專利名稱：新穎的鏈球菌抗原的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及抗原，具體地講，涉及可用作疫苗組合物的用以治療和/或預防的致病性肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)抗原。
背景技術(shù)：
肺炎鏈球菌(S.Pneumoniae)對于人類，特別是嬰兒、老年人與免疫力較弱者而言，是一重要的致病菌。它通?？捎深净贾T如細菌血癥、敗血病、肺炎與腦膜炎這類高罹病率且高死亡率的侵害疾病的病人身上分離出來。即使以適當?shù)目股刂委?，肺炎鏈球菌的感染仍不免造成許多死亡。雖然抗微生物藥物已經(jīng)能減低肺炎鏈球菌感染所造成的總死亡率，但是具耐藥性的肺炎鏈球菌的出現(xiàn)，卻成為現(xiàn)今世界上主要的問題。有效的肺炎鏈球菌疫苗可顯著影響與肺炎鏈球菌疾病相伴隨的罹病與死亡率。這些疫苗也能夠用來避免嬰兒與小孩的中耳炎。
肺炎鏈球菌疫苗的發(fā)展方向，集中于由肺炎鏈球菌莢膜多糖體所誘發(fā)產(chǎn)生的免疫反應?；诳乖圆町愃b定出的肺炎鏈球菌莢膜的血清類型已超過80多種?，F(xiàn)今所利用的肺炎鏈球菌疫苗，包含了23種最常引起疾病的莢膜多糖體，但是其缺點主要還在于有一些莢膜多糖體的致免疫性極差，血清類型的多樣性以及血清類型隨著時間、地理區(qū)域與年齡層的不同而在分布上有差異。特別是，目前正在研發(fā)用以保護小孩對抗所有其他血清型肺炎鏈球菌組份的現(xiàn)有疫苗與莢膜結(jié)合疫苗，仍未成功。雖然可改進莢膜多糖體的致免疫性，但是血清類型的特異性仍然是開發(fā)多糖體疫苗上的一大限制。利用具抗原性且具保守致免疫性的肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)抗原，無論是單獨或是與另外成份組合，皆有可能產(chǎn)生蛋白質(zhì)肺炎鏈球菌疫苗。
在1998年5月7日所公開的WO98/18930，題為“肺炎鏈球菌的抗原與疫苗”(Streptococcus Pneumoniae antigens and Vaccines)的PCT專利中描述了許多具抗原性的特定多肽，但是對于這些多肽的生物活性卻無相關(guān)報告。
因此，目前亟需以鏈球菌抗原當作疫苗的組份，用以預防和/或治療鏈球菌感染。
發(fā)明概述依據(jù)上述觀點，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與選自含有SEQ ID NO2、4、6、8、10、14、16、55至75、77至79、81與83的序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物間的同一性至少有70％。
本發(fā)明的其它方面提供了載體，其包含可操作連接至表達控制區(qū)的本發(fā)明的多核苷酸，還提供了用所述載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞以及制備多肽的方法，該方法包括在適于表達該基因的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞。
在另一方面，提供了由本發(fā)明多核苷酸所編碼的新穎多肽。
圖示簡單說明

圖1為BVH-3基因的DNA序列；SEQ ID NO1。
圖2為BVH-3蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO2。
圖3為BVH-11基因的DNA序列；SEQ ID NO3。
圖4為BVH-11蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO4。
圖5為BVH-28基因的DNA序列；SEQ ID NO5。
圖6為BVH-28蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO6。
圖7為BVH-3A基因的DNA序列，其相當于BVH-3基因5′末端；SEQ ID NO7。
圖8為BVH-3A蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO8。
圖9為BVH-3B基因的DNA序列，其相當于BVH-3基因3′末端；SEQ ID NO9。
圖10為BVH-3B蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO10。
圖11為利用MacVector序列分析軟件(6.5版)，以Clustal W程序比較按WU2、RX1、JNR.7/87、SP64、P4241與A66各肺炎鏈球菌株的BVH-3基因的讀碼框所預期的氨基酸序列。在比較列下，為一致性的狀況行，其中*與·分別代表相同與相似的氨基酸殘基。
圖12為利用MacVector序列分析軟件(6.5版)，以Clustal W程序比較按WU2、RX1、JNR.7/87、SP64、P4241、A66與SP63各肺炎鏈球菌株BVH-11基因的讀碼框所預期的氨基酸序列。在比較列下，為一致性的狀況行，其中*與·分別代表相同與相似的氨基酸殘基。
圖13為不同肺炎鏈球菌株BVH-11蛋白質(zhì)的預期氨基酸序列比較。并利用MacVector序列分析軟件(6.5版)，以Clustal W程序分析出的其同一性(I)與相似性(S)。
圖14為包含完整BVH-3基因的DNA序列(讀碼框(ORF)為核苷酸第1777至4896個)；SEQ ID NO11。
圖15為包含完整BVH-11基因的DNA序列(讀碼框為核苷酸第45至2567個)；SEQ ID NO12。
圖16為包含完整BVH-11-2基因的DNA序列(讀碼框為核苷酸第114至2630個)；SEQ ID NO13。
圖17為BVH-11-2蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO14。
圖18為SP63的BVH-3基因的DNA序列；SEQ ID NO15。
圖19為SP63的BVH-3蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO16。
圖20為BVH-3M蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO55。
圖21為BVH-3AD蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO56。
圖22為L-BVH-3-AD蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO57。
圖23為NEW 12蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO58。
圖24為BVH-3C蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO59。
圖25為BVH-11M蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO60。
圖26為BVH-11A蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO61。
圖27為BVH-11B(亦稱為NEW 13)蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQID NO62。
圖28為BVH-11C蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO63。
圖29為NEW 1蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO64。
圖30為NEW 2蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO65。
圖31為NEW 3蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO66。
圖32為NEW 4蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO67。
圖33為NEW 5蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO68。
圖34為NEW 6蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO69。
圖35為NEW 7蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO70。
圖36為NEW 8蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO71。
圖37為NEW 9蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO72。
圖38為BVH-11-2M蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO73。
圖39為NEW 10蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO74。
圖40為NEW 11蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO75。
圖41為NEW 12基因的DNA序列；SEQ ID NO76。
圖42為NEW 14蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO77。
圖43為NEW 15蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO78。
圖44為NEW 16蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO79。
圖45為GBS的BVH-71基因的DNA序列；SEQ ID NO80。
圖46為GBS的BVH-71蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO81。
圖47為GAS的BVH-71基因的DNA序列；SEQ ID NO82。
圖48為GAS的BVH-71蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID NO83。
