專利名稱：檢測免疫反應的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及檢測化合物的免疫反應的方法，尤其是在篩選用于治療疾病的化合物中。
背景技術：
傳統(tǒng)上，轉化的永生免疫細胞系一直用作藥物篩選的效應物。例如，巨噬細胞系(RAW 264.7)在免疫調(diào)節(jié)和抗癌藥物篩選領域中是一種最常用的細胞系。然而，這種方案可能忽視重要的原則廣譜免疫調(diào)節(jié)反應的開始要求巨噬細胞，B細胞和T細胞的間接相互作用。結果，具有潛力擔當免疫調(diào)節(jié)藥的化學物和/或藥物在這些“傳統(tǒng)的”篩選體系中會輕易地得出不能誘導癌細胞系的凋亡和/或抗癌細胞因子(例如，TNF-α)的分泌，因為它們的活化途徑中缺乏一些必要組分。因此，它們不能顯示出作為免疫調(diào)節(jié)藥物的真正潛力。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術所述的至少一種或多種問題。最低程度，本發(fā)明的目的是給公眾提供一種有用的選擇。
發(fā)明概述本發(fā)明提供檢測物質(zhì)的免疫反應的方法，包括將所述化合物與有生存能力的脾細胞溫育的步驟。
優(yōu)選地，有生存能力的脾細胞抽提自大鼠。
優(yōu)選地，所述物質(zhì)與脾細胞在緩沖液中于約20-40℃，更優(yōu)選約37℃下溫育。
另外，與有生存能力的脾細胞溫育的物質(zhì)通過兩維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2DE)進行分析，優(yōu)選以檢測至少一種下列蛋白的產(chǎn)量TNF-α，IFN-γ和iNOS，hoemotic蛋白LH-2，細胞色素C氧化酶多肽IV前體，DNA聚合酶β，鳥嘌呤核苷酸-結合蛋白G，T-細胞表面糖蛋白CD5前體以及α-甘露糖苷酶II。
優(yōu)選地，所述物質(zhì)與脾細胞在緩沖液中于pH約5-9，更優(yōu)選于pH約7下溫育。
附圖簡述本發(fā)明優(yōu)選的實施方案通過實施例方式并參照附圖現(xiàn)將加以解釋，在附圖中

圖1利用Wright-Giemsa染色(X1000)示出分離的脾細胞；圖2示出Rg1對TNF-α，IFN-γ分泌和iNOS合成的影響，圖2A，2B和2C分別示出Rg1處理后TNF-α，IFN-γ分泌和iNOS合成的免疫印跡；圖3示出采用和沒采用Rg1(5μg/ml)處理后從脾細胞中分泌TNF-α和IFN-γ的時程；圖4示出通過“二位一體(Two-in-One)凝膠”比較，在Rg1存在或缺乏下，脾細胞中的差異蛋白表達。Rg1處理樣品示于左邊，而對照樣品示于右邊。4A示出pH 4-5.5的樣品，而4B示出pH 5.5-7的樣品；圖5示出通過總結Rg1對脾細胞蛋白表達的影響，Rg1對脾細胞中蛋白表達的影響，以及涉及Rg1對脾細胞的免疫調(diào)節(jié)活性的可能的調(diào)節(jié)機理。
優(yōu)選實施方案的詳述本發(fā)明參照附圖通過實施例方式在以下段落中加以描述。
本發(fā)明的目的，特征和方面在下文中公開，或者從下文中顯而易見。本領域普通技術人員應理解，下文僅是對示例性實施方案的描述，并非旨在限制本發(fā)明的范圍，更寬的范圍體現(xiàn)在代表性解釋中。
在本發(fā)明中，與傳統(tǒng)利用細胞系的方法相反，脾細胞原始培養(yǎng)物用于藥物篩選中。這種脾細胞培養(yǎng)物含有全部3種對起始廣譜免疫反應所必需的免疫細胞(約30％B淋巴細胞，60％CD3+T淋巴細胞和5％巨噬細胞)。這類脾細胞可抽提自任何適于藥物篩選的哺乳動物，例如大鼠，狗，貓，小鼠，豚鼠，牛，鹿，猴子等。
