專利名稱：促血管化的組織工程骨及其體外構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種骨組織的生物替代物即組織工程骨，具體來說是促血管化處理的組織工程骨以及體外構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
由于因創(chuàng)傷或骨病所致的骨缺損在骨科臨床十分常見，而現(xiàn)有治療手段均存在明顯缺陷，使得近年來應(yīng)用組織工程學(xué)技術(shù)修復(fù)骨缺損的研究進(jìn)展迅速。自1993年Vacanti等利用牛成骨細(xì)胞與聚羥基乙酸構(gòu)建組織工程化骨以來，對骨組織工程中的種子細(xì)胞、支架材料、生長因子、培養(yǎng)條件、體內(nèi)修復(fù)等實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的研究已經(jīng)取得階段性成果，Quarto、楊志明等將此技術(shù)試用于臨床，獲得初步成功。組織工程骨的構(gòu)建基本方法為將體外培養(yǎng)的種子細(xì)胞-成骨細(xì)胞復(fù)合接種到作為細(xì)胞外基質(zhì)的支架材料上，經(jīng)過體內(nèi)或體外培養(yǎng)構(gòu)建成組織工程骨，植入體內(nèi)進(jìn)行骨缺損的修復(fù)。
骨缺損的良好修復(fù)必須依賴充分的血供，新生血管不僅是氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)及代謝廢物運(yùn)輸?shù)耐ǖ溃沂菂⑴c骨修復(fù)調(diào)控的細(xì)胞、信號分子通過的重要路徑，即血管化和骨再生是骨愈合過程中的兩個最基本環(huán)節(jié)。體外構(gòu)建的組織工程化骨，植入體內(nèi)后同樣必須迅速建立充分的血供，為種子細(xì)胞功能活動提供充足的營養(yǎng)，只有這樣才能保證組織工程化骨的活性和促進(jìn)骨缺損修復(fù)，這在完成較大骨缺損修復(fù)時顯得尤為重要。
目前促人工骨血管化的技術(shù)措施主要有6種。①用血管束包裹復(fù)合成骨細(xì)胞的可降解支架材料，新血管以枝芽方式長入材料內(nèi)；②將人工骨植入帶有軸心血管的肌肉組織內(nèi)，預(yù)構(gòu)帶血管蒂的組織工程化骨肌骨瓣；③植入組織工程化骨時，就近選擇帶血管蒂的筋膜瓣包裹移植物；這些是借用體內(nèi)已經(jīng)存在的血管條件來促進(jìn)人工骨的血管化，存在增加創(chuàng)傷、受局部血管條件限制等缺點(diǎn)，從而限制了其臨床推廣應(yīng)用。④血管內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合成骨細(xì)胞與支架材料復(fù)合；存在自體血管內(nèi)皮細(xì)胞不易獲取、體外擴(kuò)增能力有限的不足。⑤應(yīng)用促血管生成的生長因子，如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)，采用均勻吸附于支架材料內(nèi)的生長因子緩釋技術(shù)，或者通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)促進(jìn)細(xì)胞分泌；這類方法也存在缺點(diǎn)，如由于生長因子對血管生成的作用是網(wǎng)絡(luò)式的序貫作用，單一因子低濃度作用效果是有限的，而高濃度VEGF作用有誘發(fā)血管瘤的危險。⑥嘗試上述方法的聯(lián)合應(yīng)用。所以，上述六種仍然不能獲得令人滿意的人工骨的血管化效果。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有的組織工程化骨促血管化技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種新的促血管化的組織工程骨，這種組織工程骨移植后具有持續(xù)、局限和緩慢釋放促血管生長因子，實(shí)現(xiàn)血管生成與骨再生的同時快速啟動，從而明顯加速骨愈合的優(yōu)點(diǎn)。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案在體外構(gòu)建的組織化工程骨上有多個孔隙，在孔隙內(nèi)有嵌有膠原凝膠，在膠原凝膠中含有促血管生成的生長因子。
所述的促血管生成的生長因子可以采用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，在膠原凝膠中的重量含量為50～200μg/ml。
所述的膠原凝膠中的還可以含有10～100μg/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長因子，與所述的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子形成雙生長因子共同作用，比采用單一的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子能夠更好的促進(jìn)血管組織的生成。
在膠原凝膠中還可以含有400～2000U/ml的肝素(U醫(yī)學(xué)上常用的標(biāo)準(zhǔn)單位，125U相當(dāng)于1mg的劑量)，作為緩釋劑控制生長因子釋放速率，根據(jù)需要通過采用不同的肝素用量以方便地設(shè)計(jì)血管組織的生成速率。
