專利名稱：一種蒽環(huán)類抗腫瘤藥物脂質(zhì)體及其生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蒽環(huán)類抗腫瘤藥物脂質(zhì)體及其生產(chǎn)工藝，具體地說是阿霉素、表阿霉素和柔紅霉素的脂質(zhì)體和它們的硫酸銨梯度法生產(chǎn)工藝，屬于化學(xué)制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蒽環(huán)類抗腫瘤藥物如阿霉素、表阿霉素和柔紅霉素是臨床上常用的廣譜抗腫瘤藥物。目前主要應(yīng)用于乳腺癌、婦科腫瘤、胃腸腫瘤、頭頸腫瘤、肺癌、血液系統(tǒng)腫瘤、惡性淋巴瘤等。其中代表藥物是阿霉素，又稱作多柔比星(doxorubicin)，其抗腫瘤作用原理是抑制DNA合成及依賴DNA的mRNA的合成，及影響線粒體的功能結(jié)構(gòu)。雖然阿霉素作為一線用藥用途廣泛，但是由它引起的毒副作用是嚴(yán)重的。主要為限制劑量的心臟毒性，主要表現(xiàn)為心律失常、心電圖異常，嚴(yán)重的會出現(xiàn)不可逆的心功能衰竭和心肌??；劑量限制毒性還有骨髓抑制，表現(xiàn)為嚴(yán)重的粒細(xì)胞減少；此外還有胃腸道反應(yīng)、脫發(fā)、漏出血管導(dǎo)致局部軟組織炎癥壞死等。這些毒副作用極大地限制了阿霉素的臨床應(yīng)用，使應(yīng)用累積劑量不能超過550mg/m2。產(chǎn)生這些毒性與阿霉素在體內(nèi)代謝時(shí)間短同時(shí)全身分布有關(guān)。為有效應(yīng)用阿霉素降低心臟骨髓毒性，半合成表阿霉素得到臨床醫(yī)生的青睞，其與阿霉素的結(jié)構(gòu)不同在于氨基糖部分的4′位羥基由順式變?yōu)榉词?。表阿霉?epirubicin)也是廣譜抗腫瘤藥物，其引起的心臟骨髓毒性比阿霉素明顯減輕。柔紅霉素(daunorubicin)又稱正定霉素，目前主要用于白血病和一些實(shí)體腫瘤化療，毒性與阿霉素相類似。
脂質(zhì)體為磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)，主要成分是磷脂和膽固醇，與人體正常細(xì)胞膜相近，因而對人體無毒性無免疫原性，近年來被用于一些抗腫瘤藥物的包裹。由于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞破壞通透性增高，加上缺乏淋巴回流，脂質(zhì)體非常容易漏出腫瘤血管到腫瘤間質(zhì)中。當(dāng)藥物被投放到病灶部位后，藥物從脂質(zhì)體中緩慢釋放出來，以單純擴(kuò)散形式進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，達(dá)到降低毒性提高療效的目的，因此用脂質(zhì)體包裹蒽環(huán)類抗腫瘤藥物不失為一種理想的降低毒性提高療效的方法。
目前國外已有脂質(zhì)體阿霉素和柔紅霉素產(chǎn)品問世。其中脂質(zhì)體阿霉素為新一代隱形脂質(zhì)體，美國FDA批準(zhǔn)用于艾滋病卡波基肉瘤、卵巢癌和轉(zhuǎn)移性柔腺癌的治療，商品名為Doxil(美國)/Caelyx(歐洲)。另外，脂質(zhì)體柔紅霉素(商品名為DaunoXome)也得到FDA批準(zhǔn)上市。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的主要技術(shù)問題是提供一種毒副作用小、穩(wěn)定性高、體內(nèi)循環(huán)時(shí)間長的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物脂質(zhì)體。
本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供這種蒽環(huán)類抗腫瘤藥物脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種蒽環(huán)類抗腫瘤藥物脂質(zhì)體，由蒽環(huán)類抗腫瘤藥物、脂質(zhì)體材料和抗氧化劑組成，藥/脂比例(w/w)為0.05～0.2∶1；其中脂質(zhì)體材料包括磷脂和膽固醇，二者的摩爾比為40～60∶30～50mol％；抗氧化劑由α-tocopherol和desferal組成，二者的濃度分別為0.010～0.030mg/ml及0.05～0.30mg/ml。蒽環(huán)類藥物被包裹于脂質(zhì)體水相中。
脂質(zhì)體材料中還含有DSPE-PEG2000(多聚乙烯-乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)，磷脂、膽固醇和DSPE-PEG2000三者的摩爾比為40～60∶30～50∶4～20mol％。所述磷脂選自神經(jīng)鞘磷脂(sphingomyelin，SM)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(distearoylphosphatidylcholine，DSPC)或氫化磷脂酰膽堿(hydrogenated soybeanphosphatidylcholine，HSPC)中的一種，三者均屬剛性磷脂。