為了實施藥物篩選功能，脾細胞必須是有生存能力的。術語“有生存能力”在此表示脾細胞仍是活的，對此現(xiàn)有技術能夠操作。這種有生存能力的細胞在細胞和0.4％w/v臺盼藍溶液1∶1的混合物中不會被臺盼藍染色。有生存能力的脾細胞可采用已知方法從動物中去除，合適的實施例將在下文中進行描述。非生存能力的細胞在篩選平臺上不可用作效應物，因為它們不能被藥物候選物刺激，和/或彼此有效相互作用。有生存能力的脾細胞通?？稍趧游锛毎囵B(yǎng)工作所常用的大多數(shù)培養(yǎng)基中令人滿意地加以培育。然而，脾細胞不可經(jīng)受極端溫度范圍(即低于20℃和高于40℃)。有生存能力的脾細胞的最適溫度為37℃。此外，如果培養(yǎng)基處于極端pH(即高于pH 9和低于pH 5)下，脾細胞的生存力也將下降。
待檢測的化合物一般以溶液的形式存在，然后通過多種方法將其施用給有生存能力的脾細胞。例如，化合物(沒有內(nèi)毒素污染)可被直接添加到有生存能力的脾細胞上。這當然會隨待檢測化合物的不同而不同，但是將化合物添加給脾細胞不是本發(fā)明的主題。
在檢測人參Rg1的免疫反應中采用有生存能力的脾細胞將在下文詳細描述。
實施例高度純化的Rg1為人參中一種主要的皂角苷，已經(jīng)顯示可抑制癌細胞的生長。其刺激DNA，蛋白和脂類在動物組織中的生化合成。Rg1還顯示擔當免疫調(diào)節(jié)劑，使得內(nèi)皮細胞中一氧化氮產(chǎn)量在Rg1誘導后增加，T輔助細胞活性，細胞因子IL-1以及自然殺傷細胞的產(chǎn)量增加。其他屬性包括選擇性增強淋巴細胞的增殖和IL-2的產(chǎn)生。假設人參苷(ginsenoside)抗致癌效應可能與或通過胱冬肽酶(caspase)3和/或由活性氧起始的凋亡效應相關。盡管對人參效應的研究歷史悠久，但其作用的分子機理大部分仍知之甚少。
材料和方法動物周齡8-10、體重200g的雄性Sprague Dawley大鼠由香港理工大學應用生物和化學技術系動物中心(the animal holding center of theDepartment of Applied Biology and Chemical Technology，The HongKong Polytechnic University)提供。所有研究都是根據(jù)最新公布的對實驗室動物護理和使用的NIH指南(the NIH Guide for the Care and Useof Laboratory Animals)中所述的原理和程序進行的。動物倫理學批文已從香港理工大學動物倫理學分委員會獲得。
制備大鼠脾細胞將大鼠在醚深度麻醉下放置，并經(jīng)腹部大動脈放血。通過無菌技術移出脾臟，接著在10ml含有1000U/ml青霉素-鏈霉素(PS)(Gibco，USA)的RPMI-1640(Gibco，USA)培養(yǎng)基中洗滌兩次。把脾臟切成小塊后，在塑料注射器中用柱塞上下抽吸。制備單個細胞懸浮液，并放置在含有1000U/ml PS和5％檸檬酸葡萄糖的同樣培養(yǎng)基中。然后通過梯度離心將單細胞懸浮液分層到Ficoll-Pague Plus梯度(Amersham Bioscience，H.K.Ltd.)上而分離脾細胞，室溫下以400g離心35分鐘。收集含脾細胞的組分。室溫下加入4倍體積的冰冷氯化銨溶液(pH 7.4)而裂解紅細胞5分鐘，將脾細胞在普通培養(yǎng)基中洗滌兩次。淋巴細胞用Wright-Giema著色劑染色后，再在光學顯微鏡下檢查。臺盼藍染色后，經(jīng)光學顯微鏡檢查細胞生存力和數(shù)目。將脾細胞(1×106)培養(yǎng)在含有1000U/ml PS、補充有2g/L碳酸鈉的完全RPMI-1640培養(yǎng)基上。24小時溫育后，使細胞重懸浮在含有10％FCS(Gibco，USA)的同樣培養(yǎng)基上，并進行多種處理。
