專利名稱：結(jié)直腸癌放射免疫導(dǎo)向手術(shù)藥物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種放射免疫導(dǎo)向手術(shù)藥物的制備方法，具體地說，本發(fā)明涉及一種結(jié)直腸癌放射免疫導(dǎo)向手術(shù)藥物的制備方法。
背景技術(shù)：
50％接受根治性手術(shù)的結(jié)直腸癌患者最終會復(fù)發(fā)，其中主要原因是難以發(fā)現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移灶。放射免疫導(dǎo)向手術(shù)(RIGS，RadioImmunoGuided Surgery)為解決手術(shù)臺上微轉(zhuǎn)移灶的判斷提供了定性的標準，為手術(shù)徹底切除微轉(zhuǎn)移灶提供了可靠的手段。
RIGS是在放射免疫顯像(RII，RadioImmunImaging)定位診斷的基礎(chǔ)上，使用手持式探測器術(shù)中探測腫瘤及其轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的技術(shù)。目前在結(jié)直腸癌的RIGS應(yīng)用中，多采用雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體如B72.3和CC49。使用的放射性標記核素為111In和125I和131I等。
目前使用的放射性核素標記的抗體進行結(jié)直腸癌的RIGS藥物均為臨時使用時，臨時標記。這存在著很大的臨床使用不便。它包括放射性核素的預(yù)定，如果要進口還需要等上2-4周，完全不利于及時給病人手術(shù)，同時放射性藥物的標記受時間、標記場所和放射性藥物操作者的限制，大大影響RIGS的開展和推廣應(yīng)用。發(fā)展一種可以較長時間保存、可以滿足臨床隨時使用要求、不受標記場所限制、病人隨到隨時使用、靈活方便的用于結(jié)直腸癌RIGS的藥物將給臨床醫(yī)生進行RIGS帶來極大的方便，同時可以第一時間給患者進行給藥并及時進行手術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供隨時使用的結(jié)直腸癌放射免疫導(dǎo)向手術(shù)藥物的制備方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種結(jié)直腸癌放射免疫導(dǎo)向手術(shù)藥物，其特征在于，所述的藥物是由CL58抗體經(jīng)標記、凍干后制得。
本發(fā)明還提供了一種上述藥物的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)放射性的標記在CL58抗體中加入緩沖溶液調(diào)pH值至7.4，搖勻后，加入Na125I溶液，再加入N-溴代琥珀酰亞胺，搖勻，充分反應(yīng)后，加入人血清白蛋白終止反應(yīng)，并用PD-10柱純化，得到標記純化后的抗體；(2)標記抗體的純化在標記前，取Sigma公司生產(chǎn)的PD-10柱一根，用pH7.2的0.01M的磷酸緩沖溶液25ml飽和淋洗該柱，并用10mg的人血清白蛋白飽和柱子，然后待用。標記后的抗體上柱純化，體積不超過2.5ml，不足2.5ml的上住后用pH7.2的0.01M的磷酸緩沖溶液補足，棄之收集的該2.5ml淋洗液，然后再用2.5ml的pH7.2的0.01M的磷酸緩沖溶液淋洗，收集該淋洗液2.5ml，即為最終標記的產(chǎn)品。
(3)標記抗體的凍干取標記純化后的抗體，加入保護劑、成型劑或多糖后冷凍干燥即可。
其中所述的緩沖溶液為磷酸緩沖液；所述的保護劑選自以下物質(zhì)人血清白蛋白、VC、人IgG和其它無關(guān)蛋白質(zhì)；所述的成型劑選自以下物質(zhì)尿素、蔗糖、果糖等；所述的多糖選自以下物質(zhì)中的一種或多種甘露醇、蔗糖、果糖等。
本藥物的最大特點是臨床可以隨時使用，避免了以前制備導(dǎo)向手術(shù)藥物受標記條件、放射性同位素來源、以及標記環(huán)境的等條件的限制，克服了導(dǎo)向手術(shù)推廣過程中受放射性藥物限制的缺點。


圖1是注射125I-CL58后荷人結(jié)腸癌CL187裸鼠的T/NT比值隨時間的變化圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實施例1放射性的標記取CL58抗體1.0mg(5.0mg/ml)加入0.1mlpH7.4磷酸緩沖溶液(PB)，搖勻后，加入185MBq Na125I溶液，然后加入12-16μg的NBS，輕輕搖動，反應(yīng)至合適時間后，加入20mg的HSA終止反應(yīng)。測定標記率，并用PD10柱純化。
標記抗體的凍干取標記純化后的抗體，其標記抗體的比活度為3mCi/mg，抗體濃度為0.6mCi/ml，加入保護劑人血清白蛋白(HSA)，HSA含量為4mg/ml，和適量的甘露醇。分裝到干凈的西林瓶中，每瓶0.5ml，采用Dura-DryTM凍干機冷凍干燥，24h后凍干完成。然后測定凍干的標記抗體的溶解性、抗體活性和抗體的聚合情況，以及放置不同時間后標記抗體的脫碘率和活性變化并進行SDS-PAGE電泳分析。
凍干后的樣品成白色塊狀，輕輕抖動成蓬松的粉末狀。用0.5ml的蒸餾水溶解成淡黃色的透明溶液(黃色考慮為HSA的顏色)，pH為7.2左右。放置30d后游離碘含量為8％(n＝10)左右。
實施例2(1)放射性的標記在CL58抗體中加入磷酸緩沖溶液調(diào)pH值至7.2，搖勻后，加入111MBqNa125I溶液，再加入14μgN-溴代琥珀酰亞胺，搖勻，充分反應(yīng)后，加入人血清白蛋白終止反應(yīng)，并用PD10柱純化得到標記純化后的抗體；(2)標記抗體的凍干取標記純化后的抗體，加入人血清白蛋白后冷凍干燥即可。
