專利名稱：一種抗腫瘤藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤藥物，尤其是涉及一種反義藥物，該藥物成分作用于Survivin基因的啟動(dòng)子區(qū)域，通過(guò)甲基化作用使凋亡抑制因子Survivin基因沉默從而達(dá)到治療肺癌的效果。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，世界上一些國(guó)家，特別是工業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家，肺癌發(fā)病率呈逐漸增高的趨勢(shì)，尤其是女性肺癌發(fā)病率增高的幅度更為明顯。每年因肺癌死亡的人數(shù)多于乳腺癌、前列腺癌和腸癌死亡人數(shù)的總和。2002年，全世界有超過(guò)130萬(wàn)人被確診患有肺癌，超過(guò)110萬(wàn)人死于肺癌。在美國(guó)，肺癌居癌癥首位，肺癌死亡約占全部癌癥死亡的28.6％。在我國(guó)，肺癌也是第一大癌癥。2004年9月24～26日召開(kāi)的首屆中國(guó)肺癌南北高峰論壇預(yù)測(cè)，2000～2005年間，我國(guó)肺癌的發(fā)病人數(shù)將增加12萬(wàn)，男性將從2000年的26萬(wàn)增加到2005年的33萬(wàn)，女性將從2000年的12萬(wàn)增至17萬(wàn)。到2025年，我國(guó)每年肺癌患者將超過(guò)100萬(wàn)，成為世界第一肺癌大國(guó)。
肺癌的病因比較復(fù)雜，如環(huán)境污染、吸煙和高溫油煙等危險(xiǎn)因素均是肺癌高發(fā)的主要元兇。肺癌按生物學(xué)類型可分為非小細(xì)胞肺癌(Non-small Cell LungCancer，NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(Small Cell LungCancer，SCLC)兩大類。在臨床中，NSCLC占80％左右，包括腺癌、鱗癌和大細(xì)胞癌三種類型。
肺癌的早期發(fā)現(xiàn)有一定難度。肺癌起病隱匿，癥狀和呼吸道其他疾患相仿，易造成耽擱和誤診，使癌細(xì)胞得以借機(jī)增值、外侵、轉(zhuǎn)移。一旦察覺(jué)，病情多已進(jìn)入中晚期和晚期，極大影響肺癌的整體治愈率。這是肺癌難治的主要原因之一。臨床上所見(jiàn)的NSCLC中，約1/3處于早期和中期(I～I(xiàn)IIAN1)，以手術(shù)為主要治療方法；約1/3處于局部晚期(IIIAN2～I(xiàn)IIB)，放射治療是其主要治療方法；另1/3已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療以全身化療為主。但是手術(shù)治療、放射治療、全身化療都有一定的局限性，因此生物治療在腫瘤治療領(lǐng)域中逐漸成為一個(gè)熱點(diǎn)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡受兩類蛋白家族調(diào)控B細(xì)胞白血病/淋巴瘤2家族(B-cellLeukemia/Lymphoma 2，BCL2)和凋亡抑制蛋白家族(Inhibitor of Apoptosis Proteins，IAPs)。Survivin于1997年由耶魯大學(xué)的Altieri等發(fā)現(xiàn)，是IAP家族的一個(gè)獨(dú)特成員。人Survivin由142個(gè)氨基酸組成，分子量是16.5kDa，是哺乳動(dòng)物IAP家族中最小的成員。survivin基因位于染色體17q25，全長(zhǎng)1417kb。
Survivin的半衰期為30分鐘，其表達(dá)具有明顯的細(xì)胞周期依賴性。在有絲分裂過(guò)程中，Survivin分布于多種元件，如中心體、中期微管、后期紡錘體等。Survivin具有調(diào)控細(xì)胞有絲分裂并抑制細(xì)胞凋亡的功能。
研究認(rèn)為，Survivin是細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期檢查點(diǎn)之間的界面分子。Survivin主要通過(guò)直接抑制凋亡終末效應(yīng)器caspase-3和caspase-7的活性阻斷各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程；以及與周期蛋白激酶cdk4、p34cdc2相互作用阻斷凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路這兩條途徑來(lái)抑制細(xì)胞凋亡(圖1)。Survivin是周期蛋白激酶p34cdc2-cyclinB1的有絲分裂期底物，SurvivinThr34位點(diǎn)磷酸化后與caspase-9結(jié)合并抑制其活性，阻斷caspase-9依賴性的細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)。Survivin進(jìn)入核內(nèi)與cdk4結(jié)合，導(dǎo)致Rb磷酸化和p21釋放，分別加快G1→S期的轉(zhuǎn)換和抑制caspase-3的活性，阻斷線粒體釋放細(xì)胞色素c從而抑制細(xì)胞凋亡。
survivin在胚胎和胎兒器官中廣泛高度表達(dá)，在大多數(shù)結(jié)束分化的正常組織中未被檢測(cè)，但在腫瘤組織中過(guò)量表達(dá)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Survivin基因在非小細(xì)胞肺癌中高效表達(dá)，在其它組織中的表達(dá)較少。
同時(shí)survivin在其他腫瘤組織中也同樣存在過(guò)量表達(dá)，如乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、肝癌、子宮癌、卵巢癌、何杰金氏癥(Hodgkin’s Disease)、非何杰金氏(Non-Hodgkin’s)淋巴瘤、白血病、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、軟組織瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤以及黑素瘤。survivin在相應(yīng)器官的正常組織中并不表達(dá)。同時(shí)，對(duì)表達(dá)survivin的腫瘤，腫瘤病人總體存活率降低，復(fù)發(fā)率升高，并對(duì)化療等產(chǎn)生抗性。
