專利名稱：含雄株生殖系統(tǒng)的組織的藥用產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥用產(chǎn)品及其生產(chǎn)方法。更具體地，本發(fā)明涉及含花粉粒的藥用產(chǎn)品，該花粉粒具有通過對生成它的植物進(jìn)行遺傳修飾而改變了的蛋白組成。本發(fā)明的藥用產(chǎn)品的生產(chǎn)方法包括培育花粉粒具有改變的分子組成的遺傳修飾植物，將它們用于治療過敏、自身免疫疾病，以及真核生物疫苗接種和應(yīng)用于體外診斷。
背景技術(shù)：
近年來，在生物技術(shù)領(lǐng)域，獲得與經(jīng)濟(jì)相關(guān)的化合物的方法正發(fā)生著顯著變化。直到最近，諸如傳統(tǒng)的工業(yè)發(fā)酵是生產(chǎn)以經(jīng)濟(jì)利益為目的的多肽、酶、抗生素和其它物質(zhì)的主要技術(shù)選擇。同時，由于在發(fā)酵方法中所涉及的生物的微生物學(xué)、生物化學(xué)和遺傳學(xué)的知識在逐漸增加，生產(chǎn)技術(shù)同樣也得以改變和改進(jìn)。在這個背景下分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展非常顯著除了為理解許多所研究的物種的生物化學(xué)、遺傳和進(jìn)化機(jī)理而提供工具外，分子生物學(xué)還為物質(zhì)的工業(yè)生產(chǎn)進(jìn)一步開發(fā)了許多選擇方案，這是由于不同生物的特征能組合在一起的結(jié)果。
當(dāng)今市場在人和/或動物保健方面的產(chǎn)品及其生產(chǎn)方法上有著很大需求，同時在該領(lǐng)域中對技術(shù)開發(fā)的興趣也逐漸增加。從工業(yè)技術(shù)的立場來看，許多因素被認(rèn)為是限制性的或技術(shù)上的“瓶頸”。在特別具有經(jīng)濟(jì)價值的物質(zhì)的生產(chǎn)中尤為相關(guān)的是在純化中所涉及的費用，該純化一般要求一系列復(fù)雜而且昂貴的步驟。如若考慮到所有涉及到的階段-從產(chǎn)品概念到其上市-確定新的治療產(chǎn)品的費用是一個非常復(fù)雜的過程。影響費用的一個主要因素是所采用的技術(shù)，特別是對于化學(xué)合成尚未開發(fā)出來的生物產(chǎn)品或者在技術(shù)或經(jīng)濟(jì)上有缺陷的生物產(chǎn)品。重組DNA技術(shù)的進(jìn)步為幾乎無限量地生產(chǎn)蛋白和其它物質(zhì)提供了可能。另外一方面，所采用的表達(dá)系統(tǒng)對產(chǎn)品的性質(zhì)和產(chǎn)品的生產(chǎn)方法有著很大的影響。一個好的說明實例是生產(chǎn)組織纖溶酶原激活物(tPA)，它是一種用于治療心肌梗死、血栓形成和肺栓塞的抗血栓物。當(dāng)由大腸桿菌(Escherichia coli)或通過培養(yǎng)遺傳修飾的倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)生產(chǎn)這種物質(zhì)時，它在結(jié)構(gòu)上(糖基化、復(fù)性的需求等等)和生產(chǎn)方法上呈現(xiàn)出顯著差異(表現(xiàn)在它的價格上)。在大腸桿菌中，tPA的生產(chǎn)費用12％用于生產(chǎn)的發(fā)酵階段，88％用于純化。另一方面，通過CHO生產(chǎn)時，費用的75％來源于細(xì)胞培養(yǎng)，25％來自純化(Dataret al，“Process Economics of Animal cells and BacterialFermentationsA Case Study Analysis of Tissue PlasminogenActivator”Bio/Technology 11349-357，1993)。這些差異顯著，在選擇所采用的方法上有著決定性影響。還有其它因素在生產(chǎn)系統(tǒng)的選擇上也特別重要，如用于工廠設(shè)備的經(jīng)費(資金)、原材料的費用、對有資質(zhì)的工作人員(及其費用)以及環(huán)境和安全方面的需求。
植物模式最為理想化的生產(chǎn)生物來源的物質(zhì)的更為安全和便宜的系統(tǒng)是在封閉區(qū)(溫室)或農(nóng)業(yè)區(qū)培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因植物。另外，生產(chǎn)有藥用價值的物質(zhì)的植物系統(tǒng)有多種優(yōu)點，其中人們可能提到的一個優(yōu)點是沒有動物病毒和其它的動物細(xì)胞產(chǎn)物，還沒有在細(xì)菌發(fā)酵過程中酵母或動物細(xì)胞的普遍污染。在這種背景下，對擬南芥(Arabidopsisthaliana)、煙草(Nicotiana tabacum)和水稻(Oryza Sativa)等一些植物模式的遺傳和生物化學(xué)機(jī)制的了解相當(dāng)寬廣、非常透徹。在使用植物系統(tǒng)生產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)效益的物質(zhì)的主要優(yōu)點中，人們應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是更為容易大規(guī)模生產(chǎn)，這在生產(chǎn)具有工業(yè)價值的多肽和/或蛋白中是很基礎(chǔ)的。在使用微生物(重組的或非重組的)時，在大規(guī)模生產(chǎn)中所涉及的階段通常是方法經(jīng)濟(jì)性的制約因素。這包括多種原因，其中包括方法效率的決定性關(guān)系的非線性(氧轉(zhuǎn)移、流變學(xué)因素、方法的能量需求等)、必要生產(chǎn)設(shè)備的費用以及對資質(zhì)非常深的工作人員的需求。就植物系統(tǒng)而言，所提到的費用部分非常低，因為大規(guī)模生產(chǎn)可更為簡潔和線性化。除此之外，在評估工業(yè)方法經(jīng)濟(jì)性時，應(yīng)該考慮尋求消除盡可能多的純化階段數(shù)的方法。另外，植物在代謝上能進(jìn)行復(fù)雜的翻譯后修飾，如糖基化作用，它擴(kuò)寬了由植物生產(chǎn)的可能的肽、抗原或疫苗候選物的范圍。在這個意義上，本發(fā)明的方法包括開發(fā)表達(dá)系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)考慮到所需產(chǎn)物的最恰當(dāng)?shù)募?xì)胞或者亞細(xì)胞定位，并且最為重要的是去除純化步驟。
近年來，擬南芥和煙草的生殖系統(tǒng)得以深入研究，它適于本發(fā)明的去除純化步驟的邏輯。實現(xiàn)本發(fā)明的出發(fā)點是植物生殖系統(tǒng)發(fā)育所涉及的基因的現(xiàn)存知識，更準(zhǔn)確的說，是涉及絨氈層的發(fā)育，近幾年來它已成為巴西里約熱內(nèi)盧聯(lián)邦大學(xué)的植物分子遺傳實驗室的研究對象。該實驗室在該領(lǐng)域以前的研究包括本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)的狀況。一方面，涉及擬南芥的花序形成的基因表達(dá)(Franco，MSc.Dissertation，UFRJ，1992)的知識有助于理解油質(zhì)型蛋白的功能，近來采用與顯微術(shù)相關(guān)的分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行研究(Ferreira，PhD Thesis，UFRJ，1997)。另一方面，也存在關(guān)于所述油質(zhì)型蛋白的編碼基因的調(diào)節(jié)機(jī)制的知識，這是在β-葡糖醛酸糖苷酶(β-glucuronidase，GUS)基因標(biāo)記的幫助下研究的(Scholte，PhD Thesis，UFRJ，1998)。更近來，對修飾花粉粒外表面的蛋白組成的方法的描述可參見Foster等人的“Modifying the pollen coat protein composition in Brassica”，Plant Journal 31(4)477-486，2002，還可參見相同作者在文件WO99/49063中的描述。但是，作者所知道的這些文獻(xiàn)及其它參考文獻(xiàn)在將經(jīng)遺傳修飾的植物用于在雄株生殖系統(tǒng)的組織和/或細(xì)胞中生產(chǎn)藥用產(chǎn)品方面均未做任何暗示或建議，他們也沒有提及將來源于經(jīng)遺傳修飾的植物的完全的、完整的花粉粒作為藥用產(chǎn)品用在免疫反應(yīng)中，或用作疫苗或診斷的反應(yīng)物，而這些共同構(gòu)成了本發(fā)明的目標(biāo)。
就本發(fā)明的目的而言，應(yīng)該將“雄株生殖系統(tǒng)的組織和細(xì)胞”理解為雄株生殖系統(tǒng)的組織或細(xì)胞，包括花藥、絨氈層、花粉粒、及其部分和組合。就本發(fā)明的目的而言，應(yīng)該將“免疫反應(yīng)”理解為涉及真核生物的免疫系統(tǒng)的細(xì)胞和/或分子的所有反應(yīng)，該真核生物包括脊椎動物、無脊椎動物、哺乳動物等等，該細(xì)胞包括諸如巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞B和T的單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞，該分子除抗原、抗體、細(xì)胞因子和其它免疫系統(tǒng)的化學(xué)調(diào)節(jié)劑，還包括這些分子部分和組合。另外，就本發(fā)明的目的而言，應(yīng)該將“異源多肽”理解為并非由植物天然合成的氨基酸序列，而是通過本發(fā)明的方法對植物進(jìn)行遺傳修飾，從而在植物中合成的氨基酸序列。在不限制本發(fā)明的范圍的條件下，應(yīng)該強(qiáng)調(diào)使用含有至少一種異源多肽的花粉粒特別重要。
本發(fā)明提供在生產(chǎn)和使用具有治療和/或診斷作用的多肽上規(guī)避了一些困難的手段。一方面，花粉粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，這可能是由于成功繁殖的需要。因此，它們?yōu)閷苟喾N環(huán)境壓力的“進(jìn)化”對將它們作為產(chǎn)品使用的邏輯是有用的，這是因為它們的高穩(wěn)定性是受人歡迎并且是所需要的。在另外一方面，本發(fā)明的完全花粉粒可用于某些應(yīng)用中，無須純化。作為用來說明本發(fā)明而不是用來限定其范圍的實施例，含有異源多肽的完全花粉粒可在特別是用于篩選的診斷試劑盒的生產(chǎn)中直接作為抗原使用，并且可作為疫苗優(yōu)選給藥到粘膜或進(jìn)行皮下注射而使用。
