專利名稱：質(zhì)粒保持的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及質(zhì)粒的穩(wěn)定保持系統(tǒng)、用于該系統(tǒng)的宿主細(xì)胞以及采用該系統(tǒng)獲得在醫(yī)學(xué)應(yīng)用上有用的質(zhì)粒的方法。
將本文引用的所有文獻(xiàn)引入作為參考。
背景技術(shù)：
質(zhì)粒通常用于重組蛋白的制備和用于基因治療目的的DNA的制備。質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定保持對(duì)于有效制備這些產(chǎn)物很重要。但是，宿主細(xì)胞內(nèi)攜帶的外源染色體DNA本身是不穩(wěn)定的，因?yàn)榕c無質(zhì)粒的細(xì)胞相比，含有該質(zhì)粒的細(xì)胞增加了代謝負(fù)擔(dān)。為了保持質(zhì)粒穩(wěn)定性和減小代謝負(fù)擔(dān)，質(zhì)粒經(jīng)工程化以包含顯性選擇性標(biāo)記物。
在培養(yǎng)細(xì)胞中保持質(zhì)粒的常規(guī)方法為在質(zhì)粒上包括抗生素抗性基因，并在合適的抗生素存在下保持細(xì)胞。對(duì)于計(jì)劃用于治療用途的細(xì)胞或質(zhì)粒來說，這具有缺點(diǎn)，即包含抗生素抗性基因的質(zhì)粒的使用可能會(huì)促進(jìn)抗生素抗性的傳播。
一些質(zhì)粒保持的方法曾試圖利用由質(zhì)粒攜帶基因控制的自然產(chǎn)生的分離后殺滅機(jī)制(post segregational killing mechanism)。例如，hok/sok、srnB和pnd系統(tǒng)涉及由穩(wěn)定mRNA編碼的殺傷蛋白，該殺傷蛋白由小的不穩(wěn)定反義RNA調(diào)節(jié)，其結(jié)合到殺傷RNA并使其失活。該殺傷RNA在反義RNA降解后保留在無質(zhì)粒的分離物中并翻譯成致命蛋白。曾在減毒的活載體疫苗菌株傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi))CDV 908htr-A中研究過利用hok/sok系統(tǒng)的質(zhì)粒保持(Galen et al，1999，Infect.Immunol，676424-6433)。但是，這種分離后殺死機(jī)制不能在轉(zhuǎn)化后進(jìn)行質(zhì)粒篩選，因此依然依賴于質(zhì)粒上的抗生素抗性基因的存在。
已開發(fā)一些無抗生素篩選的用于保持和篩選質(zhì)粒的備選方法，其中該質(zhì)粒編碼彌補(bǔ)宿主細(xì)胞營養(yǎng)缺陷的基因。例如，宿主細(xì)胞可以是突變細(xì)胞，其不能合成必需氨基酸代謝物，只有在包含編碼丟失的用于合成此氨基酸的元件的質(zhì)粒存在時(shí)才能在缺少此氨基酸的培養(yǎng)基中存活(Wang M-D et al，1987，J.Bacteriol.，1695610-5614)。但是，由于該氨基酸必需去除，這種方法限制了生長培養(yǎng)基的組成?？捎糜趶?fù)雜培養(yǎng)基的備選方法采用具有熱敏感tRNA合成酶基因的突變宿主細(xì)胞，僅在存在包含野生型tRNA合成酶基因的質(zhì)粒時(shí)，該宿主細(xì)胞才能在非許可溫度下存活(Skogman et al，1984，Gene 31117-122)。另一篩選方法利用質(zhì)粒攜帶的tRNA基因彌補(bǔ)突變宿主細(xì)胞中必需染色體基因的無義突變(Zengel etal，1981，J.Bacteriol，145459-465)?；蛘?，增加細(xì)胞代謝負(fù)擔(dān)的基因，如pil操縱子可置于宿主染色體上，以便宿主細(xì)胞僅在編碼相應(yīng)阻遏蛋白的質(zhì)粒存在時(shí)才能存活(Ogden et al，1992，Biotech.Bioeng.，401027-1038)。
EP 0851932描述了通過操縱基因阻遏物滴定(titration)在體外培養(yǎng)細(xì)胞中保持質(zhì)粒的方法。該方法涉及對(duì)宿主細(xì)胞的工程化，以便它包含編碼阻遏物的第一染色體基因和細(xì)胞生長必需的第二染色體基因，該第二染色體基因在其控制區(qū)具有用于該阻遏物的操縱基因序列。質(zhì)粒不存在時(shí)，第二染色體基因的表達(dá)由于阻遏物結(jié)合到操縱基因而被抑制，細(xì)胞死亡。將需要保持在該宿主細(xì)胞中的質(zhì)粒工程化以包含操縱基因序列，以便在該質(zhì)粒存在時(shí)，將阻遏物從生長必需基因滴定移除(titrated away)，該基因被表達(dá)，細(xì)胞存活。這種機(jī)制也描述于Williams et al(Nucleic AcidsResearch，1999，26(9)2120-2124)和Cranenburgh et al(Nucleic AcidResearch，2001，29(5)e26-e27)。
盡管一些不依賴于抗生素篩選的質(zhì)粒保持和篩選機(jī)制已公知，考慮到質(zhì)粒在生產(chǎn)用于治療應(yīng)用的DNA和重組蛋白方面的日益增加的重要性，人們?nèi)匀恍枰_發(fā)其它的方法。此外，到目前為止開發(fā)的質(zhì)粒保持和篩選系統(tǒng)需要使用為應(yīng)用于這些系統(tǒng)而經(jīng)特別修飾的質(zhì)粒。人們依然需要這樣的質(zhì)粒保持和篩選系統(tǒng)，即其不涉及抗生素抗性且采用本領(lǐng)域普通的質(zhì)粒而無需特別修飾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一方面，提供轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其包含
i)抑制細(xì)胞生長的染色體基因；以及ii)編碼反義序列的質(zhì)粒，其中由該質(zhì)粒編碼的所述反義序列抑制所述染色體基因的作用，由此允許細(xì)胞生長。
優(yōu)選地，由所述質(zhì)粒編碼的反義序列是由質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)編碼，但它也可由該質(zhì)粒的其它區(qū)域編碼。
本發(fā)明使用的術(shù)語“反義序列”指基本上互補(bǔ)于其靶序列并能夠特異地與該靶序列雜交的核酸序列。優(yōu)選地，由質(zhì)粒編碼的反義序列在嚴(yán)緊條件下雜交到其靶序列。高嚴(yán)緊雜交條件定義為在包含50％甲酰胺、5XSSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5xDenhardts溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml變性、剪切的鮭魚精DNA的溶液中42℃孵育過夜，隨后在0.1X SSC中在約65℃清洗濾器。
本發(fā)明使用的“細(xì)胞生長”指培養(yǎng)基中的細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間增加和指細(xì)胞存活，其中活細(xì)胞的數(shù)量不隨時(shí)間減少?！耙种萍?xì)胞生長”的含義是指染色體基因?qū)?xì)胞是致命的，以致培養(yǎng)基中活細(xì)胞的數(shù)量隨時(shí)間減少，或其阻止細(xì)胞生長，以致培養(yǎng)基中活細(xì)胞的數(shù)量不隨時(shí)間增加。
根據(jù)本發(fā)明的該第一方面，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的生長依賴于質(zhì)粒的存在，導(dǎo)致對(duì)保持質(zhì)粒的細(xì)胞的篩選。如果質(zhì)粒從宿主細(xì)胞丟失，則染色體基因的作用將不再被質(zhì)粒編碼的反義序列阻止，細(xì)胞生長將被抑制。在一些實(shí)施方案中，只需單拷貝的質(zhì)粒就可抑制染色體基因的表達(dá)，從而允許細(xì)胞生長。在其它實(shí)施方案中，可能需要多拷貝的質(zhì)粒存在以抑制染色體基因的表達(dá)。
染色體基因可直接抑制細(xì)胞生長。例如，染色體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯可產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞致命的如毒素(toxin)的蛋白質(zhì)?；蛘撸旧w基因可間接抑制細(xì)胞生長。例如，染色體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯可產(chǎn)生阻遏蛋白，其抑制第二染色體基因編碼的對(duì)細(xì)胞生長必需的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯。染色體基因的轉(zhuǎn)錄還可產(chǎn)生反義序列，其結(jié)合到第二染色體基因或結(jié)合到從該第二染色體基因轉(zhuǎn)錄的mRNA而抑制對(duì)細(xì)胞生長必需的該第二染色體基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
在一些實(shí)施方案中，染色體基因可通過更復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)抑制細(xì)胞生長。例如，染色體基因可編碼活化蛋白，該活化蛋白激活第二染色體基因的表達(dá)，該第二染色體基因接著編碼阻遏蛋白，該阻遏蛋白抑制編碼對(duì)細(xì)胞生長必需的蛋白的第三染色體基因的表達(dá)?；蛘?，第一染色體基因可編碼第二染色體基因的反義抑制物，該第二染色體基因接著編碼阻遏蛋白，該阻遏蛋白阻遏編碼抑制細(xì)胞生長的蛋白的第三染色體基因的表達(dá)。這類級(jí)聯(lián)可包括超過三個(gè)染色體基因。例如，它們可包括4、5、6、7或更多的染色體基因。在所有的這些級(jí)聯(lián)中，缺少對(duì)第一染色體基因抑制的質(zhì)粒導(dǎo)致第一染色體基因引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，該級(jí)聯(lián)反應(yīng)最終導(dǎo)致細(xì)胞生長的抑制。本發(fā)明提供適合的抑制細(xì)胞生長的染色體基因例子。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞優(yōu)選用于保持治療用途的質(zhì)粒。由此，質(zhì)粒優(yōu)選包括用于插入目的基因的克隆位點(diǎn)。優(yōu)選地，質(zhì)粒還包括目的基因。所述目的基因優(yōu)選可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中、優(yōu)選人細(xì)胞中表達(dá)。所述目的基因可表達(dá)用于治療用途的目的RNA或目的蛋白。本領(lǐng)域已知且本發(fā)明提供可包括在質(zhì)粒上的這類目的基因的例子。