發(fā)明詳細說明根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與選自含有SEQ ID NO2、4、8、10、14、16、55至75、77至79、81、83的序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與選自含有SEQ ID NO2、4、6、6、8、10、14、16、55至75、77至79、81、83所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物間的同一性至少有95％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與選自含有SEQ ID NO2、4、8、10、14、16、55至75、77至79、81、83所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與選自含有SEQ ID NO2、4、10、14、16、55至75、77至79、81、83所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與選自含有SEQ ID NO2、4、8、10、14、16、55至75、77至79所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與選自含有SEQ ID NO2、8、10、16、55、56、57、58、59、64、65、66、78所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與選自含有SEQ ID NO2、8、10、16、55、56、57、59、64、65、66、78所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與選自含有SEQ ID NO4、14、58、60、61、62、63、67、68、69、70、71、72、73、74、75、77、79所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與選自含有SEQ ID NO4、14、60、61、62、63、67、68、69、70、71、72、73、74、75、77、79所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與選自含有SEQ ID NO2、4、10、14、16、55至75、77至79所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與選自含有SEQ ID NO10、55至75、77、78、79所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與選自含有SEQ ID NO55至75、77、78、79所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與選自含有SEQ ID NO2、4、6、8、10所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與選自含有SEQ ID NO2、4、10、14、16所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與選自含有SEQ ID NO2、4、14、16所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與含有SEQ ID NO2或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與含有SEQ ID NO4或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與含有SEQ ID NO10或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與含有SEQ ID NO14或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與含有SEQ ID NO16或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與含有SEQ ID NO58或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與含有SEQ ID NO60或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與含有SEQ ID NO62或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與含有SEQ ID NO64或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與含有SEQ ID NO67或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與含有SEQ ID NO68或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與含有SEQ ID NO69或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與含有SEQ ID NO72或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與含有SEQ ID NO74或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與含有SEQ ID NO77或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽間的同一性至少有70％。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其特征在于選自SEQID NO2、4、6、8、10，或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其特征在于選自SEQID NO2、4、6、8、10、14、16、55至75、77至79、81、83，或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其特征在于選自SEQID NO2、4、8、10、14、16、55至75、77至79、81、83，或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其特征在于選自SEQID NO2、4、10、14、16、55至75、77至79、81、83，或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其特征在于選自SEQID NO2、4、8、10、14、16、55至75、77至79，或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其特征在于選自SEQID NO2、4、10、14、16、55至75、77至79，或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其特征在于選自SEQID NO2、4、10、14、16，或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO2或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO4或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO10或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO14或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO16或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO10、55至75、77、78、79，或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO10、58、60、62、64、67、68、69、72、74、77，或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO10、58、60、62、64、67、68、69、72、74、77，或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO10、62、64、67、68、74、77，或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO58或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO62或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO64或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO67或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO68或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO74或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO77或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
在具體實施方案中，本發(fā)明還涉及嵌合型多肽，其包含本申請中所描述的一個或數(shù)個多肽或其片段、相似物或衍生物。
在具體實施方案中，本發(fā)明還涉及嵌合型多肽，其包含本申請的附圖中所定義的一個或數(shù)個多肽或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，本說明還涉及嵌合型多肽，其包含兩個或數(shù)個選自SEQ ID NO2、4、6、8、10、14、16、55至75、77至79、81、83的多肽或其片段、相似物或衍生物；前提是將多肽或其片段、相似物或衍生物相粘接以形成嵌合型多肽。
在一具體實施方案中，嵌合型多肽將包括兩個或數(shù)個選自SEQ IDNO10、58、60、62、64、67、68、69、72、74、77或其片段、相似物或衍生物的多肽；前提是將多肽或其片段、相似物或衍生物相粘接以形成嵌合型多肽。
在一具體實施方案中，嵌合型多肽將包括兩個或數(shù)個選自SEQ IDNO10、58、60、62、64、67、68、74、77或其片段、相似物或衍生物的多肽；前提是將多肽或其片段、相似物或衍生物相粘接以形成嵌合型多肽。
在一具體實施方案中，嵌合型多肽將包括兩個或數(shù)個選自SEQ IDNO10、62、64、67、68、74、77或其片段、相似物或衍生物的多肽；前提是將多肽或其片段、相似物或衍生物相粘接以形成嵌合型多肽。
在一具體實施方案中，嵌合型多肽將包括2至5個多肽。
在一具體實施方案中，嵌合型多肽將包括2至4個多肽。
在一具體實施方案中，嵌合型多肽將包括2至3個多肽。
在一具體實施方案中，嵌合型多肽將包括2個多肽。
在一具體實施方案中，提供通式(I)所示的嵌合型多肽A-(B)m-(C)n-D(I)其中，m為0或1；n為0或1；A選自SEQ ID NO2、4、6、8、10、14、16、55至75、77至79、81、83，或其片段、相似物或衍生物；B選自SEQ ID NO2、4、6、8、10、14、16、55至75、77至79、81、83，或其片段、相似物或衍生物；C選自SEQ ID NO2、4、6、8、10、14、16、55至75、77至79、81、83，或其片段、相似物或衍生物；D選自SEQ ID NO2、4、6、8、10、14、16、55至75、77至79、81、83，或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，A選自SEQ ID NO10、58、60、62、64、67、68、69、72、74、77，或其片段、相似物或衍生物；B選自SEQ ID NO10、58、60、62、64、67、68、69、72、74、77，或其片段、相似物或衍生物；C選自SEQ ID NO10、58、60、62、64、67、68、69、72、74、77，或其片段、相似物或衍生物；D選自SEQ ID NO10、58、60、62、64、67、68、69、72、74、77，或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，A選自SEQ ID NO10、58、60、62、64、67、68、74、77，或其片段、相似物或衍生物；
B選自SEQ ID NO10、58、60、62、64、67、68、74、77，或其片段、相似物或衍生物；C選自SEQ ID NO10、58、60、62、64、67、68、74、77，或其片段、相似物或衍生物；D選自SEQ ID NO10、58、60、62、64、67、68、74、77，或其片段、相似物或衍生物。
在一實施方案中，本發(fā)明的嵌合型多肽包括以單獨或結(jié)合形式出現(xiàn)的下列具體化實施方案的多肽序列。
