專利名稱：葛根提取物在2型糖尿病治療中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種預防和/或治療2型糖尿病的方法，同時，本發(fā)明涉及一種增強葡萄糖轉運蛋白Glut4的磷酸化和Glut4易位到靶細胞膜來增強信號傳導途徑中胰島素信號的方法；另外，本發(fā)明涉及一種簡單、廉價的方法來獲得提取物并選擇性獲取其活性正丁醇餾分和活性分子Lupinoside PA(LPA4)，用于預防和/或治療2型糖尿?。蛔詈?，本發(fā)明涉及葛根(Pueraria Tuberosa)提取物的藥物組合物。
背景技術：
2型胰島素抗性性糖尿病是一種隱襲疾病，占糖尿病病例的95％以上。這種異質疾病在流行病中的比例正在增加，估計其世界范圍的發(fā)病率每年增長6％以上1，2。該病主要表現(xiàn)為高血糖癥，原因是葡萄糖對胰島素的反應性降低或抵抗而使葡萄糖進入骨骼肌、脂肪和肝臟存在障礙3，4。大量證據(jù)表明游離脂肪酸(FFAs)對胰島素無效負有責任。體內循環(huán)中升高的游離脂肪酸伴隨著胰島素功能損傷，并通常與肥胖和2型糖尿病相關聯(lián)5-7。血漿游離脂肪酸濃度經(jīng)脂類注入而升高，導致鼠和人骨骼肌中的胰島素抗性7-9。分離的肌肉帶或培養(yǎng)的肌肉細胞與游離脂肪酸的培養(yǎng)，或脂蛋白酶在骨骼肌中的表達，減少了胰島素介導的葡萄糖吸收6-12。這些報道表明，胰島素敏感組織中越多的脂類沉積促進了胰島素的無效和抵抗。游離脂肪酸誘導的胰島素活性損傷似乎與胰島素信號傳導缺陷有關。游離脂肪酸引起的葡萄糖轉運降低與胰島素刺激的胰島素受體底物(IRS-1)磷酸化和IRS-1相關磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3-K)活化的抑制有關13-15。噻唑烷二酮(TZD)的治療減少了對抗靶組織中胰島素作用的循環(huán)游離脂肪酸，從而提高了胰島素活性16-18。經(jīng)過氧化物酶增殖物激活受體γ(PPARγ)的活化來誘導脂肪細胞中甘油激酶基因的表達，TZD增進了甘油整合入甘油三酯，并因此降低了脂肪細胞對游離脂肪酸的分泌，這幫助了胰島素的致敏作用19。

發(fā)明內容
本發(fā)明的主要目的是開發(fā)一種預防和/或治療2型糖尿病的方法。
本發(fā)明的另外一個主要目的是開發(fā)一種增進葡萄糖轉運蛋白Glut4的磷酸化和Glut4易位到靶細胞膜的方法，來增強信號傳導途徑中的胰島素信號。
本發(fā)明的另外一個目的是開發(fā)一種簡單、廉價的方法來獲得葛根提取物并選擇性獲取其活性正丁醇餾分和活性分子Lupinoside PA(LPA4)，用于預防和/或治療2型糖尿病。
本發(fā)明還有一個目的是開發(fā)一種用于預防和/或治療2型糖尿病的藥物組合物。
本發(fā)明涉及一種預防和/或治療2型糖尿病的方法，本發(fā)明還涉及一種增進葡萄糖轉運蛋白Glut4的磷酸化及Glut4易位到靶細胞膜來增強信號傳導途徑中胰島素信號的方法；另外，本發(fā)明涉及一種簡單、廉價的方法來獲得葛根提取物并選擇性獲取其活性正丁醇餾分和活性分子Lupinoside PA(LPA4)，用于預防和/或治療2型糖尿??；最后，本發(fā)明涉及葛根提取物的藥物組合物。
具體實施例方式
因此，本發(fā)明涉及一種預防和/或治療2型糖尿病的方法，同時，本發(fā)明也涉及一種增強葡萄糖轉運蛋白Glut4的磷酸化和Glut4易位到靶細胞膜的方法，來增強信號傳導途徑中的胰島素信號；另外，本發(fā)明涉及一種簡單、廉價的方法來獲得葛根提取物并選擇性獲取其活性正丁醇餾分和活性分子Lupinoside PA(LPA4)，用于預防和/或治療2型糖尿病；最后，本發(fā)明涉及葛根提取物的藥物組合物。
本發(fā)明的另一個實施方式中，涉及預防和/或治療有需要的受試者的2型糖尿病的方法，所述方法包括給該受試者注入藥用有效量的植物葛根(Pureria tuberosa)提取物或提取物的正丁醇餾分或LupinosideA4(LPA4)，可選的與一種或多種添加劑一起給藥。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，其中所述受試者是動物。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，其中所述受試者是人。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，其中所述餾分的給藥濃度為1-40mg/kg體重。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，涉及權利要求1所要求保護的方法，其中Lupinoside的給藥濃度為1-40mg/kg體重。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，涉及權利要求1所要求保護的方法，其中給藥途徑選自口服、靜脈注射、肌肉注射和皮下給藥。