用Rg1刺激脾細胞將Rg1(常用劑量5μg/ml)加入到位于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)6孔平底板(Nunc Maxisorp，USA)上脾細胞的PBS緩沖液中。在不同時間點(12-72小時)從溫育混合物中采集條件培養(yǎng)基的樣品。這些樣品儲存在-80℃?zhèn)溆?。樣品保存不超過兩個月。此外，在Rg1處理的脾細胞的樣品(間隔12和24小時)中使用2-DE分析也進行全蛋白的表達。與PBS溫育24小時的細胞用作對照。
Western印跡和免疫檢測在不同時間點采集與Rg1溫育和沒有與Rg1溫育的脾細胞培養(yǎng)物的上清液，并且用于檢測TNF-α和IFN-γ。同樣，脾細胞裂解液用于檢測iNOS的表達。上清液/裂解液中的蛋白含量通過Bradford方法(Bio-Rad Laboratory，USA)確定。對于各個分析，通過12.5％還原性SDS-PAGE膠在恒壓(150V)下電泳1小時，分析350μg蛋白。蛋白轉移至硝酸纖維素膜(Millipore，USA)上。洗滌和封閉后，以1∶500的稀釋度，對這些膜用下列探針進行檢查兔抗大鼠iNOS(Transduction Laboratories，USA)，兔抗大鼠TNF-α(PropTech，USA)或兔抗大鼠IFN-γ(PropTech，USA)。室溫溫育2小時后，洗滌這些膜，然后與1∶20,000稀釋的結合有IgG(Sigma，USA)的山羊抗兔辣根過氧化物酶(HRP)溫育。使用SuperSignal West PicoChemiluminescent試劑盒(Pierce，USA)檢測陽性結合，而使用分子動力學密度儀(Molecular Dynamics Densitometer)(Bio-RadLaboratories，USA)掃描曝光的X線膠片(Kodak)。
ELISA測定使用OptEIATM大鼠IFN-γ和TNF-α試劑盒(Pharmigen，USA)進行IFN-γ以及TNF-αELISA測定。對使用或沒用Rg1刺激的脾細胞進行檢測。在這些試劑盒中，單克隆抗大鼠IFN-γ或TNF-α抗體用作一級抗體，而生物素?；膯慰寺】勾笫驣FN-γ或TNF-α抗體用作二級抗體。加入親和素-HRP結合物后，再加入2，2-Azin-bis-3-thylbenzthiazoline-6-sulfonic acid顯色，并且采用微滴定板讀數(shù)儀(Bio-Rad Laboratories，USA)在吸光度405nm處監(jiān)測顏色變化。與標準相比，計算IFN-γ和TNF-α的量。