通過結(jié)合到染色體基因自身并由此抑制該基因的轉(zhuǎn)錄，質(zhì)粒編碼的反義序列可抑制染色體基因的作用?；蛘撸|(zhì)粒編碼的反義序列可通過結(jié)合到轉(zhuǎn)錄自染色體基因的mRNA而抑制該染色體基因的作用。取決于染色體基因的性質(zhì)，與轉(zhuǎn)錄自染色體基因的mRNA的結(jié)合可抑制染色體基因的翻譯，或阻止該染色體基因編碼的反義序列結(jié)合到其靶點(diǎn)。
在本發(fā)明第一方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)序列可操作地連接到染色體基因。“可操作地連接”指調(diào)節(jié)序列在讀框內(nèi)連接到染色體基因，以便與染色體基因同時(shí)轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選地，調(diào)節(jié)序列可操作地連接染色體基因的上游。但是，調(diào)節(jié)區(qū)可備選地可操作地連接該染色體基因的下游。當(dāng)調(diào)節(jié)序列可操作地連接染色體基因的上游，其優(yōu)選插入在核糖體結(jié)合位點(diǎn)?；蛘?，調(diào)節(jié)序列可插入在核糖體結(jié)合位點(diǎn)的上游。染色體基因或可操作地連接到調(diào)節(jié)基因的染色體基因可由組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子所控制。優(yōu)選地，染色體基因或可操作地連接到調(diào)節(jié)基因的染色體基因由組成型啟動(dòng)子控制。
質(zhì)粒編碼的反義序列可通過結(jié)合調(diào)節(jié)序列或通過結(jié)合從調(diào)節(jié)序列轉(zhuǎn)錄的mRNA而抑制染色體基因的作用。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，由該質(zhì)粒編碼的反義序列優(yōu)選由質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)編碼。
所有的質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)都產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄的RNA。在一些情況下，從質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的RNA直接用在復(fù)制的調(diào)節(jié)中(例如質(zhì)粒R1、RK6、pT181、pMV158和pIP501)。在另一些情況下，對(duì)轉(zhuǎn)錄的RNA進(jìn)行翻譯以提供質(zhì)粒復(fù)制所需的蛋白質(zhì)(例如pSC101、pPS10、p15A、F、R100、R453、P1、RK2、RA1、RSF10110、pColIV-K30、ColE2、ColE3、Rst1、pLS20和pUB110)，參見Solar et al，1998，Microbiol and Molec.Biol.Rev.62434-363。
本發(fā)明包括轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述質(zhì)粒編碼的反義序列為從這些質(zhì)粒中的任一種的復(fù)制起點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的RNA。根據(jù)該實(shí)施方案，可操作地連接到染色體基因的調(diào)節(jié)序列或從調(diào)節(jié)序列轉(zhuǎn)錄的mRNA反義于從所述質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的RNA。該質(zhì)粒不存在時(shí)，轉(zhuǎn)錄和/或翻譯可操作地連接到染色體基因的調(diào)節(jié)序列，導(dǎo)致細(xì)胞生長的抑制。在質(zhì)粒存在時(shí)，從復(fù)制起點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的RNA抑制染色體基因的作用，由此允許細(xì)胞生長。
根據(jù)本發(fā)明的這方面的優(yōu)選實(shí)施方案，由所述質(zhì)粒編碼的反義序列為RNAI，并且染色體基因上游的調(diào)節(jié)序列編碼RNAII或其部分。可選擇地，由所述質(zhì)粒編碼的反義序列為RNAII，并且染色體基因上游的調(diào)節(jié)序列編碼RNAI或其部分。
RNAI和RNAII實(shí)際上為所有研究和商業(yè)用途的質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)編碼的兩個(gè)重疊的RNA轉(zhuǎn)錄本。RNAII引導(dǎo)質(zhì)粒DNA合成的起始，使自主質(zhì)粒復(fù)制在E.coli中發(fā)生。RNAI為RNAII的反義抑制物，并阻止過量的質(zhì)粒復(fù)制以保證質(zhì)粒拷貝數(shù)不超過宿主細(xì)胞可以支持的數(shù)目?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)該反義機(jī)制可用于改進(jìn)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中的質(zhì)粒保持。
根據(jù)該實(shí)施方案，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其包含，i)可操作地連接到染色體基因的RNAII編碼區(qū)或其部分，其中染色體基因抑制細(xì)胞生長；以及ii)包含RNAI編碼區(qū)或其部分的質(zhì)粒，其中從所述RNAI編碼區(qū)或其部分轉(zhuǎn)錄的RNAI結(jié)合到從所述RNAII編碼區(qū)或其部分轉(zhuǎn)錄的RNAII，抑制所述染色體基因的作用并由此允許細(xì)胞生長。
可操作地連接到所述染色體基因的RNAII編碼區(qū)或其部分轉(zhuǎn)錄成RNAII-染色體基因mRNA。在編碼RNAI的質(zhì)粒不存在時(shí)，細(xì)胞生長被抑制?？赏ㄟ^RNAII-染色體基因mRNA結(jié)合到細(xì)胞生長必需的第二染色體基因或從這種第二染色體基因轉(zhuǎn)錄的mRNA而抑制細(xì)胞生長?？蛇x擇地，可翻譯RNAII-染色體基因，抑制細(xì)胞生長，其由染色體基因編碼的毒性蛋白質(zhì)所引起或由該染色體基因編碼的阻遏蛋白抑制細(xì)胞生長必需的第二染色體基因所引起。當(dāng)所述質(zhì)粒存在時(shí)，從該質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄的RNAI結(jié)合RNAII-染色體基因mRNA中的RNAII，阻止所述染色體基因?qū)?xì)胞生長的抑制。
本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其包含，i)可操作地連接到染色體基因的RNAI編碼區(qū)或其部分，其中所述染色體基因抑制細(xì)胞生長；以及ii)包含RNAII編碼區(qū)或其部分的質(zhì)粒，其中從所述RNAII編碼區(qū)或其部分轉(zhuǎn)錄的RNAII結(jié)合到從所述RNAI編碼區(qū)或其部分轉(zhuǎn)錄的RNAI，抑制染色體基因的作用并由此允許細(xì)胞生長。
可操作地連接到所述染色體基因的RNAI編碼區(qū)或其部分轉(zhuǎn)錄成RNAI-染色體基因mRNA。在編碼RNAII的質(zhì)粒不存在時(shí)，細(xì)胞生長被抑制?？赏ㄟ^RNAI-染色體基因mRNA結(jié)合到細(xì)胞生長必需的第二染色體基因或從這種第二染色體基因轉(zhuǎn)錄的mRNA而抑制細(xì)胞生長。可選擇地，可翻譯所述的RNAI-染色體基因，抑制細(xì)胞生長，其由所述染色體基因編碼的毒性蛋白質(zhì)所引起或由該染色體基因編碼的阻遏蛋白抑制細(xì)胞生長必需的第二染色體基因所引起。當(dāng)所述質(zhì)粒存在時(shí)，從給質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄的RNAII結(jié)合RNAI-染色體基因mRNA中的RNAI，阻止染色體基因?qū)?xì)胞生長的抑制。
所有的質(zhì)粒都產(chǎn)生從復(fù)制起點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的RNA，并且可購得的質(zhì)粒的大多數(shù)含有包含RNAI編碼區(qū)和RNAII編碼區(qū)的復(fù)制起點(diǎn)。不同于EP0851932公開的系統(tǒng)，其中質(zhì)粒保持依賴于將lac操縱基因系統(tǒng)克隆進(jìn)所用質(zhì)粒中，而本發(fā)明能夠在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中保持任何可購得的包含復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒，并篩選保持這些質(zhì)粒的宿主細(xì)胞，無需將任何額外的克隆進(jìn)質(zhì)粒。這具有以下優(yōu)點(diǎn)，即質(zhì)粒尺寸減小了，增加了DNA疫苗和基因治療應(yīng)用中質(zhì)粒的有效劑量。非必需細(xì)菌DNA的去除還減小了對(duì)CpG二核苷酸免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。
此外，在無抗生素選擇的情況下可實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒保持。所述質(zhì)粒因此無需抗生素抗性基因的存在。該質(zhì)粒上無抗生素抗性基因具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)，特別是在質(zhì)?；蛸|(zhì)粒編碼的產(chǎn)物用于治療用途的情況下。首先，所述質(zhì)粒上無抗生素抗性基因消除了抗生素抗性基因轉(zhuǎn)移到環(huán)境中包括病原體在內(nèi)的有機(jī)體的危險(xiǎn)。它還防止了從具有用于質(zhì)粒篩選的殘余抗生素的細(xì)胞中分離的質(zhì)粒的污染，從而無需對(duì)質(zhì)粒測試殘余抗生素的存在并消除了抗生素抗性基因在患者細(xì)胞中引起損害作用的風(fēng)險(xiǎn)。選擇不依賴于抗生素抗性的事實(shí)避免了由于培養(yǎng)過程中抗生素降解而導(dǎo)致的缺少質(zhì)粒選擇壓力的問題。