survivin基因可能在癌變細(xì)胞中不受調(diào)控的廣泛表達(dá)于細(xì)胞周期的各個(gè)階段，而不僅僅在有絲分裂期。同時(shí)Survivin的特異性表達(dá)使其成為肺癌治療靶點(diǎn)，同時(shí)又是有效的診斷標(biāo)記。
由于survivin在腫瘤組織與正常組織中的表達(dá)差異，及其對(duì)維持腫瘤細(xì)胞生存的需求趨向，Survivin被認(rèn)為是癌癥治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)?；赟urvivin的治療要求毒性低，同時(shí)能有效破壞腫瘤細(xì)胞獨(dú)有的生存機(jī)制。同Survivin進(jìn)行分子水平上的拮抗是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡的途徑之一，并且能同傳統(tǒng)的化療以及放療相結(jié)合進(jìn)行癌癥治療。
Hu，Jifan等報(bào)道了針對(duì)Igf2，bcl-2，MKP-I，cdc25a基因的基因沉默技術(shù)和核苷酸。該核苷酸含有導(dǎo)向元件(Guiding Element，GE)和DNA滅活元件(Inactivating Element，IE)。其中GE是一條短的正義寡核苷酸鏈，它可以與基因組DNA模板鏈互補(bǔ)，其作用是引導(dǎo)DNA滅活元件到基因組DNA特定的核苷酸序列，通常是靶基因的啟動(dòng)子附近區(qū)域。IE是一條獨(dú)特的寡核苷酸鏈，在它的5’端含有一個(gè)CpG半甲基化的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。與GE于靶序列結(jié)合后，它可以誘導(dǎo)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶使鄰近區(qū)域DNA的CpG二核苷酸甲基化，從而抑制轉(zhuǎn)錄的發(fā)生。由于IE/GE結(jié)構(gòu)中的引導(dǎo)元件是一條正義鏈，因此該寡核苷酸不會(huì)與mRNA轉(zhuǎn)錄子結(jié)合。該結(jié)構(gòu)的GE段與處于復(fù)制或轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的基因模板鏈結(jié)合，形成一個(gè)半甲基化的復(fù)制叉樣結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt1(DNA Methyltransferase)的最佳底物。它與DNA復(fù)制機(jī)制相結(jié)合，通過(guò)使細(xì)胞中新合成的DNA鏈甲基化來(lái)維持DNA的甲基化狀態(tài)。
Marzia Pennati等報(bào)道了核酶介導(dǎo)的survivin表達(dá)抑制方法。該核酶以survivin mRNA的3’端外顯子1中CUA110為靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)證明，核酶介導(dǎo)的survivin表達(dá)抑制能引起caspase-9依賴的細(xì)胞凋亡和腫瘤生長(zhǎng)抑制。
Vladimir Pisarev等報(bào)道了全長(zhǎng)的顯性負(fù)作用的survivin基因在癌癥免疫治療中的作用。在基因水平上將Survivin第34位的氨基酸Thr替換成Ala，這一改變?nèi)コ藀34cdc2-cyclin B1磷酸化位點(diǎn)，從而使突變蛋白具有顯性負(fù)作用。
Tsuruma T等同樣報(bào)道了Survivin源的蛋白疫苗應(yīng)用于結(jié)腸癌的I期臨床研究。I期臨床研究也表明了該疫苗是安全的。
Survivin在細(xì)胞存活以及有絲分鐘裂正常進(jìn)行中所起的至關(guān)重要的作用已經(jīng)得到多個(gè)領(lǐng)域研究的論證，腫瘤細(xì)胞對(duì)Survivin的需求也得到了證實(shí)。這些都表明，Survivin是癌癥治療的一個(gè)合理的靶點(diǎn)。同時(shí)Survivin的研究現(xiàn)狀提示我們，可以將Survivin作為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)肺癌的生物治療藥物，通過(guò)抑制survivin基因的表達(dá)，起到抑制腫瘤生長(zhǎng)、治療肺癌的目的。
上述發(fā)明都沒(méi)有報(bào)道以Survivin為靶點(diǎn)，采用寡核苷酸利用基因沉默技術(shù)達(dá)到治療肺癌效果的研究。
Lilly公司和ISIS公司合作開(kāi)發(fā)了以Survivin為靶點(diǎn)的第二代反義核酸藥物L(fēng)Y2181308。但是該藥物是與Survivin mRNA結(jié)合從而起到抑制的作用，對(duì)于來(lái)自于肺、結(jié)腸、乳腺、前列腺、卵巢、宮頸、皮膚以及大腦等多種細(xì)胞株，以及人黑素瘤細(xì)胞異種移植腫瘤模型，都顯示出穩(wěn)定的活性作用，能選擇性抑制Survivin蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以及抑制腫瘤生長(zhǎng)。
Chunyao Xia等報(bào)道的采用第二代合成工藝和一級(jí)高效液相純化的含硫代磷酸酯的反義核酸，由20個(gè)核苷酸組成，以survivin mRNA232-251為靶點(diǎn)。該反義核酸在間皮瘤細(xì)胞株H28和MS-1以及腫瘤模型中能有效抑制survivin的表達(dá)并在體外引起細(xì)胞凋亡。該反義核酸同化學(xué)治療相結(jié)合能提高間皮瘤臨床治療的效果，成為對(duì)付間皮瘤的一個(gè)有效的基因治療方法。