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，涉及一種用于預防和/或治療2型糖尿病的藥物組合物，所述組合物包含植物葛根提取物或提取物的正丁醇餾分或Lupinoside A4(LPA4)，和添加劑。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，所述添加劑選自諸如蛋白質、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鈣、淀粉、明膠糊的營養(yǎng)素，可藥用的載體、賦形劑、稀釋劑和溶劑。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，所述提取物從植物根中獲得。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，所述餾分濃度范圍是1-40mg/kg體重。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，其中Lupinoside的濃度范圍是1-40mg/kg體重。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，所述組合物的劑型選自膠囊、糖漿、濃縮劑、粉末和顆粒。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，所述提取物是水提取物。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，涉及一種增強葡萄糖轉運蛋白Glut4的磷酸化和Glut4易位到靶細胞膜來增強有需要的受試者的信號傳導途徑中胰島素信號的方法，所述方法包括給該受試者注入藥用有效量的植物葛根提取物或提取物的正丁醇餾分或Lupinoside A4(LPA4)，任選的與一種或多種添加劑一起給藥。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，所述添加劑選自諸如蛋白質、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鈣、淀粉、明膠糊的營養(yǎng)素，藥物可接受的載體、賦形劑、稀釋劑和溶劑。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，所述餾分給藥濃度是1-40mg/kg體重。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，其中Lupinoside的給藥濃度是1-40mg/kg體重。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，其中所述方法幫助預防和/或治療2型糖尿病。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，其中所述方法顯示了細胞對葡萄糖吸收的增加。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，其中所述方法對細胞是無毒性的。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，其中所述易位是從胰島素反應細胞的細胞質轉移到細胞膜。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，其中所述Lupinoside A4(LP4)預防棕櫚酸誘導的胰島素信號傳導缺陷。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，其中所述Lupinoside A4(LP4)使胰島素能夠刺激胰島素受體β(IRβ)和效應物激酶(Akt)的磷酸化。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，涉及一種簡單、廉價獲取提取物及隨后選擇性獲取其活性正丁醇餾分和活性分子Lupinoside PA(LPA4)用于預防和/或治療2型糖尿病的方法，所述方法包括如下步驟●將植物部分切成小塊，●用甲醇和水提取切后的小塊，●將甲醇和水提取物在乙酸乙酯和水之間分層，●用正丁醇進一步萃取水層來獲得丁醇餾分，和●用水和甲醇作為洗脫液將正丁醇餾分進行層析來獲取Lupinoside PA4(LPA4)。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，其中植物部分是根。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，其中溶劑選自甲醇和水。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，其中水和甲醇的比例為大約1∶1。