用在本發(fā)明中的質(zhì)粒包括其中從復(fù)制起點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的RNA直接用在復(fù)制調(diào)節(jié)中的質(zhì)粒，例如質(zhì)粒R1、RK6、pT181、pMV158和pIP501，以及其中從復(fù)制起點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的RNA被翻譯以提供該質(zhì)粒復(fù)制所需的蛋白質(zhì)的質(zhì)粒，例如pSC101、pPS10、p15A、F、R100、R453、P1、RK2、RA1、RSF10110、pColIV-K30、ColE2、ColE3、Rst1、pLS20和pUB110。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的質(zhì)粒包括包含RNAI編碼區(qū)和RNAII編碼區(qū)的復(fù)制起點(diǎn)。包括包含RNAI編碼區(qū)和RNAII編碼區(qū)的復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒包括包含諸如colE1ori和pMB1ori的ColE1型ori的質(zhì)粒。
可操作地連接到抑制細(xì)胞生長的染色體基因的RNAII編碼區(qū)、RNAI編碼區(qū)或其部分可由組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制。優(yōu)選地，可操作地連接到抑制細(xì)胞生長的染色體基因的RNAII編碼區(qū)、RNAI編碼區(qū)或其部分可由組成型啟動(dòng)子控制。合適的組成型啟動(dòng)子在本領(lǐng)域?yàn)橐阎牟ɡ绨珽.coli啟動(dòng)子的-35和-10序列的啟動(dòng)子，如trc啟動(dòng)子。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了包括抑制細(xì)胞生長的染色體基因的細(xì)胞，所述染色體基因可操作地連接到位于該染色體基因上游的調(diào)節(jié)序列，其中所述調(diào)節(jié)序列包括反義于從質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的RNA的序列，或其中調(diào)節(jié)序列編碼反義于從質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的RNA的序列的RNA序列。該調(diào)節(jié)序列的性質(zhì)將取決于計(jì)劃用來轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的質(zhì)粒的特性。以上提供了適合的質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)的例子。如何設(shè)計(jì)反義于從這些復(fù)制起點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的RNA的調(diào)節(jié)序列對(duì)技術(shù)人員來說是顯而易見的。
優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)序列包括RNAI編碼區(qū)或其部分，或RNAII編碼區(qū)或其部分?？刹僮鞯剡B接到抑制細(xì)胞生長的染色體基因的RNAII編碼區(qū)、RNAI編碼區(qū)或其部分可由組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制。優(yōu)選地，可操作地連接到抑制細(xì)胞生長的染色體基因的RNAII編碼區(qū)、RNAI編碼區(qū)或其部分由組成型啟動(dòng)子控制。適合的組成型啟動(dòng)子在本領(lǐng)域?yàn)橐阎牟ɡ绨珽.coli啟動(dòng)子的-35和-10序列的啟動(dòng)子，如trc啟動(dòng)子。
根據(jù)本發(fā)明的該第二方面的宿主細(xì)胞可用包括RNAI編碼區(qū)和RNAII編碼區(qū)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明第一方面的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可位于體外培養(yǎng)基中。本發(fā)明提供適合的宿主細(xì)胞的例子。
本發(fā)明的第三方面，提供在體外宿主細(xì)胞中保持質(zhì)粒的方法，包括在足以允許如上所述的宿主細(xì)胞生長的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞的步驟。該方法能夠在無抗生素抗性情況下進(jìn)行質(zhì)粒保持和選擇，使其特別適用于產(chǎn)生用于治療用途的質(zhì)粒DNA或重組蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了產(chǎn)生質(zhì)粒DNA的方法，包括進(jìn)行本發(fā)明第三方面的方法并分離所述質(zhì)粒DNA。根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供了產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，包括根據(jù)本發(fā)明第三方面的方法培養(yǎng)包含編碼目的蛋白的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并從細(xì)胞中分離蛋白質(zhì)。
本發(fā)明轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞和宿主細(xì)胞自身可具有治療用途。根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供了根據(jù)本發(fā)明第一方面的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞在治療中的用途。
本發(fā)明的第七方面，提供藥物組合物，其包括根據(jù)本發(fā)明第一方面的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，連同藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或緩沖劑，諸如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的那些。根據(jù)這方面的一個(gè)實(shí)施方案，藥物組合物為疫苗組合物。除了賦形劑、稀釋劑或緩沖劑以外，該疫苗組合物可包括一種或多種佐劑。
本發(fā)明的第八方面，提供根據(jù)本發(fā)明第一方面的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞在制備藥物中的用途。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可用作基因遞送系統(tǒng)。例如，出于基因治療的目的，轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可用來遞送所述質(zhì)粒上的目的基因。所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞還可用來遞送所述質(zhì)粒上的目的基因，該目的基因的產(chǎn)物具有治療作用，如反義寡核苷酸，或遞送編碼具有治療作用的蛋白質(zhì)的目的基因。
可選擇地，所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可用來遞送免疫原。根據(jù)該實(shí)施方案，所述質(zhì)粒上的目的基因可編碼一種或多種引起免疫應(yīng)答的抗原。技術(shù)人員會(huì)理解編碼引起免疫應(yīng)答的抗原并且可包括在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒中的目的基因。
本發(fā)明的第九方面，提供治療方法，該方法包括對(duì)患者給予上述的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或包括它們的組合物。具體地，提供了向患者遞送目的基因的方法，包括對(duì)患者給予上述的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或包括它們的組合物。如上所述，所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中質(zhì)粒上的目的基因自身可用于基因治療目的，或目的基因的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物可具有治療特性。
本發(fā)明的第十方面，提供針對(duì)病原體引起的疾病來免疫患者的方法，包括對(duì)患者進(jìn)行上述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或包括它們的組合物的給藥，其中所述細(xì)胞內(nèi)所述質(zhì)粒上的目的基因編碼誘導(dǎo)針對(duì)病原體的免疫應(yīng)答的抗原。該抗原可在對(duì)患者進(jìn)行細(xì)胞給藥之前在細(xì)胞中表達(dá)，或者包含質(zhì)粒的細(xì)胞可給藥到患者，讓抗原在給藥后在患者內(nèi)表達(dá)，這取決于細(xì)胞和控制目的基因表達(dá)的啟動(dòng)子的性質(zhì)。優(yōu)選地，所述細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞，如上所述，并且所述目的基因功能性地連接到細(xì)菌啟動(dòng)子或真核啟動(dòng)子。
本發(fā)明的第十一方面，提供保持活體內(nèi)的宿主細(xì)胞中的質(zhì)粒的方法，包括對(duì)受體有機(jī)體提供本發(fā)明第一方面的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，受體有機(jī)體為哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，染色體基因優(yōu)選抑制體內(nèi)細(xì)胞生長，以便在受體有機(jī)體體內(nèi)只有保持該質(zhì)粒的宿主細(xì)胞能夠存活。例如，染色體基因可編碼第二染色體基因的阻遏蛋白，而該第二染色體基因?yàn)榧?xì)胞完整性所必需。
以下提供用在本發(fā)明中的合適的質(zhì)粒、目的borne基因、宿主細(xì)胞的例子和抑制細(xì)胞生長的染色體基因的例子，以及本發(fā)明轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的醫(yī)學(xué)應(yīng)用的信息。