但是由于上述兩種藥物是作用于mRNA survivin，所以用藥量大，同時(shí)對(duì)于半衰期沒(méi)有什么改變。而基因沉默(Gene Silencing)是指生物體中特定基因由于種種原因不表達(dá)。這種現(xiàn)象是Peerbolte在1986年首先在轉(zhuǎn)基因植物中發(fā)現(xiàn)的。后來(lái)，人們?cè)诰€蟲(chóng)、真菌、昆蟲(chóng)、原生動(dòng)物、果蠅、斑馬魚(yú)及老鼠中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了基因沉默現(xiàn)象。發(fā)生沉默的基因可以是外源性轉(zhuǎn)移基因，也可以是入侵的病毒或宿主內(nèi)源性基因。大量的研究表明，環(huán)境因子、發(fā)育因子、DNA修飾、組蛋白乙?；潭?、基因拷貝數(shù)、位置效應(yīng)、生物的保護(hù)性限制修飾以及基因的過(guò)度轉(zhuǎn)錄等都與基因沉默有關(guān)?；虺聊话惆l(fā)生在兩種水平上轉(zhuǎn)錄水平基因沉默(Transcriptional Gene Silencing，TGS)和轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing，PTGS)。
基因及其啟動(dòng)子甲基化是轉(zhuǎn)錄水平基因沉默的一種。從所報(bào)道的基因沉默例子來(lái)看，幾乎所有的基因沉默現(xiàn)象與基因及其啟動(dòng)子的甲基化有關(guān)。DNA甲基化是真核生物表觀遺傳調(diào)控的一種重要方式，通過(guò)影響基因轉(zhuǎn)錄水平而參與細(xì)胞分化的調(diào)控過(guò)程。甲基化導(dǎo)致某些區(qū)域DNA構(gòu)象變化，從而影響了蛋白質(zhì)與DNA的相互作用，抑制了轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)區(qū)DNA的結(jié)合效率。在脊椎動(dòng)物中，DNA甲基化局限于染色體上富含CpG二核苷酸的短區(qū)域，即CpG島。
在肺癌發(fā)生過(guò)程中，基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島發(fā)生異常甲基化是一種常見(jiàn)的現(xiàn)象，在NSCLC樣本中，apc基因發(fā)生甲基化的頻率高達(dá)94％，cdh13、rar、fhit、rassfla等基因甲基化的頻率也都超過(guò)40％?；蚣谆梢酝ㄟ^(guò)去甲基化藥物逆轉(zhuǎn)，5-氮胞嘧啶(5-AZA-CR)自20世紀(jì)60年代就已被用于癌癥治療的臨床實(shí)驗(yàn)。
抑癌基因的異常甲基化會(huì)造成肺癌的發(fā)生，而腫瘤治療靶點(diǎn)survivin基因的甲基化或許能治療肺癌。最新研究發(fā)現(xiàn)，siRNA(SmallInterfering RNA)和甲基化寡核苷酸(Methylated Oligonucleotide，MON)都能誘導(dǎo)基因DNA甲基化。Kevin等和Kawasaki等都報(bào)道了某些siRNA能誘導(dǎo)基因DNA甲基化，從而引起轉(zhuǎn)錄水平基因沉默；Yao等報(bào)道了利用MON誘導(dǎo)DNA甲基化造成igf2基因沉默，并在肝癌動(dòng)物模型上達(dá)到抑制腫瘤的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗腫瘤的藥物。該藥物是通過(guò)誘導(dǎo)凋亡抑制因子甲基化進(jìn)而抑制肺癌腫瘤生長(zhǎng)，從而達(dá)到具有治療肺癌的目的。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種具有使Survivin基因發(fā)生甲基化的寡核苷酸Surkex，該序列與凋亡抑制因子Survivin的部分序列互補(bǔ)，Survivin的這部分序列富含CpG，處于Survivin基因的啟動(dòng)子區(qū)域。同時(shí)該寡核苷酸序列本身包含甲基化的堿基CmG。該序列本身形成一個(gè)半甲基化的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。與Survivin靶序列結(jié)合后，它可以誘導(dǎo)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶使鄰近區(qū)域DNA的CpG二核苷酸甲基化，從而抑制轉(zhuǎn)錄的發(fā)生。由于寡核苷酸結(jié)構(gòu)中的引導(dǎo)元件是一條正義鏈，因此該寡核苷酸不會(huì)與mRNA轉(zhuǎn)錄子結(jié)合。該序列部分結(jié)構(gòu)與處于復(fù)制或轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的Survivin基因模板鏈結(jié)合，形成一個(gè)半甲基化的復(fù)制叉樣結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt1(DNA Methyltransferase)的最佳底物。它與DNA復(fù)制機(jī)制相結(jié)合，通過(guò)使細(xì)胞中新合成的DNA鏈甲基化來(lái)維持DNA的甲基化狀態(tài)。
優(yōu)選的Surkex含有22bp堿基。其中Surkex 1包含兩個(gè)甲基化堿基，Surkex 2包含三個(gè)甲基化堿基。優(yōu)選的序列分別為SEQ.NO 1和SEQ.NO 2。Surkex序列通過(guò)與Survivin序列互補(bǔ)結(jié)合，從而使結(jié)合的Survivin基因序列發(fā)生甲基化，導(dǎo)致該Survivin基因表達(dá)降低。達(dá)到治療腫瘤的目的。
本發(fā)明在于提供一種抗腫瘤的藥物，其中的腫瘤疾病包括乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、肝癌、子宮癌、卵巢癌、何杰金氏癥、非何杰金氏、淋巴瘤、白血病、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、軟組織瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤以及黑素瘤，優(yōu)選肺癌。
本發(fā)明在于提供一種抗肺癌的寡核苷酸，該寡核苷酸具有抑制肺癌細(xì)胞中Survivin的表達(dá)作用。其中的表達(dá)包括survivin mRNA的表達(dá)和蛋白的表達(dá)。