2-DE分析脾細胞裂解液樣品制備在與或不與Rg1溫育后，將培養(yǎng)皿上的脾細胞以RPMI-1640沖洗一遍。隨后，加入含有0.2g/L EDTA的0.5g/L胰蛋白酶，溫育3分鐘。以1000g離心5分鐘收集細胞，并用PBS(pH 7.2)洗滌兩次。然后將脾細胞用最低量的含有4％Triton X-100，9M尿素和1mMPMSF的裂解緩沖液(通常200μl)在冰上裂解10分鐘。以3000g離心10分鐘收集上清液，采用Bio-Rad Laboratories，USA的蛋白分析試劑盒通過改進的Bradford法測量蛋白含量。經(jīng)同樣處理的不同動物的細胞裂解液以1∶1的蛋白比率合并在一起，并用作2-DE分析。120μl的脾細胞裂解液[在含有9M尿素，2％w/v Triton X-100，0.5％w/vDDT(Sigma，USA)，0.4％v/v IPG緩沖液4-7(Amersham PharmaciaBiotech，Uppsala，Sweden)和痕量溴酚蘭的緩沖液中至終體積300μl中]用于膠內(nèi)樣品再水合。
2-DE把樣品上樣到IPG膠條pH 4-7(3×170mm，Bio-RadLaboratories，USA)。使用Protean IEF儀(Bio-Rad Laboratories，USA)或IPGphor(Amersham Biosciences，USA)進行再水合和隨后的等電聚焦。室溫下在覆蓋有低粘度石蠟油的IPG膠條固定器上以50V進行再水合16小時。然后依序使用500V(1小時)，1000V(1小時)，4000V(2小時)和8000V(2小時)進行等電聚焦。膠條平衡在pH 6.8，含有1％(w/v)DTT(Sigma，USA)、9M尿素、30％v/v甘油、2％w/vSDS和痕量溴酚蘭的50mM Tris-HCl平衡緩沖液中10分鐘。平衡后，IPG膠條轉移至12.5％SDS-PAGE凝膠(1600×1600×1mm)，用于在Protean VI電泳槽中室溫下以恒電流30mA/凝膠電泳進行第二維分離。隨后，使用與MALDI-TOF分析相容的方法對膠銀染。銀染的膠以分子動力學密度儀(Bio-Rad Laboratories，USA)掃描。所得2-DE形式采用軟件Melanie III(Bio-Rad Laboratories，USA)加以分析。在銀染蛋白點中以體積百分比變化的基礎上，對相對量的變化進行評價。目的點變化在多凝膠上測試用于重現(xiàn)性。
銀染使蛋白顯現(xiàn)按本發(fā)明人使用MALDI-TOF質(zhì)譜儀的制造商Bruker Deltonics(USA)所建議的質(zhì)譜儀相容的方案進行銀染。簡而言之，首先將凝膠在含有50％v/v甲醇，12％v/v乙酸，0.0375％v/v甲醛的固定溶液中固定2小時。隨后用50％甲醇另洗滌凝膠20分鐘。洗滌步驟重復兩次。凝膠在含有0.05％硫代硫酸二鈉的溶液中氧化1分鐘，接著用milli-Q水洗滌(三次，每次20分鐘)。把凝膠在含有0.0375％甲醛的0.2％硝酸銀中溫育20分鐘。再次用milli-Q水洗滌凝膠三次，每次20分鐘。然后在含有0.0375％甲醛和0.004％硫代硫酸二鈉的15％碳酸鈉溶液中使凝膠顯色，直到凝膠達到所需量的染色。該過程不應長于10分鐘。最后，用含有12％乙酸的25％甲醇終止反應。
蛋白鑒定或通過軟件Melanie III(Bio-Rad，USA)進行圖像分析，或直接利用如前所述的“二位一體”膠法(Wang，A.Y.Y.，Cheung，B.Y.，Wong，M.S.，Lo，S.C.L.兩維電泳后“二位一體”凝膠用于點匹配，Proteomics2003，3，580-583)加以比較，而將不同處理后差異表達的蛋白定位于2-DE凝膠上。使用MALDI-TOF-MS(Autoflex，Bruker Daltonics，Germany)通過肽質(zhì)量指紋識別選擇和鑒定若干種差異表達的蛋白點。含有差異表達的蛋白點的膠塞從2-DE凝膠上切去，并用胰蛋白酶消化(采用由Bruker Daltonics，Germany建議的方案，該方案是如先前由Shevchenko等(Shevchenko A，Wilm M，Vorm O，Mann M.