本發(fā)明的另外一個實施方式中，其中層析是柱層析。
胰島素對靶組織敏感性降低或胰島素抗性導致了2型糖尿病，該病目前正達到工業(yè)化社會中的流行性比例。目前還不清楚胰島素是如何失去其敏感性的。大量證據(jù)表明游離脂肪酸(FFA)導致胰島素抗性。我們已經(jīng)證明棕櫚酸(一種游離脂肪酸)干擾了胰島素與3T3L1脂肪細胞細胞膜的210kDa受體蛋白結合。棕櫚酸沒有改變胰島素結合的親和力，因為Ka保持不變，但是它顯著降低了胰島素對受體的占有量，最大結合量(Bmax)從7.3pM(胰島素)到3.46pM(胰島素加棕櫚酸)。棕櫚酸對胰島素和胰島素受體(IR)之間相互作用的抑制與IRβ酪氨酸磷酸化水平的下降同時發(fā)生，這是一種主要靶細胞響應，隨后是胰島素-IR復合。隨后，我們檢查了胰島素刺激的下游信號，它們隨著IRβ的酪氨酸磷酸化而相應的被磷酸化。用棕櫚酸培養(yǎng)3T3L1細胞24小時，致使胰島素增強的IRS1、PI3激酶和Akt的磷酸化水平下降了約2倍，并完全阻斷了胰島素誘導的Glut4易位。所有這些都表明了棕櫚酸引起的胰島素信號下降，這導致了胰島素無效。從植物根中分離的LupinosideA4(LPA4)防止了棕櫚酸誘導的胰島素信號傳導缺陷。LPA4與棕櫚酸的共培養(yǎng)使胰島素能夠刺激IRβ和AKt的磷酸化以及經(jīng)胰島素誘導的Glut4易位。因此，LPA4證明了其作為治療劑在胰島素抗性和2型糖尿病中的應用。
這些報道促使我們關注引起胰島素抗性和2型糖尿病的主要化合物一游離脂肪酸。早期報道顯示在游離脂肪酸中，棕櫚酸是胰島素活性的最強抑制劑12，20-23，但是我們面對的問題是它如何導致這樣的缺陷。用棕櫚酸、十四酸、丁酸鹽、辛酸鹽、硬脂酸、月桂酸和亞油酸對3T3L1脂細胞預處理24小時，隨后用胰島素培養(yǎng)30分鐘，然后測定3H-2-脫氧葡萄糖(2-DOG)的吸收，結果表明棕櫚酸可被選為最強大的抑制劑(未顯示數(shù)據(jù))。這促使我們探索抑制棕櫚酸誘導的、胰島素刺激的葡萄糖吸收的潛在機理。棕櫚酸誘導的脂肪細胞經(jīng)裂解，分離細胞膜，溶解，進行不變性的SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)，然后進行放射自顯影。125I-胰島素結合蛋白能夠被定位在210kDa的凝膠區(qū)域，這證實了關于非變性條件下的洗滌劑溶解的胰島素受體和3T3L1脂細胞的早期報道24-26。圖1a表明棕櫚酸有效降低了胰島素與受體的結合。正如有關β-腎上腺素受體的報道27-29，棕櫚酸的結合或IR的酯化沒有改變胰島素與受體的親和力但是卻導致受體占有量下降兩倍，Bmax從7.3降低到3.6pM(圖1b)。由于硬脂酸和十四酸不能降低125I-胰島素與受體的結合(未公開數(shù)據(jù))，我們假定這是棕櫚酸特有的作用。有趣的是，放射性標記的棕櫚酸與相似分子大小的蛋白質(1a)結合，表明IR的棕櫚酸?；Ｔ谝粋€模型的幫助下，該假定背后的邏輯在圖1c中得到了解釋。為了識別棕櫚酸?；目赡芪稽c，基于近期被確定的1型胰島素樣生長因子受體的晶體結構，同源模擬了鼠胰島素受體首選3個結合域的三維結構。丙氨酸掃描突變結果有力表明了胰島素受體上的這一區(qū)域(在圖1c中的氰基環(huán)內)是胰島素結合的最可能的位點31。共有氨基酸序列27的缺乏意味著棕櫚酸?；膬?yōu)先選擇取決于三維結構，而正電和/或中性表面將有利于其?；ＤM結構表面電勢的計算、半胱氨酸殘基可溶性及近似測定已經(jīng)幫助我們從IR的L1-富含Cys-L2區(qū)域中的16個電勢對中識別出用于?；膬蓚€半胱氨酸電勢對(Cys-8&Cys-26 and Cys-266&Cys-274)。由于僅僅是棕櫚酸與IR結合并不意味著生物學上的相關性，所以我們研究了棕櫚酸對胰島素刺激的信號的影響，來證明其結合與功能的重要關聯(lián)。我們首先觀察了胰島素受體β(IRβ)的棕櫚酸?；?，通過使用棕櫚酸或不使用棕櫚酸對3T3L1培養(yǎng)24小時并隨后用胰島素培養(yǎng)。棕櫚酸顯著降低了胰島素刺激的IRβ磷酸化，而硬脂酸沒有表現(xiàn)出這樣的抑制作用(圖1d)。這些結果表明棕櫚酸結合或受體的棕櫚酸酰化具有生理學上的相關性，因為IRβ的磷酸化是來自胰島素靶細胞的主要反應。
