細(xì)胞毒活性”指抗體-藥物偶聯(lián)物化合物或抗體-藥物偶聯(lián)物化合物的胞內(nèi)代謝物的細(xì)胞殺傷、細(xì)胞生長抑制或抗增殖效果。細(xì)胞毒活性可以表示為IC50值，即半數(shù)細(xì)胞存活時(shí)每單位體積的(藥物)濃度(摩爾或質(zhì)量)。
術(shù)語“癌癥”和“癌”指或描述哺乳動(dòng)物中一般特征為細(xì)胞失調(diào)性生長的生理狀態(tài)?！澳[瘤”包含一種或多種癌細(xì)胞。癌癥的例子包括但不限于上皮癌、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤。這些癌癥的更具體例子包括鱗狀細(xì)胞癌(如鱗狀上皮細(xì)胞癌)，肺癌包括小組胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌(“NSCLC”)、肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌，腹膜癌，肝細(xì)胞癌，胃癌包括胃腸癌，胰腺癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細(xì)胞癌，乳腺癌，結(jié)腸癌，直腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜或子宮癌，唾液腺癌，腎癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝癌，肛門癌，陰莖癌，以及頭頸癌。
“表達(dá)ErbB2的癌癥”的癌細(xì)胞表面產(chǎn)生足夠水平的ErbB2，因而抗ErbB2抗體可與其結(jié)合并對該癌癥有療效。
“特征是過度激活”ErbB2受體的癌癥，是癌細(xì)胞ErbB2受體激活程度大大超過同類組織的非癌細(xì)胞中該受體激活水平的癌癥。這種過度激活可能是因?yàn)樵诎┘?xì)胞ErbB2受體過表達(dá)和/或可用于激活ErbB2受體的ErbB2配體超過正常水平。這種過度激活可引起和/或由癌細(xì)胞的惡性狀態(tài)引起。在一些實(shí)施方式中，可對癌癥進(jìn)行診斷或預(yù)后試驗(yàn)，以確定是否發(fā)生了導(dǎo)致過度激活ErbB2受體的ErbB2受體的擴(kuò)增和/或過表達(dá)?；蛘?，或此外，可對癌癥進(jìn)行診斷或預(yù)后試驗(yàn)，以確定癌癥中是否發(fā)生了造成該受體過度激活的ErbB2配體的擴(kuò)增和/或過表達(dá)。在這種癌癥亞類中，該受體的過度激活可能是自分泌刺激途徑所引起的。
“過表達(dá)”ErbB2受體的癌癥是與同類組織的非癌細(xì)胞相比，癌細(xì)胞表面ErbB2受體水平明顯較高的癌癥。這種過表達(dá)可能是基因擴(kuò)增或轉(zhuǎn)錄或翻譯增加所引起?？赏ㄟ^在診斷或預(yù)后試驗(yàn)中評價(jià)細(xì)胞表面上提呈的ErbB2蛋白水平提高(如通過免疫組化試驗(yàn)；IHC)確定ErbB2受體的過表達(dá)?；蛘?，或此外，可通過如熒光原位雜交(FISH；參見WO 98/45479)、Southern印跡或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)如實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)來測定細(xì)胞內(nèi)編碼ErbB2的核酸水平?？赏ㄟ^例如，腫瘤活檢或各種診斷試驗(yàn)如上述IHC、FISH、Southern印跡、PCR或體內(nèi)試驗(yàn)來評價(jià)患者的配體(或編碼它的核酸)水平，從而在診斷上確定ErbB2配體的過表達(dá)。也可檢測生物液體如血清中抗原(如ErbB2胞外結(jié)構(gòu)域)來研究ErbB2受體的過表達(dá)(參見例如美國專利號(hào)4933294；WO 91/05264；美國專利號(hào)5401638；和Sias等，(1990)J.Immunol.Methods，13273-80)。除了上述試驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用各種其它體內(nèi)試驗(yàn)。例如，可使患者體內(nèi)的細(xì)胞接觸用可檢測標(biāo)記如放射性同位素任選地標(biāo)記的抗體，然后可通過，例如外部放射活性掃描或分析從先前曾接觸該抗體患者的活檢組織，來評價(jià)該抗體與患者細(xì)胞的結(jié)合。
通過每個(gè)細(xì)胞表達(dá)的HER2分子拷貝數(shù)對應(yīng)的免疫組化評分評價(jià)過表達(dá)HER2的腫瘤，也可用生化方法測定0＝0-10,000拷貝/細(xì)胞，1+＝至少約200,000拷貝/細(xì)胞，2+＝至少約500,000拷貝/細(xì)胞，3+＝約1-2×106拷貝/細(xì)胞。HER2以3+水平過表達(dá)導(dǎo)致酪氨酸激酶的配體非依賴性活化(Hudziak等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，847159-7163)，這發(fā)生在約30％乳腺癌中，在這些患者中，無復(fù)發(fā)存活和總存活率減少(Slamon等，(1989)Science，244707-712；Slamon等，(1987)Science，235177-182)。
相反，“特征不是ErbB2受體過表達(dá)”的癌癥是與同類組織的非癌細(xì)胞相比，在診斷試驗(yàn)中不表達(dá)高于正常水平的ErbB2受體的癌癥。
本文所用術(shù)語“細(xì)胞毒劑”指能抑制或阻止細(xì)胞功能和/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語包括放射性同位素(如211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32p、60C和Lu的放射性同位素)，化療藥和毒素如小分子毒素或細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來源的具有酶活性的毒素，包括它們的合成類似物和衍生物。在一個(gè)方面，該術(shù)語不包括放射性同位素。
″化療藥″是用于治療癌癥的化合物?；熕幍睦影ㄍ榛瘎┤缛媾珊虲ytoxan_環(huán)磷酰胺；烷基磺酸鹽如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；吖丙啶類如苯佐多巴(benzodopa)、卡波醌、美妥多巴(meturedopa)和烏瑞多巴(uredopa)；氮丙啶和甲基蜜胺(methylamelamine)包括六甲蜜胺、曲他胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺和三甲基蜜胺；TLK286(TELCYTATM)；多聚乙酰(尤其是bullatacin和bullatacinone)；δ-9-四氫大麻酚(屈大麻酚，MARINOL_)；β-拉伯酮；拉伯醇；秋水仙素；樺木酸；喜樹堿(包括合成類似物拓?fù)涮婵?HYCAMTIN_)、CPT-11(伊立替康、CAMPTOSAR_)、乙?；矘鋲A、東莨菪亭(scopolectin)和9-氨基喜樹堿)；苔蘚抑素；callystatin；CC-1065(包括它的阿多來新、卡折來新和比折來新合成類似物)；鬼臼毒素；足葉草酸；替尼泊苷；隱花素(cryptophycin)(尤其是隱花素1和隱花素8)；海兔毒肽；多卡霉素(duocarmycin)(包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1)；紅蔥甲素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海綿抑素(spongistatin)；氮芥類如苯丁酸氮芥、萘氮芥、膽磷酰胺、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、氮芥、氧氮芥鹽酸鹽、美法侖、新恩比興、苯乙酰膽固醇氮芥、潑尼莫司汀、曲磷胺、烏拉莫司??；亞硝基脲如卡莫司汀、吡葡亞硝脲、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷諾司?。浑p膦酸鹽類，如氯屈膦酸鹽；抗生素如烯二炔類抗生素(如卡奇霉素，尤其是卡奇霉素γ1I和卡奇霉素ωI1(參見例如Agnew、Chem Intl.Ed.Engl.、33183-186(1994))和蒽環(huán)類如紅霉素乙琥珀酸酯(annamycin)、AD32、alcarubicin、柔紅霉素、右雷佐生、DX-52-1、表柔比星、GPX-100、伊達(dá)比星、KRN5500、美諾立爾，蒽環(huán)類抗生素，包括蒽環(huán)類抗生素A、望菌霉素(esperamicin)、新抑癌蛋白生色團(tuán)和相關(guān)色素蛋白烯二炔類抗生素生色團(tuán)、阿柔比星、放線菌素、安曲霉素(authramycin)、偶氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素C、卡拉比星(carabicin)、洋紅霉素、嗜癌霉素、色霉素、放線菌素D、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN_多柔比星(包括嗎啉代-多柔比星、氰基嗎啉代-多柔比星、2-吡咯啉并-多柔比星、脂質(zhì)體多柔比星和脫氧多柔比星)、依索比星、馬賽羅霉素、絲裂霉素如絲裂霉素C、麥考酚酸、諾拉霉素、橄欖霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌羅霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑霉素、鏈佐星、塊菌素、烏苯美司、凈司他丁和佐柔比星；葉酸類似物如denopterin、蝶羅呤和三甲曲沙；嘌呤類似物如氟達(dá)拉濱、6-硫基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鳥嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮尿嘧啶、卡莫氟、阿糖胞苷、雙脫氧尿嘧啶、去氧氟尿嘧啶、依諾他濱和氟尿嘧啶；雄激素如卡普睪酮、屈他雄酮丙酸酯、環(huán)硫雄醇、美雄烷和睪內(nèi)酪；抗腎上腺藥如氨魯米特、米托坦和曲洛司坦；葉酸補(bǔ)充劑如亞葉酸；醋葡醛內(nèi)酯；抗葉酸抗瘤藥如ALIMTA_、LY231514培美曲塞、二氫葉酸還原酶抑制劑如甲氨蝶呤、抗代謝藥如5-氟尿嘧啶(5-FU)及其前藥如UFT、S-1和卡培他濱，以及胸苷酸合酶抑制劑和甘氨酰胺核苷酸甲?；D(zhuǎn)移酶抑制劑如雷替曲塞(TOMUDEXRM，TDX)；二氫嘧啶脫氫酶抑制劑如恩尿嘧啶(eniluracil)；醛磷酰胺糖苷；氨基-γ-酮戊酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依達(dá)曲沙；磷胺氮芥(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；elfornithine；依利醋銨；大環(huán)內(nèi)酯類；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；蘑菇多糖；氯尼達(dá)明(lonidainine)；類美坦西醇如美登素和ansamitocins；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達(dá)醇；尼曲吖啶(nitraerine)；噴司他??；異丙嗪(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK_多糖復(fù)合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生；根霉素；西佐喃；鍺螺胺；細(xì)交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；單端孢霉烯類(尤其是T-2毒素，疣孢菌素A(verracurin A)，桿孢菌素A和蛇形菌素)；烏拉坦；長春地辛(ELDISINE_，F(xiàn)ILDESIN_)；達(dá)卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；卡胞嘧啶(gacytosine)；阿拉伯糖苷(″Ara-C″)；環(huán)磷酰胺；塞替派；類紫杉醇類和紫杉烷類，如泰素_紫杉醇(Bristol-Myers SquibbOncology，Princeton，N.J.)，ABRAXANETM無克列莫佛、清蛋白改造的紫杉醇納米顆粒制劑(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和TAXOTERE_doxetaxel(Rh_ne-Poulenc Rorer，Antony，F(xiàn)rance)；瘤可寧；吉西他濱(GEMZAR_)；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤；鉑；鉑類似物或基于鉑的類似物如順鉑、奧沙利鉑和卡鉑；長春堿(VELBAN_)；依托泊苷(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；米托蒽醌；長春新堿(ONCOVIN_)；長春花生物堿；長春瑞濱(NAVELBINE_)；二羥基蒽醌；依達(dá)曲沙；道諾霉素；氨蝶呤；適羅達(dá)；伊班膦酸鹽；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；視黃醇類如視黃酸；上述物質(zhì)的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物；以及上述兩種或多種物質(zhì)的組合；如CHOP，是環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松龍聯(lián)合療法的縮寫；FOLFOX，是奧沙利鉑(ELOXATINTM)以及5-FU和亞葉酸聯(lián)合治療方案的縮寫。
本定義中也包括調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤作用的抗激素藥，如抗雌激素藥和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERMs)，包括例如，他莫昔芬(包括NOLVADEX_他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、基奧昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮和FARESTON_托瑞米芬；抑制芳香酶的芳香酶抑制劑，它在腎上腺中調(diào)節(jié)雌激素的生產(chǎn)，例如4(5)-咪唑、氨魯米特、MEGASE_甲地孕酮乙酸鹽、AROMASIN_依西美坦、福美坦(formestanie)、法倔唑、RIVISOR_伏氯唑、FEMARA_來曲唑和ARIMIDEX_阿那曲唑；以及抗雄激素藥如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及曲沙他濱(1，3-二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，尤其是抑制參與異常細(xì)胞增殖信號(hào)傳導(dǎo)途徑的基因如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生長因子受體(EGF-R)基因表達(dá)的反義寡核苷酸；疫苗如基因治療疫苗，例如ALLOVECTIN_疫苗、LEUVECTIN_疫苗和VAXID_疫苗；PROLEUKIN_rIL-2；LURTOTECAN_拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制劑；ABARELIX_rmRH；和上述物質(zhì)的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。
本文所用術(shù)語“靶向EGFR的藥物”指與EGFR結(jié)合并任選地抑制EGFR活化的治療劑。這種藥物的例子包括與EGFR結(jié)合的抗體和小分子。與EGFR結(jié)合的抗體的例子包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506)、MAb 455(ATCC CRL HB8507)、MAb225(ATCC CRL 8508)、MAb 528(ATCC CRL 8509)(參見美國專利號(hào)4943533，Mendelsohn等)及其變體，如嵌合性225(C225或西妥昔單抗；ERBITUX_)和改形的人225(H225)(參見WO 96/40210，Imclone Systems Inc.)；結(jié)合II型EGFR突變體的抗體(美國專利號(hào)5,212,290)；結(jié)合EGFR的人源化和嵌合抗體，如美國專利號(hào)5891996所述；和結(jié)合EGFR的人抗體，如ABX-EGF(參見WO 98/50433，Abgenix)?？蓪⒖笶GFR抗體與細(xì)胞毒劑偶聯(lián)，從而產(chǎn)生免疫偶聯(lián)物(參見例如EP 659,439A2，MerckPatent GmbH)。與EGFR結(jié)合的小分子例子包括ZD 1839或Gefitinib(IRESSATM；Astra Zeneca)，埃羅替尼鹽酸鹽(CP-358774，TARCEVATM；Genentech/OSI)和AG1478，AG1571(SU 5271；Sugen)。
“酪氨酸激酶抑制劑”是以某種程度抑制酪氨酸激酶如ErbB受體的酪氨酸激酶活性的分子。這種抑制劑的例子包括前一自然段所述靶向EGFR的藥物以及喹唑啉，如PD153035，4-(3-氯苯胺基)喹唑啉，吡啶并嘧啶，嘧啶并嘧啶，吡咯并嘧啶如CGP59326、CGP 60261和CGP 62706，以及吡唑并嘧啶，4-(苯基氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，姜黃素(二阿魏酸基甲烷，4，5-雙(4-氟苯胺基)酞亞胺)，含有硝基噻吩部分的tyrphostine；PD-0183805(Warner-Lambert)；反義分子(如與編碼ErbB的核酸結(jié)合的分子)；喹喔啉(美國專利號(hào)5,804,396)；tryphostin(美國專利號(hào)5804396)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；泛ErbB抑制劑如CI-1033(Pfizer)；Affinitac(ISIS 3521；Isis/Lilly)；伊馬替尼甲磺酸鹽(Gleevac；Novartis)；PKI166(Novartis)；GW2016(Glaxo SmithKline)；CI-1033(Pfizer)；EKB-569(Wyeth)；Semaxanib(Sugen)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；INC-1C11(Imclone)；或如以下公開專利之一所述美國專利號(hào)5804396；WO99/09016(American Cyanamid)；WO 98/43960(American Cyanamid)；WO97/38983(Warner Lambert)；WO 99/06378(Warner Lambert)；WO 99/06396(WarnerLambert)；WO 96/30347(Pfizer，Inc)；WO 96/33978(Zeneca)；WO 96/3397(Zeneca)；和WO 96/33980(Zeneca)。
“抗新生血管生成劑”指以某種程度阻斷或干擾血管發(fā)育的化合物。例如，抗新生血管生成因子可以是與參與促進(jìn)新生血管生成的生長因子或生長因子受體相結(jié)合的小分子或抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗新生血管生成因子是與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)相結(jié)合的抗體。
通用術(shù)語“細(xì)胞因子”是由一群細(xì)胞分泌，作為胞間媒介物作用于另一種細(xì)胞的蛋白的總稱。這種細(xì)胞因子的例子是淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)多肽激素。細(xì)胞因子中包括生長激素如人生長激素、N-甲硫氨酰基人生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和黃體生成素(LH)；肝生長因子；成纖維細(xì)胞生長因子；促乳素；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子-α和-β；米勒管抑制物；小鼠促性腺素相關(guān)肽；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長因子；整聯(lián)蛋白；血栓形成素(TPO)；神經(jīng)生長因子如NGF-β；血小板生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因子-I和-II；紅細(xì)胞生成素(EPO)；成骨誘導(dǎo)因子；干擾素如干擾素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF)；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF)；和粒細(xì)胞-CSF(G-CSF)；白介素(ILs)如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；腫瘤壞死因子如TNF-α或TNF-β；以及其它多肽因子包括LIF和kit配體(KL)。本文所用術(shù)語細(xì)胞因子包括天然來源或重組細(xì)胞培養(yǎng)物來源的蛋白，以及天然序列細(xì)胞因子的生物活性等價(jià)物。
本申請中所用術(shù)語“前藥”指形式與母體藥物相比對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性較小，并能夠經(jīng)酶作用或水解作用而活化或轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚愿叩哪阁w形式的藥學(xué)活性物質(zhì)的前體或衍生物。參見例如Wilman，“癌癥化療中的前藥”(Prodrugs in Cancer化療)Biochemical Society Transactions，14，第375-382頁，第615屆貝爾法斯特會(huì)議(1986)和Stella等，“前藥靶向藥物遞送的化學(xué)方法”(ProdrugA Chemical Approach toTargeted Drug Delivery)Directed Drug Delivery，Borchardt等(編)，第247-267頁，Humana Press(1985)。本發(fā)明的前藥包括但不限于含有磷酸的前藥、含有硫代磷酸的前藥、含有硫酸的前藥、含有肽的前藥、D-氨基酸修飾的前藥、糖基化前藥、含有β-內(nèi)酰胺的前藥、含有任選取代的苯氧基乙酰胺的前藥或含有任選取代的苯基乙酰胺的前藥、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前藥，它們可轉(zhuǎn)化為活性更高的細(xì)胞毒性游離藥物?？裳苌鸀榍八幮问接糜诒景l(fā)明的細(xì)胞毒藥物的例子包括但不限于上述化療藥。
“脂質(zhì)體”是由各種類型的脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑組成的小囊泡，可用于將藥物(如包括抗CD30、抗CD40、抗CD70或抗Lewis Y抗體以及任選的化療藥)遞送給哺乳動(dòng)物。脂質(zhì)體的成分通常排列成雙層形式，類似于生物膜的脂質(zhì)排列。
術(shù)語“藥品說明書”用來指按照慣例包括在治療產(chǎn)品的商品包裝中的說明書，它含有關(guān)于適應(yīng)癥、用法、劑量、給藥方式、禁忌癥和/或關(guān)于使用該治療產(chǎn)品的警告的信息。
“分離的”核酸分子是經(jīng)鑒定已與通常伴隨抗體核酸天然來源中至少一種污染性核酸分子相分離的核酸分子。分離的核酸分子不是其天然狀態(tài)下所發(fā)現(xiàn)的形式。因此，分離的核酸分子與存在于天然細(xì)胞中的核酸分子有區(qū)別。然而，分離的核酸分子包括通常表達(dá)該抗體的細(xì)胞中所含的核酸分子，例如，在此種核酸分子在染色體中的位置不同于天然細(xì)胞。
表述“調(diào)控序列”指在特定宿主生物體中表達(dá)操作性連接的編碼序列必需的DNA序列。例如，適用于原核生物的調(diào)控序列包括啟動(dòng)子、任選的操縱子序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用的啟動(dòng)子、聚腺苷酸化信號(hào)和增強(qiáng)子。
當(dāng)一核酸的安置與另一核酸序列在功能上相關(guān)時(shí)，稱該二核酸“操作性連接”。例如，如果要將某多肽的前導(dǎo)序列或分泌性前導(dǎo)序列表達(dá)為參與該多肽分泌的前蛋白，可將該前導(dǎo)序列或分泌性前導(dǎo)序列的DNA操作性連接于編碼該多肽的DNA；如果要用啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響某編碼序列的轉(zhuǎn)錄，可將該啟動(dòng)子或增強(qiáng)子操作性連接于該序列；或如果要使核糖體結(jié)合位點(diǎn)安置在能促進(jìn)翻譯的位置，可將該核糖體結(jié)合位點(diǎn)操作性連接于編碼序列。通常，“操作性連接”指被連接的DNA序列是毗連的，就分泌性前導(dǎo)序列而言，則是在閱讀框中毗連的。然而，增強(qiáng)子不必毗連?？赏ㄟ^在方便的限制性位點(diǎn)連接來完成連接。如果不存在這種位點(diǎn)，可根據(jù)常規(guī)實(shí)踐采用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。
本文所用表述“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，所有這些稱謂都包括后代。因此，術(shù)語“轉(zhuǎn)化子”和“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”包括原代細(xì)胞和從其獲得的培養(yǎng)物，無論傳代次數(shù)。也應(yīng)理解，由于有意或無意的突變，所有后代的DNA內(nèi)容不可能精確相同。包括經(jīng)篩選與最初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞具有相同功能或生物活性的突變后代。當(dāng)使用不同稱謂時(shí)，可從其內(nèi)容中明顯看出。
本文中“自身免疫病”是個(gè)體自身組織所引起并針對自身組織的疾病或失調(diào)，或其并發(fā)癥或癥狀表現(xiàn)，或自身組織發(fā)生的病癥。自身免疫病或失調(diào)的例子包括但不限于關(guān)節(jié)炎(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎)，牛皮癬，皮炎包括特發(fā)性皮炎；慢性特發(fā)性蕁麻疹包括慢性自身免疫性蕁麻疹，多肌炎/皮肌炎，毒性表皮壞死溶解，系統(tǒng)性硬皮病和硬化癥，炎性腸病(IBD)相關(guān)反應(yīng)(克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎)和具有壞疽性膿皮病、結(jié)節(jié)性紅斑、原發(fā)性硬化性膽管炎和/或鞏膜外層炎并發(fā)癥的IBD)，呼吸窘迫綜合征包括成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)，腦膜炎，IgE介導(dǎo)的疾病如變態(tài)反應(yīng)和變應(yīng)性鼻炎，腦炎如Rasmussen腦炎，葡萄膜炎，結(jié)腸炎如顯微結(jié)腸炎和膠原性結(jié)腸炎，腎小球腎炎(GN)如膜性GN、特發(fā)性膜性GN、膜性增生性GN(MPGN)包括I型和II型和急進(jìn)性GN，變應(yīng)性病，濕疹，哮喘，涉及T細(xì)胞浸潤和慢性炎癥反應(yīng)的疾病，動(dòng)脈粥樣硬化，自身免疫性心肌炎，白細(xì)胞粘著缺陷，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)如皮膚SLE，狼瘡(包括腎炎、腦炎、兒科、非腎性、盤狀狼瘡、脫發(fā)癥)，青少年發(fā)作性糖尿病，多發(fā)性硬化(MS)如脊髓-眼MS，變應(yīng)性腦脊髓炎，與細(xì)胞因子和T-淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)性超敏感相關(guān)的免疫反應(yīng)，結(jié)核病，結(jié)節(jié)病，肉芽腫病包括Wegener肉芽腫病，粒細(xì)胞缺乏癥，血管炎(包括大血管血管炎(包括風(fēng)濕性多肌痛和巨細(xì)胞(Takayasu)動(dòng)脈炎)、中等血管血管炎(包括Kawasaki病和結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎)、CNS血管炎和ANCA-相關(guān)血管炎如Churg-Strauss血管炎或綜合征(CSS))，再生障礙性貧血，Coombs陽性貧血，Diamond Blackfan貧血，免疫性溶血貧血包括自身免疫性溶血貧血(AIHA)，惡性貧血，純紅細(xì)胞再生障礙(PRCA)，凝血VIII因子缺陷，血友病A，自身免疫性嗜中性白血球減少癥，全血細(xì)胞減少癥，白細(xì)胞減少癥，涉及白細(xì)胞滲出的疾病，CNS炎性疾病，多發(fā)性器官損傷綜合征，重癥肌無力，抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病，抗腎小球基底膜病，抗磷脂抗體綜合征，變應(yīng)性神經(jīng)炎，Bechet病，Castleman綜合征，Goodpasture綜合征，朗伯-伊頓肌無力綜合征，雷諾綜合征，Siorgen綜合征，斯蒂文斯-約翰遜綜合癥，實(shí)體器官移植排斥(包括高效價(jià)反應(yīng)性抗體的預(yù)處理，組織中IgA沉積，和腎移植、肝移植、腸移植、心臟移植等產(chǎn)生的排斥)，移植物抗宿主病(GVHD)，類天皰瘡大皰，天皰瘡(包括尋常性、葉狀和皰瘡粘膜類天皰瘡)，自身免疫性多發(fā)性內(nèi)分泌病，Reiter病，全身肌強(qiáng)直綜合征，免疫復(fù)合物腎炎，IgM多發(fā)性神經(jīng)病或IgM介導(dǎo)的神經(jīng)病，特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)，血栓形成性血小板減少性紫癜(TTP)，血小板減少(如心肌梗塞患者發(fā)生的血小板減少)包括自身免疫性血小板減少，睪丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎，原發(fā)性甲狀腺功能減退癥；自身免疫性內(nèi)分泌病包括自身免疫性甲狀腺炎，慢性甲狀腺炎(Hashimoto甲狀腺炎)，亞急性甲狀腺炎，特發(fā)性甲狀腺功能減退癥，Addison病，Grave病，自身免疫性多發(fā)性內(nèi)分泌腺綜合征(或多發(fā)性腺性內(nèi)分泌病綜合征)，I型糖尿病也稱為胰島素依賴型糖尿病(IDDM)包括兒科IDDM和Sheehan綜合征；自身免疫性肝炎，淋巴樣間隙性肺炎(HIV)，閉塞性細(xì)支氣管炎(非移植性)與NSIP，Guillain-Barré綜合征，伯杰病(IgA腎病)，原發(fā)性膽汁性肝硬化，脂肪便癥(谷朊腸病)，具有皰疹樣皮炎并發(fā)癥的頑固性口炎性腹瀉，冷球蛋白血癥，肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS；盧格里克病)，冠狀動(dòng)脈病，自身免疫性內(nèi)耳病(AIED)，自身免疫性聽力喪失，視覺眼肌陣攣綜合征(OMS)，多發(fā)性軟骨炎如頑固性多發(fā)性軟骨炎，肺泡蛋白沉著癥，淀粉樣變，巨細(xì)胞肝炎，鞏膜炎，意義不確定/未知的單克隆丙種球蛋白病(MGUS)，外周神經(jīng)病，腫瘤伴隨綜合征，通道疾病(channelopathy)如癲癇癥、偏頭痛、心律失常、肌失調(diào)癥、耳聾、失明、周期性癱瘓和CNS通道??；孤獨(dú)癥、炎性肌病和局部區(qū)段性腎小球血管硬化癥(FSGS)。
″烷基″是含有伯、仲、叔或環(huán)碳原子的C1-C18烴基。例子是甲基(Me，-CH3)、乙基(Et，-CH2CH3)、1-丙基(正Pr，正丙基，-CH2CH2CH3)、2-丙基(異Pr，異丙基，-CH(CH3)2)、1-丁基(正Bu，正丁基，-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(異Bu，異丁基，-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(仲Bu，仲丁基，-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(叔Bu，叔丁基，-C(CH3)3)、1-戊基(正戊基，-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2，3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3，3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3。
“鏈烯基”是至少有一個(gè)位置不飽和即碳-碳sp2雙鍵的含有伯、仲、叔或環(huán)碳原子的C2-C18烴基。例子包括但不限于乙烯或乙烯基(-CH＝CH2)、烯丙基(-CH2CH＝CH2)、環(huán)戊烯基(-C5H7)和5-己烯基(-CH2CH2CH2CH2CH＝CH2)。
“炔基”是至少有一個(gè)位置不飽和即碳-碳sp三鍵的含有伯、仲、叔或環(huán)碳原子的C2-C18烴基。例子包括但不限于乙炔基(-C≡CH)和炔丙基(-CH2C≡CH)。
“亞烷基”指1-18個(gè)碳原子的飽和支鏈或直鏈或環(huán)狀烴基，因去除母體烷烴的同一或兩個(gè)不同碳原子上的兩個(gè)氫原子而產(chǎn)生了兩個(gè)單價(jià)基中心。亞烷基一般包括但不限于亞甲基(-CH2-)、1，2-乙基(-CH2CH2-)、1，3-丙基(-CH2CH2CH2-)、1，4-丁基(-CH2CH2CH2CH2-)等。
“亞鏈烯基”指2-18個(gè)碳原子的不飽和支鏈或直鏈或環(huán)狀烴基，因去除母體烯烴的同一或兩個(gè)不同碳原子上的兩個(gè)氫原子而產(chǎn)生了兩個(gè)單價(jià)基中心。亞鏈烯基一般包括但不限于1，2-乙烯基(-CH＝CH-)。
“亞炔基”指2-18個(gè)碳原子的不飽和支鏈或直鏈或環(huán)狀烴基，因去除母體炔烴的同一或兩個(gè)不同碳原子上的兩個(gè)氫原子而產(chǎn)生了兩個(gè)單價(jià)基中心。亞炔基一般包括但不限于乙炔基(-C≡C-)、炔丙基(-CH2C≡C-)和4-戊炔基(-CH2CH2CH2C≡CH-)。
″芳基″指去除母體芳環(huán)系統(tǒng)的一個(gè)碳原子上一個(gè)氫原子所產(chǎn)生的6-20個(gè)碳原子的單價(jià)芳族烴基。在示范結(jié)構(gòu)中，一些芳基用“Ar”代表。芳基一般包括但不限于由苯衍生的基團(tuán)、取代的苯、萘、蒽、聯(lián)苯基等。
″芳烷基″指其中連接于碳原子的一個(gè)氫原子，一般是末端或sp3碳原子被芳基取代的脂肪族烷基。芳烷基一般包括但不限于芐基、2-苯基乙烷-1-基、2-苯基乙烯-1-基、萘基甲基、2-萘基乙烷-1-基、2-萘基乙烯-1-基、萘并芐基、2-萘并苯基乙烷-1-基等。芳烷基含有6-20個(gè)碳原子，例如，芳烷基的烷基部分包括鏈烷基、鏈烯基或炔基有1-6個(gè)碳原子，芳基部分有5-14個(gè)碳原子。
″雜芳烷基″指其中連接于碳原子的一個(gè)氫原子，一般是末端或sp3碳原子被雜芳基取代的脂肪族烷基。雜芳烷基一般包括但不限于2-苯并咪唑基甲基，2-呋喃基乙基等。雜芳烷基含有6-20個(gè)碳原子，例如，芳烷基的烷基部分包括鏈烷基、鏈烯基或炔基有1-6個(gè)碳原子，雜芳基部分有5-14個(gè)碳原子和選自N、O、P和S的1-3個(gè)雜原子。雜芳烷基的雜芳基部分可以是3-7元單環(huán)(2-6個(gè)碳原子)或含有7-10個(gè)環(huán)原子的雙環(huán)(4-9個(gè)碳原子和1-3個(gè)選自N、O、P和S的雜原子)，例如雙環(huán)[4，5]、[5，5]、[5，6]或[6，6]系統(tǒng)。
″取代烷基”、“取代芳基″和″取代芳烷基″分別指烷基、芳基和芳烷基中一個(gè)或多個(gè)氫原子各自獨(dú)立地被取代基所取代。取代基一般包括但不限于-X、-R、-O-、-OR、-SR、-S-、-NR2、-NR3、＝NR、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO2、＝N2、-N3、NC(＝O)R、-C(＝O)R、-C(＝O)NR2、-SO3-、-SO3H、-S(＝O)2R、-OS(＝O)2OR、-S(＝O)2NR、-S(＝O)R、-OP(＝O)(OR)2、-P(＝O)(OR)2、-PO-3、-PO3H2、-C(＝O)R、-C(＝O)X、-C(＝S)R、-CO2R、-CO2-、-C(＝S)OR、-C(＝O)SR、-C(＝S)SR、-C(＝O)NR2、-C(＝S)NR2、-C(＝NR)NR2，其中X各自獨(dú)立是鹵原子F、Cl、Br或I；R各自獨(dú)立地是-H、C2-C18烷基、C6-C20芳基、C3-C14雜環(huán)、保護(hù)基團(tuán)或前藥部分。上述亞烷基、亞鏈烯基和亞炔基也可被類似地取代。
“雜芳基”和″雜環(huán)″指其中一個(gè)或多個(gè)環(huán)原子是雜原子如氮、氧和硫的環(huán)系統(tǒng)。雜環(huán)基含有1-20個(gè)碳原子和1-3個(gè)選自N、O、P和S的雜原子。雜環(huán)可以是含有3-7個(gè)環(huán)原子(2-6個(gè)碳原子和1-3個(gè)選自N、O、P和S的雜原子)的單環(huán)或含有7-10個(gè)環(huán)原子(4-9個(gè)碳原子和1-3個(gè)選自N、O、P和S的雜原子)的雙環(huán)，例如雙環(huán)[4，5]、[5，5]、[5，6]或[6，6]系統(tǒng)。
在Paquette，Leo A.；《現(xiàn)代雜環(huán)化學(xué)原理》(Principles of Modern HeterocyclicChemistry)(W.A.Benjamin，New York，1968)，具體是第1、3、4、6、7和9章；《雜環(huán)化合物化學(xué)，一系列專著》(The Chemistry of Heterocyclic Compounds，A series ofMonographs)(John Wiley & Sons，New York，1950至今)，具體是第13、14、16、19和28卷；和J.Am.Chem.Soc.(1960)825566中描述了雜環(huán)。
雜環(huán)的示范性例子包括但不限于吡啶基、二氫吡啶基、四氫吡啶基(哌啶基)、噻唑基、四氫硫代苯基、硫氧化的四氫硫代苯基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、硫茚基(thianaphthalenyl)、吲哚基、假吲哚基(indolenyl)、喹啉基、異喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮基、吡咯啉基、四氫呋喃基、雙四氫呋喃基、四氫吡哺基、雙四氫吡喃基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、十氫喹啉基、八氫異喹啉基、吖辛因基、三嗪基、6H-1，2，5-噻二嗪基、2H，6H-1，5，2-二噻嗪基、噻吩基、噻蒽基、吡喃基、異苯并呋喃基、色烯基、呫噸基、苯并氧硫雜環(huán)己二烯基(phenoxathinyl)、2H-吡咯基、異噻唑基、異噁唑基、吡嗪基、噠嗪基、中氮茚基、異吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、4aH-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、呋咱基(furazanyl)、苯并噁嗪基、異色滿基、色滿基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、二氫吲哚基、異二氫吲哚基、奎寧環(huán)基、嗎啉基、噁唑烷基、苯并三唑基、苯并異噁唑基、羥吲哚基、苯并噁唑啉基和靛紅酰(isatinoyl)。
以實(shí)例而非限制方式，碳連接的雜環(huán)連接在吡啶的2、3、4、5或6位，噠嗪的3、4、5或6位，嘧啶2、4、5或6位，吡嗪的2、3、5或6位，呋喃、四氫呋喃、硫代呋喃、噻吩、吡咯或四氫吡咯的2、3、4或5位，噁唑、咪唑或噻唑的2、4或5位，異噁唑、吡唑或異噻唑的3、4或5位，吖丙啶的2或3位，氮雜環(huán)丁烷的2、3或4位，喹啉的2、3、4、5、6、7或8位或異喹啉的l、3、4、5、6、7或8位。更一般來說，碳連接的雜環(huán)包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基、6-吡啶基、3-噠嗪基、4-噠嗪基、5-噠嗪基、6-噠嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪基、6-吡嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基或 5-噻唑基。
以實(shí)例而非限制方式，氮連接的雜環(huán)連接在吖丙啶、氮雜環(huán)丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、二氫吲哚、1H-吲唑的1位，異吲哚或異二氫吲哚的2位，嗎啉的4位，和咔唑或β-咔啉的9位。更一般來說，氮連接的雜環(huán)包括1-吖丙啶基、1-氮雜環(huán)丁烷基(azetedyl)、1-吡咯基、1-咪唑基、-1-吡唑基和1-哌啶基。
“碳環(huán)”指含有3-7個(gè)碳原子的飽和或不飽和單環(huán)或含有7-12個(gè)碳原子的飽和或不飽和雙環(huán)。單環(huán)碳環(huán)含有3-6個(gè)環(huán)原子，更一般是5或6個(gè)環(huán)原子。雙環(huán)碳環(huán)含有7-12個(gè)環(huán)原子，如排列為雙環(huán)[4，5]、[5，5]、[5，6]或[6，6]系統(tǒng)；或含有9或10個(gè)環(huán)原子，排列為雙環(huán)[5，6]或[6，6]系統(tǒng)。單環(huán)碳環(huán)的例子包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、1-環(huán)戊-1-烯基、1-環(huán)戊-2-烯基、1-環(huán)戊-3-烯基、環(huán)己基、1-環(huán)己-1-烯基、1-環(huán)己-2-烯基、1-環(huán)己-3-烯基、環(huán)庚基和環(huán)辛基。
“接頭”、“接頭單元”或“連接”指含有將抗體與藥物部分共價(jià)連接的共價(jià)鍵或原子鏈的化學(xué)部分。在各種實(shí)施方式中，接頭表示為LU。接頭包括二價(jià)基團(tuán)如二價(jià)烷基、二價(jià)芳基，二價(jià)雜芳基，部分如-(CR2)nO(CR2)n-，烷氧基重復(fù)單元(如聚氧乙烯，PEG，聚亞甲基氧)和烷基氨基(如聚氨基乙烯，JeffamineTM)；和二酸酯和酰胺，包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯和己酰胺。
術(shù)語“手性”指不能與其鏡像對應(yīng)伙伴重疊的分子，而術(shù)語″非手性″指可與其鏡像對應(yīng)伙伴重疊的分子。
術(shù)語“立體異構(gòu)體”指化學(xué)組成相同，但原子或基團(tuán)的空間排列不同的化合物。
″非對映異構(gòu)體”指具有兩個(gè)或多個(gè)手性中心和分子不互為鏡像的立體異構(gòu)體。非對映異構(gòu)體具有不同物理特性，如熔點(diǎn)、沸點(diǎn)、廣譜特性和反應(yīng)性?？稍诟叻直媛史治龇椒ㄈ珉娪竞蜕V下分離非對映異構(gòu)體的混合物。
“對映異構(gòu)體”指一對立體異構(gòu)體化合物的鏡像可互相重疊。
本文所用立體化學(xué)定義和慣例通常遵循S.P.Parker編，《McGraw-Hill化學(xué)術(shù)語字典》(McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms)(1984)McGraw-Hill BookCompany，New York；以及Eliel，E.和Wilen，S.，《有機(jī)化合物的立體化學(xué)》(Stereochemistry of Organic compounds)(1994)John Wiley & Sons，Inc.，New York中所述。許多有機(jī)化合物以旋光活性形式存在，即它們具有沿平面-偏光的平面旋轉(zhuǎn)的能力。在描述旋光活性化合物中，用前綴D和L，或R和S表示該分子手性中心的絕對構(gòu)型。用前綴d和1或(+)和(-)作為表示該化合物沿平面-偏光旋轉(zhuǎn)的符號(hào)，(-)或1指該化合物是左旋的。前綴是(+)或d的化合物是右旋的。對于給定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，這些立體異構(gòu)體是相同的，除了它們互為鏡像外。也可將特定立體異構(gòu)體稱為對映異構(gòu)體，這些異構(gòu)體的混合物常常稱為對映異構(gòu)混合物。對映異構(gòu)體的5050混合物稱為外消旋混合物或外消旋物，可在化學(xué)反應(yīng)或加工中不發(fā)生立體選擇性或立體特異性。術(shù)語″外消旋混合物″和″外消旋物″指兩種對映異構(gòu)的等摩爾混合物，無旋光性。
“患者”的例子包括但不限于人、大鼠、豚鼠、猴、豬、山羊、奶牛、馬、犬、貓、鳥和家禽。在示范性實(shí)施方式中，患者是人。
“芳基”指碳環(huán)芳族基團(tuán)。芳基的例子包括但不限于苯基、萘基和蒽基。碳環(huán)芳族基團(tuán)或雜環(huán)芳族基團(tuán)可以是不取代的或被一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代的，這些基團(tuán)包括但不限于-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中各R’獨(dú)立地選自H、-C1-C8烷基和芳基。
本文所用術(shù)語“C1-C8烷基”指含有1-8個(gè)碳原子的直鏈或支鏈、飽和或不飽和的烴基。代表性“C1-C8烷基”包括但不限于-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基、-正己基、-正庚基、-正辛基、-正壬基和-正癸基；而支鏈C1-C8烷基包括但不限于-異丙基，-仲丁基，-異丁基，-叔丁基，-異戊基，2-甲基丁基，不飽和C1-C8烷基包括但不限于-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、-異丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2，3-二甲基-2-丁烯基、1-己基、2-己基、3-己基、-乙炔基、-丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基、-3-甲基-1丁炔基；甲基，乙基，丙基，異丙基，正丁基，異丁基，仲丁基，叔丁基，正戊基，異戊基，新戊基，正己基，異己基，2-甲基戊基，3-甲基戊基，2，2-二甲基丁基，2，3-二甲基丁基，2，2-二甲基戊基，2，3-二甲基戊基，3，3-二甲基戊基，2，3，4-三甲基戊基，3-甲基己基，2，2-二甲基己基，2，4-二甲基己基，2，5-二甲基己基，3，5-二甲基己基，2，4-二甲基戊基，2-甲基庚基，3-甲基庚基，正庚基，異庚基，正辛基，和異辛基。C1-C8烷基可以不取代或用一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代，這些基團(tuán)包括但不限于-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2-NHC(O)R’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中各R’獨(dú)立地選自H、-C1-C8烷基和芳基。
“C3-C8碳環(huán)”是3-、4-、5-、6-、7-或8-元飽和或不飽和非芳族碳環(huán)。代表性C3-C8碳環(huán)包括但不限于-環(huán)丙基、-環(huán)丁基、-環(huán)戊基、-環(huán)戊二烯基、-環(huán)己基、-環(huán)己烯基、-1，3-環(huán)己二烯基、-1，4-環(huán)己二烯基、-環(huán)庚基、-1，3-環(huán)庚二烯基、-1，3，5-環(huán)庚三烯基、-環(huán)辛基和-環(huán)辛二烯基。C3-C8碳環(huán)基團(tuán)可以不取代或用一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代，這些基團(tuán)包括但不限于-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中各R’獨(dú)立地選自H、-C1-C8烷基和芳基。
“C3-C8碳環(huán)基”指碳環(huán)基團(tuán)的氫原子之一被連接鍵取代的上述C3-C8碳環(huán)基團(tuán)。
“C1-C10亞烷基”是式-(CH2)1-10-的直鏈飽和烴基。C1-C10亞烷基的例子包括亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞丁基、亞戊基、亞己基、亞庚基、亞辛基、亞壬基和亞癸基。
“亞芳基”是含有兩個(gè)共價(jià)鍵，可以是鄰位、間位或?qū)ξ粯?gòu)型的芳基，結(jié)構(gòu)如下其中苯基可以不取代的或被多至4個(gè)基團(tuán)取代的，這些基團(tuán)包括但不限于-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中各R’獨(dú)立地選自H、-C1-C8烷基和芳基。
“C3-C8雜環(huán)”指其中1-4個(gè)環(huán)碳原子獨(dú)立地被選自O(shè)、S和N的雜原子取代的芳族或非芳族C3-C8碳環(huán)。C3-C8雜環(huán)的代表性例子包括但不限于苯并呋喃基、苯并噻吩、吲哚基、苯并吡唑基、香豆素基、異喹啉基、吡咯基、硫代苯基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、喹啉基、嘧啶基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、噠嗪基、異噻唑基、異噁唑基和四唑基。C3-C8雜環(huán)可以不取代或用至多7個(gè)基團(tuán)取代，這些基團(tuán)包括但不限于-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中各R’獨(dú)立地選自H、-C1-C8烷基和芳基。
“C3-C8雜環(huán)基”指雜環(huán)基團(tuán)的氫原子之一被連接鍵取代的上述C3-C8雜環(huán)基團(tuán)。C3-C8雜環(huán)基可以是不取代的或被多至6個(gè)基團(tuán)取代的，這些基團(tuán)包括但不限于-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中各R’獨(dú)立地選自H、-C1-C8烷基和芳基。
“示范性化合物”是藥物化合物或藥物-接頭化合物。
“示范性偶聯(lián)物”是含有藥物-配體偶聯(lián)物或藥物-接頭-配體偶聯(lián)物的可切割藥物單元的藥物-配體偶聯(lián)物。
在一些實(shí)施方式中，所述示范性化合物和示范性偶聯(lián)物是分離或純化形式。本文所用“分離”指與(a)天然來源如植物或動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，或(b)合成的有機(jī)化學(xué)反應(yīng)混合物的其它成分分離。本文所用“純化”指當(dāng)分離后，該分離物占示范性化合物或示范性偶聯(lián)物的至少95重量％，在另一方面占至少98重量％。
“羥基保護(hù)基團(tuán)”的例子包括但不限于甲氧基甲醚、2-甲氧基乙氧基甲醚、四氫吡喃醚、芐醚、對甲氧基芐醚、三甲基甲硅烷基醚、三乙基甲硅烷基醚、三異丙基甲硅烷基醚、叔丁基二甲基甲硅烷基醚、三苯基甲基甲硅烷基醚、乙酸酯、取代的乙酸酯、新戊酸酯(pivaloate)、苯甲酸酯、甲基磺酸酯和對甲苯磺酸酯。
“離去基團(tuán)”指可被另一官能團(tuán)取代的官能團(tuán)。這種離去基團(tuán)是本領(lǐng)域熟知的，例子包括但不限于鹵素(如氯、溴、碘)、甲基磺酰基(甲磺?；?、對甲苯磺?；?甲苯磺酰基)、三氟甲磺?；?triflate)和三氟甲基磺酸酯。
本文所用術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”指示范性化合物或示范性偶聯(lián)物的藥學(xué)上可接受的有機(jī)鹽或無機(jī)鹽。示范性化合物和示范性偶聯(lián)物含有至少一個(gè)氨基，因此可用此氨基形成酸加成鹽。示范性鹽包括但不限于硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、異煙酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、檸檬酸氫鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、丹寧酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、龍膽酸鹽(gentisinate)、富馬酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、糖酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、谷氨酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽和雙羥萘酸鹽(即1，1’-亞甲基-雙-(2-羥基-3-萘甲酸鹽))。藥學(xué)上可接受的鹽可包括另一分子如乙酸根離子、琥珀酸根離子或其它抗衡離子。抗衡離子可以是能穩(wěn)定母體化合物上電荷的任何有機(jī)或無機(jī)部分。而且，藥學(xué)上可接受的鹽的結(jié)構(gòu)中可具有一個(gè)以上的帶電荷原子。在多個(gè)帶電原子是藥學(xué)上可接受的鹽的一部分的情況下，可具有多個(gè)抗衡離子。因此，藥學(xué)上可接受的鹽可具有一個(gè)或多個(gè)帶電原子和/或一個(gè)或多個(gè)抗衡離子。
“藥學(xué)上可接受的溶劑合物”或“溶劑合物”指一種或多種溶劑分子和本發(fā)明化合物，如示范性化合物或示范性偶聯(lián)物的結(jié)合物。形成藥學(xué)上可接受的溶劑合物的溶劑例子包括但不限于水、異丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。
本文中使用了以下縮寫，它們具有以下所示的定義AE是耳抑素E，Boc是N-(叔丁氧基羰基)，Cit是瓜氨酸，dap是dolaproine，DCC是1，3-二環(huán)己基碳二亞胺，DCM是二氯甲烷，DEA是二乙胺，DEAD是偶氮二羧酸二乙酯，DEPC是磷酰基氰酸二乙酯，DIAD是偶氮二羧酸二異丙酯，DIEA是N，N-二異丙基乙胺，dil是dolaisoleuine，DMAP是4-二甲基氨基吡啶，DME是乙二醇二甲基醚(或1，2-二甲氧基乙烷)，DMF是N，N-二甲基甲酰胺，DMSO是二甲亞砜，doe是dolaphenine，dov是N，N二甲基纈氨酸，DTNB是5，5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)，DTPA是二亞乙基三胺五乙酸，DTT是二硫蘇糖醇，EDCI是1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，EEDQ是2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氫喹啉，ES-MS是電噴射質(zhì)譜，EtOAc是乙酸乙酯，F(xiàn)moc是N-(9-芴基甲氧基羰基)，gly是甘氨酸，HATU是O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基六氟磷酸脲，HOBt是1-羥基苯并三唑，HPLC是高壓液相色譜，ile是異亮氨酸，lys是賴氨酸，MeCN(CH3CN)是乙腈，MeOH是甲醇，Mtr是4-茴香基二苯基甲基(或4-甲氧基三苯甲基)，nor是(1S，2R)-(+)-去甲麻黃堿，PAB是對氨基芐基，PBS是磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.4)，PEG是聚乙二醇，Ph是苯基，Pnp是對硝基苯基，MC是6-馬來酰亞氨基己?；?馬來酰亞氨基己?；?，phe是L-苯丙氨酸，PyBrop是溴代三吡咯烷并六氟磷酸膦，SEC是分子大小排阻色譜，Su是琥珀酰亞胺，TBTU是O-苯并三唑-1-基-N，N,N,N-四甲基四氟硼酸脲，TFA是三氟乙酸，TLC是薄層色譜，UV是紫外線，Val是纈氨酸。
本文使用了以下接頭縮寫，它們具有以下所示的定義Val Cit是蛋白酶可切割接頭中的纈氨酸-瓜氨酸二肽位點(diǎn)；PAB是對氨基芐基氨甲酰基；(Me)vc是N-甲基-纈氨酸瓜氨酸，該接頭肽鍵經(jīng)修飾而防止其被組織蛋白酶B切斷；MC(PEG)6-OH是馬來酰亞氨基己?；?聚乙二醇；SPP是N-琥珀酰亞胺基4-(2-吡啶基硫)戊酸酯；SMCC是N-琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-1羧酸酯。
除非文中另有說明，術(shù)語“治療”指治療性和預(yù)防性手段，目的是預(yù)防或減慢(減弱)不良生理改變或失調(diào)，如癌癥發(fā)展或蔓延。對于本發(fā)明目的，有益或所需的臨床結(jié)果包括但不限于可檢測或不可檢測的癥狀緩解、疾病程度減輕，疾病狀態(tài)穩(wěn)定(即不惡化)，疾病進(jìn)展延遲或減慢，疾病狀態(tài)改善或減輕，以及緩解(部分或全部)。“治療”也可指與不接受治療的預(yù)計(jì)存活期相比，存活期延長。需要治療的對象包括已經(jīng)患有疾病或失調(diào)的對象以及傾向于患病或失調(diào)的對象或需要預(yù)防疾病或失調(diào)的對象。
在癌癥中，術(shù)語“治療”包括以下一種或全部防止腫瘤細(xì)胞、癌細(xì)胞或腫瘤生長；防止腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞復(fù)制，減輕總的腫瘤負(fù)荷或減少癌細(xì)胞數(shù)量，改善該疾病相關(guān)的一種或多種癥狀。
在自身免疫病中，術(shù)語“治療”包括以下一種或全部防止自身免疫病狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞(包括但不限于產(chǎn)生自身免疫性抗體的細(xì)胞)復(fù)制，減輕自身免疫性抗體負(fù)荷，改善自身免疫病的一種或多種癥狀。
在傳染病中，術(shù)語“治療”包括以下一種或全部防止引起傳染病的病原體的生長、增殖和復(fù)制，改善傳染病的一種或多種癥狀。
本文中使用以下細(xì)胞毒藥物縮寫，它們具有以下所示的定義MMAE是單甲基耳抑素E(MW718)；MMAF是N-甲基纈氨酸-纈氨酸-dolaisoleuine-dolaproine-苯丙氨酸(MW731.5)；MMAF-DMAEA是C-末端苯丙氨酸酰胺連接的MMAF與DMAEA(二甲基氨基乙胺)(MW801.5)；MMAF-TEG是MMAF與酯化到苯丙氨酸上的四乙二醇；MMAF-NtBu是N-叔丁基，作為酰胺連接于MMAF的C-末端；AEVB是耳抑素E戊酰芐基腙，通過AE的C末端的酸不穩(wěn)定性接頭(MW732)；AFP是帶有耳抑素F的C-末端苯丙氨酸的對亞苯基二胺的單酰胺(MW732)。
4.2本發(fā)明化合物4.2.1式(Ia)化合物在一個(gè)方面，本發(fā)明提供具有式Ia的藥物-接頭-配體偶聯(lián)物L(fēng)_Aa-Ww-Yy)pIa或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物其中，L-是配體單元；-Aa-Ww-Yy-是接頭單元(LU)，該接頭單元包括-A-是拉伸單元，a是0或1，-W-各自獨(dú)立地是氨基酸單元，w是0-12之間的一個(gè)整數(shù)，-Y-是間隔單元，和y是0、1或2；p的范圍是1～約20；和-D是具有式DE和DF的藥物單元其中，各位置獨(dú)立R2選自H和C1-C8烷基；R3選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R4選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R5選自H和甲基；
或者R4和R5連接形成碳環(huán)，并具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb獨(dú)立地選自H、C1-C8烷基和C3-C8碳環(huán)，n選自2、3、4、5和6；R6選自H和C1-C8烷基；R7選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R8各自獨(dú)立地選自H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)和O-(C1-C8烷基)；R9選自H和C1-C8烷基；R10選自芳基或C3-C8雜環(huán)；Z是O、S、NH或NR12，其中R12是C1-C8烷基；R11選自H、C1-C20烷基、芳基、C3-C8雜環(huán)、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；m是范圍在1-1000之間的一個(gè)整數(shù)；R13是C2-C8烷基；R14是H或C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R15獨(dú)立地是H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R16獨(dú)立地是H、C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；R18選自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8雜環(huán))和-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳環(huán))；和n是0-6之間的一個(gè)整數(shù)。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供具有式Ib的藥物化合物 Ib或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，其中R2選自氫和-C1-C8烷基；R3選自氫、-C1-C8烷基、-C3-C8碳環(huán)、芳基、-C1-C8烷基-芳基、-C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、-C3-C8雜環(huán)和-C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；
R4選自氫、-C1-C8烷基、-C3-C8碳環(huán)、-芳基、-C1-C8烷基-芳基、-C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、-C3-C8雜環(huán)和-C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))，其中R5選自-H和-甲基；或者R4和R5連接具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb獨(dú)立地選自H、-C1-C8烷基和-C3-C8碳環(huán)，n選自2、3、4、5和6，并以它們連接的碳原子形成環(huán)；R6選自H和-C1-C8烷基；R7選自H、-C1-C8烷基、-C3-C8碳環(huán)、芳基、-C1-C8烷基-芳基、-C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、-C3-C8雜環(huán)和-C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R8各自獨(dú)立地選自H、-OH、-C1-C8烷基、-C3-C8碳環(huán)和-O-(C1-C8烷基)；R9選自H和-C1-C8烷基；R10選自芳基或-C3-C8雜環(huán)；Z是-O-、-S-、-NH-或-NR12-，其中R12是C1-C8烷基；R11選自H、C1-C20烷基、芳基、-C3-C8雜環(huán)、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；m是范圍在1-1000之間的一個(gè)整數(shù)；R13是-C2-C8烷基；R14是H或-C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R15獨(dú)立地是H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R16獨(dú)立地是H、C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；和n是0-6之間的一個(gè)整數(shù)。
在又一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供具有式Ia’的藥物-接頭-配體偶聯(lián)物Ab_Aa-Ww-Yy-D)p式Ia’或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
其中Ab是抗體，A是拉伸單元，a是0或1，W各自獨(dú)立地是氨基酸單元，w是0-12之間的一個(gè)整數(shù)，
Y是間隔單元，和y是0、1或2，p的范圍是1～約20，和D是選自式DE和DF的藥物部分其中，各位置獨(dú)立R2選自H和C1-C8烷基；R3選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R4選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R5選自H和甲基；或者R4和R5連接形成碳環(huán)，并具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb獨(dú)立地選自H、C1-C8烷基和C3-C8碳環(huán)，n選自2、3、4、5和6；R6選自H和C1-C8烷基；R7選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R8各自獨(dú)立地選自H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)和O-(C1-C8烷基)；R9選自H和C1-C8烷基；R10選自芳基或C3-C8雜環(huán)；Z是O、S、NH或NR12，其中R12是C1-C8烷基；R11選自H、C1-C20烷基、芳基、C3-C8雜環(huán)、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；m是范圍在1-1000之間的一個(gè)整數(shù)；
R13是C2-C8烷基；R14是H或C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R15獨(dú)立地是H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R16獨(dú)立地是H、C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；R18選自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8雜環(huán))和-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳環(huán))；和n是0-6之間的一個(gè)整數(shù)。
Ab是共價(jià)連接于一個(gè)或多個(gè)藥物單元的任何抗體。Ab包括與CD30、CD40、CD70、Lewis Y抗原結(jié)合的抗體。在另一實(shí)施方式中，Ab不包括與ErbB受體或(1)-(35)中一種或多種受體結(jié)合的抗體(1)BMPR1B(骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體-IB型，Genbank登錄號(hào)NM_001203)；(2)E16(LAT1，SLC7A5，Genbank登錄號(hào)NM_003486)；(3)STEAP1(六次跨膜的前列腺上皮抗原，Genbank登錄號(hào)NM_012449)；(4)0772P(CA125、MUC16，Genbank登錄號(hào)AF361486)；(5)MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核細(xì)胞強(qiáng)化因子、間皮素，Genbank登錄號(hào)NM_005823)；(6)Napi3b(NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶質(zhì)運(yùn)載體家族34(磷酸鈉)、成員2、II型鈉依賴性磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3b，Genbank登錄號(hào)NM_006424)；(7)Sema 5b(FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、腦信號(hào)蛋白5b Hlog、sema結(jié)構(gòu)域、七個(gè)血小板反應(yīng)蛋白重復(fù)序列(1型和1型樣)、跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)和短胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、(腦信號(hào)蛋白)5B，Genbank登錄號(hào)AB040878)；(8)PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKEN cDNA 2700050C12、RIKEN cDNA 2700050C12基因，Genbank登錄號(hào)AY358628)；(9)ETBR(內(nèi)皮縮血管肽B型受體，Genbank登錄號(hào)AY275463)；(10)MSG783(RNF124，假擬蛋白FLJ20315，Genbank登錄號(hào)NM_017763)；(11)STEAP2(HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前列腺癌相關(guān)基因1、前列腺癌相關(guān)蛋白1、六次跨膜的前列腺上皮抗原2、六次跨膜的前列腺蛋白，Genbank登錄號(hào)AF455138)；(12)TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬時(shí)受體電勢陽離子通道、亞家族M、成員4，Genbank登錄號(hào)NM_017636)；
(13)CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎癌衍生生長因子，Genbank登錄號(hào)NP_003203或NM_003212)；(14)CD21(CR2(補(bǔ)體受體2)或C3DR(C3d/EB病毒受體)或Hs.73792，Genbank登錄號(hào)M26004)；(15)CD79b(IGb(免疫球蛋白-相關(guān)β)、B29，Genbank登錄號(hào)NM_000626)；(16)FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(含有磷酸酶錨定蛋白1a的SH2結(jié)構(gòu)域)、SPAP1B、SPAP1C，Genbank登錄號(hào)NM_030764)；(17)HER2(Genbank登錄號(hào)M11730)；(18)NCA(Genbank登錄號(hào)M18728)；(19)MDP(Genbank登錄號(hào)BC017023)；(20)IL20Rα(Genbank登錄號(hào)AF184971)；(21)短小蛋白聚糖(Genbank登錄號(hào)AF229053)；(22)Ephb2R(Genbank登錄號(hào)NM_004442)；(23)ASLG659(Genbank登錄號(hào)AX092328)；(24)PSCA(Genbank登錄號(hào)AJ297436)；(25)GEDA(Genbank登錄號(hào)AY260763)；(26)BAFF-R(Genbank登錄號(hào)NP_443177.1)；(27)CD22(Genbank登錄號(hào)NP-001762.1)；(28)CD79a(CD79A，CD79α，免疫球蛋白相關(guān)α，與Igβ(CD79B)發(fā)生共價(jià)作用并在表面與IgM分子形成復(fù)合物、轉(zhuǎn)導(dǎo)參與B細(xì)胞分化信號(hào)的B細(xì)胞特異性蛋白，Genbank登錄號(hào)NP_001774.1)；(29)CXCR5(伯基特淋巴瘤受體1，受CXCL13趨化因子活化的G蛋白偶聯(lián)受體，在淋巴細(xì)胞遷移和體液防御中起作用，在HIV-2感染中、也可能在AIDS、淋巴瘤、骨髓瘤和白血病的發(fā)展中起作用，Genbank登錄號(hào)NP_001707.1)；(30)HLA-DOB(能與肽結(jié)合并將肽提呈給CD4+T淋巴細(xì)胞的II型MHC分子的β亞基(Ia抗原)，Genbank登錄號(hào)NP_002111.1)；(31)P2X5(嘌呤能受體P2X配體-門控離子通道5，由胞外ATP門控的離子通道，可能參與突觸傳遞和神經(jīng)發(fā)生，缺陷可造成特發(fā)性逼尿肌不穩(wěn)定性的生理病變，Genbank登錄號(hào)NP_002552.2)；(32)CD72(B細(xì)胞分化抗原CD72，Lyb-2，Genbank登錄號(hào)NP_01773.1)；
(33)LY64(淋巴細(xì)胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRR)家族的I型膜蛋白，調(diào)節(jié)B細(xì)胞活化和凋亡，其功能缺失與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的疾病活動(dòng)升高相關(guān)，Genbank登錄號(hào)NP_005573.1)；(34)FCRH1(Fc受體樣蛋白1，推測為含有C2型Ig樣和ITAM結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的受體，可能在B-淋巴細(xì)胞分化中起作用，Genbank登錄號(hào)NP_443170.1)；或(35)IRTA2(免疫球蛋白超家族受體易位相關(guān)2，推測在B細(xì)胞發(fā)育和淋巴瘤發(fā)生中可能起作用的免疫受體；在一些B細(xì)胞惡性腫瘤中發(fā)生易位使該基因失調(diào)，Genbank登錄號(hào)NP_112571.1)；在一個(gè)實(shí)施方式中，-Ww-是-Val-Cit-。
在另一實(shí)施方式中，R3、R4和R7獨(dú)立地是異丙基或仲丁基，R5是-H。在示范性實(shí)施方式中，R3和R4各自是異丙基，R5是-H，R7是仲丁基。在又一實(shí)施方式中，R2和R6各自是甲基，R9是-H。
在又一實(shí)施方式中，各個(gè)出現(xiàn)的R8是-OCH3。
在示范性實(shí)施方式中，R3和R4各自是異丙基，R2和R6各自是甲基，R5是-H，R7是仲丁基，各個(gè)出現(xiàn)的R8是-OCH3，R9是-H。
在一個(gè)實(shí)施方式中，Z是-O-或-NH-。
在一個(gè)實(shí)施方式中，R10是芳基在示范性實(shí)施方式中，R10是-苯基。
在示范性實(shí)施方式中，當(dāng)Z是-O-時(shí)，R11是-H、甲基或叔丁基。
在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)Z是-NH時(shí)，R11是-CH(R15)2，其中R15是-(CH2)n-N(R16)2，R16是-C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH。
在另一實(shí)施方式中，當(dāng)Z是-NH時(shí)，R11是-CH(R15)2，其中R15是-(CH2)n-SO3H。
在一個(gè)方面，Ab是cAC10、cBR96、cS2C6、c1F6、c2F2、hAC10、hBR96、hS2C6、h1F6和h2F2。
式Ia的示范性實(shí)施方式具有以下結(jié)構(gòu) L-MC-vc-PAB-MMAF
其中L是抗體，Val是纈氨酸，Cit是瓜氨酸。
p代表藥物加載量，即分子(如式Ia、Ia’和Ic分子)中每個(gè)抗體(加載)的藥物分子平均數(shù)量。藥物加載量的范圍可以是每個(gè)配體(如Ab或mAb)1-20個(gè)藥物(D)。式Ia和式Ia’的組成包括與一系列藥物(1-20個(gè))偶聯(lián)的抗體集合?？捎贸Ｒ?guī)方法如質(zhì)譜、ELISA試驗(yàn)和HPLC特征鑒定偶聯(lián)反應(yīng)制品中每個(gè)抗體(加載)的藥物分子平均數(shù)量。也可根據(jù)p確定配體-藥物-偶聯(lián)物的數(shù)量分布。在一些情況下，分離、純化和特征分析均一的配體-藥物-偶聯(lián)物，其中p是得自配體-藥物-偶聯(lián)物的某個(gè)值，其它藥物加載量可用諸如反向HPLC或電泳等方法獲得。
4.2.2式(Ib)的藥物化合物在另一方面，本發(fā)明提供具有式(Ib)的藥物化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，其中R2選自-氫和-C1-C8烷基；