本發(fā)明在于提供一種抗肺癌的寡核苷酸，該寡核苷酸具有抑制肺癌的作用。同時(shí)由于該寡核苷酸序列作用于Survivin基因的啟動(dòng)子區(qū)域，在DNA階段就發(fā)生甲基化，所以延長(zhǎng)了該藥物的半衰期，更加有利于臨床用藥。


圖1 Survivin對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控Survivin主要通過(guò)直接抑制凋亡終末效應(yīng)器caspase-3和caspase-7的活性阻斷各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程；以及與周期蛋白激酶cdk4、p34cdc2相互作用阻斷凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路這兩條途徑來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。
圖2 Surkex 1和Surkex 2的作用位點(diǎn)。Survivin基因包含4個(gè)exon和3個(gè)intron區(qū)。下劃線區(qū)域?yàn)镾urkex 1和Surkex 2的作用位點(diǎn)。
圖3 Survivin基因在NCI-H460細(xì)胞株中的表達(dá)。對(duì)人NSCLC細(xì)胞株NCI-H460中RNA進(jìn)行抽提，通過(guò)RT-PCR方法，電泳檢測(cè)survivin基因在NCI-H460細(xì)胞中的表達(dá)情況。
圖4 β-actin(A)和survivin(B)模板的相對(duì)濃度一域值循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線?？v坐標(biāo)為其域值循環(huán)數(shù)的差值ΔCT(Y)，橫坐標(biāo)為模板相對(duì)濃度log。通過(guò)作圖得回歸方程為Y＝-0.0047X+7.7062，R2＝0.4478。
圖5 β-actin和survivin的擴(kuò)增融解曲線。
圖6 SurKex對(duì)survivin mRNA的影響。以0.1～5.0μM濃度的SurKex 1和SurKex 2處理人NSCLC細(xì)胞株NCI-H460，并以PBS為陰性對(duì)照。60小時(shí)后抽提各組細(xì)胞的RNA，通過(guò)QRT-PCR定量測(cè)定各組細(xì)胞中survivin mRNA的表達(dá)量。其中橫坐標(biāo)表示Surkex的濃度，縱坐標(biāo)為survivin的表達(dá)量。
圖7 SurKex對(duì)Survivin蛋白的影響。以5.0μM濃度的SurKex 1和SurKex 2處理人NSCLC細(xì)胞株NCI-H460，并以PBS為陰性對(duì)照。72小時(shí)后抽提各組細(xì)胞的蛋白，通過(guò)蛋白印跡定性測(cè)定各組細(xì)胞中Survivin蛋白的表達(dá)量，并以同時(shí)測(cè)得的各組細(xì)胞中Actin蛋白的表達(dá)量作為參照，考察SurKex對(duì)NCI-H460細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)的影響。
圖8核酸藥物純度檢測(cè)。應(yīng)用毛細(xì)管電泳進(jìn)行核酸藥物SurKex 1和Random(隨機(jī)寡核苷酸序列)的純度檢測(cè)。分離試劑盒為ssDNA100-R，其中毛細(xì)管柱為27cm×75μm，有效分離柱長(zhǎng)20cm。樣品采用10KV，15s電動(dòng)進(jìn)樣。25℃，10kv電泳分離30min，在254nm波長(zhǎng)下檢測(cè)。
圖9A、B、C、D藥物對(duì)裸鼠模型腫瘤體積的影響。在裸鼠右前肢腋下皮下接種106個(gè)NCI-H460細(xì)胞7天后開(kāi)始腹腔注射給藥，給藥劑量按照表5-1。每3天測(cè)量一次腫瘤大小。腫瘤大小通過(guò)游標(biāo)卡尺從外部測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)與寬，并由公式0.5長(zhǎng)(mm)寬2(mm2)得到。橫坐標(biāo)為注射后的天數(shù)，縱坐標(biāo)為腫瘤體積。
圖10藥物對(duì)裸鼠模型腫瘤重量的影響。按照表5-1所示分組給藥，第15天將裸鼠用CO2處死后，從體內(nèi)取出腫瘤組織，稱重。橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為腫瘤重量。
圖11藥物對(duì)裸鼠模型體重的影響。在裸鼠右前肢腋下皮下接種106個(gè)NCI-H460細(xì)胞7天后開(kāi)始腹腔注射給藥，連續(xù)給藥14天。給藥第4、7、10、13天分別測(cè)定腫瘤的體重。橫坐標(biāo)為注射后天數(shù)，縱坐標(biāo)為腫瘤重量。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1Survivin基因在NCI-H460細(xì)胞中高水平表達(dá)將培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基(含10％FBS、100μg/ml氨基卞青霉素鈉、40μg/ml硫酸鏈霉素)中的人非小細(xì)胞肺癌(Non-small CellLung Cancer，NSCLC)細(xì)胞株NCI-H460，在37℃、5％CO2的環(huán)境下生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(密度約75％，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，活細(xì)胞率＞95％)，細(xì)胞經(jīng)0.25％胰蛋白酶消化后，用無(wú)菌PBS(pH 7.4)收集，核酸抽提，用100 &micro；1 DEPC-H2O溶解，于260nm下測(cè)其吸收值，計(jì)算RNA濃度(A260×40(μg/μl))。