花粉一般和過敏有關(guān)，因為有些人遇到某些植物的花粉時會出現(xiàn)諸如打噴嚏、瘙癢、咳嗽、鼻部受刺激、流眼淚和哮喘的癥狀。這些顆粒通常在春天富集于空氣中。當(dāng)它們接觸到鼻部粘膜或咽喉，便可激發(fā)過敏反應(yīng)，如花粉癥或季節(jié)性過敏性鼻炎(詳細(xì)參見Balda et al，“Tree-pollen Allergy is Efficiently treated by Short-termImmunotherapy(ST1)with Seven Preseasonal Injections ofMolecular Standardized Allergens”.Allergy 53，740-748，1998)。如在任何過敏過程中那樣，花粉癥是指對花粉中的某些物質(zhì)高度敏感，且人與人之間差異相當(dāng)大，即使似乎有著常見的相關(guān)性。在大部分過敏反應(yīng)中，免疫系統(tǒng)對“錯誤警告”作出反應(yīng)，啟動針對變應(yīng)原的攻擊。生物合成大量特異性IgE，它們與組織中的肥大細(xì)胞和血液中的嗜堿性粒細(xì)胞結(jié)合。當(dāng)變應(yīng)原接觸到IgE，便釋放組胺、前列腺素、白三烯和其它物質(zhì)，因此引起過敏癥狀(詳細(xì)參見Batanero et al，“IgE-binding and Histamine-release Capabilities of the MainCarbohydrate Component Isolated from the Maior Allergen ofOlive Tree Pollen，Ole e 1”.J Allergy Clin Immunol 103，147-153，1999)。為獲得針對自身免疫疾病和過敏的疫苗，已經(jīng)開發(fā)了一些方法，這一般是以引起耐受性為基礎(chǔ)。例如，已知的花粉粒變應(yīng)原以膠囊形式制備時，在通過鼻部給藥引起耐受性是有效的。然而，可利用的變應(yīng)原/抗原的膠囊制備方法非常費力并且昂貴，另外一般還會引起所述變應(yīng)原/抗原的變性。本發(fā)明的方法通過在花粉粒中生產(chǎn)異源變應(yīng)原/抗原克服了這些問題。
由于花粉能刺激特異性IgE和IgG的產(chǎn)生的天然能力，我們以此假說開始花粉將會成為疫苗抗原進(jìn)入粘膜的載體和傳遞物的良好候選物，如通過鼻部免疫直接使用。除了已提及的花粉結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性提高外，本發(fā)明所考慮的另外一個特征是能使用完全花粉粒作為疫苗。有趣的是，世界衛(wèi)生組織(WHO)明確宣布的目標(biāo)之一是開發(fā)將抗原疫苗給藥到呼吸道的新系統(tǒng)。另外，最近的研究表明來源于轉(zhuǎn)基因植物的疫苗在以干粉的形式使用時似乎為優(yōu)選的解決方案，因為在由植物合成的抗原的濃度缺少一致性(詳細(xì)參見Sala et al.，“Vaccineantigen production in transgenic plantsstrategies，geneconstructs and perspectives”.Vaccine 21803-808，2003；Mielarek et al.，“Nasal vaccination using live bacterial vectors”.Advanced Drug Delivery Reviews 5155-69，2001)。另一方面，例如WHO對使用針對僵直性痙攣(或破傷風(fēng))的疫苗的建議是連續(xù)三次給予各自抗原。這種重復(fù)給藥在經(jīng)濟(jì)和后勤上有缺陷，因為一些病人不回來接受第二劑量，并且由于接種工作具有需要低溫運輸系統(tǒng)的限定因素—考慮到事實上所有的疫苗均為熱不穩(wěn)定的。疫苗在花粉粒中的可得性使之能解決上述問題除了更容易給藥(無須注射)、更容易標(biāo)準(zhǔn)化以及賦予更高熱穩(wěn)定性外，還能有助于回避目前為止在疫苗接種中所固有的后勤問題。這些優(yōu)點結(jié)合本發(fā)明的表現(xiàn)形式為研究和開發(fā)這種方式的免疫開辟了良好的前景。
在過去的二十年里，在試著改進(jìn)人用或獸用亞單位疫苗上已經(jīng)進(jìn)行了一些努力。亞單位疫苗是以來源于感染源的單個組分為基礎(chǔ)，并且由于缺少其它細(xì)胞組分(通常從其中純化該亞單位疫苗)，該亞單位疫苗免疫原性較低。因此，在開發(fā)疫苗時，需要計劃使用其它可提高待測抗原的免疫應(yīng)答的物質(zhì)，通常是同時使用佐劑。整個細(xì)胞或其部分可作為自身佐劑起作用，這在本發(fā)明的方法中是有利的。在開發(fā)過程中恰當(dāng)抗原的鑒定僅僅是獲得亞單位疫苗的第一步，因為各自抗原恰當(dāng)?shù)淖魟┫到y(tǒng)和給藥系統(tǒng)也是必要的。佐劑可為任何能提高針對抗原的體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的物質(zhì)；文獻(xiàn)中普遍認(rèn)為某些佐劑是通過將抗原逐漸釋放到免疫系統(tǒng)的細(xì)胞中起作用的。最近的研究(Wiedermann，et al.，“Modulation of an allergic immuneresponse via the mucosal route in a murine mode of inhalativetype-I allergy”.Intl.Arch.Allergy Immunol.118129-132，1999)表明粉劑形式的抗原制劑通過免疫系統(tǒng)的抗原提呈細(xì)胞同樣能增加抗原的攝入。在這種意義上，由于完全花粉粒的粉末本質(zhì)，它在應(yīng)用于疫苗時提供了這個額外的優(yōu)點。無須準(zhǔn)確知道所涉及的具體機(jī)制，已知不僅細(xì)胞免疫，還有體液免疫均可以不同程度受到激發(fā)，這取決于抗原、佐劑、給藥方案以及所涉及的物種。
為開發(fā)有效的并且在商業(yè)上切實可行的疫苗，需要考慮到生產(chǎn)成本、抗原制品的大規(guī)模生產(chǎn)能力以及佐劑系統(tǒng)之間的關(guān)系。另一方面，正在開發(fā)的疫苗數(shù)目逐漸增加，并且針對例如兒童的大范圍免疫項目所需要注射的數(shù)目逐漸增加，導(dǎo)致費用提高，以及產(chǎn)生可能中斷當(dāng)前的免疫項目的偏見。這極度需要獲得可替換的免疫手段，特別是允許所謂多價免疫接種的手段，也就是說，允許同時呈現(xiàn)多個抗原或表位的手段。在這個背景下，轉(zhuǎn)基因植物成為為獲得“可食用”疫苗的幾個嘗試的對象，這是由于它們在生產(chǎn)成本和給藥上的顯著優(yōu)點。但是，在轉(zhuǎn)基因植物中合成的用于口服的疫苗具有穿過胃腸道屏障的缺點，這破壞了很大一部分疫苗抗原。基于這個原因，現(xiàn)有技術(shù)表明由可食用的轉(zhuǎn)基因植物疫苗所引發(fā)的有效免疫應(yīng)答所需要的抗原量是有效的非腸道免疫所必需的抗原量的100倍到1000倍(具體參見Carter III，J.E.，and Langridge，W.H.R.“Plant-based vaccines forprotection against infectious and autoimmune diseases”.Critical Reviews in Plant Sciences 21(2)，93-109，2002；Streatfield and Howard“Plant-based vacci nes”.InternationalJournal for Parasitology 33，479-493，2003)。因此，仍需要開發(fā)新的替代品以克服這些困難。
大部分病原體的入侵途徑是粘膜表面，大部分感染出現(xiàn)在粘液和粘液下組織(mucous and sub mucous tissue)。但是，常規(guī)注射疫苗對在粘膜引發(fā)免疫應(yīng)答效果較差。因此，已經(jīng)進(jìn)行了幾個實驗，以提供在粘膜中免疫的替代品，這包括，例如，將抗原攝入大顆粒中(如脂質(zhì)體、免疫刺激復(fù)合物、微球)，以提高在粘液組織中的免疫應(yīng)答的效果。另一方面，恰當(dāng)佐劑的使用一般在激發(fā)所需類型的免疫應(yīng)答上非常重要。在已知佐劑以及本發(fā)明的范圍內(nèi)，人們可能會指出植物油。使用植物油佐劑相對于使用礦物油佐劑的主要優(yōu)點是植物油更容易被代謝，因此耐受性更好。將植物油作為疫苗中的佐劑使用的實例的專利文獻(xiàn)非常多，包括例如，文獻(xiàn)WO 01/95934“The use of plantoil-bodies in vaccine delivery systems”和WO 02/00169“Productionof vaccines using transgenic plants or modified plant viruses asexpression vectors and transencapsidated viral coat proteins asepitope presentation systems”。這些專利中大部分均公開了油包水乳劑或水包油乳劑(通過混合純的化學(xué)化合物制備得到)的制劑和應(yīng)用。但是，所提到的文獻(xiàn)中沒有一篇揭示或表明諸如完全花粉粒或者甚至其部分的雄株生殖系統(tǒng)的組織或細(xì)胞在用作免疫反應(yīng)中有用的藥用產(chǎn)品或者用作免疫的抗原-佐劑組合物，優(yōu)選用于粘膜。在這種背景下，本發(fā)明提供了在技術(shù)和商業(yè)上切實可行的藥用產(chǎn)品的替代品，該替代品可用于治療真核生物的免疫系統(tǒng)的機(jī)能異常，并且除了其它特征外，還可在一個系統(tǒng)中合成多種物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
考慮到現(xiàn)有技術(shù)的局限性和所有上述的報道，本發(fā)明提供了藥用產(chǎn)品及其在經(jīng)遺傳修飾的植物中的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的產(chǎn)品包括雄株生殖系統(tǒng)的組織和/或細(xì)胞，包括用于人和/或動物保健中的生物活性物質(zhì)。
一方面，本發(fā)明提供了可克服所述產(chǎn)品在生產(chǎn)、配送、儲藏和后勤方面的困難的藥用產(chǎn)品的生產(chǎn)方法。另一方面，本發(fā)明提供了一種用于免疫反應(yīng)的藥用產(chǎn)品的生產(chǎn)方法，該方法通過抗原和/或治療多肽的標(biāo)記基因、編碼基因在雄株生殖組織中表達(dá)實現(xiàn)。另外一方面，本發(fā)明的藥用產(chǎn)品可用于真核生物(包括哺乳動物和其它脊椎動物以及諸如昆蟲等等的無脊椎動物)的免疫調(diào)節(jié)中。從另外一點來看，本發(fā)明的藥用產(chǎn)品還可用于免疫診斷反應(yīng)中。方方面面構(gòu)成了本發(fā)明的目標(biāo)，并通過對其進(jìn)行詳細(xì)的描述和所附附圖以及所附權(quán)利要求書更為清楚地介紹。
具體實施例方式
為評價雄株生殖系統(tǒng)的組織和細(xì)胞作為藥用產(chǎn)品使用的可利用性，我們評估了被認(rèn)為是所述使用的最為苛刻的條件。因此，所檢測的應(yīng)用方法(盡管不限制本發(fā)明的范圍)在本文中將完全花粉粒作為疫苗、免疫治療劑和/或診斷反應(yīng)劑使用。為了實現(xiàn)這個目的，開發(fā)了基因構(gòu)建體，目標(biāo)是使報道基因的表達(dá)方式可使得人們更加容易地分析該構(gòu)建體是否存在于植物亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和花粉粒中。評估了包含報道基因GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶的編碼基因)的不同基因構(gòu)建體(i)雙元載體(binary vector)pDE1001，用于轉(zhuǎn)化含在啟動子PvChit的調(diào)控下的報道基因GUS的煙草植物，該啟動子是菜豆(Phaseusvulgaris)大豆甲殼酶的啟動子，它的基因構(gòu)建體詳細(xì)參見Lima et al.，(2002)Bean class IV chitinase promoter is modulated duringplant development and under abiotic stress.PhysiologiaPlantarum 116512-521，在此存在于被稱為pPvchitΔ1200gus的構(gòu)建體中(