所述蒽環(huán)類抗腫瘤藥物選自阿霉素、表阿霉素和柔紅霉素中的一種，本發(fā)明使用的是它們的鹽酸鹽，國內(nèi)廠家均可生產(chǎn)。
我們使用DSPC、HSPC和SM分別與膽固醇組成磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體，其中以DSPC和膽固醇組成的脂質(zhì)體穩(wěn)定性最好。DSPC(或者SM、HSPC)是組成雙層膜的磷脂，是脂質(zhì)體最基本組成成分。國外上市的Doxil/Caelyx的配方中使用的磷脂是HSPC。本發(fā)明中使用DSPC是因?yàn)镈SPC的?；滈L度一致且相變溫度(phase transitiontemperature，Tc)比HSPC為高，所以DSPC作為磷脂雙層的脂質(zhì)體應(yīng)比HSPC磷脂雙層的脂質(zhì)體更加穩(wěn)定；膽固醇的作用是降低膜的流動性提高雙層膜的穩(wěn)定性。它們濃度的配比原則是為取得最佳穩(wěn)定性的脂質(zhì)體，DSPC(或SM、HSPC)40～60mol％，膽固醇30～50mol％，高于或低于這個(gè)濃度比例脂質(zhì)體都不會穩(wěn)定，有文獻(xiàn)報(bào)道膽固醇濃度不能低于30mol％，否則就不會起到任何作用，但是膽固醇濃度又不能高于50mol％，那樣反而會加快包裹藥物從脂質(zhì)體中滲漏出來。
本發(fā)明提高藥物穩(wěn)定性是通過在配方中加入微量的α-tocopherol和desferal實(shí)現(xiàn)的。它們的作用一個(gè)是抑制磷脂和膽固醇的水解和氧化，另一個(gè)作用是抑制包裹于脂質(zhì)體水相中的蒽環(huán)類藥物的氧化。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，在本發(fā)明配方劑量下合用這兩個(gè)抗氧化劑的脂質(zhì)體的滲漏率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于只用其中一種抗氧化劑的脂質(zhì)體。合理使用這兩種抗氧化劑是本發(fā)明專利的最主要特點(diǎn)，同時(shí)區(qū)別于國外同類產(chǎn)品。如國外上市的Doxil/Caelyx的配方中使用的是組氨酸(histidine)以提高脂質(zhì)體阿霉素的穩(wěn)定性，而我們則選擇了α-tocopherol和desferal實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)體穩(wěn)定性。試驗(yàn)證明(見后說明)，本發(fā)明專利所制備的阿霉素脂質(zhì)體與國外產(chǎn)品穩(wěn)定性一致。
通常情況下，藥脂比越低藥物的包封率會越高，穩(wěn)定性也隨之增加，因此很多包封率較高的脂質(zhì)體藥物的藥脂比在0.05∶1或更低。然而藥脂比越低，進(jìn)入脂質(zhì)體中的藥物含量越少，同時(shí)制備脂質(zhì)體的輔料非常昂貴，極不利于藥物的臨床應(yīng)用。但是由于脂質(zhì)體容量有限，如果再加上均勻分布于磷脂雙層兩側(cè)的大分子PEG，又占用部分脂質(zhì)體容量，所以提高藥脂比非常困難。本發(fā)明采用上述配方，使藥脂比最高能夠達(dá)到0.2∶1，同時(shí)包封率不低于90％。國外文獻(xiàn)和脂質(zhì)體產(chǎn)品中從未見過高于此比例的，國內(nèi)許多研究機(jī)構(gòu)所制備的脂質(zhì)體藥物的藥脂比遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于此比例。
在減少藥物毒副作用的同時(shí)盡量延長藥物在體內(nèi)循環(huán)的時(shí)間從而增加藥物療效也是脂質(zhì)體藥物研發(fā)所追求的目標(biāo)，本發(fā)明通過在配方中加入親水性大分子多聚乙烯-乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)來實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的。對于蒽環(huán)類抗腫瘤藥物而言，所用DSPE-PEG2000的較佳濃度范圍是4～10mol％低于4mol％也可延長藥物的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，但效果不十分顯著；而PEG的濃度超過15mol％時(shí)，會使脂質(zhì)體形成泡沫狀micelle而不呈現(xiàn)雙層結(jié)構(gòu)。DSPE-PEG2000能夠增強(qiáng)脂質(zhì)體膜表面親水性，降低各種血漿蛋白對脂質(zhì)體的結(jié)合，使脂質(zhì)體可非常有效地躲避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，穩(wěn)定性及包封率得到提高，漏出率降低，使脂質(zhì)體的體循環(huán)時(shí)間明顯延長，體內(nèi)重新分布，降低所包藥物的毒性反應(yīng)，同時(shí)在病灶中的濃度也顯著提高，因而增加治療指數(shù)。另外由于注射時(shí)藥物仍包裹在脂質(zhì)體中，消除了藥物漏出后對組織的刺激造成炎癥壞死。