反轉(zhuǎn)錄用RNA抽提物(RNA濃度為0.025～0.125μg/μl)做模板，加緩沖液、Dnase I(5U/μl)、RNase抑制劑(40U/μl)和DEPC-H2O后，經(jīng)37℃45分鐘和75℃10分鐘處理，冰上冷卻后再依次加入緩沖液、DTT(100mM)、dNTP混合液(10mM each)、Oligo(dT)18引物(0.1μg/μl)、隨機(jī)引物(0.1μg/μl)、RNase抑制劑和MMuLV反轉(zhuǎn)錄酶(200U/μl)。經(jīng)37℃60分鐘和90℃2分鐘處理，冰上冷卻。
PCR以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為變性94℃2分鐘鐘；35個(gè)循環(huán)94℃20秒，60℃20秒，72℃30秒；延伸72℃10分鐘。
電泳及檢測(cè)1.4％的瓊脂膠濃度，電泳檢測(cè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖(圖3)，結(jié)果顯示，β-actin的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在96bp處出現(xiàn)明顯的條帶，而survivin的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在123bp處出現(xiàn)明顯的條帶。同時(shí)，由于β-actin和survivin基因的擴(kuò)增使用的是同一樣本等體積的cDNA，條帶亮度進(jìn)行初步對(duì)比顯示，survivin基因的表達(dá)量略低于β-actin，而β-actin是恒定高表達(dá)的看家基因(House Keeping Gene)，因此我們認(rèn)為survivin基因在NCI-H460細(xì)胞中高水平表達(dá)。
實(shí)施例2Surkex抑制NCI-H460中Survivin mRNA的表達(dá)轉(zhuǎn)染將處于指數(shù)生長(zhǎng)期(密度約75％，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，活細(xì)胞率＞95％)的NCI-H460細(xì)胞經(jīng)0.25％胰蛋白酶消化后，用培養(yǎng)液收集，在24孔板中以105個(gè)/孔的濃度鋪板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
將SurKex溶于無(wú)菌PBS(pH 7.4)中，并經(jīng)針頭式過(guò)濾器過(guò)濾。在Eppendorf管A中加入室溫下的Opti-MEM培養(yǎng)基100μl，再加入3μl GeneJammer轉(zhuǎn)染試劑，混勻后室溫放置5分鐘鐘。在Eppendorf管B中加入室溫下的Opti-MEM培養(yǎng)基135μl，加入15μl SurKex的PBS溶液，混勻?；旌螦、B兩管，反復(fù)抽吸混勻，室溫放置30分鐘。SurKex轉(zhuǎn)染濃度見(jiàn)表1。
表1 SurKex的轉(zhuǎn)染濃度

吸去24孔板中的培養(yǎng)基，用500μl RPMI 1640洗滌細(xì)胞。每孔逐滴加入250μl A、B管混合液，輕微搖晃混勻。37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，再向每孔加入250μl含20％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。
核酸抽提與反轉(zhuǎn)錄移除24孔板中的培養(yǎng)基，每孔加入25μl TriBlue-E，抽吸混勻后將裂解液轉(zhuǎn)移至Eppendorf管，用1ml注射器26號(hào)針頭抽吸勻漿液兩次。
氯仿加入體積為50μl，RNA用150μl 70％乙醇洗滌、20μlDEPC-H2O溶解。
其余操作同實(shí)施例1中的核酸抽提和反轉(zhuǎn)錄。
實(shí)時(shí)定量PCR(QRT-PCR)實(shí)時(shí)定量PCR(Quantative Real-time PCR，QRT-PCR)能借助熒光標(biāo)志檢測(cè)系統(tǒng)(非特異的與雙鏈DNA結(jié)合而發(fā)熒光的染料，如SYBRGreen I)檢測(cè)每個(gè)循環(huán)PCR產(chǎn)物的總累積量，以達(dá)到很好的定量結(jié)果。
在PCR用96孔板中，向每孔依次加入模板cDNA(反轉(zhuǎn)錄得到的)、正反向引物(5’-CTTGG TGAAT TTTTG AAACT GGACA，3’-CAGCT GCTCG ATGGC ACGGC GCACT)、SYBR Green SuperMix(SYBR Green qPCR試劑盒，Invitrogen公司)和石蠟油。每個(gè)樣品平行3孔。覆蓋貼膜，離心10秒后放入實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為50℃2分鐘，95℃2分鐘；40個(gè)循環(huán)95℃15秒，60℃1分鐘。
擴(kuò)增效率曲線在QRT-PCR中，通常使用擴(kuò)增效率曲線來(lái)考察兩個(gè)基因的擴(kuò)增效率的差異，其制作方法如下取PBS對(duì)照組的cDNA，以2.16倍為梯度稀釋4次，得到5個(gè)樣品(表2)，表2擴(kuò)增效率曲線的制作

每個(gè)樣品分鐘別用β-actin和survivin的引物進(jìn)行擴(kuò)增，各自平行3孔。以相對(duì)濃度對(duì)數(shù)log(Relative Quantity)為橫坐標(biāo)，survivin與β-actin的域值循環(huán)數(shù)的差值ΔCT為縱坐標(biāo)，繪制擴(kuò)增效率曲線(圖4)。同PBS對(duì)照組的cDNA相比，在β-actin和survivin模板的相對(duì)濃度為0.046至1范圍內(nèi)，其域值循環(huán)數(shù)的差值ΔCT(Y)與模板相對(duì)濃度log(RelativeQuantity)(X)呈一定的線性關(guān)系，其斜率的絕對(duì)值＜0.1，即β-actin和survivin域值循環(huán)數(shù)的差值ΔCT幾乎不隨模板濃度的變化而變化，表明樣品中β-actin和survivin模板的擴(kuò)增效率是相同的或幾乎相同的。
回歸方程為Y＝-0.0047X+7.7062，R2＝0.4478。