染色體基因包括在本發(fā)明宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中的染色體基因可為抑制生長的任何基因。
●直接抑制生長的染色體基因優(yōu)選的直接抑制生長的染色體基因包括編碼毒素的基因。編碼可用在本發(fā)明中的毒素的基因的例子包括來自B.subtilis的sacB基因、E.coli F質(zhì)粒中ccdB編碼的CcdB、質(zhì)粒RK2中parD基因編碼的Kid蛋白質(zhì)、限制性內(nèi)切核酸酶基因和抗生素基因。
●通過抑制生長必需基因間接抑制生長的染色體基因優(yōu)選的間接抑制生長的染色體基因包括編碼蛋白阻遏物的染色體基因，該蛋白阻遏物抑制細(xì)胞生長必需的第二染色體基因，以及編碼反義序列的染色體基因，該反義序列抑制細(xì)胞生長必需的第二染色體基因。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二染色體基因?qū)?xì)胞生長為條件型必需的。
當(dāng)所述染色體基因編碼蛋白質(zhì)阻遏物時(shí)，所述第二染色體基因優(yōu)選可操作地連接到由該阻遏物方便地抑制的操縱基因和啟動(dòng)子。
例如，如果所述染色體基因編碼蛋白質(zhì)阻遏物L(fēng)acI，細(xì)胞生長必需的所述第二染色體基因優(yōu)選可操作地連接到lac操縱基因和啟動(dòng)子。E.coli lac阻遏物如“The Lactose Operon(乳糖操縱子)”，J.Beckwith，inEscherichia coli and Salmonella typhimurium，Eds.，J.L.Ingraham et al.，1987 Amer.Soc.Micro.，pp.1444-1452，和Dickson et al.，1975，Science18727-35所述。采用如下方式調(diào)節(jié)lac操縱子。在非誘導(dǎo)條件下(如在葡萄糖上生長)，LacI結(jié)合到lac操縱子的操縱基因，阻止b-半乳糖苷酶(LacZ)、乳糖通透酶(LacY)和轉(zhuǎn)乙酰酶(LacA)的轉(zhuǎn)錄。在誘導(dǎo)條件下(諸如在乳糖上生長或添加不可代謝的類似物IPTG)，阻遏物不再結(jié)合到操縱基因，并發(fā)生轉(zhuǎn)錄。該操縱子的表達(dá)可通過對(duì)b-半乳糖苷酶的分析容易地檢測。
本發(fā)明其它有用的阻遏物系統(tǒng)包括用在真核細(xì)胞中調(diào)節(jié)基因活性的tet阻遏物系統(tǒng)(Gossen et al.，(1994)Current Opinions in Biotechnology，5，516-520)。tet阻遏物系統(tǒng)已用在酵母、網(wǎng)柱菌屬(dictiostelium)、植物細(xì)胞和煙草植物中。本發(fā)明另一有用的阻遏物系統(tǒng)為ArgRNV阻遏物系統(tǒng)(Burke et al.，(1994)Mol.Microbiol.13，609-618)。ArgR阻遏物通常只在精氨酸存在時(shí)結(jié)合到其操縱基因。但是，突變的ArgRNV阻遏物在無精氨酸存在時(shí)結(jié)合到操縱基因并在精氨酸存在時(shí)仍保持結(jié)合，具有反式顯性(transdominant)作用。具有兩個(gè)對(duì)稱Arg盒的理想化的ArgR結(jié)合位點(diǎn)(操縱基因)可經(jīng)工程化進(jìn)入目的質(zhì)粒，以將ArgRNV從其表達(dá)由ArgR結(jié)合位點(diǎn)控制的必需基因中滴定出。
E.coli trp阻遏物也可用在本發(fā)明中(參見“The tryptophan Operon(色氨酸操縱子)”，Yanof sky and Crawford，in Escherichia coli and Salmonellatyphimurium，mEds.，J.L.Ingraham et al.，1987，Amer.Soc.Micro.，pp.1453-1472)。trp阻遏物以50拷貝/細(xì)胞存在，需要在發(fā)酵培養(yǎng)基中存在作為阻遏物結(jié)合的誘導(dǎo)物的色氨酸。
E.coli galR阻遏物可用在本發(fā)明中(參見“The Galactose Operon(半乳糖操縱子)”，S.Adhya，inEscherichia coli and Salmonella typhimurium，Eds.，J.L.Ingraham et al.，1987，Amer.Soc.Micro.，pp.1503-1512)。
E.coli araC阻遏物也可用在本發(fā)明中(參見“The L-ArabinoseOperon(阿拉伯糖操縱子)”，R.Schlief，In Escherichia coli and Salmonellatyphimurium，Eds.，J.L.Ingraham et al.，1987，Amer.Soc.Micro.，pp.1473-1481；Dunn et al.，1984，Proc.Nat.Aca.Sci.81；5017-5020)。araC阻遏物在阿拉伯糖存在時(shí)增加結(jié)合親和力。
最后，A阻遏物可用在本發(fā)明中(Introduction to Lambda Phages，inCurrent Protocols in Molecular Biology(分子生物學(xué)現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)操作中的λ噬菌體導(dǎo)論)，Eds.Ausubel，et al.，1994，Section III，Unit 1.9；Hochschild etal.，1986，Cell 47(5)；807-816)。
對(duì)細(xì)胞生長必需的第二染色體基因可以是編碼與細(xì)胞代謝物的生物合成有關(guān)的產(chǎn)物的基因、其產(chǎn)物涉及碳代謝的基因或編碼大分子的生物合成和調(diào)節(jié)的基因，例如對(duì)宿主細(xì)胞的DNA和/或RNA合成和復(fù)制功能必需的基因。
某些編碼涉及細(xì)胞組分供給，特別是細(xì)胞壁前體供給的酶的基因?yàn)樗拗骷?xì)胞生長所必需，并可用在本發(fā)明中。例如，細(xì)菌細(xì)胞壁含有內(nèi)消旋二氨基庚二酸(DAP)，不能合成此組分將導(dǎo)致細(xì)胞裂解。因此DAP生物合成途徑中的基因，即dapA、dapB、dapC、dapD和dapE基因可用作細(xì)胞生長必需的第二染色體基因，其由第一染色體基因所抑制。dapA和dapB已被克隆和測序，并且dapB可作為單順反子得到(Richaud et al.，J.Bacteriol.166297-300，1986；Bouvier et al.，J.Biol.Chem.25914829-14834，1984)。
涉及其它細(xì)胞壁組分生物合成，如D-丙氨酸生物合成的基因，也可用在本發(fā)明中(Walsh，1989，J.Biol.Chem.264(5)2393-2396)。
涉及脂肪酸生物合成的基因也可用在本發(fā)明中。一個(gè)例子為fabA，其編碼3-羥基癸?；?ACP脫水酶，負(fù)責(zé)在不飽和和飽和脂肪酸生物合成的分歧點(diǎn)向生長的脂肪酸鏈引入雙鍵(Cronan Jr.J.E.and Rock.C.O.(1987))。Biosynthesis of membrane lipids.In‘Escherichia coli andSalmonella typhimuriumcellular and molecular biology(膜脂的生物合成，大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞和分子生物學(xué))’.Neidhardt.F.C.(ed.)American Society of Microbiology，Washington D.C.)。除非提供不飽和脂肪酸，該酶以高濃度存在，且fabA突變體裂解。
可選擇地，對(duì)細(xì)胞生長必需的所述第二染色體基因可以是涉及碳源利用的基因。特別是，該第二染色體基因可包括乳糖操縱子基因，以便在乳糖作為唯一碳源的情況下，只有保持質(zhì)粒并且乳糖操縱子基因在其中表達(dá)的細(xì)胞才能存活。其它的改變對(duì)本領(lǐng)域人員來說是顯而易見的。
谷氨酸合成酶是諸如NSO骨髓瘤細(xì)胞系的真核細(xì)胞的必需基因(Bebbington et al.，(1992)Bio/Technology 10，169-175)并且當(dāng)宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞時(shí)被優(yōu)選為所述第二染色體基因。
所述第二染色體基因還可以是宿主細(xì)胞的編碼DNA和/或RNA合成或復(fù)制蛋白的必需基因。McMacken等提供了在諸如E.coli和Salmonella細(xì)菌中與這些必需功能有關(guān)的這類基因的例子(in Escherichia coli andSalmonella typhimurium，Cellular and Molecular Biology，Ed.Neidhardt etal.，Amer.Soc.Micro.，Wash.D.C.，1987，pp.564-612)，包括但不限于以下基因dnaA、dnaB、dnaC、ssb、dnaG、polC(dnaE)、dnaQ(mutD)dnaN、dnaZX、gyrA、gyrB、polA、lig、dnaT、rpoA、rpoB、rpoC和rpoD。
盡管并非優(yōu)選，所述第二染色體基因可為抗生素抗性基因，以便用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株，能夠在抗生素存在時(shí)生長。
對(duì)于用在醫(yī)學(xué)用途中的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞來說，取決于給藥途徑，局部環(huán)境的多種因子可施加選擇性壓力。當(dāng)?shù)挚惯@種壓力的能力連接至已鑒定的基因，則這可用作可選擇的標(biāo)記物。舉例而言，對(duì)于口服給藥的細(xì)胞，特別是細(xì)菌細(xì)胞而言，對(duì)胃內(nèi)容物的低pH的抗性構(gòu)成了顯著的選擇性優(yōu)勢。在表現(xiàn)出與此有關(guān)的基因中有鏈球菌突變體(streptococcusmutants)的uvrA基因(Hanna et al，2001 J Bacteriol 1835964)、E.coli的gadA、B和C基因(Castanie-Cornet and Foster，2001，Microbiology 147709)、鼠傷寒沙門氏菌的rpoS、fur、atp和atbR基因(Baik et al，1996Microbiology 1423195)、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)的lepA、Frasel、czcA、uvrA、atpF’和醛-酮還原酶基因(Bijlsma et al，2000，J Infect Dis1821566)以及編碼單核細(xì)胞增多性利斯特菌(Listeria monocytogene)的F0F1ATP酶的基因(Cotter et al 2000 Int J Food Microbiol 60137)。