為了便于實(shí)施，本發(fā)明選擇硫酸銨梯度法作為基本生產(chǎn)工藝，通過試驗(yàn)優(yōu)化其各項(xiàng)反應(yīng)條件，最終摸索出適合于蒽環(huán)類抗腫瘤藥物脂質(zhì)體規(guī)模化生產(chǎn)的工藝路線。
一種蒽環(huán)類抗腫瘤藥物脂質(zhì)體注射液的生產(chǎn)工藝，包括以下步驟(1)制備多層脂質(zhì)體按照前述配方的量配制含有脂質(zhì)體材料和抗氧化劑的氯仿或氯仿/甲醇溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入125～400mM，pH值為5～7硫酸銨溶液水化；(2)制備小單層脂質(zhì)體將步驟(1)得到的含有多層脂質(zhì)體的硫酸銨溶液進(jìn)行五個(gè)冷凍-融化循環(huán)后，經(jīng)擠壓機(jī)擠壓成粒徑為80～120納米的小單層脂質(zhì)體液；隨后用5～15％蔗糖液(pH5～7)平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫脂質(zhì)體外的硫酸銨。
(3)制備蒽環(huán)類抗腫瘤藥物脂質(zhì)體將注射級蒽環(huán)類抗腫瘤藥物的鹽酸鹽注射液溶入濃度為5～15％的蔗糖液中(pH5～7)，在50～70℃條件下將鹽酸蒽環(huán)藥物蔗糖液加入到小單層脂質(zhì)體液中混合，在50～70℃水浴中放置10分鐘以上，使鹽酸蒽環(huán)藥物進(jìn)入小單層脂質(zhì)體中，冷卻至室溫，除去蔗糖和游離的蒽環(huán)類藥物得到成品。
步驟(1)中使用125～400mM硫酸銨溶液的作用主要是建立硫酸銨梯度提高蒽環(huán)類藥物的包封率。125～400mM可穩(wěn)定脂質(zhì)體滲透壓，優(yōu)選濃度為150～250mM；pH值采用5～7，最佳pH值是6.5。
所述步驟(2)中的五個(gè)冷凍-融化循環(huán)是指將多層脂質(zhì)體用干冰(-20℃)冷凍后在室溫下自然融化，然后再用干冰冷凍，如此循環(huán)五次。作用是進(jìn)一步提高包封率和穩(wěn)定性。在實(shí)際操作中也可省略冷凍-融化循環(huán)步驟，而直接進(jìn)入擠壓步驟。省略冷凍-融化循環(huán)步驟所制備的脂質(zhì)體理化性質(zhì)與使用冷凍-融化循環(huán)步驟所制備的脂質(zhì)體差別不顯著。小單層脂質(zhì)體的粒徑優(yōu)選100納米。
所述步驟(3)中除去游離的蒽環(huán)類藥物的方法為層析法和離心分離法，屬本領(lǐng)域公知常識，故不冗述。層析柱法可以使用Sephadex G-50柱，將脂質(zhì)體蒽環(huán)類藥物上柱，生理鹽水洗脫即可；離心法是將脂質(zhì)體蒽環(huán)藥物置入離心機(jī)，在100,000g條件下離心5～10分鐘，去除上清液，用生理鹽水溶解pellet即可。
所述步驟(2)和(3)中使用5～15％蔗糖溶液，最佳選用10％等滲液；蔗糖液pH5～7，最佳選用pH6.5。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明公開的配方能夠制得包封率大于90％的脂質(zhì)體，毒性低，穩(wěn)定性高，加入DSPE-PEG2000后，進(jìn)一步延長了藥物的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，有利于藥物的緩釋和療效提高。使用優(yōu)化后的硫酸銨梯度法操作簡便、省時(shí)，制得的脂質(zhì)體包封率高，回收率90％，磷脂，膽固醇及DSPE-PEG2000的回收率為85％左右。脂質(zhì)體滲漏率低，粒徑均勻(100±10納米)，穩(wěn)定性好，4℃放置保存一年粒徑無變化，包封率仍在85％以上。同時(shí)該方法便于滅菌及除去熱原，可實(shí)現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)。
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
具體實(shí)施例方式
表1脂質(zhì)體配方


以上材料來源如下阿霉素、表阿霉素和柔紅霉素購于浙江海正藥業(yè)。