R3選自-氫、-C1-C8烷基、-C3-C8碳環(huán)、芳基、-C1-C8烷基-芳基、-C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、-C3-C8雜環(huán)和-C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R4選自-氫、-C1-C8烷基、-C3-C8碳環(huán)、-芳基、-C1-C8烷基-芳基、-C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、-C3-C8雜環(huán)和-C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))，其中R5選自-H和-甲基；或者R4和R5一起具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb獨(dú)立地選自H、-C1-C8烷基和-C3-C8碳環(huán)，n選自2、3、4、5和6，并以它們連接的碳原子形成環(huán)；R6選自-H和-C1-C8烷基；R7選自-H、-C1-C8烷基、-C3-C8碳環(huán)、芳基、-C1-C8烷基-芳基、-C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、-C3-C8雜環(huán)和-C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R8各自獨(dú)立地選自-H、-OH、-C1-C8烷基、-C3-C8碳環(huán)和-O-(C1-C8烷基)；R9選自-H和-C1-C8烷基；R10選自芳基或-C3-C8雜環(huán)；Z是-O-、-S-、-NH-或-NR12-，其中R12是C1-C8烷基；R11選自-H、C1-C20烷基、芳基、-C3-C8雜環(huán)、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；m是范圍在1-1000之間的一個(gè)整數(shù)；R13是-C2-C8烷基；R14是-H或-C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R15獨(dú)立地是-H、-COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R16獨(dú)立地是-H、-C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；和n是0-6之間的一個(gè)整數(shù)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，R3、R4和R7獨(dú)立地是異丙基或仲丁基，R5是-H。在示范性實(shí)施方式中，R3和R4各自是異丙基，R5是-H，R7是仲丁基。
在另一實(shí)施方式中，R2和R6各自是甲基，R9是-H。
在又一實(shí)施方式中，各個(gè)出現(xiàn)的R8是-OCH3。
在示范性實(shí)施方式中，R3和R4各自是異丙基，R2和R6各自是甲基，R5是-H，R7是仲丁基，各個(gè)出現(xiàn)的R8是-OCH3，R9是-H。
在一個(gè)實(shí)施方式中，Z是-O-或-NH-。
在一個(gè)實(shí)施方式中，R10是芳基在示范性實(shí)施方式中，R10是-苯基。
在示范性實(shí)施方式中，當(dāng)Z是-O-時(shí)，R11是-H、甲基或叔丁基。
在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)Z是-NH時(shí)，R11是-CH(R15)2，其中R15是-(CH2)n-N(R16)2，R16是-C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH。
在另一實(shí)施方式中，當(dāng)Z是-NH時(shí)，R11是-CH(R15)2，其中R15是-(CH2)n-SO3H。
說明性式(Ib)化合物，各化合物可用作ADC中的藥物部分(D)，包括具有以下結(jié)構(gòu)的化合物
及其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
式(Ic)化合物在另一方面，本發(fā)明提供具有式Ic的抗體-藥物偶聯(lián)化合物(ADC)Ab-_Aa-Ww-Yy-D)pIc包含共價(jià)連接于一個(gè)或多個(gè)藥物單元(部分)的抗體?？贵w-藥物偶聯(lián)化合物包括其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
式Ic化合物中的定義是Ab是與一種或多種腫瘤相關(guān)抗原受體(1)-(35)結(jié)合的抗體(1)BMPR1B(骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體-IB型，Genbank登錄號(hào)NM_001203)；(2)E16(LAT1，SLC7A5，Genbank登錄號(hào)NM_003486)；(3)STEAP1(六次跨膜的前列腺上皮抗原，Genbank登錄號(hào)NM_012449)；(4)0772P(CA125、MUC16，Genbank登錄號(hào)AF361486)；(5)MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核細(xì)胞強(qiáng)化因子、間皮素，Genbank登錄號(hào)NM_005823)；(6)Napi3b(NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶質(zhì)運(yùn)載體家族34(磷酸鈉)、成員2、II型鈉依賴性磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3b，Genbank登錄號(hào)NM_006424)；(7)Sema 5b(FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、腦信號(hào)蛋白5b Hlog、sema結(jié)構(gòu)域、七個(gè)血小板反應(yīng)蛋白重復(fù)序列(1型和1型樣)、跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)和短胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、(腦信號(hào)蛋白)5B，Genbank登錄號(hào)AB040878)；(8)PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKEN cDNA 2700050C12、RIKEN cDNA 2700050C12基因，Genbank登錄號(hào)AY358628)；(9)ETBR(內(nèi)皮縮血管肽B型受體，Genbank登錄號(hào)AY275463)；(10)MSG783(RNF124，假擬蛋白FLJ20315，Genbank登錄號(hào)NM_017763)；(11)STEAP2(HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前列腺癌相關(guān)基因1、前列腺癌相關(guān)蛋白1、六次跨膜的前列腺上皮抗原2、六次跨膜的前列腺蛋白，Genbank登錄號(hào)AF455138)；(12)TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬時(shí)受體電勢陽離子通道、亞家族M、成員4，Genbank登錄號(hào)NM_017636)；(13)CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎癌衍生生長因子，Genbank登錄號(hào)NP_003203或NM_003212)；
(14)CD21(CR2(補(bǔ)體受體2)或C3DR(C3d/EB病毒受體)或Hs.73792，Genbank登錄號(hào)M26004)；(15)CD79b(IGb(免疫球蛋白-相關(guān)β)、B29，Genbank登錄號(hào)NM_000626)；(16)FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(含有磷酸酶錨定蛋白1a的SH2結(jié)構(gòu)域)、SPAP1B、SPAP1C，Genbank登錄號(hào)NM_030764)；(17)HER2(Genbank登錄號(hào)M11730)；(18)NCA(Genbank登錄號(hào)M18728)；(19)MDP(Genbank登錄號(hào)BC017023)；(20)IL20Rα(Genbank登錄號(hào)AF184971)；(21)短小蛋白聚糖(Genbank登錄號(hào)AF229053)；(22)Ephb2R(Genbank登錄號(hào)NM_004442)；(23)ASLG659(Genbank登錄號(hào)AX092328)；(24)PSCA(Genbank登錄號(hào)AJ297436)；(25)GEDA(Genbank登錄號(hào)AY260763)；(26)BAFF-R(Genbank登錄號(hào)NP_443177.1)；(27)CD22(Genbank登錄號(hào)NP-001762.1)；(28)CD79a(CD79A，CD79α，免疫球蛋白相關(guān)α，與Igβ(CD79B)發(fā)生共價(jià)作用并在表面與IgM分子形成復(fù)合物、轉(zhuǎn)導(dǎo)參與B細(xì)胞分化信號(hào)的B細(xì)胞特異性蛋白，Genbank登錄號(hào)NP_001774.1)；(29)CXCR5(伯基特淋巴瘤受體1，受CXCL13趨化因子活化的G蛋白偶聯(lián)受體，在淋巴細(xì)胞遷移和體液防御中起作用，在HIV-2感染中、也可能在AIDS、淋巴瘤、骨髓瘤和白血病的發(fā)展中起作用，Genbank登錄號(hào)NP_001707.1)；(30)HLA-DOB(能與肽結(jié)合并將肽提呈給CD4+T淋巴細(xì)胞的II型MHC分子的β亞基(Ia抗原)，Genbank登錄號(hào)NP_002111.1)；(31)P2X5(嘌呤能受體P2X配體-門控離子通道5，由胞外ATP門控的離子通道，可能參與突觸傳遞和神經(jīng)發(fā)生，其缺陷可造成特發(fā)性逼尿肌不穩(wěn)定性的生理病變，Genbank登錄號(hào)NP_002552.2)；(32)CD72(B細(xì)胞分化抗原CD72，Lyb-2，Genbank登錄號(hào)NP_001773.1)；(33)LY64(淋巴細(xì)胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRR)家族的I型膜蛋白，調(diào)節(jié)B細(xì)胞活化和凋亡，其功能缺失與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的疾病活動(dòng)升高相關(guān)，Genbank登錄號(hào)NP_005573.1)；
(34)FCRH1(Fc受體樣蛋白1，推測為含有C2型Ig樣和ITAM結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的受體，可能在B-淋巴細(xì)胞分化中起作用，Genbank登錄號(hào)NP_443170.1)；和(35)IRTA2(免疫球蛋白超家族受體易位相關(guān)2，推測在B細(xì)胞發(fā)育和淋巴瘤發(fā)生中可能起作用的免疫受體；在一些B細(xì)胞惡性腫瘤中發(fā)生易位使該基因失調(diào)，Genbank登錄號(hào)NP_112571.1)；A是拉伸單元，a是0或1，W各自獨(dú)立地是氨基酸單元，w是0-12之間的一個(gè)整數(shù)，Y是間隔單元，和y是0、1或2，p的范圍是1～約8，和D是選自式DE和DF的藥物部分其中，DE和DF的波浪線表示與A、W或Y的共價(jià)連接位點(diǎn)，各位置相互獨(dú)立R2選自H和C1-C8烷基；R3選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R4選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R5選自H和甲基；或者R4和R5連接形成碳環(huán)，并具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb獨(dú)立地選自H、C1-C8烷基和C3-C8碳環(huán)，n選自2、3、4、5和6；
R6選自H和C1-C8烷基；R7選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R8各自獨(dú)立地選自H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)和O-(C1-C8烷基)；R9選自H和C1-C8烷基；R10選自芳基或C3-C8雜環(huán)；Z是O、S、NH或NR12，其中R12是C1-C8烷基；R11選自H、C1-C20烷基、芳基、C3-C8雜環(huán)、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；m是范圍在1-1000之間的一個(gè)整數(shù)；R13是C2-C8烷基；R14是H或C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R15獨(dú)立地是H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R16獨(dú)立地是H、C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；R18選自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8雜環(huán))和-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳環(huán))；和n是0-6之間的一個(gè)整數(shù)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，-Ww-是-Val-Cit-。
在另一實(shí)施方式中，R3、R4和R7獨(dú)立地是異丙基或仲丁基，R5是-H。在示范性實(shí)施方式中，R3和R4各自是異丙基，R5是-H，R7是仲丁基。
在又一實(shí)施方式中，R2和R6各自是甲基，R9是-H。
在又一實(shí)施方式中，各個(gè)出現(xiàn)的R8是-OCH3。
在示范性實(shí)施方式中，R3和R4各自是異丙基，R2和R6各自是甲基，R5是-H，R7是仲丁基，各個(gè)出現(xiàn)的R8是-OCH3，R9是-H。
在一個(gè)實(shí)施方式中，Z是-O-或-NH-。
在一個(gè)實(shí)施方式中，R10是芳基。
在示范性實(shí)施方式中，R10是-苯基。
在示范性實(shí)施方式中，當(dāng)Z是-O-時(shí)，R11是-H、甲基或叔丁基。
在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)Z是-NH時(shí)，R11是-CH(R15)2，其中R15是-(CH2)n-N(R16)2，R16是-C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH。
在另一實(shí)施方式中，當(dāng)Z是-NH時(shí)，R11是-CH(R15)2，其中R15是-(CH2)n-SO3H。
式Ic ADC的示范性實(shí)施方式具有以下結(jié)構(gòu) 其中Ab是與一種或多種腫瘤相關(guān)抗原受體(1)-(35)結(jié)合的抗體；Val是纈氨酸；Cit是瓜氨酸。
p代表藥物加載量，即式I分子中每個(gè)抗體(加載)的藥物平均數(shù)量。藥物加載量的范圍可以是每個(gè)抗體(如Ab或mAb)1-20個(gè)藥物(D)。式I ADC的組成包括與一系列藥物(1-20個(gè))偶聯(lián)的抗體集合?？捎贸Ｒ?guī)方法如UV/可見光光譜法，質(zhì)譜，ELISA試驗(yàn)和HPLC特征鑒定偶聯(lián)反應(yīng)ADC制品中每個(gè)抗體(加載)的藥物平均數(shù)量。也可根據(jù)p確定ADC的數(shù)量分布。在一些情況下，分離、純化和特征分析均一的ADC，其中p是得自ADC的某個(gè)值，其它藥物加載量可用諸如反向HPLC或電泳等方法獲得。
對于一些抗體-藥物偶聯(lián)物來說，p可能受抗體上連接位點(diǎn)數(shù)量的限制。例如，當(dāng)連接是半胱氨酸的巰基時(shí)，如上述示范性實(shí)施方式中所述，抗體可僅含有一個(gè)或數(shù)個(gè)半胱氨酸巰基，或可僅含有一個(gè)或數(shù)個(gè)可通過接頭連接的具有足夠反應(yīng)活性的巰基。
一般地，偶聯(lián)反應(yīng)中能與抗體偶聯(lián)的藥物分子數(shù)將小于理論上的最大值。例如，抗體可含有不與藥物-接頭中間體或連接試劑反應(yīng)的許多賴氨酸殘基。僅最具活性的賴氨酸基團(tuán)可與胺-反應(yīng)性連接試劑反應(yīng)。通常，抗體不會(huì)含有許多(如果有)可與藥物分子連接的游離的反應(yīng)性半胱氨酸巰基。本發(fā)明化合物抗體中大多數(shù)半胱氨酸巰基殘基以二硫鍵橋存在，必須用還原劑如二硫蘇糖醇(DTT)才能還原。此外，必須將抗體置于變性條件下，以暴露反應(yīng)性親核基團(tuán)如賴氨酸或半胱氨酸?？梢詭追N不同方法控制ADC的加載量(藥物/抗體比)，包括(i)相對于抗體限制藥物-接頭中間體或連接試劑的摩爾量過量，(ii)限制偶聯(lián)反應(yīng)的時(shí)間或溫度，和(iii)部分或限制半胱氨酸巰基修飾的還原條件。
應(yīng)理解，一個(gè)以上親核基團(tuán)與藥物-接頭中間體或連接試劑反應(yīng)，然后與藥物分子試劑反應(yīng)，得到的產(chǎn)物是與抗體連接的分布著一個(gè)或多個(gè)藥物部分的ADC化合物的混合物?？赏ㄟ^抗體特異性和藥物特異性的雙ELISA抗體試驗(yàn)計(jì)算出該混合物中每個(gè)抗體(加載)的平均藥物數(shù)量。該混合物中的單個(gè)ADC分子可用質(zhì)譜鑒定，用HPLC分離，如用疏水性相互作用層析分離(“藥物加載量對抗CD30抗體-藥物偶聯(lián)物的藥理學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)和毒性的影響”(Effect of drug loading on the pharmacology，pharmacokinetics，and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate)，Hamblett，K.J.等，摘要號(hào)624，美國癌癥研究協(xié)會(huì)(American Association for Cancer Research)；2004年會(huì)，2004年3月27-31日，《AACR論文集》(Proceedings of the AACR)，第45卷，2004年3月；“控制抗體-藥物偶聯(lián)物中藥物連接的位置”(Controlling the Location ofDrug Attachment in Antibody-Drug Conjugates”，Alley，S.C.等，摘要號(hào)627，美國癌癥研究協(xié)會(huì)(American Association for Cancer Research)；2004年會(huì)，2004年3月27-31日，《AACR論文集》(Proceedings of the AACR)，第45卷，2004年3月)。因此，可利用電泳或?qū)游鰪呐悸?lián)混合物中分離得到具有一個(gè)加載值的均一ADC。
4.3接頭單元“接頭單元”(LU)是一種雙功能化合物，可用于連接藥物單元和配體單元以形成藥物-接頭-配體偶聯(lián)物，或可用于形成抗腫瘤相關(guān)抗原的免疫偶聯(lián)物。這種免疫偶聯(lián)物可以將毒性藥物選擇性遞送給腫瘤細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方式中，藥物-接頭化合物和藥物-接頭-配體偶聯(lián)物的接頭單元具有下式-Aa-Ww-Yy-
其中-A-是拉伸單元；a是0或1；-W-各自獨(dú)立地是氨基酸單元；w獨(dú)立地是0-12之間的一個(gè)整數(shù)，；-Y-是間隔單元；和y是0、1或2。
在藥物-接頭-配體偶聯(lián)物中，所述接頭能夠?qū)⑺幬锊糠趾团潴w單元連接起來。
4.3.1拉伸單元拉伸單元(-A-)(當(dāng)存在時(shí))能夠?qū)⑴潴w單元與氨基酸單元(-W-)連接起來。在這個(gè)方面，配體(L)具有可與拉伸官能團(tuán)形成連接鍵的官能團(tuán)。存在配體上的天然或化學(xué)方法產(chǎn)生的有用官能團(tuán)包括但不限于巰基(-SH)、氨基、羥基、羧基、糖的異頭羥基和羧基。在一個(gè)方面，配體的官能團(tuán)是巰基和氨基?？赏ㄟ^還原配體的分子內(nèi)二硫鍵產(chǎn)生巰基?；蛘?，可用2-亞氨基硫烷(iminothiolane)(Traut試劑)或另一種巰基發(fā)生劑使配體賴氨酸部分的氨基發(fā)生反應(yīng)生成巰基。
在一個(gè)實(shí)施方式中，拉伸單元與配體單元的硫原子形成連接鍵。硫原子可來自配體的巰基。在式IIIa和IIIb的方框中描述了本實(shí)施方式的代表性拉伸單元，其中L-、-W-、-Y-、-D、w和y的定義如上，R17選自-C1-C10亞烷基-、-C3-C8碳環(huán)-、-O-(C1-C8烷基)-、-亞芳基-、-C1-C10亞烷基-亞芳基-、-亞芳基-C1-C10亞烷基-、-C1-C10亞烷基-(C3-C8碳環(huán))-、-(C3-C8碳環(huán))-C1-C10亞烷基-、-C3-C8雜環(huán)-、-C1-C10亞烷基-(C3-C8雜環(huán))-、-(C3-C8雜環(huán))-C1-C10亞烷基-、-(CH2CH2O)r-和-(CH2CH2O)r-CH2-；r是1-10之間的一個(gè)整數(shù)。從式Ia的所有示范性實(shí)施方式如III-VI中，應(yīng)理解即使不明確說明，也可知1-20個(gè)藥物部分連接于一個(gè)配體(p＝1-20)。
L_CH2-CONH-R17-C(O)_Ww-Yy-DIIIb
說明性拉伸單元是式IIIa的拉伸單元，其中R17是-(CH2)5- 另一說明性拉伸單元是式IIIa的拉伸單元，其中R17是-(CH2CH2O)r-CH2-；r是2 又一說明性拉伸單元是式IIIb的拉伸單元，其中R17是-(CH2)5- 在另一實(shí)施方式中，拉伸單元通過配體單元的硫原子和拉伸單元的硫原子之間的二硫鍵連接于配體單元。在式IV的方框中描述了本實(shí)施方式的代表性拉伸單元，其中R17、L-、-W-、-Y-、-D、w和y的定義如上。
L_S-R17-C(O)_Ww-Yy-DIV在又一實(shí)施方式中，拉伸單元的反應(yīng)性基團(tuán)含有可與配體的伯氨基或仲氨基形成連接鍵的反應(yīng)性位點(diǎn)。這些反應(yīng)性位點(diǎn)的例子包括但不限于活化的酯如琥珀酰亞胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酸酐、?；取⒒酋Ｂ?、異氰酸酯和異硫氰酸酯。在式Va和Vb的方框中描述了本實(shí)施方式的代表性拉伸單元，其中-R17-、L-、-W-、-Y-、-D、w和y的定義如上；L_C(O)NH-R17-C(O)_Ww-Yy-DVa
在又一方面，拉伸單元的反應(yīng)性基團(tuán)所含反應(yīng)性位點(diǎn)可與可能存在于配體上的修飾的糖(-CHO)基團(tuán)起反應(yīng)。例如，可用試劑如高碘酸鈉溫和地氧化糖，糖氧化得到的(-CHO)單元可與含有官能團(tuán)如酰肼、肟、伯胺或仲胺、肼、縮氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼的拉伸單元縮合，如Kaneko，T.等(1991)Bioconjugate Chem2133-41所述。在式VIa、VIb和VIc的方框中描述了本實(shí)施方式的代表性拉伸單元、其中-R17-、L-、-W-、-Y-、-D、w和y的定義如上。
4.3.2氨基酸單元如果存在間隔單元時(shí)，此氨基酸單元(-W-)(當(dāng)存在時(shí))可將拉伸單元連接于間隔單元，如果沒有間隔單元時(shí)可將拉伸單元連接于藥物部分，如果拉伸單元和間隔單元都沒有時(shí)可將配體單元連接于藥物單元。
Ww-是二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽單元。-W-單元各自獨(dú)立地具有以下方框中所示的結(jié)構(gòu)式，w是0-12之間的一個(gè)整數(shù) 或其中R19是氫、甲基、異丙基、異丁基、仲丁基、芐基、對羥基芐基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(＝NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(＝NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、苯基、環(huán)己基，可用一種或多種酶，包括腫瘤相關(guān)蛋白酶酶切此氨基酸單元，以釋放藥物單元(-D)，在一個(gè)藥物單元質(zhì)子化的實(shí)施方式中，體內(nèi)釋放提供了該藥物(D)。
式(VII)-(IX)代表說明性Ww單元其中R20和R21如下R20R21芐基 (CH2)4NH2；甲基 (CH2)4NH2；異丙基(CH2)4NH2；異丙基(CH2)3NHCONH2；芐基 (CH2)3NHCONH2；異丁基(CH2)3NHCONH2；仲丁基(CH2)3NHCONH2； (CH2)3NHCONH2；芐基甲基；和芐基 (CH2)3NHC(＝NH)NH2；
其中R20、R21和R22如下R20R21R22芐基芐基(CH2)4NH2；異丙基芐基(CH2)4NH2；和H芐基(CH2)4NH2；其中R20、R21、R22和R23如下R20R21R22R23H芐基異丁基H；和甲基異丁基甲基異丁基.
示范性氨基酸單元包括但不限于式(VII)單元，其中R20是芐基，R21是-(CH2)4NH2；R20是異丙基，R21是-(CH2)4NH2；R20是異丙基和R21是-(CH2)3NHCONH2。
另一示范性氨基酸單元是式(VIII)的單元，其中R20是芐基，R21是芐基，R22是-(CH2)4NH2。
可設(shè)計(jì)并優(yōu)化所用的-Ww-單元使它們對特定的酶如腫瘤相關(guān)蛋白酶的酶切具有選擇性。在一個(gè)實(shí)施方式中，-Ww-單元是可被組織蛋白酶B、C和D或纖溶蛋白酶催化切割的單元。
在一個(gè)實(shí)施方式中，-Ww-是二肽、三肽、四肽或五肽。
當(dāng)R19、R20、R21、R22或R23不是氫時(shí)，R19、R20、R21、R22或R23連接的碳原子是手性碳。
R19、R20、R21、R22或R23連接的各個(gè)碳原子獨(dú)立地是(S)或(R)構(gòu)型。
在氨基酸單元的一個(gè)方面，此氨基酸單元是纈氨酸-瓜氨酸。在另一方面，此氨基酸單元是苯丙氨酸-賴氨酸(即fk)。在氨基酸單元的又一方面，此氨基酸單元是N-甲基纈氨酸-瓜氨酸。在又一方面，此氨基酸單元是5-氨基戌酸、高苯丙氨酸賴氨酸、四異喹啉羧酸酯賴氨酸、環(huán)己基丙氨酸賴氨酸、異哌啶甲酸(isonepecotic acid)賴氨酸、β-丙氨酸賴氨酸、甘氨酸絲氨酸纈氨酸谷氨酰胺和異哌啶甲酸。
在某些實(shí)施方式中，此氨基酸單元可包含天然氨基酸。在其它實(shí)施方式中，此氨基酸單元可包含非天然氨基酸。
4.3.3間隔單元當(dāng)存在氨基酸單元時(shí)，此間隔單元(-Y-)(當(dāng)存在時(shí))將氨基酸單元與藥物部分連接在一起?；蛘弋?dāng)沒有氨基酸單元時(shí)，此間隔單元將拉伸單元與藥物部分連接在一起。當(dāng)氨基酸單元和拉伸單元都不存在時(shí)，此間隔單元也將藥物部分與配體單元連接在一起。
間隔單元通常有兩種類型自我犧牲型和非自我犧牲型。非自我犧牲型間隔單元是切割，尤其是酶切割藥物-接頭-配體偶聯(lián)物或藥物-接頭化合物的氨基酸單元后，部分或全部間隔單元仍然與藥物部分連接的間隔單元。非自我犧牲型間隔單元的例子包括但不限于(甘氨酸-甘氨酸)間隔單元和甘氨酸間隔單元(見方案1所述)(同上)。當(dāng)含有甘氨酸-甘氨酸間隔單元或甘氨酸間隔單元的示范性化合物被腫瘤細(xì)胞相關(guān)蛋白酶、癌細(xì)胞相關(guān)蛋白酶或淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白酶酶切時(shí)，將甘氨酸-甘氨酸-藥物部分或甘氨酸-藥物部分與L-Aa-Ww-切斷。在一個(gè)實(shí)施方式中，在靶細(xì)胞中發(fā)生獨(dú)立水解反應(yīng)，將甘氨酸-藥物部分連接鍵切開，釋放該藥物。
在另一實(shí)施方式中，-Yy-是對氨基芐基醇(PAB)單元(參見方案2和3)，其亞苯基部分被Qm取代，Q是-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-鹵素、-硝基或-氰基；m是0-4之間的一個(gè)整數(shù)。
方案1 在一個(gè)實(shí)施方式中，非自我犧牲型間隔單元(-Y-)是-Gly-Gly-。
在另一實(shí)施方式中，非自我犧牲型間隔單元(-Y-)是-Gly-。
在一個(gè)實(shí)施方式中，提供不存在間隔單元(y＝0)的藥物-接頭化合物或藥物-接頭配體偶聯(lián)物，或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
或者，含有自我犧牲型間隔單元的示范性化合物無需分步水解而釋放-D。在此實(shí)施方式中，-Y-是一種PAB基團(tuán)，通過該P(yáng)AB基團(tuán)的氨基氮原子連接于-Ww-，并通過碳酸酯、氨基甲酸酯或醚基直接連接于-D。如果不受限于任何具體理論或機(jī)制，方案2描述了通過氨基甲酸酯或碳酸酯基直接連接于-D的PAB基團(tuán)釋放藥物的可能機(jī)制，這得到Toki等(2002)J Org.Chem.671866-1872的支持。
方案2 其中Q是-C1-C8烷基，-O-(C1-C8烷基)，-鹵素，-硝基或-氰基；m是0-4之間的一個(gè)整數(shù)；p的范圍是1～約20。
如果不受限于任何具體理論或機(jī)制，方案3描述了通過醚或胺連接鍵直接連接于-D的PAB基團(tuán)藥物釋放的可能機(jī)制。
方案3
其中Q是-C1-C8烷基，-O-(C1-C8烷基)，-鹵素，-硝基或-氰基；m是0-4之間的一個(gè)整數(shù)；p的范圍是1～約20。
自我犧牲型間隔單元的其它例子包括但不限于帶電性能類似于PAB基團(tuán)的芳族化合物，如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(Hay等(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.92237)和鄰位或?qū)ξ话被S基縮醛。可采用在酰胺鍵水解時(shí)能環(huán)化的間隔單元，如取代的和未取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues等，Chemistry Biology，1995，2，223)、合適地取代的雙環(huán)[2.2.1]和雙環(huán)[2.2.2]環(huán)系統(tǒng)(Storm等，J.Amer.Chem.Soc.，1972，94，5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry等，J.Org.Chem.，1990，55，5867)。消除甘氨酸α-位被取代的含胺藥物(Kingsbury等，J。Med。Chem.，1984，27，1447)也是用于示范性化合物的自我犧牲型間隔單元的例子。
在一個(gè)實(shí)施方式中，間隔單元是方案4中所述的支鏈雙(羥基甲基)苯乙烯(BHMS)單元，可用于摻入和釋放多個(gè)藥物。
方案4
其中Q是-C1-C8烷基，-O-(C1-C8烷基)，-鹵素，-硝基或-氰基；m是0-4之間的一個(gè)整數(shù)；n是0或1；p的范圍是1～約20。
在一個(gè)實(shí)施方式中，-D部分相同。在又一實(shí)施方式中，-D部分不同。
在一個(gè)方面，式(X)-(XII)代表間隔單元(-Yy-) 其中Q是-C1-C8烷基，-O-(C1-C8烷基)，-鹵素，-硝基或-氰基；m是0-4之間的一個(gè)整數(shù)；和式Ia’和Ic抗體-藥物偶聯(lián)化合物的實(shí)施方式包括和，其中w和y各自是0，
和 4.4藥物單元(部分)抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)的藥物部分(D是海兔毒肽/耳抑素類型偶聯(lián)物(美國專利號(hào)5635483；5780588)，已證明它們能干擾微管動(dòng)力學(xué)、GTP水解以及核和細(xì)胞分裂(Woyke等(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12)3580-3584)，具有抗癌(美國專利號(hào)5663149)和抗真菌活性(Pettit等(1998)Antimicrob.Agents Chemother.422961-2965)。
D是具有氮原子的藥物單元(部分)，該氮原子在y＝1或2時(shí)可與間隔單元形成連接鍵，在y＝0時(shí)可與氨基酸單元的C末端羧基形成連接鍵，在w和y＝0時(shí)可與拉伸單元的羧基形成連接鍵，在a、w和y＝0時(shí)可與藥物單元的羧基形成連接鍵。應(yīng)理解，在本文中術(shù)語“藥物單元”和“藥物部分”同義，可互換使用。
在一個(gè)實(shí)施方式中，-D是式DE或DF
其中，各位置獨(dú)立R2選自H和C1-C8烷基；R3選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R4選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R5選自H和甲基；或者R4和R5連接形成碳環(huán)，并具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb獨(dú)立地選自H、C1-C8烷基和C3-C8碳環(huán)，n選自2、3、4、5和6；R6選自H和C1-C8烷基；R7選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-Cx烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R8各自獨(dú)立地選自H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)和O-(C1-C8烷基)；R9選自H和C1-C8烷基；R10選自芳基或C3-C8雜環(huán)；Z是O、S、NH或NR12，其中R12是C1-C8烷基；R11選自H、C1-C20烷基、芳基、C3-C8雜環(huán)、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；m是范圍在1-1000之間的一個(gè)整數(shù)；R13是C2-C8烷基；R14是H或C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R15獨(dú)立地是H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；
各個(gè)出現(xiàn)的R16獨(dú)立地是H、C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；R18選自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8雜環(huán))和-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳環(huán))；和n是0-6之間的一個(gè)整數(shù)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，R3、R4和R7獨(dú)立地是異丙基或仲丁基，R5是-H。在示范性實(shí)施方式中，R3和R4各自是異丙基，R5是H，R7是仲丁基。
在另一實(shí)施方式中，R2和R6各自是甲基，R9是-H。
在又一實(shí)施方式中，各個(gè)出現(xiàn)的R8是-OCH3。
在示范性實(shí)施方式中，R3和R4各自是異丙基，R2和R6各自是甲基，R5是H，R7是仲丁基，各個(gè)出現(xiàn)的R8是-OCH3，R9是H。
在一個(gè)實(shí)施方式中，Z是-O-或-NH-。
在一個(gè)實(shí)施方式中，R10是芳基在示范性實(shí)施方式中，R10是-苯基。
在示范性實(shí)施方式中，當(dāng)Z是-O-時(shí)，R11是-H、甲基或叔丁基。
在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)Z是-NH時(shí)，R11是-CH(R15)2，其中R15是-(CH2)n-N(R16)2，R16是-C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH。
在另一實(shí)施方式中，當(dāng)Z是-NH時(shí)，R11是-CH(R15)2，其中R15是-(CH2)n-SO3H。
說明性藥物單元(-D)包括具有以下結(jié)構(gòu)的藥物單元

及其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
在一個(gè)方面，可將親水基團(tuán)，例如但不限于如上所示的三乙二醇酯(TEG)連接于藥物單元的R11。如果不受限于理論，親水基團(tuán)有助于藥物單元的內(nèi)化和不凝聚。
4.5配體單元配體單元(L-)的范圍包括與給定靶細(xì)胞群相關(guān)的受體、抗原或其它受體部分結(jié)合或反應(yīng)性締合或復(fù)合的配體單元(L)。配體是與尋求的治療性或生物學(xué)方法修飾的細(xì)胞群的一部分結(jié)合、復(fù)合或反應(yīng)的分子。在一個(gè)方面，配體單元的作用是將藥物單元遞送給與配體單元反應(yīng)的特定靶細(xì)胞群。這些配體包括但不限于大分子蛋白如全長抗體、抗體片段、小分子量蛋白、多肽或肽、凝集素、糖蛋白、非肽、維生素、營養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)分子(例如但不限于轉(zhuǎn)鐵蛋白)或其它細(xì)胞結(jié)合分子或物質(zhì)。
配體單元可與拉伸單元、氨基酸單元、間隔單元或藥物單元形連接鍵。配體單元可通過配體的雜原子與接頭單元形成連接鍵?？纱嬖谟谂潴w單元上的雜原子包括硫(在一個(gè)實(shí)施方式中，來自配體的巰基)，氧(在一個(gè)實(shí)施方式中，來自配體的羰基、羧基或羥基)和氮(在一個(gè)實(shí)施方式中，來自配體的伯氨基或仲氨基)。這些雜原子可存在于天然狀態(tài)的配體(如天然產(chǎn)生的抗體)上，或者可通過化學(xué)修飾引入配體中。
在一個(gè)實(shí)施方式中，配體具有巰基，配體通過此巰基的硫原子連接于接頭單元。
在又一方面，配體具有一個(gè)或多個(gè)賴氨酸殘基，可化學(xué)修飾賴氨酸殘基以引入一個(gè)或多個(gè)巰基。配體單元通過此巰基的硫原子連接于接頭單元?？捎糜谛揎椯嚢彼岬脑噭┌ǖ幌抻贜-琥珀酰亞胺基S-乙?；虼宜狨?SATA)和2-亞氨基硫烷鹽酸鹽(Traut試劑)。
在另一實(shí)施方式中，配體可具有經(jīng)化學(xué)修飾而導(dǎo)入的一個(gè)或多個(gè)巰基的糖基團(tuán)。配體單元通過此巰基的硫原子連接于接頭單元，如拉伸單元。
在又一實(shí)施方式中，配體可具有一個(gè)或多個(gè)可被氧化產(chǎn)生醛(-CHO)基的糖基團(tuán)(參見例如，Laguzza等，J.Med.Chem.1989，32(3)，548-55)。相應(yīng)醛可與拉伸單元上的反應(yīng)位點(diǎn)形成連接鍵。可與配體的羰基反應(yīng)的拉伸單元上的反應(yīng)位點(diǎn)包括但不限于肼和羥胺。用于修飾蛋白以連接或結(jié)合藥物單元的其它方案見Coligan等，Current Protocols in Protein Science，第2卷，John Wiley & Sons(2002)，納入本文作為參考。
有用的非免疫反應(yīng)性蛋白、多肽或肽配體包括但不限于轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長因子(“EGF”)、鈴蟾肽、胃泌素、胃泌素釋放肽、血小板衍生生長因子、IL-2、IL-6、轉(zhuǎn)化生長因子(“TGF”)如TGF-α和TGF-β、牛痘生長因子(“VGF”)、胰島素和胰島素樣生長因子I和II、凝集素和低密度脂蛋白的脫輔蛋白質(zhì)。
有用的多克隆抗體是獲自免疫動(dòng)物血清的異質(zhì)抗體分子群?？捎帽绢I(lǐng)域熟知的各種方法產(chǎn)生感興趣抗原的多克隆抗體。例如，為了生產(chǎn)多克隆抗體，可通過注射感興趣的抗原或其衍生物免疫各種宿主動(dòng)物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠和豚鼠?？筛鶕?jù)宿主種類用各種佐劑來加強(qiáng)免疫應(yīng)答，這些佐劑包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐劑、礦物凝膠如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚陰離子、肽、油乳化劑、鑰孔血藍(lán)素、二硝基酚和可能有用的人佐劑如BCG(卡介菌)和短小棒狀桿菌。這些佐劑也是本領(lǐng)域熟知的。
有用的單克隆抗體是針對特定抗原決定簇(如癌細(xì)胞抗原、病毒抗原、微生物抗原、蛋白、肽、糖、化學(xué)物質(zhì)、核酸、或它們的片段)的抗體的均一群體?？捎帽绢I(lǐng)域已知的通過連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的技術(shù)來制備感興趣抗原的單克隆抗體(mAb)。這些技術(shù)包括但不限于最初由K_hler和Milstein(1975，Nature 256，495-497)描述的雜交瘤技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，1983，Immunology Today 472)，和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，第77-96頁)。這些抗體可以是任何免疫球蛋白類型，包括IgG、IgM、IgE、IgA和IgD，以及它們的任何亞型?？稍隗w外或體內(nèi)培育產(chǎn)生用于本發(fā)明的mAb的雜交瘤。
有用的單克隆抗體包括但不限于人單克隆抗體、人源化單克隆抗體、抗體片段或嵌合人-小鼠(或其它物種)單克隆抗體。人單克隆抗體可由本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)制備(如Teng等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80，7308-7312；Kozbor等，1983，Immunology Today4，72-79；和Olsson等，1982，Meth.Enzymol.92，3-16)。
抗體也可以是雙特異性抗體。制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。全長雙特異性抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法是基于兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達(dá)，這兩條鏈具有不同特異性(Milstein等，1983，Nature 305537-539)。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)配對，這些雜交瘤(四體雜交瘤)可能產(chǎn)生10種不同抗體分子的混合物，其中僅有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。國際公開號(hào)WO 93/08829和Traunecker等，EMBO J.103655-3659(1991)中描述了類似方法。
根據(jù)不同方法，將具有所需結(jié)合特異性的抗體可變區(qū)(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。優(yōu)選在免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)內(nèi)融合，以含有至少一部分鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)。優(yōu)選在至少一個(gè)融合物中使其含有輕鏈結(jié)合所需位點(diǎn)的重鏈第一恒定區(qū)(CH1)。將含有編碼免疫球蛋白重鏈融合物和(如果需要)免疫球蛋白輕鏈的序列的核酸插入不同的表達(dá)載體中，并共轉(zhuǎn)染入合適的宿主生物體。在用于構(gòu)建的這三條多肽鏈比例不相等時(shí)提供最佳產(chǎn)率的實(shí)施方式中，為調(diào)整這三條多肽片段的相互比例提供了極大的靈活性。然而，當(dāng)至少兩條多肽鏈以等比例表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)率或當(dāng)該比例無特殊意義時(shí)，可能將兩條或所有三條多肽鏈的編碼序列插入到一個(gè)表達(dá)載體中。
在本方法的一個(gè)實(shí)施方式中，該雙特異性抗體的一條臂為具有第一結(jié)合特異性的雜交免疫球蛋白的重鏈，另一條臂為雜交免疫球蛋白的重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特異性)。此不對稱結(jié)構(gòu)有助于使所需雙特異性化合物與不需要的免疫球蛋白鏈組合分離，因?yàn)閮H在雙特異性分子的一半中存在免疫球蛋白輕鏈，這提供了容易的分離方式(國際公開號(hào)WO 94/04690)，將其全文納入本文作為參考。
產(chǎn)生雙特異性抗體的其它詳細(xì)內(nèi)容參見例如，Suresh等，Methods in Enzymology，1986，121210；Rodrigues等，1993，J.of Immunology 1516954-6961；Carter等，1992，Bio/Technology 10163-167；Carter等，1995，J.of Hematotherapy4463-470；Merchant等，1998，Nature Biotechnology 16677-681。采用這些技術(shù)，可制備用于治療或預(yù)防本文所述疾病的雙特異性抗體。
歐洲專利公開號(hào)EPA 0 105 360中也描述了雙功能抗體。如此參考文獻(xiàn)中所述，可用生物手段即細(xì)胞融合技術(shù)，或化學(xué)手段，尤其是交聯(lián)劑或二硫橋鍵形成劑產(chǎn)生雜交或雙功能抗體，該抗體可包括完整抗體或其一部分。獲得這類雜交抗體的方法參見例如國際公開WO 83/03679和歐洲專利公開號(hào)EPA 0 217 577，將它們納入本文作為參考。
抗體可以是免疫特異性結(jié)合癌細(xì)胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的抗體或者與腫瘤細(xì)胞或基質(zhì)結(jié)合的其它抗體的功能活性片段、衍生物或類似物。在這個(gè)方面，“功能活性”指該片段、衍生物或類似物能夠誘導(dǎo)抗-抗-獨(dú)特型抗體，它識(shí)別的抗原與衍生出該片段、衍生物或類似物的抗體識(shí)別的抗原相同。具體說，在一個(gè)示范性實(shí)施方式中，可通過缺失能特異性識(shí)別抗原的CDR序列C末端的構(gòu)架和CDR來增強(qiáng)免疫球蛋白分子獨(dú)特型的抗原性。為確定哪個(gè)CDR序列結(jié)合抗原，可將含有CDR序列的合成肽用于抗原結(jié)合試驗(yàn)，所用方法是本領(lǐng)域已知的結(jié)合試驗(yàn)方法(如BIA核心試驗(yàn))(參見例如，Kabat等，1991，《免疫學(xué)感興趣的蛋白序列》(Sequences of Proteinsof Immunological Interest)，第5版，國立衛(wèi)生研究院(National Institute of Health)，Bethesda，Md；Kabat E等，1980，J.of Immunology 125(3)961-969)。
其它有用抗體包括抗體片段，例如但不限于可用胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生含有可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)和CH1重鏈結(jié)構(gòu)域的F(ab’)2片段，和可通過還原F(ab’)2片段的二硫橋鍵產(chǎn)生的Fab片段。其它有用的抗體是抗體的重鏈和輕鏈二聚物，或其最小片段，如Fvs或單鏈抗體(SCA)(如美國專利號(hào)4946778；Bird，1988，Science242423-42；Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883；和Ward等，1989，Nature 334544-54所述)，或特異性與抗體相同的其它分子。
此外，可用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)制備含有人和非人部分的重組抗體如嵌合和人源化單克隆抗體是有用的抗體。嵌合抗體是不同部分來源于不同種動(dòng)物的分子，如具有鼠單克隆可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的分子。(參見例如Cabilly等，美國專利號(hào)4816567；和Boss等，美國專利號(hào)4,816397，將其全文納入本文作為參考)。人源化抗體是衍生自非人動(dòng)物，具有該非人動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)和人免疫球蛋白分子構(gòu)架區(qū)的抗體分子。(參見例如Queen，美國專利號(hào)5,585,089，將其全文納入本文作為參考)?？捎帽绢I(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)，例如用以下文獻(xiàn)中所述方法來產(chǎn)生這些嵌合單克隆抗體和人源化單克隆抗體國際公開號(hào)WO 87/02671；歐洲專利公開號(hào)184,187；歐洲專利公開號(hào)171496；歐洲專利公開號(hào)173494；國際公開號(hào)WO 86/01533；美國專利號(hào)4816567；歐洲專利公開號(hào)12,023；Berter等，1988，Science 2401041-1043；Liu等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 843439-3443；Liu等，1987，J.Immunol.1393521-3526；Sun等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84214-218；Nishimura等，1987，Cancer.Res.47999-1005；Wood等，1985，Nature314446-449；和Shaw等，1988，J.Natl.Cancer Inst.801553-1559；Morrison，1985，Science 2291202-1207；Oi等，1986，BioTechniques 4214；美國專利號(hào)5225539；Jones等，1986，Nature 321552-525；Verhoeyan等(1988)Science 2391534；和Beidler等，1988，J.Immunol.1414053-4060；各自以全文納入本文作為參考。
完全的人抗體尤其理想，可用不能表達(dá)內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因，但可表達(dá)人重鏈和輕鏈基因的轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)。以正常方式用選擇的抗原如本發(fā)明多肽的全部或一部分免疫轉(zhuǎn)基因小鼠?？捎贸Ｒ?guī)的雜交瘤技術(shù)獲得抗該抗原的單克隆抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在B細(xì)胞分化期間重排，然后通過類轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變。因此，采用這種技術(shù)可能產(chǎn)生治療上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗體。這種產(chǎn)生人抗體的技術(shù)概述參見Lonberg和Huszar(1995，Int.Rev.Immunol.1365-93)。產(chǎn)生人抗體和人單克隆抗體的此種技術(shù)和產(chǎn)生這種抗體的方案的詳述參見例如美國專利號(hào)5625126；5633425；5569825；5661016；5545806；各自以全文納入本文作為參考?？蓮睦?，Abgenix，Inc.(Freemont，CA)和Genpharm(San Jose，CA)購得其它人抗體。
可用稱為“導(dǎo)向選擇”的技術(shù)來產(chǎn)生識(shí)別所選擇表位的完全人抗體。在此方法中，用選擇的非人單克隆抗體，如小鼠抗體來指導(dǎo)選擇識(shí)別相同表位的完全人抗體。(Jespers等(1994)Biotechnology 12899-903)。也可用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)，包括噬菌體展示文庫來產(chǎn)生人抗體(Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222581(1991)；Quan，M.P.和Carter，P.2002.產(chǎn)生用作治療的單克隆抗體(The rise of monoclonal antibodies as therapeutics).刊于《抗IgE和變應(yīng)性疾病》(Anti-IgE and Allergic Disease)，Jardieu，P.M.和Fick Jr.，R.B編，MarcelDekker，New York，NY，第20章，第427-469頁)。
在其它實(shí)施方式中，所述抗體是抗體或其功能活性片段的融合蛋白，例如，某抗體通過共價(jià)鍵(如肽鍵)在N-末端或C-末端與不是該抗體的另一蛋白的氨基酸序列(或其部分，優(yōu)選該蛋白的至少10、20或50個(gè)氨基酸部分)融合?？贵w或其片段優(yōu)選在恒定區(qū)的N-末端共價(jià)連接于其它蛋白。
這些抗體包括通過共價(jià)連接任何類型的分子修飾的抗體類似物和衍生物，只要這種共價(jià)連接允許抗體保持其抗原結(jié)合免疫特異性。例如但不限于，所述抗體的衍生物和類似物包括，如通過糖基化、乙?；?、聚乙二醇化(pegylation)、磷酸化、酰胺化、用已知的保護(hù)/封閉基團(tuán)衍生化、蛋白水解切割、連接于細(xì)胞抗體單元或其它蛋白等作進(jìn)一步修飾?？捎靡阎夹g(shù)進(jìn)行多種化學(xué)修飾中的任何一種，這些技術(shù)包括但不限于特異性化學(xué)切割、乙酰化、甲?；?、在衣霉素的存在下代謝合成等。此外，所述類似物或衍生物可含有一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸。
所述抗體包括氨基酸殘基中含有能與Fc受體相互作用的修飾(如取代、缺失或加入)的抗體。具體說，這些抗體包括經(jīng)鑒定含有參與抗-Fc結(jié)構(gòu)域和FcRn受體之間的相互作用的氨基酸殘基修飾的抗體(參見例如國際公開號(hào)WO 97/34631，將其全文納入本文作為參考)。對癌細(xì)胞抗原有免疫特異性的抗體可購自，例如Genentech(SanFrancisco，CA)或由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，如化學(xué)合成或重組表達(dá)技術(shù)生產(chǎn)。編碼對癌細(xì)胞抗原有免疫特異性的抗體的核苷酸序列可獲自，如GenBank數(shù)據(jù)庫或類似數(shù)據(jù)庫、發(fā)表文獻(xiàn)或作常規(guī)克隆和測序。
在特定實(shí)施方式中，可使用已知用于治療和預(yù)防癌癥的抗體。對癌細(xì)胞抗原有免疫特異性的抗體可購得或由本領(lǐng)域技術(shù)人員用已知方法如重組表達(dá)技術(shù)生產(chǎn)。編碼對癌細(xì)胞抗原有免疫特異性的抗體的核苷酸序列可獲自，如GenBank數(shù)據(jù)庫或類似數(shù)據(jù)庫、發(fā)表文獻(xiàn)或作常規(guī)克隆和測序。可用于治療癌癥的抗體例子包括但不限于用于治療轉(zhuǎn)移型乳腺癌患者的人源化抗-HER2單克隆抗體賀賽汀_(曲妥珠單抗；Genentech)；用于治療非霍奇金淋巴瘤患者的嵌合性抗-CD20單克隆抗體利妥昔_(利妥昔單抗；Genentech)；用于治療卵巢癌的鼠抗體OvaRex(AltaRex Corporation，MA)；用于治療結(jié)腸直腸癌的鼠IgG2a抗體單抗17-1A(Glaxo Wellcome，NC)；用于治療表皮生長因子陽性癌癥如頭頸癌的抗EGFR IgG嵌合抗體西妥昔單抗艾比特斯(ImcloneSystems Inc.，NY)；用于治療肉瘤的人源化抗體Vitaxin(MedImmune，Inc.，MD)；用于治療慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)的人源化IgG1抗體坎帕斯I/H(Leukosite，MA)；用于治療急性髓細(xì)胞白血病(AML)的人源化抗-CD33 IgG抗體Smart MI95(ProteinDesign Labs，Inc.，CA)；用于治療非霍奇金淋巴瘤的人源化抗-CD22 IgG抗體LymphoCide(Immunomedics，Inc.，NJ)；用于治療非霍奇金淋巴瘤的人源化抗-HLA-DR抗體Smart ID10(Protein Design Labs，Inc.，CA)；用于治療非霍奇金淋巴瘤的放射性同位素標(biāo)記的鼠抗-HLA-Dr10抗體Oncolym(Techniclone，Inc.，CA)；用于治療霍奇金病或非霍奇金淋巴瘤的人源化抗CD2單克隆抗體Allomune(BioTransplant，CA)；用于治療肺癌和結(jié)腸直腸癌的抗VEGF人源化抗體阿瓦斯丁(Genentech，Inc.，CA)；用于治療非霍奇金淋巴瘤的抗CD22抗體依帕珠單抗(Immunomedics，Inc.，NJ和Amgen，CA)；用于治療結(jié)腸直腸癌的人源化抗CEA抗體CEAcide(Immunomedics，NJ)。
用于治療癌癥的其它抗體包括但不限于抗以下抗原的抗體CA125(卵巢)、CA15-3(癌)、CA19-9(癌)、L6(癌)、Lewis Y(癌)、Lewis X(癌)、甲胎蛋白(癌)、CA 242(結(jié)直腸)、胎盤堿性磷酸酶(癌)、前列腺特異性抗原(前列腺)、前列酸(prostatic acid)磷酸酶(前列腺)、表皮生長因子(癌)、MAGE-1(癌)、MAGE-2(癌)、MAGE-3(癌)、MAGE-4(癌)、抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(癌)、p97(黑色素瘤)、MUC1-KLH(乳腺癌)、CEA(結(jié)直腸)、gp100(黑色素瘤)、MART1(黑色素瘤)、PSA(前列腺)、IL-2受體(T細(xì)胞白血病和淋巴瘤)、CD20(非霍奇金淋巴瘤)、CD52(白血病)、CD33(白血病)、CD22(淋巴瘤)、人絨毛膜促性腺素(癌)、CD38(多發(fā)性骨髓瘤)、CD40(淋巴瘤)、粘蛋白(癌)、P21(癌)、MPG(黑色素瘤)和Neu癌基因產(chǎn)物(癌)。一些有用的特異性抗體包括但不限于BR96mAb(Trail，P.A.，Willner，D.，Lasch，S.J.，Henderson，A.J.，Hofstead，S.J.，Casazza，A.M.，F(xiàn)irestone，R.A.，Hellstr_m，I.，Hellstr_m，K.E.，“用BR96-多柔比星免疫偶聯(lián)物治愈異種移植的人癌”(Cure of Xenografted Human Carcinomas byBR96-Doxorubicin Immunoconjugates)Science 1993，261，212-215)，BR64(Trail，PA，Willner，D，Knipe，J.，Henderson，A.J.，Lasch，S.J.，Zoeckler，M.E.，Trailsmith，M.D.，Doyle，T.W.，King，H.D.，Casazza，A.M.，Braslawsky，G.R.，Brown，J.P.，Hofstead，S.J.，Greenfield，R.S.，F(xiàn)irestone，R.A.，Mosure，K.，Kadow，D.F.，Yang，M.B.，Hellstrom，K.E.和Hellstrom，I.“接頭改變對癌反應(yīng)性BR64-多柔比星免疫偶聯(lián)物的穩(wěn)定性、潛能和效果的影響”(Effect of Linker Variation on theStability，Potency，and Efficacy of Carcinoma-reactive BR64-DoxorubicinImmunoconjugates)Cancer Research 1997，57，100-105，抗CD40抗原的單克隆抗體如S2C6單抗(Francisco，J.A.，Donaldson，K.L.，Chace，D.，Siegall，C.B.和Wahl，A.F.“抗CD-40抗體SGN-14的激動(dòng)性能和體內(nèi)抗腫瘤活性”(Agonistic properties andin vivo antitumor activity of the anti-CD-40 antibody，SGN-14)Cancer Res.2000，60，3225-3231)，抗CD70抗原的單克隆抗體，如1F6單抗和2F2單抗，以及抗CD30抗原的單克隆抗體，如AC10(Bowen，M.A.，Olsen，K.J.，Cheng，L.，Avila，D.和Podack，E. R.“大顆粒性淋巴瘤細(xì)胞系YT上CD30的功能作用”(Functional effectsof CD30 on a large granular lymphoma cell line YT)J.Immunol.，151，5896-5906，1993Wahl等，2002 Cancer Res.62(13)3736-42)?？刹捎媒Y(jié)合腫瘤相關(guān)抗原的許多其它內(nèi)化抗體，它們的綜述如下(Franke，A.E.，Sievers，E.L.和Scheinberg，D.A.，“急性髓細(xì)胞白血病的細(xì)胞表面受體靶向治療綜述”(Cell surface receptor-targetedtherapy of acute myeloid leukemiaa review)Cancer Biother Radiopharm.2000，15，459-76；Murray，J.L.，“單克隆抗體治療實(shí)體瘤即將來臨的時(shí)代”(Monoclonalantibody treatment of solid tumorsa coming of age)Semin Oncol.2000，27，64-70；Breitling，F(xiàn).和Dubel，S.，《重組抗體》(Recombinant Antibodies)，John Wiley and Sons，New York，1998)。
在某些實(shí)施方式中，所述抗體不是曲妥珠單抗(全長，人源化抗HER2(MW145167))，賀賽汀F(ab’)2(用酶學(xué)方法衍生自抗HER2(MW 100000))，4D5(全長，鼠抗HER2，得自雜交瘤)，rhu4D5(瞬時(shí)表達(dá)的全長人源化抗體)，rhuFab4D5(重組人源化Fab(MW47738))，4D5Fc8(全長，鼠抗HER2，具有突變的FcRn結(jié)合域)或Hg(“無鉸鏈”全長人源化4D5，重鏈鉸鏈區(qū)的半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸，在大腸桿菌中表達(dá)(因此非糖基化))。
在另一特定實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明組合物和方法使用治療或預(yù)防自身免疫病的抗體。對負(fù)責(zé)產(chǎn)生自身免疫性抗體的細(xì)胞的抗原免疫特異的抗體可獲自任何組織機(jī)構(gòu)(如大學(xué)科學(xué)家或公司)，或由本領(lǐng)域技術(shù)人員用已知方法如化學(xué)合成或重組表達(dá)技術(shù)產(chǎn)生。在另一實(shí)施方式中，用于治療自身免疫病的抗體是免疫特異性的，包括但不限于抗核抗體；抗ds DNA；抗ss DNA，抗心磷脂抗體IgM、IgG；抗磷脂抗體IgM、IgG；抗SM抗體；抗線粒體抗體；甲狀腺抗體；微粒體抗體；甲狀腺球蛋白抗體；抗SCL-70；抗Jo；抗U1RNP；抗La/SSB；抗SSA；抗SSB；抗壁細(xì)胞(PeritalCell)抗體；抗組蛋白；抗RNP；C-ANCA；P-ANCA；抗著絲粒；抗核仁纖維蛋白和抗GBM抗體。
在某些實(shí)施方式中，有用抗體可結(jié)合表達(dá)在活化淋巴細(xì)胞上的受體或受體復(fù)合物。所述受體或受體復(fù)合物可包含免疫球蛋白基因超家族成員、TNF受體超家族成員、整聯(lián)蛋白、細(xì)胞因子受體、趨化因子受體、主要組織相容性蛋白、凝集素或補(bǔ)體控制蛋白。合適的免疫球蛋白超家族成員的非限制性例子是CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD22、CD28、CD79、CD90、CD152/CTLA-4、PD-1和ICOS。合適的TNF受體超家族成員的非限制性例子是CD27、CD40、CD95/Fas、CD134/OX40、CD137/4-1BB、TNF-R1、TNFR-2、RANK、TACI、BCMA、護(hù)骨素(osteoprotegerin)、Apo2/TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4和APO-3。合適的整聯(lián)蛋白的非限制性例子是CD11a、CD11b、CD11c、CD18、CD29、CD41、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD103和CD104。合適的凝集素的非限制性例子是C型、S型和I型凝集素。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述配體能結(jié)合與自身免疫病相關(guān)的活化淋巴細(xì)胞。
在另一特定實(shí)施方式中，對病毒或微生物抗原具有免疫特異性的有用配體是單克隆抗體。該抗體可以是嵌合性、人源化或人單克隆抗體。本文所用術(shù)語“病毒抗原”包括但不限于能夠引起免疫應(yīng)答反應(yīng)的任何病毒肽、多肽蛋白(如HIV gp120、HIVnef、RSV F糖蛋白、流感病毒神經(jīng)氨酸酶、流感病毒血凝素、HTLV tax、單純皰疹病毒糖蛋白(如gB、gC、gD和gE)和乙肝表面抗原)。本文所用術(shù)語“微生物抗原”包括但不限于能夠引起免疫應(yīng)答反應(yīng)的任何微生物肽、多肽、蛋白、糖、多糖或脂質(zhì)分子(如細(xì)菌、真菌、致病性原生動(dòng)物或酵母多肽包括例如LPS和莢膜多糖5/8)。
病毒或微生物抗原的免疫特異性抗體可購自，例如BD Biosciences(SanFrancisco，CA)，Chemicon International，Inc.(Temecula，CA)或Vector Laboratories，Inc.(Burlingame，CA)，或由本領(lǐng)域技術(shù)人員用已知方法如化學(xué)合成或重組表達(dá)技術(shù)產(chǎn)生。編碼病毒或微生物抗原的免疫特異性抗體的核苷酸序列可獲自，例如GenBank數(shù)據(jù)庫或類似數(shù)據(jù)庫、發(fā)表文獻(xiàn)，或作常規(guī)克隆和測序。
在一特定實(shí)施方式中，有用配體是根據(jù)本文所公開的方法可用于治療或預(yù)防病毒或微生物感染的配體。可用于治療病毒感染或微生物感染的抗體的例子包括但不限于用于治療感染RSV的患者的人源化抗呼吸道合胞病毒(RSV)單克隆抗體SYNAGIS(MedImmune，Inc.，MD)；用于治療HIV感染的CD4融合抗體PRO542(Progenics)；用于治療乙肝病毒的人抗體OSTAVIR(Protein Design Labs，Inc.，CA)；用于治療巨細(xì)胞病毒(CMV)的人源化IgG1抗體PROTOVIR(Protein Design Labs，Inc.，CA)；和抗LPS抗體。
用于治療傳染病的其它抗體包括但不限于抗以下病原體的抗原的抗體致病性細(xì)菌菌株(釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)，肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)，淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrheae)，腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitides)，白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheriae)，肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)，產(chǎn)氣莢膜羧菌(Clostridium perfringens)，破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)，流感嗜血桿菌(Hemophilus influenzae)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種(Klebsiella ozaenas)，肺炎克雷伯氏菌鼻硬結(jié)亞種(Klebsiellarhinoscleromotis)，金黃色葡萄球菌(Staphylococc aureus)，霍亂弧菌(Vibrio colerae)，大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，胚胎彎曲桿菌(Campylobacter ferns)(弧菌(Vibrio))，嗜水性氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)，蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)，鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)，假結(jié)核耶爾森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)，痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)，弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)，索氏志賀氏菌(Shigella sonnei)，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)，蒼白密螺旋體(Treponema pallidum)，極細(xì)密螺旋體(Treponemapertenue)，斑點(diǎn)病密螺旋體(Treponema carateneum)，奮森氏疏螺旋體(Borreliavincentii)，布氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)，出血黃疸鉤端螺旋體(Leptospiraicterohemorrhagiae)，結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)，卡氏肺孢子蟲(Pneumocystis carinii)，土拉熱弗朗西絲氏菌(Francisella tularensis)，流產(chǎn)布魯氏菌(Brucella abortus)，豬布魯氏菌(Brucella suis)，馬爾他布魯氏菌(Brucella melitensis)，分枝桿菌某些種(Mycoplasma spp.)，普氏立克次氏體(Rickettsia prowazeki)，Rickettsiatsutsugumushi，衣原體屬某些種(Chlamydia spp.))；致病性真菌(粗球孢子菌(Coccidioides immitis)，煙曲霉(Aspergillus fumigatus)，白色假絲酵母(Candidaalbicans)，皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)，新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)，莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum))；原生動(dòng)物(痢疾阿米巴蟲(Entomoeba histolytica)，剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)，口腔毛滴蟲(Trichomonastenas)，人毛滴蟲(Trichomonas hominis)，陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)，岡比亞毛滴蟲(Tryoanosoma gambiense)，羅得西亞毛滴蟲(Trypanosoma rhodesiense)，枯氏毛滴蟲(Trypanosoma cruzi)，杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)，熱帶利什曼原蟲(Leishmania tropica)，巴西利什曼原蟲(Leishmania braziliensis)，肺炎肺孢子蟲(Pneumocystis pneumonia)，間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)，惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)，三日瘧原蟲(Plasmodium malaria))；或寄生蟲(蠕形住腸線蟲(Enterobiusvermicularis)，毛首鞭形線蟲(Trichuris trichiura)，似蚓蛔線蟲(Ascaris lumbricoides)，旋毛形線蟲(Trichinella spiralis)，糞類圓線蟲(Strongyloides stercoralis)，日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)，曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni)，埃及血吸蟲(Schistosomahaematobium)和鉤蟲)。
用于本發(fā)明治療病毒疾病的其它抗體包括但不限于抗致病性病毒抗原的抗體，包括例如但不限于痘病毒科、皰疹病毒科、單純皰疹病毒1、單純皰疹病毒2、腺病毒科、乳頭瘤病毒科、腸道病毒科、小核糖核酸病毒科、細(xì)小病毒科、呼吸道腸道病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科、流感病毒、副流感病毒、腮腺炎、麻疹、呼吸道合胞病毒、風(fēng)疹、蟲媒病毒科、桿狀病毒科、沙粒病毒科、甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、戊肝病毒、非甲/非乙肝炎病毒、鼻病毒科、冠狀病毒科、輪狀病毒科和人免疫缺陷病毒。
在嘗試發(fā)現(xiàn)用于癌癥診斷和治療的有效分子靶點(diǎn)中，研究者已設(shè)法鑒定到與一種或多種正常的非癌細(xì)胞相比，在一種或多種特定類型的癌細(xì)胞表面上特異性表達(dá)的跨膜或腫瘤相關(guān)多肽。與非癌細(xì)胞表面相比，這種腫瘤相關(guān)多肽在癌細(xì)胞表面的表達(dá)更豐富。對這種腫瘤相關(guān)細(xì)胞表面抗原多肽的鑒定導(dǎo)致能夠通過抗體療法特異性靶向癌細(xì)胞以摧毀癌細(xì)胞。
含有式Ic抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)中的Ab而可用于治療癌癥的抗體包括但不限于抗腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的抗體。這種腫瘤相關(guān)抗原是本領(lǐng)域已知的，并可制備用于用本領(lǐng)域熟知的方法和信息來產(chǎn)生抗體。TAA的例子包括(1)-(35)，但不限于下述TAA(1)-(35)。為了方便，本領(lǐng)域已知的關(guān)于這些抗原的信息見下，包括名稱、替代名稱、Genbank登錄號(hào)和主要參考文獻(xiàn)?？贵w靶向的腫瘤相關(guān)抗原包括與相對于所列相應(yīng)序列(SEQ ID NO1-35)中鑒定到的序列或引用文獻(xiàn)中鑒定到的序列具有序列相同性至少約70％、80％、85％、90％或95％的所有氨基酸序列變體和同種型。在一些實(shí)施方式中，具有氨基酸序列變體的TAA的生物特性基本相同，或其特征與具有所列相應(yīng)序列(SEQ ID NO1-35)中發(fā)現(xiàn)的序列的TAA相同。例如，具有變體序列的TAA通常能夠特異性結(jié)合于與具有所列相應(yīng)序列的TAA特異性結(jié)合的抗體。特別將本文中特別引用的序列和內(nèi)容納入本文作為參考。