為獲得進一步證據(jù)，我們檢查了胰島素增強的下游信號，它們隨著受體酪氨酸激酶的磷酸化而得到相應的磷酸化。使用磷酸特異抗體，我們發(fā)現(xiàn)胰島素對IRS-1磷酸化和PI3K活化的刺激作用被棕櫚酸顯著抑制。棕櫚酸也降低了胰島素對其他下游分子的刺激作用，即Akt活化。然而，用硬脂酸培養(yǎng)沒有顯示這樣的抑制作用(圖2a)。關于胰島素對IRS相關的磷酸化和IRS1相關的PI3K活化的刺激作用的下降之前已經(jīng)有報道13，15，20，這里，我們表明了棕櫚酸能夠單獨導致這種缺陷。我們在研究中的另外一個有趣發(fā)現(xiàn)是棕櫚酸誘導的抑制作用的范圍窄。Western雜交的光密度分析表明IRβ、PI3 K和Akt磷酸化的胰島素刺激的磷酸化水平下降了2倍(未顯示數(shù)據(jù))。胰島素和棕櫚酸對IRβ、PI3 K和Akt的蛋白質構型都沒有任何改變(圖2a)。我們的發(fā)現(xiàn)給出這樣的印象棕櫚酸對胰島素信號的干擾可能源于IR水平，隨后抑制波流經(jīng)下游的信號傳導分子。這限制了PI3激酶的募集，導致PIP3與Akt結合的抑制，這將對Glut4轉運產(chǎn)生負面影響。最后，Glut4易位支持了這一觀點，Glut4易位對葡萄糖進入細胞是必要的。胰島素誘導的GFP-Glut4從脂肪細胞的細胞質到細胞膜的易位完全被棕櫚酸所抑制(圖2b)。
在尋找具有抗糖尿病活性的印度藥用植物過程中，發(fā)現(xiàn)葛根根部的甲醇-水(1∶1)提取物改善了胰島素活性的棕櫚酸損傷，依據(jù)3T3L1細胞對3H-2DOG的吸收。使用Diaion HP-20色譜儀，我們獲得了5個餾分(A-E)，其中餾分E表現(xiàn)出所需要的活性。通過葡聚糖凝膠色譜儀LH20對E進行分離，得到3個餾分(F-H)，其中F表現(xiàn)出棕櫚酸誘導的損傷的改善。因此，餾分F經(jīng)HPLC純化得單一分子，經(jīng)二維核磁共振和質譜分析被確認為Lupinoside PA432(圖3a)。LPA4對棕櫚酸誘導的胰島素傳導分子損傷的保護性在3T3L1脂細胞中進行了檢驗。圖3b說明了LPA4能夠防止棕櫚酸誘導的脂細胞對胰島素刺激的3H-2DOG吸收減少。棕櫚酸對胰島素刺激的IRβ酪氨酸磷酸化和Akt磷酸化的減弱作用被LPA4解除(圖3c)。已知Akt是一種非常重要的下游信號，它激活Glut4的過程對Gult4易位到胰島素靶細胞的細胞膜是必需的33,34。在響應胰島素時，Akt2被聚集到含有載體的Glut4上并對組成蛋白質進行磷酸化35。因此，LPA4在免除棕櫚酸誘導的對胰島素刺激的Akt磷酸化的抑制作用是非常有意義的，因為這個途徑的損傷導致了胰島素抗性。這一點通過我們對Glut4易位中棕櫚酸抑制的胰島素刺激的觀察而得到進一步支持。LPA4與棕櫚酸的共培養(yǎng)允許胰島素刺激GFP-Glut4從細胞質易位到細胞膜(圖3d)。Glut4是胰島素響應細胞中至關重要的葡萄糖轉運體，它構成性的通過細胞表面循環(huán)。胰島素積極將Glut4隔離在細胞內部，增加了Glut4轉運到細胞膜的速度32。盡管Glut4轉運的細胞機制還有很大疑團，但是Glut4易位缺陷牽涉到胰島素抗性34。我們對GFP-Glut4易位的測定結果說明，棕櫚酸引起胰島素刺激的Glut4易位的完全阻斷，而LPA4則全部抵消了這種阻斷作用。這些結果在胰島素抗性或2型糖尿病中顯得特別有趣，因為(i)大量研究表明游離脂肪酸，特別是棕櫚酸，在胰島素抗性的形成中的作用20-23；(ii)棕櫚酸是循環(huán)系統(tǒng)和骨骼肌細胞中發(fā)現(xiàn)最多的游離脂肪酸10，12；(iii)液體提取物的甘油二酯餾分中最普遍的酰基鏈是棕櫚酸36；(iv)棕櫚酸的消耗降低了胰島素的敏感性37，38；和(v)胰島素抗性肌肉表現(xiàn)出對棕櫚酸更高速率的吸收39。所有這些報道都關注棕櫚酸是導致胰島素抗性的主要游離脂肪酸。然而，有幾項研究表明棕櫚酸誘導的胰島素作用缺陷是由神經(jīng)酰胺介導的12?？赡艽嬖诙喾N有效的胰島素失效途徑，神經(jīng)酰胺可能是其中一種，而我們所觀察到的是另外一種，其中棕櫚酸直接導致胰島素無作用。LPA4免除了棕櫚酸引起的胰島素失效。由于LPA4在所有重要階段防止了緣于棕櫚酸的胰島素信號傳導缺陷，包括Glut4從細胞質易位到細胞膜的階段，這樣的Luponoside極具作為胰島素抗性和2型糖尿病治療劑的可能性。


圖1.(a)棕櫚酸誘導的對胰島素與受體結合和受體酪氨酸激酶磷酸化的抑制作用。放射性標記胰島素和棕櫚酸結合溶解的胰島素受體制劑的放射自顯影。3T3 L1脂細胞在不存在或存在棕櫚酸條件下培養(yǎng)24小時，受體制劑用0.1％的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)溶解。25μg蛋白與2ng125I-胰島素(特異活性30.55μCi/μg蛋白)4℃培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)結束后，105g下高速離心1小時進行壓片，125I-胰島素必然成為溶解的受體制劑。胰島素受體制劑和125I-胰島素在冷的棕櫚酸(PA)或硬脂酸(SA)存在下以相同方式培養(yǎng)。溶解的受體制劑中的25μg蛋白與[1-14C]-棕櫚酸于4℃培養(yǎng)過夜后進行放射自顯影(14C-PA)。
(b)通過Scatchard分析來確定結合親和力和受體占據(jù)量。計算胰島素結合溶解受體的最大結合量(Bmax)和Ka分別為7.3pM和0.16×1010M-1。但是，當存在棕櫚酸時，胰島素結合的Ka幾乎保持不變，即為0.158×1010M-1，而Bmax降低為3.46pM。