神經(jīng)鞘磷脂(SM，sphingomyelin)、DSPC(distearoylphosphatidylcholine)、HSPC(hydrogenated soybean phosphatidylcholine)、膽固醇和PEG2000-DSPE購于美國Avantipolar Lipids(Alabaster，AL)公司。
α-tocopherol和desferal購于美國Sigma公司。
實(shí)施例11.制備多層脂質(zhì)體將注射級DSPC、膽固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在250mM pH6.5硫酸銨溶液中。
2.制備小單層脂質(zhì)體五個(gè)冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機(jī)中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質(zhì)體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。隨后用10％蔗糖液(pH6.5)平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫脂質(zhì)體外的硫酸銨。
3.制備阿霉素脂質(zhì)體將注射級鹽酸阿霉素注射液溶于10％蔗糖液中。在65℃條件下，按藥/脂比為0.2∶1的量將阿霉素蔗糖液加入小單層脂質(zhì)體中混合，在65℃水浴中放置15分鐘。冷卻至室溫，經(jīng)0.9％氯化鈉溶液平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫蔗糖。除去游離的阿霉素。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質(zhì)，即得到阿霉素脂質(zhì)體成品。
本品脂質(zhì)體阿霉素穩(wěn)定性好，在10倍緩沖液試驗(yàn)以及與小牛血清培養(yǎng)的試驗(yàn)中，24小時(shí)后75-80％的阿霉素仍包裹于脂質(zhì)體中。
實(shí)施例21.將注射級DSPC、膽固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在150mM pH5.5硫酸銨溶液中。
2.制備小單層脂質(zhì)體將上述液體放入擠壓機(jī)中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質(zhì)體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。隨后用5％蔗糖液(pH5.5)平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫脂質(zhì)體外的硫酸銨。
3.制備阿霉素脂質(zhì)體將注射級鹽酸阿霉素注射液溶于5％蔗糖液中。在65℃條件下，按藥/脂比為0.2∶1的量將阿霉素蔗糖液加入小單層脂質(zhì)體中混合，在65℃水浴中放置30分鐘。冷卻至室溫，經(jīng)0.9％氯化鈉溶液平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫蔗糖。除去游離的阿霉素。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質(zhì)，即得到阿霉素脂質(zhì)體成品。
實(shí)施例31.制備多層脂質(zhì)體注射級HSPC、膽固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在250mM pH6.5硫酸銨溶液中。
2.制備小單層脂質(zhì)體五個(gè)冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機(jī)中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質(zhì)體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。隨后用10％蔗糖液(pH6.5)平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫脂質(zhì)體外的硫酸銨。
3.制備阿霉素脂質(zhì)體將注射級鹽酸阿霉素注射液溶于10％蔗糖液中。在65℃條件下，按藥/脂比為0.1∶1的量將阿霉素蔗糖液加入小單層脂質(zhì)體中混合，在65℃水浴中放置15分鐘。冷卻至室溫，經(jīng)0.9％氯化鈉溶液平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫蔗糖。除去游離的阿霉素。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質(zhì)，即得到阿霉素脂質(zhì)體成品。
本品脂質(zhì)體長春新堿穩(wěn)定性好，在10倍緩沖液試驗(yàn)以及與小牛血清培養(yǎng)的試驗(yàn)中，24小時(shí)后75-80％的阿霉素仍包裹于脂質(zhì)體中(見后面試驗(yàn)說明)。