圖1)，這為葡糖醛酸糖苷酶(GUS)在煙草花粉粒中的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)提供了可能；(ii)雙元載體pCambia1303(圖4和6)，用于轉(zhuǎn)化植物，作為受來源于擬南芥的富含甘氨酸的蛋白AtGRP17的啟動子調(diào)控的融合物AtGRP17-GUSGFP的受體，該AtGRP17以前被Oliveira等人稱為AtGRP7，參見他們的“Inflorescence-specificgenes from Arabidopsis thaliana encoding glycine-richproteins”.Plant J.3495-507，1993。第二個構(gòu)建體有助于融合物AtGRP17-GUSGFP在花粉粒表面的表達(dá)，這為檢測由此獲得的花粉粒應(yīng)用于本發(fā)明提供了可能。
實施例1獲得“WT”和“GM”煙草花粉粒將來自SR1系的野生型煙草植物(煙草，N.Tabacum，在本發(fā)明中稱為“WT”)和用載體pPvchitΔ1200gus(圖1)轉(zhuǎn)化的煙草植物(從以前的研究Viviane Moreira，PhD Thesis，UFRJ，2002中可得，還可參見Lima et al.，“Bean class IV chitinase promoter ismodulated during plant development and under abiotic stress”.Physiologia Plantarum 116512-521，2002)在溫室中培育，直到綻放出成熟的花朵。本發(fā)明中經(jīng)基因修飾的煙草系被稱為“GM”，它合成組成發(fā)生改變的花粉粒，在其內(nèi)部含有GUS酶。采用如下程序以收集花粉粒一旦出現(xiàn)開裂，從WT和GM植物中取出全部的花(圖2)并將完整的花藥在解剖刀的幫助下轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中。使用分析天平稱量在每個花序中的花粉粒的平均重量?？紤]到具有花藥時的總重量和沒有花藥時的總重量(在勻漿并將所述花藥中的花粉粒除去后)存在差異，在每朵花中的花粉粒的平均重量等于1毫克，由于每朵煙草花具有5(五)個花藥，每一個花藥等于0.2毫克。
實施例2“GM”花粉粒中的GUS穩(wěn)定性的評估通過確定GM花粉粒中的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的活性，定性評估在室溫下(大約25℃)花粉粒所保持的穩(wěn)定性。為了實現(xiàn)該目的，使用1μL化合物X Gluc(溶于100μL 0.1M、pH7的磷酸鹽緩沖液)和含GUS酶的轉(zhuǎn)基因完全花粉粒進(jìn)行比色反應(yīng)。檢測在實驗室進(jìn)行，GUS酶的活性室溫下至少保持1年。在這種背景下，值得強(qiáng)調(diào)的是維持酶活性所必需的物理-化學(xué)條件與維持多肽序列的免疫原性所必需的條件相比局限性更多。因此，這些結(jié)果表明在“GM”煙草的花粉粒中表達(dá)的異源肽類的穩(wěn)定性有所提高，這在本發(fā)明的應(yīng)用范圍內(nèi)是理想的。
大鼠針對煙草花粉粒的免疫應(yīng)答的分析由于本發(fā)明涉及到特別是應(yīng)用于免疫反應(yīng)的藥用產(chǎn)品的新的生產(chǎn)技術(shù)和制劑，例如免疫調(diào)節(jié)劑、疫苗和診斷試劑，因此在不同條件下的花粉粒的免疫反應(yīng)性是評估其應(yīng)用性的起點。在本文中所使用的方法包括研究接受到不同方式花粉粒暴露的雌性Wistar大鼠(褐家鼠，Ratus novergicus)的免疫應(yīng)答。
花粉粒誘導(dǎo)炎癥的能力可通過分析以不同給藥方案將WT煙草花粉粒給藥給大鼠來評估。通過對支氣管肺泡灌洗液或胸膜液中的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計數(shù)并檢測爪水腫出現(xiàn)來監(jiān)測接受到不同暴露/敏化方案的動物的細(xì)胞應(yīng)答，并通過觀察蛋白外滲、ELISA檢測全部血清學(xué)IgE和IgG濃度、Western Blot檢測抗花粉粒蛋白的特異性血清學(xué)IgG來監(jiān)測分子應(yīng)答。
如所指示的那樣，將含WT或GM煙草花粉粒的鹽水溶液懸浮液以0.5μg、50μg和500μg/只的濃度(以平均重量為1mg花粉/煙草花為基礎(chǔ)的濃度)以不同的方案給予各組動物(3到6只)，可共同給予/也可不給予作為佐劑的氫氧化鋁(5mg/只)?？赏ㄟ^下述方法分別確認(rèn)在支氣管肺泡腔或胸膜腔中是否有炎癥發(fā)生對支氣管肺泡或胸膜進(jìn)行灌洗，然后在Neubauer計數(shù)板對全部白細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，并在離心后在載玻片上對單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞進(jìn)行相對計數(shù)。兩種計數(shù)均借助于光學(xué)顯微鏡。正如將在下面的實驗中所示出的那樣，所檢測的條件均未引起與炎癥過程相應(yīng)的細(xì)胞計數(shù)的顯著改變。另外，所檢測的條件均未引起蛋白滲出物的顯著變化(炎癥過程的特點)。收集并儲存接受不同實驗條件的動物的血清樣本，以備隨后的分子分析使用。另外，根據(jù)ELISA的定量分析，所檢測的花粉粒給藥條件均未顯示出全部血清學(xué)IgE和IgG濃度的顯著增加。下表中的結(jié)果表明不同花粉粒給藥條件均未在動物中引起可檢測的過敏/炎癥型反應(yīng)。
實施例3接受單針胸膜內(nèi)注射的大鼠的免疫應(yīng)答表1將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。以5μg野生型煙草花粉粒(100μL，溶于鹽水溶液)胸膜內(nèi)注射動物。該表顯示在處理后4小時胸膜腔灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)。

