專利名稱：松果菊苷的制藥新用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種化合物的新制藥用途，特別涉及松果菊苷的新制藥用途。
背景技術：
肉蓯蓉(Herba Cistanches)為常用的傳統(tǒng)補益中藥，具有補腎陽、益精血、潤腸通便的功效。松果菊苷(圖1)是肉蓯蓉中含量較高的一種苯乙醇苷類化合物，在以管花肉蓯蓉(Cistanche tubulosa)為原料研制的國家級二類新藥苯乙醇總苷中其含量高達48％。因此進一步研究松果菊苷單體的活性具有重要的意義。
同時，松果菊苷可以是合成的或天然來源的，具體包括從玄參科、木犀科、唇形科、列當科、車前科、馬鞭草科、爵床科、鹿蹄草科等科的植物中提取分離得到的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于公開一種化合物的新制藥用途，特別涉及松果菊苷的新制藥用途。
松果菊苷是一種已知的具有藥物活性的物質，因此，可以按照常規(guī)的制劑方法，將其制備成臨床上可適用的任何一種藥劑，例如，片劑、膠囊劑、注射劑、口服液體制劑、顆粒劑等。
在制備上述制劑的過程當中，可以將松果菊苷與任何一種適用于制備成臨床藥劑的賦形劑混合使用，制備成藥物制劑。
對本發(fā)明藥物制劑的藥效學部分進行初步研究，結果表明松果菊能夠顯著改善小鼠的自主活動次數(shù)和滾筒運動的協(xié)調性；用松果菊苷和陽性藥金剛烷胺預處理后，和MPTP模型組相比能明顯的增加其活動次數(shù)和滾筒運動潛伏期。HPLC-EC實驗結果發(fā)現(xiàn)，給予松果菊苷和金剛烷胺預處理后，能夠改善紋狀體內DA的含量；而單用松果菊苷20mg/kg給藥組發(fā)現(xiàn)，可以增加正常大鼠的DA含量，并顯著性的降低DOPAC和HVA的含量，這些結果表明松果菊苷在行為學中的效應可能和改善MPTP損傷的C57小鼠紋狀體的DA水平有關；進一步研究表明松果菊苷還能顯著的增加DA/DOPAC和DA/HVA的比率，單用松果菊苷組更為顯著。用松果菊苷預處理后和模型組相比則能顯著增加黑質部位的多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量；給予MPTP后可看到黑質和紋狀體部位的TH含量均明顯降低，而給予松果菊苷預處理后則可以不同程度的增加TH含量，從而說明松果菊苷能夠保護MPTP誘導的黑質和紋狀體部位的多巴胺能神經(jīng)元的損傷。其他實驗表明，松果菊苷對腦缺血再灌注所致空間學習記憶障礙小鼠的學習記憶能具有明顯的改善作用；對腦神經(jīng)損傷所致小鼠空間學習記憶障礙有明顯的改善作用。
下述實驗例用于進一步說明本發(fā)明實驗例1松果菊苷抗帕金森病小鼠模型的神經(jīng)保護作用研究1材料1.1動物C57BL/6小鼠，雄性，體重20-25g，由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于室溫環(huán)境下，明暗周期12小時，自由進食，飲水不限。實驗前適應環(huán)境3天。隨機分六組，每組12只，分別為對照組、模型組(30mg/kgMPTP)、以及松果菊苷給藥組(10、50mg/kg)+MPTP、陽性藥金剛烷胺組(40mg/kg)+MPTP以及單用松果菊苷組(50mg/kg)。連續(xù)灌胃給藥14天，于第11天開始灌胃給藥前1小時腹腔注射MPTP 30mg/kg(對照組和單用松果菊苷組給予等體積的生理鹽水)，連續(xù)4天，最后一次給藥后1天，進行行為學指標測試，3天后脫頸處死測定多巴胺遞質含量以及免疫組化染色。
1.2松果菊苷松果菊苷(echinacoside)由北京華醫(yī)神農醫(yī)藥科技有限公司自制，純度達到90％以上。
1.3試劑1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)，多巴胺(DA)，3，4-二羥苯乙酸(DOPAC)，高香草酸(HVA)，均為Sigma公司產品。辛烷基磺酸鈉(SOS)，高氯酸(AR)，半胱氨酸(AR)，Na2EDTA(AR)，檸檬酸(AR)，無水乙酸鈉(AR)，磷酸氫二鈉(AR)，檸檬酸鉀(AR)，三乙胺(AR)，甲醇(AR)等試劑均由北京大學醫(yī)學部供應科提供。酪氨酸羥化酶(Tyroxinehydroxylase，TH)的多克隆抗體由美國Chemicon International公司提供，HistostainTM-SP Kits以及ECL發(fā)光液由北京中山生物技術有限公司提供。