實(shí)施例41.制備多層脂質(zhì)體注射級HSPC、膽固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在150mM pH5.5硫酸銨溶液中。
2.制備小單層脂質(zhì)體將上述液體放入擠壓機(jī)中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質(zhì)體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。隨后用10％蔗糖液(pH5.5)平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫脂質(zhì)體外的硫酸銨。
3.制備阿霉素脂質(zhì)體將注射級鹽酸阿霉素注射液溶于10％蔗糖液中。在65℃條件下，按藥/脂比為0.1∶1的量將阿霉素蔗糖液加入小單層脂質(zhì)體中混合，在65℃水浴中放置30分鐘。冷卻至室溫，經(jīng)0.9％氯化鈉溶液平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫蔗糖。除去游離的阿霉素。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質(zhì)，即得到阿霉素脂質(zhì)體成品。
實(shí)施例51.制備多層脂質(zhì)體將注射級SM、膽固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在250mM pH6.5硫酸銨溶液中。
2.制備小單層脂質(zhì)體五個(gè)冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機(jī)中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質(zhì)體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。隨后用10％蔗糖液(pH6.5)平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫脂質(zhì)體外的硫酸銨。
3.制備阿霉素脂質(zhì)體將注射級鹽酸阿霉素注射液溶于10％蔗糖液中。在65℃條件下，按藥/脂比為0.05∶1的量將阿霉素蔗糖液加入小單層脂質(zhì)體中混合，在65℃水浴中放置15分鐘。冷卻至室溫，經(jīng)0.9％氯化鈉溶液平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫蔗糖。除去游離的阿霉素。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質(zhì)，即得到阿霉素脂質(zhì)體成品。
本品脂質(zhì)體阿霉素穩(wěn)定性好，在10倍緩沖液試驗(yàn)以及與小牛血清培養(yǎng)的試驗(yàn)中，24小時(shí)后75-80％的阿霉素仍包裹于脂質(zhì)體中。
實(shí)施例61.制備多層脂質(zhì)體將注射級SM、膽固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在150mM pH5.5硫酸銨溶液中。
2.制備小單層脂質(zhì)體將上述液體放入擠壓機(jī)中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質(zhì)體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。隨后用10％蔗糖液(pH5.5)平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫脂質(zhì)體外的硫酸銨。
3.制備阿霉素脂質(zhì)體將注射級鹽酸阿霉素注射液溶于10％蔗糖液中。在65℃條件下，按藥/脂比為0.05∶1的量將阿霉素蔗糖液加入小單層脂質(zhì)體中混合，在65℃水浴中放置30分鐘。冷卻至室溫，經(jīng)0.9％氯化鈉溶液平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫蔗糖。除去游離的阿霉素。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質(zhì)，即得到阿霉素脂質(zhì)體成品。
實(shí)施例71.制備多層脂質(zhì)體將注射用DSPC、膽固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在350mM pH6.5硫酸銨溶液中。