(c)(i)展示了胰島素受體三個結構域(L1-富含半胱氨酸-L2)的同源模擬。由氰基標記的L1結構域是最可能的胰島素結合位點。結合常數(shù)降低300倍的丙氨酸突變殘基用紅色標記；結合常數(shù)降低10-100倍的突變用粉色標記，其余結合降低3-9倍的用黃色標記。半胱氨酸殘基用綠色標記，其Cys-8&Cys-26(在紅圈內標記為ii)和Cys-266&Cys-274(在紅圈內標記為iii)是最可能的棕櫚酸?；稽c。(ii)和(iii)顯示了兩個可能的半胱氨酸對Cys-8&Cys-26和Cys-266&Cys-274的周圍靜電勢，由于具有優(yōu)勢的正向靜電勢(藍色)和中性靜電勢(白色)環(huán)境，Cys-8&Cys-26和Cys-266&Cys-274被選為棕櫚酸?；稽c。(iv)顯示了Cys-192&Cys-201的靜電勢環(huán)境，盡管具有正確的(正向或中性)環(huán)境，但因其完全包埋在表面之下而沒有被選為潛在的?；稽c。(v)顯示了Cys-126&Cys-155周圍的靜電勢，代表了那些主要是負電的放棄位點(紅色)。
(d)對照和游離脂肪酸處理的3T3L1脂肪細胞在裂解緩沖液中超聲裂解，10000g離心10分鐘，從對照和被處理細胞中取200μg上清蛋白，加入2μgIRβ抗體，4℃培養(yǎng)過夜?？乖贵w復合物與蛋白A-瓊脂糖一起沉淀，充分洗滌沉淀，懸浮于SDS-PAGE樣品緩沖液中并煮沸，電泳。將凝膠中的蛋白轉到PVDF膜，與抗p-Tyr抗體免疫印跡。I-胰島素；P-棕櫚酸；S-硬脂酸。
圖2.(a)3T3L1與棕櫚酸和硬脂酸共培養(yǎng)，如圖1描述。培養(yǎng)結束時，在裂解緩沖液中超聲裂解細胞，10000g離心10分鐘。上清液蛋白(各50μg)于SDS-PAGE樣品緩沖液中煮沸5分鐘，12％膠濃度的SDS-PAGE電泳，轉PVDF膜，使用堿性磷酸酶偶聯(lián)的二抗與p-IRS-1(1∶1000)、p-PI3激酶p 85α(1∶1000)和p-Akt 1/2(1∶1000)抗體進行免疫測定?？笽RS 1、PI-3K和Akt 1/2的抗體被用來檢測緣于處理的蛋白結構。
(b)棕櫚酸對胰島素的作用誘導了Glut4在3T3L1脂肪細胞中的易位。涂布于蓋玻片上的3T3L1細胞經(jīng)GFP-Glut4質粒(2μg)轉染48小時，使用lipofectamine試劑。穩(wěn)定，細胞在存在或缺乏棕櫚酸條件下培養(yǎng)24小時，然后用胰島素培養(yǎng)30分鐘。在缺乏脂肪酸條件下培養(yǎng)經(jīng)GFP-Glut4轉染的細胞，胰島素作為對照(Con)。培養(yǎng)結束后，使用激光掃描聚焦顯微鏡檢查GFP-Glut4的位置。
圖3.(a)LPA4的結構和純化。使用Diaion HP-20色譜儀，獲得五個餾分(A-E)，其中餾分E表現(xiàn)出所需要的活性。通過葡聚糖凝膠Sephadex LH 20色譜儀對E進行分級分離，生成3個餾分(F-H)，其中F顯示了對棕櫚酸誘導的受損胰島素活性的改善。餾分F隨后經(jīng)HPLC純化成單一分子，通過2D NMR和質譜確定為Lupinoside PA432。
(b)在棕櫚酸或棕櫚酸加LPA4或LPA4存在下對脂肪細胞處理24小時，隨后用胰島素培養(yǎng)30分鐘。培養(yǎng)結束前5分鐘加入3H-脫氧葡萄糖。用冰預冷的含有0.3mM 2-對羥苯丙酰基-1，3，5-苯三酚(phloretin)的KRP(克-林二氏磷酸鹽)緩沖液洗滌細胞三次，目的是校正從單純擴散和非特異性的放射性捕獲中得來的葡萄糖吸收數(shù)據(jù)。用1％NP-40溶解細胞，并在液體閃爍計數(shù)器中計算放射活性。
(c)在不含棕櫚酸或棕櫚酸加LPA4或LPA4條件下培養(yǎng)3T3L1脂細胞24小時，隨后用胰島素培養(yǎng)30分鐘。每種條件下都取50μg細胞裂解液進行變性凝膠電泳，轉PVDF膜，與抗P-Akt抗體免疫印跡。50μg細胞裂解液與抗IR3抗體免疫沉淀并與抗p-Tyr抗體免疫印跡。
(d)以圖2b描述的相同方式來確定被處理細胞的Glut4易位。
方法細胞培養(yǎng)和處理3T3L1細胞系從國家細胞科學中心(Pune，印度)獲得，并在37℃、95％O2/5％CO2條件下培養(yǎng)于含有25mM葡萄糖和10％胎牛血清的達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)中。本文任何地方提到的融合細胞都經(jīng)過0.75mM游離脂肪酸(FFAs，棕櫚酸和硬脂酸)處理24小時。