腫瘤相關(guān)抗原(1)-(35)(1)BMPR1B(骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體-IB型，Genbank登錄號(hào)NM_001203，tenDijke，P.等Science 264(5155)101-104(1994)，Oncogene 14(11)1377-1382(1997))；WO2004063362(權(quán)利要求2)；WO2003042661(權(quán)利要求12)；US2003134790-A1(第38-39頁)；WO2002102235(權(quán)利要求13；第296頁)；WO2003055443(第91-92頁)；WO200299122(實(shí)施例2；第528-530頁)；WO2003029421(權(quán)利要求6)；WO2003024392(權(quán)利要求2；圖112)；WO200298358(權(quán)利要求1；第183頁)；WO200254940(第100-101頁)；WO200259377(第349-350頁)；WO200230268(權(quán)利要求27；第376頁)；WO200148204(實(shí)施例；圖4)NP_001194骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體，IB型/pid＝NP_001194.1-
交叉參考MIM603248；NP_001194.1；NM_001203_1502aaMLLRSAGKLNVGTKKEDGESTAPTPRPKVLRCKCHHHCPEDSVNNICSTDGYCFTMIEEDDSGLPVVTSGCLGLEGSDFQCRDTPIPHQRRSIECCTERNECNKDLHPTLPPLKNRDFVDGPIHHRALLISVTVCSLLLVLIILFCYFRYKRQETRPRYSIGLEQDETYIPPGESLRDLIEQSQSSGSGSGLPLLVQRTIAKQIQMVKQIGKGRYGEVWMGKWRGEKVAVKVFFTTEEASWFRETEIYQTVLMRHENILGFIAADIKGTGSWTQLYLITDYHENGSLYDYLKSTTLDAKSMLKLAYSSVSGLCHLHTEIFSTQGKPAIAHRDLKSKNILVKKNGTCCIADLGLAVKFISDTNEVDIPPNTRVGTKRYMPPEVLDESLNRNHFQSYIMADMYSFGLILWEVARRCVSGGIVEEYQLPYHDLVPSDPSYEDMREIVCIKKLRPSFPNRWSSDECLRQMGKLMTECWAHNPASRLTALRVKKTLAKMSESQDIKL(SEQ ID NO1)(2)E16(LAT1、SLC7A5，Genbank登錄號(hào)NM_003486)；Biochem.Biophys.Res.Commun.255(2)，283-288(1999)，Nature 395(6699)288-291(1998)，Gaugitsch，H.W.等(1992)J.Bio.Chem.267(16)11267-11273)；WO2004048938(實(shí)施例2)；WO2004032842(實(shí)施例IV)；WO2003042661(權(quán)利要求12)；WO2003016475(權(quán)利要求1)；WO200278524(實(shí)施例2)；WO200299074(權(quán)利要求19；第127-129頁)；WO200286443(權(quán)利要求27；第222、393頁)；WO2003003906(權(quán)利要求10；第293頁)；WO200264798(權(quán)利要求33；第93-95頁)；WO200014228(權(quán)利要求5；第133-136頁)；US2003224454(圖3)；WO2003025138(權(quán)利要求12；第150頁)；NP_003477溶質(zhì)運(yùn)載體家族7(陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)子，y+系統(tǒng))，成員5/pid＝NP_03477.3-智人交叉參考MIM600182；NP_003477.3；NM_015923；NM_003486_1507aaMAGAGPKRRALAAPAAEEKEEAREKMLAAKSADGSAPAGEGEGVTLQRNITLLNGVAIIVGTIIGSGIFVTPTGVLKEAGSPGLALVVWAACGVFSIVGALCYAELGTTISKSGGDYAYMLEVYGSLPAFLKLWIELLIIRPSSQYIVALVFATYLLKPLFPTCPVPEEAAKLVACLCVLLLTAVNCYSVKAATRVQDAFAAAKLLALALIILLGFVQIGKGVVSNLDPNFSFEGTKLDVGNIVLALYSGLFAYGGWNYLNFVTEEMINPYRNLPLAIIISLPIVTLVYVLTNLAYFTTLSTEQMLSSEAVAVDFGNYHLGVMSWIIPVFVGLSCFGSVNGSLFTSSRLFFVGSREGHLPSILSMIHPQLLTPVPSLVFTCVMTLLYAFSKDIFSVINFFSFFNWLCVALAIIGMIWLRHRKPELERPIKVNLALPVFFILACLFLIAVSFWKTPVECGIGFTIILSGLPVYFFGVWWKNKPKWLLQGIFSTTVLCQKLMQVVPQET(SEQ ID NO2)(3)STEAP1(六次跨膜的前列腺上皮抗原，Genbank登錄號(hào)NM_012449 CancerRes.61(15)，5857-5860(2001)，Hubert，R.S.等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.96(25)14523-14528)；WO2004065577(權(quán)利要求6)；WO2004027049(圖1L)；EP1394274(實(shí)施例11)；WO2004016225(權(quán)利要求2)；WO2003042661(權(quán)利要求12)；US2003157089(實(shí)施例5)；US2003185830(實(shí)施例5)；US2003064397(圖2)；WO200289747(實(shí)施例5；第618-619頁)；WO2003022995(實(shí)施例9；圖13A，實(shí)施例53；第173頁，實(shí)施例2；圖2A)；NP 036581六次跨膜的前列腺上皮抗原交叉參考MIM604415；NP_036581.1；NM_012449_1339aaMESRKDITNQEELWKMKPRRNLEEDDYLHKDTGETSMLKRPVLLHLHQTAHADEFDCPSELQHTQELFPQWHLPIKIAAIIASLTFLYTLLREVIHPLATSHQQYFYKIPILVINKVLPMVSITLLALVYLPGVIAAIVQLHNGTKYKKFPHWLDKWMLTRKQFGLLSFFFAVLHAIYSLSYPMRRSYRYKLLNWAYQQVQQNKEDAWIEHDVWRMEIYVSLGIVGLAILALLAVTSIPSVSDSLTWREFHYIQSKLGIVSLLLGTIHALIFAWNKWIDIKQFVWYTPPTFMIAVFLPIVVLIFKSILFLPCLRKKILKIRHGWEDVTKINKTEICSQL(SEQ ID NO 3)(4)0772P(CA125、MUC16、Genbank登錄號(hào) AF361486 J.Bio.Chem.276(29)27371-27375(2001))；WO2004045553(權(quán)利要求14)；WO200292836(權(quán)利要求6；圖12)；WO200283866(權(quán)利要求15；第116-121頁)；US2003124140(實(shí)施例16)；US2003091580(權(quán)利要求6)；WO200206317(權(quán)利要求6；第400-408頁)；交叉參考GI34501467；AAK74120.3；AF361486_16995aaPVTSLLTPGLVITTDRMGISREPGTSSTSNLSSTSHERLTTLEDTVDTEAMQRSTHTAVTNVRTSISGHESQSSVLSDSETPKATSPMGTTYTMGETSVSISTSDFFETSRIQIEPTSSLTSGLRETSSSERISSATEGSTVLSEVPSGATTEVSRTEVISSRGTSMSGPDQFTISPDISTEAITRLSTSPIMTESAESAITIETGSPGATSEGTLTLDTSTTTFWSGTHSTASPGFSHSEMTTLMSRTPGDVPWPSLPSVEEASSVSSSLSSPAMTSTSFFSTLPESISSSPHPVTALLTLGPVKTTDMLRTSSEPETSSPPNLSSTSAEILATSEVTKDREKIHPSSNTPVVNVGTVIYKHLSPSSVLADLVTTKPTSPMATTSTLGNTSVSTSTPAFPETMMTQPTSSLTSGLREISTSQETSSATERSASLSGMPTGATTKVSRTEALSLGRTSTPGPAQSTISPEISTETITRISTPLTTTGSAEMTITPKTGHSGASSQGTFTLDTSSRASWPGTHSAATHRSPHSGMTTPMSRGPEDVSWPSRPSVEKTSPPSSLVSLSAVTSPSPLYSTPSESSHSSPLRVTSLFTPVMMKTTDMLDTSLEPVTTSPPSMNITSDESLATSKATMETEAIQLSENTAVTQMGTISARQEFYSSYPGLPEPSKVTSPVVTSSTIKDIVSTTIPASSEITRIEMESTSTLTPTPRETSTSQEIHSATKPSTVPYKALTSATIEDSMTQVMSSSRGPSPDQSTMSQDISTEVITRLSTSPIKTESTEMTITTQTGSPGATSRGTLTLDTSTTFMSGTHSTASQGFSHSQMTALMSRTPGEVPWLSHPSVEEASSASFSLSSPVMTSSSPVSSTLPDSIHSSSLPVTSLLTSGLVKTTELLGTSSEPETSSPPNLSSTSAEILATTEVTTDTEKLEMTNVVTSGYTHESPSSVLADSVTTKATSSMGITYPTGDTNVLTSTPAFSDTSRIQTKSKLSLTPGLMETSISEETSSATEKSTVLSSVPTGATTEVSRTEAISSSRTSIPGPAQSTMSSDTSMETITRISTPLTRKESTDMAITPKTGPSGATSQGTFTLDSSSTASWPGTHSATTQRFPRSVVTTPMSRGPEDVSWPSPLSVEKNSPPSSLVSSSSVTSPSPLYSTPSGSSHSSPVPVTSLFTSIMMKATDMLDASLEPETTSAPNMNITSDESLAASKATTETEAIHVFENTAASHVETTSATEELYSSSPGFSEPTKVISPVVTSSSIRDNMVSTTMPGSSGITRIEIESMSSLTPGLRETRTSQDITSSTETSTVLYKMPSGATPEVSRTEVMPSSRTSIPGPAQSTMSLDISDEVVTRLSTSPIMTESAEITITTQTGYSLATSQVTLPLGTSMTFLSGTHSTMSQGLSHSEMTNLMSRGPESLSWTSPRFVETTRSSSSLTSLPLTTSLSPVSSTLLDSSPSSPLPVTSLILPGLVKTTEVLDTSSEPKTSSSPNLSSTSVEIPATSEIMTDTEKIHPSSNTAVAKVRTSSSVHESHSSVLADSETTITIPSMGITSAVEDTTVFTSNPAFSETRRIPTEPTFSLTPGFRETSTSEETTSITETSAVLFGVPTSATTEVSMTEIMSSNRTHIPDSDQSTMSPDIITEVITRLSSSSMMSESTQMTITTQKSSPGATAQSTLTLATTTAPLARTHSTVPPRFLHSEMTTLMSRSPENPSWKSSPFVEKTSSSSSLLSLPVTTSPSVSSTLPQSIPSSSFSVTSLLTPGMVKTTDTSTEPGTSLSPNLSGTSVEILAASEVTTDTEKIHPSSSMAVTNVGTTSSGHELYSSVSIHSEPSKATYPVGTPSSMAETSISTSMPANFETTGFEAEPFSHLTSGLRKTNMSLDTSSVTPTNTPSSPGSTHLLQSSKTDFTSSAKTSSPDWPPASQYTEIPVDIITPFNASPSITESTGITSFPESRFTMSVTESTHHLSTDLLPSAETISTGTVMPSLSEAMTSFATTGVPRAISGSGSPFSRTESGPGDATLSTIAESLPSSTPVPFSSSTFTTTDSSTIPALHEITSSSATPYRVDTSLGTESSTTEGRLVMVSTLDTSSQPGRTSSSPILDTRMTESVELGTVTSAYQVPSLSTRLTRTDGIMEHITKIPNEAAHRGTIRPVKGPQTSTSPASPKGLHTGGTKRMETTTTALKTTTTALKTTSRATLTTSVYTPTLGTLTPLNASMQMASTIPTEMMITTPYVFPDVPETTSSLATSLGAETSTALPRTTPSVFNRESETTASLVSRSGAERSPVIQTLDVSSSEPDTTASWVIHPAETIPTVSKTTPNFFHSELDTVSSTATSHGADVSSAIPTNISPSELDALTPLVTISGTDTSTTFPTLTKSPHETETRTTWLTHPAETSSTIPRTIPNFSHHESDATPSIATSPGAETSSAIPIMTVSPGAEDLVTSQVTSSGTDRNMTIPTLTLSPGEPKTIASLVTHPEAQTSSAIPTSTISPAVSRLVTSMVTSLAAKTSTTNRALTNSPGEPATTVSLVTHSAQTSPTVPWTTSIFFHSKSDTTPSMTTSHGAESSSAVPTPTVSTEVPGVVTPLVTSSRAVISTTIPILTLSPGEPETTPSMATSHGEEASSAIPTPTVSPGVPGVVTSLVTSSRAVTSTTIPILTFSLGEPETTPSMATSHGTEAGSAVPTVLPEVPGMVTSLVASSRAVTSTTLPTLTLSPGEPETTPSMATSHGAEASSTVPTVSPEVPGVVTSLVTSSSGVNSTSIPTLILSPGELETTPSMATSHGAEASSAVPTPTVSPGVSGVVTPLVTSSRAVTSTTIPILTLSSSEPETTPSMATSHGVEASSAVLTVSPEVPGMVTFLVTSSRAVTSTTIPTLTISSDEPETTTSLVTHSEAKMISAIPTLGVSPTVQGLVTSLVTSSGSETSAFSNLTVASSQPETIDSWVAHPGTEASSVVPTLTVSTGEPFTNISLVTHPAESSSTLPRTTSRFSHSELDTMPSTVTSPEAESSSAISTTISPGIPGVLTSLVTSSGRDISATFPTVPESPHESEATASWVTHPAVTSTTVPRTTPNYSHSEPDTTPSIATSPGAEATSDFPTITVSPDVPDMVTSQVTSSGTDTSITIPTLTLSSGEPETTTSFITYSETHTSSAIPTLPVSPDASKMLTSLVISSGTDSTTTFPTLTETPYEPETTAIQLIHPAETNTMVPRTTPKFSHSKSDTTLPVAITSPGPEASSAVSTTTISPDMSDLVTSLVPSSGTDTSTTFPTLSETPYEPETTATWLTHPAETSTTVSGTIPNFSHRGSDTAPSMVTSPGVDTRSGVPTTTIPPSIPGVVTSQVTSSATDTSTAIPTLTPSPGEPETTASSATHPGTQTGFTVPIRTVPSSEPDTMASWVTHPPQTSTPVSRTTSSFSHSSPDATPVMATSPRTEASSAVLTTISPGAPEMVTSQITSSGAATSTTVPTLTHSPGMPETTALLSTHPRTETSKTFPASTVFPQVSETTASLTIRPGAETSTALPTQTTSSLFTLLVTGTSRVDLSPTASPGVSAKTAPLSTHPGTETSTMIPTSTLSLGLLETTGLLATSSSAETSTSTLTLTVSPAVSGLSSASITTDKPQTVTSWNTETSPSVTSVGPPEFSRTVTGTTMTLIPSEMPTPPKTSHGEGVSPTTILRTTMVEATNLATTGSSPTVAKTTTTFNTLAGSLFTPLTTPGMSTLASESVTSRTSYNHRSWISTTSSYNRRYWTPATSTPVTSTFSPGISTSSIPSSTAATVPFMVPFTLNFTITNLQYEEDMRHPGSRKFNATERELQGLLKPLFRNSSLEYLYSGCRLASLRPEKDSSATAVDAICTHRPDPEDLGLDRERLYWELSNLTNGIQELGPYTLDRNSLYVNGFTHRSSMPTTSTPGTSTVDVGTSGTPSSSPSPTTAGPLLMPFTLNFTITNLQYEEDMRRTGSRKFNTMESVLQGLLKPLFKNTSVGPLYSGCRLTLLRPEKDGAATGVDAICTHRLDPKSPGLNREQLYWELSKLTNDIEELGPYTLDRNSLYVNGFTHQSSVSTTSTPGTSTVDLRTSGTPSSLSSPTIMAAGPLLVPFTLNFTITNLQYGEDMGHPGSRKFNTTERVLQGLLGPIFKNTSVGPLYSGCRLTSLRSEKDGAATGVDAICIHHLDPKSPGLNRERLYWELSQLTNGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHRTSVPTTSTPGTSTVDLGTSGTPFSLPSPATAGPLLVLFTLNFTITNLKYEEDMHRPGSRKFNTTERVLQTLVGPMFKNTSVGLLYSGCRLTLLRSEKDGAATGVDAICTHRLDPKSPGVDREQLYWELSQLTNGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHWIPVPTSSTPGTSTVDLGSGTPSSLPSPTSATAGPLLVPFTLNFTITNLKYEEDMHCPGSRKFNTTERVLQSLLGPMFKNTSVGPLYSGCRLTLLRSEKDGAATGVDAICTHRLDPKSPGVDREQLYWELSQLTNGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHQTSAPNTSTPGTSTVDLGTSGTPSSLPSPTSAGPLLVPFTLNFTITNLQYEEDMHHPGSRKFNTTERVLQGLLGPMFKNTSVGLLYSGCRLTLLRPEKNGAATGMDAICSHRLDPKSPGLNREQLYWELSQLTHGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHRSSVAPTSTPGTSTVDLGTSGTPSSLPSPTTAVPLLVPFTLNFTITNLQYGEDMRHPGSRKFNTTERVLQGLLGPLFKNSSVGPLYSGCRLISLRSEKDGAATGVDAICTHHLNPQSPGLDREQLYWQLSQMTNGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHRSSGLTTSTPWTSTVDLGTSGTPSPVPSPTTAGPLLVPFTLNFTITNLQYEEDMHRPGSRKFNATERVLQGLLSPIFKNSSVGPLYSGCRLTSLRPEKDGAATGMDAVCLYHPNPKRPGLDREQLYWELSQLTHNITELGPYSLDRDSLYVNGFTHQNSVPTTSTPGTSTVYWATTGTPSSFPGHTEPGPLLIPFTFNFTITNLHYEENMQHPGSRKFNTTERVLQGLLKPLFKNTSVGPLYSGCRLTLLRPEKQEAATGVDTICTHRVDPIGPGLDRERLYWELSQLTNSITELGPYTLDRDSLYVNGFNPWSSVPTTSTPGTSTVHLATSGTPSSLPGHTAPVPLLIPFTLNFTITNLHYEENMQHPGSRKFNTTERVLQGLLKPLFKSTSVGPLYSGCRLTLLRPEKHGAATGVDAICTLRLDPTGPGLDRERLYWELSQLTNSVTELGPYTLDRDSLYVNGFTHRSSVPTTSIPGTSAVHLETSGTPASLPGHTAPGPLLVPFTLNFTITNLQYEEDMRHPGSRKFNTTERVLQGLLKPLFKSTSVGPLYSGCRLTLLRPEKRGAATGVDTICTHRLDPLNPGLDREQLYWELSKLTRGIIELGPYLLDRGSLYVNGFTHRNFVPITSTPGTSTVHLGTSETPSSLPRPIVPGPLLVPFTLNFTITNLQYEEAMRHPGSRKFNTTERVLQGLLRPLFKNTSIGPLYSSCRLTLLRPEKDKAATRVDAICTHHPDPQSPGLNREQLYWELSQLTHGITELGPYTLDRDSLYVDGFTHWSPIPTTSTPGTSIVNLGTSGIPPSLPETTATGPLLVPFTLNFTITNLQYEENMGHPGSRKFNITESVLQGLLKPLFKSTSVGPLYSGCRLTLLRPEKDGVATRVDAICTHRPDPKIPGLDRQQLYWELSQLTHSITELGPYTLDRDSLYVNGFTQRSSVPTTSTPGTFTVQPETSETPSSLPGPTATGPVLLPFTLNFTIINLQYEEDMHRPGSRKFNTTERVLQGLLMPLFKNTSVSSLYSGCRLTLLRPEKDGAATRVDAVCTHRPDPKSPGLDRERLYWKLSQLTHGITELGPYTLDRHSLYVNGFTHQSSMTTTRTPDTSTMHLATSRTPASLSGPTTASPLLVLFTINFTITNLRYEENMHHPGSRKFNTTERVLQGLLRPVFKNTSVGPLYSGCRLTLLRPKKDGAATKVDAICTYRPDPKSPGLDREQLYWELSQLTHSITELGPYTLDRDSLYVNGFTQRSSVPTTSIPGTPTVDLGTSGTPVSKPGPSAASPLLVLFTLNFTITNLRYEENMQHPGSRKFNTTERVLQGLLRSLFKSTSVGPLYSGCRLTLLRPEKDGTATGVDAICTHHPDPKSPRLDREQLYWELSQLTHNITELGPYALDNDSLFVNGFTHRSSVSTTSTPGTPTVYLGASKTPASIFGPSAASHLLILFTLNFTITNLRYEENMWPGSRKFNTTERVLQGLLRPLFKNTSVGPLYSGCRLTLLRPEKDGEATGVDAICTHRPDPTGPGLDREQLYLELSQLTHSITELGPYTLDRDSLYVNGFTHRSSVPTTSTGVVSEEPFTLNFTINNLRYMADMGQPGSLKFNITDNVMQHLLSPLFQRSSLGARYTGCRVIALRSVKNGAETRVDLLCTYLQPLSGPGLPIKQVFHELSQQTHGITRLGPYSLDKDSLYLNGYNEPGPDEPPTTPKPATTFLPPLSEATTAMGYHLKTLTLNFTISNLQYSPDMGKGSATFNSTEGVLQHLLRPLFQKSSMGPFYLGCQLISLRPEKDGAATGVDTTCTYHPDPVGPGLDIQQLYWELSQLTHGVTQLGFYVLDRDSLFINGYAPQNLSIRGEYQINFHIVNWNLSNPDPTSSEYITLLRDIQDKVTTLYKGSQLHDTFRFCLVTNLTMDSVLVTVKALFSSNLDPSLVEQVFLDKTLNASFHWLGSTYQLVDIHVTEMESSVYQPTSSSSTQHFYLNFTITNLPYSQDKAQPGTTNYQRNKRNIEDALNQLFRNSSIKSYFSDCQVSTFRSVPNRHHTGVDSLCNFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLPFWAVILIGLAGLLGLITCLICGVLVTTRRRKKEGEYNVQQQCPGYYQSHLDLEDLQ(SEQ ID NO4)(5)MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核細(xì)胞強(qiáng)化因子、間皮素、Genbank登錄號(hào)NM_005823，Yamaguchi，N.等Bio1.Chem.269(2)，805-808(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.96(20)11531-11536(1999)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93(1)136-140(1996)，J.Bio.Chem.270(37)21984-21990(1995))；WO2003101283(權(quán)利要求14)；(WO2002102235(權(quán)利要求13；第287-288頁)；WO2002101075(權(quán)利要求4；第308-309頁)；WO200271928(第320-321頁)；WO9410312(第52-57頁)；交叉參考MIM601051；NP_005814.2；NM_005823_1622aaMALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSGLSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLLPRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQGGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRREVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMSPEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSGTPCLLGPGPVLTVLALLLASTLA(SEQ ID NO5)(6)Napi3b(NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶質(zhì)運(yùn)載體家族34(磷酸鈉)、成員2、II型鈉依賴型磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)子3b，Genbank登錄號(hào)NM_006424，J.Bio.Chem.277(22)19665-19672(2002)，Genomics 62(2)281-284(1999)，F(xiàn)eild，J.A.等(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.258(3)578-582)；WO2004022778(權(quán)利要求2)；EP1394274(實(shí)施例11)；WO2002102235(權(quán)利要求13；第326頁)；EP875569(權(quán)利要求1；第17-19頁)；WO200157188(權(quán)利要求20；第329頁)；WO2004032842(實(shí)施例IV)；WO200175177(權(quán)利要求24；第139-140頁)；交叉參考MIM604217；NP_006415.1；NM_006424_1690aaMAPWPELGDAQPNPDKYLEGAAGQQPTAPDKSKETNKTDNTEAPVTKIELLPSYSTATLIDEPTEVDDPWNLPTLQDSGIKWSERDTKGKILCFFQGIGRLILLLGFLYFFVCSLDILSSAFQLVGGKMAGQFFSNSSIMSNPLLGLVIGVLVTVLVQSSSTSTSIVVSMVSSSLLTVRAAIPIIMGANIGTSITNTIVALMQVGDRSEFRRAFAGATVHDFFNWLSVLVLLPVEVATHYLEIITQLIVESFHFKNGEDAPDLLKVITKPFTKLIVQLDKKVISQIAMNDEKAKNKSLVKIWCKTFTNKTQINVTVPSTANCTSPSLCWTDGIQNWTMKNVTYKENIAKCQHIFVNFHLPDLAVGTILLILSLLVLCGCLIMIVKILGSVLKGQVATVIKKTINTDFPFPFAWLTGYLAILVGAGMTFIVQSSSVFTSALTPLIGIGVITIERAYPLTLGSNIGTTTTAILAALASPGNALRSSLQIALCHFFFNISGILLWYRIPFTRLPIRMAKGLGNISAKYRWFAVFYLIIFFFLIPLTVFGLSLAGWRVLVGVGVPVVFIIILVLCLRLLQSRCPRVLPKKLQNWNFLPLWMRSLKPWDAVVSKFTGCFQMRCCYCCRVCCRACCLLCGCPKCCRCSKCCEDLEEAQEGQDVPVKAPETFDNITISREAQGEVPASDSKTECTAL(SEQ ID NO6)(7)Sema 5b(FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、腦信號(hào)蛋白5b Hlog、sema結(jié)構(gòu)域、七個(gè)血小板反應(yīng)蛋白重復(fù)序列(1型和1型樣)、跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)和短胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、(腦信號(hào)蛋白)5B、Genbank登錄號(hào)AB040878，Nagase T.等(2000)DNA Res.7(2)143-150)；WO2004000997(權(quán)利要求1)；WO2003003984(權(quán)利要求1)；WO200206339(權(quán)利要求1；第50頁)；WO200188133(權(quán)利要求1；第41-43頁，48-58)；WO2003054152(權(quán)利要求20)；WO2003101400(權(quán)利要求11)；登錄號(hào)Q9P283；EMBL；AB040878；BAA95969.1。Genew；HGNC10737；1093aaMVLAGPLAVSLLLPSLTLLVSHLSSSQDVSSEPSSEQQLCALSKHPTVAFEDLQPWVSNFTYPGARDFSQLALDPSGNQLIVGARNYLFRLSLANVSLLQATEWASSEDTRRSCQSKGKTEEECQNYVRVLIVAGRKVFMCGTNAFSPMCTSRQVGNLSRTTEKINGVARCPYDPRHNSTAVISSQGELYAATVIDFSGRDPAIYRSLGSGPPLRTAQYNSKWLNEPNFVAAYDIGLFAYFFLRENAVEHDCGRTVYSRVARVCKNDVGGRFLLEDTWTTFMKARLNCSRPGEVPFYYNELQSAFHLPEQDLIYGVFTTNVNSIAASAVCAFNLSAISQAFNGPFRYQENPRAAWLPIANPIPNFQCGTLPETGPNENLTERSLQDAQRLFLMSEAVQPVTPEPCVTQDSVRFSHLVVDLVQAKDTLYHVLYIGTESGTILKALSTASRSLHGCYLEELHVLPPGRREPLRSLRILHSARALFVGLRDGVLRVPLERCAAYRSQGACLGARDPYCGWDGKQQRCSTLEDSSNMSLWTQNITACPVRNVTRDGGFGPWSPWQPCEHLDGDNSGSCLCRARSCDSPRPRCGGLDCLGPAIHIANCSRNGAWTPWSSWALCSTSCGIGFQVRQRSCSNPAPRHGGRICVGKSREERFCNENTPCPVPIFWASWGSWSKCSSNCGGGMQSRRRACENGNSCLGCGVEFKTCNPEGCPEVRRNTPWTPWLPVNVTQGGARQEQRFRFTCRAPLADPHGLQFGRRRTETRTCPADGSGSCDTDALVEDLLRSGSTSPHTVSGGWAAWGPWSSCSRDCELGFRVRKRTCTNPEPRNGGLPCVGDAAEYQDCNPQACPVRGAWSCWTSWSPCSASCGGGHYQRTRSCTSPAPSPGEDICLGLHTEEALCATQACPEGWSPWSEWSKCTDDGAQSRSRHCEELLPGSSACAGNSSQSRPCPYSEIPVILPASSMEEATGCAGFNLIHLVATGISCFLGSGLLTLAVYLSCQHCQRQSQESTLVHPATPNHLHYKGGGTPKNEKYTPMEFKTLNKNNLIPDDRANFYPLQQTNVYTTTYYPSPLNKHSFRPEASPGQRCFPNS(SEQ ID NO7)(8)PSCA hlg(2700050C12Rik，C530008O16Rik，RIKEN cDNA 2700050C12，RIKEN cDNA 2700050C12基因，Genbank登錄號(hào)AY358628)；US2003129192(權(quán)利要求2)；US2004044180(權(quán)利要求12)；US2004044179(權(quán)利要求11)；US2003096961(權(quán)利要求11)；US2003232056(實(shí)施例5)；WO2003105758(權(quán)利要求12)；US2003206918(實(shí)施例5)；EP1347046(權(quán)利要求1)；WO2003025148(權(quán)利要求20)；交叉參考GI37182378；AAQ88991.1；AY358628_1141aaMWVLGIAATFCGLFLLPGFALQIQCYQCEEFQLNNDCSSPEFIVNCTVNVQDMCQKEVMEQSAGIMYRKSCASSAACLIASAGYQSFCSPGKLNSVCISCCNTPLCNGPRPKKRGSSASALRPGLRTTILFLKLALFSAHC(SEQ ID NO8)(9)ETBR(內(nèi)皮縮血管肽B型受體，Genbank登錄號(hào)AY275463)；Nakamuta M.等Biochem.Biophys.Res.Commun.177，34-39，1991；Ogawa Y.等Biochem.Biophys.Res.Commun.178，248-255，1991；Arai H.等Jpn.Circ.J.56，1303-1307，1992；Arai H.等J.Bio.Chem.268，3463-3470，1993；Sakamoto A.，Yanagisawa M.等Biochem.Biophys.Res.Commun.178，656-663，1991；ElshourbagyN.A.等J.Bio.Chem.268，3873-3879，1993；Haendler B.等J.Cardiovasc.Pharmacol.20，s1-S4，1992；Tsutsumi M.等Gene228，43-49，1999；Strausberg R.L.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA.99，16899-16903，2002；Bourgeois C.等J.Clin.Endocrinol.Metab.82，3116-3123，1997；Okamoto Y.等Biol.Chem.272，21589-21596，1997；Verheij J.B.等Am.J.Med.Genet.108，223-225，2002；Hofstra R.M.W.等Eur.J.Hum.Genet.5，180-185，1997；Puffenberger E.G.等Cell79，1257-1266，1994；Attie T.等，Hum.Mol.Genet.4，2407-2409，1995；AuricchioA.等Hum.Mol.Genet.5351-354，1996；AmielJ.等Hum.Mol.Genet.5，355-357，1996；Hofstra R.M.W.等Nat.Genet.12，445-447，1996；Svensson P.J.等Hum.Genet.103，145-148，1998；Fuchs S.等Mol.Med.7，115-124，2001；Pingault V.等(2002)Hum.Genet.111，198-206；WO2004045516(權(quán)利要求1)；WO2004048938(實(shí)施例2)；WO2004040000(權(quán)利要求151)；WO2003087768(權(quán)利要求1)；WO2003016475(權(quán)利要求1)；WO2003016475(權(quán)利要求1)；WO200261087(圖1)；WO2003016494(圖6)；WO2003025138(權(quán)利要求12；第144頁)；WO200198351(權(quán)利要求1；第124-125頁)；EP522868(權(quán)利要求8；圖2)；WO200177172(權(quán)利要求1；第297-299頁)；US2003109676；US6518404(圖3)；US5773223(權(quán)利要求1a；第31-34列)；WO2004001004；442aaMQPPPSLCGRALVALVLACGLSRIWGEERGFPPDRATPLLQTAEIMTPPTKTLWPKGSNASLARSLAPAEVPKGDRTAGSPPRTISPPPCQGPIEIKETFKYINTVVSCLVFVLGIIGNSTLLRIIYKNKCMRNGPNILIASLALGDLLHIVIDIPINVYKLLAEDWPFGAEMCKLVPFIQKASVGITVLSLCALSIDRYRAVASWSRIKGIGVPKWTAVEIVLIWVVSVVLAVPEAIGFDIITMDYKGSYLRICLLHPVQKTAFMQFYKTAKDWWLFSFYFCLPLAITAFFYTLMTCEMLRKKSGMQIALNDHLKQRREVAKTVFCLVLVFALCWLPLHLSRILKLTLYNQNDPNRCELLSFLLVLDYIGINMASLNSCINPIALYLVSKRFKNCFKSCLCCWCQSFEEKQSLEEKQSCLKFKANDHGYDNFRSSNKYSSS(SEQ ID NO9)(10)MSG783(RNF124、假擬蛋白FLJ20315，Genbank登錄號(hào)NM_017763)；WO2003104275(權(quán)利要求1)；WO2004046342(實(shí)施例2)；WO2003042661(權(quán)利要求12)；WO2003083074(權(quán)利要求14；第61頁)；WO2003018621(權(quán)利要求1)；WO2003024392(權(quán)利要求2；圖93)；WO200166689(實(shí)施例6)；交叉參考LocusID54894；NP_060233.2；NM_017763_1783aaMSGGHQLQLAALWPWLLMATLQAGFGRTGLVLAAAVESERSAEQKAIIRVIPLKMDPTGKTNLTLEGVFAGVAEITPAEGKLMQSHPLYLCNASDDDNLEPGFISIVKLESPRRAPRPCLSLASKARMAGERGASAVLFDITEDRAAAEQLQQPLGLTWPVVLIWGNDAEKLMEFVYKNQKAHVRIELKEPPAWPDYDVWILMTVVGTIFVIILASVLRIRCRPRHSRPDPLQQRTAWAISQLATRRYQASCRQARGEWPDSGSSCSSAPVCAICLEEFSEGQELRVISCLHEFHRNCVDPWLHQHRTCPLCVFNITEGDSFSQSLGPSRSYQEPGRRLHLIRQHPGHAHYHLPAAYLLGPSRSAVARPPRPGPFLPSQEPGMGPRHHRFPRAAHPRAPGEQQRLAGAQHPYAQGWGMSHLQSTSQHPAACPVPLRRARPPDSSGSGESYCTERSGYLADGPASDSSSGPCHGSSSDSVVNCTDISLQGVHGSSSTFCSSLSSDFDPLVYCSPKGDPQRVDMQPSVTSRPRSLDSVVPTGETQVSSHVHYHRHRHHHYKKRFQWHGRKPGPETGVPQSRPPIPRTQPQPEPPSPDQQVTGSNSAAPSGRLSNPQCPRALPEPAPGPVDASSICPSTSSLFNLQKSSLSARHPQRKRRGGPSEPTPGSRPQDATVHPACQIFPHYTPSVAYPWSPEAHPLICGPPGLDKRLLPETPGPCYSNSQPVWLCLTPRQPLEPHPPGEGPSEWSSDTAEGRPCPYPHCQVLSAQPGSEEELEELCEQAV(SEQ ID NO10)(11)STEAP2(HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前列腺癌相關(guān)基因1、前列腺癌相關(guān)蛋白1、六次跨膜的前列腺上皮抗原2、六次跨膜的前列腺蛋白，Genbank登錄號(hào)AF455138，Lab.Invest.82(11)1573-1582(2002))；WO2003087306；US2003064397(權(quán)利要求1；圖1)；WO200272596(權(quán)利要求13；第54-55頁)；WO200172962(權(quán)利要求1；圖4B)；WO2003104270(權(quán)利要求11)；WO2003104270(權(quán)利要求16)；US2004005598(權(quán)利要求22)；WO2003042661(權(quán)利要求12)；US2003060612(權(quán)利要求12；圖10)；WO200226822(權(quán)利要求23；圖2)；WO200216429(權(quán)利要求12；圖10)；交叉參考GI22655488；AAN04080.1；AF455138_1490aaMESISMMGSPKSLSETVLPNGINGIKDARKVTVGVIGSGDFAKSLTIRLIRCGYHVVIGSRNPKFASEFFPHVVDVTHHEDALTKTNIIFVAIHREHYTSLWDLRHLLVGKILIDVSNNMRINQYPESNAEYLASLFPDSLIVKGFNVVSAWALQLGPKDASRQVYICSNNIQARQQVIELARQLNFIPIDLGSLSSAREIENLPLRLFTLWRGPVVVAISLATFFFLYSFVRDVIHPYARNQQSDFYKIPIEIVNKTLPIVAITLLSLVYLAGLLAAAYQLYYGTKYRRFPPWLETWLQCRKQLGLLSFFFAMVHVAYSLCLPMRRSERYLFLNMAYQQVHANIENSWNEEEVWRIEMYISFGIMSLGLLSLLAVTSIPSVSNALNWREFSFIQSTLGYVALLISTFHVLIYGWKRAFEEEYYRFYTPPNFVLALVLPSIVILGKIILFLPCISQKLKRIKKGWEKSQFLEEGIGGTIPHVSPERVTVM(SEQ ID NO11)
(12)TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬時(shí)受體電勢陽離子通道、亞家族M、成員4，Genbank登錄號(hào)NM017636，Xu，X.Z.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98(19)10692-10697(2001)，Cell 109(3)397-407(2002)，J.Bio.Chem.278(33)30813-30820(2003))；US2003143557(權(quán)利要求4)；WO200040614(權(quán)利要求14；第100-103頁)；WO200210382(權(quán)利要求1；圖9A)；WO2003042661(權(quán)利要求12)；WO200230268(權(quán)利要求27；第391頁)；US2003219806(權(quán)利要求4)；WO200162794(權(quán)利要求14；圖1A-D)；交叉參考MIM606936；NP_060106.2；NM_017636_11214aaMVVPEKEQSWIPKIFKKKTCTTFIVDSTDPGGTLCQCGRPRTAHPAVAMEDAFGAAVVTVWDSDAHTTEKPTDAYGELDFTGAGRKHSNFLRLSDRTDPAAVYSLVTRTWGFRAPNLVVSVLGGSGGPVLQTWLQDLLRRGLVRAAQSTGAWIVTGGLHTGIGRHVGVAVRDHQMASTGGTKVVAMGVAPWGVVRNRDTLINPKGSFPARYRWRGDPEDGVQFPLDYNYSAFFLVDDGTHGCLGGENRFRLRLESYISQQKTGVGGTGIDIPVLLLLIDGDEKMLTRIENATQAQLPCLLVAGSGGAADCLAETLEDTLAPGSGGARQGEARDRIRRFFPKGDLEVLQAQVERIMTRKELLTVYSSEDGSEEFETIVLKALVKACGSSEASAYLDELRLAVAWNRVDIAQSELFRGDIQWRSFHLEASLMDALLNDRPEFVRLLISHGLSLGHFLTPMRLAQLYSAAPSNSLIRNLLDQASHSAGTKAPALKGGAAELRPPDVGHVLRMLLGKMCAPRYPSGGAWDPHPGQGFGESMYLLSDKATSPLSLDAGLGQAPWSDLLLWALLLNRAQMAMYFWEMGSNAVSSALGACLLLRVMARLEPDAEEAARRKDLAFKFEGMGVDLFGECYRSSEVRAARLLLRRCPLWGDATCLQLAMQADARAFFAQDGVQSLLTQKWWGDMASTTPIWALVLAFFCPPLIYTRLITFRKSEEEPTREELEFDMDSVINGEGPVGTADPAEKTPLGVPRQSGRPGCCGGRCGGRRCLRRWFHFWGAPVTIFMGNVVSYLLFLLLFSRVLLVDFQPAPPGSLELLLYFWAFTLLCEELRQGLSGGGGSLASGGPGPGHASLSQRLRLYLADSWNQCDLVALTCFLLGVGCRLTPGLYHLGRTVLCIDFMVFTVRLLHIFTVNKQLGPKIVIVSKMMKDVFFFLFFLGVWLVAYGVATEGLLRPRDSDFPSILRRVFYRPYLQIFGQIPQEDMDVALMEHSNCSSEPGFWAHPPGAQAGTCVSQYANWLVVLLLVIFLLVANILLVNLLIAMFSYTFGKVQGNSDLYWKAQRYRLIREFHSRPALAPPFIVISHLRLLLRQLCRRPRSPQPSSPALEHFRVYLSKEAERKLLTWESVHKENFLLARARDKRESDSERLKRTSQKVDLALKQLGHIREYEQRLKVLEREVQQCSRVLGWVAEALSRSALLPPGGPPPPDLPGSKD(SEQ ID NO12)
(13)CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎癌衍生生長因子，Genbank登錄號(hào)NP_003203或NM_003212，Ciccodicola，A.等EMBO J.8(7)1987-1991(1989)，Am.J.Hum.Genet.49(3)555-565(1991))；US2003224411(權(quán)利要求1)；WO2003083041(實(shí)施例1)；WO2003034984(權(quán)利要求12)；WO200288170(權(quán)利要求2；第52-53頁)；WO2003024392(權(quán)利要求2；圖58)；WO200216413(權(quán)利要求1；第94-95、105頁)；WO200222808(權(quán)利要求2；圖1)；US5854399(實(shí)施例2；Col 17-18)；US5792616(圖2)；交叉參考MIM187395；NP_003203.1；NM_003212_1188aaMDCRKMARFSYSVIWIMAISKVFELGLVAGLGHQEFARPSRGYLAFRDDSIWPQEEPAIRPRSSQRVPPMGIQHSKELNRTCCLNGGTCMLGSFCACPPSFYGRNCEHDVRKENCGSVPHDTWLPKKCSLCKCWHGQLRCFPQAFLPGCDGLVMDEHLVASRTPELPPSARTTTFMLVGICLSIQSYY(SEQ ID NO13)(14)CD21(CR2(補(bǔ)體受體2)或C3DR(C3d/EB病毒受體)或Hs.73792 Genbank登錄號(hào)M26004，F(xiàn)ujisaku等(1989)J.Bio.Chem.264(4)2118-2125)；Weis J.J.等J.Exp.Med.167，1047-1066，1988；Moore M.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84，9194-9198，1987；Barel M.等Mol.Immunol.35，1025-1031，1998；Weis J.J.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA.83，5639-5643，1986；Sinha S.K.等(1993)J.Immunol.150，5311-5320；WO2004045520(實(shí)施例4)；US2004005538(實(shí)施例1)；WO2003062401(權(quán)利要求9)；WO2004045520(實(shí)施例4)；WO9102536(圖9.1-9.9)；WO2004020595(權(quán)利要求1)；登錄號(hào)P20023；Q13866；Q14212；EMBL；M26004；AAA35786.1。
1033aaMGAAGLLGVFLALVAPGVLGISCGSPPPILNGRISYYSTPIAVGTVIRYSCSGTFRLIGEKSLLCITKDKVDGTWDKPAPKCEYFNKYSSCPEPIVPGGYKIRGSTPYRHGDSVTFACKTNFSMNGNKSVWCQANNMWGPTRLPTCVSVFPLECPALPMIHNGHHTSENVGSIAPGLSVTYSCESGYLLVGEKIINCLSSGKWSAVPPTCEEARCKSLGRFPNGKVKEPPILRVGVTANFFCDEGYRLQGPPSSRCVIAGQGVAWTKMPVCEEIFCPSPPPILNGRHIGNSLANVSYGSIVTYTCDPDPEEGVNFILIGESTLRCTVDSQKTGTWSGPAPRCELSTSAVQCPHPQILRGRMVSGQKDRYTYNDTVIFACMFGFTLKGSKQIRCNAQGTWEPSAPVCEKECQAPPNILNGQKEDRHMVRFDPGTSIKYSCNPGYVLVGEESIQCTSEGVWTPPVPQCKVAACEATGRQLLTKPQHQFVRPDVNSSCGEGYKLSGSVYQECQGTIPWFMEIRLCKEITCPPPPVIYNGAHTGSSLEDFPYGTTVTYTCNPGPERGVEFSLIGESTIRCTSNDQERGTWSGPAPLCKLSLLAVQCSHVHIANGYKISGKEAPYFYNDTVTFKCYSGFTLKGSSQIRCKADNTWDPEIPVCEKETCQHVRQSLQELPAGSRVELVNTSCQDGYQLTGHAYQMCQDAENGIWFKKIPLCKVIHCHPPPVIVNGKHTGMMAENFLYGNEVSYECDQGFYLLGEKKLQCRSDSKGHGSWSGPSPQCLRSPPVTRCPNPEVKHGYKLNKTHSAYSHNDIVYVDCNPGFIMNGSRVIRCHTDNTWVPGVPTCIKKAFIGCPPPPKTPNGNHTGGNIARFSPGMSILYSCDQGYLLVGEALLLCTHEGTWSQPAPHCKEVNCSSPADMDGIQKGLEPRKMYQYGAVVTLECEDGYMLEGSPQSQCQSDHQWNPPLAVCRSRSLAPVLCGIAAGLILLTFLIVITLYVISKHRERNYYTDTSQKEAFHLEAREVYSVDPYNPAS(SEQ ID NO14)(15)CD79b(CD79B、CD79β、IGb(免疫球蛋白相關(guān)β)、B29、Genbank登錄號(hào)NM 000626或11038674，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(2003)100(7)4126-4131，Blood(2002)100(9)3068-3076，Muller等(1992)Eur.J.Immunol.22(6)1621-1625)；WO2004016225(權(quán)利要求2，圖140)；WO2003087768，US2004101874(權(quán)利要求1，第102頁)；WO2003062401(權(quán)利要求9)；WO200278524(實(shí)施例2)；US2002150573(權(quán)利要求5，第15頁)；US5644033；WO2003048202(權(quán)利要求1，第306和309頁)；WO99/558658，US6534482(權(quán)利要求13，圖17A/B)；WO200055351(權(quán)利要求11，第1145-1146頁)；交叉參考MIM147245；NP_000617.1；NM_000626_1229aaMARLALSPVPSHWMVALLLLLSAEPVPAARSEDRYRNPKGSACSRIWQSPRFIARKRGFTVKMHCYMNSASGNVSWLWKQEMDENPQQLKLEKGRMEESQNESLATLTIQGIRFEDNGIYFCQQKCNNTSEVYQGCGTELRVMGFSTLAQLKQRNTLKDGIIMIQTLLIILFIIVPIFLLLDKDDSKAGMEEDHTYEGLDIDQTATYEDIVTLRTGEVKWSVGEHPGQE(SEQ ID NO15)
(16)FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(含有磷酸酶錨定蛋白1a的SH2結(jié)構(gòu)域)、SPAP1B、SPAP1C，Genbank登錄號(hào)NM_030764，Genome Res.13(10)2265-2270(2003)，Immunogenetics 54(2)87-95(2002)，Blood 99(8)2662-2669(2002)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98(17)9772-9777(2001)，Xu，M.J.等(2001)Biochem.Biophys.Res.Commun.280(3)768-775；WO2004016225(權(quán)利要求2)；WO2003077836；WO200138490(權(quán)利要求5；圖18D-1-18D-2)；WO2003097803(權(quán)利要求12)；WO2003089624(權(quán)利要求25)；交叉參考MIM606509；NP_110391.2；NM_030764_1508aaMLLWSLLVIFDAVTEQADSLTLVAPSSVFEGDSIVLKCQGEQNWKIQKMAYHKDNKELSVFKKFSDFLIQSAVLSDSGNYFCSTKGQLFLWDKTSNIVKIKVQELFQRPVLTASSFQPIEGGPVSLKCETRLSPQRLDVQLQFCFFRENQVLGSGWSSSPELQISAVWSEDTGSYWCKAETVTHRIRKQSLQSQIHVQRIPISNVSLEIRAPGGQVTEGQKLILLCSVAGGTGNVTFSWYREATGTSMGKKTQRSLSAELEIPAVKESDAGKYYCRADNGHVPIQSKVVNIPVRIPVSRPVLTLRSPGAQAAVGDLLELHCEALRGSPPILYQFYHEDVTLGNSSAPSGGGASFNLSLTAEHSGNYSCEANNGLGAQCSEAVPVSISGPDGYRRDLMTAGVLWGLFGVLGFTGVALLLYALFHKISGESSATNEPRGASRPNPQEFTYSSPTPDMEELQPVYVNVGSVDVDVVYSQVWSMQQPESSANIRTLLENKDSQVIYSSVKKS(SEQ ID NO16)(17)HER2(ErbB2，Genbank 登錄號(hào)M11730，Coussens L.等Science(1985)230(4730)1132-1139)；Yamamoto T.等Nature 319，230-234，1986；Semba K.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，6497-6501，1985；Swiercz J.M.等J.Cell Biol.165，869-880，2004；Kuhns J.J.等J.Bio.Chem.274，36422-36427，1999；Cho H.-S.等Nature 421，756-760，2003；Ehsani A.等(1993)Genomics 15，426-429；WO2004048938(實(shí)施例2)；WO2004027049(圖1I)；WO2004009622；WO2003081210；WO2003089904(權(quán)利要求9)；WO2003016475(權(quán)利要求1)；US2003118592；WO2003008537(權(quán)利要求1)；WO2003055439(權(quán)利要求29；圖1A-B)；WO2003025228(權(quán)利要求37；圖5C)；WO200222636(實(shí)施例13；第95-107頁)；WO200212341(權(quán)利要求68；圖7)；WO200213847(第71-74頁)；WO200214503(第114-117頁)；WO200153463(權(quán)利要求2；第41-46頁)；WO200141787(第15頁)；WO200044899(權(quán)利要求52；圖7)；WO200020579(權(quán)利要求3；圖2)；US5869445(權(quán)利要求3；第31-38列)；WO9630514(權(quán)利要求2；第56-61頁)；EP1439393(權(quán)利要求7)；WO2004043361(權(quán)利要求7)；WO2004022709；WO200100244(實(shí)施例3；圖4)；登錄號(hào)P04626；EMBL；M11767；AAA35808.1。EMBL；M11761；AAA35808.1。
1255aaMELAALCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTSIISAVVGILLVVVLGVVFGILIKRRQQKIRKYTMRRLLQETELVEPLTPSGAMPNQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYLEDVRLVHRDLAARNVLVKSPNHVKITDFGLARLLDIDETEYHADGGKVPIKWMALESILRRRFTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDSECRPRFRELVSEFSRMARDPQRFVVIQNEDLGPASPLDSTFYRSLLEDDDMGDLVDAEEYLVPQQGFFCPDPAPGAGGMVHHRHRSSSTRSGGGDLTLGLEPSEEEAPRSPLAPSEGAGSDVFDGDLGMGAAKGLQSLPTHDPSPLQRYSEDPTVPLPSETDGYVAPLTCSPQPEYVNQPDVRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERPKTLSPGKNGVVKDVFAFGGAVENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDQDPPERGAPPSTFKGTPTAENPEYLGLDVPV(SEQ ID NO17)(18)NCA(CEACAM6，Genbank登錄號(hào)M18728)；Barnett T.等Genomics 3，59-66，1988；Tawaragi Y.等Biochem.Biophys.Res.Commun.150，89-96，1988；Strausberg R.L.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9916899-16903，2002；WO2004063709；EP1439393(權(quán)利要求7)；WO2004044178(實(shí)施例4)；WO2004031238；WO2003042661(權(quán)利要求12)；WO200278524(實(shí)施例2)；wO200286443(權(quán)利要求27；第427頁)；WO200260317(權(quán)利要求2)；登錄號(hào)P40199；Q14920；EMBL；M29541；AAA59915.1。EMBL；M18728；344aaMGPPSAPPCRLHVPWKEVLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLAHNLPQNRIGYSWYKGERVDGNSLIVGYVIGTQQATPGPAYSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEATGQFHVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAVAFTCEPEVQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNMTLTLLSVKRNDAGSYECEIQNPASANRSDPVTLNVLYGPDVPTISPSKANYRPGENLNLSCHAASNPPAQYSWFINGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYMCQAHNSATGLNRTTVTMITVSGSAPVLSAVATVGITIGVLARVALI(SEQ ID NO18)(19)MDP(DPEP1，Genbank登錄號(hào)BC017023，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.99(26)16899-16903(2002))WO2003016475(權(quán)利要求1)；WO200264798(權(quán)利要求33；第85-87頁)；JP05003790(圖6-8)；WO9946284(圖9)；交叉參考MIM179780；AAH17023.1；BC017023_1411aaMWSGWWLWPLVAVCTADFFRDEAERIMRDSPVIDGHNDLPWQLLDMFNNRLQDERANLTTLAGTHTNIPKLRAGFVGGQFWSVYTPCDTQNKDAVRRTLEQMDVVHRMCRMYPETFLYVTSSAGIRQAFREGKVASLIGVEGGHSIDSSLGVLRALYQLGMRYLTLTHSCNTPWADNWLVDTGDSEPQSQGLSPFGQRVVKELNRLGVLIDLAHVSVATMKATLQLSRAPVIFSHSSAYSVCASRRNVPDDVLRLVKQTDSLVMVNFYNNYISCTNKANLSQVADHLDHIKEVAGARAVGFGGDFDGVPRVPEGLEDVSKYPDLIAELLRRNWTEAEVKGALADNLLRVFEAVEQASNLTQAPEEEPIPLDQLGGSCRTHYGYSSGASSLHRHWGLLLASLAPLVLCLSLL(SEQ ID NO19)(20)IL20Rα(IL20Ra、ZCYTOR7，Genbank登錄號(hào)AF184971)；Clark H.F.等Genome Res.13，2265-2270，2003；Mungall A.J.等Nature 425，805-811，2003；Blumberg H.等Cell 104，9-19，2001；Dumoutier L.等J.Immunol.167，3545-3549，2001；Parrish-Novak J.等J.Bio.Chem.277，47517-47523，2002；Pletnev S.等(2003)Biochemistry 4212617-12624；Sheikh F.等(2004)J.Immunol.172，2006-2010；EP1394274(實(shí)施例11)；US2004005320(實(shí)施例5)；WO2003029262(第74-75頁)；WO2003002717(權(quán)利要求2；第63頁)；WO200222153(第45-47頁)；US2002042366(第20-21頁)；WO200146261(第57-59頁)；WO200146232(第63-65頁)；WO9837193(權(quán)利要求1；第55-59頁)；登錄號(hào)Q9UHF4；Q6UWA9；Q96SH8；EMBL；AF184971；AAF01320.1。
553aaMRAPGRPALRPLPLPPLLLLLLAAPWGRAVPCVSGGLPKPANITFLSINMKNVLQWTPPEGLQGVKVTYTVQYFIYGQKKWLNKSECRNINRTYCDLSAETSDYEHQYYAKVKAIWGTKCSKWAESGRFYPFLETQIGPPEVALTTDEKSISVVLTAPEKWKRNPEDLPVSMQQIYSNLKYNVSVLNTKSNRTWSQCVTNHTLVLTWLEPNTLYCVHVESFVPGPPRRAQPSEKQCARTLKDQSSEFKAKIIFWYVLPISITVFLFSVMGYSIYRYIHVGKEKHPANLILIYGNEFDKRFFVPAEKIVINFITLNISDDSKISHQDMSLLGKSSDVSSLNDPQPSGNLRPPQEEEEVKHLGYASHLMEIFCDSEENTEGTSFTQQESLSRTIPPDKTVIEYEYDVRTTDICAGPEEQELSLQEEVSTQGTLLESQAALAVLGPQTLQYSYTPQLQDLDPLAQEHTDSEEGPEEEPSTTLVDWDPQTGRLCIPSLSSFDQDSEGCEPSEGDGLGEEGLLSRLYEEPAPDRPPGENETYLMQFMEEWGLYVQMEN(SEQ ID NO20)(21)短小蛋白聚糖(BCAN、BEHAB，Genbank登錄號(hào)AF229053)Gary S.C.等Gene 256，139-147，2000；Clark H.F.等Genome Res.13，2265-2270，2003；Strausberg R.L.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA.99，16899-16903，2002；US2003186372(權(quán)利要求11)；US2003186373(權(quán)利要求11)；US2003119131(權(quán)利要求1；圖52)；US2003119122(權(quán)利要求1；圖52)；US2003119126(權(quán)利要求1)；US2003119121(權(quán)利要求1；圖52)；US2003119129(權(quán)利要求1)；US2003119130(權(quán)利要求1)；US2003119128(權(quán)利要求1；圖52)；US2003119125(權(quán)利要求1)；WO2003016475(權(quán)利要求1)；WO200202634(權(quán)利要求1)；911aaMAQLFLPLLAALVLAQAPAALADVLEGDSSEDRAFRVRIAGDAPLQGVLGGALTIPCHVHYLRPPPSRRAVLGSPRVKWTFLSRGREAEVLVARGVRVKVNEAYRFRVALPAYPASLTDVSLALSELRPNDSGIYRCEVQHGIDDSSDAVEVKVKGVVFLYREGSARYAFSFSGAQEACARIGAHIATPEQLYAAYLGGYEQCDAGWLSDQTVRYPIQTPREACYGDMDGFPGVRNYGVVDPDDLYDVYCYAEDLNGELFLGDPPEKLTLEEARAYCQERGAEIATTGQLYAAWDGGLDHCSPGWLADGSVRYPIVTPSQRCGGGLPGVKTLFLFPNQTGFPNKHSRFNVYCFRDSAQPSAIPEASNPASNPASDGLEAIVTVTETLEELQLPQEATESESRGAIYSIPIMEDGGGGSSTPEDPAEAPRTLLEFETQSMVPPTGFSEEEGKALEEEEKYEDEEEKEEEEEEEEVEDEALWAWPSELSSPGPEASLPTEPAAQEKSLSQAPARAVLQPGASPLPDGESEASRPPRVHGPPTETLPTPRERNLASPSPSTLVEAREVGEATGGPELSGVPRGESEETGSSEGAPSLLPATRAPEGTRELEAPSEDNSGRTAPAGTSVQAQPVLPTDSASRGGVAVVPASGDCVPSPCHNGGTCLEEEEGVRCLCLPGYGGDLCDVGLRFCNPGWDAFQGACYKHFSTRRSWEEAETQCRMYGAHLASISTPEEQDFINNRYREYQWIGLNDRTIEGDFLWSDGVPLLYENWNPGQPDSYFLSGENCVVMVWHDQGQWSDVPCNYHLSYTCKMGLVSCGPPPELPLAQVFGRPRLRYEVDTVLRYRCREGLAQRNLPLIRCQENGRWEAPQISCVPRRPARALHPEEDPEGRQGRLLGRWKALLIPPSSPMPGP(SEQ ID NO21)(22)EphB2R(DRT、ERK、Hek5、EPHT3、Tyro5，Genbank登錄號(hào)NM_004442)Chan，J.和Watt，V.M.，Oncogene 6(6)，1057-1061(1991) Oncogene10(5)897-905(1995)，Annu.Rev.Neurosci.21309-345(1998)，Int.Rev.Cytol.196177-244(2000))；WO2003042661(權(quán)利要求12)；WO200053216(權(quán)利要求1；第41頁)；WO2004065576(權(quán)利要求1)；WO2004020583(權(quán)利要求9)；WO2003004529(第128-132頁)；WO200053216(權(quán)利要求1；第42頁)；交叉參考MIM600997；NP_004433.2；NM_004442_1987aaMALRRLGAALLLLPLLAAVEETLMDSTTATAELGWMVHPPSGWEEVSGYDENMNTIRTYQ VCNVFESSQNNWLRTKFIRRRGAHRIHVEMKFSVRDCSSIPSVPGSCKETFNLYYYEADFDSATKTFPNWMENPWVKVDTIAADESFSQVDLGGRVMKINTEVRSFGPVSRSGFYLAFQDYGGCMSLIAVRVFYRKCPRIIQNGAIFQETLSGAESTSLVAARGSCIANAEEVDVPIKLYCNGDGEWLVPIGRCMCKAGFEAVENGTVCRGCPSGTFKANQGDEACTHCPINSRTTSEGATNCVCRNGYYRADLDPLDMPCTTIPSAPQAVISSVNETSLMLEWTPPRDSGGREDLVYNIICKSCGSGRGACTRCGDNVQYAPRQLGLTEPRIYISDLLAHTQYTFEIQAVNGVTDQSPFSPQFASVNITTNQAAPSAVSIMHQVSRTVDSITLSWSQPDQPNGVILDYELQYYEKELSEYNATAIKSPTNTVTVQGLKAGAIYVFQVRARTVAGYGRYSGKMYFQTMTEAEYQTSIQEKLPLIIGSSAAGLVFLIAVVVIAIVCNRRRGFERADSEYTDKLQHYTSGHMTPGMKIYIDPFTYEDPNEAVREFAKEIDISCVKIEQVIGAGEFGEVCSGHLKLPGKREIFVAIKTLKSGYTEKQRRDFLSEASIMGQFDHPNVIHLEGVVTKSTPVMIITEFMENGSLDSFLRQNDGQFTVIQLVGMLRGIAAGMKYLADMNYVHRDLAARNILVNSNLVCKVSDFGLSRFLEDDTSDPTYTSALGGKIPIRWTAPEAIQYRKFTSASDVWSYGIVMWEVMSYGERPYWDMTNQDVINAIEQDYRLPPPMDCPSALHQLMLDCWQKDRNHRPKFGQIVNTLDKMIRNPNSLKAMAPLSSGINLPLLDRTIPDYTSFNTVDEWLEAIKMGQYKESFANAGFTSFDVVSQMMMEDILRVGVTLAGHQKKILNSIQVMRAQMNQIQSVEV(SEQ ID NO22)(23)ASLG659(B7h，Genbank登錄號(hào)AX092328)US20040101899(權(quán)利要求2)；WO2003104399(權(quán)利要求11)；WO2004000221(圖3)；US2003165504(權(quán)利要求1)；US2003124140(實(shí)施例2)；US2003065143(圖60)；WO2002102235(權(quán)利要求13；第299頁)；US2003091580(實(shí)施例2)；WO200210187(權(quán)利要求6；圖10)；WO200194641(權(quán)利要求12；圖7b)；WO200202624(權(quán)利要求13；圖1A-1B)；US2002034749(權(quán)利要求54；第45-46頁)；WO200206317(實(shí)施例2；第320-321頁，權(quán)利要求34；第321-322頁)；WO200271928(第468-469頁)；WO200202587(實(shí)施例1；圖1)；WO200140269(實(shí)施例3；第190-192頁)；WO200036107(實(shí)施例2；第205-207頁)；WO2004053079(權(quán)利要求12)；WO2003004989(權(quán)利要求1)；WO200271928(第233-234、452-453頁)；WO 0116318；282aaMASLGQILFWSIISIIIILAGAIALIIGFGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKKNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKASLCVSSFFAISWALLPLSPYLMLK(SEQ ID NO23)(24)PSCA(前列腺干細(xì)胞抗原前體，Genbank登錄號(hào)AJ297436)Reiter R.E.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95，1735-1740，1998；Gu Z.等Oncogene19，1288-1296，2000；Biochem.Biophys.Res.Commun.(2000)275(3)783-788；WO2004022709；EP1394274(實(shí)施例11)；US2004018553(權(quán)利要求17)；WO2003008537(權(quán)利要求1)；WO200281646(權(quán)利要求1；第164頁)；WO2003003906(權(quán)利要求10；第288頁)；WO200140309(實(shí)施例1；圖17)；US2001055751(實(shí)施例1；圖1b)；WO200032752(權(quán)利要求18；圖1)；WO9851805(權(quán)利要求17；第97頁)；WO9851824(權(quán)利要求10；第94頁)；WO9840403(權(quán)利要求2；圖1B)；登錄號(hào)O43653；EMBL；AF043498；AAC39607.1。
123aaMKAVLLALLMAGLALQPGTALLCYSCKAQVSNEDCLQVENCTQLGEQCWTARIRAVGLLTVISKGCSLNCVDDSQDYYVGKKNITCCDTDLCNASGAHALQPAAAILALLPALGLLLWGPGQL(SEQ ID NO24)(25)GEDA(Genbank登錄號(hào)AY260763)；AAP14954脂肪瘤HMGIC融合伴侶樣蛋白/pid＝AAP14954.1-智人物種智人(人)WO2003054152(權(quán)利要求20)；WO2003000842(權(quán)利要求1)；WO2003023013(實(shí)施例3，權(quán)利要求20)；US2003194704(權(quán)利要求45)；交叉參考GI30102449；AAP14954.1；AY260763_1236aaMPGAAAAAAAAAAAMLPAQEAAKLYHTNYVRNSRAIGVLWAIFTICFAIVNVVCFIQPYWIGDGVDTPQAGYFGLFHYCIGNGFSRELTCRGSFTDFSTLPSGAFKAASFFIGLSMMLIIACIICFTLFFFCNTATVYKICAWMQLTSAACLVLGCMIFPDGWDSDEVKRMCGEKTDKYTLGACSVRWAYILAIIGILDALILSFLAFVLGNRQDSLMAEELKAENKVLLSQYSLE(SEQ ID NO25)(26)BAFF-R(B細(xì)胞活化因子受體、BlyS受體3、BR3，Genbank登錄號(hào)NP_443177.1)；NP_443177 BAFF受體/pid＝NP_443177.1-智人Thompson，J.S.等Science 293(5537)，2108-2111(2001)；WO2004058309；WO2004011611；WO2003045422(實(shí)施例；第32-33頁)；WO2003014294(權(quán)利要求35；圖6B)；WO2003035846(權(quán)利要求70；第615-616頁)；WO200294852(第136-137列)；WO200238766(權(quán)利要求3；第133頁)；WO200224909(實(shí)施例3；圖3)；交叉參考MIM606269；NP_443177.1；NM_052945_1184aaMRRGPRSLRGRDAPAPTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLRTPRPKPAGASSPAPRTALQPQESVGAGAGEAALPLPGLLFGAPALLGLALVLALVLVGLVSWRRRQRRLRGASSAEAPDGDKDAPEPLDKVIILSPGISDATAPAWPPPGEDPGTTPPGHSVPVPATELGSTELVTTKTAGPEQQ(SEQ ID NO26)(27)CD22(B細(xì)胞受體CD22-B同種型，Genbank登錄號(hào)NP-001762.1)；Stamenkovic，I.和Seed，B.，Nature 345(6270)，74-77(1990)；US2003157113；US2003118592；WO2003062401(權(quán)利要求9)；WO2003072036(權(quán)利要求1；圖1)；WO200278524(實(shí)施例2)；交叉參考MIM107266；NP_001762.1；NM_001771_1847aaMHLLGPWLLLLVLEYLAFSDSSKWVFEHPETLYAWEGACVWIPCTYRALDGDLESFILFHNPEYNKNTSKFDGTRLYESTKDGKVPSEQKRVQFLGDKNKNCTLSIHPVHLNDSGQLGLRMESKTEKWMERIHLNVSERPFPPHIQLPPEIQESQEVTLTCLLNFSCYGYPIQLQWLLEGVPMRQAAVTSTSLTIKSVFTRSELKFSPQWSHHGKIVTCQLQDADGKFLSNDTVQLNVKHTPKLEIKVTPSDAIVREGDSVTMTCEVSSSNPEYTTVSWLKDGTSLKKQNTFTLNLREVTKDQSGKYCCQVSNDVGPGRSEEVFLQVQYAPEPSTVQILHSPAVEGSQVEFLCMSLANPLPTNYTWYHNGKEMQGRTEEKVHIPKILPWHAGTYSCVAENILGTGQRGPGAELDVQYPPKKVTTVIQNPMPIREGDTVTLSCNYNSSNPSVTRYEWKPHGAWEEPSLGVLKIQNVGWDNTTIACARCNSWCSWASPVALNVQYAPRDVRVRKIKPLSEIHSGNSVSLQCDFSSSHPKEVQFFWEKNGRLLGKESQLNFDSISPEDAGSYSCWVNNSIGQTASKAWTLEVLYAPRRLRVSMSPGDQVMEGKSATLTCESDANPPVSHYTWFDWNNQSLPHHSQKLRLEPVKVQHSGAYWCQGTNSVGKGRSPLSTLTVYYSPETIGRRVAVGLGSCLAILILAICGLKLQRRWKRTQSQQGLQENSSGQSFFVRNKKVRRAPLSEGPHSLGCYNPMMEDGISYTTLRFPEMNIPRTGDAESSEMQRPPRTCDDTVTYSALHKRQVGDYENVIPDFPEDEGIHYSELIQFGVGERPQAQENVDYVILKH(SEQ ID NO27)