賦予細(xì)胞內(nèi)存活性能(例如單核細(xì)胞增多性利斯特菌中的SvpA，Borezee et al，2001，Microbiology 1472913)或?qū)χT如溶酶體的特定細(xì)胞部位的抗性的基因也可用在適合的宿主細(xì)胞中。
優(yōu)選的間接抑制細(xì)胞生長的基因還包括編碼反義序列的染色體基因，該反義序列通過結(jié)合到第二染色體基因或結(jié)合到從該第二染色體基因轉(zhuǎn)錄的mRNA而抑制細(xì)胞生長必需的所述第二染色體基因。
反義序列為基本互補(bǔ)于其靶序列并能特異地與該靶序列雜交的序列。既然反義序列可通過直接結(jié)合到細(xì)胞生長必需的第二染色體基因或結(jié)合到從該第二染色體基因轉(zhuǎn)錄的mRNA而起作用，則所述靶序列可以為該第二染色體基因的編碼序列或非編碼序列或其部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)知道制備能與靶序列特異地雜交的反義序列的方法(參見，例如Cohen，J.S.，Trends in Pharm.Sci.，10，435(1989)，Okano，J.Neurochem.56，560(1991)；O′Connor，J.Neurochem 56，560(1991)；Lee et al.，NucleicAcids Res 6，3073(1979)；Cooney et al.，Science 241，456(1988)；Dervan etal.，Science 251，1360(1991))。
優(yōu)選地，所述反義序列在嚴(yán)緊條件下雜交到所述靶序列。高嚴(yán)緊雜交條件定義為在包含50％甲酰胺、5XSSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5x Denhardts溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml變性、剪切的鮭魚精DNA的溶液中42℃孵育過夜，隨后在0.1X SSC中在約65℃清洗濾器。
如上所述，通過引發(fā)最終導(dǎo)致細(xì)胞生長必需基因的抑制或抑制細(xì)胞生長基因的活化的涉及多個(gè)基因的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，第一染色體基因可抑制細(xì)胞生長。例如，所述第一染色體基因可編碼阻遏蛋白，該阻遏蛋白抑制編碼活化物的第二染色體基因，該活化物則會(huì)活化細(xì)胞生長必需的第三染色體基因?？蛇x擇地，所述第一染色體基因可編碼抑制所述第二染色體基因的阻遏蛋白，該第二染色體基因編碼反義序列，該反義序列另外抑制抑制細(xì)胞生長的第三染色體基因。這些僅僅是滿度本發(fā)明要求的很多基因級(jí)聯(lián)中的例子，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。
修飾的宿主細(xì)胞的產(chǎn)生抑制細(xì)胞生長的所述染色體基因可以是自然存在于宿主細(xì)胞基因組中的基因或可以是外源基因。
當(dāng)所述質(zhì)粒編碼的反義序列通過結(jié)合到可操作地連接到所述染色體基因的調(diào)節(jié)序列而抑制該染色體基因時(shí)，該染色體基因可以是可操作地連接到外源調(diào)節(jié)基因的自然產(chǎn)生的基因。例如，可移除通?？刂谱匀划a(chǎn)生的毒素基因的表達(dá)的序列，而將該毒素基因可操作地連接到由組成型啟動(dòng)子控制的外源RNAI編碼序列上。類似地，可移除通常控制自然產(chǎn)生的阻遏蛋白表達(dá)的序列，而將該阻遏蛋白基因可操作地連接到由組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制的外源RNAII編碼序列上。因此，在本文的實(shí)施例2中，自然產(chǎn)生的阻遏物基因lacI可操作地連接到RNAII編碼區(qū)。
可選擇地，所述調(diào)節(jié)序列和染色體基因可以都是外源的，當(dāng)該調(diào)節(jié)序列為RNAI或RNAII編碼序列且該染色體基因編碼抑制細(xì)胞生長必需的第二染色體基因的反義序列時(shí)，就是這種情況。
如果存在細(xì)胞生長必需的第二染色體基因，它也可以是自然產(chǎn)生的基因或外源基因。
抑制細(xì)胞生長的染色體基因可以多拷貝存在于基因組中，尤其是當(dāng)宿主細(xì)胞為真核宿主細(xì)胞時(shí)。
如何操作細(xì)胞以產(chǎn)生適用于本發(fā)明的宿主細(xì)胞對(duì)本領(lǐng)域人員來說是顯而易見的。
宿主細(xì)胞本發(fā)明適用于所有的細(xì)胞類型，包括如哺乳動(dòng)物的動(dòng)物細(xì)胞以及昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌(如酵母)、細(xì)菌和古細(xì)菌。
當(dāng)所述宿主細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，它可以是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞或革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞。當(dāng)所述細(xì)胞為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞，它優(yōu)選為E.coli(大腸桿菌)細(xì)胞或Salmonella(沙門氏菌)細(xì)胞。當(dāng)所述細(xì)胞為革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞，它優(yōu)選為Bacillus(桿菌)，Streptomyces(鏈球菌)，Lactobacillus(乳桿菌)或Lactococcus(乳球菌)細(xì)胞。
特別有用的是減毒的宿主細(xì)胞，它們經(jīng)減毒以便可接受地?zé)o副作用從而在受體有機(jī)體中自由地用于治療用途。依賴于細(xì)胞的特殊性，它可適用于獸醫(yī)或人的治療用途。
可得到的減毒細(xì)菌中有以下鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)包括菌株SL3261(aroA突變體，Titball et al，1997，Infection and Immunity 651926，Titball et al，1995，Infection and Immunity 63563)、VNP20009(purl和msbB突變體，Toso etal，2002，J Clin Oncol 20142)；傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)包括菌株CVD 908-htrA、x4073、x4632、Ty800、CVD 909和CVD 915(Galen et al，1999，Infect.Immun.676424-6433；Morona et al，1991，Gene 107139-144；Tacket et al，1997，Infect.Immun.653381-3385；Garmory et al，2002，F(xiàn)EMS MicrobiologyReviews 26339-353)；Salmonela gallinarum包括菌株9R(用于禽類接種，F(xiàn)eberwee et al，2001，Avian Dis 451024)；大腸桿菌(Escherichia coli)包括aroA、cnfl和OPM突變體(Rippere-Lampe et al，2001，Infect Immunol 693954)；
弗氏志賀菌(Shigella flexneri)包括菌株S.flexneri 2a guaBA(Altboumet al，2001，Infect Immunol 693150)；霍亂弧菌(Vibrio cholerae)包括菌株P(guān)eru2(Ryan et al，2000，Infect.Immun.68221-226)；單核細(xì)胞增多性利斯特菌(Listeria monocytogenes)包括PrfA和SvpA突變體(Sheehan et al，1996，Mol Microbiol 20785；Borezee et al，2001，Microbiology 7472913)；流產(chǎn)布魯桿菌(Brucella abortus)包括菌株RB51(Vemulapalli et al，2000，Infect Immunol 683290)；牛結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium bovis)包括菌株Calmette-Guerin(BCG)；以及結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)。
本發(fā)明有用的質(zhì)粒攜帶基因本發(fā)明轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒上攜帶的目的基因可以是任何基因。該基因可以是遞送到受體有機(jī)體時(shí)產(chǎn)生治療作用的基因。例如，可能是基因治療目的所需的遞送基因到受體有機(jī)體。
可選擇地，可能需要遞送基因到受體有機(jī)體，是因?yàn)樵摶虻霓D(zhuǎn)錄產(chǎn)物或轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物具有治療作用。例如，目的基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以是反義寡核苷酸，或者該目的基因可編碼具有治療作用的抗原。具體地，目的基因可編碼在受體有機(jī)體中引起免疫應(yīng)答的一種或多種抗原。在受體有機(jī)體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的可包括在質(zhì)粒中的目的基因的例子為caf操縱子的cafl、caflA和caflM基因。
如果需要目的基因被轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄和翻譯，優(yōu)選將它功能性地結(jié)合到啟動(dòng)子。優(yōu)選地，該啟動(dòng)子為真核啟動(dòng)子或細(xì)菌啟動(dòng)子。在給藥到受體有機(jī)體之前或者僅在給藥到受體有機(jī)體之后的宿主細(xì)胞中，所述功能性地結(jié)合到目的基因的啟動(dòng)子的選擇和宿主細(xì)胞的選擇決定了目的基因是轉(zhuǎn)錄還是轉(zhuǎn)錄和翻譯。