2.制備小單層脂質(zhì)體五個(gè)冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機(jī)中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質(zhì)體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。隨后用10％蔗糖液(pH6.5)平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫脂質(zhì)體外的硫酸銨。
3.制備阿霉素脂質(zhì)體將注射級鹽酸阿霉素注射液溶于10％蔗糖液中。在65℃條件下，按藥/脂比為0.2∶1的量將阿霉素蔗糖液加入小單層脂質(zhì)體中混合，在65℃水浴中放置60分鐘。冷卻至室溫，經(jīng)0.9％氯化鈉溶液平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫蔗糖。除去游離的阿霉素。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質(zhì)，即得到阿霉素脂質(zhì)體成品。
本品脂質(zhì)體阿霉素穩(wěn)定性好，在10倍緩沖液試驗(yàn)以及與小牛血清培養(yǎng)的試驗(yàn)中，24小時(shí)后75-80％的阿霉素仍包裹于脂質(zhì)體中。
實(shí)施例81.制備多層脂質(zhì)體將注射用DSPC、膽固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在250mM pH6.5硫酸銨溶液中。
2.制備小單層脂質(zhì)體五個(gè)冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機(jī)中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質(zhì)體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。隨后用10％蔗糖液(pH6.5)平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫脂質(zhì)體外的硫酸銨。
3.制備表阿霉素脂質(zhì)體將注射級鹽酸表阿霉素注射液溶于10％蔗糖液中。在65℃條件下，按藥/脂比為0.2∶1的量將表阿霉素蔗糖液加入小單層脂質(zhì)體中混合，在65℃水浴中放置30分鐘。冷卻至室溫，經(jīng)0.9％氯化鈉溶液平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫蔗糖。除去游離的表阿霉素。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質(zhì)，即得到表阿霉素脂質(zhì)體成品。
本品脂質(zhì)體表阿霉素穩(wěn)定性好，在10倍緩沖液試驗(yàn)以及與小牛血清培養(yǎng)的試驗(yàn)中，24小時(shí)后75-80％的表阿霉素仍包裹于脂質(zhì)體中。
實(shí)施例91.制備多層脂質(zhì)體將注射用HSPC、膽固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在250mM pH6.5硫酸銨溶液中。
2.制備小單層脂質(zhì)體五個(gè)冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機(jī)中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質(zhì)體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。隨后用10％蔗糖液(pH6.5)平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫脂質(zhì)體外的硫酸銨。
3.制備表阿霉素脂質(zhì)體將注射級鹽酸表阿霉素注射液溶于10％蔗糖液中。在65℃條件下，按藥/脂比為0.2∶1的量將表阿霉素蔗糖液加入小單層脂質(zhì)體中混合，在65℃水浴中放置15分鐘。冷卻至室溫，經(jīng)0.9％氯化鈉溶液平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫蔗糖。除去游離的表阿霉素。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質(zhì)，即得到表阿霉素脂質(zhì)體成品。
本品脂質(zhì)體表阿霉素穩(wěn)定性好，在10倍緩沖液試驗(yàn)以及與小牛血清培養(yǎng)的試驗(yàn)中，24小時(shí)后75-80％的表阿霉素仍包裹于脂質(zhì)體中。
實(shí)施例101.制備多層脂質(zhì)體將注射用DSPC、膽固醇溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在250mM pH6.5硫酸銨溶液中。