(28)CD79a(CD79A，CD79α，免疫球蛋白相關(guān)α，與Igβ(CD79B)發(fā)生共價(jià)作用并在表面與IgM分子形成復(fù)合物、轉(zhuǎn)導(dǎo)參與B細(xì)胞分化信號(hào)的B細(xì)胞特異性蛋白)蛋白序列全部mpggpgv...dvqleKP(1..226；226aa)，pI4.84，MW25028 TM2[P]基因染色體19q13.2，Genbank登錄號(hào)NP_001774.1；WO2003088808，US20030228319；WO2003062401(權(quán)利要求9)；US2002150573(權(quán)利要求4，第13-14頁)；WO9958658(權(quán)利要求13，圖16)；WO9207574(圖1)；US5644033；Ha等(1992)J.Immunol.148(5)1526-1531；Mueller等(1992)Eur.J.Biochem.221621-1625；Hashimoto等(1994)Immunogenetics 40(4)287-295；Preud’homme等(1992)Clin.Exp.Immunol.90(1)141-146；Yu等(1992)J.Immunol.148(2)633-637；Sakaguchi等(1988)EMBO J.7(11)3457-3464；226aaMPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNGTLIIQNVNKSHGGIYVCRVQEGNESYQQSCGTYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENLYEGLNLDDCSMYEDISRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP(SEQ ID NO28)(29)CXCR5(伯基特淋巴瘤受體1，受CXCL13趨化因子活化的G蛋白偶聯(lián)受體，在淋巴細(xì)胞遷移和體液防御中起作用，在HIV-2感染中、也可能在AIDS、淋巴瘤、骨髓瘤和白血病的發(fā)展中起作用)蛋白序列全部mnypltl...atslttf(1..372；372aa)，pI8.54MW41959TM7[P]基因染色體11q23.3，Genbank登錄號(hào)NP_001707.1；WO2004040000；WO2004015426；US2003105292(實(shí)施例2)；US6555339(實(shí)施例2)；WO200261087(圖1)；WO200157188(權(quán)利要求20，第269頁)；WO200172830(第12-13頁)；WO200022129(實(shí)施例1，第152-153頁，實(shí)施例2，第254-256頁)；WO9928468(權(quán)利要求1，第38頁)；US5440021(實(shí)施例2，第49-52列)；WO9428931(第56-58頁)；WO9217497(權(quán)利要求7，圖5)；Dobner等(1992)Eur.J.Immunol.222795-2799；Barella等(1995)Biochem.J.309773-779；372aaMNYPLTLEMDLENLEDLFWELDRLDNYNDTSLVENHLCPATEGPLMASFKAVFVPVAYSLIFLLGVIGNVLVLVILERHRQTRSSTETFLFHLAVADLLLVFILPFAVAEGSVGWVLGTFLCKTVIALHKVNFYCSSLLLACIAVDRYLAIVHAVHAYRHRRLLSIHITCGTIWLVGFLLALPEILFAKVSQGHHNNSLPRCTFSQENQAETHAWFTSRFLYHVAGFLLPMLVMGWCYVGVVHRLRQAQRRPQRQKAVRVAILVTSIFFLCWSPYHIVIFLDTLARLKAVDNTCKLNGSLPVAITMCEFLGLAHCCLNPMLYTFAGVKFRSDLSRLLTKLGCTGPASLCQLFPSWRRSSLSESENATSLTTF(SEQ ID NO29)(30)HLA-DOB(能與肽結(jié)合并將肽提呈給CD4+T淋巴細(xì)胞的II型MHC分子的β亞基(Ia抗原)的β亞基)蛋白序列全部mgsgwvp...vllpqsc(1..273；273 aa，pI6.56MW30820TM1[P]基因染色體6p21.3，Genbank登錄號(hào)NP_002111.1；Tonnelle等(1985)EMBO J.4(11)2839-2847；Jonsson等(1989)Immunogenetics29(6)411-413；Beck等(1992)J.Mo1.Bio1.228433-441；Strausberg等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA 9916899-16903；Servenius等(1987)J.Bio.Chem.2628759-8766；Beck等(1996)J.Mol.Biol.2551-13；Naruse等(2002)Tissue Antigens 59512-519；WO9958658(權(quán)利要求13，圖15)；US6153408(第35-38列)；US5976551(第168-170列)；US6011146(第145-146列)；Kasahara等(1989)Immunogenetics 30(1)66-68；Larhammar等(1985)J.Bio.Chem.260(26)14111-14119；273aaMGSGWVPWVVALLVNLTRLDSSMTQGTDSPEDFVIQAKADCYFTNGTEKVQFVVRFIFNLEEYVRFDSDVGMFVALTKLGQPDAEQWNSRLDLLERSRQAVDGVCRHNYRLGAPFTVGRKVQPEVTVYPERTPLLHQHNLLHCSVTGFYPGDIKIKWFLNGQEERAGVMSTGPIRNGDWTFQTVVMLEMTPELGHVYTCLVDHSSLLSPVSVEWRAQSEYSWRKMLSGIAAFLLGLIFLLVGIVIQLRAQKGYVRTQMSGNEVSRAVLLPQSC(SEQ ID NO30)(31)P2X5(嘌呤能受體P2X配體-門控離子通道5，受胞外ATP門控的離子通道，可能參與突觸傳遞和神經(jīng)發(fā)生，其缺陷可造成特發(fā)性逼尿肌不穩(wěn)定性的生理病變)蛋白序列全部mgqagck...lephrst(1..422；422aa)，pI7.63，MW47206 TM1[P]基因染色體17p13.3，Genbank登錄號(hào)NP 002552.2；Le等(1997)FEBS Lett.418(1-2)195-199；WO2004047749；WO2003072035(權(quán)利要求10)；Touchman等(2000)Genome Res.10165-173；WO200222660(權(quán)利要求20)；WO2003093444(權(quán)利要求1)；WO2003087768(權(quán)利要求1)；WO2003029277(第82頁)；
422aaMGQAGCKGLCLSLFDYKTEKYVIAKNKKVGLLYRLLQASILAYLVVWVFLIKKGYQDVDTSLQSAVITKVKGVAFTNTSDLGQRIWDVADYVIPAQGENVFFVVTNLIVTPNQRQNVCAENEGIPDGACSKDSDCHAGEAVTAGNGVKTGRCLRRENLARGTCEIFAWCPLETSSRPEEPFLKEAEDFTIFIKNHIRFPKFNFSKSNVMDVKDRSFLKSCHFGPKNHYCPIFRLGSVIRWAGSDFQDIALEGGVIGINIEWNCDLDKAASECHPHYSFSRLDNKLSKSVSSGYNFRFARYYRDAAGVEFRTLMKAYGIRFDVMVNGKGAFFCDLVLIYLIKKREFYRDKKYEEVRGLEDSSQEAEDEASGLGLSEQLTSGPGLLGMPEQQELQEPPEAKRGSSSQKGNGSVCPQLLEPHRST(SEQ ID NO31)(32)CD72(B細(xì)胞分化抗原CD72，Lyb-2)蛋白序列全部maeaity...tafrfpd(1..359；359aa)，pI8.66，MW40225 TM1[P]基因染色體9p13.3，Genbank登錄號(hào)NP_001773.1；WO2004042346(權(quán)利要求65)；WO2003026493(第51-52、57-58頁)；WO200075655(第105-106頁)；Von Hoegen等(1990)J.Immunol.144(12)4870-4877；Strausberg等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA 9916899-16903；359aaMAEAITYADLRFVKAPLKKSISSRLGQDPGADDDGEITYENVQVPAVLGVPSSLASSVLGDKAAVKSEQPTASWRAVTSPAVGRILPCRTTCLRYLLLGLLLTCLLLGVTAICLGVRYLQVSQQLQQTNRVLEVTNSSLRQQLRLKITQLGQSAEDLQGSRRELAQSQEALQVEQRAHQAAEGQLQACQADRQKTKETLQSEEQQRRALEQKLSNMENRLKPFFTCGSADTCCPSGWIMHQKSCFYISLTSKNWQESQKQCETLSSKLATFSEIYPQSHSYYFLNSLLPNGGSGNSYWTGLSSNKDWKLTDDTQRTRTYAQSSKCNKVHKTWSWWTLESESCRSSLPYICEMTAFRFPD(SEQ ID NO32)(33)LY64(淋巴細(xì)胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRR)家族的I型膜蛋白，調(diào)節(jié)B細(xì)胞活化和凋亡，其功能缺失與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的疾病活動(dòng)升高相關(guān))蛋白序列全部mafdvsc...rwkyqhi(1..661；661aa)，pI6.20，MW74147TM1[P]基因染色體5q12，Genbank登錄號(hào)NP_005573.1；US2002193567；WO9707198(權(quán)利要求11，第39-42頁)；Miura等(1996)Genomics38(3)299-304；Miura等(1998)Blood 922815-2822；WO2003083047；WO9744452(權(quán)利要求8，第57-61頁)；WO200012130(第24-26頁)；661aaMAFDVSCFFWVVLFSAGCKVITSWDQMCIEKEANKTYNCENLGLSEIPDTLPNTTEFLEFSFNFLPTIHNRTFSRLMNLTFLDLTRCQINWIHEDTFQSHHQLSTLVLTGNPLIFMAETSLNGPKSLKHLFLIQTGISNLEFIPVHNLENLESLYLGSNHISSIKFPKDFPARNLKVLDFQNNAIHYISREDMRSLEQAINLSLNFNGNNVKGIELGAFDSTVFQSLNFGGTPNLSVIFNGLQNSTTQSLWLGTFEDIDDEDISSAMLKGLCEMSVESLNLQEHRFSDISSTTFQCFTQLQELDLTATHLKGLPSGMKGLNLLKKLVLSVNHFDQLCQISAANFPSLTHLYIRGNVKKLHLGVGCLEKLGNLQTLDLSHNDIEASDCCSLQLKNLSHLQTLNLSHNEPLGLQSQAFKECPQLELLDLAFTRLHINAPQSPFQNLHFLQVLNLTYCFLDTSNQHLLAGLPVLRHLNLKGNHFQDGTITKTNLLQTVGSLEVLILSSCGLLSIDQQAFHSLGKMSHVDLSHNSLTCDSIDSLSHLKGIYLNLAANSINIISPRLLPILSQQSTINLSHNPLDCTCSNIHFLTWYKENLHKLEGSEETTCANPPSLRGVKLSDVKLSCGITAIGIFFLIVFLLLLAILLFFAVKYLLRWKYQHI(SEQ ID NO33)(34)FCRH1(Fc受體樣蛋白1，推測為含有C2型Ig樣和ITAM結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的受體，可能在B-淋巴細(xì)胞分化中起作用)蛋白序列全部mlprlll...vdyedam(1..429；429aa)，pI5.28，MW46925 TM1[P]基因染色體1q21-1q22，Genbank登錄號(hào)NP_443170.1；WO2003077836；WO200138490(權(quán)利要求6，圖18E-1-18-E-2)；Davis等(2001)Proc.Natl.Acad.Sci USA 98(17)9772-9777；WO2003089624(權(quán)利要求8)；EP1347046(權(quán)利要求1)；WO2003089624(權(quán)利要求7)；429aaMLPRLLLLICAPLCEPAELFLIASPSHPTEGSPVTLTCKMPFLQSSDAQFQFCFFRDTRALGPGWSSSPKLQIAAMWKEDTGSYWCEAQTMASKVLRSRRSQINVHRVPVADVSLETQPPGGQVMEGDRLVLICSVAMGTGDITFLWYKGAVGLNLQSKTQRSLTAEYEIPSVRESDAEQYYCVAENGYGPSPSGLVSITVRIPVSRPILMLRAPRAQAAVEDVLELHCEALRGSPPILYWFYHEDITLGSRSAPSGGGASFNLSLTEEHSGNYSCEANNGLGAQRSEAVTLNFTVPTGARSNHLTSGVIEGLLSTLGPATVALLFCYGLKRKIGRRSARDPLRSLPSPLPQEFTYLNSPTPGQLQPIYENVNVVSGDEVYSLAYYNQPEQESVAAETLGTHMEDKVSLDIYSRLRKANITDVDYEDAM(SEQ ID NO34)(35)IRTA2(免疫球蛋白超家族受體易位相關(guān)2，推測在B細(xì)胞發(fā)育和淋巴瘤發(fā)生中可能起作用的免疫受體；在一些B細(xì)胞惡性腫瘤中發(fā)生易位使該基因失調(diào))蛋白序列全部mllwvil...assaphr(1..977；977aa)，pI6.88MW106468TM1[P]基因染色體1q21，Genbank登錄號(hào)NP_112571.1；WO2003024392(權(quán)利要求2，圖97)；Nakayama等(2000)Biochem.Biophys.Res.Commun.277(1)124-127；WO2003077836；WO200138490(權(quán)利要求3，圖18B-1-18B-2)；977aaMLLWVILLVLAPVSGQFARTPRPIIFLQPPWTTVFQGERVTLTCKGFRFYSPQKTKWYHRYLGKEILRETPDNILEVQESGEYRCQAQGSPLSSPVHLDFSSASLILQAPLSVFEGDSVVLRCRAKAEVTLNNTIYKNDNVLAFLNKRTDFHIPHACLKDNGAYRCTGYKESCCPVSSNTVKIQVQEPFTRPVLRASSFQPISGNPVTLTCETQLSLERSDVPLRFRFFRDDQTLGLGWSLSPNFQITAMWSKDSGFYWCKAATMPHSVISDSPRSWIQVQIPASHPVLTLSPEKALNFEGTKVTLHCETQEDSLRTLYRFYHEGVPLRHKSVRCERGASISFSLTTENSGNYYCTADNGLGAKPSKAVSLSVTVPVSHPVLNLSSPEDLIFEGAKVTLHCEAQRGSLPILYQFHHEDAALERRSANSAGGVAISFSLTAEHSGNYYCTADNGFGPQRSKAVSLSITVPVSHPVLTLSSAEALTFEGATVTLHCEVQRGSPQILYQFYHEDMPLWSSSTPSVGRVSFSFSLTEGHSGNYYCTADNGFGPQRSEVVSLFVTVPVSRPILTLRVPRAQAVVGDLLELHCEAPRGSPPILYWFYHEDVTLGSSSAPSGGEASFNLSLTAEHSGNYSCEANNGLVAQHSDTISLSVIVPVSRPILTFRAPRAQAVVGDLLELHCEALRGSSPILYWFYHEDVTLGKISAPSGGGASFNLSLTTEHSGIYSCEADNGPEAQRSEMVTLKVAVPVSRPVLTLRAPGTHAAVGDLLELHCEALRGSPLILYRFFHEDVTLGNRSSPSGGASLNLSLTAEHSGNYSCEADNGLGAQRSETVTLYITGLTANRSGPFATGVAGGLLSIAGLAAGALLLYCWLSRKAGRKPASDPARSPPDSDSQEPTYHNVPAWEELQPVYTNANPRGENVVYSEVRIIQEKKKHAVASDPRHLRNKGSPIIYSEVKVASTPVSGSLFLASSAPHR(SEQ ID NO35)
也參見WO04/045516(2004年6月3日)；WO03/000113(2003年1月3日)；WO02/016429(2002年2月28日)；WO02/16581(2002年2月28日)；WO03/024392(2003年3月27日)；WO04/016225(2004年2月26日)；WO01/40309(2001年6月7日)和2003年11月17日提交的美國臨時(shí)專利申請序列號(hào)60/520842“治療血液來源腫瘤的組合物和方法”(COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OFTUMOR OF HEMATOPOIETIC ORIGIN)；將所有上述文獻(xiàn)以全文納入本文作為參考。
在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述配體-接頭-藥物偶聯(lián)物具有式IIIa，其中配體為抗體Ab，包括至少與CD30、CD40、CD70、Lewis Y抗原，w＝0，y＝0之一結(jié)合的抗體，D具有式Ib。示范性的式IIIa偶聯(lián)物包括R17為-(CH2)5-的偶聯(lián)物。也包括D具有實(shí)施例3中化合物2及其酯結(jié)構(gòu)的式IIIa偶聯(lián)物。也包括式IIIa中含有約3到8個(gè)，在一個(gè)方面約3到5個(gè)藥物部分D的偶聯(lián)物，即其中p值范圍為3到8，如3到5的式Ia偶聯(lián)物。認(rèn)為含有本章節(jié)中注明的結(jié)構(gòu)特征組合的偶聯(lián)物也在本發(fā)明化合物的范圍中。
在另一實(shí)施方式中，所述配體-接頭-藥物偶聯(lián)物具有式IIIa，其中配體為抗體Ab，包括至少與CD30、CD40、CD70、Lewis Y抗原，w＝1，y＝0之一結(jié)合的抗體，D具有式Ib。包括R17為-(CH2)5-的式IIIa偶聯(lián)物。也包括其中W為-Val-Cit-，和/或D具有實(shí)施例3中化合物2及其酯結(jié)構(gòu)的式IIIa偶聯(lián)物。也包括式IIIa中含有約3到8個(gè)，優(yōu)選約3到5個(gè)藥物部分D的偶聯(lián)物，即其中p值范圍為3到8，優(yōu)選3到5的式Ia偶聯(lián)物。含有本章節(jié)中注明的結(jié)構(gòu)特征組合的偶聯(lián)物也是范例。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述配體-接頭-藥物偶聯(lián)物具有式IIIa，其中配體為包含至少與CD30、CD40、CD70、Lewis Y抗原，w＝1，y＝1之一結(jié)合的抗體Ab，D具有式Ib。也包括R17為-(CH2)5-的式IIIa偶聯(lián)物。也包括其中W為-Val-Cit-；Y具有式X；D具有實(shí)施例3中化合物2及其酯的結(jié)構(gòu)；p約為3到8，優(yōu)選約3到5個(gè)藥物部分D的式IIIa偶聯(lián)物。認(rèn)為含有本章節(jié)中注明的結(jié)構(gòu)特征組合的偶聯(lián)物也屬于本發(fā)明化合物的范圍。
又一實(shí)施方式為抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)，或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，其中Ab為與上述腫瘤相關(guān)抗原(1)-(35)之一(TAA化合物)結(jié)合的抗體。
另一實(shí)施方式為TAA化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物的分離純化形式。
另一實(shí)施方式為殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞增殖的方法，包括將一定量TAA化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物給予超增殖疾病患者，所述用量能有效殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞的增殖。
另一實(shí)施方式為治療癌癥的方法，包括將一定量TAA化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物給予超增殖疾病患者，所述用量單獨(dú)或與其它有效量抗癌藥聯(lián)用能有效治療癌癥。
另一實(shí)施方式為治療自身免疫病的方法，包括將一定量TAA化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物給予超增殖疾病患者，所述用量能夠有效治療自身免疫病。
本發(fā)明中適用的抗體可用抗體合成領(lǐng)域的已知方法，具體是化學(xué)合成或重組表達(dá)方法來生產(chǎn)，優(yōu)選用重組表達(dá)技術(shù)生產(chǎn)。
4.5.1重組抗體的生產(chǎn)可用抗體合成領(lǐng)域中已知的方法，具體是化學(xué)合成或重組表達(dá)方法生產(chǎn)本發(fā)明的抗體。
抗體或其片段、衍生物或類似物的重組表達(dá)需要構(gòu)建編碼該抗體的核酸。如果抗體的核苷酸序列已知，編碼抗體的核苷酸可用化學(xué)合成的寡核苷酸組裝(如Kutmeier等，1994，BioTechniques 17242所述)，包括合成含有編碼抗體的部分序列的重疊寡核苷酸，退火和連接這些寡核苷酸，然后通過如PCR擴(kuò)增連接的寡核苷酸。
或者，可由合適來源產(chǎn)生編碼抗體的核酸分子。如果不能買到含有編碼具體抗體的核酸的克隆，但抗體的序列已知，那么可以用能與該序列3’和5’末端雜交的合成引物作PCR擴(kuò)增，或用該具體基因序列的特異性寡核苷酸探針克隆，從合適的來源(如抗體cDNA文庫，或從表達(dá)該免疫球蛋白的組織或細(xì)胞產(chǎn)生的cDNA文庫)獲得編碼該抗體的核酸。
如果特異性識(shí)別某具體抗原的抗體不可購得(或沒有用于克隆編碼此免疫球蛋白的核酸的cDNA文庫來源)，該具體抗原的特異性抗體可通過本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生，如免疫病人或合適的動(dòng)物模型如兔或鼠，以產(chǎn)生多克隆抗體，或更優(yōu)選如Kohler和Milstein(1975，Nature 256495-497)所述，或如Kozbor等(1983，Immunology Today472)或Cole等(1985《單克隆抗體和癌癥治療》(Monoclonal Antibodies and CancerTherapy)，Alan R.Liss，Inc.，第77-96頁)所述產(chǎn)生單克隆抗體?；蛘?，可通過篩選Fab表達(dá)文庫(如Huse等，1989，Science 2461275-1281所述)中能與該具體抗原結(jié)合的Fab片段的克隆或通過篩選抗體文庫(參見例如Clackson等，1991，Nature 352624；Hane等，1997 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 944937)獲得編碼該抗體的至少Fab部分的克隆。
一旦獲得至少編碼該抗體可變區(qū)的核酸序列時(shí)，可將其引入含有編碼該抗體恒定區(qū)核苷酸序列的載體中(參見例如國際公開專利WO 86/05807；WO 89/01036；和美國專利號(hào)5122464)。含有表達(dá)完整抗體分子的完全輕鏈或重鏈的載體可買到。然后，可利用編碼該抗體的核苷酸引入核苷酸取代或缺失，這對取代(或缺失)參與和不含巰基的氨基酸殘基形成鏈內(nèi)二硫鍵的一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)半胱氨酸殘基是必需的。該修飾可通過在核苷酸序列中引入特定突變或缺失的本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行，例如但不限于，化學(xué)誘變和體外定點(diǎn)誘變(Hutchinson等，1978，J.Bio.Chem.2536551)。
此外，可使用開發(fā)的通過剪接具有合適抗原特異性的鼠抗體分子基因與具有合適生物學(xué)活性的人抗體分子基因來產(chǎn)生“嵌合抗體”(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.81851-855；Neuberger等，1984，Nature 312604-608；Takeda等，1985，Nature 314452-454)的技術(shù)。嵌合抗體是不同部分來源于不同種動(dòng)物的分子，如可變區(qū)來源于鼠單克隆抗體，恒定區(qū)來源于人免疫球蛋白，如人源化抗體。
或者，可采取用于生產(chǎn)單鏈抗體所述的技術(shù)(美國專利4,694,778；Bird，1988，Science 242423-42；Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883；和Ward等，1989，Nature 334544-54)來生產(chǎn)單鏈抗體。通過一氨基酸橋連接Fv區(qū)的重鏈和輕鏈片段形成一條多肽鏈，而產(chǎn)生單鏈抗體。亦可采用在大腸桿菌中組裝功能性Fv片段的技術(shù)(Skerra等，1988，Science 2421038-1041)。
可通過已知技術(shù)產(chǎn)生識(shí)別特定表位的抗體片段。例如，此種片段包括但不限于胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab’)2片段和還原F(ab’)2片段二硫鍵橋產(chǎn)生的Fab片段。
一旦獲得編碼抗體的核酸序列時(shí)，可通過重組DNA技術(shù)用本領(lǐng)域熟知技術(shù)產(chǎn)生生產(chǎn)抗體的載體?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法構(gòu)建包含抗體編碼序列和合適轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括例如體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)、體內(nèi)基因重組。參見例如Sambrook等(1990，《分子克隆，試驗(yàn)室手冊》(MolecularCloning，A Laboratory Manual)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY)和Ausubel等(編，1998，《新編分子生物學(xué)試驗(yàn)指南》(Current Protocolsin Molecular Biology)，John Wiley & Sons，NY)所述技術(shù)。
可用常規(guī)方法(如電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和磷酸鈣沉淀)將包含某抗體核苷酸序列的表達(dá)載體或某抗體核苷酸序列轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞中，然后在常規(guī)培養(yǎng)技術(shù)下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞以產(chǎn)生該抗體。在特定實(shí)施方式中，由組成型、可誘導(dǎo)性或組織特異性啟動(dòng)子調(diào)節(jié)該抗體的表達(dá)。
用于表達(dá)重組抗體的宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌，或優(yōu)選真核細(xì)胞，特別是用于表達(dá)整個(gè)重組免疫球蛋白分子時(shí)。具體說，哺乳動(dòng)物細(xì)胞如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)，與諸如人巨細(xì)胞病毒的主要中間早期基因啟動(dòng)子元件的載體結(jié)合，成為免疫球蛋白的有效表達(dá)系統(tǒng)(Foecking等，198，Gene 45101；Cockett等，1990，BioTechnology 82)。
可用各種宿主表達(dá)載體系統(tǒng)表達(dá)免疫球蛋白抗體。此類宿主表達(dá)系統(tǒng)不僅提供了抗體編碼序列可在其中產(chǎn)生接著純化的運(yùn)載體，而且提供了當(dāng)用合適的核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染時(shí)可原位表達(dá)抗體免疫球蛋分子的細(xì)胞。這些系統(tǒng)包括但不限于微生物如用包含免疫球蛋白編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)；用包含免疫球蛋白編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母(如畢赤酵母(Saccharomyces Pichia))；用包含免疫球蛋白編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用包含免疫球蛋白編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(如花椰菜花葉病毒(CaMV)和煙草花葉病毒(TMV))感染的或用包含免疫球蛋白編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或攜帶包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組衍生啟動(dòng)子(如金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子(如腺病毒晚期啟動(dòng)子，牛痘病毒7.5K啟動(dòng)子)的重組表達(dá)構(gòu)建物的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(如COS、CHO、BH、293、293T、3T3細(xì)胞)。
細(xì)菌系統(tǒng)中，根據(jù)所表達(dá)抗體的用途可優(yōu)先選擇數(shù)種表達(dá)系統(tǒng)。例如，當(dāng)大量產(chǎn)生待表達(dá)蛋白時(shí)，可能需要能指導(dǎo)高水平融合蛋白產(chǎn)物表達(dá)并易于純化的載體。此類載體包括但不限于大腸桿菌表達(dá)載體pUR278(Ruther等，1983，EMBO J.21791)，其中將單個(gè)抗體編碼序列與載體的lac Z編碼區(qū)在閱讀框內(nèi)連接從而產(chǎn)生融合蛋白；pIN載體(Inouye & Inouye，1985，Nuceic Acids Res.133101-3109；Van Heeke& Schuster，1989，J.Bio.Chem.245503-5509)等。pGEX載體也可用于表達(dá)外來多肽，如與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白。通常，此類融合蛋白可溶，并可容易地通過吸附和結(jié)合于谷胱甘肽-瓊脂糖珠基質(zhì)然后在游離谷胱甘肽存在下洗脫從裂解細(xì)胞中純化。設(shè)計(jì)pGEX載體，使其包括凝血酶或Xa因子蛋白酶切割位點(diǎn)，以使克隆的靶基因產(chǎn)物能夠從GST部分中釋放出來。
在昆蟲系統(tǒng)中，桃木菌屬(Autographa californica)核多角體病毒(AcNPV)或果蠅(Drosophila Melanogaster)的同類病毒可用作表達(dá)外源基因的載體。此病毒在表皮球菌(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞中生長?？贵w編碼序列能夠被單獨(dú)克隆入病毒的非必需區(qū)(如多角體蛋白基因)中置于AcNPV啟動(dòng)子(如多角體蛋白啟動(dòng)子)的控制下。
在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，可采用許多基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。當(dāng)腺病毒用作表達(dá)載體時(shí)，可將感興趣的抗體編碼序列連接于腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合物，如晚期啟動(dòng)子和三重引導(dǎo)序列。然后，可通過體外或體內(nèi)重組將此嵌合基因插入腺病毒基因組中。插入病毒基因組的非必需區(qū)域(如區(qū)域E1或E3)中產(chǎn)生活的能在感染宿主中表達(dá)免疫球蛋白分子的重組病毒(參見例如Logan & Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81355-359)。也可能需要特定的起始信號(hào)以有效翻譯插入的抗體編碼序列。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子和毗鄰序列。而且，起始密碼子必須處于所需編碼序列的閱讀框中以保證整個(gè)插入物的翻譯。這些外源性翻譯控制信號(hào)和起始密碼子可以是天然或合成的各種來源?？赏ㄟ^加入合適的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件、轉(zhuǎn)錄終止子等增強(qiáng)表達(dá)的效率(參見Bittner等，1987，Methods in Enzymol.15351-544)。
此外，可選擇宿主細(xì)胞系來調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)，或以所需特定方式修飾和加工該基因產(chǎn)物。蛋白產(chǎn)物的這種修飾(如糖基化)和加工(如切割)可能對蛋白功能很重要。不同宿主細(xì)胞中蛋白和基因產(chǎn)物的翻譯后加工和修飾有特征性和特定的機(jī)制?？蛇x擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)以保證正確地修飾和加工表達(dá)的外來蛋白。為此，可使用具有恰當(dāng)加工基因產(chǎn)物的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物、糖基化和磷酸化的細(xì)胞機(jī)制的真核宿主細(xì)胞。這些哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于CHO、VERY、BH、Hela、COS、MDCK、293、293T、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D、CRL7030和Hs578Bst。
優(yōu)選長期高產(chǎn)量生產(chǎn)重組蛋白和穩(wěn)定表達(dá)。例如，可工程改造穩(wěn)定表達(dá)抗體的細(xì)胞系。比起利用包含病毒復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，可用恰當(dāng)表達(dá)調(diào)控元件(如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、序列、轉(zhuǎn)錄終止子和聚腺苷酸化位點(diǎn)等)和可選擇標(biāo)記控制的DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。引入外來DNA后，工程改造的細(xì)胞可在富營養(yǎng)化培養(yǎng)基中生長1-2天，然后換為選擇性培養(yǎng)基。重組質(zhì)粒中的選擇性標(biāo)記提供選擇抗性，并使細(xì)胞將質(zhì)粒穩(wěn)定地整合入它們的染色體中并生長形成斑點(diǎn)，進(jìn)而可克隆并擴(kuò)增成細(xì)胞系。這種方法宜用于改造表達(dá)抗體的細(xì)胞系。這種工程改造的細(xì)胞對于篩選和評價(jià)與該抗體直接或間接相互作用的腫瘤抗原尤其有用。
可使用許多選擇系統(tǒng)，包括但不限于單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977，Cell 11223)，次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Szybalska & Szybalski，192，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48202)和腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Lowy等，1980，Cell 22817)基因，可分別用于tk-，hgprt-或aprt-細(xì)胞。同樣，可利用對代謝物的抗性作為選擇以下基因的基礎(chǔ)DHFR，提供甲氨蝶呤抗性(Wigler等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77357；O’Hare等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781527)；gpt，提供霉酚酸抗性(Mulligan & Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072)；neo，提供氨基葡糖苷G418抗性(Clinical Pharmacy 12488-505；Wu和Wu，1991，Biotherapy 387-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596；Mulligan，1993，Science260926-932；和Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62191-217；May，1993，TIB TECH11(5)155-215)和hygro，提供潮霉素抗性(Santerre等，1984，Gene30147)?？刹捎帽绢I(lǐng)域共知的重組DNA技術(shù)，如Ausubel等(編.，1993，《新編分子生物學(xué)指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons，NY；Kriegler，1990，《基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)，試驗(yàn)室手冊》(Gene Transfer and Expression，ALaboratory Manual)，Stockton Press，NY；和12、13章，Dracopoli等(編)，1994，《新編人類遺傳學(xué)指南》(Current Protocols in Human Genetics)，John Wiley & Sons，NY.；Colberre-Garapin等，1981，J.Mol.Biol.1501)所述。
抗體的表達(dá)水平可通過載體擴(kuò)增得到提高(綜述，參見Bebbington和Hentschel，“在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基于基因擴(kuò)增用載體表達(dá)克隆的基因”(The use of vectors basedon gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells)，刊于DNAcloning，第3卷，(Academic Press，New York，1987))。當(dāng)表達(dá)抗體的載體系統(tǒng)中某標(biāo)記可擴(kuò)增時(shí)，提高宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中抑制劑的水平會(huì)增加該標(biāo)記基因的拷貝數(shù)。因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)與抗體核苷酸序列相連，抗體的產(chǎn)量也會(huì)提高(Crouse等，1983，Mol. Cell.Biol.3257)。
可用兩種表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，第一種載體編碼重鏈衍生的多肽，第二種載體編碼輕鏈衍生的多肽。這兩種載體包含同樣的選擇性標(biāo)記從而使輕鏈和重鏈多肽的表達(dá)相等。或者，可用一個(gè)載體同時(shí)編碼重鏈和輕鏈多肽。此種情況下，應(yīng)將輕鏈置于重鏈之前以避免毒性游離重鏈過量(Proudfoot，1986，Nature 32252；Kohler，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 772197)。重鏈和輕鏈的編碼序列可包括cDNA或基因組DNA。
一旦抗體重組表達(dá)時(shí)，可用本領(lǐng)域已知的抗體純化方法，如層析(如離子交換層析、親和層析尤其是在蛋白A后的特異性抗原親和層析和分子大小排阻柱層析)、離心、差異性溶解，或其它標(biāo)準(zhǔn)的蛋白純化技術(shù)進(jìn)行純化。
在又一示范性實(shí)施方式中，抗體是單克隆抗體。
在任何情況下，雜交抗體具有雙重特異性，優(yōu)選具有對所選半抗原特異性的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)或?qū)Π锌乖?，如腫瘤相關(guān)抗原，自身免疫病相關(guān)抗原、傳染性生物相關(guān)抗原或其它疾病相關(guān)抗原特異性的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。
4.5.2抗體的生產(chǎn)參考抗-CD30抗體說明抗體的生產(chǎn)，但本領(lǐng)域技術(shù)人員明白TNF受體家族其它成員可通過相似方式來生產(chǎn)和修飾。CD30用于抗體生產(chǎn)僅為示范性，并不旨在限制。
用于生產(chǎn)抗體的CD30抗原可為，例如包含所需表位的CD30胞外結(jié)構(gòu)域或其部分的可溶形式?；蛘撸诩?xì)胞表面表達(dá)CD30的細(xì)胞(如L540(具有T細(xì)胞表型的霍奇金淋巴瘤衍生細(xì)胞系)和L428(如具有B細(xì)胞表型的霍奇金淋巴瘤衍生細(xì)胞系))可用于產(chǎn)生抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白可用于產(chǎn)生抗體的CD30的其它形式。
在另一示范性實(shí)施方式中，用于產(chǎn)生抗體的ErbB2抗原可以是，例如包含所需表位的ErbB2胞外結(jié)構(gòu)域或其一部分的可溶形式?；蛘?，在細(xì)胞表面表達(dá)ErbB2的細(xì)胞(如經(jīng)轉(zhuǎn)染過表達(dá)ErbB2的NIH-3T3細(xì)胞；或諸如SK-BR-3等癌細(xì)胞系，參見Stancovski等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888691-8695(1991))可用于產(chǎn)生抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白用于產(chǎn)生抗體的ErbB2的其它形式。
(i)多克隆抗體優(yōu)選用相關(guān)抗原和佐劑多點(diǎn)皮下(sc)或腹腔內(nèi)(ip)注射動(dòng)物產(chǎn)生多克隆抗體?？衫秒p功能試劑或衍生劑，如磺基琥珀酰亞胺馬來酰亞氨基苯甲酰酯(通過半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R和R1是不同烷基的R1N＝C＝NR，將相關(guān)抗原與在待免疫動(dòng)物中具有免疫原性的蛋白，如鑰孔血藍(lán)素、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑偶聯(lián)。
混合如100μg或5μg蛋白或偶聯(lián)物(分別對于兔或鼠)與3體積的福氏完全佐劑，皮內(nèi)多點(diǎn)注射該溶液用抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物免疫動(dòng)物。一個(gè)月后，用1/5到1/10初始量的肽或偶聯(lián)物及福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射作加強(qiáng)免疫。7-14天后動(dòng)物放血并測定血清抗體滴度。加強(qiáng)免疫動(dòng)物，直到滴度達(dá)到平臺(tái)。優(yōu)選用同一抗原與不同蛋白和/或通過不同交聯(lián)劑偶聯(lián)的偶聯(lián)物加強(qiáng)免疫動(dòng)物。也可在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中制備作為蛋白融合物的偶聯(lián)物。同樣，凝聚劑如明礬也適用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
(ii)單克隆抗體單克隆抗體獲自一群基本均一的抗體，即組成群體的抗體除少量天然產(chǎn)生的突變外各個(gè)抗體都相同。因此，修飾語“單克隆”表明抗體的特性不是互補(bǔ)相關(guān)抗體的混合物。
例如，可通過Kohler等，Nature，256495(1975)首先描述的雜交瘤方法或重組DNA方法(美國專利號(hào)4816567)制備單克隆抗體。
在雜交瘤方法中，如上文所述方法免疫小鼠或其他合適的宿主動(dòng)物，如倉鼠，以誘生可產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生與免疫所用蛋白特異性結(jié)合的抗體的淋巴細(xì)胞。另外，可體外免疫淋巴細(xì)胞。利用合適的融合劑，如聚乙二醇，使淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，《單克隆抗體原理和實(shí)踐》(Monoclonal AntibodyPrinciples and Practice，)，第59-103頁(Academic Press，1986))。
接種如此制備的雜交瘤細(xì)胞，并在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基優(yōu)選含有一種或多種抑制不融合的親代骨髓瘤細(xì)胞生長或存活的物質(zhì)。例如，若親代骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤培養(yǎng)基一般包含次黃嘌呤、氨甲喋呤和胸腺密啶核苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)能夠防止HGPRT-缺陷的細(xì)胞生長。
優(yōu)選有效融合、能支持所選抗體產(chǎn)生細(xì)胞穩(wěn)定高水平產(chǎn)生抗體、和對培養(yǎng)基如HAT培養(yǎng)基敏感的骨髓瘤細(xì)胞。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系為鼠骨髓瘤細(xì)胞系，如衍生自從Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，California USA購買的小鼠腫瘤細(xì)胞MOPC-21和MPC-11細(xì)胞，和獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland USA的SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞。人骨髓瘤和鼠-人混雜骨髓瘤細(xì)胞系亦被描述為可用于生產(chǎn)人單克隆抗體(Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；和Brodeur等，《單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)和應(yīng)用》(Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications)，第51-63頁(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。
測定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中產(chǎn)生的針對該抗原的單克隆抗體。雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性優(yōu)選通過免疫沉淀或體外結(jié)合試驗(yàn)，如放射性免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定。單克隆抗體結(jié)合親和力可通過，如Munson等，Anal.Biochem.，107220(1980)所述的斯卡查德分析來(Scatchard analysis)測定。
鑒定雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體具有所需特異性、親和力和/或活性后，可通過有限稀釋法將該克隆亞克隆并用標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)(Goding，《單克隆抗體原理和實(shí)踐》(Monoclonal AntibodyPrinciples and Practice)，第59-103頁(Academic Press，1986))。符合此目的的合適培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細(xì)胞也可作為腹水瘤在動(dòng)物體內(nèi)生長。
通過常規(guī)的抗體純化步驟，如蛋白A-瓊脂糖、羥基磷灰石色譜、凝膠電泳、透析或親和色譜，從培養(yǎng)基、腹水或血清中適當(dāng)?shù)胤蛛x亞克隆分泌的單克隆抗體。
采用常規(guī)方法(如采用能夠特異性結(jié)合編碼鼠抗體輕鏈和重鏈基因的寡核苷酸探針)不難分離和測序編碼單克隆抗體的DNA。雜交瘤細(xì)胞可作為此類DNA的優(yōu)選來源。分離后，可將此DNA置入表達(dá)載體中，然后將載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞、猴COS細(xì)胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，或不產(chǎn)生抗體蛋白的骨髓瘤細(xì)胞中，在重組宿主細(xì)胞中合成單克隆抗體。在細(xì)菌中重組表達(dá)編碼抗體的DNA的綜述包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.，5256-262(1993)和Plückthun，Immunol.Revs.，130151-188(1992)。
在又一實(shí)施方式中，可從用McCafferty等，Nature，348552-554(1990)所述技術(shù)產(chǎn)生的抗體噬菌體文庫中分離單克隆抗體或抗體片段。Clackson等，Nature，352624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)分別描述了利用噬菌體文庫分離鼠和人抗體。后續(xù)出版物描述了通過鏈改組生產(chǎn)高親和力(nM范圍)的人抗體(Marks等，Bio/Technology，10779-783(1992))，以及通過組合感染和體內(nèi)重組方案構(gòu)建非常大的噬菌體文庫(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，212265-2266(1993))。因此，這些技術(shù)可替代傳統(tǒng)的單克隆抗體雜交瘤技術(shù)來分離單克隆抗體。
亦可修飾DNA，例如，用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)編碼序列取代同源的鼠序列(美國專利號(hào)4816567；和Morrison，等(1984)Proc.Natl Acad.Sci.USA 816851)，或?qū)⒎敲庖咔虻鞍锥嚯牡娜炕虿糠志幋a序列共價(jià)連接于免疫球蛋白編碼序列。
一般地，此類非免疫球蛋白多肽用于取代抗體恒定區(qū)，或用于取代抗體的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)，以產(chǎn)生包含對某抗原特異的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)和對另一不同抗原特異的另一抗原結(jié)合位點(diǎn)的嵌合性二價(jià)抗體。
(iii)人源化抗體人源化抗體可含非人來源的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常稱為“輸入”殘基，一般取自“輸入”的可變區(qū)。基本上按照Winter和同事的方法(Jones等，Nature 321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 2391534-1536(1988))，用超變區(qū)序列取代人抗體的相應(yīng)序列進(jìn)行人源化。因此，這類″人源化″抗體是嵌合抗體(美國專利號(hào)4,816,567)，其中大大少于完整人可變區(qū)的部分被非人動(dòng)物的相應(yīng)序列取代。實(shí)際操作中，人源化抗體一般為一些超變區(qū)殘基也許還有一些FR殘基被嚙齒動(dòng)物抗體類似部位的殘基取代的人抗體。
對于制備人源化抗體降低抗原性而言，所用人可變區(qū)，包括重鏈和輕鏈可變區(qū)的選擇非常重要。根據(jù)所謂“最適”方法，用已知的人可變區(qū)序列整個(gè)文庫篩選嚙齒動(dòng)物抗體的可變區(qū)序列。然后，接受與嚙齒動(dòng)物序列最接近的人序列作為人源化抗體的人構(gòu)架區(qū)(Sims等，J.Immunol.，1512296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.，196901(1987))。另一方法利用獲自特定輕鏈或重鏈亞群的所有人抗體的共有序列的特定構(gòu)架區(qū)。同樣的構(gòu)架可用于數(shù)種不同的人源化抗體(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta等，J.Immunol.，1512623(1993))。
在另一實(shí)施方式中，可使人源化抗體保留對抗原的高親和力和其它有利的生物學(xué)性能?？衫糜H代和人源化序列的三維模型分析親代序列和各種概念上的人源化產(chǎn)物的方法制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通?？傻玫?，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的?？捎糜?jì)算機(jī)程序說明和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)。檢視這些顯示物可分析殘基在候選免疫球蛋白序列中的可能功能作用，即分析可能影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合能力的殘基。這樣，選擇并組合接受者和輸入序列的FR殘基，以獲得所需的抗體特性，如提高對靶抗原的親和力。通常，超變區(qū)殘基直接并最充分參與影響抗原結(jié)合。
考慮了各種形式的人源化抗體。例如，人源化抗體可以是抗體片段，如Fab。或者，人源化抗體可為完整抗體，如完整的IgG1抗體。
實(shí)施例描述了示范性人源化抗體Anti-ErbB2抗體的生產(chǎn)。例如，人源化抗體可包含摻入人重鏈可變區(qū)中的非人超變區(qū)殘基，還可包含用Kabat等，《免疫學(xué)感興趣的蛋白序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，公共衛(wèi)生服務(wù)，國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)，Bethesda，MD(1991)所列可變區(qū)編號(hào)系統(tǒng)在選自69H、71H和73H的位置上的構(gòu)架區(qū)(FR)取代。在一個(gè)實(shí)施方式中，人源化抗體在69H、71H和73H的兩個(gè)或全部位置上包含F(xiàn)R取代。另一實(shí)施例描述了從賀賽汀_制劑中制備純化的曲妥珠單抗抗體。
(iv)人抗體可產(chǎn)生作為人源化抗體替代的人抗體。例如，現(xiàn)在有可能產(chǎn)生經(jīng)過免疫后不產(chǎn)生內(nèi)源性免疫球蛋白但能產(chǎn)生人抗體全部組分(repertoire)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠)。例如，據(jù)描述，在嵌合和生殖細(xì)胞系突變的小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失會(huì)完全抑制內(nèi)源性抗體的產(chǎn)生。將人生殖細(xì)胞系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)入此生殖細(xì)胞系突變小鼠中將導(dǎo)致在抗原刺激時(shí)產(chǎn)生人抗體。參見例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551(1993)；Jakobovits等，Nature，362255-258(1993)；Bruggermann等，《免疫學(xué)年鑒》(Year in Immuno.)，733(1993)；和美國專利號(hào)5,591,669、5,589,369和5,545,807。
或者，可利用噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等，Nature 348552-553(1990))在體外從未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因庫產(chǎn)生人抗體和抗體片段。按照此技術(shù)，將抗體V區(qū)基因克隆入絲狀噬菌體如M13或fd的主要或次要包膜蛋白基因的閱讀框內(nèi)，并在噬菌體顆粒表面展示為功能性抗體片段。因?yàn)樵摻z狀顆粒包含噬菌體基因組的一條DNA鏈拷貝，基于抗體功能特性的選擇也導(dǎo)致選出編碼具有這些特性的抗體的基因。因此，噬菌體模擬了B細(xì)胞的一些性能。可以各種方式進(jìn)行噬菌體展示；綜述參見，如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，《結(jié)構(gòu)生物學(xué)的當(dāng)前觀點(diǎn)》(Current Opinion in Structural Biology)3564-571(1993)。V基因節(jié)段的幾種來源可用于噬菌體展示。Clackson等，Nature，352624-628(1991)從衍生自免疫小鼠脾臟的V基因小隨機(jī)組合文庫中分離得到了抗-噁唑酮抗體的多樣性陣列?？蓸?gòu)建未免疫人供體的V基因庫，針對各種抗原(包括自身抗原)的抗體可依照Marks等，J.Mol.Biol.222581-597(1991)，或Griffith等，EMBO J.12725-734(1993)所述技術(shù)分離。參見美國專利號(hào)5565332和5573905。如上所述，體外激活的B細(xì)胞也可產(chǎn)生人抗體(參見美國專利號(hào)5567610和5229275)。人抗CD30抗體見美國專利申請序列號(hào)10/338,366所述。
(v)抗體片段已開發(fā)了產(chǎn)生抗體片段的各種技術(shù)。傳統(tǒng)上，通過蛋白酶水解消化完整抗體產(chǎn)生這些片段(參見例如Morimoto等，Journal of Biochemical and Biophysical Methods24107-117(1992)；和Brennan等，Science，22981(1985))。然而，現(xiàn)在這些片段可直接用重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)。例如，可從上述抗體噬菌體文庫中分離抗體片段。或者，可直接從大腸桿菌中回收Fab′-SH片段，化學(xué)偶聯(lián)形成F(ab′)2片段(Carter等，Bio/Technology 10163-167(1992))。根據(jù)另一方法，F(xiàn)(ab′)2片段可直接分離自重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白產(chǎn)生抗體片段的其它技術(shù)。在其它實(shí)施方式中，所選抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO93/16185；美國專利號(hào)5,571,894；和美國專利號(hào)5,587,458?？贵w片段亦可為“線性抗體”，如美國專利號(hào)5,641,870所述。此類線性抗體片段可以是單特異性或雙特異性的。
(vi)雙特異性抗體雙特異性抗體是對至少兩個(gè)不同表位具有結(jié)合特異性的抗體。示范性的雙特異性抗體可結(jié)合CD30蛋白的兩個(gè)不同表位?；蛘撸?CD30臂可與結(jié)合IgG(FcγR)如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的Fc受體的一條臂組合，以將細(xì)胞防御機(jī)制集中到表達(dá)CD30的細(xì)胞上。雙特異性抗體亦可用于將細(xì)胞毒劑定位于表達(dá)CD30的細(xì)胞。
全長雙特異性抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法基于兩對特異性不同的免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達(dá)(Millstein等，Nature，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重輕鏈的隨機(jī)配對，這些雜交瘤(四體雜交瘤)可能產(chǎn)生10種不同抗體分子的混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常用親和層析步驟純化正確分子相當(dāng)麻煩，且產(chǎn)量低。類似方法公開于WO 93/08829和Traunecker等，EMBO J.，103655-3659(1991)。根據(jù)不同方法，將具有所需結(jié)合特異性的抗體可變區(qū)(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。優(yōu)選與包含至少一部分絞鏈區(qū)、CH2和CH3的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選在至少一個(gè)融合物中存在含有輕鏈結(jié)合所需位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物的DNA和(如果需要)編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同的表達(dá)載體中，共轉(zhuǎn)染入合適的宿主生物體。在構(gòu)建中使用不等比例的三種多肽鏈來優(yōu)化產(chǎn)量時(shí)，以上實(shí)施方案為調(diào)整三種多肽片段的相互比例提供了最大的靈活性。然而，當(dāng)至少兩條多肽鏈以等比例表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)率或它們的比例不具特殊意義時(shí)，可將兩條或全部三條多肽鏈編碼序列插入一個(gè)表達(dá)載體中。
在此方法的一個(gè)實(shí)施方式中，雙特異性抗體由一條臂上有第一結(jié)合特異性的雜交免疫球蛋白重鏈，和另一條臂上的一對雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特異性)組成。發(fā)現(xiàn)此不對稱結(jié)構(gòu)有助于將所需雙特異性化合物與不需要的免疫球蛋白鏈組合物分離，因?yàn)槊庖咔虻鞍纵p鏈僅存在于雙特異性分子的一半中，這提供了容易的分離方式。該方法發(fā)表在WO 94/04690中。產(chǎn)生雙特異性抗體的其它細(xì)節(jié)參見例如Suresh等，Methods in Enzymology，121210(1986)。
按照美國專利號(hào)5,731,168所述另一方法，可工程改造一對抗體分子之間的界面以使從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得異質(zhì)二聚體的比例最大化。優(yōu)選界面包含抗體恒定區(qū)CH3結(jié)構(gòu)域的至少一部分。本方法中，用較大側(cè)鏈(如酪氨酸或色氨酸)取代了第一抗體分子界面的一個(gè)或多個(gè)小側(cè)鏈氨基酸。通過用較小側(cè)鏈氨基酸(如丙氨酸或蘇氨酸)取代大側(cè)鏈氨基酸，在第二抗體分子界面上產(chǎn)生了與大側(cè)鏈尺寸相同或相似的補(bǔ)償性“空穴”。這提供了提高該異質(zhì)二聚體產(chǎn)量超過不需要的終產(chǎn)物如同質(zhì)二聚體的機(jī)制。
文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)了從抗體片段產(chǎn)生雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可用化學(xué)連接鍵制備雙特異性抗體。Brennan等，Science，22981(1985)描述了蛋白酶水解切割完整抗體產(chǎn)生F(ab′)2片段的方法。當(dāng)存在二硫醇復(fù)合劑亞砷酸鈉時(shí)還原這些片段可穩(wěn)定鄰近的二硫醇基團(tuán)并防止分子間形成二硫鍵。然后將產(chǎn)生的Fab′片段轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼趸郊姿猁}(TNB)衍生物。然后，再通過巰基乙二胺還原將一種Fab′-TNB衍生物轉(zhuǎn)變?yōu)镕ab′-硫醇，并將其與等摩爾量的其它Fab′-TNB衍生物混合形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作選擇性固定酶的試劑。
最近的進(jìn)展促進(jìn)從大腸桿菌中直接回收Fab′-SH片段將其化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體。Shalaby等，J.Exp.Med.，175217-225(1992)描述了完全人源化的雙特異性抗體F(ab′)2分子的產(chǎn)生。將大腸桿菌分別分泌的各Fab′片段在體外直接化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性分子。
已描述了從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中直接制備和分離雙特異性抗體片段的各種技術(shù)。例如，用亮氨酸拉鏈產(chǎn)生雙特異性抗體。Kostelny等，J.Immunol.，148(5)1547-1553(1992)。通過基因融合將Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽連接于兩種不同抗體的Fab’部分。在絞鏈區(qū)還原該抗體同質(zhì)二聚體以形成單體，然后再氧化形成抗體異質(zhì)二聚體。此方法也可用于產(chǎn)生抗體同質(zhì)二聚體。Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)所述的″雙抗體″技術(shù)為制造雙特異性抗體片段提供了一種替代機(jī)制。這種片段包含通過一個(gè)接頭與輕鏈可變區(qū)(VL)連接的重鏈可變區(qū)(VH)，但該接頭太短不能使同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域配對。因此，迫使一條片段的VH和VL域與另一片段的互補(bǔ)VL和VH域配對，從而形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。另外，也報(bào)道了用單鏈Fv(sFv)二聚體制備雙特異性抗體片段的另一方案。參見Gruber等，J.Immunol.，1525368(1994)。
也考慮了二價(jià)以上的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt等J.Immunol.14760(1991)。
(vii)其它的氨基酸序列修飾考慮了本文所述的抗體氨基酸序列的修飾。例如，可能需要提高抗體的親和力或其它生物學(xué)性能。通過在抗體核酸中引入合適的核苷酸改變或通過肽合成制備抗體的氨基酸序列變體。這些修飾包括例如缺失和/或插入和/或取代抗體氨基酸序列中的殘基。進(jìn)行缺失、插入和取代的任何組合以達(dá)到最終構(gòu)建物，只要該最終構(gòu)建物具有所需特性。氨基酸變化也會(huì)改變抗體的翻譯后加工，如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)量或位置。
有助于誘變定位的用于鑒定抗體中某些殘基或區(qū)域的方法稱為“丙氨酸掃描誘變”，如Cunningham和Wells Science，2441081-1085(1989)所述。這里，鑒定了一個(gè)殘基或一組靶殘基(如帶電殘基如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或帶負(fù)電氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或聚丙氨酸)取代以影響氨基酸與抗原的相互作用。通過在取代位點(diǎn)引入更多的或其它的變化，精細(xì)確定顯示對這種取代在功能上敏感的氨基酸位置。因此，雖然引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)預(yù)先確定，但突變本身的性質(zhì)無需預(yù)先確定。例如，為了分析在某給定位點(diǎn)產(chǎn)生的突變的性能，在目標(biāo)密碼子或區(qū)域進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)誘變，并篩選表達(dá)的抗體變體是否具有所需活性。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端融合，長度從一個(gè)殘基到包含一百個(gè)或更多殘基的多肽，以及一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入物。末端插入物的例子包括含有N-末端甲硫胺酰殘基的抗體或與細(xì)胞毒性多肽融合的抗體?？贵w分子的其它插入變體包括抗體N-或C-末端與能增加抗體血清半衰期的酶(如ADEPT)或多肽的融合物。
另一變體類型是氨基酸取代變體。這些變體的抗體分子中至少一個(gè)氨基酸殘基被不同殘基取代。最感興趣的取代誘變位點(diǎn)包括超變區(qū)，但也考慮了FR區(qū)改變。
通過選擇對以下性質(zhì)的維持影響顯著不同的取代顯著改變抗體的生物學(xué)性能a)取代區(qū)中多肽骨架結(jié)構(gòu)，如片層或螺旋構(gòu)象，b)分子中靶位點(diǎn)的帶電或疏水性，或c)側(cè)鏈體積。根據(jù)側(cè)鏈的共同性將天然產(chǎn)生的殘基分為以下幾組(1)疏水性正亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸；(2)中性親水性半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸；(3)酸性天冬氨酸、谷氨酸；(4)堿性天冬酰胺、谷胺酰胺、組氨酸、賴氨酸、精氨酸；(5)影響鏈取向的殘基甘氨酸、脯氨酸；和(6)芳族色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。
非保守取代包括將這些組別之一的成員交換為另一組別的成員。
尤其優(yōu)選的取代變體包含取代親代抗體(如人源化或人抗體)超變區(qū)的一個(gè)或多個(gè)殘基。通常，選擇用于進(jìn)一步開發(fā)的所得變體的生物學(xué)性能將比產(chǎn)生它的親代抗體有所改進(jìn)。產(chǎn)生這種取代變體的方便方法包括用噬菌體展示進(jìn)行親和力成熟(affinity maturation)。簡要說，突變幾個(gè)超變區(qū)位點(diǎn)(如6-7個(gè)位點(diǎn))，以在各位點(diǎn)上產(chǎn)生所有可能的氨基取代。以單價(jià)方式展示此法從絲狀噬菌體顆粒產(chǎn)生的抗體變體，與M13基因III產(chǎn)物融合包裝在各顆粒中。然后如本文所述篩選噬菌體展示的變體的生物學(xué)活性(如結(jié)合親合力)。為了鑒定供修飾的超變區(qū)候選位點(diǎn)，可進(jìn)行丙氨酸掃描誘變，以鑒定對抗原結(jié)合起顯著作用的超變區(qū)殘基?；蛘呋虼送?，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)有益于鑒定抗原-抗體之間的接觸點(diǎn)。根據(jù)本文所述技術(shù)，這種接觸殘基和相鄰殘基是取代的候選殘基。一旦產(chǎn)生這種變體，如本文所述篩選一組變體，選出在一個(gè)或多個(gè)相關(guān)試驗(yàn)中性能出色的抗體作進(jìn)一步開發(fā)。
可能需要修飾本發(fā)明抗體的效應(yīng)器功能，以增強(qiáng)該抗體的抗原依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。這可通過在抗體的Fc區(qū)引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代而實(shí)現(xiàn)?；蛘呋虼送?，將半胱氨酸殘基引入Fc區(qū)，從而在此區(qū)形成鏈間二硫鍵。如此產(chǎn)生的同質(zhì)二聚體抗體的內(nèi)化能力提高和/或補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)增加。參見Caron等J.Exp Med.1761191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.1482918-2922(1992)。也可用異質(zhì)雙功能交聯(lián)劑制備具有增強(qiáng)抗腫瘤活性的同質(zhì)二聚體抗體，如Wolff等Cancer Research532560-2565(1993)所述。另外，抗體可被工程改造為具有雙Fc區(qū)，并由此獲得增強(qiáng)的補(bǔ)體胞溶和ADCC能力。參見Stevenson等Anti-Cancer Drug Design3219-230(1989)。
為了增加抗體的血清半衰期，可在抗體中摻入拯救受體結(jié)合表位，如美國專利號(hào)5739277所述。本文所用術(shù)語″拯救受體結(jié)合表位”指負(fù)責(zé)增加IgG分子體內(nèi)血清半衰期的IgG分子(如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc區(qū)中的表位。
(viii)糖基化變體本發(fā)明ADC中的抗體可在其恒定區(qū)的保守位點(diǎn)糖基化(Jefferis和Lund，(1997)Chem.Immunol.65111-128；Wright和Morrison，(1997)TibTECH 1526-32)。免疫球蛋白的寡糖側(cè)鏈會(huì)影響蛋白功能(Boyd等，(1996)Mol.Immunol.3.21311-1318；Wittwe和Howard，(1990)Biochem。294175-4180)，糖蛋白部分之間分子內(nèi)相互作用可影響其構(gòu)象和糖蛋白的三維表面(Hefferis和Lund，同上；Wyss和Wagner，(1996)Current Opin.Biotech.7409-416)。根據(jù)其特異性識(shí)別結(jié)構(gòu)，寡糖也可用于使給定糖蛋白靶向某分子。例如，有報(bào)道稱在半乳糖苷化的IgG中，寡糖部分翻轉(zhuǎn)(flip)出CH2內(nèi)部空間，使末端N-乙酰氨基葡萄糖殘基能夠與甘露糖結(jié)合蛋白相結(jié)合(Malhotra等，(1995)Nature Med.1237-243)。由糖肽酶除去中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)產(chǎn)生的坎帕斯-1H(識(shí)別人淋巴細(xì)胞CDw52抗原的重組人源化鼠單克隆IgG1抗體)中的寡糖導(dǎo)致補(bǔ)體介導(dǎo)的胞溶(CMCL)完全降低(Boyd等，(1996)Mol.Immunol.321311-1318)，然而用神經(jīng)氨酸酶選擇性除去唾液酸殘基不導(dǎo)致DMCL喪失。有報(bào)道稱抗體的糖基化也會(huì)影響抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)。具體說，含有受四環(huán)素調(diào)節(jié)表達(dá)的β(1，4)-N-乙酰葡萄糖轉(zhuǎn)移酶III(GnTIII)，一種催化GlcNAc二分的糖基轉(zhuǎn)移酶的CHO細(xì)胞據(jù)報(bào)道具有改進(jìn)的ADCC活性(Umana等(1999)Mature Biotech.17176-180)。