在一具體實施方案中，A為SEQ ID NO10、58、60、62、64、67、68、74、77，或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，A為SEQ ID NO10或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，A為SEQ ID NO58或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，A為SEQ ID NO62或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，A為SEQ ID NO64或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，A為SEQ ID NO67或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，A為SEQ ID NO68或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，A為SEQ ID NO74或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，A為SEQ ID NO77或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，B為SEQ ID NO10、58、62、64、67、68、74、77，或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，B為SEQ ID NO10或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，B為SEQ ID NO58或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，B為SEQ ID NO62或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，B為SEQ ID NO64或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，B為SEQ ID NO67或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，B為SEQ ID NO68或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，B為SEQ ID NO74或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，B為SEQ ID NO77或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，C為SEQ ID NO10、58、62、64、67、68、74、77，或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，C為SEQ ID NO10或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，C為SEQ ID NO58或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，C為SEQ ID NO62或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，C為SEQ ID NO64或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，C為SEQ ID NO67或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，C為SEQ ID NO68或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，C為SEQ ID NO74或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，C為SEQ ID NO77或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，D為SEQ ID NO10、58、62、64、67、68、74、77，或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，D為SEQ ID NO10或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，D為SEQ ID NO58或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，D為SEQ ID NO62或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，D為SEQ ID NO64或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，D為SEQ ID NO67或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，D為SEQ ID NO68或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，D為SEQ ID NO74或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，D為SEQ ID NO77或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，m為0。
在一具體實施方案中，n為0。
在一具體實施方案中，m與n都為0。
在一具體實施方案中，m與n都為0，A為SEQ ID NO64或其片段、相似物或衍生物，而B為SEQ ID NO62或其片段、相似物或衍生物。
在一具體實施方案中，m與n都為0，A為SEQ ID NO62或其片段、相似物或衍生物，而B為SEQ ID NO64或其片段、相似物或衍生物。
根據(jù)本發(fā)明，所有編碼多肽的嵌合型多肽與多核苷酸，皆在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在一具體實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多肽或嵌合型多肽具抗原性。
在一具體實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多肽或嵌合型多肽能夠引發(fā)個體的免疫反應。
在具體實施方案中，本發(fā)明還涉及能夠產(chǎn)生對本發(fā)明中所定義的多肽或嵌合型多肽具結(jié)合特異性的抗體的多肽。
“具結(jié)合特異性”的抗體表示抗體能夠辨識特定的多肽并與其結(jié)合，但對于樣本例如天然地包含所選肽的生物樣本中的其他分子則基本上不識別并結(jié)合。利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，可以測定出將所選的多肽當作抗原時的特異性結(jié)合能力。
除非另外定義，此處所使用技術(shù)上或科學上的術(shù)語與本發(fā)明領域普通技術(shù)人員一般所了解的意義相同。所有的出版物、專利申請、專利與其他本文所提的參考文獻，將全部引入本文做參考。如有沖突，將以本說明書(包括定義)為準。此外，使用的實驗材料、方法與實施例只為敘述說明，因此并不受其限制。
本發(fā)明所使用多肽的“片段”、“衍生物”或“相似物”包括那些經(jīng)由一個或數(shù)個被保守或非保守氨基酸殘基(最好是保守的)替換的多肽，且其以為天然或非天然的氨基酸。在一具體實施方案中，本發(fā)明多肽的衍生物和相似物與那些于附圖中說明的序列或其片段有約70％的同一性。換句話說，有70％的殘基是相同的。在一具體實施方案中，多肽的同源性將高于75％。在一具體實施方案中，多肽的同源性將高于80％。在一具體實施方案中，多肽的同源性將高于85％。在一具體實施方案中，多肽的同源性將高于90％。在一具體實施方案中，多肽的同源性將高于95％。在一具體實施方案中，多肽的同源性將高于99％。在一具體實施方案中，本發(fā)明多肽的衍生物或相似物中氨基酸殘基的替換、修飾與刪除將少于20個，最好少于10個。優(yōu)選的替換是本領域中已知為保守的，例如替換的殘基擁有如疏水性、分子大小、電荷與官能團等相同的物理和化學性質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，多肽同時包括多肽與嵌合型多肽。
也包括已經(jīng)與其他化合物融合而已改變生物與藥理學性質(zhì)的多肽，例如與聚乙二醇融合以增長半衰期；與前導或分泌序列融合以方便純化；還有前原(prepro)序列和與原(pro)序列以及(多)糖類融合。
再者，在一些氨基酸區(qū)域為多態(tài)性的情況下，更有需要改變一個或數(shù)個特別的氨基酸，使其更有效地模仿不同鏈球菌株上不同的抗原表位。
此外，本發(fā)明的多肽可經(jīng)由末端氨基的?；?例如，乙酰化或硫基乙酸酰胺化)與末端羧基酰胺化(例如利用氨或甲胺)予以修飾，提供穩(wěn)定性與增強疏水性，以便連結(jié)或結(jié)合至支持物或其他分子上。
同時本發(fā)明也包括多肽片段、相似物或衍生物的相同或相異多肽多聚體。這些聚合物形式包括例如一個或數(shù)個多肽由例如親和素/生物素、戊二醛或二甲基過亞胺酯(dimethylsuperimidate)等交聯(lián)物交聯(lián)的形式。這些聚合形式也包含兩個或數(shù)個由重組DNA技術(shù)制造的多順反子mRNA所產(chǎn)生的串聯(lián)或反向鄰接的序列。較好的是，本發(fā)明多肽的片段、衍生物或相似物將包括至少一個具抗原性的區(qū)域；例如至少一個抗原表位。
為了形成抗原性聚合物(例如合成的多聚體)，多肽可利用有雙鹵代乙?；?、硝基芳香鹵化物等對硫基具特異性的試劑。因此，不同肽的兩個巰基間的連結(jié)可能只有一個鍵，或是具有兩個，通常至少四個，但不超過16個，且通常不超過14個碳原子的連接基團。
在一特別的具體化實施方案中，本發(fā)明的片段、相似物或衍生物皆不含甲硫氨酸起始殘基。較好的是多肽不含引導或分泌序列(信號序列)。本發(fā)明多肽的信號部分可利用已建立的分子生物學技術(shù)加以確認。通常目的多肽可以從鏈球菌培養(yǎng)物中分離出來，然后測序以確認其成熟蛋白的起始殘基，進而確定成熟多肽的序列。
依據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了疫苗組合物，其至少包含本發(fā)明中的一個或數(shù)個鏈球菌多肽和與之混合的可藥用的載體稀釋劑或佐劑。適當?shù)淖魟┌ㄓ?，例如弗式完全佐劑或不完全佐劑；鹽類，例如AlK(SO4)2，AlNa(SO4)2，AlNH4(SO4)2，二氧化硅，高齡土；碳多核苷酸，例如聚IC(poly IC)與聚AU(poly AU)。較好的佐劑包括奎爾A(QuilA)與鋁水凝膠(Alhydrogel)。本發(fā)明的疫苗可利用注射、快速輸液、鼻咽吸收、皮膚吸收或頰部或口腔等非腸胃方式來施用?？伤幱玫妮d體也包括破傷風類毒素。
本發(fā)明的疫苗組合物是用以治療或預防鏈球菌的感染和/或如P.R.Murry(主編)，E.J.Baron，M.A.Pfaller，F(xiàn).C.Tenover和R.H.Yolken等人于Manual of Clinical Microbiology，ASM Press，Washington，D.C.第6版，1995一書中第1482頁所述受鏈球菌感染所造成的疾病與癥狀(此篇已并入本文做參考)。在一具體實施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物被用以治療與預防腦膜炎、中耳炎、細菌血癥與肺炎。在一具體實施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物被用以治療與預防鏈球菌的感染和/或受鏈球菌，特別是肺炎鏈球菌、A群鏈球菌(化膿鏈球菌)[Grouup Astrepococcus(pyogenes)]、B群鏈球菌(GBS或無乳鏈球菌)[Grouup Bstrepococcus(GBS或agalactiae)]、異常泌乳菌(dysgalactiae)、乳頭菌(uberis)、土壤絲菌(nocardia)以及金黃色葡萄球菌(streptococcus aureus)感染后的疾病與癥狀。在一具體實施方案中，鏈球菌的感染是肺炎鏈球菌。
