專利名稱：一種具有抗皰疹病毒活性的木豆提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有抗病毒活性的木豆乙醇提取物。
背景技術(shù)：
木豆(Cajanus cajan)原產(chǎn)于印度，目前全世界種植面積約520萬(wàn)公頃，主要分布在亞洲、非洲和南美洲(趙真忠，2003)。我國(guó)栽培木豆主要分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，即云南、廣西、四川、重慶、廣東、貴州、海南、福建、湖南、江西、江蘇等省區(qū)(谷勇等，2000)。
木豆全身是寶，經(jīng)濟(jì)、生態(tài)價(jià)值極高，同時(shí)還具有多種顯著的藥用和保健功效。木豆的藥用價(jià)值是在我國(guó)最早開(kāi)發(fā)利用的，早在《陸川本草》中記載木豆葉“平、淡、有小毒”?！吨腥A藥?！分羞M(jìn)一步指出木豆葉主治小兒水痘，痛腫。近年來(lái)，我國(guó)研究木豆中提取、分離有關(guān)藥用成分的報(bào)道較少，主要有中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物開(kāi)發(fā)研究所(年度)曾研究木豆葉中的抗消炎成分，得出11種結(jié)晶成分(李正紅等，2001)，鑒定為牡荊苷、水楊酸、三十一烷、β-谷甾醇、柚皮素-4′，7-二甲醚及β-香樹(shù)脂醇等。此外，林勵(lì)(年度)等以抑菌試驗(yàn)指導(dǎo)植物有效成分的提取分離，從海南產(chǎn)木豆葉提取物萃取的乙酸乙酯部分分離和鑒定了6個(gè)化合物，牡荊苷，異牡荊苷，芹菜素，木犀草素，柚皮素-4′，7-二甲醚和β-谷甾醇，在這些已知的成分中，具有較高藥理活性的植物黃酮類化合物占絕大多數(shù)。
近年來(lái)對(duì)木豆的藥理活性方面也有一些研究報(bào)道，主要是中藥木豆葉對(duì)治療股骨頭缺血性壞死有神奇功效。海南省人民醫(yī)院根據(jù)民間經(jīng)驗(yàn)，用木豆治療外傷、燒傷感染和褥瘡等已經(jīng)取得了較好的療效(劉中秋等，1998)。孫紹美等(1995)研究木豆葉有效成分木豆素的藥理作用表明木豆素制劑具有明顯的抑制毛細(xì)血管的通透性、鎮(zhèn)痛、消炎作用，毒性小，在有效劑量范圍內(nèi)動(dòng)物無(wú)不良反應(yīng)，且其抗炎作用強(qiáng)于水楊酸。劉中秋(1998)等在證實(shí)木豆的抗菌消炎作用的基礎(chǔ)上，以抗炎等藥效學(xué)為指標(biāo)，對(duì)生脈成骨片中的主藥——木豆葉的不同提取物進(jìn)行篩選，分別用醇提取物、水提取物進(jìn)行小鼠抗炎作用的藥理研究，結(jié)果表明，木豆葉水提部分的抗炎作用最強(qiáng)，驗(yàn)證了民間利用木豆葉水煎劑可解毒消腫的功效。雖然關(guān)于木豆有效成分的提取和分離工藝有待進(jìn)一步研究，但是可以肯定的是植物黃酮類化合物在其發(fā)揮藥理藥效活性過(guò)程中起了至關(guān)重要的作用。
病毒是最小的病原微生物，但病毒的傳播最廣，是目前世界上發(fā)病率最高的傳染性疾病之一。在臨床上較多的疾病與病毒感染有關(guān)。據(jù)國(guó)外統(tǒng)計(jì)資料報(bào)道，近3/4的傳染病是由病毒引起的，不同的病毒感染引起不同的疾患，需要針對(duì)該病毒的抗病毒藥物治療。
皰疹是由皰疹病毒引起的感染性皮膚病，表現(xiàn)為疼痛或淺感覺(jué)障礙，是臨床常見(jiàn)病多發(fā)病之一，好發(fā)于春秋季節(jié)。帶狀皰疹的臨床癥狀雖不是很嚴(yán)重，但有時(shí)可引起嚴(yán)重的并發(fā)癥，且?guī)畎捳罨颊咭蛴写虡油椿驘仆?，而出現(xiàn)緊張、恐懼，心情煩躁、焦慮，常常影響工作和睡眠，因此危害較大。(尚小紅，2005；伍偉禎，2004)皰疹病毒分為單純皰疹、帶狀皰疹、巨細(xì)胞病毒和E-B病毒，該類病毒在人體中可形成潛伏感染，引起不同組織疾病，在一定的環(huán)境下反復(fù)發(fā)作。