實驗例1凍干的標記抗體的動物體內(nèi)分布研究凍干后的樣品用0.5ml蒸餾水溶解后，在用無菌的pH7.2磷酸緩沖溶液稀釋，然后給荷CL-187人結(jié)腸癌裸鼠尾靜脈注射凍干的標記抗體125I-CL58，注射體積0.1ml，放射性活度為370KBq，抗體含量為3.3μg。同時在用藥前3天給裸鼠飲用1％的KI水以封閉甲狀腺。于注射后1d、3d、5d和7d等從眼球取血(每組5只)，扭斷頸椎至死，解剖，取心、肝、脾、腎、肺、胃、腸、肌肉、骨骼和腫瘤，稱重，并測定放射性計數(shù)，計算ID％/g和T/NT比值。具體體內(nèi)分布結(jié)果見表1。
從表1我們可以看出在注射凍干的標記抗體后24h腫瘤攝取就比其它各臟器組織中的放射性攝取高，T/NT均大于1。在注射125I-CL58后在72小時腫瘤攝取達到最高，ID％/g高達為14.7％。到用藥后7d腫瘤攝取仍高達11.5％，T/NT均大于3.0以上(見圖1)。這表明凍干后的標記樣品保持了很高的生物活性，凍干樣品具有很好的腫瘤靶向性。隨著時間的延長，T/NT越來越高。
荷瘤鼠顯像取荷人腸癌細胞CL187裸鼠，當瘤子直徑約0.5cm時，用藥前3天給飲用1％的KI水以封閉甲狀腺，然后尾靜脈注射標記抗體0.1ml，放射性活度約為0.1mCi，于注射后1d、2d、3d、4d和7d于西門子的ECT ICON下進行圖像采集，能峰為51keV(因儀器的最低能峰為51keV，能窗為80％，采集矩陣為128×128，圖像放大為3.20，進行裸鼠正位顯像，觀察腫瘤攝取變化和全身分布情況。其顯像結(jié)果見圖2(箭頭所示為腫瘤)，由圖可見，注射凍干的標記抗體后24h，腫瘤就能清晰顯像，隨著時間的推移，腫瘤顯像越來越清晰，到7d后幾乎就只有腫瘤顯像，表明凍干后的標記抗體具有很好的生物活性腫瘤靶向性，為該凍干藥物進行腸癌的RIGS提供了有力的藥物支持。
表1.125I標記的抗CEA單抗CL58的動物體內(nèi)分布(荷CL187腸癌細胞裸鼠，N＝5)


注射125I-CL58后荷人結(jié)腸癌CL187裸鼠的T/NT比值隨時間的變化見圖1。
文獻1.99mTc/188Re標記的抗CEA單抗CL58及其生物分布研究，中華核醫(yī)學雜志，Vol 20，No5p228-229(2000)；2.CHARACTERIZATION OF MONOCLONAL ANTIBODY CL58AGAINST CARCINOEMBRYONIC ANTIGEN (CEA) AND STUDYOF ITS BIODISTRIBUTION。Chinese Journal of CancerResearch，2002，Vol.14(2)p108-112；3.人結(jié)直腸癌粘膜下注射-(125)I標記抗CEA單抗CL58放射免疫導(dǎo)向手術(shù)的研究，中華普通外科雜志，2002，Vol 7，No.10p599-601；4.Clinical Application of Radioimmunoguided Surgery inColorectal Cancer Using 125I-LabeledCarcinoembryonic Antigen-Specific MonoclonalAntibody Submucosally.Diseases of the Colon & Rectum.46(12)1659-1666，December 2003.
權(quán)利要求
1.一種結(jié)直腸癌放射免疫導(dǎo)向手術(shù)藥物，其特征在于，所述的藥物是由CL58抗體經(jīng)標記、凍干后制得。
2.如權(quán)利要求1所述藥物的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)放射性的標記在CL58抗體中加入緩沖溶液調(diào)pH值至7-8，搖勻后，加入Na125I溶液，再加入N-溴代琥珀酰亞胺，搖勻，充分反應(yīng)后，加入人血清白蛋白終止反應(yīng)，并用PD-10柱純化得到標記純化后的抗體；(2)標記抗體的凍干取標記純化后的抗體，加入保護劑、成型劑或多糖后冷凍干燥即可。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的緩沖溶液為磷酸緩沖液。
4.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的保護劑選自以下物質(zhì)人血清白蛋白、VC、人IgG和其它無關(guān)蛋白質(zhì)。
5.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的成型劑選自以下物質(zhì)尿素、蔗糖、果糖。
6.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的多糖選自以下物質(zhì)中的一種或多種甘露醇、蔗糖、果糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種結(jié)直腸癌放射免疫導(dǎo)向手術(shù)藥物，其特征在于，所述的藥物是由CL58抗體經(jīng)標記、凍干后制得。本藥物的最大特點是臨床可以隨時使用，避免了以前制備導(dǎo)向手術(shù)藥物受標記條件、放射性同位素來源、以及標記環(huán)境的等條件的限制，克服了導(dǎo)向手術(shù)推廣過程中受放射性藥物限制的缺點。
文檔編號A61P35/00GK1679970SQ20051001127
公開日2005年10月12日 申請日期2005年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月27日
發(fā)明者楊志, 王雪娟, 林保和, 張梅穎 申請人:北京大學臨床腫瘤學院