小標(biāo)題縮寫CAM Leu tot(在Neubauer計數(shù)板上所計數(shù)的全部白細(xì)胞)；Mono％(單核細(xì)胞的百分比)；Eos％(嗜酸性粒細(xì)胞的百分比)；Neut％(嗜中性粒細(xì)胞的百分比)；E.P.M(平均值標(biāo)準(zhǔn)誤)。
表2將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。以50μg野生型煙草花粉粒(100μL，溶于鹽水溶液)胸膜內(nèi)注射動物。該表顯示在處理后4小時胸膜腔灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)。

表3將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。以500μg野生型煙草花粉粒(100μL，溶于鹽水溶液)胸膜內(nèi)注射動物。該表顯示在處理后4小時胸膜腔灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)。

表1到3的結(jié)果表明所檢測的條件均未在統(tǒng)計學(xué)上顯著改變胸膜腔灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)，表明在這些條件下給予花粉粒并不會引起過敏的特征性炎癥反應(yīng)?？紤]到這些結(jié)果，通過使用大量的動物并將其暴露于更高劑量的花粉粒中進(jìn)行新的系列實驗。
實施例4接受連續(xù)胸膜內(nèi)注射的大鼠的免疫應(yīng)答表4將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。在三次連續(xù)暴露中胸膜內(nèi)注射鹽水溶液(作為對照，100μL/只)，每次暴露之間間隔1周。該表表明通過以5μg花粉粒/只(體積為100μL)胸膜內(nèi)注射，在處理后4小時胸膜腔灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)。

表5將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。在三次連續(xù)暴露中胸膜內(nèi)注射5μg野生型煙草花粉粒(溶于鹽水溶液，100μL/只注射)，每次暴露之間間隔1周。該表表明通過以5μg花粉粒/只(體積為100μL)胸膜內(nèi)注射，在處理后4小時胸膜腔灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)。

表6將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。在三次連續(xù)暴露中胸膜內(nèi)注射50μg野生型煙草花粉粒(溶于鹽水溶液，100μL/只注射)，每次暴露之間間隔1周。該表表明通過以50μg花粉粒/只(體積為100μL)胸膜內(nèi)注射，在處理后4小時胸膜腔灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)。

表7將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。在三次連續(xù)暴露中胸膜內(nèi)注射500μg野生型煙草花粉粒(溶于鹽水溶液，100μL/只注射)，每次暴露之間間隔1周。該表表明通過以500μg花粉粒/只(體積為100μL)胸膜內(nèi)注射，在處理后4小時胸膜腔灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)。


表4到7的結(jié)果表明在連續(xù)給予5μg和50μg花粉粒的條件下，未發(fā)現(xiàn)在胸膜腔灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)在統(tǒng)計學(xué)上有顯著改變。在給予500μg花粉粒的條件下，單核細(xì)胞和嗜中性細(xì)胞計數(shù)顯著增加，同時嗜酸性細(xì)胞也有所增加(盡管在統(tǒng)計學(xué)上不顯著)。這些結(jié)果同樣分別表示在圖3的圖A、B和C。從對接受500μg花粉粒給藥的動物的細(xì)胞計數(shù)中所觀察到的增加表明動物僅僅響應(yīng)極高濃度的所述花粉粒。但是，在小于等于50μg/只的濃度范圍，三次連續(xù)胸膜內(nèi)給予花粉粒不會引起可檢測的炎性類型的應(yīng)答(過敏的特點)。由于胸膜內(nèi)給予抗原的常規(guī)條件很少超過20μg/只的濃度，因此這些結(jié)果表明胸膜內(nèi)花粉粒注射可出乎意料地應(yīng)用于對動物的免疫或免疫治療方案中，而不出現(xiàn)由此所引起的典型過敏/炎性癥狀。為了確定接受鼻內(nèi)給予花粉粒的動物的反應(yīng)，進(jìn)行了另外一系列實驗，如下表所示。
實施例5接受兩次連續(xù)鼻內(nèi)滴注的大鼠的免疫應(yīng)答表8將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。在兩次連續(xù)暴露中鼻內(nèi)滴注鹽水溶液(作為對照，50μL/鼻孔/只)，每次暴露之間間隔1周。該表示出最后一次滴注后4小時正常動物的支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)。

表9將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。在兩次連續(xù)暴露中鼻內(nèi)滴注5μg野生型煙草花粉粒(溶于鹽水溶液，滴注50μL/鼻孔/只)，每次暴露之間間隔1周。該表示出最后一次鼻內(nèi)滴注后4小時支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)。

表10花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。在兩次連續(xù)暴露中鼻內(nèi)滴注50μg野生型煙草花粉粒(溶于鹽水溶液，滴注50μL/鼻孔/只)，每次暴露之間間隔1周。該表示出最后一次鼻內(nèi)滴注后4小時支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)。

表11將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。在兩次連續(xù)暴露中鼻內(nèi)滴注500μg野生型煙草花粉粒(溶于鹽水溶液，滴注50μL/鼻孔/只)，每次暴露之間間隔1周。該表示出最后一次鼻內(nèi)滴注后4小時支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)。

實施例6接受三次連續(xù)鼻內(nèi)滴注的大鼠的免疫應(yīng)答表12將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。在三次連續(xù)暴露中鼻內(nèi)滴注生理鹽水(作為對照，50μg/鼻孔/只)，每次暴露之間間隔1周。該表示出正常動物的支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)。


表13將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。在三次連續(xù)暴露中鼻內(nèi)滴注5μg野生型煙草花粉粒(溶于鹽水溶液，滴注50μL/鼻孔/只)，每次暴露之間間隔1周。該表示出最后一次鼻內(nèi)滴注后4小時支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)。

表14將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。在三次連續(xù)暴露中鼻內(nèi)滴注50μg野生型煙草花粉粒(溶于鹽水溶液，滴注50μL/鼻孔/只)，每次暴露之間間隔1周。該表示出最后一次鼻內(nèi)滴注后4小時支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)。

表15將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。在三次連續(xù)暴露中鼻內(nèi)滴注500μg野生型煙草花粉粒(溶于鹽水溶液，滴注50μL/鼻孔/只)，每次暴露之間間隔1周。該表示出最后一次鼻內(nèi)滴注后4小時支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)。

表12到15的結(jié)果表明在所檢測的條件下，支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)在統(tǒng)計學(xué)上均未出現(xiàn)顯著改變，表明在這些條件下給予花粉粒并不會引起可檢測的敏化型炎癥反應(yīng)?？紤]到這些結(jié)果，進(jìn)行了涉及到大量動物和更高濃度花粉粒的新的一系列實驗。這些結(jié)果同樣分別在圖3的圖A、B和C中示出，該圖清楚顯示在連續(xù)給予5μg、50μg和500μg花粉粒的條件下胸膜腔灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)在統(tǒng)計學(xué)上沒有顯著改變。
實施例7接受皮下注射、然后“加強(qiáng)免疫”的大鼠的免疫應(yīng)答-10μg花粉粒在胸膜腔中的攻擊表16將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。該表示出沒有接受任何敏化或攻擊處理的正常動物的胸膜腔灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)。


表17將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。皮下注射鹽水溶液(對應(yīng)為對照，100μL/只)，然后在7天之后同樣條件下加強(qiáng)免疫。該表示出在通過胸膜內(nèi)注射10μg花粉粒(溶于100μL鹽水溶液)/只處理后4小時胸膜腔灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)(加強(qiáng)免疫后7天，也就是第14天)。