單純皰疹病毒(HSV)分為HSV-1型和HSV-2，近年來(lái)進(jìn)行的深入研究后又發(fā)現(xiàn)HSV-6，7，8型。HSV感染是一種全身性疾病，病毒經(jīng)呼吸道、口腔、生殖器粘膜或破損皮膚進(jìn)入人體，可潛于人體正常粘膜、血液、唾液以及局部感覺(jué)神經(jīng)節(jié)和多數(shù)器官內(nèi)，幾乎所有的內(nèi)臟和粘膜表皮內(nèi)都可分離到HSV。原發(fā)感染主要見(jiàn)于免疫功能低下嬰幼兒或嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良或有其它感染的兒童。原發(fā)感染消退后，病毒可持續(xù)潛居體內(nèi)。正常人中約有半數(shù)以上為本病毒的攜帶者，可通過(guò)口、鼻分泌物而成為傳染源，由于HSV在人體中不產(chǎn)生永久免疫力，故每當(dāng)機(jī)體抗病能力減退時(shí)，如患某種發(fā)熱性傳染病，胃腸功能紊亂、月經(jīng)、妊娠、病灶感染、過(guò)度疲勞、情緒環(huán)境改變時(shí)，體內(nèi)潛伏的HSV即被激發(fā)而發(fā)病。因而，尋求新的抗皰疹病毒藥物成為當(dāng)務(wù)之急。
抗病毒類藥物是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一大類藥物，現(xiàn)已成為國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥市場(chǎng)上令人矚目的活躍藥品之一。從1975年發(fā)現(xiàn)阿糖腺苷，特別是1977年阿昔洛韋(ACV，無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷)問(wèn)世后，抗病毒藥物才真正起步，盡管如此，目前上市的該類藥物只有20余種，僅為抗感染藥物的十四分之一左右，且大多有一定的毒副作用或抗病毒效果不明顯，難以為病人所認(rèn)可。
參考文獻(xiàn)趙真忠.一種很有發(fā)展?jié)摿Φ臒釒啛釒е参铩径?福建熱作科技，2003，28(3)31～32谷勇，周榕，鄒恒芳等.木豆栽培技術(shù)與綜合利用.西南林學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，20(4)213～217李正紅，周朝鴻，谷勇，張建云.中國(guó)木豆研究現(xiàn)狀及開(kāi)發(fā)前景.林業(yè)科學(xué)研究，2001，14(6)647～681劉中秋，周華，林勵(lì)，廖慧芳，周莉玲.生脈成骨片中木豆葉提取工藝研究.中成藥.1998，20(3)7～9孫紹美，宋玉梅，劉儉等.木豆素制劑藥理作用研究.中草藥，1995，26(3)147～148劉中秋，周華，林勵(lì)，廖慧芳，周莉玲.生脈成骨片中木豆葉提取工藝研究.中成藥.1998，20(3)7～9尚小紅.針灸治療帶狀皰疹概況.2005，25(2)82～84伍偉禎.不同抗病毒藥物治療帶狀皰疹的成本-效果分析.國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào)，2004，10(16)181～182發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明以木豆莖葉的乙醇提取物為實(shí)驗(yàn)材料，首次經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有顯著的抗皰疹病毒活性，從而為開(kāi)發(fā)這一新的抗病毒新藥奠定了化學(xué)和生物學(xué)基礎(chǔ)，并可直接用于開(kāi)發(fā)抗病毒新藥。