糖基化抗體一般為N-連接或O-連接。N-連接指糖部分與天冬酰氨殘基的側(cè)鏈相連。三肽序列天冬酰氨-X-絲氨酸和天冬酰氨-X-蘇氨酸(其中X為除脯氨酸外的任一氨基酸)是糖部分與天冬酰氨側(cè)鏈酶促連接的識(shí)別序列。因此，多肽中存在此三肽序列立即產(chǎn)生潛在的糖基化位點(diǎn)。O-連接的糖基化指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一與羥基氨基酸相連，羥基氨基酸中最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，但也可用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。
抗體的糖基化變體是抗體糖基化模式發(fā)生改變的變體。改變意味著該抗體中缺失了一個(gè)或多個(gè)糖部分，增加了一個(gè)或多個(gè)糖部分，改變了糖基化組成(糖基化模式)，糖基化程度等。
可通過改變氨基酸序列，使其包含一個(gè)或多個(gè)上述三肽序列(N-連接的糖基化位點(diǎn))，方便地在抗體中加入糖基化位點(diǎn)。也可通過在原抗體序列中加入或取代一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基(O-連接的糖基化位點(diǎn))來實(shí)現(xiàn)這種改變。類似地，可通過改變抗體天然糖基化位點(diǎn)的氨基酸來去除糖基化位點(diǎn)。
通常通過改變編碼的核苷酸序列改變氨基酸序列。這些方法包括但不限于從天然來源中分離(在天然產(chǎn)生的氨基酸序列變體的情況下)或通過寡核苷酸介導(dǎo)(或定點(diǎn))的誘變、PCR誘變和早期制備的抗體變體或非變體抗體的盒誘變。
也可在不改變氨基酸序列或編碼的核苷酸序列的情況下改變抗體的糖基化(包括糖基化模式)。糖基化很大程度上取決于用來表達(dá)抗體的宿主細(xì)胞。由于用于表達(dá)重組糖蛋白，如作為潛在治療手段的抗體的細(xì)胞類型鮮有天然細(xì)胞，預(yù)計(jì)抗體糖基化模式可能發(fā)生顯著變異。參見例如Hse等，(1997)J.Bio.Chem.2729062-9070。除了選擇宿主細(xì)胞外，在重組產(chǎn)生抗體期間影響糖基化的因素包括生長模式、培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)密度、氧合作用、pH、純化方案等。提出了各種方法來改變特定宿主生物所獲得的糖基化模式，包括引入或過表達(dá)參與寡糖產(chǎn)生的某些酶(美國專利號(hào)5047335；5510261；5278299)?？捎妹?，如內(nèi)切糖苷酶(Endo H)除去糖蛋白上的糖基化，或某些類型的糖基化。此外，可遺傳改造重組宿主細(xì)胞，如使其加工某種類型多糖的能力缺陷。這些技術(shù)和相似技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。
用常規(guī)糖分析技術(shù)，包括凝集素色譜、NMR、質(zhì)譜、HPLC、GPC、單糖組成分析、依次酶促消化和利用高pH陰離子交換色譜根據(jù)所帶電荷分離寡糖的HPAEC-PAD方法，不難分析抗體的糖基化結(jié)構(gòu)。用于分析目的的釋放寡糖方法的也是已知的，包括但不限于酶處理(通常用肽-N-糖苷酶F/內(nèi)切-β-半乳糖苷酶進(jìn)行)，用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膲A性環(huán)境消除以主要釋放O-連接糖結(jié)構(gòu)，和用無水肼釋放N-連接和O-連接寡糖的化學(xué)方法。
4.5.2a篩選抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和細(xì)胞系尤其可用于篩選具有預(yù)防或治療包括Lewis Y、CD30、CD40和CD70等蛋白過表達(dá)疾病或失調(diào)的潛能的抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和細(xì)胞系尤其可用于篩選具有預(yù)防或治療HER2過表達(dá)疾病或失調(diào)的潛能的抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)(US6632979)。篩選有用的ACD可包括將一定劑量范圍的候選ADC給予轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，測定各個(gè)時(shí)間點(diǎn)ADC對所評價(jià)疾病或失調(diào)的作用。或者或此外，如果應(yīng)用，可在接觸疾病誘導(dǎo)物之前或同時(shí)給予該藥物?？上盗泻蛡€(gè)別篩選，或在培養(yǎng)基中平行篩選，或高通量篩選候選ADC。篩選用于預(yù)防或治療疾病或失調(diào)的APC的速度僅受限于合成速率或篩選方法，包括檢測/測定/分析數(shù)據(jù)。
一個(gè)實(shí)施方式是篩選方法，該方法包括(a)將穩(wěn)定的腎細(xì)胞癌細(xì)胞系細(xì)胞植入非人動(dòng)物體內(nèi)，(b)將候選ADC藥物給予該非人動(dòng)物和(c)測定候選藥物抑制由植入細(xì)胞系形成腫瘤的能力。
另一實(shí)施方式是篩選方法，該方法包括(a)使穩(wěn)定的霍奇金病細(xì)胞系細(xì)胞與候選ADC藥物接觸和(b)評價(jià)候選ADC藥物阻斷CD40配體激活的能力。
另一實(shí)施方式是篩選方法，該方法包括(a)使穩(wěn)定的霍奇金病細(xì)胞系細(xì)胞與候選ADC藥物接觸和(b)評價(jià)候選ADC藥物誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的能力。在一個(gè)實(shí)施方式中，評價(jià)候選ADC藥物誘導(dǎo)凋亡的能力。
一個(gè)實(shí)施方式是篩選方法，該方法包括(a)將穩(wěn)定的癌細(xì)胞系細(xì)胞植入非人動(dòng)物體內(nèi)，(b)將候選ADC藥物給予該非人動(dòng)物和(c)測定候選藥物抑制植入細(xì)胞系形成腫瘤的能力。本發(fā)明也涉及篩選用于治療特征為HER2過表達(dá)的疾病或失調(diào)的候選ADC方法，該方法包括(a)使穩(wěn)定的乳腺癌細(xì)胞系細(xì)胞與候選藥物接觸和(b)評價(jià)候選ADC抑制該穩(wěn)定細(xì)胞系生長的能力。
另一實(shí)施方式是篩選方法，該方法包括(a)使穩(wěn)定癌細(xì)胞系細(xì)胞與候選ADC藥物接觸和(b)評價(jià)候選ADC阻斷配體激活HER2的能力。在一個(gè)實(shí)施方式中，評價(jià)候選ADC阻斷調(diào)蛋白結(jié)合的能力。在另一實(shí)施方式中，評價(jià)候選ADC阻斷配體刺激的酪氨酸磷酸化的能力。
另一實(shí)施方式是篩選方法，該方法包括(a)使穩(wěn)定癌細(xì)胞系細(xì)胞與候選ADC藥物接觸和(b)評價(jià)候選ADC誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的能力。在一個(gè)實(shí)施方式中，評價(jià)候選ADC誘導(dǎo)凋亡的能力。
另一實(shí)施方式是篩選方法，該方法包括(a)將候選ADC藥物給予其乳腺細(xì)胞過表達(dá)天然人HER2蛋白或其片段的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，這種轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物含有穩(wěn)定整合入其基因組中的具有天然人HER2生物學(xué)活性的天然人HER2蛋白或其片段的核酸序列，該核酸序列操作性連接有指導(dǎo)其在乳腺中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，并發(fā)育成對抗-HER2抗體治療無反應(yīng)或反應(yīng)差的乳腺腫瘤；或給予攜帶了植入腫瘤的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物；和(b)評價(jià)候選ADC對靶疾病或失調(diào)的作用。所述疾病或失調(diào)可以是但不限于過表達(dá)HER2的癌癥，如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌和膀胱癌。該癌癥優(yōu)選每個(gè)細(xì)胞至少表達(dá)約500,000個(gè)拷貝，更優(yōu)選每個(gè)細(xì)胞至少表達(dá)約2,000,000個(gè)拷貝HER2的乳腺癌。例如，可用本領(lǐng)域熟知和本文所述的試驗(yàn)方法評價(jià)候選ADC藥物誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和/或凋亡的能力。
在一個(gè)實(shí)施方式中，將某劑量范圍的化合物給予轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，并評價(jià)隨時(shí)間推移動(dòng)物對該化合物的生理反應(yīng)來篩選候選ADC。給藥可以是口服，或通過合適的注射，這取決于待評價(jià)化合物的化學(xué)性質(zhì)。在一些情況下，可適當(dāng)?shù)貙⒒衔锱c能提高該化合物藥效的輔助因子聯(lián)合給藥。如果將衍生自所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞系用于篩選治療各種疾病的化合物，可在合適的時(shí)間將測試化合物加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，用合適的生化和/或組織學(xué)試驗(yàn)評價(jià)隨時(shí)間推移所述細(xì)胞對化合物的反應(yīng)。在一些情況下，可適當(dāng)?shù)貙⒏信d趣化合物與能提高該化合物藥效的輔助因子一起加入培養(yǎng)基中。
因此，本文提供了鑒定特異性靶向和結(jié)合靶蛋白的ADC的試驗(yàn)，靶蛋白的存在與細(xì)胞功能異常相關(guān)，并且參與腫瘤發(fā)展因果相關(guān)的細(xì)胞增殖和/或分化的發(fā)病機(jī)理。
為了鑒定阻斷配體活化ErbB(如ErbB2)受體的ADC，可測定化合物阻斷ErbB配體與表達(dá)ErbB(ErbB2)受體(如與另一ErbB受體偶聯(lián)，與感興趣的ErbB受體形成ErbB異質(zhì)寡聚物)的細(xì)胞結(jié)合的能力。例如，可將分離自過表達(dá)HER2的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和經(jīng)轉(zhuǎn)染而表達(dá)另一ErbB受體(HER2與其形成異質(zhì)寡聚物)的細(xì)胞與ADC一起孵育，即一起培養(yǎng)，然后接觸標(biāo)記的ErbB配體。然后，可評價(jià)該化合物阻斷配體與ErbB異質(zhì)寡聚物中的ErbB受體結(jié)合的能力。
例如，候選ADC能否抑制調(diào)蛋白(HRG)與過表達(dá)HER2和從本文所述轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物(如小鼠)建立的乳腺腫瘤細(xì)胞系結(jié)合，可用單層細(xì)胞培養(yǎng)物在冰上，24孔板中進(jìn)行?？蓪⒖笶rbB2單克隆抗體加入各孔中，孵育30分鐘。然后加入125I-標(biāo)記的rHRGβ1177-224(25,000cpm)，繼續(xù)孵育4-16小時(shí)。制得劑量反應(yīng)曲線，計(jì)算感興趣化合物的IC50值(細(xì)胞毒活性)。
或者或此外，可評價(jià)ADC阻斷ErbB配體刺激ErbB異質(zhì)寡聚物中的ErbB受體酪氨酸磷酸化的能力。例如，可將本文所述從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物建立的細(xì)胞系與測試ADC一起孵育，然后用抗-磷酸酪氨酸單克隆抗體(任選地連接有可檢測標(biāo)記)測定ErbB配體依賴性酪氨酸磷酸化活性。美國專利號(hào)5766863所述的激酶受體激活試驗(yàn)也可用于測定ErbB受體激活和化合物對該活性的阻斷。
在一個(gè)實(shí)施方式中，可篩選在MCF7細(xì)胞中抑制p180酪氨酸磷酸化激活HRG的ADC，如下所述。例如，可將從HER2-轉(zhuǎn)基因動(dòng)物建立的細(xì)胞系接種在24孔板中，將化合物加入各孔中，室溫孵育30分鐘；然后將rHRGβ1177-244加入各孔使終濃度為0.2 nM，繼續(xù)孵育約8分鐘。吸去各孔中的培養(yǎng)基，加入100μl SDS樣品緩沖液(5％SDS、25mM DTT和25mM Tris-HCl，pH6.8)終止反應(yīng)?？稍?-12％梯度凝膠(Novex)上對各樣品(25μl)進(jìn)行電泳，然后電泳轉(zhuǎn)移到聚二氟亞乙基膜上。產(chǎn)生抗-磷酸酪氨酸(1μg/ml)免疫印跡顯色，用反射光密度計(jì)定量主要反應(yīng)條帶的Mr-180,000強(qiáng)度。評價(jià)受體磷酸化抑制的替代方法是Sadick等(1998)Jour.of Pharm.and Biomed.Anal.所述的KIRA(激酶受體激活)試驗(yàn)。一些良好建立的已知能抑制p180酪氨酸磷酸化激活HRG的抗HER2單克隆抗體可用作此試驗(yàn)中的陽性對照?？芍苽溆煞瓷涔饷芏扔?jì)測定的抑制p180酪氨酸磷酸化激活HRG的劑量反應(yīng)曲線，計(jì)算感興趣化合物的IC50。
也可評價(jià)測試ADC對衍生自HER2-轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞系的生長抑制作用，如Schaefer等(1997)Oncogene151385-1394所述。根據(jù)此試驗(yàn)，可用各種濃度的測試化合物處理細(xì)胞4天，用結(jié)晶紫或氧化還原染料Alamar藍(lán)染色。與化合物一起孵育可顯示它對此細(xì)胞系的生長抑制作用類似于單克隆抗體2C4對MDA-MB-175細(xì)胞所顯示的作用(Schaefer等，同上)。在又一實(shí)施方式中，外源性HRG不會(huì)顯著逆轉(zhuǎn)此種抑制。
為鑒定特異性靶向感興趣抗原的生長抑制性化合物，可篩檢化合物能否抑制衍生自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的過表達(dá)感興趣抗原的癌細(xì)胞生長，進(jìn)行美國專利號(hào)5677171所述試驗(yàn)。根據(jù)此試驗(yàn)，在補(bǔ)充10％胎牛血清、谷胺酰胺和青霉素鏈霉素的F12和DMEM培養(yǎng)基的11混合物中培養(yǎng)過表達(dá)感興趣抗原的癌細(xì)胞。將20,000個(gè)細(xì)胞接種于35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿(2ml/35mm皿)中，加入各種濃度的測試化合物。6天后，用電子COULTERTM細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，與未處理細(xì)胞相比。抑制約20-100％或約50-100％細(xì)胞生長的化合物可選擇為生長抑制性化合物。
為了選擇誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的化合物，可與對照相比評估膜完整性喪失，如PI、臺(tái)盼藍(lán)或7AAD攝取試驗(yàn)所示。PI攝取試驗(yàn)采用分離自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的感興趣腫瘤組織的細(xì)胞。根據(jù)此試驗(yàn)，在補(bǔ)充10％熱滅活的FBS(Hyclone)和2mM L-谷胺酰胺的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(D-MEM)Ham′s F-12(5050)中培養(yǎng)細(xì)胞。因此，在沒有補(bǔ)體和免疫效應(yīng)細(xì)胞的情況下進(jìn)行該試驗(yàn)。將這些細(xì)胞以每皿3×106個(gè)的密度接種于100×20mm皿中，使其貼壁過夜。然后去除培養(yǎng)基，僅用新鮮培養(yǎng)基或含有各種濃度的化合物的培養(yǎng)基換液。孵育細(xì)胞3天。各處理后，用PBS洗滌單層(細(xì)胞)，胰酶消化脫附。然后1200rpm、4℃離心細(xì)胞5分鐘，將沉淀重懸于3ml冰冷的Ca2+結(jié)合緩沖液(10mM Hepes，pH7.4，140mM NaCl，2.5mM CaCl2)中，等份分裝到35mm有篩網(wǎng)蓋子的12×75mm試管中(每管1ml，每處理組3管)，以去除細(xì)胞團(tuán)。然后將PI加入試管中(10μg/ml)。用FACSCANTM流式細(xì)胞儀和FACSCONVERTTMCellQuest軟件(Becton Dickinson)分析樣品。通過PI攝取測定的誘導(dǎo)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平細(xì)胞死亡的化合物可選擇為細(xì)胞死亡誘導(dǎo)化合物。
為了選擇誘導(dǎo)凋亡的化合物，用從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的感興趣腫瘤組織建立的細(xì)胞進(jìn)行膜聯(lián)蛋白結(jié)合試驗(yàn)。培養(yǎng)細(xì)胞，接種于平皿，如前一段所述。然后去除培養(yǎng)基，僅用新鮮培養(yǎng)基或含有10μg/ml抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)的培養(yǎng)基換液。孵育3天后，用PBS洗滌單層(細(xì)胞)，胰酶消化脫附。然后如上所述離心細(xì)胞，重懸于Ca2+結(jié)合緩沖液中，等份分裝入試管中，用于細(xì)胞死亡試驗(yàn)。然后將標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白(如膜聯(lián)蛋白V-FITC)(1μg/ml)加入試管中。用FACSCANTM流式細(xì)胞儀和FACSCONVERTTMCellQuest軟件(Becton Dickinson)分析樣品。與對照相比誘導(dǎo)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平膜聯(lián)蛋白結(jié)合的化合物選擇為凋亡誘導(dǎo)化合物。
4.5.3體外細(xì)胞增殖試驗(yàn)通常，用以下方法測定抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)的細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制活性在細(xì)胞培養(yǎng)基中使具有受體蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞接觸ADC的抗體；培養(yǎng)細(xì)胞約6小時(shí)～5天；測定細(xì)胞活力。用基于細(xì)胞的體外試驗(yàn)測定本發(fā)明ADC引起的活力(增殖)、細(xì)胞毒性和凋亡誘導(dǎo)(胱冬酶激活)。
用細(xì)胞增殖試驗(yàn)測定抗體-藥物偶聯(lián)物的體外效果(實(shí)施例18，圖7-10)。CellTiter-Glo_發(fā)光細(xì)胞活力試驗(yàn)(試劑盒)可購得(Promega Corp.，Madison，WI)，同類試驗(yàn)方法依據(jù)鞘翅目熒光素酶的重組表達(dá)(美國專利號(hào)5583024；5674713和5700670)。此細(xì)胞增殖試驗(yàn)根據(jù)作為代謝活性細(xì)胞指標(biāo)的ATP存在量測定培養(yǎng)物中活細(xì)胞的數(shù)量(Crouch等(1993)J.Immunol.Meth.16081-88，美國專利號(hào)6602677)。在96孔板中進(jìn)行CellTiter-Glo_試驗(yàn)，使其適應(yīng)自動(dòng)化高通量篩選(HTS)(Cree等(1995)Anticancer Drugs 6398-404)。同類試驗(yàn)方法包括將一種試劑(CellTiter-Glo_試劑)直接加入培養(yǎng)在補(bǔ)充血清培養(yǎng)基的細(xì)胞中。不需要洗滌細(xì)胞、去除培養(yǎng)基和多次移液操作步驟。加入試劑混合后，該系統(tǒng)可在384孔板中10分鐘內(nèi)檢測到少至15細(xì)胞/孔。可用ADC連續(xù)處理細(xì)胞，或者處理后使細(xì)胞與ADC分離。通常，簡單地處理細(xì)胞即3小時(shí)，與連續(xù)處理細(xì)胞顯示效果相同。
同類的″加入-混合-測定″模式導(dǎo)致細(xì)胞裂解和產(chǎn)生與ATP存在量成比例的發(fā)光信號(hào)。ATP量與培養(yǎng)基中存在的細(xì)胞數(shù)量成正比。CellTiter-Glo_試驗(yàn)產(chǎn)生″熒光型″發(fā)光信號(hào)，由熒光素酶反應(yīng)產(chǎn)生，其半衰期通常大于5小時(shí)，這取決于所用細(xì)胞類型和培養(yǎng)基。以相對發(fā)光單位(RLU)反映活細(xì)胞數(shù)。底物甲蟲熒光素經(jīng)重組螢火蟲熒光素酶的氧化而脫羧，伴隨ATP轉(zhuǎn)化為AMP并產(chǎn)生光子。延長的半衰期不需要用試劑注射器，為連續(xù)或分批模式處理多塊板提供了靈活性。此細(xì)胞增殖試驗(yàn)可用于各種多孔板，如96或384孔板?？捎冒l(fā)光計(jì)或CCD照相機(jī)攝像裝置記錄數(shù)據(jù)。發(fā)光輸出表示為隨時(shí)間測定的相對光單位(RLU)。
用細(xì)胞增殖試驗(yàn)，上述四種不同乳腺腫瘤細(xì)胞系的體外細(xì)胞殺傷試驗(yàn)(圖7-10)測定抗體-藥物偶聯(lián)物的抗增殖作用。確立已知過表達(dá)HER2受體蛋白的SK-BR-3和BT-474的IC50值。表2a顯示在細(xì)胞增殖試驗(yàn)中示范性抗體-藥物偶聯(lián)物對SK-BR-3細(xì)胞的效果(IC50)測量值。表2b顯示在細(xì)胞增殖試驗(yàn)中示范性抗體-藥物偶聯(lián)物對BT-474細(xì)胞的效果(IC50)測量值。
抗體-藥物偶聯(lián)物曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAF，3.8MMAF/Ab；曲妥珠單抗-MC-(N-Me)vc-PAB-MMAF，3.9MMAF/Ab；曲妥珠單抗-MC-MMAF，4.1MMAF/Ab；曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAE，4.1MMAE/Ab；曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAE，3.3MMAE/Ab和曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAF，3.7MMAF/Ab不抑制MCF-7細(xì)胞的增殖(圖9)。
抗體-藥物偶聯(lián)物曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAE，4.1MMAE/Ab；曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAE，3.3MMAE/Ab 曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAF，3.7MMAF/Ab；曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAF，3.8MMAF/Ab；曲妥珠單抗-MC-(N-Me)vc-PAB-MMAF，3.9MMAF/Ab和曲妥珠單抗-MC-MMAF，4.1MMAF/Ab不抑制MDA-MB-468細(xì)胞的增殖(圖10)。
MCF-7和MDA-MB-468細(xì)胞不過表達(dá)HER2受體蛋白。因此，本發(fā)明的抗HER2抗體-藥物偶聯(lián)物顯示只選擇性抑制表達(dá)HER2的細(xì)胞。
表2a SK-BR-3細(xì)胞
表2b BT474細(xì)胞
H＝曲妥珠單抗7C2＝結(jié)合與曲妥珠單抗不同表位的抗-HER2鼠抗體。
Fc8＝不結(jié)合FcRn的突變體Hg＝“無鉸鏈”的全長人源化4D5，其重鏈鉸鏈區(qū)的半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸。在大腸桿菌中表達(dá)(因此非糖基化)。
抗TF Fab＝抗組織因子抗體片段*對MDA-MB-468細(xì)胞的活性令人驚訝和出乎意料地發(fā)現(xiàn)，表2a和2b中ADC的體外細(xì)胞增殖活性結(jié)果總地顯示出，每個(gè)抗體的平均藥物部分?jǐn)?shù)量低的ADC也顯示了藥效，如IC50＜0.1μgADC/ml。該結(jié)果說明至少對于曲妥珠單抗ADC來說，每個(gè)抗體的藥物部分的最佳比例可小于8，可約為2～5。
4.5.4體內(nèi)血漿清除率和穩(wěn)定性在大鼠和食蟹猴中研究了ADC的藥代動(dòng)力學(xué)血漿清除率和穩(wěn)定性。測量隨時(shí)間推移的血漿濃度。表2c顯示抗體-藥物偶聯(lián)物和其它給藥樣品在大鼠中的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。大鼠是ErbB受體抗體的非特異性模型，因?yàn)橐阎笫蟛槐磉_(dá)HER2受體蛋白。
表2c大鼠中的藥代動(dòng)力學(xué)特性H＝曲妥珠單抗通過半胱氨酸[cys]連接，除非另有說明劑量2mg/kg，除非另有說明
AUCinf是從給藥到無限時(shí)間的血漿濃度時(shí)間曲線下面積，是對測量物(藥物，ADC)的總接觸的一種衡量。CL定義為單位時(shí)間中被清除的測量物的血漿體積，通過體重標(biāo)準(zhǔn)化表示。T1/2期是藥物在體內(nèi)消除期間的半衰期。偶聯(lián)物％是與所檢測的總抗體相比，ADC的相對量，用獨(dú)立ELISA免疫親和試驗(yàn)檢測(“生物技術(shù)產(chǎn)品的分析方法”(Analytical Methods for Biotechnology Products)，F(xiàn)erraiolo等，第85-98頁，刊于《藥物的藥代動(dòng)力學(xué)特性》(Pharmacokinetics of Drugs)(1994)P.G.Welling和L.P.Balant編，《試驗(yàn)藥理學(xué)手冊》(Handbook of Experimental Pharmacology)，第110卷，Springer-Verlag測定。偶聯(lián)物％的計(jì)算簡單，為ADC的AUCinf÷總抗體的AUCinf，是接頭穩(wěn)定性的通用指標(biāo)，盡管其它因素和機(jī)制也可能起作用。
圖11顯示將抗體-藥物偶聯(lián)物H-MC-vc-PAB-MMAF-TEG和H-MC-vc-PAB-MMAF給予Sprague-Dawley大鼠后的血漿濃度清除率研究圖。測量了隨時(shí)間推移的總抗體和ADC的濃度。
圖12顯示以不同劑量給予ADC時(shí)兩階段血漿濃度清除率研究圖，測量了隨時(shí)間推移的總抗體和ADC的濃度。
體內(nèi)藥效用高表達(dá)HER2的轉(zhuǎn)基因外植體小鼠模型測量了本發(fā)明ADC的體內(nèi)藥效。在對賀賽汀_治療無反應(yīng)或反應(yīng)差的Fo5mmtv轉(zhuǎn)基因小鼠中增殖獲得同種異體移植物。用ADC處理對象一次，監(jiān)測該對象3-6周，測定腫瘤加倍的時(shí)間、細(xì)胞殺傷的對數(shù)和腫瘤縮小。然后進(jìn)行劑量反應(yīng)和多劑量試驗(yàn)。
腫瘤在表達(dá)neu的突變激活形式的轉(zhuǎn)基因小鼠中容易生長，HER2的大鼠同源物而不是在乳腺癌中過表達(dá)的HER2未發(fā)生突變，在過表達(dá)非突變HER2的轉(zhuǎn)基因小鼠中腫瘤形成能力小得多(Webster等(1994)Semin.Cancer Biol.569-76)。
為增強(qiáng)非突變HER2的腫瘤形成，用HER2 cDNA質(zhì)粒產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠，該質(zhì)粒中，上游ATG缺失而防止了上游ATG密碼子啟動(dòng)的翻譯，否則會(huì)降低下游真正的HER2啟動(dòng)子的翻譯起始頻率(例如，參見Child等(1999)J.Bio.Chem.27424335-24341)。此外，將一種嵌合內(nèi)含子加在5’端，也應(yīng)能增強(qiáng)表達(dá)水平，如以前的報(bào)道(Neuberger和Williams(1988)Nucleic Acids Res.166713；Buchman和Berg(1988)Mol.Cell.Biol.84395；Brinster等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85836)所述。該嵌合內(nèi)含子衍生自Promega的載體，pCI-neo哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(bp890-1022)。此cDNA 3’-端側(cè)接有人生長激素外顯子4和5，以及聚腺苷酸序列。而且，使用FVB小鼠，因?yàn)樵撈废的茌^易生長腫瘤。采用MMTV-LTR啟動(dòng)子保證HER2在乳腺中組織特異性表達(dá)。用AIN 76A飼養(yǎng)動(dòng)物，以提高其腫瘤形成的易感性(Rao等(1997)Breast Cancer Res.and Treatment 45149-158)。
表2d在同種異體移植物小鼠模型-MMTV-HER2 Fo5乳腺腫瘤，無胸腺裸小鼠中測量的腫瘤在第1天(T＝0)單劑量，除非另有說明H＝通過半胱氨酸[cys]連接的曲妥珠單抗，除非另有說明
7C2＝結(jié)合與曲妥珠單抗不同表位的抗-HER2鼠抗體。
Fc8＝不結(jié)合FcRn的突變體Hg＝“無鉸鏈”的全長人源化4D5，其重鏈鉸鏈區(qū)的半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸。在大腸桿菌中表達(dá)(因此非糖基化)。
2H9＝抗EphB2R11D10＝抗0772P術(shù)語Ti是在T＝0時(shí)研究組中患有腫瘤的動(dòng)物數(shù)÷該組總動(dòng)物數(shù)。術(shù)語PR是腫瘤部份緩解的動(dòng)物數(shù)÷在T＝0時(shí)該組患有腫瘤的動(dòng)物數(shù)。術(shù)語CR是腫瘤完全緩解的動(dòng)物數(shù)÷在T＝0時(shí)該組患有腫瘤的動(dòng)物數(shù)。術(shù)語“Log細(xì)胞殺傷”是腫瘤體積加倍的時(shí)間天數(shù)減去對照腫瘤體積加倍的時(shí)間天數(shù)除以3.32乘對照動(dòng)物(給予運(yùn)載體)腫瘤體積加倍的時(shí)間。Log細(xì)胞殺傷的計(jì)算考慮了因治療所致的腫瘤生長延遲和對照組的腫瘤體積加倍時(shí)間。利用Log細(xì)胞殺傷的值將ADC的抗腫瘤活性分為++++≥3.4(高活性)+++ ＝2.5-3.4++ ＝1.7-2.4+ ＝1.0-1.6無活性＝0圖13顯示在第0天給予攜帶MMTV-HER2 Fo5乳腺腫瘤同種異體移植物的無胸腺裸小鼠以下物質(zhì)后平均腫瘤體積隨時(shí)間的改變運(yùn)載體、曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAE(1250μg/m2)和曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAF(555μg/m2)。(H＝曲妥珠單抗)。與對照(運(yùn)載體)生長水平相比，ADC治療延遲了腫瘤生長。圖14顯示在第0天給予攜帶MMTV-HER2 Fo5乳腺腫瘤同種異體移植物的無胸腺裸小鼠10mg/kg(660μg/m2)曲妥珠單抗-MC-MMAE和1250μg/m2曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAE后平均腫瘤體積隨時(shí)間的改變。圖15顯示在第0天給予攜帶MMTV-HER2 Fo5乳腺腫瘤同種異體移植物的無胸腺裸小鼠650μg/m2曲妥珠單抗-MC-MMAF后平均腫瘤體積隨時(shí)間的改變。表2d和圖13-15顯示ADC在最初來源于MMTV-HER2轉(zhuǎn)基因小鼠的HER2陽性腫瘤(Fo5)的同種異體移植物中具有強(qiáng)抗腫瘤活性。在此模型中，單用抗體(如曲妥珠單抗)不具有顯著的抗腫瘤活性(Erickson等美國專利號(hào)6632979)。如圖13-15所示，與對照(運(yùn)載體)生長水平相比，ADC治療延遲了腫瘤生長。
令人驚訝和出乎意料地發(fā)現(xiàn)，表2d中ADC的體內(nèi)抗腫瘤活性結(jié)果總地表明，每個(gè)抗體的平均藥物部分?jǐn)?shù)量少的ADC也顯示具有效果，如腫瘤加倍時(shí)間＞15天和細(xì)胞殺傷的對數(shù)平均值＞1.0。圖1顯示對于此抗體-藥物偶聯(lián)物曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAF而言，平均腫瘤體積減小，在MMAF曲妥珠單抗比為2和4時(shí)腫瘤不發(fā)展，而當(dāng)該比為5.9和6時(shí)腫瘤發(fā)展，但發(fā)展速度低于運(yùn)載體(緩沖液)。在此種小鼠異種移植模型中腫瘤發(fā)展速度大約相同，即運(yùn)載體和曲妥珠單抗都是3天。該結(jié)果提示至少對于曲妥珠單抗ADC來說，每個(gè)抗體的藥物部分最佳比例可小于8，可約為2～4。
4.5.5嚙齒動(dòng)物毒性在急性毒性大鼠模型中評價(jià)抗體-藥物偶聯(lián)物和ADC-陰性對照“運(yùn)載體”。用ADC治療雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠，然后觀察和分析其對各種器官的作用研究ADC毒性。粗觀察結(jié)果包括體重改變以及病損和出血跡象。對給藥動(dòng)物進(jìn)行臨床病理學(xué)參數(shù)(血清化學(xué)成分和血液學(xué))、組織病理學(xué)和尸體檢查。
考慮到相對于僅給予運(yùn)載體的動(dòng)物，給予ADC后動(dòng)物的體重?fù)p失或體重改變是全身性或局部毒性的一種粗通用指標(biāo)。圖17-19顯示給予各種劑量ADC和對照(運(yùn)載體)后對大鼠體重的作用。
通過肝臟酶增加、有絲分裂細(xì)胞數(shù)和凋亡圖像以及肝細(xì)胞壞死數(shù)量增加衡量肝毒性。通過白細(xì)胞、主要粒細(xì)胞(中性粒細(xì)胞)和/或血小板的消耗，以及涉及的淋巴器官，即萎縮或凋亡活性來觀察血液淋巴毒性。也通過胃腸道病損如有絲分裂細(xì)胞數(shù)增加和凋亡圖像以及退行性結(jié)腸炎觀察毒性。
所研究的表明肝臟損傷的酶包括AST(天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)-定位胞質(zhì)；肝臟、心臟、骨骼肌、腎臟-肝臟血漿比為7000∶1-T1/217小時(shí)ALT(丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶)-定位胞質(zhì)；肝臟、腎臟、心臟、骨骼肌-肝臟血漿比為3000∶1-T1/242小時(shí)；晝夜變化GGT(g-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶)-定位分泌或吸收能力高的細(xì)胞質(zhì)膜；肝臟、腎臟、腸-肝損傷的較差預(yù)示物；通常在膽管疾病中升高在雌性Sprague-Dawley大鼠中研究曲妥珠單抗-MC-val-cit-MMAF、曲妥珠單抗-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF、曲妥珠單抗-MC-MMAF和曲妥珠單抗-MC-val-cit-PAB-MMAF的毒性特征(實(shí)施例19)。人源化曲妥珠單抗抗體一點(diǎn)也不與大鼠組織結(jié)合，認(rèn)為任何毒性都是非特異性的。將劑量水平為840和2105μg/m2MMAF的變體與2105ug/m2曲妥珠單抗-MC-val-cit-PAB-MMAF作比較。
第1、2、3、4、6和7組(分別為運(yùn)載體、9.94 & 24.90mg/kg曲妥珠單抗-MC-val-cit-MMAF、10.69mg/kg曲妥珠單抗-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF和10.17&25.50mg/kg曲妥珠單抗-MC-MMAF)動(dòng)物在研究期間體重增加。第5和8組(分別是26.78mg/kg曲妥珠單抗-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF和21.85mg/kg曲妥珠單抗-MC-val-cit-PAB-MMAF)動(dòng)物在研究期間體重減少。在研究第5天，在第2、6和7組動(dòng)物的體重改變與第1組動(dòng)物沒有明顯不同。第3、4、5和8組動(dòng)物的體重改變與第1組動(dòng)物相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(實(shí)施例19)。
在兩種劑量水平時(shí)，用曲妥珠單抗-MC-MMAF(第6和7組)治療的大鼠與用運(yùn)載體治療的對照動(dòng)物無區(qū)別；即此偶聯(lián)物在此模型中顯示出優(yōu)異的安全性。用曲妥珠單抗-MC-val-cit-MMAF(無自我犧牲型PAB部分；第2和3組)治療的大鼠顯示對MMAF偶聯(lián)物的典型劑量依賴性改變；與全長MC-val-cit-PAB-MMAF偶聯(lián)物相比改變程度較低(第8組)。在第3組動(dòng)物(高劑量曲妥珠單抗-MC-val-cit-MMAF)中，第5天的血小板計(jì)數(shù)約為基線值的30％，相比而言第8組動(dòng)物(高劑量曲妥珠單抗-MC-val-cit-PAB-MMAF)為15％。呈劑量依賴方式的肝臟酶AST和ALT升高，膽紅素和血小板減少程度增加在用曲妥珠單抗-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF治療的動(dòng)物(第4和5組)中最明顯；第5組動(dòng)物(高劑量組)在第5天顯示ALT水平約為基線值的10倍，在尸檢時(shí)血小板降低了約90％。
也用高劑量的曲妥珠單抗-MC-MMAF(實(shí)施例19，高劑量研究第2、3、4組)和運(yùn)載體對照(第1組)治療雌性Sprague Dawley大鼠。觀察到溫和的毒性信號(hào)，包括肝臟酶ALT、AST和GGT呈劑量依賴性升高。在第5天，最高劑量組動(dòng)物顯示ALT升高2倍，AST升高5倍；GGT也升高(6U/L)。在第12天，酶水平顯示正常趨勢。在第5天，所有三個(gè)劑量組動(dòng)物有輕微的粒細(xì)胞增多，所有動(dòng)物的血小板計(jì)數(shù)基本維持不變。形態(tài)改變輕微；以4210μg/m2劑量水平治療的動(dòng)物(第2組)肝臟、脾臟、胸腺、腸和骨髓的組織學(xué)(改變)不明顯。分別在5500μg/m2劑量水平治療的動(dòng)物(第3組)的胸腺和肝臟中觀察到凋亡和有絲分裂活性略為增加。骨髓是正常細(xì)胞，但顯示有明顯的粒細(xì)胞增多，這與這些動(dòng)物的外周血計(jì)數(shù)中觀察到的絕對粒細(xì)胞增多一致。用最高劑量治療的第4組動(dòng)物性質(zhì)上顯示出相同特征；與第3組動(dòng)物相比，肝臟中的有絲分裂活性看起來有所增加。在脾臟和肝臟中也觀察到髓外造血作用。
EphB2R是1型TM酪氨酸激酶受體，小鼠和人之間緊密同源，在結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中過表達(dá)。2H9是EphB2R的抗體。單純抗體對腫瘤生長沒有作用，但2H9-val-cit-MMAE殺傷表達(dá)EphB2R的細(xì)胞，在攜帶CXF1103人結(jié)腸腫瘤的小鼠異種移植物模型中顯示具有療效(Mao等(2004)Cancer Res.64781-788)。2H9和7C2都是小鼠IgG1抗-HER2抗體。比較了2H9-MC-val-cit-PAB-MMAF(3.7MMAF/Ab)、7C2-MC-val-cit-PAB-MMAF(4MMAF/Ab)和曲妥珠單抗-MC-val-cit-PAB-MMAF(5.9MMAF/Ab)的的毒性特征。各免疫偶聯(lián)物或免疫偶聯(lián)物的藥物部分結(jié)構(gòu)上的差異可能影響其藥代動(dòng)力學(xué)特性，并最終影響安全性。人源化曲妥珠單抗抗體與大鼠組織一點(diǎn)也不結(jié)合，故認(rèn)為任何毒性都是非特異性的。
食蟹猴毒性/安全性類似于大鼠毒性/安全性的研究，用ADC治療食蟹猴，然后測定肝臟酶，并檢查和分析對各種器官的作用。粗觀察結(jié)果包括體重改變以及病損和出血跡象。對給藥動(dòng)物進(jìn)行臨床病理學(xué)參數(shù)(血清化學(xué)成分和血液學(xué))、組織病理學(xué)和尸體檢查(實(shí)施例19)。
抗體-藥物偶聯(lián)物H-MC-vc-PAB-MMAE(H＝通過半胱氨酸連接的曲妥珠單抗)在任何測試的劑量水平時(shí)都沒有顯示肝臟毒性。外周血粒細(xì)胞在給予一次劑量1100mg/m2后耗盡，給藥14天后完全恢復(fù)?？贵w-藥物偶聯(lián)物H-MC-vc-PAB-MMAF顯示在550(瞬時(shí))和880mg/m2劑量水平時(shí)肝臟酶升高，沒有粒細(xì)胞減少跡象，血小板呈劑量依賴性短時(shí)(第2和3組)下降。
4.6合成本發(fā)明化合物可用以下方案5-16中所述的合成方法制備示范性化合物和示范性偶聯(lián)物。如下所詳述，利用含有能與藥物和配體結(jié)合的反應(yīng)位點(diǎn)的接頭方便地制備示范性化合物或示范性偶聯(lián)物。在一個(gè)方面，接頭的反應(yīng)位點(diǎn)含有能與配體(例如但不限于抗體)上存在的親核基團(tuán)反應(yīng)的親電子基團(tuán)?？贵w上有用的親核基團(tuán)包括但不限于巰基、羥基和氨基?？贵w親核基團(tuán)的雜原子可與接頭上的親電子基團(tuán)反應(yīng)，形成共價(jià)鍵連接于接頭單元。有用的親電子基團(tuán)包括但不限于馬來酰亞胺和鹵代乙酰胺基團(tuán)。親電子基團(tuán)提供了方便的抗體連接位點(diǎn)。
在另一實(shí)施方式中，接頭的反應(yīng)位點(diǎn)含有能與抗體上存在的親電子基團(tuán)反應(yīng)的親核基團(tuán)?？贵w上有用的親電子基團(tuán)包括但不限于醛和酮的羰基。接頭親核基團(tuán)的雜原子可與抗體上的親電子基團(tuán)反應(yīng)形成共價(jià)鍵連接于抗體單元。接頭上有用的親核基團(tuán)包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、縮氨基硫脲、羧酸肼和芳基酰肼。抗體上的親電子基團(tuán)提供了方便的接頭連接位點(diǎn)。
在接頭中，也可用羧酸官能團(tuán)和氯甲酸酯官能團(tuán)作為反應(yīng)位點(diǎn)，因?yàn)樗鼈兛膳c藥物的仲氨基反應(yīng)形成酰胺連接鍵。接頭上有用的反應(yīng)位點(diǎn)還有碳酸酯官能團(tuán)，例如但不限于對硝基苯基碳酸酯，它可與藥物例如但不限于N-甲基纈氨酸的氨基反應(yīng)，形成氨基甲酸酯連接鍵。一般地，可通過在兩個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或肽片段之間形成肽鍵來制備基于肽的藥物。可根據(jù)例如，肽化學(xué)領(lǐng)域熟知的液相合成法(參見E.Schr_der和K.Lübke，“肽”(The peptides)，第1卷，第76-136頁，1965，AcademicPress)制備這種肽鍵。
以下方案8-9中描述了具有親電子馬來酰亞胺基團(tuán)的說明性拉伸單元的合成。方案10描述了用于合成接頭的通用合成方法。方案11顯示了具有val-cit基團(tuán)、親電子馬來酰亞胺基團(tuán)和PAB自我犧牲型間隔基團(tuán)的接頭單元的構(gòu)建。方案12描述了具有phe-lys基團(tuán)、親電子馬來酰亞胺基團(tuán)、具有和沒有PAB自我犧牲型間隔基團(tuán)的接頭的合成。方案13提供了合成藥物-接頭化合物方案的概要，而方案14提供了制備藥物-接頭化合物的替代途徑。方案15描述了含有BHMS基團(tuán)的支鏈接頭的合成。方案16概述了抗體與藥物-接頭化合物連接形成藥物-接頭-抗體偶聯(lián)物，方案14介紹了例如但不限于每抗體2或4個(gè)藥物的藥物-接頭-抗體偶聯(lián)物的合成。
如下所詳述，用含有結(jié)合藥物和配體的兩個(gè)或多個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)的接頭方便地制備示范性偶聯(lián)物。在一個(gè)方面，接頭的反應(yīng)位點(diǎn)含有能與配體如抗體上存在的親核基團(tuán)反應(yīng)的親電子基團(tuán)?？贵w上有用的親核基團(tuán)包括但不限于巰基、羥基和氨基?？贵w親核基團(tuán)的雜原子能與接頭上的親電子基團(tuán)反應(yīng)形成共價(jià)鍵連接于接頭單元。有用的親電子基團(tuán)包括但不限于馬來酰亞胺和鹵代乙酰胺基團(tuán)。親電子基團(tuán)提供了方便的抗體連接位點(diǎn)。
在另一實(shí)施方式中，接頭的反應(yīng)位點(diǎn)含有能與配體如抗體上存在的親電子基團(tuán)反應(yīng)的親核基團(tuán)?？贵w上有用的親電子基團(tuán)包括但不限于醛和酮的羰基。接頭親核基團(tuán)的雜原子可與抗體上的親電子基團(tuán)反應(yīng)形成共價(jià)鍵連接于抗體單元。接頭上有用的親核基團(tuán)包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、縮氨基硫脲、羧酸肼和芳基酰肼。抗體上的親電子基團(tuán)提供了方便的接頭連接位點(diǎn)。
4.6.1藥物部分的合成一般地，可通過在兩個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或肽片段之間形成肽鍵來制備基于肽的藥物?？筛鶕?jù)例如，肽化學(xué)領(lǐng)域熟知的液相合成法(參見E.Schr_der和K.Lüibke，“肽”(The peptides)，第1卷，第76-136頁，1965，Academic Press)制備這種肽鍵。
可根據(jù)以下通用方法制備耳抑素/海兔毒肽藥物部分美國專利號(hào)5635483；美國專利號(hào)5780588；Pettit等(1989)J.Am.Chem.Soc.1115463-5465；Pettit等(1998)Anti-Cancer Drug Design 13243-277；和Pettit等(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.15859-863。
在一個(gè)實(shí)施方式中，混合化學(xué)量大約相等的二肽和三肽，優(yōu)選在單罐反應(yīng)中合適的縮合條件下制備藥物。以下方案5-7中介紹了此方法。
方案5介紹了用作合成式Ib藥物化合物中間體的N-末端三肽單元F的合成。
方案5 如方案5所示，在合適的偶聯(lián)條件下，如在PyBrop和二異丙基乙胺的存在下，或用DCC將保護(hù)氨基酸A(其中PG代表胺保護(hù)基團(tuán)，R4選自氫、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、烷基-芳基、烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)、烷基-(C3-C8雜環(huán))，R5選自H和甲基；或者R4和R5一起具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb獨(dú)立地選自氫、C1-C8烷基和C3-C8碳環(huán)，n選自2、3、4、5和6，并與它們連接的碳原子形成環(huán))偶聯(lián)于叔丁酯B(其中R6選自-H和-C1-C8烷基；R7選自氫、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、烷基-芳基、烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和烷基-(C3-C8雜環(huán)))(參見例如，Miyazaki，K.等Chem.Pharm.Bull.1995，43(10)，1706-1718)。
合適的保護(hù)基團(tuán)PG，和能夠保護(hù)具有保護(hù)基團(tuán)的氨基的合適的合成方法是本領(lǐng)域熟知的。參見例如Greene，T.W.和Wuts，P.G.M.，《有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)》(Protective Groups in Organic Synthesis)，第2版，1991，John Wiley & Sons。示范性的保護(hù)氨基酸A是PG-異亮氨酸，尤其是PG-纈氨酸，而其它合適的保護(hù)氨基酸包括但不限于PG-環(huán)己基甘氨酸、PG-環(huán)己基丙氨酸、PG-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸、PG-氨基異丁酸、PG-苯丙氨酸、PG-苯基甘氨酸和PG-叔丁基甘氨酸。Z是示范性保護(hù)基團(tuán)。Fmoc是另一示范性保護(hù)基團(tuán)。示范性叔丁酯B是dolaisoleuine叔丁酯。
例如，可用層析法純化二肽C，然后，當(dāng)PG是芐氧基羰基時(shí)用H2和10％Pd-C的乙醇溶液脫保護(hù)，或用二乙胺去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)。得到的胺D容易與氨基酸BB形成肽鍵(其中R1選自-H、-C1-C8烷基和-C3-C8碳環(huán)；R2選自-H和-C1-C8烷基；或R1和R2一起具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb獨(dú)立地選自-H、-C1-C8烷基和-C3-C8碳環(huán)，n選自2、3、4、5和6，并與它們連接的氮原子形成環(huán)；R3選自氫、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、烷基-芳基、烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和烷基-(C3-C8雜環(huán)))。N，N-二烷基氨基酸是示范性氨基酸BB，如市售的N，N-二甲基纈氨酸?？捎靡阎椒ㄍㄟ^還原性雙烷化來制備其它N，N-二烷基氨基酸(參見例如Bowman，R.E，Stroud，H.H J.Chem.Soc.，1950，1342-1340)。Fmoc-Me-L-纈氨酸和Fmoc-Me-L-甘氨酸是兩個(gè)示范性氨基酸BB，用于合成N-單烷基衍生物。用以三乙胺作為堿的偶聯(lián)試劑DEPC使胺D和氨基酸BB反應(yīng)提供三肽E。然后用HCl使E的C-末端保護(hù)基團(tuán)脫保護(hù)，以提供式F的三肽化合物。
分別在下面的通用步驟A和通用步驟B中概述方案5中所示的說明性DEPC偶聯(lián)法和PyBrop偶聯(lián)法。在下面的通用步驟C中概述了通過催化性氫化使Z-保護(hù)的胺脫保護(hù)的說明性方法。
通用步驟A用DEPC合成肽。用質(zhì)子惰性有機(jī)溶劑，如二氯甲烷(0.1-0.5 M)稀釋N-保護(hù)的或N，N-雙取代的氨基酸或肽D(1.0當(dāng)量)和胺BB(1.1當(dāng)量)。然后加入有機(jī)堿如三乙胺或二異丙基乙胺(1.5當(dāng)量)，然后加入DEPC(1.1當(dāng)量)。在HPLC或TLC監(jiān)測下攪拌得到的溶液(優(yōu)選在氬氣下)長達(dá)12小時(shí)。室溫下真空去除溶劑，用例如HPLC或快速柱層析(硅膠柱)純化粗產(chǎn)物?；旌舷嚓P(guān)餾分，真空下濃縮產(chǎn)生三肽E，真空干燥過夜。
通用步驟B用PyBrop合成肽。用質(zhì)子惰性有機(jī)溶劑如二氯甲烷或DME稀釋任選含有羧基保護(hù)基團(tuán)的氨基酸B(1.0當(dāng)量)，提供濃度為0.5～1.0mM的溶液，然后加入二異丙基乙胺(1.5當(dāng)量)。加入一部分固體Fmoc-或Z-保護(hù)的氨基酸A(1.1當(dāng)量)，然后將PyBrop(1.2當(dāng)量)加入得到的混合物中。用TLC或HPLC監(jiān)測該反應(yīng)，之后的操作步驟類似于通用步驟A。
通用步驟C通過催化性氫化去除Z。在合適的容器如厚壁圓底燒瓶中用乙醇稀釋Z-保護(hù)的氨基酸或肽C，提供濃度為0.5-1.0mM的溶液。加入10％碳載鈀(5-10％w/w)，將反應(yīng)混合物置于氫氣下。用HPLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，通常在1-2小時(shí)內(nèi)完成。通過預(yù)先洗滌的硅藻土墊過濾反應(yīng)混合物，過濾后再用極性有機(jī)溶劑如甲醇洗滌硅藻土。真空濃縮洗脫溶液，用有機(jī)溶劑優(yōu)選甲苯稀釋得到的殘留物。然后在真空下去除有機(jī)溶劑，得到脫保護(hù)的胺C。
方案6顯示用于制備式K的C-末端二肽的方法和用于將式K二肽與式F三肽偶聯(lián)以制成式Ib藥物化合物的方法。
方案6
可用肽化學(xué)熟知的縮合劑，如在三乙胺的存在下的DEPC將修飾氨基酸Boc-Dolaproine G(參見例如Pettit，G.R.等Synthesis，1996，719-725)與式H的胺縮合容易地制備二肽K，如方案5所示。
然后，可用通用步驟D將式K二肽與式F的三肽偶聯(lián)，制成Fmoc-保護(hù)的式L藥物化合物，然后用通用步驟E使其脫保護(hù)，提供式(Ib)藥物化合物。
通用步驟D藥物合成。用質(zhì)子惰性有機(jī)溶劑如二氯甲烷稀釋二肽K(1.0當(dāng)量)和三肽F(1當(dāng)量)的混合物，形成0.1M溶液，然后加入強(qiáng)酸如三氟乙酸(1/2v/v)，在0℃、氮?dú)庀聰嚢璧玫降幕旌衔?小時(shí)。可用TLC或優(yōu)選HPLC監(jiān)測反應(yīng)。真空下去除溶劑，優(yōu)選用甲苯使得到的殘留物共沸干燥兩次。得到的殘留物在高真空下干燥12小時(shí)，然后用質(zhì)子惰性有機(jī)溶劑如二氯甲烷稀釋。加入有機(jī)堿如三乙胺或二異丙基乙胺(1.5當(dāng)量)，然后加入PyBrop(1.2當(dāng)量)或DEPC(1.2當(dāng)量)，這取決于殘基上的化學(xué)官能團(tuán)。用TLC或HPLC監(jiān)測反應(yīng)混合物，完成后，將反應(yīng)進(jìn)行后續(xù)步驟，與通用步驟A所述相似或相同。
通用步驟E用二乙胺去除Fmoc。用質(zhì)子惰性有機(jī)溶劑如二氯甲烷稀釋Fmoc-保護(hù)的藥物L(fēng)，將二乙胺(_v/v)加入得到的溶液中。用TLC或HPLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，一般在2小時(shí)內(nèi)完成。真空濃縮反應(yīng)混合物，優(yōu)選用甲苯共沸干燥得到的殘留物，然后高真空干燥，得到具有脫保護(hù)氨基的藥物Ib。
方案7顯示了用于制備式(Ib)MMAF衍生物的方法。
方案7
用肽化學(xué)中熟知的縮合劑，如三乙胺存在下的DEPC將修飾的氨基酸Boc-Dolaproine G(參見例如Pettit，G.R.等Synthesis，1996，719-725)與式M的保護(hù)氨基酸縮合容易地制備二肽O，如方案5和6所示。
然后，可用通用步驟D將式O二肽與式F的三肽偶聯(lián)，制成Fmoc-保護(hù)的式P的MMAF化合物，然后可用通用步驟E使其脫保護(hù)，提供式(Ib)MMAF藥物化合物。
因此，上述方法可用于制備可用于本發(fā)明的藥物。
4.6.2藥物接頭的合成為制備本發(fā)明的藥物-接頭化合物，使藥物與接頭上的反應(yīng)位點(diǎn)反應(yīng)。通常，當(dāng)間隔單元(-Y-)和拉伸單元(-A-)都存在時(shí)，接頭可具有以下結(jié)構(gòu)
或者，當(dāng)沒有間隔單元(-Y-)時(shí)，接頭可具有以下結(jié)構(gòu) 當(dāng)拉伸單元(-A-)和間隔單元(-Y-)都不存在時(shí)，接頭也可具有以下結(jié)構(gòu) 當(dāng)氨基酸單元(W)和間隔單元(Y)都不存在時(shí)，接頭也可具有以下結(jié)構(gòu) 通常，合適的接頭含有連接于任選的拉伸單元和任選的間隔單元的氨基酸單元。反應(yīng)位點(diǎn)1在間隔單元末端，反應(yīng)位點(diǎn)2在拉伸單元末端。如果沒有間隔單元，反應(yīng)位點(diǎn)1在氨基酸單元的C末端。
在本發(fā)明的示范性實(shí)施方式中，反應(yīng)位點(diǎn)1能與藥物的氮原子反應(yīng)，反應(yīng)位點(diǎn)2能與配體上的巰基反應(yīng)。反應(yīng)位點(diǎn)1和2能與不同官能團(tuán)反應(yīng)。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，反應(yīng)位點(diǎn)1是在本發(fā)明的另一方面，反應(yīng)位點(diǎn)1是在本發(fā)明的又一方面，反應(yīng)位點(diǎn)1是對硝基苯基碳酸酯，具有下式在本發(fā)明的一個(gè)方面，反應(yīng)位點(diǎn)2是巰基接受基團(tuán)。合適的巰基接受基團(tuán)包括鹵代乙酰胺基團(tuán)，具有下式其中X代表離去基團(tuán)，優(yōu)選O-甲磺?；?、O-甲苯磺酰基、-Cl、-Br或-I；或者馬來酰亞胺基團(tuán)，具有下式有用的接頭可從商業(yè)來源，如Molecular Biosciences Inc.(Boulder，CO)購得，或按以下方案8-10中所總結(jié)的方法制備。
方案8 其中X是-CH2-或-CH2OCH2-；當(dāng)X是-CH2-時(shí)n是0-10之間的一個(gè)整數(shù)；或者當(dāng)X是-CH2OCH2-時(shí)n是1-10之間的一個(gè)整數(shù)。
方案9所示方法在Mitsunobu條件下將馬來酰亞胺與甘油混合，制得聚乙二醇馬來酰亞胺拉伸單元(參見例如，Walker，M.A.J.Org.Chem.1995，60，5352-5)，然后裝入對硝基苯基碳酸酯反應(yīng)位點(diǎn)基團(tuán)。
方案9 其中E是-CH2-或-CH2OCH2-；e是0-8之間的一個(gè)整數(shù)；
或者，可制備PEG-馬來酰亞胺和PEG-鹵代乙酰胺拉伸單元，如Frisch等，Bioconjugate Chem.1996，7，180-186所述。方案10說明了含有馬來酰亞胺拉伸基團(tuán)和任選的對氨基芐基醚自我犧牲型間隔基團(tuán)的說明性接頭單元的通用合成方法。
方案10 其中Q是-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-鹵素、-硝基或-氰基；m是0-4之間的一個(gè)整數(shù)；n是0-10之間的一個(gè)整數(shù)。
可用下述購自Molecular Biosciences(Boulder，CO)的市售中間體、用有機(jī)合成的已知技術(shù)將有用的拉伸基團(tuán)摻入到接頭中。可通過使以下中間體與氨基酸單元的N-末端反應(yīng)將式(IIIa)拉伸基團(tuán)引入接頭中，如方案11和12所述其中n是1-10之間的一個(gè)整數(shù)，T是-H或-SO3Na；其中n是0-3之間的一個(gè)整數(shù)；
可通過使以下中間體與氨基酸單元的N-末端反應(yīng)將式(IIIb)拉伸單元引入接頭中其中X是-Br或-I；和可通過使以下中間體與氨基酸單元的N-末端反應(yīng)將式(IV)拉伸單元引入接頭中
可通過使以下中間體與氨基酸單元的N-末端反應(yīng)將式(Va)拉伸單元引入接頭中可根據(jù)已知方法合成其它有用的拉伸基團(tuán)。可按照J(rèn)ones，D.S.等，TetrahedronLetters，2000，41(10)，1531-1533；和Gilon，C.等，Tetrahedron，1967，23(11)，4441-4447所述方法用N-Boc-羥胺處理鹵代烷來制備下式氨氧基拉伸基團(tuán)。
其中-R17-選自-C1-C10亞烷基-、-C3-C8碳環(huán)-、-O-(C1-C8烷基)-、-亞芳基-、-C1-C10亞烷基-亞芳基-、-亞芳基-C1-C10亞烷基-、-C1-C10亞烷基-(C3-C8碳環(huán))-、-(C3-C8碳環(huán))-C1-C10亞烷基-、-C3-C8雜環(huán)-、-C1-C10亞烷基-(C3-C8雜環(huán))-、-(C3-C8雜環(huán))-C1-C10亞烷基-、-(CH2CH2O)r-、-(CH2CH2O)r-CH2-；r是1-10之間的一個(gè)整數(shù)；可從異氰硫基羧酸氯化物制備下式的異硫氰酸酯拉伸基團(tuán)，如Angew.Chem.，1975，87(14)517所述。
其中-R17-如本文所述。
方案11顯示了獲得含有馬來酰亞胺拉伸單元和任選的對氨基芐基自我犧牲型間隔單元的val-cit二肽接頭的方法。
方案11
其中Q是-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-鹵素、-硝基或-氰基；m是0-4之間的一個(gè)整數(shù)。
方案12說明了含有馬來酰亞胺拉伸單元和對氨基芐基自我犧牲型間隔單元的phe-lys(Mtr)二肽接頭單元的合成。原材料AD(lys(Mtr))可購自(Bachem，Torrance，CA)，或可根據(jù)Dubowchik等Tetrahedron Letters(1997)385257-60所述制備。
方案12
其中Q是-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-鹵素、-硝基或-氰基；m是0-4之間的一個(gè)整數(shù)。
如方案13所示，接頭可與式(Ib)藥物化合物的氨基反應(yīng)形成含有酰胺或氨基甲酸酯基團(tuán)的藥物-接頭化合物，將藥物單元連接于接頭單元。當(dāng)反應(yīng)位點(diǎn)1是羧酸基團(tuán)時(shí)，如接頭AJ，可用HATU或PyBrop和合適的胺堿進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生藥物-接頭化合物AK，其在藥物單元和接頭單元之間含有酰胺鍵。當(dāng)反應(yīng)位點(diǎn)1是碳酸酯時(shí)，如接頭AL，可用DMF/吡啶混合物中的HOBt將該接頭偶聯(lián)于藥物，而提供藥物-接頭化合物AM，其在藥物單元和接頭單元之間含有氨基甲酸酯鍵。
或者，當(dāng)反應(yīng)位點(diǎn)1是良好的離去基團(tuán)時(shí)，如接頭AN，可通過親核取代過程將該接頭與藥物的氨基偶聯(lián)，提供在藥物單元和接頭單元之間具有胺連接(AO)的藥物-接頭化合物。
方案13中描述了用于將藥物與配體連接形成藥物-接頭化合物的說明性方法，在通用步驟G-H中簡述。
方案13 通用步驟G用HATU形成酰胺。用合適的有機(jī)溶劑如二氯甲烷稀釋藥物(Ib)(1.0當(dāng)量)和含有羧酸反應(yīng)位點(diǎn)的N-保護(hù)的接頭(1.0當(dāng)量)，用HATU(1.5當(dāng)量)和有機(jī)堿，優(yōu)選吡啶(1.5當(dāng)量)處理得到的溶液。在惰性氣體，優(yōu)選氬氣下攪拌反應(yīng)混合物6小時(shí)，期間用HPLC監(jiān)測反應(yīng)混合物。濃縮反應(yīng)混合物，用HPLC純化得到的殘留物，產(chǎn)生式AK酰胺。
步驟H用HOBt形成氨基甲酸酪。用質(zhì)子惰性有機(jī)溶劑如DMF稀釋含有對硝基苯基碳酸酯反應(yīng)位點(diǎn)的接頭AL(1.1當(dāng)量)和藥物(Ib)(1.O當(dāng)量)的混合物，提供濃度為50-100mM的溶液，用HOBt(2-0當(dāng)量)處理得到的溶液，置于惰性氣體，優(yōu)選氬氣下。攪拌反應(yīng)混合物15分鐘，然后加入有機(jī)堿如吡啶(1/4v/v)，用HPLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。一般在16小時(shí)中消耗掉此接頭。然后在真空下濃縮反應(yīng)混合物，用例如HPLC純化得到的殘留物，產(chǎn)生氨基甲酸酯AM。
方案14中簡述了制備藥物-接頭化合物的替代方法。用方案14的方法，將藥物連接于沒有連接拉伸單元的部分接頭單元(如ZA)。這提供了中間體AP，它具有含F(xiàn)moc-保護(hù)的N-末端氨基酸單元。然后去除Fmoc基團(tuán)，將得到的胺中間體AQ用PyBrop或DEPC催化的偶聯(lián)反應(yīng)連接于拉伸單元。方案14中介紹了含有溴代乙酰胺拉伸單元AR或PEG馬來酰亞胺拉伸單元AS的藥物-接頭化合物的構(gòu)建。
方案14
其中Q是-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-鹵素、-硝基或-氰基；m是0-4之間的一個(gè)整數(shù)。
方案15中顯示了制備含有支鏈間隔基團(tuán)的接頭單元的方法。
方案15
方案15介紹了含有馬來酰亞胺拉伸單元和雙(4-羥甲基)苯乙烯(BHMS)單元的val-cit二肽接頭的合成。改進(jìn)了以前文獻(xiàn)報(bào)道的BHMS中間體(AW)的合成方法(參見Firestone等的國際公開號(hào)WO 9813059和Crozet，M.P.；Archaimbault，G.；Vanelle，P.；Nouguier，R.Tetrahedron Lett.(1985)265133-5134)，并將其用作原材料，市售的二乙基(4-硝基芐基)膦酸酯(AT)和市售的2，2-二甲基-1，3-二噁烷-5-酮(AU)?？捎梅桨?所述方法從中間體AW制備接頭AY和BA。
4.6.3樹枝狀接頭接頭可以是通過分枝狀多功能接頭部分將一個(gè)以上的藥物部分共價(jià)連接于配體，例如但不限于抗體的樹枝類型接頭(Sun等(2002)Bioorganic & Medicinal ChemistryLetters 122213-2215；Sun等(2003)Bioorganic & Medicinal Chemistry 111761-1768)。樹枝狀接頭可提高藥物與抗體，即加載的摩爾比，這關(guān)系到藥物-接頭-配體偶聯(lián)物的藥效。因此，當(dāng)半胱氨酸工程改造的抗體僅攜帶一個(gè)反應(yīng)性半胱氨酸巰基時(shí)，可通過樹枝狀接頭連接大量藥物部分。
以下樹枝狀接頭試劑的示范性實(shí)施方式允許多達(dá)9個(gè)親核藥物部分試劑通過與氯乙基氮芥官能團(tuán)反應(yīng)相偶聯(lián) 4.6.4藥物部分與抗體偶聯(lián)方案16介紹了每個(gè)抗體約含2～4個(gè)藥物的藥物-接頭-配體偶聯(lián)物的制備方法。用還原劑如二硫蘇糖醇(DTT)處理抗體，還原一些或全部的半胱氨酸二硫殘基，形成高親核性的半胱氨酸巰基(-CH2SH)。因此，根據(jù)Klussman等(2004)，BioconjugateChemistry 15(4)765-773中第766頁的偶聯(lián)方法，使部分還原的抗體與含有親電子官能團(tuán)如馬來酰亞胺或α-鹵代羰基的藥物-接頭化合物或接頭試劑反應(yīng)。
方案16
例如，用過量的100mM二硫蘇糖醇(DTT)處理抗體如AC10的500mM硼酸鈉和500mM氯化鈉溶液(pH8.0)。37℃孵育約30分鐘后，通過在Sephadex G25樹脂上洗脫交換緩沖液，用含有l(wèi)mM DTPA的PBS洗脫。通過該溶液的280nm吸光度確定還原抗體濃度以及通過與DTNB(Aldrich，Milwaukee，WI)反應(yīng)和412nm吸光度確定巰基濃度核實(shí)巰基/抗體值。在冰上冷卻溶于PBS的還原抗體。將已知濃度的溶于乙腈和水的藥物接頭如MC-val-cit-PAB-MMAE的DMSO溶液加入預(yù)冷的還原抗體的PBS溶液中。約1小時(shí)后，加入過量馬來酰亞胺終止反應(yīng)，給未反應(yīng)的抗體巰基加帽。離心超濾濃縮反應(yīng)混合物，純化ADC如AC10-MC-vc-PAB-MMAE，并通過G25樹脂用PBS溶液洗脫脫鹽，在無菌條件下通過0.2μm濾器過濾，冷凍儲(chǔ)存。
制備具有各種接頭和藥物部分MMAE和MMAF的各種抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)。下表是按照實(shí)施例27的方法制備，用HPLC和藥物加載量試驗(yàn)特征鑒定的一組示范性ADC。
靶(抗原) ADC 分離量(mg) 藥物/抗體比0772P 16E12-MC-vc-PAB-MMAE1.75 40772P 11D10-MC-vc-PAB-MMAE46.8 4.40772P 11D10-MC-vc-PAB-MMAF54.5 3.8短小蛋白聚糖短小蛋白聚糖-MC-MMAF2 6短小蛋白聚糖短小蛋白聚糖-MC-vc-MMAF 2 6短小蛋白聚糖短小蛋白聚糖-MC-vc-PAB-MMAF 1.46CD21 CD21-MC-vc-PAB-MMAE 38.1 4.3CD21 CD21-MC-vc-PAB-MMAF 43 4.1CRIPTO11F4-MC-vc-PAB-MMAF 6 4.8CRIPTO25G8-MC-vc-PAB-MMAF 7.44.7E16 12G12-MC-vc-PAB-MMAE2.34.6E16 3B5-MC-vc-PAB-MMAE 2.94.6E16 12B9-MC-vc-PAB-MMAE 1.43.8E16 12B9-MC-vc-PAB-MMAE 5.14E16 12G12-MC-vc-PAB-MMAE3 4.6E16 3B5-MC-vc-PAB-MMAE 4.84.1
E163B5-MC-vc-PAB-MMAF 24.74.4EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAE 29.97.1EphB2R 2H9-MC-fk-PAB-MMAE 25 7.5EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAE 175 4.1EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAF 150 3.8EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAF 120 3.7EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAE 10.74.4IL-20RaIL20Ra-fk-MMAE 26 6.7IL-20RaIL20Ra-vc-MMAE 27 7.3EphB2 IL8-MC-vc-PAB-MMAE 251 3.7MDPMDP-vc-MMAE 32MPF19C3-vc-MMAE1.446.5MPF7D9-vc-MMAE 4.3 3.8MPF19C3-vc-MMAE7.9 3MPF7D9-MC-vc-PAB-MMAF 5 4.3Napi3b 10H1-vc-MMAE4.5 4.6Napi3b 4C9-vc-MMAE 3.0 5.4Napi3b 10H1-vc-MMAE4.5 4.8Napi3b 10H1-vc-MMAF6.5 4NCA3E6-MC-fk-PAB-MMAE 49.65.4NCA3E6-MC-vc-PAB-MMAE 56.26.4PSCA PSCA-fk-MMAE51.78.9PSCA PSCA-vc-MMAE61.18.6Napi3b 10H1-MC-vc-PAB-MMAE 75 4.2Napi3b 10H1-MC-vc-PAB-MMAF 95 4.4Napi3b 10H1-MC-MMAF92 4EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAE 79 5EphB2R 2H9-MC-MMAF 92 4.90772P 11D10(Fc嵌合)-MC-vc-PAB-MMAE79 4.30772P 11D10(Fc嵌合)-MC-vc-PAB-MMAF70 4.50772P 11D10(Fc嵌合)-MC-MMAF 23 4.5
短小蛋白聚糖 6D2-MC-vc-PAB-MMAF 0.3 4.5短小蛋白聚糖 6D2-MC-MMAF 0.364.5EphB2R 2H9(Fc嵌合)-MC-vc-PAB-MMAE 19834.3E1612B9-MC-vc-PAB-MMAE 14.14.6E1612B9-MC-vc-PAB-MMAF 16.44.5E1612G12-MC-vc-PAB-MMAE 10.54.1E1612G12-MC-vc-PAB-MMAF 10.23.8E163B5-MC-vc-PAB-MMAE 58.63.8E163B5-MC-vc-PAB-MMAF 8 3.10772P 11D10(Fc嵌合)-MC-vc-PAB-MMAE 340 3.9Steap1 (Steap1-92)-MC-vc-PAB-MMAE 3.5 4Steap1 (Steap1-92)-MC-vc-PAB-MMAF 4.7 4Steap1 (Steap1-120)-MC-vc-PAB-MMAE 2 4Steap1 (Steap1-120)-MC-vc-PAB-MMAF 2.3 4E163B5-MC-vc-PAB-MMAF 52.24.54.7.組合物和給藥方法在其它實(shí)施方式中，描述了包含有效量的示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物和藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或介質(zhì)的組合物。為方便起見，將藥物單元和藥物-接頭化合物稱為示范性化合物，而藥物-配體偶聯(lián)物和藥物-接頭-配體偶聯(lián)物稱為示范性偶聯(lián)物。這些化合物適用于獸醫(yī)或人類給藥。
本發(fā)明組合物可以是給予患者的任何組合物形式。例如，該組合物可以是固體、液體或氣體(氣霧劑)形式。一般的給藥途徑包括但不限于口服、局部、胃腸道外、舌下、直腸、陰道、眼部、腫瘤內(nèi)和鼻內(nèi)。胃腸道外給藥包括皮下注射、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、胸內(nèi)注射或輸液技術(shù)。在一個(gè)方面，胃腸道外給予該組合物。在又一方面，靜脈內(nèi)給予示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物或組合物。
可配制藥物組合物，使得在給予患者該組合物后示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物可被生物利用。組合物可采取單一或多劑量單位的形式，例如，片劑可以是單劑量單位，氣霧劑形式的示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物的容器可容納多個(gè)劑量單位。
用于制備該藥物組合物的材料在其用量下應(yīng)無毒。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將明白該藥物組合物中活性成分的最佳劑量取決于各種因素。相關(guān)因素包括但不限于動(dòng)物類型(如人)、示范性化合物或示范性偶聯(lián)物的具體形式、給藥方式和采用的組成。
藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體可為顆粒狀，因此該組合物可以是，例如片劑或粉末形式。運(yùn)載體是液體時(shí)，該組合物可以是，例如口服糖漿或注射液。此外，運(yùn)載體可以是氣態(tài)或微粒，以提供用于(例如)吸入給藥的氣霧劑組合物。
當(dāng)口服給藥時(shí)，該組合物優(yōu)選固體或液體形式，半固體、半液體、懸浮液和凝膠形式也包括在本文所考慮的固體或液體形式中。
作為口服給藥的固體組合物，可將該組合物制成粉劑、顆粒劑、壓縮片劑、丸劑、膠囊、口香糖、糯米紙囊劑等。這種固體組合物一般含有一種或多種惰性稀釋劑。此外，可存在一種或多種以下物質(zhì)粘合劑如羧甲基纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素或明膠；賦形劑如淀粉、乳糖或糊精、崩解劑如藻酸、藻酸鈉、原始凝膠(Primogel)、玉米淀粉等；潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotex；助流劑如膠體二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精、調(diào)味劑如薄荷、甲基水楊酸或橙味劑；以及著色劑。
當(dāng)組合物是膠囊，如明膠膠囊形式時(shí)，除上述類型的材料外，它還可含有液態(tài)運(yùn)載體如聚乙二醇、環(huán)式糊精或脂肪油。
該組合物可以是液體形式，如酏劑、糖漿、溶液、乳液或懸浮劑。液體可用于口服給藥或注射遞送。當(dāng)口服給藥時(shí)，組合物可含有甜味劑、防腐劑、染料/著色劑和味道增強(qiáng)劑中的一種或多種。注射給藥的組合物中，也可包含表面活性劑、防腐劑、濕潤劑、分散劑、懸浮劑、緩沖液、穩(wěn)定劑和等滲劑中的一種或多種。
無論是溶液、懸浮液或其它類似形式的液體組合物也可包含一種或多種以下物質(zhì)無菌稀釋劑如注射用水，鹽溶液，優(yōu)選生理鹽水、林格溶液、等滲氯化鈉，可用作溶劑或懸浮介質(zhì)的不揮發(fā)性油如合成的甘油單酯或甘油二酯，聚乙二醇，甘油，環(huán)式糊精，丙二醇或其它溶劑；抗菌劑如芐基醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖液如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽緩沖液，以及調(diào)節(jié)張力的物質(zhì)如氯化鈉或右旋糖?？蓪⑽改c道外組合物包裝在由玻璃、塑料或其它材料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。生理鹽水是示范性輔佐劑。注射組合物優(yōu)選無菌。