所述的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子在膠原凝膠中的最佳含量為100μg/ml。
所述的堿性成纖維細(xì)胞生長因子在膠原凝膠中的最佳含量為50μg/ml。
所述的肝素在膠原凝膠中的最佳含量為500U/ml。
本發(fā)明還提供了這種促血管化的組織工程骨的體外構(gòu)建方法，包括(1)體外制備用于組織構(gòu)建的支架材料制備用于組織工程骨構(gòu)建的支架材料，在將復(fù)合生長因子的部位預(yù)留多個孔隙；(2)組織工程骨的體外構(gòu)建將體外大量擴(kuò)增的相應(yīng)種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合，然后在體外靜態(tài)或動態(tài)培養(yǎng)一定時間，得到組織工程化骨組織；
(3)生長因子的緩釋處理將促血管生成的生長因子復(fù)合入膠原凝膠中；(4)生長因子的嵌入將含有生長因子的多塊凝膠嵌入體外構(gòu)建的組織工程化骨組織的預(yù)留孔隙中。
上述方法中，所述的促血管生成的生長因子可以為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，其在膠原凝膠中的含量為50～200μg/ml；或血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子混合成的雙生長因子，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子在膠原凝膠中含量為50～200μg/ml，堿性成纖維細(xì)胞生長因子在膠原凝膠中的含量為10～100μg/ml。
在所述的膠原凝膠中還可以含有400～2000U/ml的肝素。
上述方法中，所述的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子在膠原凝膠中的最佳含量為100μg/ml。
上述方法中，所述的堿性成纖維細(xì)胞生長因子在膠原凝膠中的最佳含量為50μg/ml。
上述方法中，所述的肝素在膠原凝膠中的最佳含量為500U/ml。
本發(fā)明的促血管化的組織工程骨由于在組織化工程骨的一些局部區(qū)域孔隙內(nèi)復(fù)合有促血管生成的生長因子，具有如下有益效果(1)生長因子在組織工程骨中復(fù)合的區(qū)域?yàn)槎帱c(diǎn)的局部方式，避免了均勻復(fù)合時對組織工程骨中成骨反應(yīng)的不利影響。
(2)當(dāng)將堿性成纖維細(xì)胞生長因子引入時，使其與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子聯(lián)合應(yīng)用，協(xié)調(diào)促進(jìn)血管生成，避免了單一因子劑量過低時療效不足，而劑量過高時并發(fā)癥較多的缺陷。
(3)膠原凝膠即作為生長因子的載體，同時作為緩釋材料，延長了生長因子局部釋放和作用時間，當(dāng)膠原凝膠中還復(fù)合有作為緩釋劑的肝素時，通過肝素用量的變化可以更加方便地設(shè)計(jì)生長因子局部釋放和作用的時間，使血管組織更好的生長。
(4)應(yīng)用本發(fā)明的血管化的組織工程骨的構(gòu)建方法，使組織工程骨在體外構(gòu)建，與生長因子的局部復(fù)合方式結(jié)合，通過控制生產(chǎn)因子的局部濃度和復(fù)合位置，可以有效控制血管化的形成。
(5)同現(xiàn)有技術(shù)相比，通過該技術(shù)構(gòu)建的血管化組織工程骨在移植時對患者創(chuàng)傷反應(yīng)小，不損傷局部的其它重要血管。
(6)組織工程骨在移植后，隨著組織修復(fù)改建的完成，局部血管在初期大量增加后，可以在后期逐漸減少，從而與局部組織功能相協(xié)調(diào)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的促血管化的組織工程骨及其體外構(gòu)建方法作進(jìn)一步說明，以助于理解本發(fā)明的內(nèi)容。
實(shí)施例1(1)體外處理用于骨組織構(gòu)建的支架材料制備或購買成骨性支架材料(脫蛋白骨衍生材料、羥基磷灰石、磷酸三鈣等)，在將復(fù)合生長因子的部位鉆孔而預(yù)留多個孔隙，孔隙直徑為2～8mm；(2)組織工程骨的體外構(gòu)建利用現(xiàn)有的組織工程技術(shù)將體外大量擴(kuò)增的相應(yīng)種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合，然后利用已有技術(shù)在體外靜態(tài)或動態(tài)培養(yǎng)一定時間，得到組織工程化骨組織；
(3)生長因子的緩釋處理將血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子與肝素按調(diào)和，然后復(fù)合入膠原凝膠中，使復(fù)合后的膠原凝膠中生長因子及肝素的含量為VEGF100μg/ml、bFGF50μg/ml、肝素500U/ml；(4)生長因子的嵌入將含有生長因子的多塊凝膠嵌入體外構(gòu)建的組織工程化骨組織的預(yù)留孔隙中。