放射性標記胰島素結合溶解的受體制劑對照和游離脂肪酸處理的3T3L1脂細胞首先用0.02M含有0.14MNaCl的磷酸鹽緩沖液(pH-7.4)洗滌三次，然后懸浮于裂解緩沖液(20mMTris-HCl，40mM NaCl，5mM EDTA，5mM碘乙酰胺，pH-8.4)，裂解緩沖液中添加了蛋白酶抑制劑(1μg/ml抑肽酶，1μg/ml抑肽素，1μg/ml亮肽素，2mM苯甲基硫酰氟化物和1μg/ml胰島素抑制劑)。然后，這些細胞于-70℃冷凍-溶解三次，4℃下10000rpm離心15分鐘。收集的沉淀懸浮于裂解緩沖液，超聲處理，再次于4℃下10000rpm離心15-20分鐘。上清液于10mM Tris-HCl(pH-7.4)緩沖液中透析過夜，冷凍干燥減小溶液體積。然后，將膜制劑與0.1M二碘水楊酸鋰混合至膜蛋白濃度約為5mg/ml，混合物經(jīng)電動玻璃-聚四氟乙烯樹脂組織勻漿器勻漿處理，35000g離心20分鐘，上清液于20mM、pH-9.4的碳酸氫鈉溶液中透析12小時。在勻速攪拌下在該溶液中加入0.1％TritonX-100(v/v)和25％甘油。經(jīng)冷凍干燥來減小溶液體積，于10mM Tris-HCl緩沖液(pH-8.4)中透析。重組人胰島素經(jīng)125I放射性標記，使用葡聚糖凝膠柱Sephadex-G15分離游離碘中的125I-胰島素，凝膠柱經(jīng)含有0.14M NaCl和1％(w/v)BSA的0.01M磷酸鹽緩沖液(pH-7.2)平衡處理。125I-胰島素的放射比活性是30.55μCi/μg蛋白。
對照和游離脂肪酸處理的3T3L1脂肪細胞(每次培養(yǎng)25μg)的溶解的胰島素受體制劑，用終體積為500μl的含有125I標記的重組人胰島素2ng的0.02M磷酸緩沖液(含有0.15M NaCl和0.25％BSA(PBS))于4℃下培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)結束后，經(jīng)105g高速離心(Sorvall Ultra-80)沉淀1小時。每個離心管中的沉淀溶解于1X樣品緩沖液(63mMTris-HCl pH6.8，10％甘油，2％SDS，and 0.025％溴酚藍)，進行非變性SDS-PAGE(4％濃縮膠鋪于6.5％分離膠上)。制干膠，Kodak X-OMATAR放射自顯影(參見圖1a)。
Scatchard分析為確定125I-胰島素與受體蛋白的最佳結合條件，結合培養(yǎng)以不同的溫度和時間周期進行，同時改變溶解的受體制劑量。結果發(fā)現(xiàn)，在pH8.4和4℃下過夜培養(yǎng)產(chǎn)生最大量的放射性標記胰島素結合。受體制劑(15μg蛋白)4℃下于終體積為500μl的緩沖液(0.02M磷酸鹽緩沖液，pH8.4，含有0.15M NaCl和0.25％BSA(PBS))中培養(yǎng)過夜，在不含未標記胰島素(總結合)或含有10000倍過量的未標記胰島素(非特異結合)條件下，具有變化的125I-胰島素濃度(0.18-0.72nmoles/L)。另一組實驗中，受體制劑同時與125I-胰島素和未標記的胰島素(而不含0.08mM未標記的棕櫚酸)進行培養(yǎng)。培養(yǎng)結束后，加入500μl預冷的0.5％聚乙二醇(PEG，分子量6000)來分離游離的和結合的放射活性。樣品經(jīng)渦旋振蕩充分混合，冰浴10分鐘，冷凍離心機20000g離心15分鐘。吸出上清液，洗滌緩沖液(0.02M磷酸鹽緩沖液，含有0.15M NaCl和0.25％BSA)洗滌沉淀三次。125I-γ計數(shù)器檢測最終沉淀的放射活性。通過從總結合中減去非特異性結合來計算特異性結合。然后用Scatchard分析數(shù)據(jù)，來確定在含有或不含棕櫚酸條件下胰島素受體結合的親和力和結合量(參見圖1b)。
分子模擬通過使用InsightII 98.0(Accelrys Inc.，San Diego，CA，USA)，在IGF-1R的X射線衍射結構之上(PDBlIGR.ENT，具有59％的氨基酸一致性)建立了胰島素受體的同源模擬。在Silicon Graphics OCTANE工作站上，通過InsightII的DISCOVER模型，使用cff91力場進行能量最小化和分子動力。通過最陡下降法(steepest descent)和共軛梯度法(conjugate gradient)(每次100步)的結合運用，以0.001kcal/mol的收斂標準完成了能量最小化；重復這些步驟，直至得到滿意的結構參數(shù)。通過用于100步平衡(100 steps of equilibration)和1000步動力(1000steps of dynamics)的千萬億分之一秒的時間步長(time step)來進行分子動力模擬。在運行最小化和動力對選擇部分進行調整時，對分子的其他部分進行距離限制(參見圖1c)。