在治療具體疾病或病癥中示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物的有效量取決于疾病或病癥的性質(zhì)，可用標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)測定有效量。此外，可任選地進(jìn)行體外或體內(nèi)試驗(yàn)以幫助鑒定最佳劑量范圍。用于組合物的準(zhǔn)確劑量也取決于給藥途徑，和疾病或失調(diào)的嚴(yán)重性，應(yīng)根據(jù)醫(yī)生的判斷和各個(gè)患者的情況來決定。
該組合物含有有效量的示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物，以獲得合適劑量。此用量一般至少約為該組合物重量0.01％的示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物。當(dāng)口服給藥時(shí)，此用量可約為該組合物重量的0.1％-80％。在一個(gè)方面，口服組合物可含有約占該組合物重量4％-50％的示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物。在又一方面，制備本發(fā)明組合物，以使胃腸道外單位劑量含有約0.01重量％-2重量％的示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物。
對于靜脈內(nèi)給藥而言，該組合物可含有每千克動(dòng)物體重約0.01-100mg的示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物。在一個(gè)方面，該組合物可包含約每千克動(dòng)物體重1-100mg的示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物。在另一方面，給藥量約為0.1-25mg/kg體重的示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物。
通常，給予患者的示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物劑量一般約為0.01mg/kg動(dòng)物體重-2000mg/kg動(dòng)物體重。在一個(gè)方面，給予患者的劑量約為0.01mg/kg動(dòng)物體重-10mg/kg動(dòng)物體重，在另一方面，給予患者的劑量約為0.1mg/kg動(dòng)物體重-250mg/kg動(dòng)物體重，在又一方面，給予患者的劑量約為0.1mg/kg動(dòng)物體重-20mg/kg動(dòng)物體重，在又一方面，給藥劑量約為0.1mg/kg動(dòng)物體重-10mg/kg動(dòng)物體重，在又一方面，給藥劑量約為1mg/kg動(dòng)物體重-10mg/kg動(dòng)物體重。
示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物或組合物可通過任何方便的途徑，例如通過輸液或推注給藥，通過上皮或粘膜層(如口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收?？梢匀砘蚓植拷o藥。已知各種遞送系統(tǒng)，如包裹在脂質(zhì)體、微粒、微膠囊、膠囊等中，它們可用于給予示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物或組合物。在某些實(shí)施方式中，將一種以上的示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物或組合物給予患者。
在特定實(shí)施方式中，可能需要將一種或多種示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物或組合物局部給予需要治療的部位。這可通過，例如但不限于手術(shù)期間局部輸注；局部施用，如術(shù)后與創(chuàng)傷敷料聯(lián)用；注射；導(dǎo)管方式；栓劑方式；或植入方式(植入物為多孔性、非多孔性或明膠材料，包括膜如硅塑(sialastic)膜或纖維)來實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，可通過直接注射于癌、腫瘤或贅生物或瘤前組織的部位(或之前部位)給藥。在另一實(shí)施方式中，可通過直接注射于自身免疫病病變部位(或之前部位)給藥。
在某些實(shí)施方式中，可能需要通過合適途徑將一種或多種示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物或組合物引入中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，這些途徑包括心室內(nèi)和鞘內(nèi)注射。通過心室內(nèi)導(dǎo)管，例如連接有儲(chǔ)器，如Ommaya儲(chǔ)藥器的心室內(nèi)導(dǎo)管有助于心室內(nèi)注射。
例如也可通過使用吸入器或噴霧器，與促氣霧劑一起配制，或通過碳氟化合物或合成肺部表面活性劑灌注進(jìn)行肺部給藥。
在又一實(shí)施方式中，示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物或組合物可以控釋系統(tǒng)遞送，例如但不限于使用泵或各種聚合材料。在又一實(shí)施方式中，可將控釋系統(tǒng)置于示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物或組合物的靶(如腦)的附近，因而僅需要全身給藥劑量的一部分(參見例如Goodson，《控釋的醫(yī)學(xué)應(yīng)用》(Medical Applications ofControlled Release)，同上，第2卷，第115-138頁(1984))?？捎肔anger綜述(Science2491527-1533(1990))中討論的其它控釋系統(tǒng)。
術(shù)語“運(yùn)載體”指稀釋劑、輔佐劑或賦形劑，將示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物與運(yùn)載體一起給藥。這種藥物運(yùn)載體可以是液體，如水和油，包括石油、動(dòng)物、植物或合成來源的液體，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。運(yùn)載體可以是鹽水、阿拉伯樹膠、明膠、淀粉糊、滑石粉、角蛋白、膠體氧化硅、尿素等。此外，可使用輔助劑、穩(wěn)定劑、增稠劑、潤滑劑和著色劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)給予患者時(shí)，示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物或組合物和藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體無菌。當(dāng)靜脈內(nèi)給予示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物時(shí)，水是示范性運(yùn)載體。鹽水溶液以及右旋糖和甘油的水溶液也可用作液體運(yùn)載體，尤其是注射溶液。合適的藥物運(yùn)載體還包括賦形劑如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要，本發(fā)明組合物也可含有少量濕潤劑或乳化劑，或pH緩沖劑。
本發(fā)明組合物可采取溶液，懸液，乳液，片劑，丸劑，微型片劑(pellet)，膠囊，含有液體、粉劑、緩釋劑、栓劑、乳劑、氣霧劑、噴霧劑、懸浮劑的膠囊形式或其它適合使用的形式。合適的藥物運(yùn)載體的其它例子見E.W.Martin的《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)常規(guī)方法將示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物配成適合靜脈內(nèi)給予動(dòng)物，尤其是人的藥物組合物。用于靜脈內(nèi)給藥的運(yùn)載體一般是無菌等滲緩沖水溶液。需要時(shí)，該組合物也可包含增溶劑。用于靜脈內(nèi)給藥的組合物可任選地包含局部麻醉劑如利多卡因，以緩解注射部位的疼痛。通常，在標(biāo)明活性物質(zhì)用量的密封容器如安瓿或藥囊中以單位劑型單獨(dú)或混合形式，例如，作為凍干粉末或無水濃縮物提供。當(dāng)通過輸注給予示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物時(shí)，可用，例如含有藥物級(jí)無菌水或鹽水的輸液瓶配藥。當(dāng)通過注射給予示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物時(shí)，可提供裝有注射用無菌水或鹽水的安瓿，以便在給藥前混合這些成分。
用于口服遞送的組合物可以是例如片劑、錠劑、水性或油性懸液、顆粒、粉劑、乳液、膠囊、糖漿或酏劑形式。口服給藥的組合物可含有一種或多種以下任選的物質(zhì)，例如甜味劑如果糖，阿斯巴甜或糖精；調(diào)味劑如薄荷、冬青油或櫻桃油；著色劑；和防腐劑，以提供藥學(xué)可口的制劑。而且，以片劑或丸劑形式給藥時(shí)，可包衣該組合物以延遲在胃腸道中的崩解和吸收，從而在延長時(shí)間中提供緩釋作用。滲透活性驅(qū)動(dòng)化合物周圍的選擇性通透膜也適用于口服給藥的化合物。在這些遞送平臺(tái)中，膠囊周圍環(huán)境的液體被該驅(qū)動(dòng)化合物吸收而膨脹，通過孔隙釋放藥物或藥物組合物。這些遞送平臺(tái)可提供基本零級(jí)動(dòng)力學(xué)的遞送模式，與立即釋放劑型的峰值模式相反。也可采用延時(shí)(釋放)材料如單硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯。
該組合物可用于局部給藥，此時(shí)運(yùn)載體可以是溶液、乳液、軟膏或凝膠基質(zhì)形式。如果用于透皮給藥，該組合物可以是透皮貼劑或離子電滲裝置形式。局部劑型可包含濃度約為0.05％-50％w/v(每單位體積組合物中的重量)，另一方面為0.1％-10％w/v的示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物。
該組合物可用于直腸給藥，其形式為，例如在直腸中融化并釋放示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物的栓劑。
該組合物可包含改變固體或液體劑量單位的物理形式的各種材料。例如，該組合物可包含在活性成分周圍形成包衣外殼的材料。形成包衣外殼的材料一般是惰性的，可選自例如糖、蟲膠和其它腸溶包衣物質(zhì)?；蛘?，可將活性成分包裝在明膠膠囊中。
該組合物可由氣態(tài)劑量單位組成，例如，可以是氣霧劑形式。術(shù)語氣霧劑用來指各種系統(tǒng)，從膠體性質(zhì)系統(tǒng)到由密封包裝組成的系統(tǒng)?？赏ㄟ^液化氣或壓縮氣體或通過適合地分散活性成分的泵系統(tǒng)進(jìn)行遞送。
無論是固體、液體或氣體形式，本組合物可包括用于治療癌癥、自身免疫病或傳染病的藥物。
4.8示范性偶聯(lián)物的治療用途示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物可用于治療患者的癌癥、自身免疫病或傳染病。
4.8.1治療癌癥示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物可用于抑制腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞的增殖，引起腫瘤或癌細(xì)胞凋亡，或治療患者的癌癥。因此，可使用各種形式的示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物治療動(dòng)物癌癥。可用藥物-接頭-配體偶聯(lián)物將藥物或藥物單元遞送到腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞中。如果不受限于理論，在一個(gè)實(shí)施方式中，示范性偶聯(lián)物的配體單元與癌細(xì)胞或腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合或締合，通過受體介導(dǎo)的胞吞作用使示范性偶聯(lián)物被腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞攝入?？墒蛊渑c腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞的抗原結(jié)合，或與腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞相關(guān)的胞外基質(zhì)蛋白結(jié)合。一旦進(jìn)入細(xì)胞，接頭單元中的一個(gè)或多個(gè)特異性肽序列就受到一種或多種腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞相關(guān)蛋白酶的水解，導(dǎo)致藥物或藥物-接頭化合物釋放。然后，釋放的藥物或藥物-接頭化合物在細(xì)胞內(nèi)自由遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制活性。在另一實(shí)施方式中，示范性偶聯(lián)物在腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞外被切下藥物或藥物單元后，藥物或藥物-接頭化合物即可透入細(xì)胞中。
在一個(gè)實(shí)施方式中，配體單元與腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞結(jié)合。
在另一實(shí)施方式中，配體單元與腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞表面上的腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞抗原結(jié)合。
在另一實(shí)施方式中，配體單元與腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞相關(guān)的胞外基質(zhì)蛋白的腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞抗原結(jié)合。
配體單元對具體腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞的特異性對確定哪些腫瘤或癌癥能最有效地治療很重要。例如，具有BR96配體單元的示范性偶聯(lián)物可用于治療(BR96)抗原陽性癌，包括肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌和胰腺癌。含有抗CD30或抗CD40配體單元的示范性偶聯(lián)物可用于治療血液惡性腫瘤。
可用示范性偶聯(lián)物治療的癌癥的其它具體類型包括但不限于表3所列的癌癥。
表3實(shí)體瘤，包括但不限于纖維肉瘤粘液肉瘤脂肪肉瘤軟骨肉瘤成骨肉瘤脊索瘤血管肉瘤內(nèi)皮肉瘤淋巴管肉瘤淋巴管內(nèi)皮肉瘤滑膜瘤間皮瘤尤因瘤平滑肌肉瘤橫紋肌肉瘤結(jié)腸癌結(jié)直腸癌腎癌胰腺癌骨癌乳腺癌卵巢癌前列腺癌食道癌胃癌口腔癌鼻癌喉癌鱗狀細(xì)胞癌基底細(xì)胞癌腺癌汗腺瘤皮脂腺癌乳頭狀癌乳頭狀腺癌囊腺癌髓樣癌支氣管癌腎細(xì)胞癌肝癌膽管癌絨毛膜癌精原細(xì)胞瘤胚性癌腎母細(xì)胞瘤宮頸癌子宮癌睪丸癌小細(xì)胞肺癌膀胱癌肺癌上皮癌膠質(zhì)瘤成膠質(zhì)細(xì)胞瘤星形細(xì)胞瘤髓母細(xì)胞瘤顱咽管瘤室管膜瘤松果體瘤成血管細(xì)胞瘤聽神經(jīng)瘤少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤腦脊膜瘤皮膚癌黑色素瘤神經(jīng)母細(xì)胞瘤視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤血液癌癥，包括但不限于
急性淋巴母細(xì)胞白血病“ALL”急性淋巴母細(xì)胞B-細(xì)胞白血病急性淋巴母細(xì)胞T-細(xì)胞白血病急性髓母細(xì)胞白血病“AML”急性前髓細(xì)胞白血病“APL”急性單核母細(xì)胞白血病急性紅白血病急性原巨核細(xì)胞白血病急性骨髓單核細(xì)胞白血病急性非淋巴細(xì)胞白血病急性不分化性白血病慢性髓細(xì)胞白血病“CML”慢性淋巴細(xì)胞白血病“CLL”毛細(xì)胞白血病多發(fā)性骨髓瘤急性和慢性白血病淋巴母細(xì)胞性骨髓性淋巴細(xì)胞性髓細(xì)胞白血病淋巴瘤霍奇金病非霍奇金淋巴瘤多發(fā)性骨髓瘤瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥重鏈病真性紅細(xì)胞增多癥示范性偶聯(lián)物提供偶聯(lián)物特異性靶向腫瘤或癌癥，從而降低了這些化合物的全身毒性。接頭單元穩(wěn)定了血液中的示范性偶聯(lián)物，但它在細(xì)胞中可被腫瘤特異性蛋白酶切割，而釋放藥物。
4.8.2癌癥的多手段治療可給予示范性偶聯(lián)物和/或示范性化合物來治療或預(yù)防癌癥，包括但不限于腫瘤、轉(zhuǎn)移或特征為細(xì)胞生長失控的其它疾病或失調(diào)。
在其它實(shí)施方式中，提供了治療或預(yù)防癌癥的方法，該方法包括將有效量的示范性偶聯(lián)物和化療藥給予需要的患者。在一個(gè)實(shí)施方式中，化療藥是用于治療未發(fā)現(xiàn)是難治癌癥的藥物。在另一實(shí)施方式中，化療藥是用于治療已發(fā)現(xiàn)是難治癌癥的藥物。可將示范性偶聯(lián)物給予也用外科手術(shù)治療的癌癥患者。
在一個(gè)實(shí)施方式中，其它治療方法是放療。
在特定實(shí)施方式中，示范性偶聯(lián)物與化療藥或與放療一起給予。在另一特定實(shí)施方式中，在給予示范性偶聯(lián)物之前或之后，在給予示范性偶聯(lián)物之前或之后(在一個(gè)方面)至少1小時(shí)、5小時(shí)、12小時(shí)、1天、1周、1月，在另一方面是幾個(gè)月(如長達(dá)三個(gè)月)后給予化療藥或放療。
可經(jīng)一系列步驟給予化療藥?？山o予表4中所列的任何一種化療藥或組合。關(guān)于放療，根據(jù)待治療癌癥類型使用放療方案。例如但不限于，給予X-射線輻射；具體是高能兆伏級(jí)(輻射能量大于1MeV)用于深部腫瘤，電子束和中電壓X-射線輻射可用于皮膚癌。也可給予發(fā)射γ-射線的放射性同位素，如鐳、鈷和其它元素的放射性同位素。
此外，提供用示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物治療癌癥的方法，作為在證明或可證明化療或放療毒性太高，如對所治療對象產(chǎn)生不可接受的或不能承受的副作用時(shí)，化療或放療的替代療法?？扇芜x地用另一種癌癥治療方法如手術(shù)、放療或化療治療動(dòng)物，這取決于發(fā)現(xiàn)哪種治療是可接受和可承受的。
示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物也可以體外或離體方式使用，如用于治療某些癌癥，包括但不限于白血病和淋巴瘤，這種治療包括自身干細(xì)胞移植。方法包括收集動(dòng)物的自身造血于細(xì)胞和清除所有癌細(xì)胞等多步過程，然后，給予高劑量的示范性化合物和/或示范性偶聯(lián)物(伴隨或不伴隨高劑量放療)根除殘留的剩余骨髓細(xì)胞群，將干細(xì)胞移植物輸注回動(dòng)物。然后在骨髓功能恢復(fù)和動(dòng)物復(fù)原時(shí)提供支持性護(hù)理。
4.8.3癌癥的多種藥物治療公開了治療癌癥的方法，該方法包括將有效量的示范性偶聯(lián)物和另一抗癌治療制劑給予需要它的患者。合適的抗癌藥包括但不限于甲氨蝶呤、紫杉醇、L-天冬酰胺酶、巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、羥基脲、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、亞硝基脲、順鉑、卡鉑、絲裂霉素、達(dá)卡巴嗪、丙卡巴肼、拓?fù)涮婵怠⒌?、環(huán)磷酰胺、依托泊甙、5-氟尿嘧啶、BCNU、伊立替康、喜樹堿、博來霉素、多柔比星、黃膽素、道諾霉素、放線菌素d、普卡霉素、米托蒽醌、天冬酰胺酶、長春堿、長春新堿、長春瑞濱、紫杉醇和多西他賽。在一個(gè)方面，抗癌劑包括但不限于表4所列藥物。
表4
4.8.4自身免疫病的治療示范性偶聯(lián)物可用于殺傷產(chǎn)生自身免疫病的細(xì)胞或抑制其復(fù)制或治療自身免疫病。因此，示范性偶聯(lián)物可以各種形式用于治療患者的自身免疫病。藥物-接頭-配體偶聯(lián)物可用于將藥物遞送給靶細(xì)胞。如果不受限于理論，在一個(gè)實(shí)施方式中，藥物-接頭-配體偶聯(lián)物與靶細(xì)胞表面上的抗原結(jié)合，然后，通過受體介導(dǎo)的胞吞作用將示范性偶聯(lián)物攝入靶細(xì)胞。一旦進(jìn)入細(xì)胞，接頭單元內(nèi)一個(gè)或多個(gè)特定肽序列被酶解或水解切割，導(dǎo)致藥物釋放。然后，釋放的藥物在胞質(zhì)中自由遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制活性。在另一實(shí)施方式中，示范性偶聯(lián)物在靶細(xì)胞外被切下藥物，然后藥物穿透入細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方式中，配體單元與自身免疫性抗原結(jié)合。在一個(gè)方面，該抗原位于參與自身免疫病的細(xì)胞表面上。
在另一實(shí)施方式中，配體單元與細(xì)胞表面上的自身免疫性抗原結(jié)合。
在一個(gè)實(shí)施方式中，配體與自身免疫病相關(guān)的活化淋巴細(xì)胞結(jié)合。
在又一實(shí)施方式中，示范性偶聯(lián)物殺傷或抑制產(chǎn)生與具體自身免疫病相關(guān)的自身免疫性抗體的細(xì)胞增殖。
可用示范性偶聯(lián)物治療的自身免疫病的具體類型包括但不限于Th2淋巴細(xì)胞相關(guān)疾病(如特應(yīng)性皮炎、特應(yīng)性哮喘、鼻結(jié)膜炎、變應(yīng)性鼻炎、Omenn綜合征、全身性硬化和移植物抗宿主病)；Th1淋巴細(xì)胞相關(guān)疾病(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、牛皮癬、斯耶格倫綜合征、橋本甲狀腺炎、格雷夫斯病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、韋格納肉芽腫病和結(jié)核病)；活化B淋巴細(xì)胞相關(guān)疾病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肺出血-腎炎綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和I型糖尿病)；以及表5所述疾病。
表5活動(dòng)性慢性肝炎阿狄森病變態(tài)性肺泡炎變態(tài)性反應(yīng)變態(tài)性鼻炎阿爾波特綜合征過敏性反應(yīng)強(qiáng)直性脊柱炎抗磷脂綜合征關(guān)節(jié)炎蛔蟲病黑霉菌病特應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)特應(yīng)性皮炎特應(yīng)性鼻炎貝切特病鳥愛好者肺支氣管哮喘卡普蘭綜合征心肌病乳糜瀉恰加斯病慢性腎小球腎炎寇甘綜合征冷凝集素病先天性風(fēng)疹感染CREST綜合征克羅恩氏病冷球蛋白血癥庫興綜合征皮肌炎盤狀狼瘡德雷斯勒綜合征伊-朗綜合征艾柯病毒感染腦脊髓炎內(nèi)分泌性眼病愛波斯坦-巴爾病毒感染馬肺氣腫病(Equine Heaves)紅斑病伊凡斯綜合征費(fèi)爾提綜合征纖維肌痛富克斯睫狀體炎胃萎縮胃腸道變態(tài)反應(yīng)巨細(xì)胞動(dòng)脈炎腎小球腎炎肺出血-腎炎綜合征移植物抗宿主病格雷夫斯病Guillain-Barre病橋本甲狀腺炎溶血性貧血亨諾-許蘭紫癜特發(fā)性腎上腺萎縮特發(fā)性肺纖維化(Pulmonary Fibritis)IgA腎病炎性腸病胰島素依賴性糖尿病青少年關(guān)節(jié)炎青少年糖尿病(I型)朗-伊綜合征蹄葉炎扁平苔蘚狼瘡樣肝炎狼瘡淋巴細(xì)胞減少梅尼埃病混合型結(jié)締組織病多發(fā)性硬化重癥肌無力惡性貧血多腺體綜合征早老性癡呆原發(fā)性丙種球蛋白缺乏癥原發(fā)性膽汁性肝硬化牛皮癬牛皮癬性關(guān)節(jié)炎雷諾氏現(xiàn)象習(xí)慣性流產(chǎn)萊特爾綜合征風(fēng)濕熱類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎
Sampter綜合征血吸蟲病施密特綜合征硬皮病許曼綜合征斯耶格倫綜合征全身肌強(qiáng)直綜合征交感性眼炎系統(tǒng)性紅斑狼瘡高安動(dòng)脈炎顳動(dòng)脈炎甲狀腺炎血小板減少甲狀腺毒癥中毒性表皮壞死松解癥B型胰島素抗性I型糖尿病潰瘍性結(jié)腸炎葡萄膜炎白斑病瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥韋格納肉芽腫病4.8.5自身免疫病的多種藥物治療也公開了治療自身免疫病的方法，該方法包括將有效量的示范性偶聯(lián)物和已知用于治療自身免疫病的另一種治療制劑給予需要的患者。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗自身免疫病藥包括但不限于表6所列藥物。
表6環(huán)孢菌素環(huán)孢菌素A麥考酚酸嗎乙酯西羅莫司他克莫司enanercept氯潑尼松硫唑嘌呤甲氨蝶呤環(huán)磷酰胺氯潑尼松氨基己酸氯喹羥化氯喹氫化可的松地塞米松苯丁酸氮芥DHEA達(dá)那唑溴麥角環(huán)肽美洛昔康英夫利昔單抗4.8.6傳染病的治療示范性偶聯(lián)物可用于殺傷或抑制產(chǎn)生傳染病的細(xì)胞增殖或治療傳染病。因此，示范性偶聯(lián)物可以各種形式用于治療患者的傳染病。藥物-接頭-配體偶聯(lián)物可用于將藥物遞送給靶細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，配體單元能與傳染病細(xì)胞結(jié)合。
在一個(gè)實(shí)施方式中，該偶聯(lián)物殺傷產(chǎn)生具體傳染病的細(xì)胞或抑制其增殖。
可用示范性偶聯(lián)物治療的傳染病的具體類型包括但不限于表7所述疾病。
表7細(xì)菌病白喉百日咳神秘菌血癥尿路感染胃腸炎蜂窩織炎會(huì)厭炎氣管炎腺樣肥大咽后膿腫膿皰病臁瘡肺炎心內(nèi)膜炎膿毒性關(guān)節(jié)炎肺炎球菌腹膜炎菌血癥(Bactermia)腦膜炎急性化膿性腦膜炎尿道炎子宮頸炎直腸炎咽炎輸卵管炎附睪炎淋病梅毒李斯特氏菌病炭疽病諾卡菌病沙門氏菌病傷寒痢疾結(jié)膜炎竇炎普魯氏菌病兔熱病(Tullaremia)霍亂黑死病破傷風(fēng)壞死性腸炎放線菌病混合型厭氧性感染梅毒回歸熱鉤端螺旋體病萊姆病鼠咬熱結(jié)核病淋巴結(jié)炎麻風(fēng)病衣原體衣原體肺炎沙眼包涵體性結(jié)膜炎全身性真菌病組織胞漿菌病球孢子菌病芽生菌病孢子絲菌病隱球酵母病全身性念珠菌病曲霉病毛霉菌病足分支菌病廣色霉菌病立克次氏體病斑疹傷寒洛磯山斑疹熱埃里希體病東方蜱傳播的立克次氏體病立克次氏體痘昆士蘭熱巴爾通體病寄生蟲病瘧疾巴倍斯焦蟲病非洲昏睡病恰加斯病利什曼病杜姆杜馬病弓形體病腦膜腦炎角膜炎阿米巴病賈第蟲病隱孢子蟲病等孢球蟲病無孢子蟲病微孢子蟲病蛔蟲病鞭蟲感染鉤蟲感染蟯蟲感染眼幼蟲遷移性匍行疹旋毛蟲病麥地那龍線蟲病淋巴絲蟲病羅阿絲蟲病盤尾絲蟲病犬心蟲病血吸蟲病游泳者癢病(Swimmer’s Itch)東方肺吸蟲東方肝吸蟲肝片吸蟲病姜片蟲病后睪吸蟲病絳蟲感染包蟲病泡狀棘球蚴病病毒病麻疹亞急性硬化性全腦炎感冒腮腺炎風(fēng)疹玫瑰疹傳染性紅斑水痘呼吸道合胞病毒感染哮吼細(xì)支氣管炎傳染性單核細(xì)胞增多癥脊髓灰質(zhì)炎皰疹性咽峽炎手足口病博恩霍爾姆病生殖器皰疹生殖器疣無菌性腦膜炎心肌炎心包炎胃腸炎獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)人免疫缺陷病毒(HIV)雷耶綜合征川畸綜合征流行性感冒支氣管炎病毒“游走性”肺炎(Viral“Walking”Pneumonia)急性發(fā)熱性呼吸系統(tǒng)疾病急性咽結(jié)膜熱流行性角膜結(jié)膜炎單純皰疹病毒1(HSV-1)單純皰疹病毒2(HSV-2)帶狀皰疹細(xì)胞肥大包涵體病狂犬病進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病庫魯病致命的家族性失眠癥克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各病Gerstmann-Straussler-Scheinker病熱帶痙攣性下肢輕癱西方馬腦炎加利福尼亞腦炎圣路易腦炎黃熱病登革熱淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎拉沙熱出血熱漢特病毒(Hantvirus)肺綜合征馬爾堡病毒感染埃博拉病毒感染天花4.8.7傳染病的多種藥物治療本文公開了治療傳染病的方法，該方法包括將示范性偶聯(lián)物和作為抗傳染病藥的另一治療制劑給予需要的患者。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗傳染病藥是但不限于表8所列藥物。
表8β-內(nèi)酰胺抗生素類青霉素G青霉素V氯唑西林雙氯西林甲氧西林萘夫西林苯唑西林氨芐西林阿莫西林巴氨西林阿洛西林羧芐西林美洛西林哌拉西林替卡西林氨基糖苷類阿米卡星慶大霉素卡那霉素新霉素奈替米星鏈霉素妥布霉素大環(huán)內(nèi)酯類阿奇毒素克拉霉素紅霉素林可霉素克林霉素四環(huán)素類地美環(huán)素多西環(huán)素米諾環(huán)素土霉素四環(huán)素喹諾酮類西諾沙星萘啶酸氟喹諾酮類環(huán)丙沙星依諾沙星格帕沙星左氧氟沙星洛美沙星諾氟沙星氧氟沙星司帕沙星曲伐沙星多肽類桿菌肽多粘菌素E多粘菌素B磺胺類硫代異噁唑磺胺甲基異噁唑磺胺嘧啶磺胺甲二唑硫代乙酰胺其它抗菌藥甲氧芐啶磺胺甲二唑(Sulfamethazole)氯霉素去甲萬古霉素異甲硝唑奎奴普丁達(dá)福普汀利福平大觀霉素呋喃妥因抗病毒藥通用抗病毒藥碘苷(Idoxuradine)阿糖腺苷曲氟尿苷阿昔洛韋泛昔洛韋(Famcicyclovir)噴昔洛韋(Pencicyclovir)伐昔洛韋(Valacyclovir)更昔洛韋(Gancicyclovir)膦甲酸利巴韋林金剛烷胺金剛乙胺西多福韋反義寡核苷酸免疫球蛋白干擾素用于HIV感染的藥物替諾福韋Emtricitabine齊多夫定去羥肌苷扎西他濱司他夫定拉米夫定奈韋拉平地拉韋啶沙奎那韋利托那韋茚地那韋奈非那韋5.實(shí)施例實(shí)施例1-化合物AB的制備用DMF(120mL，0.2M)稀釋Fmoc-val-cit-PAB-OH(14.61g，24.3mmol，1.0當(dāng)量，F(xiàn)irestone等的美國專利號(hào)6214345)，將二乙胺(60mL)加入此溶液中。用HPLC監(jiān)測此反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在2小時(shí)內(nèi)完成。濃縮反應(yīng)混合物，超聲處理10分鐘時(shí)用乙酸乙酯(大約100mL)沉淀得到的殘留物。加入醚(200mL)，再將沉淀超聲處理5分鐘。不要攪拌，讓溶液靜置30分鐘，然后過濾，在高真空下干燥，產(chǎn)生Val-cit-PAB-OH，無需進(jìn)一步純化即可用于下一步驟。產(chǎn)率8.84g(96％)。用DMF(110mL)稀釋Val-cit-PAB-OH(8.0g，21mmol)，用MC-Osu處理得到的溶液(Willner等，(1993)Bioconjugate Chem.4521；6.5g，21mmol，1.0當(dāng)量)。根據(jù)HPLC，反應(yīng)在2小時(shí)后完成。濃縮反應(yīng)混合物，用乙酸乙酯(50mL)沉淀得到的油。超聲處理15分鐘后，加入醚(400mL)，再超聲處理混合物，直到所有大顆粒被打碎。然后過濾溶液，干燥固體，得到灰白色固體中間體。產(chǎn)率11.63g(96％)；ES-MSm/z 757.9[M-H]
用DMF(120mL，0.2M)稀釋Fmoc-val-cit-PAB-OH(14.61g，24.3mmol，1.0當(dāng)量，美國專利號(hào)6214345，授予Firestone等)，將二乙胺(60mL)加入此溶液中。用HPLC監(jiān)測此反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在2小時(shí)內(nèi)完成。濃縮反應(yīng)混合物，超聲處理10分鐘時(shí)用乙酸乙酯(大約100mL)沉淀得到的殘留物。加入醚(200mL)，再將沉淀超聲處理5分鐘。不要攪拌，讓溶液靜置30分鐘，然后過濾，在高真空下干燥，產(chǎn)生Val-cit-PAB-OH，無需進(jìn)一步純化即可用于下一步驟。產(chǎn)率8.84g(96％)。用DMF(110mL)稀釋Val-cit-PAB-OH(8.0g，21mmol)，用MC-Osu處理得到的溶液(Willner等，(1993)Bioconjugate Chem.4521；6.5g，21mmol，1.0當(dāng)量)。根據(jù)HPLC，反應(yīng)在2小時(shí)后完成。濃縮反應(yīng)混合物，用乙酸乙酯(50mL)沉淀得到的油。超聲處理15分鐘后，加入醚(400mL)，再超聲處理混合物，直到所有大顆粒被打碎。然后過濾溶液，干燥固體，得到灰白色固體中間體。產(chǎn)率11.63g(96％)；ES-MSm/z 757.9[M-H]。
用DMF(120mL，0.12M)稀釋灰白色固體中間體(8.0g，14.0mmol)，將雙(4-硝基苯基)碳酸酯(8.5g，28.0mmol，2.0當(dāng)量)和DIEA(3.66mL，21.0mmol，1.5當(dāng)量)加入得到的溶液中。根據(jù)HPLC，該反應(yīng)在1小時(shí)內(nèi)完成。濃縮反應(yīng)混合物，產(chǎn)生用EtOAc沉淀的油狀物，然后用EtOAc(約25mL)研磨。再用醚(約200mL)沉淀溶質(zhì)，研磨15分鐘。過濾固體，在高真空下干燥，產(chǎn)生化合物AB，根據(jù)HPLC其純度為93％，無需進(jìn)一步純化即可用于下一步驟。產(chǎn)率9.7g(94％)。
實(shí)施例2-制備化合物1 用二氯甲烷(3mL)稀釋苯丙氨酸叔丁酯鹽酸鹽(868mg，3mmol)、N-Boc-Dolaproine(668mg，1當(dāng)量)、DEPC(820μL，1.5當(dāng)量)和DIEA(1.2mL)。室溫(約28攝氏度)2小時(shí)后，用二氯甲烷(20mL)稀釋反應(yīng)混合物，用NaHCO3飽和水溶液(2×10mL)、NaCl飽和水溶液(2×10mL)依次洗滌。分離并濃縮有機(jī)層。將得到的殘留物重懸于乙酸乙酯，通過乙酸乙酯快速層析純化?；旌喜饪s相關(guān)餾分，產(chǎn)生二肽，為白色固體684mg(46％)。ES-MSm/z491.3[M+H]+。
對于在叔丁酯存在下選擇性Boc切割，用二噁烷(2mL)稀釋上述二肽(500mg，1.28mmol)。加入4M HCl/二噁烷(960μL，3當(dāng)量)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)混合物過夜。RP-HPLC觀察到BOC脫保護(hù)幾乎完全，叔丁酯被切割的量最小。在冰浴上冷卻混合物，加入三乙胺(500μL)。10分鐘后，從冰浴中取出混合物，用二氯甲烷(20mL)稀釋，用NaHCO3飽和水溶液(2×10mL)、NaCl飽和水溶液(2×10mL)依次洗滌。濃縮有機(jī)層，產(chǎn)生黃色泡沫287mg(57％)。無需進(jìn)一步純化即可使用該中間體。
在室溫下用TFA(3mL)、二氯甲烷(3mL)處理三肽Fmoc-Meval-val-dil-O-t-Bu(其制備如WO 02/088172，題為“五肽化合物及其相關(guān)用途”(Pentapeptide Compounds andUses Related Thereto)所述；0.73mmol)2小時(shí)。濃縮混合物至干燥，殘留物與甲苯(3×20mL)共蒸發(fā)，在真空下干燥過夜。用二氯甲烷(5mL)稀釋殘留物，加入該脫保護(hù)的二肽(287mg，0.73mmol)，然后加入DIEA(550μL，4當(dāng)量)，DEPC(201μL，1.1當(dāng)量)。室溫兩小時(shí)后，用乙酸乙酯(50mL)稀釋反應(yīng)混合物，用10％檸檬酸水溶液(2×20mL)、NaHCO3飽和水溶液(2×10mL)、NaCl飽和水溶液(10mL)依次洗滌。分離并濃縮有機(jī)層。將得到的殘留物重懸于乙酸乙酯，通過乙酸乙酯快速層析純化?；旌喜饪s相關(guān)餾分，產(chǎn)生Fmoc-Meval-val-dil-dap-phe-O-t-Bu，為白色固體533mg(71％)。Rf0.4(EtOAc)。ES-MSm/z1010.6[M+H]+。
用二氯甲烷(3mL)、二乙胺(1mL)稀釋該產(chǎn)物(200mg，0.2mmol)。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)混合物過夜。去除溶劑，產(chǎn)生油狀物，用硅膠快速層析以分步梯度的0-10％MeOH二氯甲烷溶液純化，產(chǎn)生化合物1，為白色固體137mg(87％)。Rf0.3(10％MeOH/CH2Cl2)。ES-MSm/z788.6[M+H]+。
實(shí)施例3-制備化合物2 通過4M HCl/二噁烷(4ml)室溫處理7小時(shí)由化合物1(30mg，0.038mmol)制備化合物2。去除溶劑，真空干燥殘留物過夜。產(chǎn)生化合物2，為吸濕性白色固體35mg(120％，以鹽酸鹽計(jì)算)。ES-MSm/z732.56[M+H]+。
實(shí)施例4-制備化合物3 在室溫下用4M HCl/二噁烷(4ml)處理Fmoc-Meval-val-dil-dap-phe-O-t-Bu(實(shí)施例2，50mg)16小時(shí)。去除溶劑，真空干燥殘留物過夜。產(chǎn)生50mg吸濕性白色固體中間體。
用二氯甲烷(1mL)稀釋該白色固體中間體(20mg，0.02mmol)；加入DEPC(5μL，0.03mmol，1.5當(dāng)量)，然后加入DIEA(11μL，0.06mmol，3當(dāng)量)，和叔丁胺(3.2μL，0.03mmol，1.5當(dāng)量)。室溫2小時(shí)后，RP-HPLC發(fā)現(xiàn)該反應(yīng)未完成。加入更多DEPC(10μL)和叔丁胺(5μL)，再攪拌反應(yīng)4小時(shí)。用二氯甲烷(15mL)稀釋反應(yīng)混合物，用水(5mL)、0.1M HCl水溶液(10mL)、NaCl飽和水溶液(10mL)依次洗滌。分離并濃縮有機(jī)層。用二氯甲烷稀釋得到的殘留物，通過快速層析以分步梯度的0-5％MeOH二氯甲烷溶液純化?；旌喜饪s相關(guān)餾分，產(chǎn)生Fmoc保護(hù)的中間體，為白色固體7.3mg(36％)。Rf0.75(10％MeOH/CH2Cl2)。
在室溫下，用二氯甲烷(0.5mL)稀釋Fmoc保護(hù)的中間體，并用二乙胺(0.5mL)處理3小時(shí)。濃縮反應(yīng)混合物至干燥。用硅膠快速層析以分步梯度的0-10％MeOH二氯甲烷溶液分離產(chǎn)物，產(chǎn)生化合物3，為白色固體4mg(70％)。Rf0.2(10％MeOH/CH2Cl2)。ES-MSm/z 787[M+H]+，809[M+Na]+。
實(shí)施例5-制備化合物4 用二氯甲烷(5mL)稀釋Boc-L-苯丙氨酸(265mg，1mmol，1當(dāng)量)和三甘醇單甲基醚(164μL，1mmol，1當(dāng)量)。然后加入DCC(412mg，2mmol，2當(dāng)量)，再加入DMAP(10mg)。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)混合物過夜。濾除沉淀。真空下去除溶劑，用乙酸乙酯稀釋殘留物，用乙酸乙酯硅膠快速層析純化。拉出含有產(chǎn)物的餾分，濃縮，真空干燥產(chǎn)生白色固體377mg(91％)。Rf0.5(EtOAc)。ES-MSm/z 434[M+Na]+。
用二噁烷(10mL)和4M HCl/二噁烷(6mL)室溫下處理上述材料6小時(shí)去除Boc保護(hù)基團(tuán)。真空去除溶劑，真空干燥殘留物，產(chǎn)生白色固體。
用二氯甲烷(3mL)稀釋三甘醇單甲基醚苯甲酸酯的鹽酸鹽(236mg，0.458mmol，1當(dāng)量)和N-Boc-Dolaproine(158mg，0.55mmol，1.2當(dāng)量)。將DEPC(125μL，1.5當(dāng)量)加入混合物，然后加入DIEA(250μL，3當(dāng)量)。室溫2小時(shí)后，用乙酸乙酯(30mL)稀釋反應(yīng)混合物，用NaHCO3飽和水溶液(2×10mL)、10％檸檬酸水溶液(2×10mL)、NaCl飽和水溶液(10mL)依次洗滌。分離并濃縮有機(jī)層。將得到的殘留物重懸于乙酸乙酯，通過乙酸乙酯硅膠快速層析純化?；旌喜饪s相關(guān)餾分，產(chǎn)生白色泡沫中間體131mg(50％)。Rf0.25(EtOAc)。ES-MSm/z581.3[M+H]+。
在二氯甲烷(2mL)、TFA(0.5mL)中室溫2小時(shí)完成Boc脫保護(hù)。真空去除溶劑，殘留物與甲苯(3×25mL)共蒸發(fā)，然后真空干燥產(chǎn)生138mg二肽TFA鹽。
用二氯甲烷(2mL)稀釋Fmoc-Meval-val-dil-OH(實(shí)施例2，147 mg，0.23mmol，1當(dāng)量)和二肽TFA鹽(138mg)。將DEPC(63μL，1.5當(dāng)量)加入混合物中，然后加入DIEA(160μL，4當(dāng)量)。室溫2小時(shí)后，用二氯甲烷(30mL)稀釋反應(yīng)混合物，用10％檸檬酸水溶液(2×20mL)，NaCl飽和水溶液(20mL)依次洗滌。分離并濃縮有機(jī)層。將得到的殘留物重懸于二氯甲烷，通過硅膠快速層析以分步梯度的0-5％MeOH二氯甲烷溶液純化。混合并濃縮相關(guān)餾分，產(chǎn)生白色泡沫205mg(81％)。Rf0.4(10％MeOH/CH2Cl2)。ES-MSm/z1100.6[M+H]+，1122.4[M+Na]+。
通過用二乙胺(2mL)的二氯甲烷(6mL)溶液處理去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)。室溫6小時(shí)后，真空去除溶劑，用硅膠快速層析以分步梯度的0-10％MeOH二氯甲烷溶液分離產(chǎn)物?；旌喜饪s相關(guān)餾分。從二氯甲烷/己烷1∶1中蒸發(fā)后，獲得化合物4，為白色泡沫133mg(80％)。Rf0.15(10％MeOH/CH2Cl2)。ES-MSm/z878.6[M+H]+。
實(shí)施例6-制備化合物5
將Fmoc-Meval-val-dil-OH(實(shí)施例2，0.50g，0.78mmol)和dap-phe-OMe·HCl(0.3g，0.78mmol，根據(jù)Pettit，G.R.等Anti-Cancer Drug Design 1998，13，243-277制備)溶解于CH2Cl2(10mL)，然后加入二異丙基乙胺(0.30mL，1.71mmol，2.2當(dāng)量)。加入DEPC(0.20mL，1.17，1.5當(dāng)量)，將反應(yīng)物置于Ar中。根據(jù)HPLC，反應(yīng)在1小時(shí)內(nèi)完成。將混合物濃縮成油狀物，用SiO2層析(300×25mm柱)純化，用100％EtOAc洗脫。分離得到產(chǎn)物，為白色泡沫狀固體。產(chǎn)率0.65g(87％)。ES-MSm/z968.35[M+H]+，991.34[M+Na]+；UVλmax215，265nm。
用二乙胺(2mL)處理Fmoc保護(hù)肽(0.14g，0.14mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液，將反應(yīng)物置于室溫下2小時(shí)。將根據(jù)HPLC監(jiān)測完成的反應(yīng)濃縮為油狀物，溶解于2mL DMSO中，注入制備型HPLC中(C12-RP柱，5μ，100_，以10-100％線性梯度的MeCN水溶液(含有0.1％TFA)洗脫40分鐘，然后以100％溶液洗脫20分鐘，流速為25mL/分鐘)。蒸發(fā)含有產(chǎn)物的餾分，產(chǎn)生三氟乙酸鹽白色粉末。產(chǎn)率0.126g(98％)。Rf0.28(100％EtOAc)；ES-MSm/z746.59[M+H]+，768.51[M+Na]+；UVλmax215nm。
實(shí)施例7-制備化合物6 將化合物5的三氟乙酸鹽(0.11g，0.13mmol)、化合物AB(0.103g，0.14mmol，1.1當(dāng)量)和HOBt(3.4mg，26μmol，0.2當(dāng)量)懸浮于DMF/比啶(分別為2mL/0.5mL)中。加入二異丙基乙胺(22.5μL，0.13mmol，1.0當(dāng)量)，在氬氣下攪拌黃色溶液。3小時(shí)后，再加入1.0當(dāng)量DIEA。24小時(shí)后，反應(yīng)混合物中包含0.5當(dāng)量活化接頭?？偣?0小時(shí)后，反應(yīng)完成。蒸發(fā)反應(yīng)物，溶解于DMSO中，注入制備型HPLC(C12-RP柱，5μ，100_，以10-100％線性梯度的MeCN水溶液(含有0.1％TFA)洗脫40分鐘，然后以100％溶液洗脫20分鐘，流速為50mL/分鐘)中。蒸發(fā)所需餾分，產(chǎn)生黃色油狀產(chǎn)物。加入二氯甲烷(約2mL)和過量醚，產(chǎn)生白色沉淀化合物6，過濾并干燥。產(chǎn)率90mg(52％)。ES-MSm/z1344.32[M+H]+，1366.29[M+Na]+；UVλmax215，248nm。
實(shí)施例8-制備化合物7 用DMF(1.5mL)稀釋化合物4(133mg，0.15mmol，1當(dāng)量)、化合物AB(123mg，0.167mmol，1.1當(dāng)量)和HOBt(4mg，0.2當(dāng)量)。2分鐘后，加入吡啶(5mL)，用RP-HPLC監(jiān)測反應(yīng)。顯示反應(yīng)在18小時(shí)內(nèi)完成。用二氯甲烷(20mL)稀釋反應(yīng)混合物，用10％檸檬酸水溶液(2×10mL)、水(10mL)、NaCl飽和水溶液(10mL)依次洗滌。分離并濃縮有機(jī)層。將得到的殘留物重懸于二氯甲烷，通過硅膠快速層析以分步梯度的0-10％MeOH二氯甲烷溶液純化。混合并濃縮相關(guān)餾分，產(chǎn)生化合物7，為白色泡沫46mg(21％)。Rf0.15(10％MeOH/CH2Cl2)。ES-MSm/z1476.94[M+H]+。
實(shí)施例9-制備MC-Val-Cit-PAB-MMAF叔丁酯8 在氬氣下將化合物1(83mg，0.11mmol)、化合物AB(85mg，0.12mmol，1.1當(dāng)量)和HOBt(2.8mg，21μmol，0.2當(dāng)量)溶解于無水DMF(1.5mL)和吡啶(0.3mL)中。30小時(shí)后，通過HPLC發(fā)現(xiàn)該反應(yīng)基本完成。蒸發(fā)混合物，溶解于最小量的DMSO中，用制備型HPLC(C12-RP柱，5μ，100_，以10-100％線性梯度的MeCN水溶液(含有0.1％TFA)洗脫40分鐘，然后以100％溶液洗脫20分鐘，流速為25mL/分鐘)純化，產(chǎn)生化合物8，為白色固體。產(chǎn)率103mg(71％)。ES-MSm/z1387.06[M+H]+，1409.04[M+Na]+；UVλmax205，248nm。
實(shí)施例10-制備MC-val-cit-PAB-MMAF9 將化合物8(45mg，32μmol)懸浮在二氯甲烷(6mL)中，然后加入TFA(3mL)。得到的溶液靜置2小時(shí)。真空濃縮反應(yīng)混合物，用制備型HPLC(C12-RP柱，5μ，100_，以10-100％線性梯度的MeCN水溶液(含有0.1％TFA)洗脫40分鐘，然后以100％溶液洗脫20分鐘，流速為25mL/分鐘)純化。濃縮所需餾分，獲得馬來酰亞氨基己酰基-纈氨酸-瓜氨酸-對羥甲基氨基苯-MMAF(MC-val-cit-PAB-MMAF)9，為灰白色固體。產(chǎn)率11mg(25％)。ES-MSm/z1330.29[M+H]+，1352.24[M+Na]+；UVλmax205，248nm。
實(shí)施例11-制備MC-val-cit-PAB-MMAF叔丁基酰胺10 用吡啶/DMF(6mL)稀釋化合物3(217mg，0.276mmol，1.0當(dāng)量)、化合物AB(204mg，0.276mmol，1.0當(dāng)量)和HOBt(11mg，0.0828mmol，0.3當(dāng)量)。將DIEA(0.048mL)加入此混合物，攪拌該混合物約16小時(shí)。真空下使揮發(fā)性有機(jī)物揮發(fā)。用Chromatotron_(放射狀薄層層析)以分步梯度的(0-5-10％甲醇的DCM溶液)純化粗殘留物，產(chǎn)生MC-val-cit-PAB-MMAF叔丁基酰胺10。產(chǎn)率172mg(45％)；ES-MSm/z1386.33[M+H]+，1408.36[M+Na]+；UVλmax215，248nm。
實(shí)施例12-通過偶聯(lián)AC10和MC-MMAE制備AC10-MC-MMAE用過量100mM二硫蘇糖醇(DTT)處理溶解于500mM硼酸鈉和500mM氯化鈉，pH8.0中的AC10。37℃孵育約30分鐘后，在Sephadex G25樹脂上洗脫交換緩沖液，用含有1mM DTPA的PBS洗脫。測定該溶液280nm吸光度確定還原抗體濃度和與DTNB(Aldrich，Milwaukee，WI)反應(yīng)測定412nm吸光度確定的巰基濃度測定巰基/抗體值。在冰上冷卻溶解于PBS的還原抗體。
將溶解于DMSO的藥物接頭試劑、馬來酰亞氨基己?；?單甲基耳抑素E即MC-MMAE，在乙腈和水中稀釋為已知濃度，加入預(yù)冷的還原抗體AC10的PBS溶液。約1小時(shí)后，加入過量馬來酰亞胺終止反應(yīng)，并給未反應(yīng)的抗體巰基加帽。離心超濾濃縮反應(yīng)混合物，純化AC10-MC-MMAE，并通過G25樹脂的PBS溶液洗脫脫鹽，在無菌條件下通過0.2μm濾器過濾，冷凍儲(chǔ)存。
實(shí)施例13-通過偶聯(lián)AC10和MC-MMAF制備AC10-MC-MMAF按照實(shí)施例12的方案，通過偶聯(lián)AC10和MC-MMAF制備AC10-MC-MMAF。
實(shí)施例14-通過偶聯(lián)AC10和MC-val-cit-PAB-MMAE制備AC10-MC-val-cit-PAB-MMAE按照實(shí)施例12的方案，通過偶聯(lián)AC10和MC-val-cit-PAB-MMAE制備AC10-MC-val-cit-PAB-MMAE。
實(shí)施例15-通過偶聯(lián)AC10和MC-val-cit-PAB-MMAF(9)制備A10-MC-val-cit-PAB-MMAF按照實(shí)施例12的方案，通過偶聯(lián)AC10和MC-val-cit-PAB-MMAF(9)制備AC10-MC-val-cit-PAB-MMAF。
實(shí)施例16-測定所選化合物的細(xì)胞毒性在Lewis Y陽性細(xì)胞系OVCAR-3、H3396乳腺癌、L2987肺癌和LS174t結(jié)腸癌上評價(jià)MMAF和化合物1-5的細(xì)胞毒活性?？蓽y定對Lewis Y陽性細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。為評價(jià)化合物1-5的細(xì)胞毒性，以每孔約5-10,000個(gè)細(xì)胞的密度將細(xì)胞接種到150μl培養(yǎng)基中，然后在試驗(yàn)開始時(shí)用分級(jí)劑量的化合物1-5(4復(fù)孔)處理。細(xì)胞毒試驗(yàn)通常在加入測試化合物后進(jìn)行96小時(shí)。在最后4-6小時(shí)孵育期間，可向各孔中加入50μl刃天青染料，以測定培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的活細(xì)胞。用熒光分光光度計(jì)以激發(fā)波長535nm和發(fā)射波長590nm測定染料的還原。在分析中，可比較刃天青被處理細(xì)胞還原的程度與被未處理對照細(xì)胞還原的程度。
在1小時(shí)接觸試驗(yàn)中，細(xì)胞可用藥物脈沖處理1小時(shí)，然后洗滌；可在孵育96小時(shí)后測定細(xì)胞毒作用。
實(shí)施例17-所選化合物的體外細(xì)胞毒數(shù)據(jù)表10顯示如通用步驟I所述測定了化合物7-10的cAC10偶聯(lián)物對CD30+細(xì)胞系Karpas299的作用。顯示了兩個(gè)單獨(dú)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)化合物7和9的cAC10偶聯(lián)物比cAC10-val-cit-MMAE的活性略高。
表10
在其他試驗(yàn)中，BR96-val-cit-MMAF的效果比游離的MMAF至少高250倍。
通用步驟I-細(xì)胞毒性測定。為評價(jià)示范性偶聯(lián)物7-10的細(xì)胞毒性，以每孔約5-10,000的密度將細(xì)胞接種到150μl培養(yǎng)基中，然后在試驗(yàn)開始時(shí)用分級(jí)劑量的示范性偶聯(lián)物7-10(4復(fù)孔)處理。細(xì)胞毒試驗(yàn)通常在加入測試化合物后進(jìn)行96小時(shí)。在最后4-6小時(shí)孵育期間，在各孔中加入50μl刃天青染料，以測定培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的活細(xì)胞。用熒光分光光度計(jì)以激發(fā)波長535nm和發(fā)射波長590nm測定染料的還原。在分析中，可比較刃天青被處理細(xì)胞還原的程度與被未處理對照細(xì)胞還原的程度。
實(shí)施例18-體外細(xì)胞增殖試驗(yàn)可用以下方案(Promega Corp.Technical Bulletin TB288；Mendoza等(2002)Cancer Res.625485-5488)的細(xì)胞增殖試驗(yàn)測定ADC的效果1.將培養(yǎng)基含有約104細(xì)胞(SKBR-3、BT474、MCF7或MDA-MB-468)的100μl細(xì)胞培養(yǎng)物等份加入到96孔不透明板的各孔中。
2.制備含有培養(yǎng)基但沒有細(xì)胞的對照孔。
3.將ADC加入試驗(yàn)孔中，孵育3-5天。
4.將該板平衡到室溫約30分鐘。
5.加入CellTiter-Glo試劑，其體積與各孔中存在的細(xì)胞培養(yǎng)基的體積相等。
6.在軌道搖床上混合諸成分2分鐘，誘導(dǎo)細(xì)胞裂解。
7.室溫孵育該板10分鐘，以穩(wěn)定發(fā)光信號(hào)。
8.記錄發(fā)光信號(hào)，以RLU＝相對發(fā)光單位作圖。
實(shí)施例19-大鼠的血漿清除率在Sprague-Dawley大鼠(Charles River Laboratories，各250-275克)中研究了抗體-藥物偶聯(lián)物和總抗體的血漿清除藥代動(dòng)力學(xué)特征。動(dòng)物通過尾靜脈推注(IV Push)給藥。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)經(jīng)頸靜脈插管或斷尾法(tail stick)收集約300μl全血至鋰/肝素抗凝的容器中，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)如下給藥后0(給藥前)、10和30分鐘；1、2、4、8、24和36小時(shí)；以及2、3、4、7、14、21、28天。用ELISA-ECD/GxhuFc-HRP測定總抗體。用ELISA-MMAE/MMAF/ECD-Bio/SA-HRP測定抗體-藥物偶聯(lián)物。
實(shí)施例20-猴的血漿清除率可在食蟹猴中研究抗體-藥物偶聯(lián)物和總抗體的血漿清除藥代動(dòng)力學(xué)特征。圖12顯示將H-MC-vc-MMAE以不同劑量0.5、1.5、2.5和3.0mg/kg在第1天和第21天給予食蟹猴后的二級(jí)血漿濃度清除率研究。測定隨時(shí)間推移的總抗體和ADC的濃度。(H＝曲妥珠單抗)。
實(shí)施例21-對轉(zhuǎn)基因外植體小鼠體內(nèi)腫瘤體積的效果適合于轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)的動(dòng)物可購自如Taconic(Germantown，N.Y.)等標(biāo)準(zhǔn)商業(yè)來源。許多品系是合適的，但優(yōu)選FVB雌性小鼠，因?yàn)樗鼈兏子谀[瘤形成。FVB雄性可用于交配，切除輸精管的CD.1雄性可用于激發(fā)假孕。切除輸精管的小鼠可購自任何商品供應(yīng)商。奠基鼠可繁育FVB小鼠或129/BL6×FVB p53雜合小鼠。p53等位基因雜合小鼠可用于增加腫瘤形成。一些F1腫瘤來自雜交品系。建立腫瘤鼠可僅為FVB。
可用單次劑量或多劑量的ADC IV注射治療帶有腫瘤(從Fo5 mmtv轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的同種異體移植物)的動(dòng)物。評估注射后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腫瘤體積。
實(shí)施例22-通過叔丁酯合成MC-MMAF合成1
將MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu(化合物1，128.6mg，0.163mmol)懸浮于CH2Cl2(0.500mL)中。加入6-馬來酰亞氨基己酸(68.9mg，0.326mmol)和1，3-二異丙基碳二亞胺(0.0505mL，0.326mmol)，然后加入吡啶(0.500mL)。攪拌反應(yīng)混合物1.0小時(shí)。HPLC分析表明完全消耗了起始化合物1。減壓蒸發(fā)掉揮發(fā)性有機(jī)物。通過快速柱層析以分步梯度的0-5％甲醇CH2Cl2溶液分離產(chǎn)物。共回收到96mg純凈的MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu(12)(60％產(chǎn)率)。ES-MSm/z981.26[M+H]+；1003.47[M+Na]+；979.65[M-H]-。
在室溫下將MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu(化合物12，74mg，0.0754mmol)懸浮于CH2Cl2(2.0mL)和TFA(1mL)中。2.5小時(shí)后，HPLC分析表明完全消耗了原材料。減壓蒸發(fā)掉揮發(fā)性有機(jī)物，通過制備型RP-HPLC用Phenomenex C12SynergiMax-RP 80_柱(250×21.20 mm)分離產(chǎn)物。洗脫線性梯度l0％-90％MeCN/0.05％TFA(水溶液)洗脫30分鐘，再用90％MeCN/0.05％TFA(水溶液)等度洗脫20分鐘。ES-MSm/z925.33[M+H]+；947.30[M+Na]+；923.45[M-H]-。
實(shí)施例23a-通過二甲氧基芐基酯合成MC-MMAF(11)合成2
制備Fmoc-L-苯丙氨酸-2，4-二甲氧基芐基酯(Fmoc-Phe-ODMB)在3頸5-L圓底燒瓶中裝入Fmoc-L-苯丙氨酸(200g，516mmol Bachem)、2，4-二甲氧基芐基醇(95.4g，567mmol，Aldrich)和CH2Cl2(2.0L)。在N2下用20分鐘將N，N-二甲基甲酰胺叔丁基縮醛(155mL，586mmol，F(xiàn)luka)加入得到的懸液中，產(chǎn)生清澈的溶液。室溫下攪拌該反應(yīng)物過夜，然后，TLC分析(0.42，庚烷/EtOAc＝2∶1)表明反應(yīng)完成。減壓濃縮反應(yīng)混合物，產(chǎn)生淡黃色油狀物，再溶解于CH2Cl2(200mL)中，通過硅膠短塞(25cm×25cm，CH2Cl2)純化，產(chǎn)生無色泡沫(250g)。將MeCN(1L)加入得到的泡沫中能完全溶解該物質(zhì)。然后濃縮干燥，再溶解于MeCN(1L)，攪拌得到的懸液1小時(shí)，過濾，用MeCN(2×200mL)洗滌濾餅，產(chǎn)生Fmoc-L-苯丙氨酸-2，4-二甲氧基芐基酯，為白色固體(113.58g，41％，95.5％AUC，HPLC分析)。數(shù)據(jù)HPLC。
制備L-苯丙氨酸-2，4-二甲氧基芐基酯(Phe-ODMB)在500-mL圓底燒瓶中裝入Fmoc-L-苯丙氨酸-2，4-二甲氧基芐基酯(26.00g，48.3mmol)、CH2Cl2(150mL)和二乙胺(75mL，Acros)。室溫?cái)嚢杌旌衔铮肏PLC監(jiān)測反應(yīng)完成。4小時(shí)后，濃縮混合物(水浴溫度＜30℃)。將殘留物重懸于CH2Cl2(200mL)并濃縮。重復(fù)該步驟一次。將MeOH(20mL)加入殘留物，這引起凝膠形成。用CH2Cl2(200mL)稀釋該殘留物，濃縮，真空下過夜產(chǎn)生渾濁油狀物。將殘留物懸浮于CH2Cl2(200mL)中，然后加入甲苯(120mL)。濃縮該混合物，真空下過夜產(chǎn)生殘留物。
數(shù)據(jù)HPLC，1H NMR。
制備Fmoc-Dolaproine(Fmoc-Dap)將Boc-Dolaproine(58.8g，0.205mol)懸浮于4 N HCl的1，4-二噁烷(256mL，1.02mol，Aldrich)溶液。攪拌1.5小時(shí)后，TLC分析表明反應(yīng)完成(10％MeOH/CH2Cl2)，濃縮反應(yīng)物至接近干燥。再加入1，4-二噁烷(50mL)，濃縮該混合物至干燥，真空干燥過夜。將得到的白色固體溶于H2O(400mL)中，轉(zhuǎn)移到裝有機(jī)械攪拌器和溫度探頭的3-L三頸圓底燒瓶中。用1分鐘加入N，N-二異丙基乙胺(214.3mL，1.23mol，Acros)，導(dǎo)致放熱，溫度從20.5升至28.2℃(內(nèi)部)。冰浴冷卻該混合物，加入1，4-二噁烷(400mL)。用15分鐘從加料漏斗加入Fmoc-OSu(89.90g，0.267mol，Advanced ChemTech)的1，4-二噁烷(400mL)溶液，將反應(yīng)溫度維持在9℃以下。讓混合物回復(fù)到室溫，攪拌19小時(shí)，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法將該混合物濃縮成水性漿液(390g)。用H2O(750mL)和Et2O(750mL)稀釋懸液，形成許多白色沉淀。分層，固體保持在有機(jī)層中。用濃鹽酸(30mL)酸化水層，并用EtOAc(3×500mL)萃取。用MgSO4干燥合并的萃取物，過濾并濃縮產(chǎn)生59.25g黃色油狀物A。用NaHCO3飽和溶液(200mL)萃取一次Et2O萃取物，固體保持在水層中。用濃鹽酸(50mL)酸化水性懸液，用Et2O(50mL)萃取，固體保持在有機(jī)層中。過濾有機(jī)層，濃縮產(chǎn)生32.33g黃色油狀物B?；旌线@兩種油狀物(A和B)，用硅膠快速層析純化，用CH2Cl2(3.5L)洗脫，然后用3％MeOH/CH2Cl2(9L)洗脫，產(chǎn)生68.23g白色泡沫狀Fmoc-dolaproine(81％，HPLC測定純度為97.5％(AUC))。
制備Fmoc-Dap-Phe-ODMB
將粗Phe-ODMB(48.3mmol)懸浮于無水DMF(105mL，Acros)中5分鐘，加入Fmoc-Dap(19.80g，48.3mmol)。冰浴冷卻混合物，加入TBTU(17.08g，53.20mmol，Matrix Innovations)。用3分鐘通過注射器加入N，N-二異丙基乙胺(25.3mL，145.0mmol，Acros)。1小時(shí)后，移開冰浴，使混合物溫暖30分鐘。將該混合物傾入水(1L)中，用乙酸乙酯(300mL)萃取。分層后，再用乙酸乙酯(2×150mL)萃取水層。用鹽水(150mL)洗滌合并的有機(jī)層，干燥(MgSO4)并過濾(濾紙)，以去除不溶物(無機(jī)物和一些二苯并富烯)。濃縮后，殘留物(41g)吸附在二氧化硅(41g)上，用層析(22cm×8cm柱；65％庚烷/EtOAc(2.5L)；33％庚烷/EtOAc(3.8L)純化，產(chǎn)生29.4g白色泡沫狀產(chǎn)物(86％，HPLC測定純度為92％)。
數(shù)據(jù)HPLC，1H NMR，TLC(1∶1 EtOAc/庚烷Rf＝0.33，香蘭素染色為紅色)。
制備Dap-Phe-ODMB在1-L圓底燒瓶中裝入Fmoc-Dap-Phe-ODMB(27.66g)、CH2Cl2(122mL)和二乙胺(61mL，Acros)。室溫?cái)嚢柙撊芤?，用HPLC監(jiān)測反應(yīng)完成。7小時(shí)后，濃縮混合物(水浴溫度＜30℃)。將殘留物懸浮于CH2Cl2(300mL)中并濃縮。重復(fù)該步驟兩次。將MeOH(20mL)和CH2Cl2(300mL)加入殘留物，濃縮該溶液。將殘留物懸浮于CH2Cl2(100mL)和甲苯(400mL)中，濃縮，真空下過夜產(chǎn)生的殘留物，得到乳膏樣殘留物。
數(shù)據(jù)HPLC，1H NMR，MS。
制備Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB將粗制Dap-Phe-ODMB(39.1mmol)懸浮于無水DMF(135mL，Acros)中5分鐘，加入Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH(24.94g，39.1mmol，制備參見實(shí)施例2)。冰浴冷卻混合物，加入TBTU(13.81g，43.0mmol，Matrix Innovations)。用2分鐘通過注射器加入N，N-二異丙基乙胺(20.5mL，117.3mmol，Acros)s。1小時(shí)后，移開冰浴，使混合物溫暖30分鐘。將該混合物傾入水(1.5L)中，用乙酸乙酯(480mL)稀釋。靜置15分鐘后，分層，用乙酸乙酯(300mL)萃取水層。用鹽水(200mL)洗滌混合的有機(jī)層，干燥(MgSO4)并過濾(濾紙)，以去除不溶物(無機(jī)物和一些二苯并富烯)。濃縮后，從燒瓶上刮下殘留物(49g)，使其吸附在二氧化硅(49g)上，用層析(直徑15cm×10cm柱；2∶1EtOAc/庚烷(3L)，EtOAc(5L)；250mL餾分)純化，產(chǎn)生31.84g白色泡沫狀Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB(73％，HPLC測定純度為93％(AUC))。
數(shù)據(jù)HPLC，TLC(2∶1 EtOAc/庚烷，Rf＝0.21，香蘭素染色為紅色)。
制備MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB在1-L圓底燒瓶中裝入Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB(28.50g)、CH2Cl2(80mL)和二乙胺(40mL)。室溫?cái)嚢杌旌衔镞^夜，然后減壓濃縮。將殘留物吸附在二氧化硅(30g)上，用快速層析(直徑15cm×8cm柱；2％MeOH/DCM(2L)，3％MeOH/DCM(1L)，6％MeOH/DCM(4L)；250mL餾分)純化，產(chǎn)生15.88g白色泡沫狀MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB(69％，HPLC測定純度為96％(AUC))。
數(shù)據(jù)HPLC，TLC(6％MeOH/DCM，Rf＝0.24，香蘭素染色為紅色)。
制備MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB室溫在50-mL圓底燒瓶中裝入MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB(750mg，0.85mmol)、無水DMF(4mL)、馬來酰亞氨基己酸(180mg，0.85mmol)和TBTU(300mg，0.93mmol，Matrix Innovations)。通過注射器加入N，N-二異丙基乙胺(450μL，2.57mmol)。1.5小時(shí)后，將該混合物傾入水(50mL)中，用乙酸乙酯(30mL)稀釋。加入NaCl以改善分層。分層后，用乙酸乙酯(25mL)萃取水層。干燥(MgSO4)、過濾和濃縮混合的有機(jī)層。用快速層析[100mL二氧化硅；25％庚烷/EtOAc(100mL)，10％庚烷/EtOAc(200mL)，EtOAc(1.5L)]純化得到的油狀物(1g)，產(chǎn)生白色泡沫狀MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB(13)(521mg，57％，HPLC測定純度為94％(AUC))。
數(shù)據(jù)1H NMR，HPLC。
制備MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH(MC-MMAF)(11)在50-mL圓底燒瓶中裝入溶解于2.5％TFA/CH2Cl2(20mL)中的MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB(化合物13，428mg，0.39mmol)。該溶液在2分鐘后變成粉-紫色。用HPLC和TLC(6％MeOH/DCM，KMnO4染色)監(jiān)測反應(yīng)完成。40分鐘后，加入三滴水，濃縮混濁的粉-紫色混合物，產(chǎn)生521mg粉紅色殘留物。用層析(15％IPA/DCM)純化產(chǎn)生270mg MC-MMAF(73％，HPLC測定純度為92％)，為白色固體。
實(shí)施例23b-合成mc-MMAF的類似物
將MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu(化合物1，35mg，0.044mmol)懸浮于DMF(0.250mL)中。加入4-(2，5-二氧-2，5-二氫-吡咯-1-基)-苯甲酸(11mg，0.049mmol)和HATU(17mg，0.044mmol)，然后加入DIEA(0.031mL，0.17mmol)。攪拌此反應(yīng)混合物2.0小時(shí)。HPLC分析表明完全消耗了起始化合物1。
通過制備型RP-HPLC，用Phenomenex C12Synergi Max-RP 80_柱(250×21.20mm)分離產(chǎn)物。洗脫線性梯度10％-80％MeCN/0.05％TFA(水溶液)洗脫8分鐘，然后再用80％MeCN/0.05％TFA(水溶液)等度洗脫12分鐘。總共分離得到20mg純凈產(chǎn)物(14)(0.02mmol，產(chǎn)率46％)。ES-MSm/z987.85[M+H]+；1019.41[M+Na]+；985.54[M-H]-。
將MB-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu(化合物14，38mg，0.0385mmol)懸浮于CH2Cl2(1mL)和TFA(1mL)中。攪拌混合物2.0小時(shí)，然后減壓蒸發(fā)掉揮發(fā)性有機(jī)物。通過制備型RP-HPLC，用Phenomenex C12Synergi Max-RP 80_柱(250×21.20mm)純化產(chǎn)物。洗脫線性梯度10％-80％MeCN/0.05％TFA(水溶液)洗脫8分鐘，然后再用80％MeCN/0.05％TFA(水溶液)等度洗脫12分鐘?？偣卜蛛x得到14.4mg MB-MMAF產(chǎn)物(0.015mmol，產(chǎn)率40％)。ES-MSm/z930.96[M+H]+952.98[M+Na]+；929.37[M-H]-。
實(shí)施例23c-制備MC-MeVal-Cit-PAB-MMAF(16)
將DIEA(4.48mL，25.71mmol)加入Fmoc-MeVal-OH(3.03g，8.57mmol)和N，N’-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(3.29g，12.86mmol)的CH2Cl2(80mL)室溫懸浮液中。攪拌此反應(yīng)混合物3.0小時(shí)，然后傾入分液漏斗，用0.1M HCl(水溶液)萃取有機(jī)混合物。減壓濃縮粗制有機(jī)殘留物，通過硅膠快速柱層析用20-100％乙酸乙酯/己烷線性梯度分離產(chǎn)物。總共回收2.18g純凈的Fmoc-MeVal-OSu(4.80mmol，產(chǎn)率56％)。
將L-瓜氨酸(0.85g，4.84mmol)和NaHCO3(0.41g，4.84mmol)的H2O(13mL)溶液加入Fmoc-MeVal-OSu(2.18g，4.84mmol)的DME(13mL)和THF(6.5mL)的室溫懸浮液中。室溫?cái)嚢柙搼腋∫?6小時(shí)，然后將其萃取到叔BuOH/CHCl3/H2O中，用1MHCl酸化至pH＝2-3。分離、干燥和減壓濃縮有機(jī)相。用二乙醚研磨殘留物，產(chǎn)生2.01g Fmoc-MeVal-Cit-COOH，無需進(jìn)一步純化即可使用。
將粗制Fmoc-MeVal-Cit-COOH懸浮于2∶1 CH2Cl2/MeOH(100mL)中，加入對氨基芐基醇(0.97g，7.9mmol)和EEDQ(1.95g，7.9mmol)。攪拌此懸浮液125小時(shí)，然后減壓去除揮發(fā)性有機(jī)物，通過硅膠快速柱層析用10％MeOH/CH2Cl2純化殘留物?；厥盏郊儍舻腇moc-MeVal-Cit-PAB-OH(0.55g，0.896mmol，產(chǎn)率18.5％)。ES-MSm/z616.48[M+H]+。
將STRATOSPHEREStm(哌嗪-樹脂-結(jié)合)(＞5mmol/g，150mg)加入Fmoc-MeVal-Cit-PAB-OH(0.55g，0.896mmol)的CH2Cl2(40mL)懸液中。室溫?cái)嚢?6小時(shí)后，通過硅藻土(用MeOH預(yù)洗滌)過濾該混合物，減壓濃縮。用二乙醚和己烷研磨殘留物。產(chǎn)生固體物質(zhì)MeVal-Cit-PAB-OH，將它懸浮于CH2Cl2(20mL)中，加入MC-OSu(0.28g，0.896mmol)、DIEA(0.17mL，0.99mmol)和DMF(15mL)。攪拌此懸浮液16小時(shí)，但反應(yīng)混合物的HPLC分析顯示反應(yīng)不完全，因此減壓濃縮懸液得到6mL體積，然后加入10％NaHCO3(水溶液)，再攪拌該懸液16小時(shí)。減壓去除溶劑，通過硅膠快速柱層析用0-10％MeOH/CH2Cl2梯度純化殘留物，產(chǎn)生42mg(0.072mmol，產(chǎn)率8％)MC-MeVal-Cit-PAB-OH。
將DIEA(1.06mL，6.06mmol)加入MC-MeVal-Cit-PAB-OH(2.37g，4.04mmol)和雙(硝基苯基)碳酸酯(2.59g，8.52mmol)的CH2Cl2(10mL)懸浮溶液中。攪拌此懸液5.5小時(shí)，減壓濃縮，用二乙醚研磨純化。將MC-MeVal-Cit-PAB-OCO-pNP(147mg，0.196mmol)懸浮于1∶5吡啶/DMF溶液(3mL)中，加入HOBt(5mg，0.039mmol)、DIEA(0.17mL，0.978mmol)和MMAF(化合物2，150mg，0.205mmol)。室溫?cái)嚢璐朔磻?yīng)混合物16小時(shí)，然后通過制備型RP-HPLC(x3)，用Phenomenex C12SynergiMax-RP 80_柱(250×21.20mm)純化。洗脫線性梯度10％-90％MeCN/0.05％TFA(水溶液)洗脫30分鐘，然后再用90％MeCN/0.05％TFA(水溶液)等度洗脫20分鐘。獲得的MC-MeVal-Cit-PAB-MMAF(16)是淡黃色固體(24.5mg，0.0182，產(chǎn)率0.45％)。ES-MSm/z 1344.95[M+H]+；1366.94[M+Na]+。
實(shí)施例23d-制備環(huán)庚基-Val-Cit-PAB-MMAF(17)的琥珀酰亞胺酯將化合物1(300mg，0.38mmol)、Fmoc-Val-Cit-PAB-pNP(436mg，0.57mmol，1.5當(dāng)量)懸浮于5mL無水吡啶中。加入HOBt(10mg，0.076mmol，0.2當(dāng)量)，然后加入DIEA(199μl，1.14mmol，3當(dāng)量)。超聲處理反應(yīng)混合物10分鐘，然后室溫?cái)嚢柽^夜。減壓去除吡啶，將殘留物重懸于CH2Cl2中。通過硅膠快速層析以分步梯度的0-10％MeOH CH2Cl2溶液分離混合物。拉出含有產(chǎn)物的餾分，濃縮，真空下干燥過夜，產(chǎn)生317mg(產(chǎn)率59％)Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAF-OtBu。ES-MSm/z 1415.8[M+H]+。
在20％TFA/CH2Cl2(10mL)中攪拌Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAF-OtBu(100mg)2小時(shí)。用CH2Cl2(50mL)稀釋混合物。用水(2×30mL)和鹽水(1×30mL)依次洗滌有機(jī)層。濃縮有機(jī)相，加到含10％MeOH/CH2Cl2的硅膠墊上。用30％MeOH/CH2Cl2洗脫得到產(chǎn)物。真空下干燥過夜后，獲得Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAF，為白色固體，38mg，產(chǎn)率40％。ES-MSm/z 1357.7[M-H]-。
將67mg Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAF懸浮于CH2Cl2(2mL)二乙胺(2mL)和DMF(2mL)。室溫?cái)嚢杌旌衔?小時(shí)。減壓去除溶劑。將殘留物與吡啶(2mL)共蒸發(fā)，然后與甲苯(2×5mL)共蒸發(fā)，真空干燥。獲得淡褐色油狀Val-Cit-PAB-MMAF，無需進(jìn)一步純化即可使用。
