專利名稱：蚯蚓微管結(jié)合蛋白Tau、其編碼基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及編碼一種蚯蚓的微管結(jié)合蛋白的基因Etau。本發(fā)明還涉及該基因編碼的蛋白質(zhì)功能、含有上述基因序列的重組載體及其亞克隆和重組微生物，以及由這些亞克隆獲得到的真核表達(dá)載體及轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。此外，本發(fā)明還涉及該基因在神經(jīng)元微管組裝中的作用及其臨床醫(yī)學(xué)中對神經(jīng)退行性疾病研究的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1975年，Weingarten等在研究神經(jīng)元微管系統(tǒng)的分子結(jié)構(gòu)過程中，發(fā)現(xiàn)了一種與微管蛋白質(zhì)具有高親和力的蛋白質(zhì)，將其歸類于微管結(jié)合蛋白(microtubule associated protein，MAP)，命名為神經(jīng)tau。該蛋白質(zhì)具有促進(jìn)微管裝配和穩(wěn)定微管網(wǎng)絡(luò)的作用，與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)運(yùn)輸以及神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育相關(guān)。近十幾年的研究顯示，神經(jīng)tau與神經(jīng)退行性疾病，特別是與早老性癡呆(Alzheimer’s disease，AD)的病理過程密切相關(guān)。Tau的異常超磷酸化是神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)的主要成分，而NFTs是AD等神經(jīng)退行性疾病的一種重要的病理特征。1998年，Hutton等發(fā)現(xiàn)了17號(hào)染色體相關(guān)的帕金森氏病(Parkinson’s PD)樣額顳葉癡呆(frontotemporaldementia with parkinsonsm linked to chromosome 17，F(xiàn)TDP-17)的病因是該染色體上的tau基因發(fā)生了突變。最近研究表明，該蛋白質(zhì)也存在于神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)，能與DNA相互作用，具有穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)的作用；還能與某些具有重要功能的蛋白質(zhì)相互作用，表現(xiàn)出類似分子伴侶的功能。由于tau在AD等神經(jīng)退行性疾病病理機(jī)制研究中的重要地位，使其成為微管結(jié)合蛋白家族中最受矚目的成員之一。
自從tau首先從成體腦組織中被提取出來，人們就知道它以幾種形式(異構(gòu)體)存在，后來發(fā)現(xiàn)這是發(fā)育調(diào)控的結(jié)果(Matus，1988)。分子克隆研究現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)成體哺乳動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)中至少存在六種tau蛋白質(zhì)異構(gòu)體，它們來源于同一個(gè)基因，經(jīng)mRNA轉(zhuǎn)錄后的不同剪接而得到。
Tau基因位于17號(hào)染色體上，它在種系間高度保守。迄今為止，已經(jīng)從小鼠、大鼠、牛以及人類的表達(dá)庫中獲得了tau的克隆(Lee等，1988；Goedert等，1988；Goedert等，1989a；Himmler，1989a；Himmler等，1989b；Mori等，1989；Kosik等，1989；Kanai等，1989；Goedert等，1989b)。目前以全長cDNA克隆形式被分離出來的六種人類tau的異構(gòu)體分別由352-441個(gè)氨基酸組成，差別主要在于三個(gè)插入序列的存在與否(Goedert等，1988；Goedert等，1989a；Goedert等，1989b；Goedert和Jakes，1990)。