質(zhì)譜測序蛋白銀染的聚丙烯酰胺凝膠。Aanl.Chem.68850-8，1996)所述方法的改進)。簡而言之，膠塞被切成小塊，用milli-Q水洗滌兩次，接著用25mM碳酸氫銨的50％乙腈洗滌。樣品中的半胱氨酸殘基用10mMDTT還原，并用55mM碘代乙酰胺處理而衍生化。乙腈再水合和干燥后，樣品用胰蛋白酶(5ng/μl胰蛋白酶的25mM碳酸氫銨)37℃下消化過夜。消化樣品用50％乙腈/1％三氟乙酸通過超聲抽提。收集含有消化的肽的上清液。消化的肽(0.5μl-1.5μl)與1-2μl的α-氰基-4-羥基肉桂酸(10mg/ml的50％乙腈，0.1％三氟乙酸)基質(zhì)和100fM促腎上腺皮質(zhì)激素(ATCH)片段18-39混合作為內(nèi)標。儀器以陽離子反射方式在20kV加速壓下操作。所得肽質(zhì)量指紋使用矩陣科學(Matrix Science)的MSCOT搜索引擎對Swiss-Prot進行檢索。所有檢索都使用1-100kDa的質(zhì)量窗以質(zhì)量公差±100ppm進行。每個樣品允許有一個失誤切割，而半胱氨酸假定是氨基甲酰胺基甲基化的，以及甲硫氨酸為氧化形式。
結果脾細胞分離如上文方法所述制備脾細胞，并在Wright-Giemsa染色后檢查細胞。采用Leica Q500MC成像處理和分析系統(tǒng)(Leica，Germany)，分離的脾細胞(大和小淋巴細胞)圖像示于圖1中。未見紅細胞污染。臺盼藍染色證實95％以上的分離細胞是有生存能力的。由于大和小淋巴細胞皆存在，該制備物可用作研究Rg1的免疫調(diào)節(jié)活性的效應物。
根據(jù)IFN-γ，TNF-α和iNOS產(chǎn)量測定Rg1對脾細胞的影響在成功制備有生存能力的脾細胞之后，加入Rg1作為刺激物以研究這些脾細胞可能的反應。Western印跡檢測IFN-γ和TNF-α在培養(yǎng)基中的分泌。iNOS的表達也在脾細胞裂解液中加以測試。大多數(shù)藥理學研究Rg1所用的濃度為5-20μg/ml。一方面，預備研究利用5μg/ml的Rg1，導致在IFN-γ和TNF-α試驗中的陽性結果。因此，5μg/ml的Rg1用于本發(fā)明人試驗中。IFN-γ，TNF-α和iNOS在不同時間間隔處Rg1誘導時Western印跡的結果示于圖2(2A為TNF-α，2B為IFN-γ，而2C為iNOS)中。沒有Rg1處理的脾細胞用作比較用對照。結果顯示，對照組在72小時的溫育過程中，細胞培養(yǎng)基或脾細胞裂解液均未檢測到IFN-γ，TNF-α和iNOS。另一方面，當用5μg/ml Rg1刺激時，可檢測到兩個細胞因子和iNOS。TNF-α在間隔24小時和48小時皆被檢測到，而IFN-γ在24小時被檢測到。誘導的NOS在用Rg1溫育后12小時和24小時被檢測到。隨后，利用ELISA對培養(yǎng)基的系列樣品進行這些抗癌細胞因子(IFN-γ和TNF-α)的定量記錄。各個條件重復測定三次，結果示于圖3中。兩個細胞因子的分泌方式誘導后很相似。這些細胞因子的數(shù)量在Rg1誘導后增加1000倍以上，而其水平在溫育24小時時達到最高。24小時后，兩個細胞因子分泌水平隨著溫育時間延長開始下降。該結果也與Western印跡的結果一致，在Western印跡中，最高的IFN-γ和TNF-α分泌出現(xiàn)在Rg1誘導后24小時處。