在一特別的具體化實施例中，疫苗被施用于處于受鏈球菌感染危險中的個體上，例如嬰兒、老年人與免疫力較弱者。
本申請書所使用的“個體”，包括哺乳類。在一具體實施方案中，此哺乳類為人類。
疫苗組合物較好的單位劑量約為0.001至100μg/kg(抗原/體重)，再較好的是0.01至10μg/kg，最好的是0.1至1μg/kg，免疫接種之間有一至六周的間隔，施用一至三次。
依據(jù)另一方面，本發(fā)明提供多核苷酸編碼的多肽，其特征為選自SEQ ID NO2、4、6、8、10、14、16、55至75、77至79、81與83，或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
在一具體化實施方案中，多核苷酸為SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、12、13、15、76、80、82中所列出者，其可能包含了編碼本發(fā)明多肽的讀碼框。必須要了解的是，在圖示中所列的多核苷酸序列可以因簡并密碼而改變，但仍能編碼本發(fā)明中的多肽。而本發(fā)明更提供了能與上述多核苷酸序列(或其互補序列)雜交的多核苷酸，序列間的同一性為50％。在一具體實施方案中，序列間的同一性為70％。在一具體實施方案中，序列間的同一性為75％。在一具體實施方案中，序列間的同一性為80％。在一具體實施方案中，序列間的同一性為85％。在一具體實施方案中，序列間的同一性為90％。在另一具體實施方案中，多核苷酸是可在嚴格的條件下雜交的，其同一性至少有95％。在一具體實施方案中，同一性超過97％。
在另一具體實施方案中，多核苷酸為SEQ ID NO1、3、7、9、11、12、13、15、76、80、82中所列編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。
在另一具體實施方案中，多核苷酸為SEQ ID NO1、3、9、11、12、13、15、76、80、82中所列編碼本發(fā)明多肽且包含讀碼框的多核苷酸。
在另一具體實施方案中，多核苷酸為SEQ ID NO1、3、9、11、12、13、15、76中所列編碼本發(fā)明多肽且包含讀碼框的多核苷酸。
在另一具體實施方案中，多核苷酸為SEQ ID NO1、3、7、9、11、12、13、15、76中所列編碼本發(fā)明多肽且包含讀碼框的多核苷酸。
在另一具體實施方案中，多核苷酸為SEQ ID NO1、7、9、11、15、76中所列編碼本發(fā)明多肽且包含讀碼框的多核苷酸。
在另一具體實施方案中，多核苷酸為SEQ ID NO1、9、11、15、76中所列編碼本發(fā)明多肽且包含讀碼框的多核苷酸。
在另一具體實施方案中，多核苷酸為SEQ ID NO1、7、9、11中所列編碼本發(fā)明多肽且包含讀碼框的多核苷酸。
在另一具體實施方案中，多核苷酸為SEQ ID NO1中所列編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。
在另一具體實施方案中，多核苷酸為SEQ ID NO7中所列編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。
在另一具體實施方案中，多核苷酸為SEQ ID NO9中所列編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。
在另一具體實施方案中，多核苷酸為SEQ ID NO11中所列編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。
在另一具體實施方案中，多核苷酸為SEQ ID NO15中所列編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。
在另一具體實施方案中，多核苷酸為SEQ ID NO3、12、13、76中所列編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。
在另一具體實施方案中，多核苷酸為SEQ ID NO3中所列編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。
在另一具體實施方案中，多核苷酸為SEQ ID NO12中所列編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。
在另一具體實施方案中，多核苷酸為SEQ ID NO13中所列編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。
在另一具體實施方案中，多核苷酸為SEQ ID NO76中所列編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。
就如同本領域技術(shù)人員所容易了解的，多核苷酸包括DNA與RNA。
本發(fā)明亦包括與本申請書所述多核苷酸互補的多核苷酸。
在另一方面，本發(fā)明編碼多肽的多核苷酸或其片段、相似物或衍生物，可在DNA免疫方法中使用。換句話說，它們可以被摻入能夠復制與表達的載體中，再經(jīng)由注射，使其在活體中表達抗原性的多肽；例如將多核苷酸插入在真核細胞中始有作用的CMV啟動子所控制的載體中，而此載體最好是以肌肉注射為之。
依據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，其系以重組技術(shù)在宿主細胞內(nèi)表達編碼該多肽的多核苷酸，并將多肽產(chǎn)物回收。同時，亦可依據(jù)所建立的化學合成技術(shù)生產(chǎn)多肽，例如在液相或固相下合成寡肽，并將之粘接以生產(chǎn)完整的多肽(區(qū)段接合)。
一般取得與評估多核苷酸與多肽的方法，如下列參考資料中所述Sambrook et al，分子克隆實驗室手冊(Molecular cloningALaboratory Manual)第二版，紐約冷泉港，1989；目前分子生物學中的規(guī)程(Current Protocols in Molecular Biology)，Ausubel F.M.等人編輯，John Wiley and Sons，Inc.New York；從分子克隆到基因工程的PCR克隆規(guī)程(PCR Cloning Protocols，from Molecular Cloning toGenetic Engineering)，White B.A.編輯，Humana Press，Totowa，NewJersey，1997，490頁；蛋白質(zhì)的純化、原理和實踐(Protein Purification，Principles and Practices)，Scopes R.K.，Springer Verlag，New York，第3版，1993，380頁；目前免疫學規(guī)程(Current Protocols in Immunology)，Coligan J.E.等人編輯.，John Wiley & sons Inc.，New York，上述皆列入本文做參考。
為了重組生產(chǎn)，以可編碼出該多肽的載體來感染宿主細胞，再將之培養(yǎng)于利于活化啟動子的改良培養(yǎng)液中，篩選轉(zhuǎn)化株或擴增該基因。那些能在宿主細胞中有活性并能復制的適當載體包括染色體、非染色體與合成的DNA序列，例如細菌質(zhì)粒、噬菌體DNA、桿狀病毒、酵母菌質(zhì)粒以及衍生自質(zhì)粒與噬菌體DNA組合的載體。利用限制酶可將多核苷酸插入載體上的適當位置，也就是說其能夠被連接至包含啟動子、核糖體結(jié)合位(共有區(qū)或席恩達格諾氏[Shine-Dalgarno]序列)和一可有可無的操縱子(調(diào)控元件)的表達控制區(qū)域上。我們可依據(jù)已建立的分子生物原理(Sambrook et al，分子克隆實驗室手冊，第二版，紐約冷泉港，1989；目前分子生物學中的規(guī)程，Ausubel F.M.等人編輯.，John Wiley and Sons，Inc.New York)，來選擇表達控制區(qū)域上的個別構(gòu)成部分以適合某一宿主細胞與載體。適當?shù)膯幼影ǖ幌抻贚TR或SV40啟動子、大腸桿菌的lac、tac或trp啟動子以及噬菌體的lambda PL啟動子。載體最好也包含一復制起點以及篩選標記，例如氨芐西林抗性基因。適當?shù)募毦d體包括pET、pQE70、pQE60、pQE-9、pbs、pD10 phagescript、psiX174、pBluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、Pkk223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5，而真核細胞的載體有pBlueBacIII、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG與pSVL。宿主細胞可為細菌的大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、鏈霉菌屬(Streptomyces)；真菌的黑霉菌(Aspergillus niger)、小巢狀麥菌(Aspergillus nidulins)；酵母菌的酵母菌屬(Saccharomyces)與真核細胞，如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)與COS。
多肽在培養(yǎng)表達之后，通常利用離心來收集細胞，以物理或化學方法將細胞打破(假使表達的多肽并未分泌至培養(yǎng)液中)后，保留粗萃取液以分離出所欲求的多肽。之后依照多肽的性質(zhì)利用已建立的技術(shù)來純化培養(yǎng)液或溶胞產(chǎn)物中的多肽；例如利用硫酸銨或酒精沉淀、酸萃取、陰離子或陽離子交換層析法、磷酸纖維素層析法、疏水相互作用層析法、羥基磷灰石層析法以及外源凝集素層析法，之后再以HPLC作最后純化。
多肽可以在有或無引導序列或分泌序列的方式下表達。前述的引導序列可以利用翻譯后加工將之除去(見美國專利案號4,431,739、4,425,437與4,338,397)或以化學方式將之除去，以純化所表達的多肽。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明的鏈球菌多肽可用來診斷鏈球菌的感染，特別是肺炎鏈球菌感染的診斷試驗。有許多診斷方法可以利用，例如檢測生物樣本中的鏈球菌體；其可利用以下的方法a)從病人取得生物樣本；b)將能與本發(fā)明鏈球菌多肽反應的抗體或其片段與生物樣本一同培養(yǎng)，以形成混合物；然后c)檢測混合物中特異結(jié)合的抗體或片段，其表示有鏈球菌的存在。
在另一方式中，則可檢測生物樣本中含有或可能含有特異對抗鏈球菌抗原的抗體，其方法如下a)從病人取得生物樣本；b)將本發(fā)明的一個或數(shù)個鏈球菌多肽或其片段與生物樣本一同培養(yǎng)，以形成混合物；然后c)檢測混合物中特異結(jié)合的抗原或片段，其表示有對鏈球菌具特異性的抗體的存在。
本領域技術(shù)人員知曉此診斷試驗將有許多的形式，其包括免疫性試驗，如酶免疫吸附法(ELISA)、放線免疫分析法或是膠乳凝集法，其本質(zhì)上皆在確認抗體對于生物體中存在的蛋白質(zhì)是否有特異性。
本發(fā)明中編碼多肽的DNA序列亦可被設計為DNA探針，用以檢測懷疑有鏈球菌的生物樣本。本發(fā)明的檢測方法包括a)從病人取得生物樣本；b)將一個或數(shù)個含編碼本發(fā)明多肽DNA序列或其片段的DNA探針與生物樣本一同培養(yǎng)，以形成混合物；然后c)檢測混合物中特異結(jié)合的DNA探針，其表示有鏈球菌的存在。