融解曲線在QRT-PCR中，通常使用融解曲線(DissociationCurve)來(lái)考察擴(kuò)增的特異性。分鐘別以PBS對(duì)照組的cDNA為模板，DEPC-H2O為陰性對(duì)照(Negative Control，NC)，用β-actin和survivin的引物進(jìn)行擴(kuò)增，各自平行3孔，觀察融解曲線。以cDNA為模板，用β-actin的引物進(jìn)行擴(kuò)增的3個(gè)平行樣品的融解曲線只在83℃位置出現(xiàn)一個(gè)峰，用survivin的引物進(jìn)行擴(kuò)增的3個(gè)平行樣品的融解曲線只在80℃位置出現(xiàn)一個(gè)峰，表明β-actin和survivin都無(wú)非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)；而以DEPC-H2O為陰性對(duì)照(NC)，用β-actin和survivin的引物進(jìn)行擴(kuò)增的各3個(gè)平行樣品的融解曲線在溫度變化過(guò)程中都不出現(xiàn)峰，表明β-actin和survivin的引物在擴(kuò)增過(guò)程中都無(wú)二聚體形成(圖5)。
相對(duì)定量的數(shù)據(jù)處理對(duì)于本實(shí)驗(yàn)，當(dāng)β-actin和survivin的擴(kuò)增效率相等，即EA＝ES時(shí)，經(jīng)內(nèi)標(biāo)β-actin歸一化后，給藥組survivin基因表達(dá)量可表示為其占對(duì)照組survivin基因表達(dá)量的百分鐘比的形式，歸一化計(jì)算方法如下ΔCT(0)＝CT(S0)-CT(A0)ΔCT(1)＝CT(S1)-CT(A1)ΔΔCT＝ΔCT(1)-ΔCT(0)survivin expression=2-ΔΔCT×100%]]>式中survivin expression表示同對(duì)照組相比，給藥組樣品中survivin的表達(dá)率；CT(A0)和CT(S0)分鐘別為對(duì)照組中β-actin和survivin的域值循環(huán)數(shù)；CT(A1)和CT(S1)分鐘別為給藥組中β-actin和survivin的域值循環(huán)數(shù)。
結(jié)果顯示(見(jiàn)表3和圖6)，SurKex 1濃度從0.1μM升至5.0μM，相應(yīng)survivin mRNA的表達(dá)率從103.77％降至4.07％；而SurKex 2濃度從0.1μM升至5.0μM，相應(yīng)survivin mRNA的表達(dá)率從104.97％降至8.40％，表明SurKex對(duì)人NSCLC細(xì)胞株NCI-H460中survivin mRNA具有明顯的抑制作用，并且隨著劑量的增大，抑制作用更趨明顯。在5.0μM濃度下，SurKex 1和SurKex 2幾乎完全抑制了survivin mRNA的表達(dá)。
表3 SurKex對(duì)survivin mRNA的影響

實(shí)施例3Surkex抑制NCI-H460中Survivin蛋白的表達(dá)轉(zhuǎn)染將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-H460細(xì)胞在6孔板中以5105個(gè)/孔的濃度鋪板。
Eppendorf管A中加入200μl Opti-MEM培養(yǎng)基和6μl GeneJammer轉(zhuǎn)染試劑，Eppendorf管B中加入270μl Opti-MEM培養(yǎng)基和30μlSurKex的PBS溶液。轉(zhuǎn)染時(shí)，每孔加入500μl A、B管混合液，以及500μl Opti-MEM培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，再向每孔加入1ml含20％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)60小時(shí)。
SurKex轉(zhuǎn)染濃度見(jiàn)表4，其余操作同實(shí)施例2。
表4 SurKex的轉(zhuǎn)染濃度

蛋白抽提移除24孔板中的培養(yǎng)基，用PBS洗滌三次，用細(xì)胞刮鏟刮下貼壁細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中，1,000rpm離心5分鐘，棄上清。加入1ml裂解液(10mM Tris-HCl pH 7.4，1％ Triton-100，150mM氯化鈉，5mM EDTA，1mM PMSF，1μg/ml亮抑酶肽，1μg/ml抑蛋白酶肽)，冰浴放置30分鐘，每隔5分鐘振蕩一次。2,000rpm離心3分鐘后將上清液轉(zhuǎn)移至新Eppendorf管，Lorry法測(cè)定蛋白濃度，并調(diào)整至3mg/ml。分裝出一部分用于Actin檢測(cè)。
免疫沉淀取750μl調(diào)整濃度后的蛋白溶液，加入250μl鼠抗人SurvivinIgG2a，室溫孵育1小時(shí)。吸取0.4ml固定化的Protein A至分鐘離柱套管(Spin Cup Column and Microcentrifuge Tube)中，離心(4,000rpm1分鐘)，棄濾過(guò)液。加入0.4ml結(jié)合/洗滌Buffer，加蓋后上下顛倒10次，離心(4,000rpm 1分鐘)，棄濾過(guò)液，重復(fù)2次。然后加入333μl蛋白抗體孵育液，室溫放置10分鐘，離心(4,000rpm 1分鐘)，棄濾過(guò)液，重復(fù)3次。再加入400μl結(jié)合/洗滌緩沖液，加蓋后上下顛倒10次，離心(4,000rpm 1分鐘)，棄濾過(guò)液，重復(fù)3次。最后加入190μl洗脫緩沖液，加蓋后上下顛倒10次，離心(4,000rpm 1分鐘)，收集濾過(guò)液用于Survivin檢測(cè)。
電泳與電轉(zhuǎn)印用4％的濃縮膠和12％的分離膠進(jìn)行蛋白電泳。取待測(cè)蛋白樣品20μl，加入5μl 5上樣緩沖液和3μl 1M DTT，煮沸5分鐘，離心10秒。用于檢測(cè)。Actin、Survivin的樣品及蛋白Marker的上樣體積分別為10μl、20μl和3μl。