表18將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。皮下注射50μg野生型煙草-WT-花粉粒(100μL/只，溶于鹽水溶液)，然后在7天之后同樣條件下加強(qiáng)免疫。該表示出在通過胸膜內(nèi)注射10μg花粉粒(溶于100μL鹽水溶液)/只處理后4小時胸膜腔灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)(加強(qiáng)免疫后7天，也就是第14天)。

表19將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。皮下注射500μg野生型煙草-WT-花粉粒(100μL/只，溶于鹽水溶液)，然后在7天之后同樣條件下加強(qiáng)免疫。該表示出在通過胸膜內(nèi)注射10μg花粉粒(溶于100μL鹽水溶液)/只處理后4小時胸膜腔灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)(加強(qiáng)免疫后7天，也就是第14天)。

表20將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。皮下注射50μg野生型煙草-WT-花粉粒(100μL/只，溶于含5mg作為佐劑的氫氧化鋁的鹽水溶液)，然后在7天之后同樣條件下加強(qiáng)免疫。該表示出在通過胸膜內(nèi)注射10μg花粉粒(溶于100μL鹽水溶液)/只處理后4小時胸膜腔灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)(加強(qiáng)免疫后7天，也就是第14天)。

表21將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。皮下注射500μg野生型煙草-WT-花粉粒(100μL/只，溶于含5mg作為佐劑的氫氧化鋁的鹽水溶液)，然后在7天之后同樣條件下加強(qiáng)免疫。該表示出在通過胸膜內(nèi)注射10μg花粉粒(溶于100μL鹽水溶液)/只處理后4小時胸膜腔灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)(加強(qiáng)免疫后7天，也就是第14天)。


實施例8接受皮下注射、然后“加強(qiáng)免疫”的大鼠的免疫應(yīng)答-20μg花粉粒在胸膜腔中的攻擊表22將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。皮下注射鹽水溶液(對應(yīng)為對照，100μL/只)，然后在7天之后同樣條件下加強(qiáng)免疫。該表示出沒有接受任何敏化或攻擊處理的正常動物的胸膜腔灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)。

表23將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。皮下注射鹽水溶液(對應(yīng)為對照，100μL/只)，然后在7天之后同樣條件下加強(qiáng)免疫。該表示出在通過胸膜內(nèi)注射20μg花粉(溶于100μL鹽水溶液)/只處理后4小時胸膜腔灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)(加強(qiáng)免疫后7天，也就是第14天)。


表24將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。皮下注射50μg野生型煙草花粉粒(100μL/只，溶于含5mg作為佐劑的氫氧化鋁的鹽水溶液)，然后在7天之后同樣條件下加強(qiáng)免疫。該表示出在通過胸膜內(nèi)注射20μg花粉粒(溶于100μL鹽水溶液)/只處理后4小時胸膜腔灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)。

表25將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。皮下注射100μg野生型煙草花粉粒(100μL/只，溶于含5mg作為佐劑的氫氧化鋁的鹽水溶液)，然后在7天之后同樣條件下加強(qiáng)免疫。該表示出在通過胸膜內(nèi)注射20μg花粉粒(溶于100μL鹽水溶液)/只處理后4小時胸膜腔灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)。


實施例9接受皮下注射花粉粒，然后加強(qiáng)免疫的大鼠的免疫應(yīng)答—通過跖下注射20μg花粉粒攻擊兩組動物在如下條件下接受皮下注射花粉粒懸浮液(100μL/只)1-皮下注射50μg溶于鹽水溶液的花粉粒，并且氫氧化鋁作為佐劑(5mg/只)，和2-皮下注射100μg溶于鹽水溶液的花粉粒，并且氫氧化鋁作為佐劑(5mg/只)。
在皮下注射后一個星期(第七天)，各組動物接受新一輪的皮下注射(加強(qiáng)免疫，以相同的各自花粉粒濃度，但是不含佐劑)。一周后(第14天)，所有的動物組均通過跖下注射20μg花粉粒懸浮液(50μL)攻擊。在任何評估條件下在爪/腳的足底均未發(fā)現(xiàn)水腫。
實施例10接受鼻內(nèi)滴注花粉粒，然后加強(qiáng)免疫的大鼠的免疫應(yīng)答—通過跖下注射20μg花粉粒攻擊四組動物在如下條件下接受鼻內(nèi)滴注花粉粒懸浮液(50μL/鼻孔)1-鼻內(nèi)滴注50μg溶于鹽水溶液的花粉粒；2-鼻內(nèi)滴注25μg溶于鹽水溶液的花粉粒；3-鼻內(nèi)滴注50μg溶于鹽水溶液的花粉粒，并且氫氧化鋁作為佐劑(5mg/只)；和4-鼻內(nèi)滴注25μg溶于鹽水溶液的花粉粒，并且氫氧化鋁作為佐劑(5mg/只)。
在鼻內(nèi)滴注一周后(第7天)，各組動物接受新一輪的鼻內(nèi)給藥(加強(qiáng)免疫，以相同的各自花粉粒濃度，但是不含佐劑)。一周后(第14天)，所有的動物組均通過跖下注射20μg花粉粒懸浮液(50μL)攻擊。在任何評估條件下均未出現(xiàn)爪/腳水腫。
實施例11接受連續(xù)鼻內(nèi)滴注WT和GM煙草花粉粒的大鼠的免疫應(yīng)答各組動物接受鼻內(nèi)滴注(50μL/鼻孔，濃度為0μg、5μg和50μg完全花粉/只)野生型花粉(WT)懸浮液或轉(zhuǎn)基因花粉懸浮液(GM-其花粉粒含GUS蛋白)。間隔7天進(jìn)行三組滴注，之后進(jìn)行支氣管肺泡灌洗和細(xì)胞計數(shù)。
表26將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。在三次連續(xù)暴露中鼻部滴注鹽水溶液(對照，50μL/鼻孔/只)，且每次暴露間隔一個星期。該表示出在上述條件下的最后一次滴注后4小時在支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)。

表27將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。在三次連續(xù)暴露中鼻部滴注5μg野生型煙草花粉粒-WT-(溶于鹽水溶液，滴注50μL/鼻孔/只)，且每次暴露間隔一個星期。該表示出在上述條件下的最后一次滴注后4小時在支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)。


表28將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。在三次連續(xù)暴露中鼻部滴注5μg轉(zhuǎn)基因煙草花粉粒-GM-(溶于鹽水溶液，滴注50μL/鼻孔/只)，且每次暴露間隔一個星期。該表示出在上述條件下的最后一次滴注后4小時在支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)。

表29將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。在三次連續(xù)暴露中鼻部滴注50μg野生型煙草花粉粒-WT-(溶于鹽水溶液，滴注50μL/鼻孔/只)，且每次暴露間隔一個星期。該表示出在上述條件下的最后一次滴注后4小時在支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)。


表30將花粉粒暴露給褐家鼠Wistar大鼠的實驗條件及其各自的結(jié)果。在三次連續(xù)暴露中鼻部滴注50μg轉(zhuǎn)基因煙草花粉粒-GM-(溶于鹽水溶液，滴注50μL/鼻孔/只)，且每次暴露間隔一個星期。該表示出在上述條件下的最后一次滴注后4小時在支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞計數(shù)。

表26到30的結(jié)果在圖3的圖D到F中更好地給出，這表明在通過鼻內(nèi)方式給藥的花粉粒濃度中，細(xì)胞計數(shù)均未發(fā)生顯著改變(這是過敏-炎性反應(yīng)的特點)。在給予WT和GM花粉粒后單核細(xì)胞與嗜中性粒細(xì)胞的計數(shù)在統(tǒng)計學(xué)上出現(xiàn)顯著差異(圖3的圖D和E)，這讓人感到意外，但就本發(fā)明的目的而言是有利的，因為這表明組成發(fā)生變化的花粉粒(GM)在以50μg的濃度使用時，與野生型煙草花粉粒(WT)相比，更不易在支氣管肺泡腔內(nèi)引起炎癥。
實施例12接受不同花粉粒給藥方案的大鼠的免疫應(yīng)答-ELISA檢測血清總IgG表31示出接受實施例6、表12到15中所描述的條件的動物的血清IgG濃度的數(shù)據(jù)。
表31接受三次連續(xù)鼻內(nèi)給藥的動物的血清樣本中的血清總IgG的濃度(μg/mL)數(shù)據(jù)，不同濃度的野生型煙草花粉粒(WT)懸浮液的每次使用的間隔為1周。

表32示出接受實施例7、表16、19到21中所描述的條件的動物的血清IgG濃度數(shù)據(jù)。
表32接受如下處理的動物的血清樣本中血清總IgG濃度(μg/ml)的數(shù)據(jù)胸膜內(nèi)注射不同濃度的野生型煙草花粉粒(WT)，可含或不含佐劑(AlOH3)，然后在一周后同樣條件下加強(qiáng)免疫，并且在此一周后胸膜內(nèi)注射10μg花粉粒攻擊。