1.4儀器XZ-4型小鼠自主活動儀，由中國醫(yī)學科學院藥物研究所研制。SD-2型小鼠滾筒儀，北京大學醫(yī)學部實驗儀器廠生產。高效液相電化學檢測系統(tǒng)(Princeton Applied Research Model 174A Polarographic Analyzer)，美國Princeton Applied Research Corporation生產。
2方法2.1行為學實驗2.1.1一般行為學表現(xiàn)觀察小鼠在腹腔給予MPTP造模后的一般行為表現(xiàn)，有無異常反應，比較分析各組之間的差異。
2.1.2自主活動實驗使用XZ-4型小鼠自主活動儀測定小鼠自發(fā)活動并記數(shù)，將小鼠放入自主活動箱中(高13cm，直徑25cm)(每次同時測定4只小鼠，每個活動箱中一只)由記錄儀自動記錄小鼠活動情況，測定每只小鼠5分鐘內的活動次數(shù)，進行統(tǒng)計學處理。
2.1.3滾筒實驗使用SD-2型小鼠滾筒儀測試小鼠的滾筒行為表現(xiàn)。測試前連續(xù)訓練3天，每天2次，轉速為12轉/分鐘，訓練時間120秒。將小鼠置于滾筒儀的滾筒上，設置轉速25轉/分鐘，測試小鼠從滾筒開始旋轉到離開滾筒的時間作為小鼠運動潛伏期，測試時間為60秒。每只小鼠測3次取平均值，通過Mann-WhitneyU-test進行統(tǒng)計學的顯著性分析。
2.2高效液相-電化學法(HPLC-EC)分析使用高效液相電化學檢測儀測定紋狀體內DA以及其代謝產物DOPAC和HVA的含量。
樣品預處理將小鼠脫頸處死，取小鼠雙側紋狀體加入100μl溶液A(0.4M HClO4)冰浴超聲勻漿處理，4℃靜置1個小時，注意避光保存。然后離心15分鐘(15,000×g，4℃)，取上清加入40μl溶液B(20mM檸檬酸鈉，300mM K2HPO4和2mM Na2EDTA)，充分混勻后4℃靜置1個小時，條件同上。再離心15分鐘(15,000×g，4℃)，得到樣品上清，-80℃存放備用。
樣品測定將上清過濾(孔徑0.22μm)后，取15μl上樣。其中流動相配制如下取檸檬酸10.5073g，乙酸鈉5.7400g，Na2EDTA 0.3723g，SOS 0.2576g，NaCl 0.5851g定容至1L，過濾，然后按照175∶10加入乙腈，脫氣處理。流速控制為1.0ml/min。電化學檢測器工作壓0.7v，測定溫度37℃。標準品在濃度和峰面積間有良好的線性關系r＞0.99。多巴胺及其代謝物的含量用ng/mg濕組織重表示。
2.3Western blotting實驗樣品預處理將小鼠斷頭處死，在冰浴培養(yǎng)皿內迅速分離黑質和紋狀體，置于Eppendorf管內迅速稱重，于-80℃冰箱存放。加入勻漿緩沖液(1g∶5ml)冰浴制備勻漿，勻漿緩沖液為80mM Tris-HCL緩沖液(pH 7.4)，0.1mM PMSF，0.4mM DTT，0.1％SDS(W/V)，2mM Na2EDTA。將勻漿液離心15分鐘(15,000×g，4℃)，收集上清，并使用Lawry法測定蛋白濃度。
SDS-PAGE取樣品蛋白加入上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，使蛋白質變性。進行7.5％SDS-PAGE電泳。加入電泳緩沖液，80V恒壓電泳2h。電泳緩沖液為Tris-甘氨酸緩沖液，包括0.3％Tris，1.44％甘氨酸，0.1％SDS。標準蛋白質包括兔磷酸化酶B 97.4kDa，牛血清白蛋白66.2kDa，兔肌動蛋白43.0kDa，牛碳酸酐酶31.0kDa，胰蛋白酶抑制劑20.1kDa，雞蛋清溶菌酶14.4kDa。
轉膜電泳，60V過夜，將樣品蛋白轉移到PVDF膜上。轉移液為Towbin液，配制方法如下取Tris 4.55g，甘氨酸21.62g，SDS 0.3g，甲醇150ml加雙蒸水定容至1.5L。然后用PBST洗液沖洗膜，PBST洗液配方取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.38g，KH2PO40.24g，吐溫-20 5ml加三蒸水至800ml，以1M HCL調pH值至7.4，定容1000ml。