將Bio-Ice冷卻裝置裝滿水后放置于-20℃，PVDF膜先在甲醇中浸泡1分鐘后，同轉(zhuǎn)印濾紙、纖維襯墊以及電泳后的凝膠一起在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡1h。在凝膠支架轉(zhuǎn)印夾的陰極面上依次放上纖維襯墊、轉(zhuǎn)印濾紙、凝膠、PVDF膜、轉(zhuǎn)印濾紙、纖維襯墊，用玻棒輕輕地輾去氣泡，合上陽(yáng)極面，插入到電轉(zhuǎn)印模塊中。在轉(zhuǎn)印槽內(nèi)放入電轉(zhuǎn)印模塊和Bio-Ice冷卻裝置。開(kāi)啟磁力攪拌，在電轉(zhuǎn)印緩沖液中恒定電壓100V電轉(zhuǎn)印50分鐘。
封閉與抗體孵育將轉(zhuǎn)印后的PVDF膜用PBS振蕩洗滌兩次，每次5分鐘。將PVDF膜放入封閉緩沖液(2％BSA的PBS溶液)中，室溫振蕩1小時(shí)后轉(zhuǎn)移至溶有鼠抗人Actin IgG1或鼠抗人SurvivinIgG2a(一抗)的孵育緩沖液(1％BSA的PBS溶液)中，4℃振蕩過(guò)夜。一抗?jié)舛葹?.8μg/ml。將一抗孵育后的PVDF膜用洗滌液(0.5％Tween的PBS溶液)振蕩洗滌三次，每次10分鐘，然后轉(zhuǎn)移至溶有羊抗鼠IgG-HRP(二抗)的孵育緩沖液中，室溫振蕩1小時(shí)。二抗?jié)舛葹?.5μg/ml。將二抗孵育后的PVDF膜用洗滌液振蕩洗滌三次，每次10分鐘。
顯色將PVDF膜用0.1M醋酸緩沖液(pH 5.2)振蕩洗滌兩次，每次10分鐘。取一片AEC(20mg)加入到5ml DMF中，避光溶解后取1ml，用醋酸緩沖液1∶15稀釋后加入20μl 30％過(guò)氧化氫，混勻。放入PVDF膜，避光顯色20分鐘，觀察結(jié)果PBS、SurKex 1和SurKex2處理組樣品的Actin蛋白含量幾乎相同，表明樣品中細(xì)胞總蛋白的含量幾乎相同；而SurKex 1和SurKex 2處理組樣品的Survivin蛋白含量同PBS處理組樣品相比顯著降低，表明SurKex對(duì)人NSCLC細(xì)胞株NCI-H460中Survivin蛋白具有明顯的抑制作用，在5.0μM濃度下，SurKex 1和SurKex 2幾乎完全抑制了Survivin蛋白的表達(dá)(圖7)。
實(shí)施例4Surkex抑制NCI-H460肺癌裸鼠模型腫瘤的生長(zhǎng)NCI-H460肺癌裸鼠模型隨機(jī)設(shè)計(jì)寡核苷酸序列(Random，ATGCT mCGGAA CCTTTmCGVAG GA)(Syngen，美國(guó))，該序列與Surkex同為22個(gè)堿基組成并含2個(gè)mC，原則上不與任何基因及其mRNA，特別是Survivin基因及其mRNA互補(bǔ)。
應(yīng)用毛細(xì)管電泳進(jìn)行核酸藥物SurKex 1和Random的純度檢測(cè)分離試劑盒為ssDNA 100-R，其中毛細(xì)管柱為27cm×75μm，有效分離柱長(zhǎng)20cm。樣品采用10KV，15s電動(dòng)進(jìn)樣。25℃，10ky電泳分離30min，在254nm波長(zhǎng)下檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)(圖8)。根據(jù)峰面積計(jì)算，SurKex1和Random全序列的純度都＞99％。純度檢測(cè)后，將106個(gè)NCI-H460細(xì)胞懸浮于0.2ml無(wú)菌PBS中，皮下注射至裸鼠右側(cè)腋窩部位。腫瘤細(xì)胞接種7天后，皮下腫瘤即可明顯觸知。挑選出70只荷瘤裸鼠，隨機(jī)分成7組(每組N＝10)，計(jì)為第1天，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始。
給藥以PBS作為空白對(duì)照，18mg/Kg的Random作為陰性對(duì)照，1.5mg/Kg的Cisplatin作為陽(yáng)性對(duì)照，SurKex 1采用3個(gè)劑量，分別為2mg/Kg、6mg/Kg和18mg/Kg，并將6mg/Kg SurKex 1同1.5mg/KgCisplatin聯(lián)合給藥(表5)。
給藥方式均為腹腔注射(IP)，體積均為5ml/Kg，連續(xù)給藥14天。
表5給藥分組情況

腫瘤與體重的測(cè)量從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始到結(jié)束，采用雙盲方法，每3天測(cè)量一次腫瘤大小(0.5長(zhǎng)(mm)寬2(mm2))，同時(shí)稱一次體重。在實(shí)驗(yàn)的第14天，外部測(cè)量計(jì)算得到的體積為770.1±110.4mm3。在給藥結(jié)束的第二天(第15天)，將裸鼠用CO2處死后，從體內(nèi)取出腫瘤組織，稱量得到的重量為1.004±0.134g(得到的重量全部超過(guò)0.4克，均值超過(guò)1.0克)，腫瘤生長(zhǎng)良好，于-70℃保存。
數(shù)據(jù)分析合成藥的療效以瘤重抑制百分率表示，計(jì)算公式為瘤重抑制百分率％＝(1-T/C)100％其中T為用藥組瘤重、C為對(duì)照組瘤重。合成藥抑制率大于40％，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著差異，是藥物有效的必要條件。
兩藥相互作用指數(shù)(coefficient of drug interaction，CDI)的計(jì)算公式為CDI＝AB/(A×B)其中，AB為兩藥聯(lián)用組與對(duì)照組瘤重的比值，A和B分別為各藥物單獨(dú)使用組與對(duì)照組瘤重的比值。當(dāng)CDI＜1時(shí)表明兩藥有協(xié)同作用，當(dāng)CDI＜0.7時(shí)表明協(xié)同作用非常顯著。
動(dòng)物體重變化可用于顯示藥物毒性，給藥組動(dòng)物去瘤后的平均體重下降自身對(duì)照超過(guò)15％，表示藥物的毒性反應(yīng)。
藥物對(duì)裸鼠模型腫瘤體積的影響見(jiàn)圖9。
藥物對(duì)裸鼠模型腫瘤重量的影響見(jiàn)圖10。
藥物對(duì)裸鼠模型腫瘤體重的影響見(jiàn)圖11。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明同第一組(PBS組)相比，第二組(Random即隨機(jī)寡核苷酸組)的腫瘤體積增長(zhǎng)曲線略低于PBS組，腫瘤重量也略小，但瘤重抑制率為30.6％，且無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，認(rèn)為無(wú)效。