免疫沉淀200μg對照和游離脂肪酸處理的細胞裂解物(于裂解緩沖液[1％NP-40，20mM HEPES(pH 7.4)，2mM EDTA，100mM NaF，10mM焦磷酸鈉，1mM原釩酸鈉，1μg/ml亮肽素，1μg/ml抑肽酶，1μg/ml抑肽素和1mM PMSF]冰浴超聲處理10分鐘)與2μg胰島素受體β抗體于4℃下培養(yǎng)過夜。每管加入50μl蛋白A-瓊脂糖，4℃下培養(yǎng)2小時。4℃下10000g離心2分鐘，沉淀加入500μl含0.1％CHAPS的PBS溶液，懸浮后于4℃下10000g離心2分鐘。沉淀經(jīng)充分洗滌后進行SDS-PAGE，然后用抗磷酸酪氨酸抗體進行Western雜交(抗鼠；1∶1000)(參見圖1d)。
電泳和免疫雜交對照和處理的細胞裂解物(60g)在10％SDS-PAGE上分離，4℃、90V條件下于轉移緩沖液(25mM Tris，193mm甘氨酸，20％甲醇，pH8.5)中轉PVDF膜(Millipore，Bedford，MA 01730)1.5小時。用含有5％脫脂奶粉的TBST緩沖液(20mM Tris堿，137mM NaCl，1mM HCl，0.1％吐溫20)封閉膜，與抗p-IRS(抗羊；1∶1000)、p-PI3K(抗羊；1∶1000)和p-Akt(抗兔；1∶2000)培養(yǎng)過夜。用聯(lián)有二抗的堿性磷酸酶檢測免疫反應條帶(參見圖2a)。
轉染和Glut4易位將3T3L1細胞涂布于含有coverslips的60mm平皿中，在添加了10％(v/v)FBS和100μg/ml青霉素/鏈霉素的DMEM中通氣(空氣/CO2(19∶1))培養(yǎng)。24小時后，用不含F(xiàn)BS和抗生素的DMEM洗滌細胞。依照生產(chǎn)商(Life Technologies)的說明書，通過Lipofectamine試劑，用GFP-Glut4(2μg)的質粒DNA轉染2×105個細胞。轉染48小時后，細胞經(jīng)含有0.75mM棕櫚酸處理或不含棕櫚酸的處理24小時，然后在不含或含有100nM的胰島素條件下培養(yǎng)30分鐘。Coverslips上的細胞被固定于多聚甲醛(3.5％)中并涂布于載玻片。Coverslips于激光掃描聚焦顯微鏡下檢查GFP-Glut4的易位(Leica Corp.，Rockleigh，NJ)(參見圖2b)。
從葛根中提取和分離lupinoside PA4葛根的根部(1kg，切碎并用甲醇(3x1.5L)提取)。提取液經(jīng)真空干燥，得到90g殘渣，估測其生物活性。甲醇提取液被分入乙酸乙酯和水層。水層經(jīng)正丁醇進一步萃取。真空去除乙酸乙酯、正丁醇和水溶解部分的溶劑，分別生成2.5g、12g和64g餾分。檢測每一餾分的生物活性，發(fā)現(xiàn)正丁醇餾分中存在活性。將正丁醇餾分上Diaion HP-20色譜儀，以水和甲醇為洗脫劑。甲醇洗脫劑經(jīng)蒸發(fā)至干品(2.4g)，進一步上Sephadex LH-20色譜儀，使用甲醇-水(1∶1)和甲醇為洗脫劑。甲醇-水餾分經(jīng)減壓蒸發(fā)生成表現(xiàn)出生物活性的固體(1.4g)。該固體經(jīng)制備型HPLC(μ-Bondapak C-18反向柱，甲醇-1％含水(1％)乙酸(7∶3)，流速12mm/min，紫外檢測器，檢測波長210nm)，得到單一化合物，確認為lupinoside PA4(L PA4)32(0.28g)，經(jīng)1D，2D NMR和Q-TOF-MS以及其他化學反應確定了其化學結構(參見圖3a)。
LPA4對棕櫚酸誘導的葡萄糖吸收抑制的治療效果3T3L1脂細胞在不含和含有LPA4(2011g/ml)和棕櫚酸(0.75mM)的條件下被處理24小時，接著用含有100nM胰島素并添加了0.2％牛血清蛋白的Kreb′s Ringer Phosphate(KRP)緩沖液(12.5mM HEPES，pH7.4，120mM NaCl，6mM KCl，1.2mM MgSO4，1mM CaCl2，0.4mMNaH2PO4，0.6mM Na2HPO4)培養(yǎng)30分鐘，在培養(yǎng)結束前5分鐘于各培養(yǎng)液中加入3H-2-DOG(0.4nmoles)。3T3L1細胞經(jīng)冰預冷的含有0.3mM根皮素的KRP緩沖液洗滌三次，來校正從簡單擴散和非特異性放射性捕獲而獲得的葡萄糖吸收數(shù)據(jù)。細胞溶解于1％NP-40，用液體閃爍計數(shù)器檢測(Packard，Tricarb 2100 TR)[3H]-脫氧葡萄糖(參見圖3b)。
在不含或含有LPA4和棕櫚酸條件下，采用同樣方法培養(yǎng)的3T3L1細胞經(jīng)超聲裂解，如上述方法檢測裂解液中p-IR和p-Akt(參見圖3c)。
在另一組實驗中，細胞被上述GFP-Glut4轉染后，經(jīng)不含或含有LPA4和棕櫚酸條件下培養(yǎng)24小時。然后，細胞經(jīng)100nM胰島素培養(yǎng)，聚焦顯微鏡下監(jiān)測Glut4易位(參見圖3d)。
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權利要求
1.一種預防和/或治療2型糖尿病的方法，所述方法包括對受試者給入藥用有效量的植物葛根提取物或所述提取物的正丁醇餾分或Lupinoside A4(LPA4)，任選的與添加劑一起給藥。