表33示出接受實施例11、表26到30中所描述的條件的動物的血清IgG濃度數(shù)據(jù)。
表33接受如下處理的動物的血清樣本中血清總IgG的濃度(μg/ml)數(shù)據(jù)接受3(三)次連續(xù)鼻內(nèi)給藥，并且不同濃度的野生型煙草花粉粒(WT)懸浮液或經(jīng)遺傳修飾(GM)的煙草花粉粒懸浮液的每次使用的間隔為1周。

實施例13對接受連續(xù)皮下注射被識別為變應(yīng)原的水樺樹(Betulafontinallis)花粉粒的大鼠的免疫應(yīng)答的分析為使動物經(jīng)受更易實現(xiàn)炎性和/或過敏反應(yīng)的條件，以推翻在檢測中所使用的動物不會產(chǎn)生應(yīng)答的假說，設(shè)計了新的實驗方案，該方案使用在文獻(xiàn)中報道與過敏事件相關(guān)的花粉粒(Ahlholm et al.，“Geneticand Environmental Factors Affecting the Allergenicity of Birch(Betula pubescens ssp.Czerepanovii[Orl]Hamet-ahti)Pollen”Clin.Exp.Allergy 281384-1388，1998)。在這個意義上，水樺樹花粉?？缮藤彛⑵渑c大鼠按如下所示使用于實驗中各組動物(每組5只)在如下條件下暴露于花粉粒中第1組—皮下注射(100μL/只)●溶于鹽水溶液的樺樹花粉懸浮液(100μg/只)；●溶于鹽水溶液+Al(OH)3(5mg/只)的樺樹花粉懸浮液(100μg/只)；●溶于鹽水溶液+Al(OH)3(5mg/只)的野生型煙草花粉懸浮液-WT(100μg/只)；第2組—滴注(50μL/鼻孔)●溶于鹽水溶液+Al(OH)3(5mg/只)的樺樹花粉懸浮液(100μg/只)；在上述條件下連續(xù)暴露8周后，第1組通過注射50μg花粉粒懸浮液(50μL)到腳墊進(jìn)行攻擊，并用體積描記器測量動物的腳的體積。表34的結(jié)果表明接受皮下注射WT煙草花粉的動物出現(xiàn)了水腫，而注射樺樹花粉的動物出現(xiàn)的水腫程度較低。
表34體積描記器所測量的右爪/腳(對照組)和左爪/腳(攻擊組)的體積(ml)。大鼠在上述條件下接受了8(八)次連續(xù)皮下注射花粉粒，然后通過跖下注射50μg花粉粒懸浮液(50μL/爪)攻擊。所列出的平均值示出了左爪和右爪之間體積上的差異。


對第2組動物進(jìn)行連續(xù)八周鼻部滴注后，在上述條件下將支氣管肺泡內(nèi)灌洗液用于細(xì)胞計數(shù)。細(xì)胞計數(shù)表明與對照組動物沒有變化。將這些結(jié)果結(jié)合在一起可得到如下結(jié)論(i)針對皮下注射的花粉粒的過敏反應(yīng)僅僅在連續(xù)暴露次數(shù)增加后出現(xiàn)，并且在不存在佐劑時更強(qiáng)；(ii)在任何鼻部滴注條件下，均不能在大鼠中檢測過敏反應(yīng)的典型改變。由于水腫的確出現(xiàn)于使用WT煙草花粉和樺樹花粉的皮下注射條件，并在本發(fā)明所評估的所有條件下通過滴注未出現(xiàn)典型的過敏改變，因此這些結(jié)果表明在抗原呈遞方式和應(yīng)答模式上似乎有著一定的聯(lián)系。
實施例14接受不同花粉粒給藥方案的大鼠的免疫應(yīng)答-WesternBlot檢測抗花粉粒蛋白的特異性血清IgGWestern Blot監(jiān)測了抗花粉粒蛋白的特異性血清IgG的形成，其中WT(野生型)花粉和GM(含GUS酶)蛋白的全部抽提物通過凝膠電泳分離，然后將條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。然后將接受三次WT花粉或GM花粉滴注(每次滴注間隔一周)的動物的血清分別匯集并與所述膜(提前剪成小片，以便分離樣本)孵育，在洗滌之后，與堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗抗-大鼠IgG一起孵育。與足量的底物發(fā)生的比色反應(yīng)指示檢測針對花粉粒蛋白的特異性IgG。如表35所示，“WT”煙草花粉粒滴注的動物的血清以及用“GM”煙草花粉粒滴注的動物的血清表明存在特異性抗所述花粉粒的蛋白的IgG型抗體。將這些實驗的結(jié)果結(jié)合在一起發(fā)現(xiàn)在哺乳動物中將花粉粒作為免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)因子使用是切實可行的。更具體地，這些結(jié)果指出在哺乳動物中將完全花粉粒作為保護(hù)性應(yīng)答(針對花粉粒蛋白的特異性血清IgG的形成)的刺激因子是切實可行的。
表35Western Blot檢測針對WT和GM煙草花粉粒的蛋白的特異性血清IgG