Rg1對蛋白表達的影響由于Rg1發(fā)現(xiàn)在溫育24小時后誘導IFN-γ和TNF-α生產(chǎn)，因此在溫育24小時后還研究了Rg1對脾細胞蛋白質(zhì)組(proteome)的影響。同樣處理的樣品以1∶1的蛋白比率合并，并用于如材料和方法中所述的2-DE分析。無論在PBS還是在含有Rg1的PBS中，全部樣品皆在溫育24小時后采集。與PBS溫育的樣品用作比較用對照。為了便于鑒定差異表達的蛋白，如前所述(Wang等，2003)進行“二位一體”凝膠方法。簡而言之，樣品第一維IEF(使用或沒用Rg1溫育)分開在不同Protean IEF細胞中但同時進行。IEF完成后，將IEF膠條切成等半。半份IEF膠條對應于同樣的pH范圍，但以不同樣品(有或無Rg1溫育)電泳，并排放到Protean VI電泳裝置中制備的第二維SDS-PAGE的頂部。所得對照樣品的凝膠和Rg1處理樣品的凝膠在銀染后利用Melanin III加以比較。圖4表明蛋白表達在正常樣品和Rg1處理樣品中的差異。在用正常樣品電泳的一半凝膠中約有102個蛋白點被檢測，而在用Rg1處理的樣品電泳的另一半凝膠中有122個蛋白點被檢測。
蛋白鑒定在凝膠內(nèi)胰蛋白酶消化后，MALDI-TOF-MS用于鑒定差異表達的蛋白。7個差異表達的蛋白點通過MASCOT搜索引擎得以成功鑒定。6個蛋白被上調(diào)，包括細胞色素C氧化酶，homeotic蛋白LH-2，T細胞表面糖蛋白CD5，DNA聚合酶β，α-甘露糖苷酶II以及鳥嘌呤核苷酸結合蛋白G。其他蛋白發(fā)現(xiàn)是下調(diào)的，并且被鑒定為假設的抗增殖因子。7個鑒定的蛋白的詳情匯總在表1中。
表I.脾細胞的差異表達的蛋白點的身份。
討論大鼠脾細胞由巨噬細胞，T細胞和B細胞組成。這群細胞用作效應物對Rg1是否存在免疫調(diào)節(jié)活性進行測試。利用Western印跡和ELISA，發(fā)現(xiàn)Rg1刺激了脾細胞的IFN-γ，TNF-α和iNOS的產(chǎn)生。Rg1誘導后，IFN-γ和TNF-α的產(chǎn)量在24小時達到峰值。本發(fā)明人的結果與Gao等(Gao H.，Wang，F(xiàn).，Lien，E.J.，Trousdale M.D.PharmaceuticalResearch 1996，13，1196-200)的報道相似，其中在用三七(Panaxnotoginseng)的粗制品對分離自小鼠脾臟的淋巴細胞誘導后24小時和48小時檢測到最高量的IFN-γ和TNF-α。在本發(fā)明人的試驗中，對IFN-γ和TNF-α的產(chǎn)生達到其峰值的時間較短。這可能是由于下列事實純化的Rg1而非粗制品用于本發(fā)明人的研究中。
另一方面，Rg1對分子水平的作用方式可能已被揭示出來，這在其他研究中尚未發(fā)現(xiàn)。脾細胞中的差異蛋白表達通過Rg1誘導加以研究?；谥苯颖容^“二位一體”凝膠的蛋白表達，發(fā)現(xiàn)了蛋白表達在正常樣品和Rg1處理樣品之間的顯著變化。有87個蛋白發(fā)現(xiàn)是上調(diào)的，而另有38個蛋白發(fā)現(xiàn)是下調(diào)的。還有38個點沒有任何顯著的變化。
胰蛋白酶消化后，利用MALDI-TOF-MS對差異表達蛋白進行了選擇和鑒定。有7個蛋白成功地得以鑒定，其中6個是上調(diào)蛋白。它們是細胞色素C氧化酶，homeotic蛋白LH-2，T細胞表面糖蛋白CD5，DNA聚合酶β，α-甘露糖苷酶II以及鳥嘌呤核苷酸結合蛋白G。剩余蛋白點(假設的抗增殖因子)發(fā)現(xiàn)是下調(diào)的。從文獻中可知，DNA聚合酶β相關于DNA合成。其上調(diào)表明Rg1刺激DNA合成。該刺激是否通過類固醇激素依賴的或不依賴的途徑介導現(xiàn)在還未知。