2.權利要求1所述方法，其中所述受試者是動物。
3.權利要求1所述方法，其中所述受試者是人。
4.權利要求1所述方法，其中所述提取物是從所述植物根中獲得的。
5.權利要求1所述方法，其中所述添加劑選自諸如蛋白質、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鈣、淀粉、明膠糊的營養(yǎng)素，可藥用的載體、賦形劑、稀釋劑和溶劑。
6.權利要求1所述方法，其中所述餾分的給藥濃度為1-40mg/kg體重。
7.權利要求1所述方法，其中所述Lupinoside的給藥濃度為1-40mg/kg體重。
8.權利要求1所述方法，其中給藥途徑選自口服、靜脈注射、肌肉注射和皮下給藥。
9.用于預防和/或治療2型糖尿病的藥物組合物，所述組合物包括植物葛根提取物或所述提取物的正丁醇餾分或Lupinoside A4(LPA4)，和一種或多種添加劑。
10.權利要求9所述藥物組合物，其中所述添加劑選自諸如蛋白質、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鈣、淀粉、明膠糊的營養(yǎng)素，可藥用的載體、賦形劑、稀釋劑和溶劑。
11.權利要求9所述藥物組合物，其中所述提取物是從所述植物的根中獲得的。
12.權利要求9所述藥物組合物，其中所述餾分的濃度范圍為1-40mg/kg體重。
13.權利要求9所述藥物組合物，其中所述Lupinoside的濃度范圍為1-40mg/kg體重。
14.權利要求9所述藥物組合物，其中所述組合物的劑型選自膠囊、糖漿、濃縮劑、粉末和顆粒。
15.權利要求9所述藥物組合物，其中所述提取物是水提取物。
16.一種增強Glut4磷酸化和Glut4易位到靶細胞膜來增強受試者體內信號傳導途徑中胰島素信號的方法，所述方法包括為受試者給入藥用有效量的植物葛根提取物或所述提取物的正丁醇餾分或Lupinoside A4(LPA4)，任選的與添加劑一起給藥。
17.權利要求16所述方法，其中受試者是動物。
18.權利要求16所述方法，其中所述受試者是人。
19.權利要求16所述方法，其中所述提取物是從所述植物根中獲得的。
20.權利要求16所述方法，其中所述添加劑選自諸如蛋白質、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鈣、淀粉、明膠糊的營養(yǎng)素，可藥用的載體、賦形劑、稀釋劑和溶劑。
21.權利要求16所述方法，其中所述餾分的給藥濃度為1-40mg/kg體重。
22.權利要求16所述方法，其中所述Lupinoside的給藥濃度為1-40mg/kg體重。
23.權利要求16所述方法，該方法幫助預防/治療2型糖尿病。
24.權利要求16所述方法，該方法顯示細胞對葡萄糖吸收的提高。
25.權利要求16所述方法，該方法對細胞是非毒性的。
26.權利要求16所述方法，其中所述易位是從胰島素響應細胞的細胞質到細胞膜。
27.權利要求16所述方法，其中所述Lupinoside A4(LP4)預防棕櫚酸誘導的胰島素信號傳導缺陷。
28.權利要求16所述方法，其中所述Lupinoside A4(LP4)使胰島素能夠刺激IRβ和Akt磷酸化。
29.一種簡單、廉價的獲得植物葛根提取物和隨后選擇性獲取其活性正丁醇餾分和活性分子Lupinoside PA(LPA4)用于預防和/或治療2型糖尿病的方法，所述方法包括如下步驟a)將植物部分切成小塊，b)用甲醇和水提取切后的小塊，c)將甲醇和水提取物在乙酸乙酯和水之間分層，d)用正丁醇進一步萃取水層來獲得丁醇餾分，和e)用水和甲醇作為洗脫液將正丁醇餾分進行層析來獲取Lupinoside PA4(LPA4)。
30.權利要求29所述方法，其中所述植物部分是根。
31.權利要求29所述方法，其中所述溶劑選自甲醇和水。
32.權利要求29所述方法，其中水和甲醇的比例是1∶1。
33.權利要求29所述方法，其中所述色譜分離是柱層析。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種預防和/或治療2型糖尿病的方法，同時，本發(fā)明涉及一種增強葡萄糖轉運蛋白Glut4的磷酸化和Glut4易位到靶細胞膜來增強信號傳導途徑中胰島素信號的方法；另外，本發(fā)明涉及一種簡單、廉價的方法來獲得提取物并選擇性獲取其活性正丁醇餾分和活性分子Lupinoside PA(LPA
文檔編號A61K36/488GK1997379SQ200480042340
公開日2007年7月11日 申請日期2004年12月27日 優(yōu)先權日2004年1月9日
發(fā)明者S·巴哈塔查亞, D·戴伊, S·K·曼達爾, M·慕克吉, B·C·帕爾, T·比斯瓦, M·達塔, S·S·羅伊, A·班底奧帕迪亞伊, S·班多帕迪亞伊, A·庫納爾, B·B·吉芮 申請人:科學與工業(yè)研究委員會