圖1為木豆提取物制備的工藝流程圖。LC/MS/MS分析結(jié)果表明，該提取物主成分的分子量為200-600，與標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)照，確定主要成份為牡荊苷、異牡荊苷、木犀草素、芹菜素、山萘酚、異鼠李素，見(jiàn)附圖2-7。圖2為木豆樣品總離子流圖；圖3為牡荊苷質(zhì)譜圖(其中431.0為它的分子離子峰)；圖4為異牡荊苷質(zhì)譜圖(其中431.5為它的分子離子峰)；圖5為木犀草素的質(zhì)譜圖(其中284.7為它的分子離子峰)；圖6為芹菜素的質(zhì)譜圖(其中269.2為它的分子離子峰)；圖7為山萘酚的質(zhì)譜圖(其中286.3為它的分子離子峰)；圖8為異鼠李素的質(zhì)譜圖(其中315.2為它的分子離子峰)；圖9為木豆提取物體外抗病毒活性效果及模式分析圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1木豆提取物的制備木豆提取物通過(guò)下列步驟得到(見(jiàn)流程圖1)將采收的木豆莖葉陰干，粉碎后加入10倍量的65～80％乙醇，加熱回流2～5h，提取物通過(guò)濾紙過(guò)濾，上清液經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，按實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行適當(dāng)稀釋。
實(shí)施例2木豆提取物細(xì)胞毒分析1.細(xì)胞培養(yǎng)RC-37(非洲綠猴腎細(xì)胞)在含有5％胎牛血清和均為100mg/ml青霉素與鏈霉素的DMEM單層培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。細(xì)胞融合時(shí)傳代。細(xì)胞置24孔和6孔板上分別進(jìn)行細(xì)胞毒和抗病毒分析。
2.病毒
HSV-1病毒株由德國(guó)海德堡大學(xué)藥學(xué)與分子技術(shù)學(xué)院(IPMB)提供。當(dāng)RC-37細(xì)胞長(zhǎng)成單層后接種病毒，將病毒按滴度稀釋后加入培養(yǎng)瓶中，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到90％以上時(shí)，放入-20度冰箱內(nèi)。反復(fù)凍融3次后合并。
3.細(xì)胞毒分析(1)將細(xì)胞置24孔板上，密度為每孔5*104，37℃培養(yǎng)24h。
(2)移去培養(yǎng)基，加入新鮮的含有適當(dāng)稀釋度的木豆乙醇提取物，每濃度10個(gè)重復(fù)。含1％乙醇而無(wú)藥物的1ml培養(yǎng)基作為對(duì)照。
(3)4d培養(yǎng)后，移去培養(yǎng)基，中性紅方法分析。培養(yǎng)基用含40mg/ml的中性紅的DMEM代替，37℃培養(yǎng)3h。
(4)移去培養(yǎng)基，用含有0.5％甲醛的1％CaCl2中洗1min。
(5)之后細(xì)胞在含有1％乙酸的50％乙醇中溶解，在混合器中培養(yǎng)5min，這樣與細(xì)胞結(jié)合的中性紅洗提出。
(6)540nm處測(cè)OD，測(cè)定吸收的中性紅；對(duì)照組為100％。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，木豆乙醇提取物的最大無(wú)毒濃度為48μg/ml。
實(shí)施例3木豆提取物體外抗病毒活性效果1.直接蝕斑分析(1)2*103PFU與不同濃度的木豆醇提物在室溫下培養(yǎng)1h。
(2)經(jīng)處理的系列稀釋的病毒的37℃下吸附細(xì)胞1h。
(3)棄去殘余接種體，感染細(xì)胞用含有0.5％甲基纖維素的培養(yǎng)基覆蓋，6個(gè)重復(fù)，37℃培養(yǎng)4d。