Rg1對DNA合成的刺激效果也在大鼠和小鼠骨髓細胞中被觀察到。另一方面，還有兩個上調(diào)蛋白homeotic蛋白LH-2和T細胞表面糖蛋白CD5已知參與B細胞和T細胞增殖。據(jù)報道，homeotic蛋白LH-2是B淋巴細胞分化的早期標記，也參與控制B細胞分化(Xu，Y.，Baldassare，M.，F(xiàn)isher，P.，Rathbun，G.，Oltz，E.M.，Yancopoulos，G.D.，Jessell，T.M.，Alt，F(xiàn).W.Proc Natl Acad Sci USA.，1993，90，227-31)。T細胞表面糖蛋白CD5為一跨膜蛋白，已知在調(diào)節(jié)T細胞增殖中擔當受體(Vermeer，L.A.，deBoer，N.K.，Bucci，C.，Bos，N.A.，Kroese，F(xiàn).G.，Alberti，S.Eur.J.Immunol.1994，24，585-92)。另兩個鑒定的上調(diào)蛋白細胞色素C氧化酶和α-甘露糖苷酶II可能參與細胞代謝過程。細胞色素C氧化酶是一種參與呼吸鏈的氧化性磷酸化作用的線粒體膜酶(Kadenbach，B.Biochim.Biophys.Acta 2003，1604，77-94)。由于ATP是呼吸過程的終產(chǎn)物之一，當細胞色素C增加時ATP的合成也很可能增加。已知細胞內(nèi)高的ATP含量歸功于細胞生長和增殖用的能量供應。細胞色素C氧化酶還參與cAMP生成的跨膜信號傳導途徑(Frizzell，R.A.Am J Respir Crit Care Med.1995，151，S54-8)。α-甘露糖苷酶II為高爾基膜蛋白，控制甘露糖轉化為復合的N-glycon。其可能參與溶酶體合成，因為注定為溶酶體的蛋白在高爾基體內(nèi)通過加入6-磷酸甘露糖被共價修飾。然而，其真正的功能還不清楚。
鳥嘌呤核苷酸結合蛋白G是另一上調(diào)蛋白，為膜相關蛋白，其將許多類型的膜受體連接到多種第二信使系統(tǒng)上(Gilman，A.G.Ann.Rev.Biochem.1987，56，615-49)。β和γ亞基為把α亞基(一種外周蛋白)固定至質(zhì)膜上的疏水整合膜蛋白。已知G蛋白的一個組分Gsα·GTP能夠結合到腺苷酰基環(huán)化酶，這刺激cAMP的產(chǎn)生(Lania，A.，Mantovani，G.，Spada，A.Eur.J.Endocrin.2001，145，543-559)。據(jù)報道，Rg1可增加老年動物中胞內(nèi)cAMP和cGMP，導致白介素2(IL-2)的表達以及脾細胞增殖(Liu M.，Zhang J.T.Yao Xue Xue Bao，1996，31，95-100)。因此，鳥嘌呤核苷酸結合蛋白G的上調(diào)可能暗示cAMP水平相應的增加，而這又誘導IL-2表達和脾細胞增殖的相應增加。假設的抗增殖因子，盡管其真正的功能還未確立，但據(jù)信抑制細胞增殖。因此，這種蛋白在Rg1處理后的下調(diào)表明細胞增殖的機會增加。
上述結果還顯示，Rg1處理后12小時和24小時檢測到iNOS。誘導的NOS已知產(chǎn)生一氧化氮，其在諸如血管舒張、抑制血小板聚集和神經(jīng)傳遞的不同生理過程中起重要作用。一氧化氮也已知擔當細胞毒介導劑，并且歸功于巨噬細胞的殺菌和殺腫瘤活性[36]。因此，iNOS的上調(diào)可用于評價細胞的殺菌活性。這種酶的產(chǎn)生可能受到細胞因子(IFN-γ和TNF-α)的調(diào)節(jié)。Karupiah等報道了病毒復制受到IFN-γ誘導的NOS的抑制(Karupiah，G.