除了在本發(fā)明提到的其它優(yōu)點外，使用花粉粒的方法具有重要的特點只需要極少量用于免疫的植物材料。表35的結(jié)果表明在三(3)次給予5μg花粉粒后，形成了針對花粉粒中的蛋白的特異性血清IgG。即便是目前為止沒有進(jìn)行過為確定引起表35中所觀察到的免疫應(yīng)答所必需的最小量的研究，但是本發(fā)明的結(jié)果提供了估計在諸如人類的其它物種中用于免疫所必需的花粉粒的量的合理的基礎(chǔ)。已知人的免疫系統(tǒng)被認(rèn)為較鼠的免疫系統(tǒng)敏感100到1000倍，這意味著通過保持給藥量和體重之間的比例，僅僅通過幾十或幾百平方米的栽培便足以合成用于全部人群的疫苗。除此之外，這還可采用簡單的防范措施，以降低對生物安全的擔(dān)憂。另外，容易想到花粉粒防范的幾個其它方法是可行的，如輻射、使用自殺基因以及不育障礙。本發(fā)明的方法特別適用于動物疫苗接種，可用于對抗流行病，并預(yù)防或治療由于使用生物武器或者恐怖襲擊所導(dǎo)致的情況。
實施例15用于轉(zhuǎn)化到具有可在花粉粒外表面合成異源多肽的花粉粒的植物的基因構(gòu)建體的獲取在本發(fā)明的另外一個優(yōu)選的實施方案中，花粉粒外表面的異源多肽是所需要的，因為它涉及到花粉粒在體外抗原-抗體型反應(yīng)中的使用，也就是說，用于體外免疫診斷的反應(yīng)。為評估該可利用性，用基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化擬南芥，該基因構(gòu)建體可指導(dǎo)異源多肽的表達(dá)，該異源多肽的亞細(xì)胞定位與出現(xiàn)在花粉粒外表面一致。
為了實現(xiàn)這些需求，在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，待測異源多肽的編碼基因通過翻譯融合到AtGRP17基因的編碼序列(SEQ 1)，而所述融合受到AtGRP17的啟動子區(qū)(SEQ 2)的至少一部分的調(diào)控，該啟動子能指導(dǎo)在花藥的絨氈層的基因融合物的表達(dá)。為制備所述基因構(gòu)建體，進(jìn)行如下步驟為擴(kuò)增AtGRP17的啟動子區(qū)及其ORF，使用特異性寡核苷酸RR1f(5’ATA AAG CTT TTT CTC TGT TTT TGT CCG TGG AAC)和RR2r(5’ATA CCA TGG CAC GTG ATT CGG TGG AAG TCC TGCC)。質(zhì)粒pCO27(參見Oliveira et al“Inflorescence-specific genesfrom Arabidopsis thaliana encoding glycine-rich proteins”.PlantJ.3495-507，1993；Franco et al.，“Distal regulatory regionsrestrict the expression of cis-linked gene to the tapetal cells”.FEBS Letters 259651-6，2002)作為靶標(biāo)用于啟動子區(qū)和AtGRP17ORF的PCR擴(kuò)增。通過使用寡核苷酸RR1f和RR2r，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物ProAtGRP67(圖6)，在用酶Xbal和Ncol剪切后將該擴(kuò)增產(chǎn)物連接到用相同的酶剪切的質(zhì)粒pCambia上(圖5)，因此產(chǎn)生構(gòu)建體pProAtGRP17_GUSGFP(圖7)。
實施例16擬南芥的轉(zhuǎn)化和異源多肽位置的分析將前面的實施例中的基因構(gòu)建體導(dǎo)入大腸桿菌和根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefasciens)，為實現(xiàn)隨后轉(zhuǎn)入到擬南芥中。通過采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所`熟知的方法提取基因組DNA，并通過對導(dǎo)入轉(zhuǎn)化植物的異源區(qū)的PCR介導(dǎo)的擴(kuò)增進(jìn)行對植物轉(zhuǎn)化的確定。還通過采用X-Gluc作為底物的比色反應(yīng)以及相應(yīng)的藍(lán)色的形成對在預(yù)定亞細(xì)胞位置的GUS酶活性的表達(dá)分析對植物轉(zhuǎn)化進(jìn)行了確定。通過立體顯微術(shù)和光學(xué)顯微術(shù)觀察植物組織樣本。
通過電穿孔將含報道基因gus和gfp的基因構(gòu)建體(圖7)導(dǎo)入大腸桿菌，通過熱休克導(dǎo)入根癌土壤桿菌。通過對限制性內(nèi)切酶消化得到的片段(圖8)的期待分布的分析可確定克隆。將擬南芥花序使用含所述基因構(gòu)建體的根癌土壤桿菌培養(yǎng)物接種(稱為“浸花法(floraldip)”的轉(zhuǎn)化技術(shù)，參見Clough & Bent“Floral dipa SimplifiedMethod for Agrobacterium-mediated Transformation of Arabidopsisthaliana”The Plant Journal 16(6)735-743，1998)。收集該處理后所得到的種子并播種在裝有含潮霉素的選擇培養(yǎng)基的平板上。將從平板上選出的幼苗移植到人工氣候室中的土壤中，在人工氣候室中，幼苗在有利于自我授精的環(huán)境下生長。通過對顯微術(shù)所得到的這些植物的花序(圖9A-D)的分析可確定在期待的亞細(xì)胞位置存在GUS活性(通過在實施例2中所描述的相應(yīng)的比色反應(yīng))。更具體地，G US酶的活性僅僅在花藥發(fā)育晚期(圖9A)，更為具體地說是在花藥的絨氈層(圖9C)才能檢測到。
實施例17檢測在花粉粒表面的異源多肽實施例16中的擬南芥植物的轉(zhuǎn)化形成了在花粉粒中能有效生產(chǎn)異源多肽的11個品系。這些品系在人工氣候室中培育并自花傳粉，以為在隨后獲得成百上千的種子提供可能。每一種品系的種子直接播種到土壤中，并將所得到的植物在人工氣候室中培育。在花序形成之后，在解剖刀的幫助下將所有的花收集到Eppendorf管中。將100μL磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH7)加入所述管中，然后振蕩該管，以形成均一的花粉粒懸浮液。然后，加入1μL X Gluc試劑，并在37℃孵育30分鐘。然后，GUS酶可引發(fā)藍(lán)色復(fù)合物的形成。然后用微量移液器收集部分懸浮液，并將其置于載玻片上，以在顯微鏡下進(jìn)行觀察。所觀察的結(jié)果(圖9D)表明在花粉粒中存在活性異源多肽(GUS酶)。將這些結(jié)果結(jié)合在一起可發(fā)現(xiàn)將完全花粉粒作為試劑用于免疫診斷的使用是切實可行的。
普通技術(shù)人員可從本發(fā)明的描述中理解任何異源多肽可通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)，包括翻譯后修飾的多肽，如糖基化蛋白等等。同樣，異源多肽或異源多肽片段的翻譯融合物的組合可通過本發(fā)明的教導(dǎo)生產(chǎn)，包括但不限于多肽的至少一部分，該多肽來源于真核生物，如包括人的哺乳動物、植物、寄生蟲、真菌；或者該多肽來源于原核生物，如細(xì)菌，甚至病毒，以及其組合，無須考慮是天然多肽還是合成多肽?；诒景l(fā)明的目的的優(yōu)選的治療肽包括肽激素、細(xì)胞因子、干擾素、抗體(和/或其片段)及其組合。通過這些方法生產(chǎn)的異源多肽可用于幾個免疫反應(yīng)，包括用于哺乳動物的免疫調(diào)節(jié)和體外免疫診斷反應(yīng)。根據(jù)所選抗原和/或根據(jù)所選抗原的組合，所稱的免疫調(diào)節(jié)可具有免疫治療、免疫防護(hù)或免疫接種的目的。
序列表申請人資料(a)姓名UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO EFUNDA O OSWALDO CRUZ(FEDERAL UNIVERSITY OF RIO DEJANEIRO AND OSWALDO CRUZ FOUNDATION)(b)地址UFRJ-Universidade Federal do Rio de Janeiro，Av.BrigadeiroTrompowski，s/n°；Cidade Universitária，Rio de Janeiro-RJ.；FIOCRUZ-Av.Brasil 4365，Rio de Janeiro-RJ發(fā)明名稱藥用產(chǎn)品及其生產(chǎn)方法所列出序列的數(shù)目2
Seq.nr.1大小1629個堿基對類型cDNA基因名稱AtGRP17功能油質(zhì)型蛋白SEQ 1At GRP17的編碼區(qū)的完整序列(4940-5358)+(5545-6757)a tgagcgaaga actaagtcaa aagccatcat cagctcagtc4981 tctgtcactg agagagggca gaaataggtt tccttttctg tccctgtcac agagagaggg5041 cagatttttt ccttctctat ctctttcaga gagagatgga agaaagtttt cttttctcag5101 tatgttctct tttctcatgc cactgttgga ggttattaag attattattg cttctgtggc5161 ctccgtaatc ttcgtcggtt tcgcctgtgt aaccctcgct ggttctgccg cagcattagt5221 cgtaagcacc ccggttttca tcatatttag tcctgttctc gtaccagcta cgatagccac5281 ggttgtcttg gcgacaggat tcacggccgg tggctctttt ggagcgacgg cacttggtct5341 catcatgtgg cttgttaagt aagattatta taacagctta tattgagatc actcgagatt5401 tatgcttaat tatataatat tcataaacct atagtttaaa agtatattga acttcatttg5461 ttaacgtact ttataaatat tgaacttcgt tcgttttctt aattggtctc taagtatata5521 tacatacttt tttgtgtgat gcagacgtag gatgggagta aagccgaagg ataatccacc5581 tccggcagga cttccaccga attcgggagc aggagcagga ggagctcaaa gtctgatcaa5641 aaagtcaaag gcaaagtcta aaggtgggct taaggcttgg tgtaagaaga tgttaaaaag5701 taaattcggt ggtaaaaaag gcaagtccgg gggtggaaaa agtaaatttg gaggtaaagg5761 cggtaagtcc gaaggtgaag aaggtatgtc gtctggggat gaaggtatgt ctggaagtga5821 aggaggtatg tccggaggtg aaggaggtaa atccaaaagt ggaaaaggta aactcaaagc5881 taaactcgaa aagaaaaaag gtatgtccgg agggtccgag agtgaagaag gtatgtctgg5941 aagtgaagga ggtatgtctg gtggtggagg aagtaaatcc aaaagtaaaa aaagtaaact6001 caaagctaaa ttgggaaaga aaaaaggtat gtccggaggc atgtcaggaa gtgaagaagg6061 tatgtctgga agtgaaggag gtatgtccag tggtggagga agtaaatcca aaagtaaaaa6121 aagtaaactc aaagctaaat tgggaaagaa aaaaggtatg tccggaggca tgtcaggaag6181 tgaagaaggt atgtctggaa gtgaaggagg tatgtccgga ggtggaggag gtaaatccaa6241 aagtagaaaa agtaaactca aagctaaatt gggaaagaaa aaatgtatgt ccggaggcat6301 gtcaggaagt gaaggaggta tgtctggaag tgaaggaggt atatccggag gtggtatgtc6361 tgggggcagt ggaagtaaac acaaaattgg aggaggtaaa cacggaggtc ttggaggtaa6421 attcggaaag aaaagaggca tgtccggaag tggaggaggc atgtcaggaa gtgaaggagg6481 tgtgtctgga agtgaaggaa gtatgtctgg aggtggtatg tctgggggta gcggaagtaa6541 acacaaaatt ggaggaggta aacacggagg tcttagaggt aaattcggaa agaaaagagg6601 tatgtcagga agtgaaggag gtatgtctgg aagtgaagga ggtatgtcgg aaagtggtat6661 gtccgggagt ggagggggta aacacaaaat cggaggaggt aaacacaaat ttggaggagg6721 taaacacgga ggtggaggtg gccacatggc ggagtaa從AtGRP17翻譯得到的蛋白序列MSEELSQKPSSAQSLSLREGRNRFPFLSLSQREGRFFPSLSLSERDGRKFSFLSMFSFLMPLLEVIKIIIASVASVIFVGFACVTLAGSAAALVVSTPVFIIFSPVLVPATIATVVLATGFTAGGSFGATALGLIMWLVKRRMGVKPKDNPPPAGLPPNSGAGAGGAQSLIKKSKAKSKGGLKAWCKKMLKSKFGGKKGKSGGGKSKFGGKGGKSEGEEGMSSGDEGMSGSEGGMSGGEGGKSKSGKGKLKAKLEKKKGMSGGSESEEGMSGSEGGMSGGGGSKSKSKKSKLKAKLGKKKGMSGGMSGSEEGMSGSEGGMSSGGGSKSKSKKSKLKAKLGKKKGMSGGMSGSEEGMSGSEGGMSGGGGGKSKSRKSKLKAKLGKKKCMSGGM