與tau蛋白質(zhì)沉積相關(guān)的病癥并不只限于阿爾茨海默病，在許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中也可以觀察到，諸如皮克病(心包性假性肝硬變)和進(jìn)行性核上麻痹(Joachim等，1987)。除此之外，還發(fā)現(xiàn)在大部分老齡的唐氏綜合癥患者腦中tau是配對螺旋樣纖維的組成部分。這提示對于多種神經(jīng)細(xì)胞的損傷，tau可能以一種相對非專一性的方式被影響。換句話說，tau的不同修飾，每一種針對特定的疾病，可能導(dǎo)致相似的神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成。
Tau是阿爾茨海默病病理學(xué)研究中的關(guān)鍵分子之一，并且與其他幾種神經(jīng)退行性疾病有關(guān)(Grundke-Iqbal等，1986a；Grundke-Iqbal等，1986b；Iqbal等，1986)。統(tǒng)計(jì)數(shù)字顯示，所有與tau有關(guān)的病理學(xué)占據(jù)了癡呆病的75％。在這些神經(jīng)系統(tǒng)的疾病中，家族遺傳性額顳頁癡呆引起了廣泛的關(guān)注。此種家族性癡呆的患者，其tau基因發(fā)生了某些錯(cuò)義突變(Poorkaj等，1998；Hutton等，1998；Spillantini等，1998)，表明tau蛋白質(zhì)的單基因突變引發(fā)其積累和加工的異?？梢灾苯訉?dǎo)致癡呆產(chǎn)生。為了弄清阿爾茨海默病及其他與tau蛋白質(zhì)有關(guān)的病理學(xué)過程的分子機(jī)制，了解tau蛋白質(zhì)各方面的功能是十分必要的。
Tau最初是以一種重要的腦微管結(jié)合蛋白被發(fā)現(xiàn)的，它可以促進(jìn)微管的組裝并穩(wěn)定后者的結(jié)構(gòu)(Weingarten等，1975)。90年代，幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別報(bào)道了tau存在于多種細(xì)胞株系的細(xì)胞核中(Loomis等，1990；Davisand Johnson，1999)，Greenwood等人發(fā)現(xiàn)核tau與DNA有直接或間接的結(jié)合(Greenwood and Johnson，1995)，因此推測tau蛋白質(zhì)除作為微管結(jié)合蛋白外，還具有其他的功能。弄清tau的功能無疑將會(huì)有助于闡明阿爾茨海默病及其他與tau蛋白質(zhì)相關(guān)的病理學(xué)過程的分子機(jī)制。
到目前為止，盡管已經(jīng)在許多動(dòng)物種類中發(fā)現(xiàn)了Tau蛋白質(zhì)并對其功能做了大量研究，但是從未見在蚯蚓中發(fā)現(xiàn)Tau蛋白質(zhì)的報(bào)道。根據(jù)果蠅、大鼠、小鼠及人類的Tau結(jié)構(gòu)的保守性，本發(fā)明人從蚯蚓身體部分及神經(jīng)節(jié)部分的總RNA中，通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的Tau基因，命名為Etau，并且對其限制性酶譜、序列及表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析，并得到了多克隆抗體。此外，本發(fā)明人還研究了該基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)該基因與微管的組裝及與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)運(yùn)輸以及神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種從蚯蚓總RNA中通過RT-PCR得到的基因E-tau和該基因表達(dá)的蛋白質(zhì)E-Tau、含有上述基因序列的重組載體及其亞克隆和重組微生物，以及由該基因構(gòu)建的真核表達(dá)載體、轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。