本發(fā)明的DNA探針亦可用于檢測循環(huán)的鏈球菌，例如在樣本中的肺炎鏈球菌核酸；又例如可用聚合酶鏈反應來診斷鏈球菌的感染。探針可以傳統(tǒng)的技術(shù)合成，也可以在固相上固定化，或是標記上可檢測的標記。本申請書中較好的DNA探針，乃一與本發(fā)明肺炎鏈球菌多肽的核苷酸至少有6個連續(xù)互補核苷酸的寡聚分子。
另一檢測患者中鏈球菌的診斷方法包括a)以可檢測的標記物標記能與本發(fā)明多肽或其片段反應的抗體；b)將標記的抗體或標記的片段施給到患者；然后c)檢測患者中特異結(jié)合的已標記抗體或已標記片段，其表示有鏈球菌的存在。
本發(fā)明的另一方面，乃將發(fā)明的多肽當做免疫原來生產(chǎn)特異性的抗體，并將之用以診斷，特別是治療鏈球菌的感染。利用適當?shù)暮Y選方法，可確定出適當?shù)目贵w；例如在一試驗模式中，計算某一抗體對抗鏈球菌感染的被動保護能力。本發(fā)明實施例中所述的老鼠模式就是一個例子。抗體可能是一完整的抗體分子或只是與抗原結(jié)合的抗體分子片段，而且可能屬于不同的免疫球蛋白類型?？贵w或其片段可能來自于動物，特別是來自哺乳類動物，尤其是來自小鼠、大鼠或是人類。它可能是一天然的抗體或其片段，需要的話，還可為重組的抗體或抗體片段?！爸亟M抗體”與“重組抗體片段”分別代表著由分子生物技術(shù)所制造出的抗體與抗體片段。抗體或抗體片段可為多克隆的或是較好的單克隆的。它對肺炎鏈球菌多肽上許多的抗原表位具特異性，但最好只對其一具特異性。
并不限制范圍，本發(fā)明還涉及被稱為BVH-3、BVH-11、BVH-11-2、BVH-28與BVH-71的新抗原。本發(fā)明還涉及截短的多肽，其包括被稱為BVH-3、BVH-11、BVH-11-2、BVH-28與BVH-71新抗原的片段。本發(fā)明還涉及嵌合型多肽，其包括被稱為BVH-3、BVH-11、BVH-11-2、BVH-28與BVH-71新抗原的片段。以下即為總結(jié)本發(fā)明抗原間關(guān)系的參照表
實施例1本實施例系說明肺炎鏈球菌的基因克隆。
以含有添加的Bgl II(AGATCT)與Xba I限制位點(TCTAGA)堿基延伸區(qū)的寡聚核苷酸，在血清類型6的SP64肺炎鏈球菌株的基因組上，以PCR(DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR System 2400 PerkinElmer，San Jose，CA)來擴增肺炎鏈球菌BVH-3(SEQ ID NO1)基因與肺炎鏈球菌BVH-28(SEQ ID NO5)基因的編碼區(qū)域。然后利用QIAgen(Chatworth，CA的QIAquick凝膠萃取試劑盒從瓊脂凝膠上將PCR產(chǎn)物回收。以Bgl II與Xba I限制酶(Pharmacia Canada Inc，BaiedUrfe，Canada)切后，以酚氯仿加以萃取，而后再以酒精沉淀。另外將Superlinker載體pSL301(Invitrogen，San Diego，CA)，以Bgl II與Xba I限制酶切后，以QIAgen(Chatworth，CA)的QIAquick凝膠萃取試劑盒從瓊脂凝膠上回收。將Bgl II與Xba I限制酶切過的基因組DNA片段與Bgl II與Xba I限制酶切過的pSL301載體粘接。粘接后的產(chǎn)物再根據(jù)Simanis的方法(Hanahan，D.DNA Cloning，1985，D.M.Glover(ed)，pp.109-135)轉(zhuǎn)化至DH5a大腸桿菌[f80 lacZ DM15 endA1 recA1hsdR17(rK-mK+)supE44 thi-11-gyrA96 relA1 D(lacZYA-argF)U169](Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中。以QIAgen的試劑盒來純化含有BVH-3或BVH-28基因的pSL301重組質(zhì)粒(rpSL301)，再以核苷酸測序(Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit，ABI，F(xiàn)oster City，CA)來確定插入的DNA。以Bgl II(AGATCT)與Xho I(CTCGAG)限制酶切重組質(zhì)粒pSL301(rpSL301)，再以QIAgen(Chatworth，CA)的QIAquick凝膠萃取試劑盒純化Bgl II-Xho I DNA片段。利用BamHl(GGATCC)與Xho I限制酶切含有硫氧還蛋白-His·Tag序列的pET-32c(+)表達載體(Novagen，Madison，WT)后，再以QIAgen(Chatworth，CA)的QIAquick凝膠萃取試劑盒萃取，而后將Bgl II-Xho I的DNA片段粘接至BamH I-Xho I的pET-32c(+)載體上，使產(chǎn)生硫氧還蛋白-His·Tag-BVH-3或硫氧還蛋白-His·Tag-BVH-28融合蛋白的編碼序列。將粘接的產(chǎn)物根據(jù)Simanis的方法(Hanahan，D.DNA Cloning，1985，D.M.Glover(ed)，pp.109-135)轉(zhuǎn)化至DH5a大腸桿菌[f80 lacZ DM15endA1 recA1 hsdR17(rK-mK+)supE44 thi-11-gyrA96 relA1 D(lacZYA-argF)U169](Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中。以QIAgen(Chatworth，CA)的QIAquick試劑盒回收重組pET-32(+)質(zhì)粒，再以DNA測序(TaqDye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit，ABI，F(xiàn)oster City，CA)來確認硫氧還蛋白-His·Tag與DNA插入片段融合處的序列。
實施例2本實施例系克隆肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)基因至CMV質(zhì)粒pCMV-GH的說明。
將肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)的DNA編碼區(qū)域插入pCMV-GH質(zhì)粒(Tanget al.，Nature，1992，356152)上受巨細胞病毒啟動子(CMV)轉(zhuǎn)錄控制的人類生長激素(hGH)基因下游的位置。具CMV啟動子的載體只有在置入真核細胞中才有作用，在大腸桿菌中是沒有的，而此載體亦含有氨芐西林抗性基因。
利用Bgl II(AGATCT)與Xba I(TCTAGA)限制酶，從rpSL301(見實施例1)取得BVH-3(SEQ ID NO1)與BVH-28(SEQ ID NO5)基因的編碼區(qū)域。再以QIAgen(Chatworth，CA)的QIAquick凝膠萃取試劑盒純化所消化的產(chǎn)物。之后將含有人類生長激素基因用以產(chǎn)生融合蛋白的pCMV-GH載體(Laboratory of Dr.Stephen A.Johnston，Department of Biochemistry，The University of Texas，Dallas，Texas)以Bgl II與Xba I切過后，利用QIAgen(Chatworth，CA)的QIAquick凝膠萃取試劑盒將之從瓊脂糖凝膠中純化。再將此Bgl II-Xba I DAN片段與Bgl II-Xba I pCMV-GH載體相粘接，產(chǎn)生一受CMV啟動子控制的hGH-BVH-3或hGH-BVH-28融合蛋白。將此粘接的產(chǎn)物根據(jù)Simanis的方法(Hanahan，D.DNA Cloning，1985，D.M.Glover(ed)，pp.109-135)轉(zhuǎn)化至DH5a大腸桿菌[f80 lacZ DM15 endA1 recA1 hsdR17(rK-mK+)supE44 thi-11-gyrA96 relA1 D(lacZYA-argF)U169](Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中。以QIAgen(Chatworth，CA)試劑盒回收pCMV重組質(zhì)粒。
以含有添加的Bgl II(AGATCT)與Hind III限制位點(AAGCTT)堿基延伸區(qū)的寡聚核苷酸，在血清類型6的SP64肺炎鏈球菌株的基因組上，以PCR(DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR System 2400 PerkinElmer，San Jose，CA)來擴增肺炎鏈球菌BVH-11(SEQ ID NO3)基因的編碼區(qū)域。然后利用QIAgen(Chatworth，CA)的QIAquick凝膠萃取試劑盒從瓊脂凝膠上將PCR產(chǎn)物回收。以限制酶(Pharmacia Canada Inc，Baie dUrfe，Canada)切后，以酚氯仿加以萃取，而后再以酒精沉淀。另外將pCMV-GH載體(Laboratory of Dr.Stephen A.Johnston，Department of Biochemistry，The University of Texas，Dallas，Texas)以Bgl II與Hind III限制酶切后，以QIAgen(Chatworth，CA)的QIAquick凝膠萃取試劑盒從瓊脂凝膠上回收。將Bgl II-Hind III DNA片段與BglII-Hind III限制酶切過的pCMV-GH載體粘接，產(chǎn)生一受CMV啟動子控制的hGH-BVH-11融合蛋白。粘接后的產(chǎn)物再根據(jù)Simanis的方法(Hanahan，D.DNA Cloning，1985，D.M.Glover(ed)，pp.109-135)轉(zhuǎn)化至DH15a大腸桿菌[f80 lacZ DM15 endA1 recA1 hsdR17(rK-mK+)supE44thi-11-gyrA96 relA1 D(lacZYA-argF)U169](Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中。以QIAgen的試劑盒純化pCMV重組質(zhì)粒，再以核苷酸測序來確認插入的DNA。
實施例3本實施例系說明利用DNA對肺炎鏈球菌抗原引發(fā)免疫反應。
在一組8只雌性BALB/c老鼠(Chareles River，St-Constant，Quebec，Canada)中，通過肌肉注射50μl含有100μg能夠編碼BVH-3、BVH-11或BVH-28基因的pCMV-GH重組質(zhì)粒與50μg能夠表達粒性白細胞-巨噬細胞群落誘導因子(GM-CSF)的pCMV-GH-GM-CSF質(zhì)粒(Laboratory of Dr.Stephen A.Johnston，Department of Biochemistry，The University of Texas，Dallas，Texas)，每2至3周注射一次，共三次而進行免疫；而在對照老鼠則注射100μg的pCMV-GH質(zhì)粒與50μgpCMV-GH-GM-CSF質(zhì)粒。在每次免疫前與第三次注射后的第7天從眼穴采取血液樣本，再以硫氧還蛋白-His·Tag-肺炎鏈球菌融合蛋白當作包被蛋白，利用ELISA測定反應所生的抗體。利用編碼BVH-3、BVH-11或BVH-28肺炎鏈球菌蛋白的pCMV-GH重組質(zhì)粒做DNA免疫，其將誘發(fā)產(chǎn)生對抗各自重組蛋白的抗體。交互的抗體效價，乃定義為吸光值高于背景值0.1時血清稀釋的最高倍數(shù)，其值超過4×103。
實施例4本實施例系說明肺炎鏈球菌重組蛋白的生產(chǎn)與純化。