SGSEGGMSGSEGGISGGGMSGGSGSKHKIGGGKHGGLGGKFGKKRGMSGSGGGMSGSEGGVSGSEGSMSGGGMSGGSGSKHKIGGGKHGGLRGKFGKKRGMSGSEGGMSGSEGGMSESGMSGSGGGKHKIGGGKHKFGGGKHGGGGGHMAESeq.nr.2大小1658個堿基對類型DNA啟動子名稱ProAtGRP17功能啟動子SEQ 2AtGRP17的啟動子區(qū)的完整序列(3371-4939)3371 acaaagaaat taactatgaa acaatgcttt gtttaaatga agtaattaat3421 cggtactata gcgtatatac atagaatgga tccaatttaa ccaaagcaac tgtatgtgac3481 tatgtgaatg attcaatcgt gagacattga aattgtcgtt tctccattac ctttttggaa3541 gaaaaaccat cgaaagctag ctaagacttt ttttattaaa cgaacttgct actatttcta3601 tgttttcttt gaaatgaaaa ttaaatttgt tactgtttca cctaaaactc aaaagtattg3661 ctttttaatt ttattattaa gaaaaactaa tcttatttat gttaagaaac ctgtcaattt3721 ttcattgtta atttcggctc tataattatt aattaacaat caatttctca aaaattgcaa3781 tcatgattat gattagatat atattagttg gattgtgatg cattttttgt aatataaaat3841 ggatgtttgt attagtttct cactcatgta attaaacacc aaatgctaga aactagtact3901 tttgtttctc agctctcgtc tattgttata tctgcaacac gaacaaaaac cttatctagg3961 tgttatatat cacggttatg tttatgagtt agaagggatt cttcaacaaa aatcacggaa4021 ctacttgtat atatgtatgt gtgtatccga tcgaggttga cttccggggt tggacgttga4081 agaagacgaa ttcattgatt gggcttatat atgggcatgt attacttggt tcaagtttgt4141 aacactttta gctttttcaa ttctattcga aaccaaaata ttgggctata tatctttata4201 caaccttcaa gataaattgg accaatttta gaagagcaaa ttgaacccgg ccgttagcgt4261 tagccaaacc ccaactcctt ttcagtacaa ttaaatcaag aatttctaat aaatcgtgaa4321 tttctagaca tacatatcat aatttcgtca aagcgagcct acacctagtt ttgagctaca4381 taactctttt cttttttttt ttatgattag gaggtttcaa aacccttgga cccataattt4441 cttataatta gttttgtaat actaaattta ccattgagag cgacctctcg tcactagtaa4501 ttcgaagatc tcatattcat gacctatatt aaccatcttc cagtcaagta atttcaatcg4561 aaattcatca aaatcatata tttaacttag taatcacata tgatatggct aatatacgta4621 atataacgat aaagatttct tcacgctttg atattccata aagcaatgga aatatggaat4681 ggaagaaaac atttgaattt tacaagaaac aataaataga aggcctacaa aacatgacaa4741 cccacacaca cacacacgaa aagagaaaat ataaagaagg acatgtaacg tgacgtagcg4801 tagatctcca ttcactccaa tcgttttgca tggagcatgc atgtgtgtgt accgtgcacg4861 tagtagagac cacacaactc cttcataaaa gccctctctc tcttaccatc accaaaacac4921 aacaatccga tcagaaaat
權(quán)利要求
1.用于免疫反應(yīng)的藥用產(chǎn)品，其特征在于包括雄株生殖系統(tǒng)的至少部分組織或細(xì)胞，所述至少部分組織或細(xì)胞包含通過對產(chǎn)生所述組織或細(xì)胞的植物進(jìn)行遺傳修飾得到的異源多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥用產(chǎn)品，其特征在于包括完全/完整的花藥或其部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的藥用產(chǎn)品，其特征在于包括完全花粉?；蚱洳糠?。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3所述的藥用產(chǎn)品，其特征在于包括從所述組織和/或細(xì)胞中至少部分純化的至少部分多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4所述的藥用產(chǎn)品，其特征在于所述多肽選自至少部分真核生物抗原、原核生物抗原、病毒抗原或合成抗原，以及治療肽、肽激素、細(xì)胞因子、白介素和其組合。
6.根據(jù)上述任一項權(quán)利要求所述的藥用產(chǎn)品，其特征在于所述免疫反應(yīng)是真核生物的免疫調(diào)節(jié)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥用產(chǎn)品，其特征在于所述的免疫調(diào)節(jié)用作免疫治療。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥用產(chǎn)品，其特征在于所述免疫治療用于治療過敏。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥用產(chǎn)品，其特征在于所述免疫治療用于治療自身免疫疾病。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥用產(chǎn)品，其特征在于所述免疫治療用于治療癌癥。
11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥用產(chǎn)品，其特征在于所述免疫調(diào)節(jié)用于接種脊椎動物。
12.根據(jù)權(quán)利要求6到11所述的藥用產(chǎn)品，其特征在于所述免疫調(diào)節(jié)是通過非腸道給藥給脊椎動物實現(xiàn)的。
13.根據(jù)權(quán)利要求6到11所述的藥用產(chǎn)品，其特征在于所述免疫調(diào)節(jié)是通過給藥到脊椎動物的粘膜表面而實現(xiàn)的。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥用產(chǎn)品，其特征在于所述粘膜表面是鼻表面。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥用產(chǎn)品，其特征在于所述粘膜表面是肺表面。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥用產(chǎn)品，其特征在于所述粘膜表面是口腔或舌下粘膜表面。
17.根據(jù)權(quán)利要求1到5所述的藥用產(chǎn)品，其特征在于所述免疫反應(yīng)是體外免疫反應(yīng)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的藥用產(chǎn)品，其特征在于所述免疫反應(yīng)包括與所述藥用產(chǎn)品相互作用的細(xì)胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的藥用產(chǎn)品，其特征在于所述免疫反應(yīng)包括與所述藥用產(chǎn)品相互作用的分子。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的藥用產(chǎn)品，其特征在于所述分子為抗體或其部分。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的藥用產(chǎn)品，其特征在于所述分子為抗原或其部分。
22.用于免疫反應(yīng)的藥用產(chǎn)品的生產(chǎn)方法，其特征在于包括培育能夠產(chǎn)生含異源多肽的雄株生殖系統(tǒng)的組織或細(xì)胞的遺傳修飾植物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于所述植物由含與至少部分異源多肽的編碼序列有效連接的至少部分啟動子區(qū)的基因序列所修飾，以致所述異源多肽包含在雄株生殖系統(tǒng)的細(xì)胞或組織中。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于所述啟動子區(qū)包含能指導(dǎo)所述異源多肽在花藥或花藥的任何亞細(xì)胞位置表達(dá)的任何核苷酸序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于所述啟動子區(qū)包含能指導(dǎo)所述異源多肽在花粉粒細(xì)胞中表達(dá)的任何核苷酸序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于所述啟動子區(qū)包含能以所述異源多肽存在于成熟花粉粒中的方式指導(dǎo)所述異源多肽的表達(dá)的任何核苷酸序列。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于—所述啟動子區(qū)包含能指導(dǎo)在花藥的絨氈層的基因表達(dá)的任何核苷酸序列；—所述序列有效連接到油質(zhì)型蛋白的至少一部分的編碼序列；并且—所述編碼油質(zhì)型蛋白的至少一部分的序列通過翻譯融合到編碼用于免疫反應(yīng)的一條或多條多肽的至少部分的序列。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于所述啟動子區(qū)包含至少部分序列SEQ.2。
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于所述編碼至少部分油質(zhì)型蛋白的序列包含至少部分序列SEQ.1。
30.根據(jù)權(quán)利要求22到29所述的方法，其特征在于所述異源多肽選自至少部分肽，該肽來源于真核生物，如包括人的哺乳動物、植物、寄生蟲、真菌，或來源于原核生物，如細(xì)菌，甚至病毒，以及其組合，無須考慮是天然肽還是合成肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于治療過敏、自身免疫疾病，哺乳動物免疫以及體外診斷的藥用產(chǎn)品。這些產(chǎn)品優(yōu)選包含具有通過對生成它的植物進(jìn)行遺傳修飾而改變了的蛋白組成的花粉粒。本發(fā)明的生產(chǎn)方法包括培育能生產(chǎn)具有改變了分子組成的花粉粒的遺傳修飾植物。
文檔編號A61P37/08GK1905890SQ200480040363
公開日2007年1月31日 申請日期2004年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月13日
發(fā)明者里卡多·阿馬拉·雷默, R·瑪吉斯, M·阿爾維斯費雷拉, M·科倫哈利馬 申請人:里卡多·阿馬拉·雷默