實(shí)施例2(1)體外制備用于組織構(gòu)建的支架材料制備用于組織工程骨構(gòu)建的支架材料，在將復(fù)合生長因子的部位鉆孔而預(yù)留多個孔隙，孔隙直徑為2～8mm；(2)組織工程骨的體外構(gòu)建將體外大量擴(kuò)增的相應(yīng)種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合，然后在體外靜態(tài)或動態(tài)培養(yǎng)一定時間，得到組織工程化骨組織；(3)生長因子的緩釋處理將血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子與肝素按調(diào)和，然后復(fù)合入膠原凝膠中，使膠原凝膠中生長因子及肝素的含量為VEGF200μg/ml、bFGF10μg/ml、肝素400U/ml；(4)生長因子的嵌入將含有生長因子的多塊凝膠嵌入體外構(gòu)建的組織工程化骨組織的預(yù)留孔隙中。
實(shí)施例3(1)體外制備用于組織構(gòu)建的支架材料制備用于組織工程骨構(gòu)建的支架材料，在將復(fù)合生長因子的部位鉆孔而預(yù)留多個孔隙，孔隙直徑為2～8mm；(2)組織工程骨的體外構(gòu)建將體外大量擴(kuò)增的相應(yīng)種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合，然后在體外靜態(tài)或動態(tài)培養(yǎng)一定時間，得到組織工程化骨組織；(3)生長因子的緩釋處理將血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子與肝素按調(diào)和，然后復(fù)合入膠原凝膠中，使膠原凝膠中生長因子及肝素的含量為VEGF200μg/ml、bFGF100μg/ml、肝素2000U/ml；(4)生長因子的嵌入將含有生長因子的多塊凝膠嵌入體外構(gòu)建的組織工程化骨組織的預(yù)留孔隙中。
實(shí)施例4(1)體外制備用于組織構(gòu)建的支架材料制備用于組織工程骨構(gòu)建的支架材料，在將復(fù)合生長因子的部位鉆孔而預(yù)留多個孔隙，孔隙直徑為2～8mm；(2)組織工程骨的體外構(gòu)建將體外大量擴(kuò)增的相應(yīng)種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合，然后在體外靜態(tài)或動態(tài)培養(yǎng)一定時間，得到組織工程化骨組織；(3)生長因子的緩釋處理將血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子與肝素按調(diào)和，然后復(fù)合入膠原凝膠中，使膠原凝膠中生長因子及肝素的含量為VEGF50μg/ml、bFGF30μg/ml、肝素600U/ml；(4)生長因子的嵌入將含有生長因子的多塊凝膠嵌入體外構(gòu)建的組織工程化骨組織的預(yù)留孔隙中。
將實(shí)施例1～4中的組織工程骨移植入兔尺骨中段或羊脛骨中段骨缺損區(qū)域，經(jīng)過術(shù)后3天、2周、4周、12周、18周的X線攝片、和移植區(qū)域的病理組織分析、血管灌注實(shí)驗(yàn)等，發(fā)現(xiàn)術(shù)后2周內(nèi)大量的具有血管內(nèi)皮細(xì)胞表型的細(xì)胞聚集在膠原凝膠區(qū)域，并產(chǎn)生大量的網(wǎng)狀血管，術(shù)后4～12周血管直徑增大，但數(shù)量逐漸減少，術(shù)后12～18周該區(qū)域的血管分布與鄰近的組織無明顯差異；復(fù)合促血管生成物質(zhì)的組織工程骨與單一的組織工程骨比較骨修復(fù)效果，可見前者在術(shù)后2周時成骨活動就比后者強(qiáng)，術(shù)后4周開始其骨痂和骨修復(fù)效果均優(yōu)于移植單一的組織工程骨。
實(shí)施例5(1)體外處理用于骨組織構(gòu)建的支架材料制備或購買成骨性支架材料(脫蛋白骨衍生材料、羥基磷灰石、磷酸三鈣等)，在將復(fù)合生長因子的部位鉆孔而預(yù)留多個孔隙，孔隙直徑為2～8mm；(2)組織工程骨的體外構(gòu)建利用現(xiàn)有的組織工程技術(shù)將體外大量擴(kuò)增的相應(yīng)種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合，然后利用已有技術(shù)在體外靜態(tài)或動態(tài)培養(yǎng)一定時間，得到組織工程化骨組織；(3)生長因子的緩釋處理將血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子復(fù)合入膠原凝膠中，使復(fù)合后的膠原凝膠中生長因子的含量為200μg/m；(4)生長因子的嵌入將含有生長因子的多塊凝膠嵌入體外構(gòu)建的組織工程化骨組織的預(yù)留孔隙中。
實(shí)施例6
(1)體外處理用于骨組織構(gòu)建的支架材料制備或購買成骨性支架材料(脫蛋白骨衍生材料、羥基磷灰石、磷酸三鈣等)，在將復(fù)合生長因子的部位鉆孔而預(yù)留多個孔隙，孔隙直徑為2～8mm；(2)組織工程骨的體外構(gòu)建利用現(xiàn)有的組織工程技術(shù)將體外大量擴(kuò)增的相應(yīng)種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合，然后利用已有技術(shù)在體外靜態(tài)或動態(tài)培養(yǎng)一定時間，得到組織工程化骨組織；(3)生長因子的緩釋處理將血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子調(diào)和，然后復(fù)合入膠原凝膠中，使復(fù)合后的膠原凝膠中生長因子的含量為VEGF100μg/ml、bFGF50μg/ml；(4)生長因子的嵌入將含有生長因子的多塊凝膠嵌入體外構(gòu)建的組織工程化骨組織的預(yù)留孔隙中。