以電穿孔(Gene Pulser II裝置，BIO-RAD實驗室，Mississauga，Canada)的方式，分別將含有相當于SEQ ID NO1、3或5的BVH-3、BVH-11或BVH-28基因的pET重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至AD494(DE3)(Dara-leu7697 DlacX74 DphoA PvuII phoR DmalF3 F’[lac+(lacIq)]pro)trxB∷Kan)(Novagen，Madison，WI)大腸桿菌中；在此株菌中，控制著融合蛋白表達的T7啟動子，為T7 RNA聚合酶(出現(xiàn)在1DE3原噬菌體上)所辨識，而此聚合酶的基因又在lac啟動子控制下，lac啟動子受異丙基-β-d-硫吡喃半乳糖苷(IPTG)所誘導。將此AD494(DE3)/rpET轉(zhuǎn)化體在37℃，250轉(zhuǎn)/秒下，培養(yǎng)于每毫升含有100μg氨芐西林(Sigma-Aldrich Canada Ltd.，Oakville，Canada)的LB培養(yǎng)液(蛋白胨10g/L，酵母菌提取物5g/L，氯化鈉10g/L)中，直至波長600nm的吸光值達到0.6。而后在加入終濃度為1mM異丙基-β-d-硫吡喃半乳糖苷的情況下再培養(yǎng)2小時，以誘導硫氧還蛋白-His·Tag-BVH-3、硫氧還蛋白-His·Tag-BVH-11或硫氧還蛋白-His·Tag-BVH-28融合蛋白的生成。以離心方式沉淀100ml培養(yǎng)液的細胞，并將之冷凍在-70℃。
利用His·Tag序列(6個連續(xù)組氨酸殘基)會與固定在組織胺酸結(jié)合金屬螯合樹脂上雙價離子(Ni2+)結(jié)合的特性，以親和層析法純化由異丙基-β-d-硫吡喃半乳糖苷誘導AD494(DE3)/rpET所生成可溶性細胞質(zhì)部分的融合蛋白。簡言之，將由100ml異丙基-β-d-硫吡喃半乳糖苷誘導所得的沉淀細胞懸浮于磷酸緩沖溶液(PBS)500mM氯化鈉，pH7.1中，超聲波震蕩破碎后，在20,000xg下離心20分鐘以除去其他破碎片。將懸浮液過濾(膜孔徑為0.22μm)后，置入1毫升的HiTrap(Pharmacia Biotech，Baie dUrfe，Canada)預注可馬上使用的柱中。之后以1M的咪唑-500mM氯化鈉磷酸鹽緩沖溶液，pH7.1，將硫氧還蛋白-His·Tag-鏈球菌融合蛋白洗脫下來。接下來利用透析法用PBS并于4℃下除去樣品中的鹽類與咪唑。并以MicroBCA(Pierce，Rockford，Illinois)來估算從可溶性部分所獲得的融合蛋白的量。
實施例5
本實施例說明利用免疫接種保護老鼠對抗致死肺炎鏈球菌的感染。
在一組8只雌性BALB/c老鼠(Chareles River)中，皮下注射25μg親和法純化的硫氧還蛋白-His·Tag-BVH-3融合蛋白與15μg奎爾A佐劑(Cedarlane Laboratories Ltd，Hornby，Canada)，以3周的間隔共注射三次進行免疫；而在對照組，則只以磷酸鹽緩沖溶液中的奎爾A佐劑注射。在每次免疫前與免疫后第1、22、43天和第三次注射后的第7天(第50天)從眼穴采取血液樣本。一星期之后以約106CFU 3型肺炎鏈球菌株WU2對老鼠激發(fā)免疫反應。將利用于激發(fā)免疫反應的肺炎鏈球菌接種在巧克力瓊脂平板上，以確定CFU與激發(fā)劑量。在14天的時間內(nèi)與第14天記錄死亡率，并將存活的老鼠犧牲采血，檢驗是否有肺炎鏈球菌的存在，存活記錄如表1。
以標準的免疫分析法來分析激發(fā)免疫前血清是否有對抗肺炎鏈球菌抗體的出現(xiàn)；ELISA與印跡分析分析法的結(jié)果皆顯示，以大腸桿菌所生產(chǎn)的肺炎鏈球菌重組蛋白免疫后，引發(fā)了能夠?qū)怪亟M與天然肺炎鏈球菌蛋白的抗體。
表1BVH-3重組蛋白所介導的保護作用
用BVH-3重組蛋白免疫過的老鼠，在感染之后全數(shù)存活；但是只供以佐劑的對照組卻無一存活。兩組老鼠的存活率有著極大的差異性(P＜0.0001，指數(shù)排列試驗[log rank test]對存活曲線的非參數(shù)分析；P＝0.0002，費休氏精確試驗[Fisher’s exact test])在激發(fā)免疫反應后14天，所有存活老鼠的血液細菌培養(yǎng)皆為陰性。
實施例6本實施例描述從不同肺炎鏈球菌株克隆BVH-3與BVH-11基因以及這些基因的分子保守性。
以跨越BVH-3與BVH-11基因不同區(qū)域的DNA探針，分析不同鏈球菌株的染色體DNA后，發(fā)現(xiàn)有一個BVH-3基因拷貝與二個BVH-11基因拷貝。這二個BVH-11基因拷貝并不相同，此處稱之為BVH-11(SEQ ID NO12；讀碼框從第45至2567位核苷酸)與BVH-11-2(SEQ ID NO13；讀碼框從第114至2630位核苷酸)。
BVH-3與BVH-11編碼區(qū)域的第一個氨基酸具引導序列的特征，其亦稱為信號肽(Signal peptide)。在序列中亦發(fā)現(xiàn)了脂蛋白修飾/加工位置的一致性信號肽酶切位L-X-X-C。SP64肺炎鏈球菌BVH-3、BVH-11與BVH-11-2的成熟蛋白質(zhì)分別有1019、821與819個氨基酸。利用PCR(DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR系統(tǒng)2400 PerkinElmer，San Jose，CA)從6或7個的SP64肺炎鏈球菌株的基因組DNA上，擴增肺炎鏈球菌基因上編碼成熟的BVH-3，稱為BVH-3M(核苷酸第1837至4896；SEQ ID NO11)、BVH-11M(核苷酸第102至2567；SEQ ID NO12)、BVH-11-2M(核苷酸171至2630；SEQ IDNO13)等區(qū)域。第6血清型的SP64肺炎鏈球菌株與第9血清型的SP63臨床分離肺炎鏈球菌株由laboratoire de la santépublique duQuébec，Sainte-Anne-de-Bellevue提供；第4血清型的JNR.7/87肺炎鏈球菌株由Andrew Camilli，Tufts University School of Medicine，Boston提供；從第2血清型的D39肺炎鏈球菌株衍生的無莢膜Rx1菌株與第3血清型的A66與WU2肺炎鏈球菌株由David E.Briles(University ofAlabama，Birmingham)所提供；而第3血清型的P4241臨床分離肺炎鏈球菌株則由centre de recherche en infectiologie du centre hospitalier del’universite Laval，Sainte-Foy所提供。用于PCR以擴增BVH-3、BVH-11與BVH-11-2基因的寡核苷酸引物對，分別為皆具有限制位點的OCRR479-OCRR480、HAMJ160-OCRR488與HAMJ160-HAMJ186，例外的是從SP64菌株擴增BVH-11基因所使用的引物，其為HAMJ487與OCRR488。引物序列如下表所示(表2)。利用QIAgen(Chatworth，CA)的QIAquick凝膠萃取試劑盒于瓊脂凝膠上將PCR產(chǎn)物回收，再以Bgl II-Xba I或Bgl II-Hind III(Pharmacia Canada Inc，Baie dUrfe，Canada)限制酶切，切后的產(chǎn)物再以QIAgen(Chatworth，CA)的QIAquick PCR純化試劑盒純化。將PCR產(chǎn)物與Bgl II-Xba I或Bgl II-Hind III的pSL301載體相粘接。粘接的產(chǎn)物再根據(jù)Simanis的方法(Hanahan，D.DNA Cloning，1985，D.M.Glover(ed)，pp.109-135)轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌[φ80 lacZ ΔM15 endA1 recA1 hsdR17(rK-mK+)supE44 thi-1λ-gyrA96 relA1 Δ(lacZYA-argF)U169](Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中。而后以QIAgen的試劑盒純化含有BVH-3、BVH-11或BVH-11-2基因的pSL301重組質(zhì)粒(rpSL301)，再以核苷酸測序(Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing試劑盒，ABI，F(xiàn)osterCity，CA)來確認插入的DNA。圖11與圖12分別描述從BVH-3與BVH-11推衍氨基酸序列所建立的共有序列。比較所有菌株的BVH-3蛋白質(zhì)序列，發(fā)現(xiàn)同一性為99％至100％，但第9血清型的SP63菌株的BVH-3(SEQ ID NO15和SEQ ID NO16)除外，其缺少對應于SP64菌株的BVH-3′蛋白的第244至420氨基酸殘基的一連串共177個氨基酸。分析其他第9血清型的菌株，發(fā)現(xiàn)4個BVH-3分子的中有3個有相同的缺失序列，因而認為此3個菌株應屬第9血清型肺炎鏈球菌克隆的成員。
比較7個肺炎鏈球菌株的13個BVH-11核苷酸序列后，發(fā)現(xiàn)其序列非常類似。利用電腦(MacVecctor，Clustal W 1.4)以多數(shù)排列對照方式分析BVH-11預期的蛋白質(zhì)序列，發(fā)現(xiàn)這些序列在一長834個氨基酸的序列上有75％相同，而有82％的同源性。在配對排列時，同一性則有80％至100％(圖13)。此序列在整個結(jié)構(gòu)中呈現(xiàn)出相當高的相似度。這些蛋白質(zhì)一級序列的改變幾乎都在蛋白質(zhì)C端最后的125個氨基酸，而這些區(qū)域?qū)⒔?gòu)成一個功能部位(domain)。仔細地檢視此功能部位后顯示了兩群序列，圖13的前9個序列屬于一群，但后4個卻屬于另一群。比較(MacVecctor，Clustal W 1.4)13個蛋白質(zhì)功能部位的序列后，發(fā)現(xiàn)有39％相同。當比較屬于同一群的序列時，同一性將提高至92％。
實施例7本實施例說明BVH-3基因與BVH-11基因部分的同源性。
用由BVH-3與BVH-11基因所得的DNA探針做分子分析，顯示BVH-3與BVH-11二者是相關(guān)的。在斑點印跡雜交研究中，DNA探針不是由BVH-3組成就是由BVH-11組成，但都能與BVH-3與BVH-11基因二者雜交，顯示BVH-3與BVH-11擁有同源序列。經(jīng)比較讀碼框與蛋白質(zhì)的序列后，發(fā)現(xiàn)其分別有43％與33％相同。仔細檢視后發(fā)現(xiàn)，相當于BVH-3上第1至225氨基酸與BVH-11上第1至228氨基酸的區(qū)域，在DNA與蛋白質(zhì)水平上分別有73％與75％的相同。相反，在相當于BVH-3上第226至1039氨基酸與BVH-11上第229至840氨基酸的3’端區(qū)域，在DNA與蛋白質(zhì)水平上分別只有34％與22％的相同。因此，BVH-3與BVH-11基因的5’端包含高度保守的序列，其他部分則具有較高的歧異度。這些結(jié)果認為BVH-3與BVH-11可能憑借保守區(qū)域中的序列，而有相似的功能，但是對于BVH-3與BVH-11特定的功能則可能由歧異部分來調(diào)節(jié)。
實施例8本實施例敘述利用聚合酶鏈反應來克隆截短的BVH-3、BVH-11與BVH-11-2基因，以及BVH-3與BVH-11截短分子的表達。
利用成對的寡核苷酸，以PCR來擴增從SP64肺炎鏈球菌株得到的跨越BVH-3(SEQ ID NO1與11)、BVH-11(SEQ ID NO3與12)與BVH-11-2(SEQ ID NO13)等基因的片段。每個引物的5’端皆有限制位點，以使擴增后的產(chǎn)物能夠以符合讀框(in-frame)的方式插入經(jīng)消化的質(zhì)粒的載體(表2與表3)。PCR擴增的產(chǎn)物以限制內(nèi)切酶切過后，粘接于直鏈化的pSL301(見實施例1)、pCMV-GH(見實施例2)或pET(Novagen，Madison，WI)等已被酶作用產(chǎn)生了匹配黏性末端的表達載體。以限制酶切pSL301與pCMV-GH重組質(zhì)粒，使能以符合讀框的方式插入pET表達載體。將所得克隆先在DH5α大腸桿菌中穩(wěn)定下來，然后再引入BL21(λDE3)或AD494(λDE3)的大腸桿菌中以表達截短BVH-3或BVH-11分子。以核苷酸測序來確認每一建構(gòu)的質(zhì)粒。重組蛋白表達時，N端與硫氧還蛋白或His-tag融合或是在C端與His·Tag融合。以超聲波震蕩破碎異丙基-β-d-硫吡喃半乳糖苷所誘導的大腸桿菌培養(yǎng)液后離心取得上清液部分，利用His結(jié)合金屬螯合樹脂(QIAgen，Chatsworth，CA)純化表達的重組蛋白。產(chǎn)生的基因產(chǎn)物如表3所列。對應于N端區(qū)域包括信號序列的基因產(chǎn)物，稱之為脂化蛋白質(zhì)或脂蛋白(L-protein)。對應于缺乏信號序列的N末端區(qū)域的基因產(chǎn)物，稱之為無信號序列的蛋白質(zhì)(w/o ss)