2.制備小單層脂質(zhì)體五個(gè)冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機(jī)中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質(zhì)體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。隨后用10％蔗糖液(pH6.5)平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫脂質(zhì)體外的硫酸銨。
3.制備柔紅霉素脂質(zhì)體將注射級鹽酸柔紅霉素注射液溶于10％蔗糖液中。在65℃條件下，按藥/脂比為0.2∶1的量將柔紅霉素蔗糖液加入小單層脂質(zhì)體中混合，在65℃水浴中放置15分鐘。冷卻至室溫，經(jīng)0.9％氯化鈉溶液平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫蔗糖。除去游離的柔紅霉素。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質(zhì)，即得到柔紅霉素脂質(zhì)體成品。
本品脂質(zhì)體柔紅霉素穩(wěn)定性好，在10倍緩沖液試驗(yàn)以及與小牛血清培養(yǎng)的試驗(yàn)中，24小時(shí)后75-80％的柔紅霉素仍包裹于脂質(zhì)體中。
實(shí)施例11、急性毒性試驗(yàn)一.材料昆明小鼠購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物研究所鹽酸阿霉素購于浙江海正藥業(yè)。
鹽酸阿霉素脂質(zhì)體注射液，實(shí)施例3。
二.方法比較鹽酸阿霉素和鹽酸阿霉素脂質(zhì)體注射液一次性小鼠尾靜脈給藥后的急性毒性反應(yīng)和死亡分布。
將小鼠隨機(jī)分組，每組10只，共90只。其中鹽酸阿霉素注射液組為40只，鹽酸阿霉素脂質(zhì)體注射液組50只。分別注射鹽酸阿霉素和鹽酸阿霉素脂質(zhì)體注射液，鹽酸阿霉素注射液劑量分別為15、20、25、30毫克/公斤體重，而鹽酸阿霉素脂質(zhì)體注射液劑量分別為20、30、40、50、60毫克/公斤體重。觀察14天，每日觀察小鼠體重變化、急性中毒癥狀和死亡數(shù)目來確定半數(shù)致死量(LD50)。結(jié)果見表2。
三.結(jié)果表2.阿霉素和脂質(zhì)體阿霉素的急性毒性試驗(yàn)(LD50)

結(jié)論阿霉素脂質(zhì)體有效降低載荷藥物的毒性，本試驗(yàn)中降低毒性1.88倍。
實(shí)施例12與國外同類產(chǎn)品比較脂質(zhì)體蒽環(huán)藥物穩(wěn)定性滲漏試驗(yàn)鹽酸阿霉素脂質(zhì)體注射液，實(shí)施例3。
Doxil/Caelyx購自美國先靈葆雅公司(Schering-Plough)。Caelyx在中國的商品名為楷萊。
將同等量的鹽酸阿霉素脂質(zhì)體和Caelyx分別置入透析袋中，在37℃溫度下與1,000倍的PBS緩沖液+10％小牛血清一起培養(yǎng)透析，在不同時(shí)間，分別自透析液中取樣檢測。
結(jié)論鹽酸阿霉素脂質(zhì)體與Caelyx的滲漏速度一致，說明兩者穩(wěn)定性一致。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例12本品與國外同類產(chǎn)品比較脂質(zhì)體蒽環(huán)藥物穩(wěn)定性滲漏試驗(yàn)圖
權(quán)利要求
1.一種蒽環(huán)類抗腫瘤藥物脂質(zhì)體，其特征在于由蒽環(huán)類抗腫瘤藥物、脂質(zhì)體材料和抗氧化劑組成，藥/脂比例(w/w)為0.05～0.2∶1；其中脂質(zhì)體材料包括磷脂和膽固醇，二者的摩爾比為40～60∶30～50mol％；抗氧化劑由α-tocopherol和desferal組成，二者的濃度分別為0.010～0.030mg/ml及0.05～0.30mg/ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蒽環(huán)類藥物脂質(zhì)體，其特征在于所述脂質(zhì)體材料中還含有多聚乙烯-乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)；磷脂、膽固醇和DSPE-PEG2000三者的摩爾比為40～60∶30～50∶4～20mol％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種蒽環(huán)類藥物脂質(zhì)體，其特征在于所述磷脂選自二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、氫化磷脂酰膽堿(HSPC)或神經(jīng)鞘磷脂(SM)中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種蒽環(huán)類藥物脂質(zhì)體，其特征在于所述蒽環(huán)類藥物選自阿霉素、表阿霉素或柔紅霉素中的一種。