該基因?qū)儆谝环N新的微管相關(guān)蛋白質(zhì)Tau的基因，其表達(dá)產(chǎn)物屬于一種新的蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域已部分了解神經(jīng)Tau蛋白質(zhì)具有促進(jìn)微管裝配和穩(wěn)定微管網(wǎng)絡(luò)的作用，與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)運(yùn)輸以及神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育相關(guān)；神經(jīng)tau與神經(jīng)退行性疾病，特別是與早老性癡呆(Alzheimer’s disease，AD)的病理過程密切相關(guān)。本發(fā)明還涉及該基因表達(dá)的蛋白質(zhì)E-Tau在制備治療神經(jīng)退行性疾病的藥物中的應(yīng)用，該神經(jīng)退行性疾病特別是早老性癡呆。
本發(fā)明提供的基因Etau具有如SEQ ID NO.1所示的多核苷酸序列。另一方面，該基因中的一個(gè)或多個(gè)堿基的缺失、插入或替代產(chǎn)生具有與SEQ ID NO.1所示序列具有相同功能的變異體也應(yīng)包括在本發(fā)明的內(nèi)容之內(nèi)。因此，本發(fā)明應(yīng)當(dāng)包括具有SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸的變異體，這些變異體的序列與SEQ ID NO.1所示序列的同源性至少為80％，優(yōu)選的至少為90％。
所以本發(fā)明還提供了該基因的變異體的片段。
另一方面，本發(fā)明提供含有該基因及其變異體或其片段的重組載體。選擇的載體通常能在使用的特定宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能，也就是說，載體與宿主細(xì)胞兼容，從而能實(shí)現(xiàn)基因的擴(kuò)增和(或)基因的表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，上述載體是pET28a(NOVAGEN)，插入的是Etau或其片段，插入位點(diǎn)可以是Nco I和Xho I或EcoR I和BamH I等。
用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)選載體是能夠與細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞相容的那些載體。其中尤其包括pCRII、pCR3和pcDNA3.1(Invitrogen，SanDiego，CA)、pB SII(Stratagene，La Jolla，CA)、pET 15(Novagen，Madison，WI)、pGEX(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)、pEGFP-N1(Clontech，PaloAlto，CA)、pETL(BlueBacII，Invitrogen)、pDSR-α(PCT Pub.No.WO90/14363)和pFastBacDual(Gibco-BRL，Grand Island，NY)。
另一方面，本發(fā)明還提供含有上述重組載體的重組微生物。當(dāng)載體構(gòu)建完成，即將本發(fā)明多核苷酸插入到載體的適當(dāng)部位之后，就可以將所得載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞內(nèi)，用于本發(fā)明多核苷酸的擴(kuò)增和(或)表達(dá)。可以用本領(lǐng)域熟知的方法將載體轉(zhuǎn)化到選定的宿主細(xì)胞內(nèi)，這些方法包括，例如，轉(zhuǎn)染法、感染法、氯化鈣法、電穿孔法、顯微注射法、脂轉(zhuǎn)染法、DEAE-葡聚糖法，或已知的其他方法。選擇的方法會(huì)根據(jù)所用宿主細(xì)胞的類型而有部分變化。這些方法以及其他適當(dāng)?shù)姆椒ㄒ褳樵擃I(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，并且在Sambrook等人的《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊》(Cold Spring Harbor Laboratories，1989)和Davis等人的《分子生物學(xué)基本方法》(Elsevier，1986)中均有所描述。