用5％脫脂奶粉和5％牛血清白蛋白封閉1h。加入酪氨酸羥化酶(Tyroxinehydroxylase，TH)的多克隆抗體(1∶200稀釋)，4℃孵育過夜。用PBST沖洗，10分鐘×2次，加入生物素標記的二抗(1％BSA-PBS稀釋)，1∶300稀釋，37℃孵育30分鐘。再用PBST沖洗，10分鐘×2次，加入辣根酶標記鏈酶卵白素(1％BSA-PBS稀釋)，1∶300稀釋，37℃孵育30分鐘。用PBST沖洗，10分鐘×2次，加入ECL發(fā)光液，反應5分鐘，X光片顯影、定影。
2.4統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)均以均值±標準差表示。除滾筒實驗采用Mann-Whitney U檢驗外，其余實驗的各組間比較采用t-檢驗和雙因素ANOVA檢驗，P＜0.05為統(tǒng)計學上有顯著性差異。
3結果松果菊苷對抗MPTP損傷的自主活動實驗和行為學實驗結果分別見圖2和圖3。結果表明松果菊苷能夠顯著改善小鼠的自主活動次數(shù)和滾筒運動的協(xié)調性。MPTP模型組與對照組相比活動次數(shù)明顯減少(對照組295.2±69.4，模型組63.2±23.0，P＜0.01)，運動潛伏期也明顯縮短(對照組57.2±5.6s，模型組21.3±8.6s，P＜0.01)。用松果菊苷和陽性藥金剛烷胺預處理后，和MPTP模型組相比能明顯的增加其活動次數(shù)和滾筒運動潛伏期，5分鐘內的自主活動次數(shù)分別為松果菊苷5mg/kg組114.9±33.0、20mg/kg組179.0±63.6，金剛烷胺40mg/kg組203.5±77.2，滾筒潛伏期分別為松果菊苷5mg/kg組39.0±4.6s、20mg/kg組48.6±8.3s，金剛烷胺40mg/kg組51.6±8.2s。單用松果菊苷20mg/kg組，其自主活動次數(shù)和滾筒運動潛伏期和對照組相比沒有顯著性差異(P＞0.05)，分別為299.6±50.8和58.5±4.7s。
HPLC-EC實驗結果發(fā)現(xiàn)，對照組的DA、DOPAC、HVA的含量分別為1.65±0.37、1.96±0.45和0.78±0.25ng/mg，而模型組的含量則分別降低為0.39±0.06、0.54±0.14和0.43±0.13ng/mg(P＜0.01，表1)。給予松果菊苷(5、20mg/kg)和金剛烷胺預處理后，能夠改善紋狀體內DA的含量(分別為P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01)，但對DOPAC和HVA含量的變化影響不大(P＞0.05)。而單用松果菊苷20mg/kg給藥組發(fā)現(xiàn)，可以增加正常大鼠的DA含量(P＜0.05)，并顯著性的降低DOPAC和HVA的含量(P＜0.01)，這些結果表明松果菊苷在行為學中的效應可能和改善MPTP損傷的C57小鼠紋狀體的DA水平有關。進一步研究表明松果菊苷還能顯著的增加DA/DOPAC和DA/HVA的比率，單用松果菊苷組更為顯著。
表1.預防性的給予松果菊苷和金剛烷胺對小鼠腦紋狀體內DA及其代謝物DOPAC和HVA的影響

所有數(shù)據(jù)均以均值±標準差表示，n＝6。
和模型組比*P＜0.05，**P＜0.01；和對照組比#P＜0.05，##P＜0.01。
小鼠黑質部位的酪氨酸羥化酶(Tyroxine hydroxylase，TH)是多巴胺合成代謝中的限速酶。通過TH抗體特異性染色，可以明顯的觀察到多巴胺能神經(jīng)元。在多巴胺能神經(jīng)元的胞漿內可明顯觀察到褐色的陽性反應。給予MPTP后可發(fā)現(xiàn)黑質部位的多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量與正常對照組相比明顯降低，而用松果菊苷預處理后和模型組相比則能顯著增加黑質部位的多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量。