表2PCR所使用的引物
表3從肺炎鏈球菌SP64產(chǎn)生的截短的BVH-3和BVH-11基因產(chǎn)物
實施例9本實施例敘述單克隆抗體的分離，并利用該抗體找出BVH-3、BVH-11與BVH-11-2蛋白質(zhì)抗原表位的特征。
在雌性BALB/c老鼠(Charels River)中，通過皮下注射SP64肺炎鏈球菌BVH-3、BVH-11與BVH-11-2基因的產(chǎn)物與15μg奎爾A佐劑(Cedarlane Laboratories Ltd，Hornby，Canada)而進行免疫。在第一組老鼠(融合實驗1)，于第1與第14天用25μg親和純化的硫氧還蛋白-His·Tag-BVH-3M融合蛋白進行免疫；在第二組老鼠(融合實驗2)則以3的間隔用親和純化的25μg，硫氧還蛋白-His·Tag-BVH-11M進行三次免疫。第三組老鼠(融合實驗3)則在第1和5第15天用親和純化的硫氧還蛋白-His·Tag-BVH-11-2M融合蛋白進行免疫。第四組老鼠(融合實驗4)在第1天以25μg親和純化的硫氧還蛋白-His·BVH-11B融合蛋白進行免疫，并在第16與第37天用磷酸鹽緩沖溶液中的重組BVH-11B做靜脈注射進行加強免疫；在融合前3至4天，將25μg懸浮于磷酸鹽緩沖溶液的抗原，分別靜脈注射至老鼠中。如先前J.Hamel等(J.Med.Microbiol.，23，pp 163-170)所述，將脾臟細胞與不分泌的SP2/0骨髓瘤細胞融合以產(chǎn)生雜交瘤。同時也根據(jù)Hamel(同上)等所述，以酶聯(lián)免疫吸附法對雜交瘤的培養(yǎng)上清液做初步的篩選，該篩選采用以制備的純化重組蛋白與熱殺死的肺炎鏈球菌懸浮液包被的平板。經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法所篩選出對不同抗原有反應的陽性雜交瘤，再利用限制稀釋法進行克隆，加以培養(yǎng)，而后將之冷凍保存。
利用酶聯(lián)免疫吸附法與Western印跡法檢驗雜交瘤對抗BVH-3與BVH-11基因產(chǎn)物的狀況，以確定由單克隆抗體所辨識的抗原表位特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有6個單克隆抗體能辨識BVH-3與BVH-11所共有的抗原表位(H3-1-F9、H3-1-D4、H3-1-H12、H11-1-E7、H11-1-H10與H11-1.1-G11)，此些單克隆抗體對該2個蛋白質(zhì)皆有反應(表4)。SP64肺炎鏈球菌的BVH-11與BVH-11-2分子由單克隆抗體(3A1、13C11、10H10、1D8、10G9、10A2、3E8、10D7、2H7與6H7)確定的共有的抗原表位，并不出現(xiàn)在BVH-3上，而此些單克隆抗體對BVH-11與BVH-11-2重組蛋白皆能反應(表5)。
表4BVH-3免疫反應性單克隆抗體與一系列BVH-3與BVH-11基因產(chǎn)物的反應狀況
表5對抗SP64肺炎鏈球菌BVH-11-2蛋白所生成的單克隆抗體與一系列BVH-11基因產(chǎn)物的反應狀況
a表中所列的單克隆抗體并不與BVH-3重組分子反應。
從單克隆抗體(表4與表5)免疫反應研究所獲的結(jié)果與各個基因所對應的蛋白質(zhì)序列相吻合。事實上與BVH-3及BVH-11分子交互反應的單克隆抗體，能辨別對應于保守區(qū)域的BVH-3C蛋白質(zhì)；對BVH-11與BVH-11-2特異的單克隆抗體，則能與這些分子上不同部分的抗原表位反應。從與單克隆抗體的反應情況即可分辨BVH-3與BVH-11以及BVH-11與BVH-11-2。
實施例10本實施例說明在肺炎鏈球菌中同時表達BVH-3與BVH-11基因。
利用Western印跡法可以檢測BVH-3與BVH-11基因是否在肺炎鏈球菌中表達。在37℃，5％二氧化碳下，將SP63與SP64肺炎鏈球菌株，過夜培養(yǎng)于巧克力瓊脂平板上，再將細菌懸浮于磷酸鹽緩沖溶液中后，于56℃下作用20分鐘，以熱殺死菌體。為了制備抗原，以含有SDS與2-疏基乙醇的樣本緩沖液處理懸浮的肺炎鏈球菌株，于100℃下反應5分鐘。根據(jù)Laemmli[Nature，227，pp.680-685(1970)的方法，利用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將肺炎鏈球菌蛋白抗原分離解析。電泳之后再根據(jù)Towbin[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，pp.4350-4354(1979)]的方法將蛋白質(zhì)以電泳的方式轉(zhuǎn)漬至硝酸纖維素紙上，再以老鼠抗血清與單克隆抗體探測。利用間接的酶聯(lián)免疫分析法，亦即利用綴合的抗鼠免疫球蛋白與顯色基質(zhì)來檢測與抗體反應的抗原。當以對抗重組BVH-3所生成的抗血清與SP64肺炎鏈球菌抗原試驗后，產(chǎn)生了二個大約127kDa與99kDa表觀分子量的反應帶。再以H3-1-F9、H3-1-D4、H3-1-H12、H11-1-E7、H11-1-H10與H11-1.1-G11等單克隆抗體分別當作免疫探針測試后，帶亦同樣出現(xiàn)在相當分子量的位置。相反的是，對BVH-3分子特異的單克隆抗體只檢測127kDa的帶，而對BVH-11分子特異的單克隆抗體只檢測99kDa的帶，因此證實了127kDa與99kDa的帶分別為BVH-3與BVH-11。這些研究證明了BVH-3與BVH-11蛋白質(zhì)同時出現(xiàn)在肺炎鏈球菌中；此外，這些結(jié)果也支持我們先前所觀察的，亦即BVH-3與BVH-11擁有其兩個蛋白質(zhì)所共同的抗原表位以及其他蛋白質(zhì)所沒有的抗原表位。
在SP64肺炎鏈球菌中成熟的BVH-3、BVH-11與BVH-11-2蛋白質(zhì)分別有1019、821與419個氨基酸，其預估的分子量為112.5kDa、92.4kDa與91.7kDa。雖然從序列所估算的分子量與在SDS-PAGE上所計算的分子量有出入，BVH-3仍然能以其較大的分子量與BVH-11做區(qū)別。此外，SP63肺炎鏈球菌的BVH-3分子在SDS-PAGE上表觀分子量為112kDa，有別于SP64菌株的BVH-3的127kDa分子量。這些數(shù)據(jù)亦支持SP63肺炎鏈球菌株的BVH-3有著177個氨基酸殘基的缺失。
實施例11本實施例描述接種BVH-3或BVH-11基因重組產(chǎn)物對受感染老鼠所給予的保護。
在一組7或8只雌性BALB/c老鼠(Charels River)中，以親和純化的硫氧還蛋白-His·Tag-BVH-3M融合蛋白或是親和法純化的硫氧還蛋白-Hix·Tag-BVH-11M融合蛋白或在對照組中以磷酸鹽緩沖溶液中的奎爾A佐劑做皮下免疫注射，每3周注射一次，共三次；在第三次免疫注射后的第12至14天，再以WU2肺炎鏈球菌珠做靜脈內(nèi)攻擊反應或是以P4241菌株做鼻內(nèi)攻擊。將用于攻擊反應的肺炎鏈球菌接種在巧克力瓊脂平板上，以確定CFU與攻擊劑量，攻擊劑量約為106CFU。在攻擊后的14天內(nèi)和第14天記錄死亡率，并將存活的老鼠犧牲采血，檢驗是否有肺炎鏈球菌的存在。存活記錄如表6與表7所示。
表6BVH-3M與BVH-11M重組蛋白在感染致命性WU2肺炎鏈球菌下所提供的保護狀況
a在攻擊后第14天時存活老鼠數(shù)目∶死亡的老鼠數(shù)目。
表7BVH-3M與BVH-11M重組蛋白在感染致命性P4241肺炎鏈球菌下所提供的保護狀況
d在攻擊后第14天時存活老鼠數(shù)目∶死亡的老鼠數(shù)目。
以BVH-3M或BVH-11M蛋白質(zhì)免疫的老鼠在WU2感染后，全部存活；但是在對照組只用佐劑的老鼠卻無一存活。以BVH-3M或BVH-11M蛋白質(zhì)免疫的老鼠在P4214感染后，除有一只外全部存活；但是在只注射佐劑的對照組老鼠卻只有一只存活。在攻擊后第14天，所有存活老鼠的細菌血液培養(yǎng)皆為陰性。這些結(jié)果清楚地顯示，BVH-3M與BVH-11M在老鼠中誘發(fā)了保護性的抗肺炎鏈球菌的免疫反應。而這些蛋白質(zhì)在所分離出肺炎鏈球菌中具有相當高保守性的事實，更強調(diào)了以BVH-3與BVH-11當作普遍疫苗候選者的潛在能力。事實上，第6血清型的SP64肺炎鏈球菌的BVH-3與BVH-11蛋白質(zhì)能針對不同莢膜血清類型的感染誘發(fā)保護作用。
在理想情況下，一個能夠?qū)狗窝祖溓蚓膊〔a(chǎn)生保護作用的疫苗，通常也能對抗腦膜炎、中耳炎、細菌血癥與敗血癥。BVH-3與BVH-11對于致命的系統(tǒng)性與肺炎性感染模式能夠產(chǎn)生保護作用。因此認為，在人類中基于BVH-3與BVH-11蛋白質(zhì)的疫苗，應能減低所有肺炎鏈球菌所引起的廣泛一系列疾病的發(fā)生率。
表6與表7的數(shù)據(jù)，清楚地說明了BVH-3與BVH-11皆為肺炎鏈球菌中有關(guān)誘發(fā)保護作用的分子。但是目前仍不知道，不為BVH-3與BVH-11所共有的特異序列是否亦能調(diào)節(jié)保護作用。在一組雌性BALB/c老鼠(Charels River)中，皮下免疫注射親和純化的硫氧還蛋白-His·Tag-BVH-3AD、-BVH-3B或-BVH-3C融合蛋白與15μg奎爾A佐劑(Cedarlane Laboratories Ltd，Hornby，Canada)，每3周注射一次，共三次。對照組老鼠則只用磷酸緩沖溶液中的奎爾A佐劑或存于佐劑中的硫氧還蛋白-His·Tag或硫氧還蛋白-His·Tag-融合蛋白(His-thio)進行免疫。
為確知NEW4、NEW5、NEW6、NEW7、NEW8、NEW9、NEW10、NEW11、NEW14與BVH-11B等截短蛋白質(zhì)的保護能力，在一組雌性BALB/c老鼠(Charels River)中，皮下免疫注射25μg親和純化的硫氧還蛋白-His·Tag-融合蛋白與15μg奎爾A佐劑，每3周注射一次，共2次；在最后一次免疫后的第10至14天，再以致命的肺炎鏈球菌對老鼠進行攻擊反應。我們的結(jié)果指出，由BVH-3分子第512至1039氨基酸組成的BVH-3B截短蛋白，能引發(fā)對抗使老鼠致命的WU2與P4241菌株的保護作用。同樣地，分別含有BVH-11分子第354至840、286至840與286至713氨基酸的BVH-11B、NEW4與NEW5截短蛋白，對于用WU2進行靜脈內(nèi)攻擊和用P4241菌株進行鼻內(nèi)攻擊，皆能引發(fā)保護作用。此外，以BVH-11-2分子第272至838與227至699位氨基酸組成的NEW10與NEW14免疫，亦能對抗肺炎鏈球菌株所造成的死亡。這些結(jié)果顯示，分別在SP64肺炎鏈球菌BVH-11與BVH-11-2蛋白序上的第286至713與272至699這428個氨基酸的區(qū)域，含有具保護性的抗原表位；13個BVH-11蛋白序列中的這個區(qū)域，同一性為91％，同源性為94％。
表8以BVH-3與BVH-11基因產(chǎn)物接種老鼠后所引發(fā)保護作用效果的評估
a攻擊反應后第14天時，老鼠存活數(shù)目∶死亡數(shù)目。
b以WU2攻擊的劑量為105CFU。
c活過14天的老鼠以存活14天計算以確定平均值。
實施例12本實施例描述編碼嵌合型多肽基因的克隆與表達。所述多肽乃BVH-3羧基末端區(qū)域融合至BVH-11羧基末端的C’端所形成的多肽，用嵌合型多肽免疫接種后，可觀察到額外的保護作用。