本發(fā)明的多核苷酸的擴(kuò)增和(或)表達(dá)可以在原核宿主細(xì)胞、酵母宿主細(xì)胞、昆蟲宿主細(xì)胞(桿狀病毒系統(tǒng))和(或)真核宿主細(xì)胞中進(jìn)行。表達(dá)宿主細(xì)胞的選擇在某種程度上取決于是否要對目的蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后修飾(如糖基化和/或磷酸化)。如果需要，則優(yōu)選的是酵母宿主細(xì)胞、昆蟲宿主細(xì)胞或哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。有關(guān)表達(dá)載體的綜述，可參考Meth.Enz.，Vol.185(D.V.Goeddel，ed.，Academic Press 1990)。
另一方面，本發(fā)明還提供一種方法，用以獲得本發(fā)明的表達(dá)蛋白質(zhì)。該方法包括培養(yǎng)宿主細(xì)胞以合成該蛋白質(zhì)，然后收集和裂解宿主細(xì)胞，再用本領(lǐng)域熟知的方法選擇性地回收產(chǎn)物。
另一方面，本發(fā)明還提供該基因及其變異體或其片段的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，使用GFP融合的Etau來轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，并得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。該細(xì)胞系例如包括HEK 293(ATCC CRL-1573)、HeLa(ATCC CCL-2)、NIH 3T3(ATCC CRL-1658)、BNL CL.2(ATCC TIB-73)、HepG2(ATCC HB-8065)、COS7(ATCC CRL-1651)、CHO(ATCCCRL-9618)、SH-SY5Y(ATCC CRL-2266)、IMR 32(ATCC CCL-127)、MRC5(ATCC CCL-171)、MCF7(ATCC HTB-22)、562(ATCC CCL-243)、SKOV-3(ATCC HTB-77)、HUV-EC(ATCC CRL-1730)(primary cell)和C6(ATCC CCL-107)等真核細(xì)胞系(購自ATCC)。
另外根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)方法，還得到Etau的多克隆抗體，這些標(biāo)記GFP的Etau細(xì)胞系及多克隆抗體可以用于原位雜交以研究本發(fā)明的基因Etau的表達(dá)模式，但不局限于此。
由于神經(jīng)tau與神經(jīng)退行性疾病，特別是與早老性癡呆(Alzheimer’sdisease，AD)的病理過程密切相關(guān)。本發(fā)明還涉及蛋白質(zhì)E-Tau在制備治療神經(jīng)退行性疾病的藥物中的應(yīng)用，該神經(jīng)退行性疾病特別是早老性癡呆。


圖1表示蚯蚓總RNA的瓊脂糖凝膠圖。
圖2表示本發(fā)明RT-PCR的瓊脂糖凝膠圖。MDNA標(biāo)記；1EtauDNA，其中方框內(nèi)為本發(fā)明基因。
圖3表示本發(fā)明多核苷酸的限制性酶切瓊脂糖凝膠圖。MDNA標(biāo)記；1重組載體；2空載體；3雙酶切重組載體；4Etau DNA。
圖4表示本發(fā)明基因經(jīng)真核表達(dá)載體構(gòu)建Etau-GFP的酶切瓊脂糖凝膠圖。MDNA標(biāo)記；1重組載體；2空載體；3雙酶切重組載體；4Etau DNA。
圖5通過SDS-PAGE檢測純化的本發(fā)明基因的表達(dá)產(chǎn)物。M標(biāo)準(zhǔn)分子量；1純化的本發(fā)明蛋白質(zhì)，其分子量約為46KDa。
圖6表示本發(fā)明基因經(jīng)真核表達(dá)載體構(gòu)建成Etau-GFP在細(xì)胞中的表達(dá)模式。
圖7表示本發(fā)明基因所得的多克隆抗體的western blot圖。M標(biāo)準(zhǔn)分子量；1純化的本發(fā)明蛋白質(zhì)的免疫條帶，其分子量約為46KDa。
圖8表示本發(fā)明基因表達(dá)的蛋白質(zhì)E-Tau與微管相互作用的紫外光譜圖。在37℃保溫的微管蛋白質(zhì)(10μM)溶液中加入E-Tau(2μM)，用日立分光光度計(jì)檢測溶液在350nm吸光值的變化(微管組裝后溶液的吸光值將變大)。曲線1溶液中只有微管蛋白質(zhì)；曲線2溶液中同時(shí)含有微管蛋白質(zhì)和E-Tau蛋白質(zhì)。