小鼠紋狀體和黑質部位的TH的Western blotting實驗結果如圖4所示。結果表明給予MPTP后可看到黑質和紋狀體部位的TH含量均明顯降低，而給予松果菊苷預處理后則可以不同程度的增加TH含量，從而說明松果菊苷在一定程度上能夠保護MPTP誘導的黑質和紋狀體部位的多巴胺能神經(jīng)元的損傷。
實驗例2松果菊苷抗癡呆作用的研究1.松果菊苷對腦血管性癡呆小鼠空間學習記憶能力的影響的實驗隨機將105只小鼠分為六組，偽手術組，腦缺血組，松果菊苷100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg組，陽性藥喜得鎮(zhèn)0.8mg/kg組，連續(xù)灌胃給藥12天，第13天做腦缺血再灌注手術，手術當天給藥1小時后，烏拉坦1g/kg麻醉，行頸中部切口，分離頸總動脈，并將迷走神經(jīng)分離開，用動脈夾夾閉頸總動脈10分鐘，再灌注10分鐘，再夾閉10分鐘。偽手術組只分離頸總動脈但不夾閉動脈?？p合傷口，手術后肌注青霉素0.1ml/只(4萬單位/只)。手術后偽手術組16只小鼠，其它各組分別為12只小鼠。手術后第2天開始水迷宮測試，水迷宮共測試4天，每天給藥1小時后進行水迷宮試驗，記錄小鼠到達終點的游泳時間(T)和錯誤次數(shù)(Ne)。
表2.松果菊苷對腦缺血再灌注所致小鼠空間記憶障礙游泳時間的影響

P＜0.05，**P＜0.01，與腦缺血模型組比較表3.松果菊苷對腦缺血再灌注所致小鼠空間記憶障礙錯誤次數(shù)的影響

P＜0.05，**P＜0.01，與腦缺血模型組比較表2和3的試驗結果顯示，腦缺血再灌注模型小鼠的游泳時間和錯誤次數(shù)明顯大于偽手術組，水迷宮第2，3，4天兩組之間有顯著性差異，第3，4天各給藥組小鼠游泳時間和錯誤次數(shù)都小于模型組，特別是松果菊苷400mg/kg和陽性藥與模型組比較有顯著性差異。由此說明松果菊苷對腦缺血再灌注所致空間學習記憶障礙小鼠的學習記憶能具有明顯的改善作用。
2、松果菊苷對東莨菪堿所致小鼠空間學習獲得障礙的影響隨機將小鼠分為空白對照組、東莨菪堿模型組、松果菊苷100mg/kg組、200mg/kg組、400mg/kg組、陽性藥腦復康組，連續(xù)灌胃給藥18天，第19天開始水迷宮訓練，水迷宮共訓練4天，每天訓練前1小時給藥，第5天開始水迷宮測試，灌胃給藥50min后，腹腔注射東莨菪堿3mg/kg，20min后進行水迷宮測試，記錄小鼠的錯誤次數(shù)(Ne)和潛伏期(Lp)。
表4松果菊苷對東莨菪堿所致空間記憶獲得障礙的影響

*P＜0.05與模型組比較表4中試驗結果顯示，東莨菪堿模型組錯誤次數(shù)和游泳時間都較正常對照組增加，各給藥組都有減少模型小鼠錯誤次數(shù)和縮短游泳時間的作用。松果菊苷400mg/kg和陽性藥腦復康500每個mg/kg能顯著縮短模型小鼠游泳時間。結果表明松果菊苷對東莨菪堿所致的小鼠空間學習記憶獲得障礙有明顯的改善作用，提示松果菊苷具有抗老年癡呆癥作用。


圖1松果菊苷的結構圖2對5分鐘內小鼠自主活動次數(shù)的影響。數(shù)據(jù)均以均值±標準差表示，n＝10。和MPTP組相比*P＜0.05，**P＜0.01。
圖3對小鼠滾筒運動潛伏期的影響，n＝10。和MPTP組比較*P＜0.05，**P＜0.01。用Mann-Whitney U檢驗進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。
圖4小鼠紋狀體和黑質的TH水平的Western blotting實驗結果1.對照；2.MPTP(30mg/kg)；3.松果菊苷(5mg/kg)+MPTP；4.松果菊苷(20mg/kg)+MPTP；5.金剛烷胺+MPTP；6.松果菊苷(20mg/kg)。
實施例1片芯處方(以1000片計)松果菊苷 250g噴霧干燥乳糖 83.3g微晶纖維素41.7g羧甲基淀粉鈉 16.7g交聯(lián)羧甲基纖維素鈉16.7g十二烷基硫酸鈉8.3g硬脂酸鎂 2.1g按上述片芯處方稱取各輔料，研磨混合并過80目篩3次，干法制粒兩次，使細粉量約占20～30％左右；整粒，加入0.3％的硬脂酸鎂混勻后以12mm淺弧沖模壓片，并包薄膜衣，采用雙鋁塑包裝。
該片劑每片含主藥250mg。每次2粒，每日3次。