5.一種蒽環(huán)類藥物脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝，包括以下步驟(1)制備多層脂質(zhì)體按照權(quán)利要求1或2所述配方的量配制含有脂質(zhì)體材料和抗氧化劑的氯仿或氯仿/甲醇溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入125～400mM，pH值為5～7硫酸銨溶液水化；(2)制備小單層脂質(zhì)體將步驟(1)得到的含有多層脂質(zhì)體的硫酸銨溶液進(jìn)行五個(gè)冷凍-融化循環(huán)后，經(jīng)擠壓機(jī)擠壓成80～120納米的小單層脂質(zhì)體液；隨后用5～15％蔗糖液(pH5～7)平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫脂質(zhì)體外的硫酸銨。(3)制備蒽環(huán)類藥物脂質(zhì)體將注射級蒽環(huán)類抗腫瘤藥物的鹽酸鹽溶入濃度為5～15％的蔗糖液中，在50～70℃條件下將鹽酸蒽環(huán)藥物蔗糖液加入到小單層脂質(zhì)體液中混合，在50～70℃水浴中放置10分鐘以上，使鹽酸蒽環(huán)藥物進(jìn)入小單層脂質(zhì)體中，冷卻至室溫，除去蔗糖和游離的蒽環(huán)類藥物得到成品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種蒽環(huán)類藥物脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述步驟(1)中硫酸銨濃度為125-400mM；pH值為5～7。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種蒽環(huán)類藥物脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述步驟(2)中的五個(gè)冷凍-融化循環(huán)是指將多層脂質(zhì)體用干冰冷凍后在室溫下自然融化，然后再用干冰冷凍，如此循環(huán)五次。但在實(shí)際操作中也可省略冷凍-融化循環(huán)步驟，而直接進(jìn)入擠壓步驟。省略冷凍-融化循環(huán)步驟所制備的脂質(zhì)體理化性質(zhì)與使用冷凍-融化循環(huán)步驟所制備的脂質(zhì)體差別不顯著。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種蒽環(huán)類藥物脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述步驟(2)中小單層脂質(zhì)體的粒徑為80～120納米，最佳為100納米。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種蒽環(huán)類藥物脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述步驟(3)中除去游離的蒽環(huán)類藥物的方法為層析法或離心分離法。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種蒽環(huán)類藥物脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述步驟(2)和(3)中使用5～15％蔗糖溶液，最佳選用10％等滲液；蔗糖液pH5～7，最佳選用pH6.5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蒽環(huán)類抗腫瘤藥物脂質(zhì)體及其生產(chǎn)工藝，屬于化學(xué)制藥領(lǐng)域。一種蒽環(huán)類藥物堿脂質(zhì)體，由蒽環(huán)類藥物、脂質(zhì)體材料和抗氧化劑組成，藥/脂比例(w/w)為0.05～0.2∶1；其中脂質(zhì)體材料包括磷脂和膽固醇，二者的摩爾比為40～60∶30～50mol％；抗氧化劑由α－tocopherol和desferal組成，二者的濃度分別為0.010～0.030mg/ml及0.05～0.30mg/ml。該生產(chǎn)工藝包括(1)制備多層脂質(zhì)體；(2)制備小單層脂質(zhì)體；(3)制備蒽環(huán)類藥物脂質(zhì)體。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是成品毒性小、包封率高、穩(wěn)定性好；方法操作簡便，可工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號A61P35/00GK1813676SQ200510005250
公開日2006年8月9日 申請日期2005年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月3日
發(fā)明者曹利人 申請人:北京文卓醫(yī)藥生物制品技術(shù)開發(fā)有限公司