將用67mg Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAF制備的所有Val-Cit-PAB-MMAF懸浮于吡啶(2mL)中，加入二琥珀酰亞胺基辛二酸酯(74mg，0.2mmol，4當(dāng)量)的吡啶(1mL)溶液中。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)混合物。3小時(shí)后，加入醚(20mL)。收集沉淀，用額外量的醚洗滌。將淡紅色固體懸浮于30％MeOH/CH2Cl2中，通過硅膠墊過濾以30％MeOH/CH2Cl2作為洗脫液。獲得的化合物17為白色固體，20mg(產(chǎn)率29％)。ES-MSm/z1388.5[M-H]-實(shí)施例24-mcMMAF抗體-藥物偶聯(lián)物的體內(nèi)效果cAC10-mcMMAF在Karpas-299 ALCL異種移植物中的效果為評價(jià)平均每個(gè)抗體4個(gè)藥物部分(cAC10-mcF4)的cAC10-mcMMAF的體內(nèi)效果，將Karpas-299人ALCL細(xì)胞植入免疫缺陷型C.B-17 SCID小鼠(每只小鼠5×106細(xì)胞)皮下。用式(0.5×L×W2)(其中L和W是兩個(gè)雙向測量值的較長值和較短值)測量腫瘤體積。當(dāng)研究動(dòng)物中平均腫瘤體積達(dá)到約100mm3(范圍48-162)時(shí)，將小鼠分為3組(每組5只小鼠)，不治療，或通過尾靜脈靜脈內(nèi)單次注射給予1或2mg/kg的cAC10-mcF4(圖1)。在開始治療后7天內(nèi)，未治療小鼠中腫瘤快速生長到平均體積＞1,000mm3。相反，所有cAC10-mcF4治療的腫瘤顯示出快速消退，1mg/kg組中3/5，2mg/kg組中5/5獲得完全腫瘤消退反應(yīng)。雖然2mg/kg組中完全反應(yīng)鼠之一在約4周后腫瘤復(fù)發(fā)，但是此組中其余4/5反應(yīng)鼠以及1mg/kg組中3只完全反應(yīng)鼠在治療后10周都未檢測到腫瘤。
cBR96-mcMMAF在L2987 NSCLC異種移植物中的效果cBR96是識(shí)別LeY抗原的嵌合抗體。為評價(jià)每個(gè)抗體4個(gè)藥物(cBR96-mcF4)的cBR96-mcMMAF的體內(nèi)效果，將L2987非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)腫瘤片段植入無胸腺裸小鼠中。當(dāng)腫瘤平均生長到約100mm3時(shí)，將小鼠分為3組未治療組和2個(gè)治療組。對于治療組而言，如圖3a所示，將cBR96-mcF4給予小鼠，劑量為每4天3或10mg/kg/注射，共注射4次(q4d×4)。如圖3b所示，將cBR96-mcF4或非結(jié)合對照偶聯(lián)物，cAC10-mcF4給予小鼠，劑量為每4天10mg/kg/注射，共注射4次(q4d×4)。如圖3a和3b所示，與對照相比，BR96-mcF4產(chǎn)生顯著的腫瘤生長延遲。
圖2顯示了cAC10-mcMMAF對皮下(植入)L540CY的體內(nèi)單次劑量的藥效試驗(yàn)。此研究中，未治療組中有4只小鼠，各治療組中有10只。
實(shí)施例25-MC-MMAF抗體-藥物偶聯(lián)物的體外效果cAC10-抗體-藥物偶聯(lián)物對CD30+細(xì)胞系的活性。圖4a和16b顯示代表性試驗(yàn)中的劑量反應(yīng)曲線，其中用連續(xù)稀釋的cAC10-mcMMAF(圖4a)或cAC10-vcMMAF(圖4b)培育Karpas 299(間變性大細(xì)胞淋巴瘤)和L428(霍奇金淋巴瘤)培養(yǎng)物96小時(shí)。用50μM刃天青[7-羥基-3H-吩噁嗪-3-酮10-氧化物]標(biāo)記該培養(yǎng)物4小時(shí)，測量熒光。在GraphPad Prism4.00版中用4-參數(shù)劑量反應(yīng)曲線擬合法還原所得數(shù)據(jù)。IC50值定義為與未處理對照培養(yǎng)物相比生長降低50％時(shí)的濃度。各濃度測定四次。
cBR96-抗體-藥物偶聯(lián)物對Ley+細(xì)胞系的活性。圖5a和5b顯示代表性試驗(yàn)中的劑量反應(yīng)曲線，其中用連續(xù)稀釋的cBR96-mcMMAF(圖5a)或-vcMMAF(圖5b)培育H3396(乳腺癌)和L2987(非小細(xì)胞肺癌)培養(yǎng)物96小時(shí)。用50μM刃天青標(biāo)記該培養(yǎng)物4小時(shí)，測定熒光。在GraphPad Prism 4.00版中用4-參數(shù)劑量反應(yīng)曲線擬合法還原所得數(shù)據(jù)。IC50值定義為與未處理對照培養(yǎng)物相比生長降低50％時(shí)的濃度。各濃度測定四次。
c1F6-抗體-藥物偶聯(lián)物對CD70+腎細(xì)胞癌細(xì)胞系的活性。圖6a和6b顯示代表性試驗(yàn)中的劑量反應(yīng)曲線，其中用連續(xù)稀釋的c1F6-mcMMAF(圖6a)或-vcMMAF(圖6b)培育Caki-1和786-O細(xì)胞培養(yǎng)物96小時(shí)。用50μM刃天青標(biāo)記該培養(yǎng)物4小時(shí)，測定熒光。在GraphPad Prism4.00版中用4-參數(shù)劑量反應(yīng)曲線擬合法還原所得數(shù)據(jù)。IC50值定義為與未處理對照培養(yǎng)物相比生長降低50％時(shí)的濃度。各濃度測定四次。
實(shí)施例26-純化曲妥珠單抗將一小瓶440mg賀賽汀_(huMAb4D5-8，rhuMAb HER2，美國專利號(hào)5821337)抗體)溶解于50mLMES緩沖液(25mM MES，50mM NaCl，pH5.6)中，加到以相同緩沖液中平衡的陽離子交換柱(Sepharose S，15cm×1.7cm)上。然后用相同緩沖液(柱體積的5倍)洗滌該柱。將緩沖液的NaCl濃度提高到200mM洗脫曲妥珠單抗。收集含有該抗體的餾分，稀釋到10mg/mL，用含有50mm磷酸鉀，50mMNaCl，2mMEDTA，pH6.5的緩沖液透析。
實(shí)施例27-通過偶聯(lián)曲妥珠單抗和MC-MMAE制備曲妥珠單抗-MC-MMAE
用過量100mM二硫蘇糖醇(DTT)處理溶解于500mM硼酸鈉和500mM氯化鈉，pH8.0中的曲妥珠單抗。37℃孵育約30分鐘后，在Sephadex G25樹脂上洗脫交換緩沖液，用含有1mM DTPA的PBS洗脫。測定該溶液280nm吸光度確定的還原抗體濃度和通過與DTNB(Aldrich，Milwaukee，WI)反應(yīng)測定412nm吸光度確定巰基濃度測定巰基/抗體值。將還原抗體溶于冰冷卻的PBS。
溶于DMSO的藥物接頭試劑、馬來酰亞氨基己酰基-單甲基耳抑素E(MMAE)即MC-MMAE，以乙腈和水稀釋為已知濃度，加入預(yù)冷的還原性抗體曲妥珠單抗的PBS溶液。約1小時(shí)后，加入過量馬來酰亞胺終止反應(yīng)，并給未反應(yīng)的抗體巰基加帽。離心超濾濃縮反應(yīng)混合物，純化曲妥珠單抗-MC-MMAE，并通過G25樹脂的PBS溶液洗脫脫鹽，在無菌條件下通過0.2μm濾器過濾，冷凍儲(chǔ)存。
實(shí)施例28-通過偶聯(lián)曲妥珠單抗和MC-MMAF制備曲妥珠單抗-MC-MMAF按照實(shí)施例27的步驟，通過偶聯(lián)曲妥珠單抗和MC-MMAF制備曲妥珠單抗-MC-MMAF。
實(shí)施例29-通過偶聯(lián)曲妥珠單抗和MC-val-cit-PAB-MMAE制備曲妥珠單抗-MC-val-cit-PAB-MMAE按照實(shí)施例27的步驟，通過偶聯(lián)曲妥珠單抗和MC-val-cit-PAB-MMAE制備曲妥珠單抗-MC-val-cit-PAB-MMAE。
實(shí)施例30-通過偶聯(lián)曲妥珠單抗和MC-val-cit-PAB-MMAF 9制備曲妥珠單抗-MC-val-cit-PAB-MMAF9按照實(shí)施例27的步驟，通過偶聯(lián)曲妥珠單抗和MC-val-cit-PAB-MMAF 9制備曲妥珠單抗-MC-val-cit-PAB-MMAF9。
實(shí)施例31-大鼠毒性在成年Sprague-Dawley大鼠(每只75-125克，Charles River實(shí)驗(yàn)室(Hollister，CA)中評價(jià)游離藥物和ADC的急性毒性反應(yīng)曲線。第一天注射動(dòng)物，獲得基線、第三和第五天獲得完整的化學(xué)和血液學(xué)曲線，第五天進(jìn)行完整的尸檢。對所有動(dòng)物進(jìn)行肝酶測定，對每組隨機(jī)選取三只動(dòng)物的下述組織進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)檢驗(yàn)胸骨、肝臟、腎臟、胸腺、脾臟、大小腸。各試驗(yàn)組結(jié)果如下
對于曲妥珠單抗-MC-val-cit-MMAF、曲妥珠單抗-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF、曲妥珠單抗-MC-MMAF和曲妥珠單抗-MC-val-cit-PAB-MMAF來說，利用MMAF分子量731.5和賀賽汀分子量145167來計(jì)算μgMMAF/m2。
體表面積計(jì)算如下[{(體重(g)的0.667次方)×11.8}/10000](《工業(yè)和審稿人指南》(Guidance for Industry and Reviewers)，2002)。
以10mL/kg劑量于實(shí)驗(yàn)第一天通過單次尾靜脈內(nèi)推注給予制劑溶液。第一天和其后每日注射前測量動(dòng)物體重。用含有EDTA的試管收集全血作血液學(xué)分析。將全血收集在血清分離試管中作臨床化學(xué)分析。在研究第-4、3和5天注射前收集血樣。尸檢前將全血收集到含有肝素鈉的試管中，血漿凍存于-70℃，用于后續(xù)可能分析。收集以下組織并置于中性福爾馬林緩沖液中作尸檢肝臟、腎臟、心臟、胸腺、脾臟、大腦、胸骨和包括胃、大小腸的胃腸道切片。檢查胸骨、小腸、大腸、肝、胸腺、脾臟和腎臟。
將各時(shí)間點(diǎn)肝相關(guān)血清酶水平與雌性Sprague-Dawley大鼠的正常范圍(第5和第95百分點(diǎn))作比較。將各時(shí)間點(diǎn)白細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)與雌性Sprague-Dawley大鼠的正常范圍(第5和第95百分點(diǎn))作比較。
正常雌性Sprague-Dawley大鼠中的高劑量研究
提交11只動(dòng)物的組織進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)分析。這些動(dòng)物為用曲妥珠單抗-MC-MMAF免疫偶聯(lián)物進(jìn)行急性劑量范圍毒性研究的一部分。給藥后跟蹤動(dòng)物12天。
實(shí)施例32-食蟹猴毒性/安全性將三組各四只(2雄2雌)幼年(naive)食蟹猴(Macaca fascicularis，Cynomolgusmonkey)用于曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAE和曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAF研究。試驗(yàn)第1和第22天進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥。
H＝曲妥珠單抗劑量表示為動(dòng)物體表面積以與其它物種相關(guān)，即μg/m2劑量與動(dòng)物種類無關(guān)，因此可進(jìn)行種間比較。ADC制劑含有PBS、5.4mM磷酸鈉、4.2mM磷酸鉀、140mM氯化鈉，pH6.5。
給藥前，以及每次給藥后5分鐘、6小時(shí)、10小時(shí)、和1、3、5、7、14、21天收集血液進(jìn)行血液學(xué)分析。用光散射法測定紅細(xì)胞(RBC)和血小板(PLT)數(shù)。用過氧化物酶/嗜堿法測定白細(xì)胞數(shù)。陽離子染色加光散射法測定網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)。在Advia120裝置上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用UV/NADH以U/L測定ALT(丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶)和AST(天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)；在Olympus AU400裝置上，利用總抗體ELISA-ECD/GxhuFc-HRP偶聯(lián)物抗體ELISA-MMAE/MMAF//ECD-Bio/SA-HRP試驗(yàn)進(jìn)行IFCC方法測定。
實(shí)施例33-人源化抗-ErbB2單克隆抗體4D5的產(chǎn)生和特征鑒定根據(jù)Fendly等(1990)Cancer Research 501550-1558所述產(chǎn)生特異性結(jié)合ErbB2胞外結(jié)構(gòu)域的鼠單克隆抗體4D5。簡要說，用含有25mM EDTA磷酸鹽緩沖液(PBS)收集根據(jù)Hudziak等Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)847158-7163(1987)所述產(chǎn)生的NIH3T3/HER2-3400細(xì)胞(表達(dá)大約1×105ErbB2分子/細(xì)胞)，用于免疫BALB/c小鼠。在第0、2、5、7周將含107細(xì)胞的0.5ml PBS注射入小鼠腹腔。在第9和13周，給產(chǎn)生能免疫沉淀32p-標(biāo)記的ErbB2抗血清的小鼠腹腔注射用麥芽凝集素-瓊脂糖(WGA)純化的ErbB2膜提取物。然后，靜脈注射0.1ml ErbB2制備物，取脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞系X63-Ag8.653融合。用ELISA和放射性免疫沉淀篩選雜交瘤上清ErbB2-結(jié)合抗體。
表位作圖和特征鑒定用競爭結(jié)合分析(Fendly等Cancer Research 501550-1558(1990))測定單克隆抗體4D5結(jié)合的ErbB2表位。用PANDEXTM篩選儀定量熒光以測定完整細(xì)胞上的直接熒光，進(jìn)行交叉阻斷研究。用已確立的方法(Wofsy等Selected Methods in CellularImmunology，第287頁，Mishel和Schiigi(編)San FranciscoW.J.Freeman Co.(1980))將異硫氰酸熒光素酯(FITC)偶聯(lián)于單克隆抗體。胰酶處理鋪滿的NIH 3T3/HER2-3400單層細(xì)胞，洗滌一次，以1.75×106細(xì)胞/ml重懸于含0.5％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％NaN3的冷PBS中。加入乳膠顆粒(IDC，Portland，OR)至終濃度為1％，以減少PANDEXTM培養(yǎng)板薄膜的堵塞。將20μl細(xì)胞懸液和20μl純化單克隆抗體(100μg/ml-0.1μg/ml)加入PANDEXTM培養(yǎng)板孔中冰上孵育30分鐘。將20μl預(yù)定稀釋度的FITC-標(biāo)記單克隆抗體加入各孔，孵育30分鐘，洗滌，用PANDEXTM定量熒光。與不相關(guān)單克隆抗體對照相比，如果其它抗體各阻斷了結(jié)合達(dá)50％或更大，則認(rèn)為這些單克隆抗體識(shí)別共有表位。本實(shí)驗(yàn)中，單克隆抗體4D5指定表位I(529-625氨基酸殘基，包含在ErbB2胞外結(jié)構(gòu)域中。
用乳腺癌腫瘤細(xì)胞系SK-BR-3(參見Hudziak等(1989)Molec.Cel.Biol.9(3)1165-1172)評價(jià)了單克隆抗體4D5的生長抑制特征。簡要說，用0.25％(vol/vol)胰酶處理使SK-BR-3細(xì)胞脫附，以每毫升4×105細(xì)胞的密度懸浮于完全培養(yǎng)基中。將100μl等分(4×104細(xì)胞)接種于96-孔微量稀釋培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁后只加入100μl培養(yǎng)基或含單克隆抗體(終濃度5μg/ml)的培養(yǎng)基。72小時(shí)后，用PBS(pH7.5)洗板兩次，結(jié)晶紫(0.5％的甲醇溶液)染色，如Sugarman等(1985)Science 230943-945所述分析相對細(xì)胞增殖。單克隆抗體4D5抑制了約56％SK-BR-3細(xì)胞的增殖。
也評價(jià)單克隆抗體4D5抑制MCF7細(xì)胞全細(xì)胞裂解物中Mr 180,000范圍蛋白在HRG-刺激下酪氨酸磷酸化能力(Lewis等(1996)Cancer Research 561457-1465)。報(bào)道稱MCF7細(xì)胞表達(dá)所有已知的ErbB2受體，但水平較低。由于ErbB2、ErbB3和ErbB4分子大小基本相同，不可能通過Western印跡分析評價(jià)全細(xì)胞裂解物來辨別哪種蛋白酪氨酸磷酸化。然而，這些細(xì)胞對于HRG酪氨酸磷酸化試驗(yàn)很理想，因?yàn)樵谒脤?shí)驗(yàn)條件下沒有外源加入的HRG時(shí)，這些細(xì)胞中Mr180,000范圍的酪氨酸磷酸化蛋白水平低至不可檢測。
在24孔板中接種MCF7細(xì)胞，各孔加入ErbB2單克隆抗體，室溫孵育30分鐘；然后每孔加入rHRGβl177-244使終濃度為0.2nM，繼續(xù)孵育8分鐘。小心吸干每孔中的培養(yǎng)基加入100μlSDS樣品緩沖液(5％SDS，25mM DTT和25mM Tris-HCl，pH6.8)終止反應(yīng)。在4-12％梯度凝膠(Novex)上電泳各樣品(25μl)，然后電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。用抗磷酸化酪氨酸抗體(4G10，購自UBI，以1μg/ml使用)使免疫印跡顯色，用反射光密度計(jì)定量Mr180,000處的主要反應(yīng)條帶的強(qiáng)度，如前所述(Holmes等(1992)Science 2561205-1210；Sliwkowski等J.Bio.Chem.26914661-14665(1994))。
單克隆抗體4D5顯著抑制Mr180,000處的HRG-誘導(dǎo)的酪氨酸磷酸化信號(hào)的產(chǎn)生。但沒有HRG時(shí)，不能刺激Mr180,000范圍蛋白的酪氨酸磷酸化。另外，該抗體與EGFR(Fendly等Cancer Research 501550-1558(1990))、ErbB3或ErbB4無交叉反應(yīng)。單克隆抗體4D5能夠阻斷約50％HRG刺激的酪氨酸磷酸化。
評價(jià)在存在或沒有外源性rHRGβ1時(shí)單克隆抗體4D5對MDA-MB-175和SK-BR-3細(xì)胞的生長抑制作用(Schaefer等Oncogene 151385-1394(1997))。MDA-MB-175細(xì)胞的ErbB2水平比正常乳腺上皮細(xì)胞高4-6倍并且在MDA-MB-175細(xì)胞中ErbB2-ErbB4受體發(fā)生組成型酪氨酸磷酸化。無論外源性HRG存在與否，單克隆抗體4D5能夠抑制MDA-MB-175細(xì)胞增殖。4D5對細(xì)胞增殖的抑制取決于ErbB2表達(dá)水平(Lewis等Cancer Immunol.Immunother.37255-263(1993))。在SK-BR-3細(xì)胞中檢測到的最大抑制率為66％。然而，外源性HRG可克服這種作用。
利用″基因轉(zhuǎn)化誘變″方法人源化鼠單克隆抗體4D5，如美國專利號(hào)5821337所述，特別將其全部內(nèi)容納入作為參考。用于以下實(shí)驗(yàn)的人源化單克隆抗體4D5稱為huMAb4D5-8。此抗體是IgG1同種型。
引用的參考文獻(xiàn)本發(fā)明不限于實(shí)施例中所公開的具體實(shí)施方式
范圍，它們旨在說明本發(fā)明的少數(shù)方面，功能上等價(jià)的任何實(shí)施方式都在本發(fā)明范圍內(nèi)。實(shí)際上，除了本文所示和所述的以外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白本發(fā)明的各種修改都屬于本發(fā)明范圍。
將本文引用的所有參考文獻(xiàn)內(nèi)容納入本文作為參考用于所有目的，就好像各出版物或?qū)＠驅(qū)＠暾埍惶貏e地和單獨(dú)地將其內(nèi)容納入本文作為參考用于所有目的那樣。
序列表<110>S.O.多羅尼納(Doronina，Svetlana O.)B.E.托克(Toki，Brian E.)P.D.森特(Senter，Peter D.)A.J.艾本斯(Ebens，Allen J.)P.波拉克斯(Polakis，Paul)M.X.斯利沃科夫斯基(Sliwkowski，Mark X.)S.D.斯班舍(Spencer，Susan D.)T.B.克林(Kline，Toni Beth)<120>能夠與配體偶聯(lián)的單甲基纈氨酸化合物<130>018891-001020PC<141>2004-11-05<150>US 60/598,899<151>2004-08-04<150>US 60/557,116<151>2004-03-26<150>US 60/518,534<151>2003-11-06<160>35<210>1<211>502<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>1Met Leu Leu Arg Ser Ala Gly Lys Leu Asn Val Gly Thr Lys Lys1 5 10 15Glu Asp Gly Glu Ser Thr Ala Pro Thr Pro Arg Pro Lys Val Leu20 25 30Arg Cys Lys Cys His His His Cys Pro Glu Asp Ser Val Asn Asn35 40 45Ile Cys Ser Thr Asp Gly Tyr Cys Phe Thr Met Ile Glu Glu Asp50 55 60Asp Ser Gly Leu Pro Val Val Thr Ser Gly Cys Leu Gly Leu Glu65 70 75Gly Ser Asp Phe Gln Cys Arg Asp Thr Pro Ile Pro His Gln Arg80 85 90Arg Ser Ile Glu Cys Cys Thr Glu Arg Asn Glu Cys Asn Lys Asp95 100 105Leu His Pro Thr Leu Pro Pro Leu Lys Asn Arg Asp Phe Val Asp110 115 120Gly Pro Ile His His Arg Ala Leu Leu Ile Ser Val Thr Val Cys125 130 135Ser Leu Leu Leu Val Leu Ile Ile Leu Phe Cys Tyr Phe Arg Tyr140 145 150Lys Arg Gln Glu Thr Arg Pro Arg Tyr Ser Ile Gly Leu Glu Gln155 160 165Asp Glu Thr Tyr Ile Pro Pro Gly Glu Ser Leu Arg Asp Leu Ile170 175 180Glu Gln Ser Gln Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu Pro Leu Leu185 190 195Val Gln Arg Thr Ile Ala Lys Gln Ile Gln Met Val Lys Gin Ile200 205 210Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Met Gly Lys Trp Arg Gly215 220 225Glu Lys Val Ala Val Lys Val Phe Phe Thr Thr Glu Glu Ala Ser230 235 240Trp Phe Arg Glu Thr Glu Ile Tyr Gln Thr Val Leu Met Arg His245 250 255Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Ile Lys Gly Thr Gly260 265 270Ser Trp Thr Gln Leu Tyr Leu Ile Thr Asp Tyr His Glu Asn Gly275 280 285Ser Leu Tyr Asp Tyr Leu Lys Ser Thr Thr Leu Asp Ala Lys Ser290 295 300Met Leu Lys Leu Ala Tyr Ser Ser Val Ser Gly Leu Cys His Leu305 310 315His Thr Glu Ile Phe Ser Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His320 325 330Arg Asp Leu Lys Ser Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Thr335 340 345Cys Cys Ile Ala Asp Leu Gly Leu Ala Val Lys Phe Ile Ser Asp350 355 360
Thr Asn Glu Val Asp Ile Pro Pro Asn Thr Arg Val Gly Thr Lys365370 375Arg Tyr Met Pro Pro Glu Val Leu Asp Glu Ser Leu Asn Arg Asn380385 390His Phe Gln Ser Tyr Ile Met Ala Asp Met Tyr Ser Phe Gly Leu395400 405Ile Leu Trp Glu Val Ala Arg Arg Cys Val Ser Gly Gly Ile Val410415 420Glu Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr His Asp Leu Val Pro Ser Asp Pro425430 435Ser Tyr Glu Asp Met Arg Glu Ile Val Cys Ile Lys Lys Leu Arg440445 450Pro Ser Phe Pro Asn Arg Trp Ser Ser Asp Glu Cys Leu Arg Gln455460 465Met Gly Lys Leu Met Thr Glu Cys Trp Ala His Asn Pro Ala Ser470475 480Arg Leu Thr Ala Leu Arg Val Lys Lys Thr Leu Ala Lys Met Ser485490 495Glu Ser Gln Asp Ile Lys Leu500<210>2<211>507<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>2Met Ala Gly Ala Gly Pro Lys Arg Arg Ala Leu Ala Ala Pro Ala1 5 10 15Ala Glu Glu Lys Glu Glu Ala Arg Glu Lys Met Leu Ala Ala Lys20 25 30Ser Ala Asp Gly Ser Ala Pro Ala Gly Glu Gly Glu Gly Val Thr35 40 45Leu Gln Arg Asn Ile Thr Leu Leu Asn Gly Val Ala Ile Ile Val50 55 60Gly Thr Ile Ile Gly Ser Gly Ile Phe Val Thr Pro Thr Gly Val65 70 75Leu Lys Glu Ala Gly Ser Pro Gly Leu Ala Leu Val Val Trp Ala80 85 90Ala Cys Gly Val Phe Ser Ile Val Gly Ala Leu Cys Tyr Ala Glu95 100 105Leu Gly Thr Thr Ile Ser Lys Ser Gly Gly Asp Tyr Ala Tyr Met110 115 120Leu Glu Val Tyr Gly Ser Leu Pro Ala Phe Leu Lys Leu Trp Ile125 130 135Glu Leu Leu Ile Ile Arg Pro Ser Ser Gln Tyr Ile Val Ala Leu140 145 150Val Phe Ala Thr Tyr Leu Leu Lys Pro Leu Phe Pro Thr Cys Pro155 160 165Val Pro Glu Glu Ala Ala Lys Leu Val Ala Cys Leu Cys Val Leu170 175 180Leu Leu Thr Ala Val Asn Cys Tyr Ser Val Lys Ala Ala Thr Arg185 190 195Val Gln Asp Ala Phe Ala Ala Ala Lys Leu Leu Ala Leu Ala Leu200 205 210Ile Ile Leu Leu Gly Phe Val Gln Ile Gly Lys Gly Val Val Ser215 220 225Asn Leu Asp Pro Asn Phe Ser Phe Glu Gly Thr Lys Leu Asp Val230 235 240Gly Asn Ile Val Leu Ala Leu Tyr Ser Gly Leu Phe Ala Tyr Gly245 250 255Gly Trp Asn Tyr Leu Asn Phe Val Thr Glu Glu Met Ile Asn Pro260 265 270Tyr Arg Asn Leu Pro Leu Ala Ile Ile Ile Ser Leu Pro Ile Val275 280 285Thr Leu Val Tyr Val Leu Thr Asn Leu Ala Tyr Phe Thr Thr Leu290 295 300Ser Thr Glu Gln Met Leu Set Ser Glu Ala Val Ala Val Asp Phe305 310 315Gly Asn Tyr His Leu Gly Val Met Ser Trp Ile Ile Pro Val Phe320 325 330Val Gly Leu Ser Cys Phe Gly Ser Val Asn Gly Ser Leu Phe Thr335 340 345Ser Ser Arg Leu Phe Phe Val Gly Ser Arg Glu Gly His Leu Pro350 355 360Ser Ile Leu Ser Met Ile His Pro Gln Leu Leu Thr Pro Val Pro365 370 375Ser Leu Val Phe Thr Cys Val Met Thr Leu Leu Tyr Ala Phe Ser380 385 390Lys Asp Ile Phe Ser Val Ile Asn Phe Phe Ser Phe Phe Asn Trp395 400 405Leu Cys Val Ala Leu Ala Ile Ile Gly Met Ile Trp Leu Arg His
410 415 420Arg Lys Pro Glu Leu Glu Arg Pro Ile Lys Val Asn Leu Ala Leu425 430 435Pro Val Phe Phe Ile Leu Ala Cys Leu Phe Leu Ile Ala Val Ser440 445 450Phe Trp Lys Thr Pro Val Glu Cys Gly Ile Gly Phe Thr Ile Ile455 460 465Leu Ser Gly Leu Pro Val Tyr Phe Phe Gly Val Trp Trp Lys Asn470 475 480Lys Pro Lys Trp Leu Leu Gln Gly Ile Phe Ser Thr Thr Val Leu485 490 495Cys Gln Lys Leu Met Gln Val Val Pro Gln Glu Thr500 505<210>3<211>339<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>3Met Glu Ser Arg Lys Asp Ile Thr Asn Gln Glu Glu Leu Trp Lys1 5 10 15Met Lys Pro Arg Arg Asn Leu Glu Glu Asp Asp Tyr Leu His Lys20 25 30Asp Thr Gly Glu Thr Ser Met Leu Lys Arg Pro Val Leu Leu His35 40 45Leu His Gln Thr Ala His Ala Asp Glu Phe Asp Cys Pro Ser Glu50 55 60Leu Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Pro Gln Trp His Leu Pro Ile65 70 75Lys Ile Ala Ala Ile Ile Ala Ser Leu Thr Phe Leu Tyr Thr Leu80 85 90Leu Arg Glu Val Ile His Pro Leu Ala Thr Ser His Gln Gln Tyr95 100 105Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu Val Ile Asn Lys Val Leu Pro Met110 115 120Val Ser Ile Thr Leu Leu Ala Leu Val Tyr Leu Pro Gly Val Ile125 130 135Ala Ala Ile Val Gln Leu His Asn Gly Thr Lys Tyr Lys Lys Phe140 145 150Pro His Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr Arg Lys Gln Phe Gly155 160 165Leu Leu Ser Phe Phe Phe Ala Val Leu His Ala Ile Tyr Ser Leu170 175 180Ser Tyr Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu Leu Asn Trp185 190 195Ala Tyr Gln Gln Val Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp Ile Glu200 205 210His Asp Val Trp Arg Met Glu Ile Tyr Val Ser Leu Gly lle Val215 220 225Gly Leu Ala Ile Leu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ser Ile Pro Ser230 235 240Val Ser Asp Ser Leu Thr Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gln Ser245 250 255Lys Leu Gly Ile Val Ser Leu Leu Leu Gly Thr Ile His Ala Leu260 265 270Ile Phe Ala Trp Asn Lys Trp Ile Asp Ile Lys Gln Phe Val Trp275 280 285Tyr Thr Pro Pro Thr Phe Met Ile Ala Val Phe Leu Pro Ile Val290 295 300Val Leu Ile Phe Lys Ser Ile Leu Phe Leu Pro Cys Leu Arg Lys305 310 315Lys Ile Leu Lys Ile Arg His Gly Trp Glu Asp Val Thr Lys Ile320 325 330Asn Lys Thr Glu Ile Cys Ser Gln Leu335<210>4<211>6995<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>4Pro Val Thr Ser Leu Leu Thr Pro Gly Leu Val Ile Thr Thr Asp1 5 10 15Arg Met Gly Ile Ser Arg Glu Pro Gly Thr Ser Ser Thr Ser Asn20 25 30Leu Ser Ser Thr Ser His Glu Arg Leu Thr Thr Leu Glu Asp Thr35 40 45Val Asp Thr Glu Ala Met Gln Pro Ser Thr His Thr Ala Val Thr50 55 60Asn Val Arg Thr Ser Ile Ser Gly His Glu Ser Gln Ser Ser Val
65 70 75Leu Ser Asp Ser Glu Thr Pro Lys Ala Thr Ser Pro Met Gly Thr80 85 90Thr Tyr Thr Met Gly Glu Thr Ser Val Ser Ile Ser Thr Ser Asp95 100 105Phe Phe Glu Thr Ser Arg Ile Gln Ile Glu Pro Thr Ser Ser Leu110 115 120Thr Ser Gly Leu Arg Glu Thr Ser Ser Ser Glu Arg Ile Ser Ser125 130 135Ala Thr Glu Gly Ser Thr Val Leu Ser Glu Val Pro Ser Gly Ala140 145 150Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu Val Ile Ser Ser Arg Gly Thr155 160 165Ser Met Ser Gly Pro Asp Gln Phe Thr Ile Ser Pro Asp Ile Ser170 175 180Thr Glu Ala Ile Thr Arg Leu Ser Thr Ser Pro Ile Met Thr Glu185 190 195Ser Ala Glu Ser Ala Ile Thr Ile Glu Thr Gly Ser Pro Gly Ala200 205 210Thr Ser Glu Gly Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Thr Phe215 220 225Trp Ser Gly Thr His Ser Thr Ala Ser Pro Gly Phe Ser His Ser230 235 240Glu Met Thr Thr Leu Met Ser Arg Thr Pro Gly Asp Val Pro Trp245 250 255Pro Ser Leu Pro Ser Val Glu Glu Ala Ser Ser Val Ser Ser Ser260 265 270Leu Ser Ser Pro Ala Met Thr Ser Thr Ser Phe Phe Ser Thr Leu275 280 285Pro Glu Ser Ile Ser Ser Ser Pro His Pro Val Thr Ala Leu Leu290 295 300Thr Leu Gly Pro Val Lys Thr Thr Asp Met Leu Arg Thr Ser Ser305 310 315Glu Pro Glu Thr Ser Ser Pro Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Ala320 325 330Glu Ile Leu Ala Thr Ser Glu Val Thr Lys Asp Arg Glu Lys Ile335 340 345His Pro Ser Ser Asn Thr Pro Val Val Asn Val Gly Thr Val Ile350 355 360Tyr Lys His Leu Ser Pro Ser Ser Val Leu Ala Asp Leu Val Thr365 370 375Thr Lys Pro Thr Ser Pro Met Ala Thr Thr Ser Thr Leu Gly Asn380 385 390Thr Ser Val Ser Thr Ser Thr Pro Ala Phe Pro Glu Thr Met Met395 400 405Thr Gln Pro Thr Ser Ser Leu Thr Ser Gly Leu Arg Glu Ile Ser410 415 420Thr Ser Gln Glu Thr Ser Ser Ala Thr Glu Arg Ser Ala Ser Leu425 430 435Ser Gly Met Pro Thr Gly Ala Thr Thr Lys Val Ser Arg Thr Glu440 445 450Ala Leu Ser Leu Gly Arg Thr Ser Thr Pro Gly Pro Ala Gln Ser455 460 465Thr Ile Ser Pro Glu Ile Ser Thr Glu Thr Ile Thr Arg Ile Ser470 475 480Thr Pro Leu Thr Thr Thr Gly Ser Ala Glu Met Thr Ile Thr Pro485 490 495Lys Thr Gly His Ser Gly Ala Ser Ser Gln Gly Thr Phe Thr Leu500 505 510Asp Thr Ser Ser Arg Ala Ser Trp Pro Gly Thr His Ser Ala Ala515 520 525Thr His Arg Ser Pro His Ser Gly Met Thr Thr Pro Met Ser Arg530 535 540Gly Pro Glu Asp Val Ser Trp Pro Ser Arg Pro Ser Val Glu Lys545 550 555Thr Ser Pro Pro Ser Ser Leu Val Ser Leu Ser Ala Val Thr Ser560 565 570Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Thr Pro Ser Glu Ser Ser His Ser Ser575 580 585Pro Leu Arg Val Thr Ser Leu Phe Thr Pro Val Met Met Lys Thr590 595 600Thr Asp Met Leu Asp Thr Ser Leu Glu Pro Val Thr Thr Ser Pro605 610 615Pro Ser Met Asn Ile Thr Ser Asp Glu Ser Leu Ala Thr Ser Lys620 625 630Ala Thr Met Glu Thr Glu Ala Ile Gln Leu Ser Glu Asn Thr Ala635 640 645Val Thr Gln Met Gly Thr Ile Ser Ala Arg Gln Glu Phe Tyr Ser650 655 660Ser Tyr Pro Gly Leu Pro Glu Pro Ser Lys Val Thr Ser Pro Val665 670 675Val Thr Ser Ser Thr Ile Lys Asp Ile Val Ser Thr Thr Ile Pro
680 685 690Ala Ser Ser Glu Ile Thr Arg Ile Glu Met Glu Ser Thr Ser Thr695 700 705Leu Thr Pro Thr Pro Arg Glu Thr Ser Thr Ser Gln Glu Ile His710 715 720Ser Ala Thr Lys Pro Ser Thr Val Pro Tyr Lys Ala Leu Thr Ser725 730 735Ala Thr Ile Glu Asp Ser Met Thr Gln Val Met Ser Ser Ser Arg740 745 750Gly Pro Ser Pro Asp Gln Ser Thr Met Ser Gln Asp Ile Ser Thr755 760 765Glu Val Ile Thr Arg Leu Ser Thr Ser Pro Ile Lys Thr Glu Ser770 775 780Thr Glu Met Thr Ile Thr Thr Gln Thr Gly Ser Pro Gly Ala Thr785 790 795Ser Arg Gly Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Phe Met Ser800 805 810Gly Thr His Ser Thr Ala Ser Gln Gly Phe Ser His Ser Gln Met815 820 825Thr Ala Leu Met Ser Arg Thr Pro Gly Glu Val Pro Trp Leu Ser830 835 840His Pro Ser Val Glu Glu Ala Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Ser845 850 855Ser Pro Val Met Thr Ser Ser Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro860 865 870Asp Ser Ile His Ser Ser Ser Leu Pro Val Thr Ser Leu Leu Thr875 880 885Ser Gly Leu Val Lys Thr Thr Glu Leu Leu Gly Thr Ser Ser Glu890 895 900Pro Glu Thr Ser Ser Pro Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Ala Glu905 910 915Ile Leu Ala Thr Thr Glu Val Thr Thr Asp Thr Glu Lys Leu Glu920 925 930Met Thr Asn Val Val Thr Ser Gly Tyr Thr His Glu Ser Pro Ser935 940 945Ser Val Leu Ala Asp Ser Val Thr Thr Lys Ala Thr Ser Ser Met950 955 960Gly Ile Thr Tyr Pro Thr Gly Asp Thr Asn Val Leu Thr Ser Thr965 970 975Pro Ala Phe Ser Asp Thr Ser Arg Ile Gln Thr Lys Ser Lys Leu980 985 990Ser Leu Thr Pro Gly Leu Met Glu Thr Ser Ile Ser Glu Glu Thr99510001005Ser Ser Ala Thr Glu Lys Ser Thr Val Leu Ser Ser Val Pro Thr101010151020Gly Ala Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu Ala Ile Ser Ser Ser102510301035Arg Thr Ser Ile Pro Gly Pro Ala Gln Ser Thr Met Ser Ser Asp104010451050Thr Ser Met Glu Thr Ile Thr Arg Ile Ser Thr Pro Leu Thr Arg105510601065Lys Glu Ser Thr Asp Met Ala Ile Thr Pro Lys Thr Gly Pro Ser107010751080Gly Ala Thr Ser Gln Gly Thr Phe Thr Leu Asp Ser Ser Ser Thr108510901095Ala Ser Trp Pro Gly Thr His Ser Ala Thr Thr Gln Arg Phe Pro110011051110Arg Ser Val Val Thr Thr Pro Met Ser Arg Gly Pro Glu Asp Val111511201125Ser Trp Pro Ser Pro Leu Ser Val Glu Lys Asn Ser Pro Pro Ser113011351140Ser Leu Val Ser Ser Ser Ser Val Thr Ser Pro Ser Pro Leu Tyr114511501155Ser Thr Pro Ser Gly Ser Ser His Ser Ser Pro Val Pro Val Thr116011651170Ser Leu Phe Thr Ser Ile Met Met Lys Ala Thr Asp Met Leu Asp117511801185Ala Ser Leu Glu Pro Glu Thr Thr Ser Ala Pro Asn Met Asn Ile119011951200Thr Ser Asp Glu Ser Leu Ala Ala Ser Lys Ala Thr Thr Glu Thr120512101215Glu Ala Ile His Val Phe Glu Asn Thr Ala Ala Ser His Val Glu122012251230Thr Thr Ser Ala Thr Glu Glu Leu Tyr Ser Ser Ser Pro Gly Phe123512401245Ser Glu Pro Thr Lys Val Ile Ser Pro Val Val Thr Ser Ser Ser125012551260Ile Arg Asp Asn Met Val Ser Thr Thr Met Pro Gly Ser Ser Gly126512701275Ile Thr Arg Ile Glu Ile Glu Ser Met Ser Ser Leu Thr Pro Gly128012851290Leu Arg Glu Thr Arg Thr Ser Gln Asp Ile Thr Ser Ser Thr Glu
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Ser Thr<210>32<211>359<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>32Met Ala Glu Ala Ile Thr Tyr Ala Asp Leu Arg Phe Val Lys Ala1 5 10 15Pro Leu Lys Lys Ser Ile Ser Ser Arg Leu Gly Gln Asp Pro Gly20 25 30Ala Asp Asp Asp Gly Glu Ile Thr Tyr Glu Asn Val Gln Val Pro35 40 45Ala Val Leu Gly Val Pro Ser Ser Leu Ala Ser Ser Val Leu Gly50 55 60Asp Lys Ala Ala Val Lys Ser Glu Gln Pro Thr Ala Ser Trp Arg65 70 75Ala Val Thr Ser Pro Ala Val Gly Arg Ile Leu Pro Cys Arg Thr80 85 90Thr Cys Leu Arg Tyr Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Thr Cys Leu95 100 105Leu Leu Gly Val Thr Ala Ile Cys Leu Gly Val Arg Tyr Leu Gln110 115 120Val Ser Gln Gln Leu Gln Gln Thr Asn Arg Val Leu Glu Val Thr125 130 135Asn Ser Ser Leu Arg Gln Gln Leu Arg Leu Lys Ile Thr Gln Leu140 145 150Gly Gln Ser Ala Glu Asp Leu Gln Gly Ser Arg Arg Glu Leu Ala155 160 165Gln Ser Gln Glu Ala Leu Gln Val Glu Gln Arg Ala His Gln Ala170 175 180Ala Glu Gly Gln Leu Gln Ala Cys Gln Ala Asp Arg Gln Lys Thr185 190 195Lys Glu Thr Leu Gln Ser Glu Glu Gln Gln Arg Arg Ala Leu Glu200 205 210Gln Lys Leu Ser Asn Met Glu Asn Arg Leu Lys Pro Phe Phe Thr215 220 225Cys Gly Ser Ala Asp Thr Cys Cys Pro Ser Gly Trp Ile Met His230 235 240Gln Lys Ser Cys Phe Tyr Ile Ser Leu Thr Ser Lys Asn Trp Gln245 250 255Glu Ser Gln Lys Gln Cys Glu Thr Leu Ser Ser Lys Leu Ala Thr260 265 270Phe Ser Glu Ile Tyr Pro Gln Ser His Ser Tyr Tyr Phe Leu Asn275 280 285Ser Leu Leu Pro Asn Gly Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Trp Thr Gly290 295 300Leu Ser Ser Asn Lys Asp Trp Lys Leu Thr Asp Asp Thr Gln Arg305 310 315Thr Arg Thr Tyr Ala Gln Ser Ser Lys Cys Asn Lys Val His Lys320 325 330Thr Trp Ser Trp Trp Thr Leu Glu Ser Glu Ser Cys Arg Ser Ser335 340 345Leu Pro Tyr Ile Cys Glu Met Thr Ala Phe Arg Phe Pro Asp350 355<210>33<211>661<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>33Met Ala Phe Asp Val Ser Cys Phe Phe Trp Val Val Leu Phe Ser1 5 10 15Ala Gly Cys Lys Val Ile Thr Ser Trp Asp Gln Met Cys Ile Glu20 25 30Lys Glu Ala Asn Lys Thr Tyr Asn Cys Glu Asn Leu Gly Leu Ser35 40 45Glu Ile Pro Asp Thr Leu Pro Asn Thr Thr Glu Phe Leu Glu Phe50 55 60Ser Phe Asn Phe Leu Pro Thr Ile His Asn Arg Thr Phe Ser Arg65 70 75Leu Met Asn Leu Thr Phe Leu Asp Leu Thr Arg Cys Gln Ile Asn80 85 90Trp Ile His Glu Asp Thr Phe Gln Ser His His Gln Leu Ser Thr95 100 105Leu Val Leu Thr Gly Asn Pro Leu Ile Phe Met Ala Glu Thr Ser110 115 120Leu Asn Gly Pro Lys Ser Leu Lys His Leu Phe Leu Ile Gln Thr125 130 135Gly Ile Ser Asn Leu Glu Phe Ile Pro Val His Asn Leu Glu Asn
140 145 150Leu Glu Ser Leu Tyr Leu Gly Ser Asn His Ile Ser Ser Ile Lys155 160 165Phe Pro Lys Asp Phe Pro Ala Arg Asn Leu Lys Val Leu Asp Phe170 175 180Gln Asn Asn Ala Ile His Tyr Ile Ser Arg Glu Asp Met Arg Ser185 190 195Leu Glu Gln Ala Ile Asn Leu Ser Leu Asn Phe Asn Gly Asn Asn200 205 210Val Lys Gly Ile Glu Leu Gly Ala Phe Asp Ser Thr Val Phe Gln215 220 225Ser Leu Asn Phe Gly Gly Thr Pro Asn Leu Ser Val Ile Phe Asn230 235 240Gly Leu Gln Asn Ser Thr Thr Gln Ser Leu Trp Leu Gly Thr Phe245 250 255Glu Asp Ile Asp Asp Glu Asp Ile Ser Ser Ala Met Leu Lys Gly260 265 270Leu Cys Glu Met Ser Val Glu Ser Leu Asn Leu Gln Glu His Arg275 280 285Phe Ser Asp Ile Ser Ser Thr Thr Phe Gln Cys Phe Thr Gln Leu290 295 300Gln Glu Leu Asp Leu Thr Ala Thr His Leu Lys Gly Leu Pro Ser305 310 315Gly Met Lys Gly Leu Asn Leu Leu Lys Lys Leu Val Leu Ser Val320 325 330Asn His Phe Asp Gln Leu Cys Gln Ile Ser Ala Ala Asn Phe Pro335 340 345Ser Leu Thr His Leu Tyr Ile Arg Gly Asn Val Lys Lys Leu His350 355 360Leu Gly Val Gly Cys Leu Glu Lys Leu Gly Asn Leu Gln Thr Leu365 370 375Asp Leu Ser His Asn Asp Ile Glu Ala Ser Asp Cys Cys Ser Leu380 385 390Gln Leu Lys Asn Leu Ser His Leu Gln Thr Leu Asn Leu Ser His395 400 405Asn Glu Pro Leu Gly Leu Gln Ser Gln Ala Phe Lys Glu Cys Pro410 415 420Gln Leu Glu Leu Leu Asp Leu Ala Phe Thr Arg Leu His Ile Asn425 430 435Ala Pro Gln Ser Pro Phe Gln Asn Leu His Phe Leu Gln Val Leu440 445 450Asn Leu Thr Tyr Cys Phe Leu Asp Thr Ser Asn Gln His Leu Leu455 460 465Ala Gly Leu Pro Val Leu Arg His Leu Asn Leu Lys Gly Asn His470 475 480Phe Gln Asp Gly Thr Ile Thr Lys Thr Asn Leu Leu Gln Thr Val485 490495Gly Ser Leu Glu Val Leu Ile Leu Ser Ser Cys Gly Leu Leu Ser500 505 510Ile Asp Gln Gln Ala Phe His Ser Leu Gly Lys Met Ser His Val515 520 525Asp Leu Ser His Asn Ser Leu Thr Cys Asp Ser Ile Asp Ser Leu530 535 540Ser His Leu Lys Gly Ile Tyr Leu Asn Leu Ala Ala Asn Ser Ile545 550 555Asn Ile Ile Ser Pro Arg Leu Leu Pro Ile Leu Ser Gln Gln Ser560 565 570Thr Ile Asn Leu Ser His Asn Pro Leu Asp Cys Thr Cys Ser Asn575 580 585Ile His Phe Leu Thr Trp Tyr Lys Glu Asn Leu His Lys Leu Glu590 595 600Gly Ser Glu Glu Thr Thr Cys Ala Asn Pro Pro Ser Leu Arg Gly605 610 615Val Lys Leu Ser Asp Val Lys Leu Ser Cys Gly Ile Thr Ala Ile620 625 630Gly Ile Phe Phe Leu Ile Val Phe Leu Leu Leu Leu Ala Ile Leu635 640 645Leu Phe Phe Ala Val Lys Tyr Leu Leu Arg Trp Lys Tyr Gln His650 655 660Ile<210>34<211>429<212>PRT<213>肉蠅(Sarcophaga bullata)<400>34Met Leu Pro Arg Leu Leu Leu Leu Ile Cys Ala Pro Leu Cys Glu1 5 10 15Pro Ala Glu Leu Phe Leu Ile Ala Ser Pro Ser His Pro Thr Glu20 25 30Gly Ser Pro Val Thr Leu Thr Cys Lys Met Pro Phe Leu Gln Ser
35 40 45Ser Asp Ala Gln Phe Gln Phe Cys Phe Phe Arg Asp Thr Arg Ala50 55 60Leu Gly Pro Gly Trp Ser Ser Ser Pro Lys Leu Gln Ile Ala Ala65 70 75Met Trp Lys Glu Asp Thr Gly Ser Tyr Trp Cys Glu Ala Gln Thr80 85 90Met Ala Ser Lys Val Leu Arg Ser Arg Arg Ser Gln Ile Asn Val95 100 105His Arg Val Pro Val Ala Asp Val Ser Leu Glu Thr Gln Pro Pro110 115 120Gly Gly Gln Val Met Glu Gly Asp Arg Leu Val Leu Ile Cys Ser125 130 135Val Ala Met Gly Thr Gly Asp Ile Thr Phe Leu Trp Tyr Lys Gly140 145 150Ala Val Gly Leu Asn Leu Gln Ser Lys Thr Gln Arg Ser Leu Thr155 160 165Ala Glu Tyr Glu Ile Pro Ser Val Arg Glu Ser Asp Ala Glu Gln170 175 180Tyr Tyr Cys Val Ala Glu Asn Gly Tyr Gly Pro Ser Pro Ser Gly185 190 195Leu Val Ser Ile Thr Val Arg Ile Pro Val Ser Arg Pro Ile Leu200 205 210Met Leu Arg Ala Pro Arg Ala Gln Ala Ala Val Glu Asp Val Leu215 220 225Glu Leu His Cys Glu Ala Leu Arg Gly Ser Pro Pro Ile Leu Tyr230 235 240Trp Phe Tyr His Glu Asp Ile Thr Leu Gly Ser Arg Ser Ala Pro245 250 255Ser Gly Gly Gly Ala Ser Phe Asn Leu Ser Leu Thr Glu Glu His260 265 270Ser Gly Asn Tyr Ser Cys Glu Ala Asn Asn Gly Leu Gly Ala Gln275 280 285Arg Ser Glu Ala Val Thr Leu Asn Phe Thr Val Pro Thr Gly Ala290 295 300Arg Ser Asn His Leu Thr Ser Gly Val Ile Glu Gly Leu Leu Ser305 310 315Thr Leu Gly Pro Ala Thr Val Ala Leu Leu Phe Cys Tyr Gly Leu320 325 330Lys Arg Lys Ile Gly Arg Arg Ser Ala Arg Asp Pro Leu Arg Ser335 340 345Leu Pro Ser Pro Leu Pro Gln Glu Phe Thr Tyr Leu Asn Ser Pro350 355 360Thr Pro Gly Gln Leu Gln Pro Ile Tyr Glu Asn Val Asn Val Val365 370 375Ser Gly Asp Glu Val Tyr Ser Leu Ala Tyr Tyr Asn Gln Pro Glu380 385 390Gln Glu Ser Val Ala Ala Glu Thr Leu Gly Thr His Met Glu Asp395 400 405Lys Val Ser Leu Asp Ile Tyr Ser Arg Leu Arg Lys Ala Asn Ile410 415 420Thr Asp Val Asp Tyr Glu Asp Ala Met425<210>35<211>977<212>PRT<213>智人(Homo sapien)<400>35Met Leu Leu Trp Val Ile Leu Leu Val Leu Ala Pro Val Ser Gly1 5 10 15Gln Phe Ala Arg Thr Pro Arg Pro Ile Ile Phe Leu Gln Pro Pro20 25 30Trp Thr Thr Val Phe Gln Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys35 40 45Gly Phe Arg Phe Tyr Ser Pro Gln Lys Thr Lys Trp Tyr His Arg50 55 60Tyr Leu Gly Lys Glu Ile Leu Arg Glu Thr Pro Asp Asn Ile Leu65 70 75Glu Val Gln Glu Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Ala Gln Gly Ser80 85 90Pro Leu Ser Ser Pro Val His Leu Asp Phe Ser Ser Ala Ser Leu95 100 105Ile Leu Gln Ala Pro Leu Ser Val Phe Glu Gly Asp Ser Val Val110 115 120Leu Arg Cys Arg Ala Lys Ala Glu Val Thr Leu Asn Asn Thr Ile125 130 135Tyr Lys Asn Asp Asn Val Leu Ala Phe Leu Asn Lys Arg Thr Asp140 145 150Phe His Ile Pro His Ala Cys Leu Lys Asp Asn Gly Ala Tyr Arg
Cys Thr Gly Tyr Lys Glu Ser Cys Cys Pro Val Ser Ser Asn Thr170 175 180Val Lys Ile Gln Val Gln Glu Pro Phe Thr Arg Pro Val Leu Arg185 190 195Ala Ser Ser Phe Gln Pro Ile Ser Gly Asn Pro Val Thr Leu Thr200 205 210Cys Glu Thr Gln Leu Ser Leu Glu Arg Ser Asp Val Pro Leu Arg215 220 225Phe Arg Phe phe Arg Asp Asp Gln Thr Leu Gly Leu Gly Trp Ser230 235 240Leu Ser Pro Asn Phe Gln Ile Thr Ala Met Trp Ser Lys Asp Ser245 250 255Gly Phe Tyr Trp Cys Lys Ala Ala Thr Met Pro His Ser Val Ile260 265 270Ser Asp Ser Pro Arg Ser Trp Ile Gln Val Gln Ile Pro Ala Ser275 280 285His Pro Val Leu Thr Leu Ser Pro Glu Lys Ala Leu Asn Phe Glu290 295 300Gly Thr Lys Val Thr Leu His Cys Glu Thr Gln Glu Asp Ser Leu305 310 315Arg Thr Leu Tyr Arg Phe Tyr His Glu Gly Val Pro Leu Arg His320 325 330Lys Ser Val Arg Cys Glu Arg Gly Ala Ser Ile Ser Phe Ser Leu335 340 345Thr Thr Glu Asn Ser Gly Asn Tyr Tyr Cys Thr Ala Asp Asn Gly350 355 360Leu Gly Ala Lys Pro Ser Lys Ala Val Ser Leu Ser Val Thr Val365 370 375Pro Val Ser His Pro Val Leu Asn Leu Ser Ser Pro Glu Asp Leu380 385 390Ile Phe Glu Gly Ala Lys Val Thr Leu His Cys Glu Ala Gln Arg395 400 405Gly Ser Leu Pro Ile Leu Tyr Gln Phe His His Glu Asp Ala Ala410 415 420Leu Glu Arg Arg Ser Ala Asn Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Ser425 430 435Phe Ser Leu Thr Ala Glu His Ser Gly Asn Tyr Tyr Cys Thr Ala440 445 450Asp Asn Gly Phe Gly Pro Gln Arg Ser Lys Ala Val Ser Leu Ser455 460 465Ile Thr Val Pro Val Ser His Pro Val Leu Thr Leu Ser Ser Ala470 475 480Glu Ala Leu Thr Phe Glu Gly Ala Thr Val Thr Leu His Cys Glu485 490 495Val Gln Arg Gly Ser Pro Gln Ile Leu Tyr Gln Phe Tyr His Glu500 505 510Asp Met Pro Leu Trp Ser Ser Ser Thr Pro Ser Val Gly Arg Val515 520 525Ser Phe Ser Phe Ser Leu Thr Glu Gly His Ser Gly Asn Tyr Tyr530 535 540Cys Thr Ala Asp Asn Gly Phe Gly Pro Gln Arg Ser Glu Val Val545 550 555Ser Leu Phe Val Thr Val Pro Val Ser Arg Pro Ile Leu Thr Leu560 565 570Arg Val Pro Arg Ala Gln Ala Val Val Gly Asp Leu Leu Glu Leu575 580 585His Cys Glu Ala Pro Arg Gly Ser Pro Pro Ile Leu Tyr Trp Phe590 595 600Tyr His Glu Asp Val Thr Leu Gly Ser Ser Ser Ala Pro Ser Gly605 610 615Gly Glu Ala Ser Phe Asn Leu Ser Leu Thr Ala Glu His Ser Gly620 625 630Asn Tyr Ser Cys Glu Ala Asn Asn Gly Leu Val Ala Gln His Ser635 640 645Asp Thr Ile Ser Leu Ser Val Ile Val Pro Val Ser Arg Pro Ile650 655 660Leu Thr Phe Arg Ala Pro Arg Ala Gln Ala Val Val Gly Asp Leu665 670 675Leu Glu Leu His Cys Glu Ala Leu Arg Gly Ser Ser Pro Ile Leu680 685 690Tyr Trp Phe Tyr His Glu Asp Val Thr Leu Gly Lys Ile Ser Ala695 700 705Pro Ser Gly Gly Gly Ala Ser Phe Asn Leu Ser Leu Thr Thr Glu710 715 720His Ser Gly Ile Tyr Ser Cys Glu Ala Asp Asn Gly Pro Glu Ala725 730 735Gln Arg Ser Glu Met Val Thr Leu Lys Val Ala Val Pro Val Ser740 745 750Arg Pro Val Leu Thr Leu Arg Ala Prp Gly Thr His Ala Ala Val755 760 765Gly Asp Leu Leu Glu Leu His Cys Glu Ala Leu Arg Gly Ser Pro770 775 780
Leu Ile Leu Tyr Arg Phe Phe His Glu Asp Val Thr Leu Gly Asn785 790 795Arg Ser Ser Pro Ser Gly Gly Ala Ser Leu Asn Leu Ser Leu Thr800 805 810Ala Glu His Ser Gly Asn Tyr Ser Cys Glu Ala Asp Asn Gly Leu815 820 825Gly Ala Gln Arg Ser Glu Thr Val Thr Leu Tyr Ile Thr Gly Leu830 835 840Thr Ala Asn Arg Ser Gly pro Phe Ala Thr Gly Val Ala Gly Gly845 850 855Leu Leu Ser Ile Ala Gly Leu Ala Ala Gly Ala Leu Leu Leu Tyr860 865 870Cys Trp Leu Ser Arg Lys Ala Gly Arg Lys Pro Ala Ser Asp Pro875 880 885Ala Arg Ser Pro Pro Asp Ser Asp Ser Gln Glu Pro Thr Tyr His890 895 900Asn Val Pro Ala Trp Glu Glu Leu Gln Pro Val Tyr Thr Asn Ala905 910 915Asn Pro Arg Gly Glu Asn Val Val Tyr Ser Glu Val Arg Ile Ile920 925 930Gln Glu Lys Lys Lys His Ala Val Ala Ser Asp Pro Arg His Leu935 940 945Arg Asn Lys Gly Ser Pro Ile Ile Tyr Ser Glu Val Lys Val Ala950 955 960Ser Thr Pro Val Ser Gly Ser Leu Phe Leu Ala Ser Ser Ala Pro965 970 975His Arg
權(quán)利要求
1.一種具有下式的化合物L(fēng)-(D)p或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物其中，L-是配體單元；p的范圍是1～約20；和-D是選自式DE和DF的藥物部分其中，在各位置獨(dú)立地為R2選自H和C1-C8烷基；R3選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R4選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R5選自H和甲基；或者R4和R5共同形成碳環(huán)，并具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb獨(dú)立地選自H、C1-C8烷基和C3-C8碳環(huán)，n選自2、3、4、5和6；R6選自H和C1-C8烷基；R7選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；各R8獨(dú)立地選自H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)和O-(C1-C8烷基)；R9選自H和C1-C8烷基；R10選自芳基或C3-C8雜環(huán)；Z是O、S、NH或NR12，其中R12是C1-C8烷基；R11選自H、C1-C20烷基、芳基、C3-C8雜環(huán)、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；m是范圍在1-1000之間的一個(gè)整數(shù)；R13是C2-C8烷基；R14是H或C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R15獨(dú)立地是H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R16獨(dú)立地是H、C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；R18選自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8雜環(huán))和-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳環(huán))；和n是0-6之間的一個(gè)整數(shù)。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，還包含接頭單元(LU)，所述化合物具有下式L-LU-D或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