在一些情況下，可能需要遞送已經(jīng)表達(dá)了目的基因的宿主細(xì)胞，這時(shí)，可選擇功能性地結(jié)合到目的基因的啟動(dòng)子以便它在宿主細(xì)胞中起作用并促進(jìn)宿主細(xì)胞中所述目的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。例如，當(dāng)所述宿主細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞，則這種情況下功能性地結(jié)合到目的基因的啟動(dòng)子可為細(xì)菌啟動(dòng)子。
在其它情況下，可能需要遞送包括包含目的基因的質(zhì)粒的宿主細(xì)胞到受體有機(jī)體，但延遲目的基因的表達(dá)，直到將細(xì)胞遞送到受體有機(jī)體。例如，當(dāng)所述宿主細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞，則這種情況下所述功能性地結(jié)合到目的基因的啟動(dòng)子可為真核啟動(dòng)子，其不會(huì)在宿主細(xì)胞中促進(jìn)目的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，而是在遞送到受體有機(jī)體后進(jìn)行。
本發(fā)明有用的疫苗接種方法應(yīng)理解，采用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的疫苗接種可通過多種給藥途徑中的任何一種進(jìn)行。對(duì)于Mycobacterium，例如通常的途徑為真皮內(nèi)或皮下注射。對(duì)于腸道細(xì)菌如Salmonella、Shigella或E.coli，優(yōu)選口服給藥(尤其是抗酸突變體)或經(jīng)直腸給藥。在一些情況下，經(jīng)粘膜、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥可以為優(yōu)選的。
其它體內(nèi)應(yīng)用的給藥應(yīng)理解，可以采用多種方法用于非疫苗接種用途的給藥。
除了用于疫苗接種的經(jīng)腸和腸道外給藥途徑，非疫苗接種用途可能需要其它的程序。其中有采用可植入的滲透性容器，在該容器中包含本發(fā)明的細(xì)胞。
附圖簡述

圖1pUC18 ori圖譜，顯示RNAI和RNAII轉(zhuǎn)錄本的位置。RNAII引導(dǎo)DNA合成的起始，RNAI為RNAII的反義抑制物。
圖2用在阻遏物oriSELECT中的宿主細(xì)胞基因組的例子。該宿主細(xì)胞基因組包含連接到阻遏物基因順反子的RNAII編碼區(qū)，二者由組成型RNAII啟動(dòng)子控制。該基因組還包括由可誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制的必需基因。在質(zhì)粒不存在時(shí)，表達(dá)該阻遏蛋白并阻遏必需基因，抑制細(xì)胞生長。質(zhì)粒產(chǎn)生的RNAI結(jié)合到RANII-阻遏物mRNA融合的RNAII轉(zhuǎn)錄本阻斷所述阻遏蛋白的翻譯，允許必需基因的表達(dá)和細(xì)胞生長。
圖3用在毒素基因oriSELECT中的宿主細(xì)胞基因組的例子。該基因組包含置于RNAII下游的編碼枯草桿菌(bacillus subtilis)果聚糖生成酶的sacB基因(Link et al，1997 J.Bacteriol.1796228-6237)。在蔗糖存在時(shí)，sacB合成毒性產(chǎn)物，該細(xì)胞在蔗糖存在時(shí)被殺滅，除非存在表達(dá)阻斷毒性基因mRNA翻譯的RNAI的質(zhì)粒。
圖4用在反義oriSELECT中的宿主細(xì)胞基因組的例子。宿主細(xì)胞基因組包含細(xì)胞生長必需的基因和連接到反義于該細(xì)胞生長必需基因的基因的RNAII編碼區(qū)。質(zhì)粒不存在時(shí)，該反義RNA將結(jié)合到必須基因mRNA，由此阻止必需基因的翻譯和細(xì)胞生長。當(dāng)細(xì)胞用提供RNAI的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，RNAI將結(jié)合到所述的RNAII-反義RNA，阻止其結(jié)合到必須基因mRNA，允許細(xì)胞生長。
圖5通過PCR從pUC18擴(kuò)增RNAII的5’端。顯示了RNAI和RNAII的轉(zhuǎn)錄本的位置，以及在RNAII 5’端插入編碼阻遏物lacI的基因的上游之前，用于擴(kuò)增RNAII 5’端引物的位置，來將該基因用于插進(jìn)用在阻遏物oriSELECT中的宿主細(xì)胞基因組中。
圖6利用PCR從DH1 ORT菌株的基因組DNA擴(kuò)增lacI的5’端。顯示了用于該擴(kuò)增的引物5lacI和3lacI的位置。
圖7通過結(jié)合利用圖5中的引物產(chǎn)生的RNAII擴(kuò)增產(chǎn)物和利用圖6中的引物產(chǎn)生的lacI擴(kuò)增產(chǎn)物而形成的產(chǎn)物。顯示了用在擴(kuò)增組合產(chǎn)物中的引物位置。
圖8用在阻遏物oriSELECT中的宿主細(xì)胞基因組的另一例子。該宿主細(xì)胞的基因組含有連接到阻遏物基因順反子(lacI)的RNAII編碼區(qū)，二者由基于E.coli trc啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)的-10和-35序列和間隔(spacing)的組成型啟動(dòng)子控制。該基因組還包含由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制的必需基因(未示出)。無質(zhì)粒時(shí)，該阻遏蛋白被表達(dá)并阻遏必需基因，抑制細(xì)胞生長。質(zhì)粒產(chǎn)生的RNAI結(jié)合到RANII-阻遏物mRNA融合的RANII轉(zhuǎn)錄本而阻斷所述阻遏蛋白的翻譯，允許必需基因的表達(dá)和細(xì)胞生長。
現(xiàn)在將通過與采用質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)作為選擇標(biāo)記物的質(zhì)粒保持系統(tǒng)有關(guān)的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做更加詳細(xì)地說明。應(yīng)理解的是，可對(duì)實(shí)施例描述的系統(tǒng)作出修改。
實(shí)施例本發(fā)明僅采用復(fù)制起點(diǎn)(pMB1或ColEI ori)作為選擇性標(biāo)記物而使質(zhì)粒的選擇和保持成為可能，該選擇性標(biāo)記本文記為oriSELECT。如圖1所示，這些ColEI相容oris編碼兩重疊的RNA轉(zhuǎn)錄本，RNAII引導(dǎo)質(zhì)粒DNA合成的起始，RNAI為RNAII的反義抑制物(Scott et al，1984，Microbiol.Rev.481-23；Chan et al，1985 J.Biol.Chem.2608925-8935)。實(shí)際上所有的研究或商用質(zhì)粒都依賴于這些oris在E.coli中自主復(fù)制。
本發(fā)明可包括構(gòu)建遺傳上修飾的E.coli菌株，其中該基因組被修飾以含有連接到操縱子(operon)中的抑制性元件的編碼RNAII的區(qū)。質(zhì)粒產(chǎn)生的RNAI結(jié)合到RANII-mRNA融合阻止抑制性基因mRNA的翻譯，由此允許細(xì)胞存活和生長。這種質(zhì)粒保持系統(tǒng)的三種建議的機(jī)制描述如下實(shí)施例1阻遏物oriSELECT如圖2所示，用在阻遏物oriSELECT中的宿主細(xì)胞基因組包含連接到阻遏物基因順反子的RNAII編碼區(qū)，二者由組成型RNAII啟動(dòng)子控制。連接到阻遏物順反子的RNAII編碼區(qū)也可由備選的組成型啟動(dòng)子控制，例如基于Trc啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)的E.coli-10和-35序列以及間隔的啟動(dòng)子，如圖8所示。該宿主細(xì)胞還可包含由可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制的細(xì)胞生長必需基因(圖8中未示出)。
無質(zhì)粒時(shí)，該阻遏蛋白被表達(dá)并通過結(jié)合到控制必需基因的操縱基因/啟動(dòng)子而阻遏必需基因，抑制細(xì)胞生長。質(zhì)粒產(chǎn)生的RNAI結(jié)合到RANII-阻遏物mRNA融合的RANII轉(zhuǎn)錄本而阻斷該阻遏物的翻譯，允許必需基因的表達(dá)，從而允許細(xì)胞生長。
為了構(gòu)建用在Repressor oriSELECT的這種宿主細(xì)胞，從細(xì)菌菌株的染色體刪除必需基因，例如dapD(Richaud et al，1984，J.Biol.Chem.25914824-14828)或fabA(Cronan et al，1987，Biosynthesis of membranelipids(膜脂的生物合成).In′Escherichia coli and Salmonella typhimuriumcellular and molecular biology′，Neidhardt，F(xiàn).C.(ed.).American Society ofMicrobiology，Washington D.C.)，將它們置于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(例如Plac)的控制下并插回到該染色體中。從該染色體中刪除編碼與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有關(guān)的阻遏物的基因，這種情況下為lacI。這種阻遏物基因置于操縱子中RNAII部分的編碼區(qū)的下游，讓組成型RNAII啟動(dòng)子(或任何其它組成型啟動(dòng)子，例如基于Trc啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)的E.coli-10和-35序列以及間隔的啟動(dòng)子)驅(qū)動(dòng)二者的轉(zhuǎn)錄。RNAII編碼區(qū)的3’端被修飾以結(jié)合入阻遏物的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，以便它是重疊的并被RNAI所阻斷。有時(shí)，可通過增加RNAII編碼區(qū)的3’端和lac核糖體結(jié)合位點(diǎn)的距離來增強(qiáng)LacI阻遏蛋白的表達(dá)。將該構(gòu)建體插入到染色體中。