將實(shí)施例5，6中的組織工程骨移植入兔尺骨中段骨缺損區(qū)域，經(jīng)過術(shù)后3天、2周、4周、12周、18周的X線攝片、和移植區(qū)域的病理組織分析、血管灌注實(shí)驗(yàn)等，發(fā)現(xiàn)其促經(jīng)血管生成的速度和微血管密度均低于實(shí)施1～4的效果，但是比未復(fù)合促血管生成生長因子的單一組織工程骨顯示出更強(qiáng)的促血管生成作用，當(dāng)大量提高血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的濃度后，則局部血管生成的質(zhì)量下降，有時可產(chǎn)生血管瘤、組織水腫等副作用。
權(quán)利要求
1.一種促血管化的組織工程骨，其特征在于在體外構(gòu)建的組織化工程骨上有多個孔隙，在孔隙內(nèi)嵌有膠原凝膠，在膠原凝膠中含有促血管生成的生長因子。
2.如權(quán)利要求1所述的促血管化的組織工程骨，其特征在于所述的膠原凝膠中含有的促血管生成的生長因子為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，其在膠原凝膠中的含量為50～200μg/ml。
3.如權(quán)利要求2所述的促血管化的組織工程骨，其特征在于在所述的促血管生成的生長因子還包括堿性成纖維細(xì)胞生長因子，其在膠原凝膠中的含量為10～100μg/ml。
4.如權(quán)利要求3所述的促血管化的組織工程骨，其特征在于所述的膠原凝膠中還含有400～2000U/ml的肝素。
5.如權(quán)利要求2或3或4所述的促血管化的組織工程骨，其特征在于所述的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子在膠原凝膠中的含量為100μg/ml。
6.如權(quán)利要求3或4所述的促血管化的組織工程骨，其特征在于所述的堿性成纖維細(xì)胞生長因子在膠原凝膠中的含量為50μg/ml。
7.如權(quán)利要求4所述的促血管化的組織工程骨，其特征在于所述的肝素在膠原凝膠中的含量為500U/ml。
8.一種權(quán)利要求1中所述的促血管化的組織工程骨的體外構(gòu)建方法，包括(1)體外制備用于組織構(gòu)建的支架材料制備用于組織工程骨構(gòu)建的支架材料，在將復(fù)合生長因子的部位預(yù)留多個孔隙；(2)組織工程骨的體外構(gòu)建將體外大量擴(kuò)增的相應(yīng)種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合，然后在體外靜態(tài)或動態(tài)培養(yǎng)一定時間，得到組織工程化骨組織；(3)生長因子的緩釋處理將促血管生成的生長因子復(fù)合入膠原凝膠中；(4)生長因子的嵌入將含有生長因子的多塊凝膠嵌入體外構(gòu)建的組織工程化骨組織的預(yù)留孔隙中。
9.如權(quán)利要求8所述的促血管化的組織工程骨的體外構(gòu)建方法，其特征在于所述的促血管生成的生長因子為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，其在膠原凝膠中的含量為50～200μg/ml；或血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子混合成的雙生長因子，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子在膠原凝膠中含量為50～200μg/ml，堿性成纖維細(xì)胞生長因子在膠原凝膠中的含量為10～100μg/ml。
10.如權(quán)利要求9所述的促血管化的組織工程骨的體外構(gòu)建方法，其特征在于在所述的膠原凝膠中還含有400～2000U/ml的肝素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型的促血管化的組織工程骨，在體外構(gòu)建的組織化工程骨上有多個孔隙，在孔隙內(nèi)有嵌有膠原凝膠，在膠原凝膠中含有50～200μg/ml的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、10～100μg/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長因子、400～2000U/ml的肝素。這種體外構(gòu)建的組織工程骨移植后在早期能夠促進(jìn)移植物內(nèi)和移植物周圍的血管生成，從而為骨再生創(chuàng)造有利條件，使骨愈合效果良好。
文檔編號A61L27/00GK1631455SQ200510002378
公開日2005年6月29日 申請日期2005年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月19日
發(fā)明者段小軍, 楊柳 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院