3.一種具有下式的化合物L(fēng)U-D或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物其中，-LU-是接頭單元；和-D是選自式DE和DF的藥物部分其中，在各位置獨(dú)立地為R2選自H和C1-C8烷基；R3選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R4選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R5選自H和甲基；或者R4和R5共同形成碳環(huán)，并具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb獨(dú)立地選自H、C1-C8烷基和C3-C8碳環(huán)，n選自2、3、4、5和6；R6選自H和C1-C8烷基；R7選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；各R8獨(dú)立地選自H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)和O-(C1-C8烷基)；R9選自H和C1-C8烷基；R10選自芳基或C3-C8雜環(huán)；Z是O、S、NH或NR12，其中R12是C1-C8烷基；R11選自H、C1-C20烷基、芳基、C3-C8雜環(huán)、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；m是范圍在1-1000之間的一個(gè)整數(shù)；R13是C2-C8烷基；R14是H或C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R15獨(dú)立地是H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R16獨(dú)立地是H、C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；R18選自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8雜環(huán))和-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳環(huán))；和n是0-6之間的一個(gè)整數(shù)。
4.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物是具有式Ia’的抗體-藥物偶聯(lián)物Ab_Aa-Ww-Yy-D)pIa’或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，其中Ab是抗體，A是拉伸單元，a是0或1，各W獨(dú)立地是氨基酸單元，w是0-12之間的一個(gè)整數(shù)，Y是間隔單元，和y是0、1或2，p的范圍是1～約20，和D是選自式DE和DF的藥物部分其中，在各位置獨(dú)立地為R2選自H和C1-C8烷基；R3選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R4選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R5選自H和甲基；或者R4和R5共同形成碳環(huán)，并具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb獨(dú)立地選自H、C1-C8烷基和C3-C8碳環(huán)，n選自2、3、4、5和6；R6選自H和C1-C8烷基；R7選自H，C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；各R8獨(dú)立地選自H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)和O-(C1-C8烷基)；R9選自H和C1-C8烷基；R10選自芳基或C3-C8雜環(huán)；Z是O、S、NH或NR12，其中R12是C1-C8烷基；R11選自H、C1-C20烷基、芳基、C3-C8雜環(huán)、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；m是范圍在1-1000之間的一個(gè)整數(shù)；R13是C2-C8烷基；R14是H或C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R15獨(dú)立地是H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R16獨(dú)立地是H、C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；R18選自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8雜環(huán))和-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳環(huán))；和n是0-6之間的一個(gè)整數(shù)。
5.如權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D是式DF
6.如權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D是式DE
7.如權(quán)利要求1所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其具有下式Ab-(D)p其中a、w和y各自為0。
8.如權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述抗體通過抗體的半胱氨酸殘基連接于藥物部分。
9.如權(quán)利要求8所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，p是2-5。
10.如權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，p是2-8。
11.如權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，p是2-5。
12.如權(quán)利要求4或8的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其具有下式其中L是抗體，R17是-C1-C10亞烷基-、-C3-C8碳環(huán)-、-O-(C1-C8烷基)-、-亞芳基-、-C1-C10亞烷基-亞芳基-、-亞芳基-C1-C10亞烷基-、-C1-C10亞烷基-(C3-C8碳環(huán))-、-(C3-C8碳環(huán))-C1-C10亞烷基-、-C3-C8雜環(huán)-、-C1-C10亞烷基-(C3-C8雜環(huán))-、-(C3-C8雜環(huán))-C1-C10亞烷基-、-(CH2CH2O)r-和-(CH2CH2O)r-CH2-；r是1-10之間的一個(gè)整數(shù)。
13.如權(quán)利要求12所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其具有下式
14.如權(quán)利要求12所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其具有下式其中w和y各自為0。
15.如權(quán)利要求14所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D是式DE。
16.如權(quán)利要求15所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，式DE具有下式
17.如權(quán)利要求14所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D是式DF.
18.如權(quán)利要求17所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，式DF具有下式
19.如權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其具有下式
20.如權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其具有下式
21.如權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其具有下式
22.如權(quán)利要求21所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D是式DE。
23.如權(quán)利要求22所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，式DE具有下式
24.如權(quán)利要求21所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D是式DF。
25.如權(quán)利要求24所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，式DF具有下式
26.如權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其具有下式
27.如權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，w是2-12之間的一個(gè)整數(shù)。
28.如權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，w是2。
29.如權(quán)利要求28所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，Ww是-纈氨酸-瓜氨酸-。
30.如權(quán)利要求27所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，Ww是5-氨基戊酸、高苯丙氨酸賴氨酸、四異喹啉羧酸酯賴氨酸、環(huán)己基丙氨酸賴氨酸、異哌啶甲酸賴氨酸、β-丙氨酸賴氨酸、甘氨酸絲氨酸纈氨酸谷氨酰胺和異哌啶甲酸。
31.如權(quán)利要求4、6或7所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于D具有下式
32.如權(quán)利要求4、5或7所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于D具有下式
33.如權(quán)利要求5所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D具有下式
34.如權(quán)利要求5所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D具有下式
35.如權(quán)利要求5所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D具有下式
36.如權(quán)利要求5所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D具有下式
37.如權(quán)利要求5所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D具有下式
38.如權(quán)利要求5所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D具有下式
39.如權(quán)利要求5所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D具有下式
40.如權(quán)利要求5所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D具有下式
41.如權(quán)利要求5所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D具有下式
42.如權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述抗體是單克隆抗體。
43.如權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述抗體是雙特異性抗體。
44.如權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述抗體是嵌合抗體。
45.如權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述抗體是人源化抗體。
46.如權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述抗體是抗體片段。
47.如權(quán)利要求46所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述抗體片段是Fab片段。
48.如權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，大量的藥物部分直到抗體-藥物偶聯(lián)化合物進(jìn)入具有所述抗體-藥物偶聯(lián)物的抗體特異性細(xì)胞表面受體的細(xì)胞中才與抗體切斷分開，且當(dāng)所述抗體-藥物偶聯(lián)物確實(shí)進(jìn)入所述細(xì)胞中時(shí)藥物部分才與抗體切斷分開。
49.如權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，與含有所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物的藥物部分的藥物化合物相比，在哺乳動(dòng)物中所述化合物或所述化合物的胞內(nèi)代謝物的生物利用度提高。
50.如權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，與不含有藥物部分的所述化合物的類似物相比，在哺乳動(dòng)物中所述化合物或所述化合物的胞內(nèi)代謝物的生物利用度提高。
51.如權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述藥物部分在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)才與所述化合物的抗體或與所述化合物的胞內(nèi)代謝物切斷分開。
52.一種具有下式的抗體-藥物偶聯(lián)化合物其中，Ab是抗體，Val是纈氨酸，Cit是瓜氨酸。
53.如權(quán)利要求52所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述抗體是AC10、S2C6、BR96、1F6和2F2中的至少一種。
54.一種藥物組合物，它含有有效量的權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、運(yùn)載體或賦形劑。
55.如權(quán)利要求54所述的藥物組合物，其還包含治療有效量的選自微管形成抑制劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑和DNA結(jié)合劑的化療藥。
56.一種殺傷腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞或抑制腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括用一定量的權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物處理腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞，有效殺傷腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞或抑制腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞的增殖。
57.一種治療癌癥的方法，所述方法包括將一定量的權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物給予患者，所述量能有效治療癌癥。
58.如權(quán)利要求57所述的方法，其還包括給予有效量的另一種抗癌藥、免疫抑制劑或抗傳染病藥。
59.一種治療自身免疫病的方法，所述方法包括將一定量的權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物給予患者，所述量能有效治療自身免疫病。
60.一種治療傳染病的方法，所述方法包括將一定量的權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物給予患者，所述量能有效治療傳染病。
61.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物是包含藥學(xué)上可接受的稀釋劑、運(yùn)載體或賦形劑的制劑。
62.如權(quán)利要求61所述的方法，其特征在于，給予患者的所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物的用量范圍約為0.1-10mg/kg患者體重。
63.如權(quán)利要求61所述的方法，其特征在于，以大約三周的間隔給予所述抗體-藥物偶聯(lián)物。
64.如權(quán)利要求61所述的方法，其特征在于，經(jīng)胃腸道外或靜脈內(nèi)給予所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物。
65.如權(quán)利要求64所述的方法，其特征在于，將所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物與藥學(xué)上可接受的胃腸道外運(yùn)載體配制在一起。
66.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，將所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物配制成單位劑量注射形式。
67.一種檢測癌細(xì)胞的試驗(yàn)，該試驗(yàn)包括使細(xì)胞接觸權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)物化合物，和測定抗體-藥物偶聯(lián)化合物與細(xì)胞的結(jié)合程度。
68.如權(quán)利要求67所述的試驗(yàn)，其特征在于，所述結(jié)合程度是用免疫組化(IHC)方法測定的。
69.一種制品，其包括權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)物化合物；容器；和包裝說明書或標(biāo)簽，說明該化合物可用于治療特征為CD30、CD40、CD70和Lewis Y中至少一種過表達(dá)的癌癥。
70.如權(quán)利要求2所述的化合物，其特征在于，所述接頭單元(LU)包含-Aa-Ww-Yy-其中-A-是拉伸單元，a是0或1，各-W-獨(dú)立地是氨基酸單元，w是0-12之間的一個(gè)整數(shù)，-Y-是間隔單元，和y是0、1或2。
71.如權(quán)利要求3所述的化合物，其特征在于，所述接頭單元包含-Aa-Ww-Yy-其中-A-是拉伸單元，a是0或1，各-W-獨(dú)立地是氨基酸單元，w是0-12之間的一個(gè)整數(shù)，-Y-是間隔單元，和y是0、1或2。
72.一種具有下式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物其中，L-是配體單元；-A-是拉伸單元；a是0或1；各-W-獨(dú)立地是氨基酸單元；w是0-12之間的一個(gè)整數(shù)；各n獨(dú)立地是0或1；p的范圍是1～約20；和各個(gè)出現(xiàn)的D獨(dú)立地是選自式DE和DF的藥物部分其中，在各位置獨(dú)立地為R2選自H和C1-C8烷基；R3選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R4選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R5選自H和甲基；或者R4和R5共同形成碳環(huán)，并具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb獨(dú)立地選自H、C1-C8烷基和C3-C8碳環(huán)，n選自2、3、4、5和6；R6選自H和C1-C8烷基；R7選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；各R8獨(dú)立地選自H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)和O-(C1-C8烷基)；R9選自H和C1-C8烷基；R10選自芳基或C3-C8雜環(huán)；Z是O、S、NH或NR12，其中R12是C1-C8烷基；R11選自H、C1-C20烷基、芳基、C3-C8雜環(huán)、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；m是范圍在1-1000之間的一個(gè)整數(shù)；R13是C2-C8烷基；R14是H或C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R15獨(dú)立地是H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R16獨(dú)立地是H、C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；R18選自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8雜環(huán))和-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳環(huán))；和n是0-6之間的一個(gè)整數(shù)。
73.如權(quán)利要求72所述的化合物，其特征在于，w是2-12之間的一個(gè)整數(shù)。
74.一種具有下式的化合物其中，在各位置獨(dú)立地為R2選自-氫和-C1-C8烷基；R3選自-氫、-C1-C8烷基、-C3-C8碳環(huán)、芳基、-C1-C8烷基-芳基、-C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、-C3-C8雜環(huán)和-C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R4選自-氫、-C1-C8烷基、-C3-C8碳環(huán)、-芳基、-C1-C8烷基-芳基、-C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、-C3-C8雜環(huán)和-C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))，其中R5選自-H和-甲基；或R4和R5一起具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb獨(dú)立地選自-H、-C1-C8烷基和-C3-C8碳環(huán)，n選自2、3、4、5和6，并與它們連接的碳原子形成環(huán)；R6選自-H和-C1-C8烷基；R7選自-H、-C1-C8烷基、-C3-C8碳環(huán)、芳基、-C1-C8烷基-芳基、-C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、-C3-C8雜環(huán)和-C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；各R8獨(dú)立地選自-H、-OH、-C1-C8烷基、-C3-C8碳環(huán)和-O-(C1-C8烷基)；R9選自-H和-C1-C8烷基；R10選自芳基或-C3-C8雜環(huán)；Z是-O-、-S-、-NH-或-NR12-，其中R12是C1-C8烷基；R11選自-H、C1-C20烷基、芳基、-C3-C8雜環(huán)、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；m是范圍在1-1000之間的一個(gè)整數(shù)；R13是-C2-C8烷基；R14是-H或-C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R15獨(dú)立地是-H、-COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R16獨(dú)立地是-H、-C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；和n是0-6之間的一個(gè)整數(shù)。
75.如權(quán)利要求74所述的化合物，其具有下式或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
76.如權(quán)利要求74所述的化合物，其具有下式或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
77.如權(quán)利要求74所述的化合物，其具有下式或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
78.如權(quán)利要求74所述的化合物，其具有下式或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
79.如權(quán)利要求74所述的化合物，其具有下式或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
80.如權(quán)利要求74所述的化合物，其具有下式或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
81.如權(quán)利要求74所述的化合物，其具有下式或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
82.如權(quán)利要求74所述的化合物，其具有下式或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
83.如權(quán)利要求74所述的化合物，其具有下式或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
84.如權(quán)利要求74所述的化合物，其具有下式或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
85.一種具有下式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物其中R2選自-氫和-C1-C8烷基；R3選自-氫、-C1-C8烷基、-C3-C8碳環(huán)、芳基、-C1-C8烷基-芳基、-C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、-C3-C8雜環(huán)和-C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R4選自-氫、-C1-C8烷基、-C3-C8碳環(huán)、-芳基、-C1-C8烷基-芳基、-C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、-C3-C8雜環(huán)和-C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))，其中R5選自-H和-甲基；或R4和R5一起具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb獨(dú)立地選自-H、-C1-C8烷基和-C3-C8碳環(huán)，n選自2、3、4、5和6，并與它們連接的碳原子形成環(huán)；R6選自-H和-C1-C8烷基；R7選自-H、-C1-C8烷基、-C3-C8碳環(huán)、芳基、-C1-C8烷基-芳基、-C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、-C3-C8雜環(huán)和-C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；各R8獨(dú)立地選自-H、-OH、-C1-C8烷基、-C3-C8碳環(huán)和-O-(C1-C8烷基)；R9選自-H和-C1-C8烷基；R10選自芳基或-C3-C8雜環(huán)；Z是-O-、-S-、-NH-或-NR12-，其中R12是C1-C8烷基；R11選自-H、C1-C20烷基、芳基、-C3-C8雜環(huán)、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；m是范圍在1-1000之間的一個(gè)整數(shù)；R13是-C2-C8烷基；R14是-H或-C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R15獨(dú)立地是-H、-COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R16獨(dú)立地是-H、-C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；和n是0-6之間的一個(gè)整數(shù)。
86.如權(quán)利要求85所述的化合物，其具有下式或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
87.如權(quán)利要求85所述的化合物，其具有下式或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
88.如權(quán)利要求85所述的化合物，其具有下式或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
89.如權(quán)利要求85所述的化合物，其具有下式或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
90.如權(quán)利要求85所述的化合物，其具有下式或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
91.如權(quán)利要求85所述的化合物，其具有下式或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
92.如權(quán)利要求85所述的化合物，其具有下式或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
93.如權(quán)利要求85所述的化合物，其具有下式或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
94.如權(quán)利要求85所述的化合物，其具有下式或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
95.如權(quán)利要求72所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，其特征在于，所述配體單元是抗體。
96.如權(quán)利要求1所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，其特征在于，所述配體單元是抗體。
97.如權(quán)利要求2所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，其特征在于，所述配體單元是抗體。
98.如權(quán)利要求95、96或97中任一項(xiàng)所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，其特征在于，所述抗體是單克隆抗體。
99.如權(quán)利要求98所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，其特征在于，所述單克隆抗體是cBR96、cAC10、2F2、S2C6或1F6。
100.如權(quán)利要求1所述的化合物，其具有下式或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。
101.一種殺傷腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞或抑制腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括將一定量的權(quán)利要求1、2、4、72或85-97中任一項(xiàng)所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物給予患者，所述用量能有效殺傷腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞或抑制腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞增殖。
102.一種治療癌癥的方法，所述方法包括將一定量的權(quán)利要求1、2、72或85-97中任一項(xiàng)所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物給予患者，所述用量能有效治療癌癥。
103.一種治療自身免疫病的方法，所述方法包括將一定量的權(quán)利要求1、2、4、72或85-97中任一項(xiàng)所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物給予患者，所述用量能有效治療自身免疫病。
104.一種治療傳染病的方法，所述方法包括將一定量的權(quán)利要求1、2、72或85-97中任一項(xiàng)所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物給予患者，所述用量能有效治療傳染病。
105.如權(quán)利要求101所述的方法，還包括給予有效量的另一種抗癌藥。
106.如權(quán)利要求102所述的方法，還包括給予治療有效量的另一種抗癌藥。
107.如權(quán)利要求103所述的方法，還包括給予治療有效量的免疫抑制劑。
108.如權(quán)利要求104所述的方法，還包括給予治療有效量的抗傳染病藥。
109.如權(quán)利要求1、2、4、72或85-97中任一項(xiàng)所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，它是分離或純化形式的。
110.如權(quán)利要求101所述的方法，其特征在于，所述患者是人。
111.如權(quán)利要求102所述的方法，其特征在于，所述患者是人。
112.如權(quán)利要求103所述的方法，其特征在于，所述患者是人。
113.如權(quán)利要求104所述的方法，其特征在于，所述患者是人。
114.如權(quán)利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述抗體與CD30、CD40、Lewis Y和CD70結(jié)合。
115.如權(quán)利要求4或52所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述抗體不是與ErbB受體結(jié)合的抗體或與受體(1)-(35)中一種或多種結(jié)合的抗體(1)BMPR1B(骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體-IB型，Genbank登錄號(hào)NM_001203)；(2)E16(LAT1，SLC7A5，Genbank登錄號(hào)NM_003486)；(3)STEAP1(六次跨膜的前列腺上皮抗原，Genbank登錄號(hào)NM_012449)；(4)0772P(CA125、MUC16，Genbank登錄號(hào)AF361486)；(5)MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核細(xì)胞強(qiáng)化因子、間皮素，Genbank登錄號(hào)NM_005823)；(6)Napi3b(NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶質(zhì)運(yùn)載體家族34(磷酸鈉)、成員2、II型鈉依賴性磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3b，Genbank登錄號(hào)NM_006424)；(7)Sema5b(FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、腦信號(hào)蛋白5b Hlog、sema結(jié)構(gòu)域、七個(gè)血小板反應(yīng)蛋白重復(fù)序列(1型和1型樣)、跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)和短胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、(腦信號(hào)蛋白)5B，Genbank登錄號(hào)AB040878)；(8)PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKEN cDNA 2700050C12、RIKEN cDNA 2700050C12基因，Genbank登錄號(hào)AY358628)；(9)ETBR(內(nèi)皮縮血管肽B型受體，Genbank登錄號(hào)AY275463)；(10)MSG783(RNF124，假擬蛋白FLJ20315，Genbank登錄號(hào)NM_017763)；(11)STEAP2(HGNC 8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前列腺癌相關(guān)基因1、前列腺癌相關(guān)蛋白1、六次跨膜的前列腺上皮抗原2、六次跨膜的前列腺蛋白，Genbank登錄號(hào)AF455138)；(12)TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬時(shí)受體電勢陽離子通道、亞家族M、成員4，Genbank登錄號(hào)NM_017636)；(13)CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎癌衍生生長因子，Genbank登錄號(hào)NP_003203或NM_003212)；(14)CD21(CR2(補(bǔ)體受體2)或C3DR(C3d/EB病毒受體)或Hs.73792，Genbank登錄號(hào)M26004)；(15)CD79b(IGb(免疫球蛋白-相關(guān)β)、B29，Genbank登錄號(hào)NM_000626)；(16)FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(含有磷酸酶錨定蛋白1a的SH2結(jié)構(gòu)域)、SPAP1B、SPAP1C，Genbank登錄號(hào)NM_030764)；(17)HER2(Genbank登錄號(hào)M11730)；(18)NCA(Genbank登錄號(hào)M18728)；(19)MDP(Genbank登錄號(hào)BC017023)；(20)IL20Rα(Genbank登錄號(hào)AF184971)；(21)短小蛋白聚糖(Genbank登錄號(hào)AF229053)；(22)Ephb2R(Genbank登錄號(hào)NM_004442)；(23)ASLG659(Genbank登錄號(hào)AX092328)；(24)PSCA(Genbank登錄號(hào)AJ297436)；(25)GEDA(Genbank登錄號(hào)AY260763)；(26)BAFF-R(Genbank登錄號(hào)NP_443177.1)；(27)CD22(Genbank登錄號(hào)NP-001762.1)；(28)CD79a(CD79A、CD79α、免疫球蛋白相關(guān)α，Genbank登錄號(hào)NP_001774.1)；(29)CXCR5(伯基特淋巴瘤受體1，Genbank登錄號(hào)NP_001707.1)；(30)HLA-DOB(與肽結(jié)合并將肽提呈給CD4+T淋巴細(xì)胞的II型MHC分子的β亞基(Ia抗原)，Genbank登錄號(hào)NP_002111.1)；(31)P2X5(嘌呤能受體P2X配體-門控離子通道5，Genbank登錄號(hào)NP_002552.2)；(32)CD72(B細(xì)胞分化抗原CD72，Lyb-2，Genbank登錄號(hào)NP_001773.1)；(33)LY64(淋巴細(xì)胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRR)家族的I型膜蛋白，Genbank登錄號(hào)NP_005573.1)；(34)FCRH1(Fc受體樣蛋白1，Genbank登錄號(hào)NP_443170.1)；和(35)IRTA2(免疫球蛋白超家族受體易位相關(guān)2，Genbank登錄號(hào)NP_112571.1)。
116.如權(quán)利要求95、96或97所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，其特征在于，所述抗體不是與ErbB受體結(jié)合的抗體或與受體(1)-(35)中一種或多種結(jié)合的抗體(1)BMPR1B(骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體-IB型，Genbank登錄號(hào)NM_001203)；(2)E16(LAT1，SLC7A5，Genbank登錄號(hào)NM_003486)；(3)STEAP1(六次跨膜的前列腺上皮抗原，Genbank登錄號(hào)NM_012449)；(4)0772P(CA125、MUC16，Genbank登錄號(hào)AF361486)；(5)MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核細(xì)胞強(qiáng)化因子、間皮素，Genbank登錄號(hào)NM_005823)；(6)Napi3b(NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶質(zhì)運(yùn)載體家族34(磷酸鈉)、成員2、II型鈉依賴性磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3b，Genbank登錄號(hào)NM_006424)；(7)Sema 5b(FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、腦信號(hào)蛋白5b Hlog、sema結(jié)構(gòu)域、七個(gè)血小板反應(yīng)蛋白重復(fù)序列(1型和1型樣)、跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)和短胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、(腦信號(hào)蛋白)5B，Genbank登錄號(hào)AB040878)；(8)PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKEN cDNA 2700050C12、RIKEN cDNA 2700050C12基因，Genbank登錄號(hào)AY358628)；(9)ETBR(內(nèi)皮縮血管肽B型受體，Genbank登錄號(hào)AY275463)；(10)MSG783(RNF124，假擬蛋白FLJ20315，Genbank登錄號(hào)NM_017763)；(11)STEAP2(HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前列腺癌相關(guān)基因1、前列腺癌相關(guān)蛋白1、六次跨膜的前列腺上皮抗原2、六次跨膜的前列腺蛋白，Genbank登錄號(hào)AF455138)；(12)TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬時(shí)受體電勢陽離子通道、亞家族M、成員4，Genbank登錄號(hào)NM_017636)；(13)CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎癌衍生生長因子，Genbank登錄號(hào)NP_003203或NM_003212)；(14)CD21(CR2(補(bǔ)體受體2)或C3DR(C3d/EB病毒受體)或Hs.73792，Genbank登錄號(hào)M26004)；(15)CD79b(IGb(免疫球蛋白-相關(guān)β)、B29，Genbank登錄號(hào)NM_000626)；(16)FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(含有磷酸酶錨定蛋白1a的SH2結(jié)構(gòu)域)、SPAP1B、SPAP1C，Genbank登錄號(hào)NM_030764)；(17)HER2(Genbank登錄號(hào)M11730)；(18)NCA(Genbank登錄號(hào)M18728)；(19)MDP(Genbank登錄號(hào)BC017023)；(20)IL20Rα(Genbank登錄號(hào)AF184971)；(21)短小蛋白聚糖(Genbank登錄號(hào)AF229053)；(22)Ephb2R(Genbank登錄號(hào)NM_004442)；(23)ASLG659(Genbank登錄號(hào)AX092328)；(24)PSCA(Genbank登錄號(hào)AJ297436)；(25)GEDA(Genbank登錄號(hào)AY260763)；(26)BAFF-R(Genbank登錄號(hào)NP_443177.1)；(27)CD22(Genbank登錄號(hào)NP-001762.1)；(28)CD79a(CD79A，CD79α，免疫球蛋白相關(guān)α，Genbank登錄號(hào)NP_001774.1)；(29)CXCR5(伯基特淋巴瘤受體1，Genbank登錄號(hào)NP_001707.1)；(30)HLA-DOB(與肽結(jié)合并將肽提呈給CD4+T淋巴細(xì)胞的II型MHC分子的β亞基(Ia抗原)，Genbank登錄號(hào)NP_002111.1)；(31)P2X5(嘌呤能受體P2X配體-門控離子通道5，Genbank登錄號(hào)NP_002552.2)；(32)CD72(B細(xì)胞分化抗原CD72，Lyb-2，Genbank登錄號(hào)NP_001773.1)；(33)LY64(淋巴細(xì)胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRR)家族的I型膜蛋白，Genbank登錄號(hào)NP_005573.1)；(34)FCRH1(Fc受體樣蛋白1，Genbank登錄號(hào)NP_443170.1)；和(35)IRTA2(免疫球蛋白超家族受體易位相關(guān)2，Genbank登錄號(hào)NP_112571.1)。
117.如權(quán)利要求28所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，Ww是-苯丙氨酸-賴氨酸-。
118.如權(quán)利要求28所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，Ww是-N-甲基纈氨酸-瓜氨酸-。
119.一種抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其含有共價(jià)連接于一個(gè)或多個(gè)藥物部分的抗體，所述化合物具有式IcAb_Aa-Ww-Yy-D)pIc或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，其中Ab是與一種或多種腫瘤相關(guān)抗原(1)-(35)結(jié)合的抗體(1)BMPR1B(骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體-IB型，Genbank登錄號(hào)NM_001203)；(2)E16(LAT1，SLC7A5，Genbank登錄號(hào)NM_003486)；(3)STEAP1(六次跨膜的前列腺上皮抗原，Genbank登錄號(hào)NM_012449)；(4)0772P(CA125、MUC16，Genbank登錄號(hào)AF361486)；(5)MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核細(xì)胞強(qiáng)化因子、間皮素，Genbank登錄號(hào)NM_005823)；(6)Napi3b(NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶質(zhì)運(yùn)載體家族34(磷酸鈉)、成員2、II型鈉依賴性磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3b，Genbank登錄號(hào)NM_006424)；(7)Sema 5b(FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、腦信號(hào)蛋白5b Hlog、sema結(jié)構(gòu)域、七個(gè)血小板反應(yīng)蛋白重復(fù)序列(1型和1型樣)、跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)和短胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、(腦信號(hào)蛋白)5B，Genbank登錄號(hào)AB040878)；(8)PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKEN cDNA 2700050C12、RIKEN cDNA 2700050C12基因，Genbank登錄號(hào)AY358628)；(9)ETBR(內(nèi)皮縮血管肽B型受體，Genbank登錄號(hào)AY275463)；(10)MSG783(RNF124，假擬蛋白FLJ20315，Genbank登錄號(hào)NM_017763)；(11)STEAP2(HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前列腺癌相關(guān)基因1、前列腺癌相關(guān)蛋白1、六次跨膜的前列腺上皮抗原2、六次跨膜的前列腺蛋白，Genbank登錄號(hào)AF455138)；(12)TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬時(shí)受體電勢陽離子通道、亞家族M、成員4，Genbank登錄號(hào)NM_017636)；(13)CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎癌衍生生長因子，Genbank登錄號(hào)NP_003203或NM_003212)；(14)CD21(CR2(補(bǔ)體受體2)或C3DR(C3d/EB病毒受體)或Hs.73792，Genbank登錄號(hào)M26004)；(15)CD79b(IGb(免疫球蛋白-相關(guān)β)、B29，Genbank登錄號(hào)NM_000626)；(16)FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(含有磷酸酶錨定蛋白1a的SH2結(jié)構(gòu)域)、SPAP1B、SPAP1C，Genbank登錄號(hào)NM_030764)；(17)HER2(Genbank登錄號(hào)M11730)；(18)NCA(Genbank登錄號(hào)M18728)；(19)MDP(Genbank登錄號(hào)BC017023)；(20)IL20Rα(Genbank登錄號(hào)AF184971)；(21)短小蛋白聚糖(Genbank登錄號(hào)AF229053)；(22)Ephb2R(Genbank登錄號(hào)NM_004442)；(23)ASLG659(Genbank登錄號(hào)AX092328)；(24)PSCA(Genbank登錄號(hào)AJ297436)；(25)GEDA(Genbank登錄號(hào)AY260763)；(26)BAFF-R(Genbank登錄號(hào)NP_443177.1)；(27)CD22(Genbank登錄號(hào)NP-001762.1)；(28)CD79a(CD79A，CD79α，免疫球蛋白相關(guān)α，Genbank登錄號(hào)NP_001774.1)；(29)CXCR5(伯基特淋巴瘤受體1，Genbank登錄號(hào)NP_001707.1)；(30)HLA-DOB(與肽結(jié)合并將肽提呈給CD4+T淋巴細(xì)胞的II型MHC分子的β亞基(Ia抗原)，Genbank登錄號(hào)NP_002111.1)；(31)P2X5(嘌呤能受體P2X配體-門控離子通道5，Genbank登錄號(hào)NP_002552.2)；(32)CD72(B細(xì)胞分化抗原CD72，Lyb-2，Genbank登錄號(hào)NP_001773.1)；(33)LY64(淋巴細(xì)胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRR)家族的I型膜蛋白，Genbank登錄號(hào)NP_005573.1)；(34)FCRH1(Fc受體樣蛋白1，可能在B-淋巴細(xì)胞分化中起作用，Genbank登錄號(hào)NP_443170.1)；和(35)IRTA2(免疫球蛋白超家族受體易位相關(guān)2，Genbank登錄號(hào)NP_112571.1)，A是拉伸單元，a是0或1，各W獨(dú)立地是氨基酸單元，w是0-12之間的一個(gè)整數(shù)，Y是間隔單元，和y是0、1或2，p的范圍是1-20，和D是選自式DE和DF的藥物部分其中，DE和DF的波浪線指至A、W或Y的共價(jià)連接位點(diǎn)，各位置相互獨(dú)立地為R2選自H和C1-C8烷基；R3選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R4選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；R5選自H和甲基；或者R4和R5共同形成碳環(huán)，并具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb獨(dú)立地選自H、C1-C8烷基和C3-C8碳環(huán)，n選自2、3、4、5和6；R6選自H和C1-C8烷基；R7選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環(huán))、C3-C8雜環(huán)和C1-C8烷基-(C3-C8雜環(huán))；各R8獨(dú)立地選自H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳環(huán)和O-(C1-C8烷基)；R9選自H和C1-C8烷基；R10選自芳基或C3-C8雜環(huán)；Z是O、S、NH或NR12，其中R12是C1-C8烷基；R11選自H、C1-C20烷基、芳基、C3-C8雜環(huán)、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；m是范圍在1-1000之間的一個(gè)整數(shù)；R13是C2-C8烷基；R14是H或C1-C8烷基各個(gè)出現(xiàn)的R15獨(dú)立地是H、COOH、一(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；各個(gè)出現(xiàn)的R16獨(dú)立地是H、C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；R18選自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8雜環(huán))和-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳環(huán))；和n是0-6之間的一個(gè)整數(shù)。
120.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D是式DE
121.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D是式DF
122.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物具有下式Ab-(D)p其中a、w和v各自為0。
123.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述抗體通過所述抗體的半胱氨酸殘基連接于藥物部分。
124.如權(quán)利要求123所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，p是1-4。
125.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，p是2-8。
126.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，p是2-5。
127.如權(quán)利要求123所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其具有下式
128.如權(quán)利要求127所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其具有下式其中w和y各自為0。
129.如權(quán)利要求128所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D是式DE。
130.如權(quán)利要求129所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，式DE具有下式
131.如權(quán)利要求128所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D是式DF。
132.如權(quán)利要求131所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，式DF具有下式
133.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其具有下式
134.如權(quán)利要求133所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其具有下式
135.如權(quán)利要求134所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其具有下式
136.如權(quán)利要求135所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D是式DE。
137.如權(quán)利要求136所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，式DE具有下式
138.如權(quán)利要求134所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D是式DF。
139.如權(quán)利要求138所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，式DF具有下式
140.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其具有下式
141.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，w是2-12之間的一個(gè)整數(shù)。
142.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，w是2。
143.如權(quán)利要求142所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，Ww是-纈氨酸-瓜氨酸-。
144.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D具有下式
145.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D具有下式
146.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D具有下式
147.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D具有下式
148.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D具有下式
149.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D具有下式
150.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D具有下式
151.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D具有下式
152.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D具有下式
153.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D具有下式
154.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，D具有下式
155.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述抗體與HER2受體特異性結(jié)合。
156.如權(quán)利要求155所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述化合物與HER2受體的胞外結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，并抑制過表達(dá)HER2受體的腫瘤細(xì)胞生長。
157.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述抗體是單克隆抗體。
158.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述抗體是雙特異性抗體。
159.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述抗體是嵌合抗體。
160.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述抗體是人源化抗體。
161.如權(quán)利要求160所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述人源化抗體選自huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(曲妥珠單抗)。
162.如權(quán)利要求161所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述抗體是huMAb4D5-8(曲妥珠單抗)。
163.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述抗體是抗體片段。
164.如權(quán)利要求163所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述抗體片段是Fab片段。
165.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，大量的藥物部分直到抗體-藥物偶聯(lián)化合物進(jìn)入具有所述抗體-藥物偶聯(lián)物的抗體特異性細(xì)胞表面受體的細(xì)胞中才與抗體切斷分開，且當(dāng)所述抗體-藥物偶聯(lián)物確實(shí)進(jìn)入所述細(xì)胞中時(shí)藥物部分才與抗體切斷分開。
166.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，與含有所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物的藥物部分的藥物化合物相比，在哺乳動(dòng)物中所述化合物或所述化合物的胞內(nèi)代謝物的生物利用度提高。
167.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，與不含有藥物部分的所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物的類似物相比，在哺乳動(dòng)物中所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物或其胞內(nèi)代謝物的生物利用度提高。
168.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述藥物部分在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)才與所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物的抗體或與所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物的胞內(nèi)代謝物切斷分開。
169.如權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其選自下式其中Val是纈氨酸，Cit是瓜氨酸。
170.如權(quán)利要求169所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述抗體是huMAb4D5-8(曲妥珠單抗)。
171.一種藥物組合物，其含有有效量的權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、運(yùn)載體或賦形劑。
172.如權(quán)利要求171所述的藥物組合物，還包含治療有效量的化療藥，選自微管形成抑制劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑和DNA結(jié)合劑。
173.一種殺傷腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞或抑制腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括用一定量的權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物處理腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞，有效殺傷腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞或抑制腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞的增殖。
174.一種治療癌癥的方法，所述方法包括將一定量的權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物給予過度增殖病患者，所述用量能有效治療癌癥。
175.如權(quán)利要求174所述的方法，還包括給予有效量的另一種抗癌藥。
176.如權(quán)利要求174所述的方法，還包括給予有效量的免疫抑制劑。
177.如權(quán)利要求174所述的方法，還包括給予有效量的抗傳染病藥。
178.一種治療自身免疫病的方法，所述方法包括將一定量的權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物給予患者，所述用量能有效治療自身免疫病。
179.一種治療傳染病的方法，所述方法包括將一定量的權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物給予患者，所述用量能有效治療傳染病。
180.一種抑制細(xì)胞增殖的方法，該方法包括使細(xì)胞培養(yǎng)基中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞接觸權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)物化合物，和測定所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物的細(xì)胞毒活性，藉此抑制細(xì)胞增殖。
181.如權(quán)利要求180所述的方法，還包括培養(yǎng)細(xì)胞約6小時(shí)～5天
182.如權(quán)利要求180所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有抗體-藥物偶聯(lián)化合物能結(jié)合的HER2受體蛋白。
183.如權(quán)利要求180所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是SK-BR-3乳腺腫瘤細(xì)胞。
184.如權(quán)利要求180所述的方法，其特征在于，所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物的細(xì)胞毒活性是主要由抗體-藥物偶聯(lián)化合物的藥物部分組成的藥物化合物的兩倍以上。
185.一種治療癌癥的方法，所述方法包括給予患者由權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、運(yùn)載體或賦形劑組成的制劑。
186.如權(quán)利要求185所述的方法，其特征在于，所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物與ErbB2基因編碼的受體特異性結(jié)合。
187.如權(quán)利要求185所述的方法，其特征在于，給予患者的所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物的劑量范圍約為0.1-10mg/kg患者體重。
188.如權(quán)利要求185所述的方法，其特征在于，以大約三周的間隔給予所述抗體-藥物偶聯(lián)物。
189.如權(quán)利要求185所述的方法，其特征在于，經(jīng)胃腸道外給予所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物。
190.如權(quán)利要求189所述的方法，其特征在于，將所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物與藥學(xué)上可接受的胃腸道外運(yùn)載體配制在一起。
191.如權(quán)利要求185所述的方法，其特征在于，將所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物配制成單位劑量注射形式。
192.如權(quán)利要求185所述的方法，其特征在于，所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物是靜脈內(nèi)給予的。
193.如權(quán)利要求185所述的方法，還包括給予與選自(1)-(35)的腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合的第二抗體。
194.如權(quán)利要求193所述的方法，其特征在于，所述第二抗體與細(xì)胞毒劑偶聯(lián)。
195.一種抑制過表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原的腫瘤細(xì)胞生長的方法，所述方法包括將權(quán)利要求119所述的與所述腫瘤相關(guān)抗原特異性結(jié)合的抗體-藥物偶聯(lián)物化合物和化療藥給予患者，其中所述抗體-藥物偶聯(lián)物和所述化療藥各自的給藥量能有效抑制腫瘤細(xì)胞在患者中的生長。
196.如權(quán)利要求195所述的方法，其特征在于，所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物能使腫瘤細(xì)胞對所述化療藥敏感。
197.一種治療易患或經(jīng)診斷患有特征為ErbB2受體過表達(dá)疾病的病人的方法，所述方法包括給予有效量的聯(lián)用權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)化合物和化療藥。
198.一種檢測癌細(xì)胞的試驗(yàn)，所述試驗(yàn)包括使細(xì)胞接觸權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)物化合物，和測定抗體-藥物偶聯(lián)化合物與細(xì)胞的結(jié)合程度。
199.如權(quán)利要求198所述的試驗(yàn)，其特征在于，所述細(xì)胞是乳腺腫瘤細(xì)胞。
200.如權(quán)利要求198所述的試驗(yàn)，其特征在于，通過用熒光原位雜交(FISH)測定腫瘤相關(guān)抗原編碼核酸的水平來確定所述結(jié)合程度。
201.如權(quán)利要求198所述的試驗(yàn)，其特征在于，所述結(jié)合程度是通過免疫組化(IHC)方法測定的。
202.一種制品，其包括權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)物化合物；容器；和包裝說明書或標(biāo)簽，說明該化合物可用于治療特征為ErbB2受體過表達(dá)的癌癥。
203.如權(quán)利要求202所述的制品，其特征在于，所述標(biāo)簽和包裝說明書說明所述化合物可用于治療特征為ErbB2受體過表達(dá)的癌癥。
204.如權(quán)利要求202所述的制品，其特征在于，所述癌癥是乳腺癌。
205.如權(quán)利要求204所述的制品，其特征在于，所述癌癥的特征是ErbB2受體以2+或更高水平過表達(dá)。
206.一種治療哺乳動(dòng)物癌癥的方法，其特征在于，所述癌癥的特征是ErbB2(HER2)受體過表達(dá)和對抗-ErbB2抗體治療無反應(yīng)或反應(yīng)差，所述方法包括將治療有效量的權(quán)利要求119所述的抗體-藥物偶聯(lián)物化合物給予所述哺乳動(dòng)物。
207.如權(quán)利要求206所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物是人。
208.如權(quán)利要求206所述的方法，其特征在于，所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物的抗體是生長抑制抗體。
209.如權(quán)利要求206所述的方法，其特征在于，所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
210.如權(quán)利要求206所述的方法，其特征在于，所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物誘導(dǎo)凋亡。
211.如權(quán)利要求206所述的方法，其特征在于，所述癌癥選自乳腺癌、卵巢癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、前列腺癌或膀胱癌。
212.如權(quán)利要求211所述的方法，其特征在于，所述癌癥是乳腺癌和以2+或更高水平過表達(dá)ErbB2的乳腺癌。
213.如權(quán)利要求211所述的方法，其特征在于，所述乳腺癌以3+水平過表達(dá)ErbB2。
214.如權(quán)利要求206所述的方法，其特征在于，所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物的抗體具有4D5單克隆抗體的生物學(xué)特征。
215.如權(quán)利要求206所述的方法，其特征在于，所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物的抗體結(jié)合的表位與4D5單克隆抗體結(jié)合的表位基本相同。
216.如權(quán)利要求206所述的方法，其特征在于，所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物的抗體是單克隆抗體4D5(ATCC CRL 10463)。
217.如權(quán)利要求216所述的方法，其特征在于，所述抗體是人源化抗體。
218.如權(quán)利要求217所述的方法，其特征在于，所述抗體選自人源化抗體huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(曲妥珠單抗)。
219.如權(quán)利要求218所述的方法，其特征在于，所述抗體是人源化抗體huMAb4D5-8(曲妥珠單抗)。
220.如權(quán)利要求206所述的方法，其特征在于，所述抗體-藥物偶聯(lián)化合物的抗體是抗體片段。
221.如權(quán)利要求220所述的方法，其特征在于，所述抗體片段是Fab片段。
全文摘要
制備耳抑素肽，包括MeVal－Val－Dil－Dap－去甲麻黃堿(MMAE)和MeVal－Val－Dil－Dap－Phe(MMAF)，通過各種接頭包括馬來酰亞胺癸?；璿al－cit－PAB將其連接于配體。得到的配體藥物偶聯(lián)物在體外和體內(nèi)都有活性。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1938046SQ200480039706
公開日2007年3月28日申請日期2004年11月5日優(yōu)先權(quán)日2003年11月6日
發(fā)明者S·O·多羅尼納, P·D·森特, B·E·托克, A·J·艾本斯, T·B·克林, P·波拉克斯, M·X·斯利沃科夫斯基, S·D·斯班舍申請人:西雅圖基因公司

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該技術(shù)已申請專利。僅供學(xué)習(xí)研究，如用于商業(yè)用途，請聯(lián)系技術(shù)所有人。
技術(shù)研發(fā)人員：S.O.多羅尼納;P.D.森特;B.E.托克;A.J.艾本斯;T.B.克林;P.波拉克斯;M.X.斯利沃科夫斯基;S.D.斯班舍
技術(shù)所有人：西雅圖基因公司
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