，Xie，Q.W.，Buller，R.M.，Nathan，C.，Duarte，C.，MacMicking，J.D.Science 1993，261，1445-48)。這些研究人員提出了誘導NOS對于IFN-γ的實際抗病毒效果是必需和足夠的。文獻中還清楚記載了IFN-γ可與TNF-α協(xié)同作用，促進iNOS的基因表達。此外，細胞色素C氧化酶和ATP在Rg1處理后的增加可能還增加iNOS的生成。蛋白激酶C(PKC)活性對于iNOS表達是必要的，其中PKC在結合到膜受體的過程中需要ATP。還已知PKC-介導的信號傳導刺激G蛋白的活性。因此，iNOS的增加也會導致IL-2，IFN-γ和TNF-α的量的增加。7種鑒定的蛋白以及IL-2，IFN-γ，TNF-α和iNOS可能的相互作用所顯現(xiàn)出的免疫調(diào)節(jié)效果匯總在圖5中。
總之，免疫調(diào)節(jié)是一復雜的活動，涉及多種蛋白和細胞組分之間的相互作用。使用脾細胞對Rg1免疫調(diào)節(jié)活性進行篩選已證明在了解涉及Rg1免疫調(diào)節(jié)的機理方面是成功的。本發(fā)明可提供大規(guī)模篩選免疫調(diào)節(jié)用TCM以及癌癥治療新藥物的構思。
盡管本發(fā)明的優(yōu)選實施方案已通過實施例詳細描述，但是顯而易見，本領域技術人員會對此進行修飾和改進。另外，本發(fā)明的實施方案不應解釋為僅受到實施例或附圖的限制。然而，特別值得注意的是，這些修飾和改進也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，正如權利要求書所述。例如，作為一個實施方案的部分所述的特征可用于另一實施方案中從而產(chǎn)生其他實施方案。因此，本發(fā)明旨在覆蓋如同在權利要求的范圍內(nèi)的這些修飾和變化及其等同物。
權利要求
1.一種檢測物質(zhì)對生物體的工作機理的方法，包括將該化合物與有生存能力的脾細胞溫育的步驟。
2.權利要求1的方法，其中有生存能力的脾細胞抽提自大鼠。
3.權利要求1的方法，其中該物質(zhì)與脾細胞在緩沖液中約20-40℃下溫育。
4.權利要求3的方法，其中該物質(zhì)與脾細胞在緩沖液中約37℃下溫育。
5.權利要求1的方法，其進一步包括通過兩維聚丙烯酰胺凝膠電泳分析與有生存能力的脾細胞溫育的物質(zhì)的步驟。
6.權利要求5的方法，其進一步包括檢測至少一種下列蛋白和/或其前體和/或其分解產(chǎn)物產(chǎn)量的步驟TNF-α，IFN-γ和iNOS，hoemotic蛋白LH-2，細胞色素C氧化酶多肽IV前體，DNA聚合酶β，鳥嘌呤核苷酸-結合蛋白G，T-細胞表面糖蛋白CD5前體以及α-甘露糖苷酶II。
7.權利要求1的方法，其中該物質(zhì)與脾細胞在緩沖液中pH約5-9下溫育。
8.權利要求7的方法，其中該物質(zhì)與脾細胞在緩沖液中pH約7下溫育。
9.權利要求1的方法，其中工作機理為免疫反應。
全文摘要
傳統(tǒng)上，轉化的永生免疫細胞系一直用作藥物篩選的效應物。這種方案可能忽視重要的原則廣譜免疫調(diào)節(jié)反應的開始要求巨噬細胞，B細胞和T細胞的間接相互作用。本發(fā)明利用有生存能力的脾細胞提供檢測物質(zhì)的免疫反應的方法。
文檔編號A61P37/00GK1645143SQ20051000420
公開日2005年7月27日 申請日期2005年1月14日 優(yōu)先權日2004年1月14日
發(fā)明者盧俊立, 黃文秀, 王淵淵 申請人:香港理工大學