實施例2片芯處方(以1000片計)松果菊苷 250g噴霧干燥乳糖 79.3g交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮59.5g十二烷基硫酸鈉7.9g硬脂酸鎂 1.98g制備方法同例1該片劑每片含主藥250mg。每次2粒，每日3次。
實施例3片芯處方(以1000片計)松果菊苷 250g微晶纖維素125g羧甲基淀粉鈉 33.4g十二烷基硫酸鈉7.9g硬脂酸鎂 1.98g制備方法同例1該片劑每片含主藥250mg。每次2粒，每日3次。
實施例4膠囊處方(以1000粒膠囊計)
松果菊苷 250g淀粉 5g乳糖 20g微粉硅膠 3g硬脂酸鎂 0.77g按上述處方稱取各輔料，混勻，過100目篩3遍，灌裝一號膠囊，鋁塑包裝，每板10粒膠囊。
該膠囊每粒含主藥250mg，每次2粒，每天3次。
實施例5顆粒劑處方(以1000袋計)松果菊苷 500g糖粉 125g乳糖 125g硬脂酸鎂 3.6g按上述處方稱取各輔料，充分混勻，過80目篩3遍，采用干法制粒機制粒，整粒，得14目篩顆粒，用鋁塑復合膜分裝。
該顆粒劑每袋含主藥0.5g，溫開水沖服，每次1袋，每天3次。
實施例6注射用松果菊苷處方(以1000支計)松果菊苷 62.5g甘露醇12.5g注射用水加至1000ml稱取上述各成分置于無菌容器中，加無菌注射用水，攪拌使溶解，然后加配制量的0.02％活性炭，攪拌10分鐘，無菌過濾，濾液檢驗合格后分裝于10ml西林瓶中，冷凍干燥24h后無菌分裝。
每瓶含松果據(jù)苷250mg，肌內注射，一次250mg，每日2次，臨用前用生理鹽水4ml溶解后注射。
權利要求
1.松果菊苷在制備治療癡呆癥藥物中的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所說的治療癡呆癥是對學習記憶具有改善作用。
3.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所說的治療癡呆癥是對腦缺血導致的學習記憶障礙具有改善作用。
4.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所說的治療癡呆癥是對腦神經(jīng)損傷所致學習記憶障礙具有改善作用。
5.松果菊苷在制備治療帕金森病藥物中的應用。
6.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于所說的治療帕金森病是改善自主活動次數(shù)和運動的協(xié)調性。
7.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于所說的治療帕金森病是增加腦組織中多巴胺含量，降低二羥基苯乙酸高香草酸的含量。
8.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于所說的治療帕金森病是增加腦組織中黑質部位的多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量。
9.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于所說的治療帕金森病是指對多巴胺能神經(jīng)元的損傷具有保護作用。
10.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于所說的治療抗帕金森病是保護黑質和紋狀體部位的多巴胺能神經(jīng)元的損傷。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于公開一種化合物的新制藥用途，即松果菊苷在制備治療癡呆癥藥物、抗帕金森病藥物中的新制藥用途。本發(fā)明公開了松果菊苷對學習記憶障礙的改善作用、對自主活動和運動的協(xié)調性的改善作用以及保護神經(jīng)元的損傷等作用。
文檔編號A61P25/00GK1810252SQ200510002898
公開日2006年8月2日 申請日期2005年1月28日 優(yōu)先權日2005年1月28日
發(fā)明者屠鵬飛, 蒲小平, 尚偉芬, 姜勇, 齊學兵, 周欣, 逄劍 申請人:北京華醫(yī)神農醫(yī)藥科技有限公司