現(xiàn)在該細(xì)胞將組成型地產(chǎn)生阻遏物。該阻遏蛋白會(huì)結(jié)合到控制必需基因的染色體操縱基因，由此阻止細(xì)胞生長。當(dāng)細(xì)胞用包含ColEI-相容ori的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，RNAI將結(jié)合RNAII并阻止下游阻遏物基因的翻譯，允許細(xì)胞生長。
如果染色體必需基因具有其自身相關(guān)的阻遏物，該阻遏物(減弱啟動(dòng)子(minus its promoter))可被工程化進(jìn)入RNAII下游操縱子中，并將該操縱子插進(jìn)細(xì)菌染色體以置換野生型阻遏物。
必需基因可以為條件型必需外源基因(例如抗生素抗性基因)。
如果必需外源基因?yàn)檎T導(dǎo)型并具有其自身相關(guān)的外源阻遏物，該阻遏物基因可被工程化進(jìn)入RNAII下游操縱子中并將該操縱子插進(jìn)細(xì)菌染色體。
實(shí)施例2毒素基因oriSELECT如圖3所示，用在毒素基因oriSELECT的宿主細(xì)胞的基因組包含置于RNAII下游的編碼枯草桿菌果聚糖生成酶的sacB基因(Link et al，1997J.Bacteriol.1796228-6237)。在蔗糖存在時(shí)，sacB合成毒性產(chǎn)物，細(xì)胞被殺滅，除非介入表達(dá)RNAI的質(zhì)粒。另一由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的毒性基因可融合到RNAII編碼區(qū)替代sacB。
利用由RNAII編碼區(qū)和編碼sacB的下游基因組成的操縱子來工程化構(gòu)建體。RNAII編碼區(qū)的3’端被修飾以并入sacB的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。組成型RNAII啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)。當(dāng)將其被插進(jìn)細(xì)菌染色體，細(xì)胞可在物無蔗糖時(shí)生長，但當(dāng)添加蔗糖時(shí)，產(chǎn)生毒素，細(xì)胞死亡。當(dāng)細(xì)胞用包含ColEI-相容ori的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，RNAI將結(jié)合RNAII-毒素基因mRNA并阻斷翻譯，允許細(xì)胞在蔗糖存在時(shí)生長。
溫度敏感或化學(xué)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子可用于驅(qū)動(dòng)該RNAII-毒素基因融合的表達(dá)。在允許溫度或在誘導(dǎo)物存在時(shí)，細(xì)胞被殺滅，除非引進(jìn)表達(dá)RNAI的質(zhì)粒。
實(shí)施例3雙反義oriSELECT如圖4所示，在雙反義oriSELECT中，宿主細(xì)胞基因組包含細(xì)胞生長必需的基因和連接到反義于細(xì)胞生長必需基因的基因的RNAII編碼區(qū)。
將必需基因(例如dapD或fabA)的反義版本置于編碼RNAII區(qū)的操縱子下游，讓組成型RNAII啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)二者的轉(zhuǎn)錄。RNAI編碼區(qū)的3’端被修飾以結(jié)合入必需基因反義轉(zhuǎn)錄本部分，以便它被RNAII部分交疊。將該構(gòu)建體插進(jìn)細(xì)菌染色體。
現(xiàn)在該細(xì)胞將組成型地產(chǎn)生RNAII和反義RNA。該反義RNA將結(jié)合到所述必需基因mRNA。由此阻止必需基因的翻譯和細(xì)胞生長。
當(dāng)細(xì)胞用包含ColEI-相容ori的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，RNAI將結(jié)合RNAII-反義RNA并阻止其結(jié)合到必需基因mRNA，允許細(xì)胞生長。
實(shí)施例4阻遏物oriSELECT菌株的產(chǎn)生可通過將RNAII-lacI操縱子整合進(jìn)(并由此置換)染色體lacI阻遏物基因而將ORT菌株DH1lackan(Willians et al，1998)、DH1lacdapD和DH1lacP2dapD(Cranenburgh et al，2001，Nucleic Acid Res.29e26)轉(zhuǎn)變成oriSELECT菌株?；趐KO3整合系統(tǒng)的單質(zhì)粒結(jié)構(gòu)(Link et al，1997 J.Bacteriol.1796228-6237)用于在所有ORT菌株中用RNAII-lacI置換野生型lacI，描述如下。
1.通過PCR和克隆擴(kuò)增圍繞lacI的染色體lac操縱子部分；2.由插入lacI阻遏物基因上游的RNAII編碼區(qū)構(gòu)成的工程化的操縱子，置換其天然啟動(dòng)子。應(yīng)定位該LacI核糖體結(jié)合位點(diǎn)，以便在mRNA上，它被反義RNAII的結(jié)合所阻斷。
3.將RNAII-lacI操縱子基因座克隆進(jìn)整合質(zhì)粒pKO3。
4.將RNAII-lacI操縱子基因座整合進(jìn)DH1lackan、DH1lacdapD和DH1lacP2dap D的野生型lac操縱子基因座以產(chǎn)生oriSELECT菌株。
5.利用具有ColEI/pMB1ori和無lacO序列(以避免ORT選擇)的質(zhì)粒測試質(zhì)粒在這些菌株中的選擇性和保持。
以下更加詳細(xì)地描述構(gòu)建該oriSELECT菌株所需的克隆步驟剪接PCR產(chǎn)生RNAII-lacI融合1.采用下列引物通過PCR從pUC18擴(kuò)增RNAII5’端的部分(產(chǎn)物＝176bp)，如圖5所示。
5RNAIIGAATGCATCAAAGGATCTTCTTGAGA(26nt)3RNAIIACATTCACCACCGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCA(42nt)2.采用下列引物通過PCR從DH1 gDNA擴(kuò)增lacI5’端部分(產(chǎn)物＝597bp)，如圖6所示5lacIGATACCAAATACGGTGGTGAATGTGAAACCAGTAACGTTATA(42nt)3lacIACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACA(25nt)3.在單一PCR中組合兩PCR產(chǎn)物并采用5RNAII和3lacI引物擴(kuò)增以產(chǎn)生749bp RNAII-lacI基因融合PCR產(chǎn)物(5RNAII和3lacI引物之間的區(qū)域)，如圖7所示。
4.利用NsiI和ApaI剪切剪接的PCR產(chǎn)物以產(chǎn)生用于克隆進(jìn)乳糖操縱子替換lacI啟動(dòng)子和5’端的片段。
克隆乳糖操縱子部分并插入RNAII-lacI1.利用以下引物從DH1 gDNA擴(kuò)增lac操縱子。
5LOCTCTTGCGCCGGGTCGACATACCCC(25nt)3LOTAAGTCGACCACGGGTTGCCGTTTT(25nt)
引物5LO摻入天然SalI位點(diǎn)(帶下劃線的)，而3LO引入一個(gè)單核苷酸改變(黑體)?？侾CR產(chǎn)物大小＝5803bp。
2.利用SalI剪切PCR產(chǎn)物并克隆進(jìn)同樣用SalI剪切的pUC18。
3.利用NsiI和ApaI剪切該質(zhì)粒并克隆進(jìn)步驟4的片段中，用RNAII-lacI基因融合置換lacI的啟動(dòng)子和5’端。
4.用NsiI剪切插入物并連接進(jìn)同樣用NsiI剪切的pKO3recA。
5.整合進(jìn)DH1lacdapD、DH1lacP2dapD和DH1lackan以產(chǎn)生oriSELECT菌株。
6.利用具有pMB1復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒測試質(zhì)粒選擇和保持。
當(dāng)RNAII組成型啟動(dòng)子用于驅(qū)動(dòng)RNAII-基因融合的表達(dá)時(shí)，如果需要的話，其它任何組成型啟動(dòng)子可被替換。RNAII啟動(dòng)子用在這些實(shí)施例中，因它已經(jīng)存在。備選地優(yōu)選組成型啟動(dòng)子為基于Trc啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)的E.coli-10和-35序列以及間隔的啟動(dòng)子。這種E.coli啟動(dòng)子比RNAII啟動(dòng)子更陌生，因此可在希望產(chǎn)生增加量的lacI阻遏蛋白時(shí)采用，由此保證在無質(zhì)粒時(shí)阻止生長。
可通過增加RNAII編碼區(qū)的3’端和lacI核糖體結(jié)合位點(diǎn)的距離來增強(qiáng)lacI阻遏蛋白的表達(dá)。
還應(yīng)理解的是插入基因盒的備選方法可用于代替上述的pKO3方法。例如，λRed重組系統(tǒng)可用于以線性PCR產(chǎn)物來整合基因盒(Murphy，1998，J.Bacteriol.，1802063-2071)。
這些實(shí)施例基于RNAII-基因融合表達(dá)盒，用RNAI起反義抑制物的功能。這是因?yàn)樵诤匈|(zhì)粒的細(xì)胞中，存在的RNAI 5倍過量于RNAII(Liang et al，1999，29219-37)。由于可得到摩爾數(shù)過量的RNAI，由此RNAI可作為更加有效的抑制物。但是，可能有這樣的情況，即采用RNAI構(gòu)建基因融合更加有利，而不是RNAII。這時(shí)，來自質(zhì)粒的RNAII轉(zhuǎn)錄本將起反義抑制物的作用。
在oriSELECT菌株中，表達(dá)來自ColEI/pMB1ori的Rom蛋白的基因的染色體整合可能是必需的，因?yàn)檫@將增強(qiáng)RNAI與RNAII的結(jié)合親和力(Chan et al，1984 J.Biol.Chem.2608925-8935)。