第三組(Cisplatin組)對(duì)NCI-H460肺癌裸鼠模型腫瘤體積的增長(zhǎng)以及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的腫瘤重量具有明顯的抑制作用(P＜0.05)，且瘤重抑制率為82.6％。認(rèn)為有效。
同第二組(Random組)相比，第四組(2mg/kg Surkex組)、第五組(6mg/kg Surkex組)對(duì)腫瘤體積的增長(zhǎng)及腫瘤重量同PBS組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，瘤重抑制率分別為22.1％和27.4％，認(rèn)為無(wú)效。
第六組(18mg/kg Surkex組)對(duì)NCI-H460肺癌裸鼠模型腫瘤體積的增長(zhǎng)以及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的腫瘤重量具有明顯的抑制作用(P＜0.05)，且瘤重抑制率為44.9％。
雖然第五組(6mg/kg Surkex組)的SurKex 1單用已經(jīng)被證實(shí)是無(wú)效的，但6mg/kg的SurKex 1與1.5mg/kg的Cisplatin合用(即第七組)是有效的；而且同1.5mg/kg的Cisplatin單獨(dú)使用組(第三組)相比，對(duì)NCI-H460肺癌裸鼠模型腫瘤體積的增長(zhǎng)以及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的腫瘤重量具有明顯的抑制作用(P＜0.05)，且對(duì)應(yīng)于第一組(PBS組)和第二組(Random組)的瘤重抑制率為92.1％和88.5％。同時(shí)第七組中6mg/kg的SurKex 1與1.5mg/kg的Cisplatin的相互作用指數(shù)CDI為0.63，小于0.7，體現(xiàn)出非常顯著的協(xié)同作用。
藥物的毒性結(jié)果第三組(Cisplatin組)裸鼠的平均體重(去瘤后)下降(自身對(duì)照)18.9％，超過(guò)15％，顯示出化療藥物順鉑的毒性反應(yīng)。
第六組(18mg/kg Surkex組)裸鼠體重同PBS組相比，雖然存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但其去瘤后的平均體重下降自身對(duì)照1.9％，小于15％，可以認(rèn)為不具有毒性反應(yīng)。相對(duì)于化療藥物，SurKex 1對(duì)動(dòng)物體造成的傷害要小的多。
合用組裸鼠的體重同Cisplatin單獨(dú)使用組(第三組)相比，雖然不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但其平均體重(去瘤后)下降(自身對(duì)照)13.2％，小于15％，可以認(rèn)為不具有毒性反應(yīng)，顯示出合用組對(duì)化療藥物順鉑的毒性具有一定的降低作用。
所以，18mg/Kg劑量的寡核苷酸藥物SurKex 1在能顯著抑制裸鼠NCI-H460肺癌模型中腫瘤的生長(zhǎng)；6mg/Kg劑量的寡核苷酸藥物SurKex 1與1.5mg/Kg劑量的化療藥物順鉑聯(lián)用具有顯著的協(xié)同作用，且降低了順鉑的毒性。
權(quán)利要求
1.一種抗腫瘤藥物組合物，其特征在于包括一段靶基因是凋亡抑制因子Survivin富含CpG的啟動(dòng)子區(qū)域的寡核苷酸和可藥用的載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中的抗腫瘤藥物組合物，其特征在于所述的寡核苷酸序列具有抑制肺癌細(xì)胞中Survivin的表達(dá)作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中的抗腫瘤藥物組合物，其特征在于所述的寡核苷酸序列包含甲基化的堿基CmG。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中的抗腫瘤藥物組合物，其特征在于所述的寡核苷酸是Surkex 1，序列為5‘AmCGGGTCCCGmCGATTCAAATCT，與Survivin基因的2767-2788位堿基序列互補(bǔ)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中的抗腫瘤藥物組合物，其特征在于所述的寡核苷酸是Surkex 2，序列為5‘CmCGACGGCACCCATGCmCGCmCGC，與Survivin基因的2803-2819位堿基序列互補(bǔ)。
6.一種權(quán)利要求1所述的藥物組合物在治療或預(yù)防肺癌的藥物中的應(yīng)用。
7.一種權(quán)利要求4所述的藥物組合物在治療或預(yù)防肺癌的藥物中的應(yīng)用。
8.一種權(quán)利要求5所述的藥物組合物在治療或預(yù)防肺癌的藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的應(yīng)用，其特征在于所述的寡核苷酸具有抑制肺癌細(xì)胞中Survivin的表達(dá)作用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種通過(guò)誘導(dǎo)凋亡抑制因子甲基化進(jìn)而抑制肺癌腫瘤生長(zhǎng)的藥物成分。該藥物成分主要包括一種與凋亡抑制因子Survivin的啟動(dòng)子區(qū)域部分序列互補(bǔ)的寡核苷酸序列Surkex 1和Surkex 2。該序列與Survivin序列互補(bǔ)結(jié)合，從而降低凋亡抑制因子Survivin表達(dá)，腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，達(dá)到治療肺癌的效果。同時(shí)由于作用位點(diǎn)在Survivin的啟動(dòng)子區(qū)域部分，更加有利于臨床用藥。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1820785SQ20051000778
公開(kāi)日2006年8月23日 申請(qǐng)日期2005年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月17日
發(fā)明者周向軍, 黃瑋琳, 王永祥, 潘武賓 申請(qǐng)人:深圳市清華源興生物醫(yī)藥科技有限公司