(4)單層細(xì)胞用10％福爾馬林固定。
(5)移走固定液，用1％結(jié)晶紫染色，幾分鐘后，移走結(jié)晶紫，水洗一次。查蝕斑數(shù)，未處理的細(xì)胞為對(duì)照。
2.抗病毒模式為了確定抗病毒的模式，分為以下四組(1)預(yù)處理病毒用木豆提取物預(yù)處理病毒，二者室溫下孵育1h，加入到6孔板上，37℃培養(yǎng)1h后，加入覆蓋培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d。
(2)吸附病毒在感染前木豆提取物與病毒共同孵育，并立即加入到6孔板上，37℃培養(yǎng)1h后，加入覆蓋培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d。
(3)病毒復(fù)制將病毒直接加到6孔板上，37℃培養(yǎng)1h后，同時(shí)加入覆蓋培養(yǎng)基和提取物，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d。
(4)預(yù)處理細(xì)胞在病毒感染前用木豆提取物預(yù)處理細(xì)胞，37℃培養(yǎng)1h后，加入病毒，37℃培養(yǎng)1h后，加入覆蓋培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用木豆提取物預(yù)處理HSV-1病毒，抑制率可達(dá)100％，高于文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)；對(duì)于吸附階段、復(fù)制階段和用藥物預(yù)處理細(xì)胞的抑制率分別為43％、9％和8％。所以，木豆提取物對(duì)HSV-1病毒有明顯的抑制作用，有望成為一種治療帶狀皰疹的新藥。
本發(fā)明的組合物可與藥學(xué)上可接受的載體或溶劑給藥，可通過(guò)口服、全身或局部給藥。組合物的形式可為液體制劑、固體制劑形式給藥；對(duì)于局部給藥來(lái)說(shuō)，該組合物可以在固體支持物如紗布或海綿上給藥，也可以制備成軟膏、栓劑或噴劑來(lái)局部使用。該組合物還可以以飲料、食品或添加劑的形式服用。
權(quán)利要求
1.一種具有抗病毒活性的木豆乙醇提取物。該提取物由65％～80％乙醇加熱回流2～5h制得。
2.權(quán)利要求1所述的乙醇提取物，其主要成分為分子量200-600之間的牡荊苷、異牡荊苷、木犀草素、芹菜素、山萘酚、異鼠李素。
3.權(quán)利要求2所述的乙醇提取物作為活性劑可與藥學(xué)上可接受的載體形成組合物。
4.權(quán)利要求3所述的藥物學(xué)上可接受的載體，包括本領(lǐng)域常規(guī)使用的溶劑、各種賦形劑、解崩劑等。
5.權(quán)利要求3所述的組合物為膠囊、片劑、丸劑、注射液、口服液、沖劑、糖漿、粉劑、顆粒劑、栓劑、軟膏、噴劑、飲料、食品或添加劑等形式。
6.施用抑制病毒有效劑量的權(quán)利要求3的組合物可以治療由皰疹病毒引起的病毒感染。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種具有抗皰疹病毒活性的木豆乙醇提取物，主要成分為具有較高藥理活性的黃酮類化合物，LC/MS/MS測(cè)得該提取物主成分的分子量為200－600。該提取物抗皰疹病毒效果明顯，是一種開(kāi)發(fā)前景廣闊的病毒抑制劑。
文檔編號(hào)A61P31/22GK1739597SQ20051001017
公開(kāi)日2006年3月1日 申請(qǐng)日期2005年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月12日
發(fā)明者祖元?jiǎng)? 付玉杰, 王微, 李慶勇, 候春蓮, 張琳, 張瑩, 陳麗艷, 劉威 申請(qǐng)人:東北林業(yè)大學(xué), 祖元?jiǎng)?br>