權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其包含i)抑制細(xì)胞生長的染色體基因；以及ii)編碼反義序列的質(zhì)粒，其中由所述質(zhì)粒編碼的所述反義序列抑制所述染色體基因的作用，由此允許細(xì)胞生長。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述質(zhì)粒包括插入目的基因的克隆位點(diǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述質(zhì)粒還包括目的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中由所述質(zhì)粒編碼的反義序列通過結(jié)合到所述染色體基因而抑制所述染色體基因的作用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中由所述質(zhì)粒編碼的反義序列通過結(jié)合到從所述染色體基因轉(zhuǎn)錄的mRNA而抑制所述染色體基因的作用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中調(diào)節(jié)序列可操作地連接到所述染色體基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中由所述質(zhì)粒編碼的反義序列通過結(jié)合到所述調(diào)節(jié)序列而抑制所述染色體基因的作用。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中由所述質(zhì)粒編碼的反義序列通過結(jié)合到從所述調(diào)節(jié)序列轉(zhuǎn)錄的mRNA而抑制所述染色體基因的作用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中由所述質(zhì)粒編碼的反義序列由所述質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)編碼。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中由所述質(zhì)粒編碼的反義序列為RNAI或其部分，并且所述調(diào)節(jié)序列可操作地連接到編碼RNAII或其部分的染色體基因。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中由所述質(zhì)粒編碼的反義序列為RNAII或其部分，并且所述調(diào)節(jié)序列可操作地連接到編碼RNAI或其部分的染色體基因。
12.包含抑制細(xì)胞生長的染色體基因的宿主細(xì)胞，所述染色體基因可操作地連接位于所述染色體基因上游的調(diào)節(jié)序列，其中所述的調(diào)節(jié)序列為RNAI基因或其部分，或RNAII基因或其部分。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或權(quán)利要求12所述的宿主細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞在體外培養(yǎng)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或權(quán)利要求12和13所述的宿主細(xì)胞，其為原核細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞，其為細(xì)菌細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為E.coli細(xì)胞或Salmonella細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞為革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞，其中細(xì)胞為Bacillus細(xì)胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求15-19任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞，其為減毒細(xì)胞。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為真核細(xì)胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為如酵母的真菌。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為植物細(xì)胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為如哺乳動(dòng)物細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-24任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞，其中所述染色體基因?yàn)槎舅鼗颉?br> 26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞，其中所述毒素基因?yàn)閟acB。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-24任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞，其中所述染色體基因編碼阻遏蛋白，所述阻遏蛋白抑制細(xì)胞生長必需的第二染色體基因。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞，其中所述第二染色體基因?qū)?xì)胞生長為條件型必需。
29.根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞，其中所述染色體基因編碼阻遏物lacI，且所述第二染色體基因可操作地連接到lac操縱子和啟動(dòng)子。
30.根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞，其中所述染色體基因?yàn)閐apD或fabA。
31.根據(jù)權(quán)利要求1-24任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞，其中所述的染色體基因編碼反義序列，所述反義序列抑制細(xì)胞生長必需的第二染色體基因。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞，其中由所述染色體基因編碼的所述反義序列通過結(jié)合到所述染色體基因而抑制第二染色體基因的表達(dá)。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞，其中由所述染色體基因編碼的所述反義序列通過結(jié)合到從所述第二染色體基因轉(zhuǎn)錄的mRNA而抑制第二染色體基因的表達(dá)。
34.根據(jù)權(quán)利要求31-33任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞，其中所述第二染色體基因?qū)?xì)胞生長為條件型必需。
35.根據(jù)權(quán)利要求31-33任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞，其中所述第二染色體基因?yàn)閐apD或fabA。
36.根據(jù)權(quán)利要求1-35任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞，其中所述染色體基因或調(diào)節(jié)序列-染色體基因融合由組成型啟動(dòng)子控制。
37.根據(jù)權(quán)利要求1-35任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞，其中所述染色體基因或調(diào)節(jié)序列-染色體基因融合由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制。
38.在體外宿主細(xì)胞中保持質(zhì)粒的方法，包括在足以允許所述細(xì)胞生長的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求1-11或13-37任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的步驟。
39.產(chǎn)生質(zhì)粒DNA的方法，包括根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞并分離所述質(zhì)粒DNA。
40.產(chǎn)生重組蛋白的方法，包括根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法培養(yǎng)包含編碼目的蛋白的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞并從所述細(xì)胞分離所述蛋白。
41.藥物組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求1-37任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞連同藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或緩沖劑。
42.權(quán)利要求1-37任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞在治療中的用途。
43.權(quán)利要求1-37任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞在制備用于基因遞送或蛋白遞送的藥物中的應(yīng)用。
44.向患者遞送目的基因的方法，包括對(duì)所述患者進(jìn)行權(quán)利要求3-11或13-37任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的給藥。
45.在受體有機(jī)體中保持質(zhì)粒的方法，包括向所述有機(jī)體介入權(quán)利要求1-11或13-37任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞內(nèi)的所述染色體基因?yàn)榧?xì)胞在體內(nèi)生長所必需。
全文摘要
本發(fā)明涉及質(zhì)粒的穩(wěn)定保持系統(tǒng)、用于該系統(tǒng)的宿主細(xì)胞以及采用該系統(tǒng)獲得在醫(yī)學(xué)應(yīng)用上有用的質(zhì)粒的方法。具體而言，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其包含i)抑制細(xì)胞生長的染色體基因；以及ii)編碼反義序列的質(zhì)粒，其中由所述質(zhì)粒編碼的所述反義序列抑制所述染色體基因的作用，由此允許細(xì)胞生長，并提供體內(nèi)宿主細(xì)胞中質(zhì)粒的穩(wěn)定保持方法。
文檔編號(hào)A61K35/74GK1902317SQ200480040185
公開日2007年1月24日 申請(qǐng)日期2004年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月20日
發(fā)明者羅基·馬爾科·科瑞安恩波格 申請(qǐng)人:科步爾生物制劑有限公司