從上述的研究可以清楚知道，BVH-3與BVH-11乃同時出現(xiàn)在肺炎鏈球菌上但血清學上有區(qū)別的分子。老鼠的免疫研究結(jié)果表明，此2個蛋白質(zhì)皆為不錯的疫苗候選者。這些蛋白質(zhì)對肺炎鏈球菌，不管其為任何類型，皆能提供對抗其的保護作用；即使這兩個蛋白質(zhì)有共同的抗原表位與序列，它們有著不同的特性，也可能起著不同的生物功能。因此，免疫接種此2個蛋白質(zhì)，將比分別進行單一免疫提供一較高的保護作用。可以探究幾種方法以證實此論點，即將全長或截短的BVH-3與BVH-11以組合或結(jié)合的方式施用。于此我們將描述稱做NEW12(分別為SEQ ID NO76與58)的BVH-3-BVH-11融合基因與蛋白質(zhì)的遺傳工程，以及將NEW12蛋白當作疫苗的可能性。
分別以設計的寡核苷酸對，利用PCR擴增分別橫跨SP64肺炎鏈球菌BVH-3與BVH-11基因3’端第1414至3117(SEQ ID NO1)與第1060至2520位核苷酸(SEQ ID NO3)的BVH-3和BVH-11基因片段；所使用的HAMJ278與HAMJ279以及HAMJ282與HAMJ283引物對，其在5’端有一限制內(nèi)切酶的切位，使得PCR擴增的基因產(chǎn)物得以符合讀框方式克隆至經(jīng)消化的pET21b(+)質(zhì)粒載體上(表2)。以限制酶將PCR擴增產(chǎn)物切過后，與受同樣限制酶作用的直鏈化pET21b(+)質(zhì)粒相粘接，再以測序來確認所建構(gòu)的質(zhì)粒。將含有NdeI-Hind III BVH-3 PCR產(chǎn)物的pET216(+)重組質(zhì)粒用限制酶Hind III與Not I酶作用直鏈化后，使其能以符合讀框方式克隆pET21b(+)重組載體上含有BVH-11基因的Hind III-Not I DNA片段。在未引入BL21(λDE3)大腸桿菌以表達嵌合型肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)前，先將所得克隆穩(wěn)定培養(yǎng)于DH5α大腸桿菌中。這個稱做NEW12的嵌合型重組多肽，表達為在C端融合了His-tag。將異丙基-β-d-硫吡喃半乳糖苷誘導大腸桿菌的培養(yǎng)液超聲波震蕩破碎后，將其離心所得的上清液的部分利用結(jié)合His的組織胺金屬螯合樹脂(QIAgen，Chatsworth，CA)純化所表達的NEW12重組蛋白。
根據(jù)上述相同的步驟，其有可能同時表達NEW1與NEW4、NEW1與NEW5、NEW1與NEW10或NEW1與NEW14以建構(gòu)其他的嵌合型多肽；亦可利用NEW1的上游部分或NEW4、NEW5、NEW10、BVH-11B或NEW14的下游部分來建構(gòu)。也有可能同時表達2個以上的BVH-3、BVH-11或BVH-11-2基因的片段以建構(gòu)其他的嵌合型多肽。
在一組8只的雌性BALB/c老鼠(Charels River)中，皮下免疫注射25μg親和純化的His·Tag-NEW1、-BVH-11B或-NEW12融合蛋白與15μg奎爾A佐劑，每3周注射一次，共2次。在最后一次免疫后的第10至14天，再以致命的肺炎鏈球菌對老鼠進行攻擊。如前所述，分別含有BVH-3蛋白的第472至1039氨基酸與BVH-11蛋白的第354至840氨基酸的NEW1與BVH-11B分子，即為蛋白質(zhì)上皆能引發(fā)保護性免疫反應的部分。為確認嵌合型多肽是否能夠如其各自多肽那樣有效地促進保護作用，攻擊反應劑量將加以調(diào)整，使NEW1與BVH-11B分子不產(chǎn)生預期的保護作用。有趣的是，NEW12嵌合型蛋白能夠引發(fā)保護作用對抗使老鼠致命的WU2與P4241。當以NEW12免疫時，8只老鼠中有7只在攻擊后10天仍能存活，但是以NEW1、BVH-11B與BVH-3M或只有佐劑免疫時，32只老鼠中有28只在攻擊后5天死亡。因此，以NEW12免疫接種的老鼠，能夠?qū)U2的攻擊反應提供一較高的保護。這些結(jié)果顯示，以嵌合型多肽或可能是BVH-3與BVH-11基因產(chǎn)物的組合來免疫，將比單獨施予BVH-3或BVH-11抗原，更能夠提供一額外的保護。
表9以NEW12嵌合型分子接種老鼠所引發(fā)保護作用效果的評估
實施例13本實施例說明肺炎鏈球菌以外的鏈球菌種間與BVH-3與BVH-11相關(guān)序列的鑒定。
如先前所示，BVH-3、BVH-11與BVH-11-2間為相關(guān)蛋白的同一家族且擁有共同序列的蛋白質(zhì)，從這些基因的保守區(qū)域的核苷酸序列做同源性搜尋，同時以FASTA軟件比對GenBank與EMBL中的序列。其中同源性最高者為稱做B群鏈球菌或GBS的無乳鏈球菌屬中一段長為2.469kb的基因，其能編碼一92kDa但未知其功能的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO81)；此基因被稱為BVH-71。在一稱做A群鏈球菌或GAS的化膿鏈球菌屬中，亦鑒定出其與GBS有99.2％的同一性與99.5％的相似性的蛋白(SEQ ID NO83)。BVH-71基因(SEQ ID NO80與82)5’端的第1至71 7核苷酸，與BVH-3(第1至675核苷酸)以及BVH-11(第1至684核苷酸)基因保守區(qū)域同一性分別為58％與60％。GBS和GAS BVH-71開放讀碼框翻譯序列的頭239個氨基酸與BVH-3與BVH-11的頭225與228氨基酸，其同一性分別為51％與54％。除了結(jié)構(gòu)上的相似性外，BVH-3、BVH-11與BVH-71等鏈球菌蛋白質(zhì)也擁有共同的抗原表位。在以GAS或GBS完整細胞的Western印跡法中，利用H11-1.1-G11單克隆抗體對BVH-3與BVH-11保守區(qū)域反應，其在97kDa處出現(xiàn)條帶。同樣地，在Western印跡分析法中也檢測到GAS與GBS的BVH-71重組蛋白。
這些結(jié)果顯示，BVH-71、BVH-3與BVH-11蛋白質(zhì)間可能擁有相似的功能，我們的結(jié)果也認為BVH-71蛋白質(zhì)可用來當作抗鏈球菌的蛋白質(zhì)疫苗成分。在另一具體實施方案中，BVH-71蛋白質(zhì)可用來當作抗GAS或抗GBS的蛋白質(zhì)疫苗成分。
權(quán)利要求
1.一分離的多核苷酸，其所編碼的多肽與SEQ ID NO4、14、58、60-63、67-75、77和79中的任何一種的同一性至少為95％，其中當對個體給藥時，所述多肽引起抗鏈球菌免疫反應。
2.權(quán)利要求1的一分離的多核苷酸，其中所述多肽能夠誘導與具有SEQ ID NO4、14、58、60-63、67-75、77和79中的任何一種氨基酸序列的多肽具結(jié)合特異性的抗體的產(chǎn)生。
3.一分離的多核苷酸，其與權(quán)利要求1所述的多核苷酸互補。
4.一分離的多核苷酸，其與權(quán)利要求2所述的多核苷酸互補。
5.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中所述的核苷酸為DNA。
6.如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其中所述的核苷酸為DNA。
7.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中所述的核苷酸為RNA。
8.如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其中所述的核苷酸為RNA。
9.一載體，其包含被可操作地連接到表達控制區(qū)域的權(quán)利要求1所述的多核苷酸。
10.一載體，其包含被可操作地連接到表達控制區(qū)域的權(quán)利要求2所述的多核苷酸。
11.一宿主細胞，其是被權(quán)利要求9所述的載體轉(zhuǎn)染的。
12.一宿主細胞，其是被權(quán)利要求10所述的載體轉(zhuǎn)染的。
13.一種制造多肽的方法，其包括在適于表達該多肽的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求11所述的宿主細胞。
14.一種制造多肽的方法，其包括在適于表達該多肽的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求12所述的宿主細胞。
15.一分離的多肽，其與SEQ ID NO4、14、58、60-63、67-75、77和79中的任何一種的同一性至少為95％，其中當對個體給藥時，所述多肽引起抗鏈球菌免疫反應。
16.一分離的多肽，其能夠誘導與具有SEQ ID NO4、14、58、60-63、67-75、77和79中的任何一種氨基酸序列的多肽具結(jié)合特異性的抗體的產(chǎn)生。
17.一分離的多肽，其具有選自SEQ ID NO4、14、58、60-63、67-75、77和79的氨基酸序列。
18.如權(quán)利要求17所述的一種分離的多肽，其中N端的甲硫氨酸殘基已被刪除。
19.如權(quán)利要求17所述的多肽，其中的分泌性氨基酸序列已被刪除。
20.一嵌合型多肽，其包含2個或數(shù)個選自SEQ ID NO4、14、58、60-63、67-75、77和79的多肽；條件是所述的2個或數(shù)個多肽相連接以形成嵌合型多肽。
21.一嵌合型多肽，其包含具有SEQ ID NO58、60、62、67-69、72、74和77氨基酸序列的多肽；條件是這些多肽相連接以形成嵌合型多肽。
22.通式(I)所示的嵌合型多肽，其中嵌合型多肽具有通式(I)A-(B)m-(C)n-D (I)其中，m為0或1；n為0或1；A選自SEQ ID NO4、14、58、60-63、67-75、77和79；B選自SEQ ID NO4、14、58、60-63、67-75、77和79；C選自SEQ ID NO4、14、58、60-63、67-75、77和79；和D選自SEQ ID NO4、14、58、60-63、67-75、77和79。
23.權(quán)利要求20的嵌合型多肽，其中具有通式(I)A-(B)m-(C)n-D (I)其中，m為0或1；n為0或1；A選自SEQ ID NO58、60、62、67-69、72、74和77；B選自SEQ ID NO58、60、62、67-69、72、74和77；C選自SEQ ID NO58、60、62、67-69、72、74和77；和D選自SEQ ID NO58、60、62、67-69、72、74和77。
24.一種疫苗組合物，其包含如權(quán)利要求15-23中任一項所述的多肽，與可藥用的載體、稀釋劑或佐劑。
25.權(quán)利要求24的疫苗組合物在制備藥物中的應用，所述藥物用于在易受腦膜炎、中耳炎、細菌血癥或肺炎感染的個體中治療或預防處理腦膜炎、中耳炎、細菌血癥或肺炎感染，其中對所述個體施用治療或預防量的所述的組合物。
26.權(quán)利要求24的疫苗組合物在制備用于治療或預防處理鏈球菌感染的藥物中的應用。
27.如權(quán)利要求25所述的應用，其中該個體為哺乳類動物。
28.如權(quán)利要求25所述的應用，其中該個體為人類。
29.如權(quán)利要求25所述的應用，其中所述腦膜炎、中耳炎、細菌血癥或肺炎感染由肺炎鏈球菌、A群鏈球菌、B群鏈球菌、異常泌乳菌、乳頭菌、土壤絲菌或金黃色葡萄球菌所引起。
30.如權(quán)利要求25所述的應用，其中所述腦膜炎、中耳炎、細菌血癥或肺炎感染由肺炎鏈球菌所引起。
全文摘要
所揭示的為鏈球菌蛋白質(zhì)以及編碼該蛋白質(zhì)的多核苷酸。該蛋白質(zhì)具抗原性，因此為一有用的疫苗組份，可用以預防或治療受鏈球菌感染的動物。另外也揭示了生產(chǎn)蛋白質(zhì)抗原的重組方法與檢測鏈球菌感染的診斷分析。
文檔編號A61P31/04GK1654657SQ200510003749
公開日2005年8月17日 申請日期1999年12月20日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月23日
發(fā)明者喬西·漢梅爾, 伯納德·R·布羅迪爾, 伊沙貝爾·派紐, 丹尼斯·馬丁, 克萊蒙特·里奧斯, 娜莎莉·查蘭得 申請人:益得生物醫(yī)學公司