圖9Etau的限制性酶切圖譜的的確定和各種亞克隆的構(gòu)建。
圖10Etau與人類tau(Htau)蛋白活性的對比(在37℃保溫的微管蛋白質(zhì)(10μM)溶液中加入E-Tau或Htau(2μM)，用日立分光光度計(jì)檢測溶液在350nm吸光值的變化)。
圖11通過SDS-PAGE檢測純化的Etau亞克隆的表達(dá)產(chǎn)物。M標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量，B亞克隆B，E亞克隆E。
圖12亞克隆B、E蛋白表達(dá)產(chǎn)物的生物活性測定(在37℃保溫的微管蛋白質(zhì)(10μM)溶液中加入B或E(2μM)，用日立分光光度計(jì)檢測溶液在350nm吸光值的變化)。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合優(yōu)選的實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)的說明，但并不意味著對本發(fā)明的內(nèi)容限制。
實(shí)施例1蚯蚓總RNA的制備步驟1實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備1)塑料制品(包括槍頭、EP管、勻漿管等)先將DEPC(焦碳酸二乙酯)水從容量瓶中倒入瓷缸中，將塑料制品逐個(gè)浸泡其中，其中小槍頭需要吸管打入DEPC水，過夜，然后高壓，再烤干備用，實(shí)驗(yàn)前將槍頭等放入吸頭臺(tái)，再高壓一次(EP管)；2)玻璃制品泡酸過夜，沖洗干凈，蒙錫紙烤干備用(DEPC水泡)(洗凈后先泡1‰ DEPC過夜，再烤干)；3)勻漿器(包括剪刀、鑷子)先洗凈后，再高壓(不需要泡DEPC)；4)取組織用的剪刀用時(shí)在火上烤一下。
步驟2蚯蚓樣品制備1)首先準(zhǔn)備好用于包裝樣本的鋁箔或冷凍保存管，并且用油性記號(hào)筆在鋁箔或凍存管外表多處寫明樣本編號(hào)。
2)準(zhǔn)確切除蚯蚓(赤子愛勝蚓，Esiena fetida)所需組織后，立即在冰上剔除結(jié)締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類型。
3)在不含RNase的PBS中迅速漂洗樣本，以去除血漬和污物。
4)用準(zhǔn)備好的鋁箔或冷凍保存管裝載包裹組織，迅速投入液氮冷卻。
步驟3組織樣本的碾磨及勻漿1)將超低溫保存的樣品除去樣品袋，在電子天平上稱重后，轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的碾缽中，用杵子碾磨組織，其間不斷加入液氮，直至碾磨成粉末狀。
2)將碾磨成粉末狀的樣品，轉(zhuǎn)移至已經(jīng)加入適量TRIzol試劑的勻漿管中，把勻漿管置于冰浴中，在組織勻漿粉碎機(jī)上進(jìn)行勻漿。勻漿液較透明且無顆粒即可。
3)小心吸取勻漿液轉(zhuǎn)入新的離心管，在15～30℃放置5min。
4)將離心管于4℃，12000rpm，10min離心。
5)小心吸取上清液轉(zhuǎn)入新的離心管。
步驟4蚯蚓總RNA的抽提1)向裂解液中加入氯仿，蓋緊離心管蓋，用力振蕩離心管(溶液充分乳化，成乳白狀，無分相現(xiàn)象)；在15～30℃放置3min。
2)于4℃，12000rpm，離心15min。
3)從離心機(jī)中小心地取出離心管，吸取體積約為TRIzol試劑起始加入量一半的上清至另一無RNA酶的離心管。
步驟5蚯蚓總RNA的洗滌及洗脫(應(yīng)用Qiagen RNA提取試劑盒)(QIAGEN)1)向在步驟4離心得到的上清液中加入一倍體積的70％乙醇，反復(fù)顛倒直至混勻。
2)小心的吸取700μL混合液(包括其中的沉淀物)轉(zhuǎn)移到放置于2mL收集管中(試劑盒中提供)的RNease旋轉(zhuǎn)柱(spin column)中，10,000rpm離心15秒，棄去過濾液和收集管。
3)轉(zhuǎn)移RNease旋轉(zhuǎn)柱到一個(gè)新的2mL收集管中。吸取700μL BufferRW1到RNease旋轉(zhuǎn)柱中，10,000rpm離心15sec進(jìn)行洗滌，棄去過濾液和收集管。
4)轉(zhuǎn)移RNease旋轉(zhuǎn)柱到一個(gè)新的2mL收集管中。吸取500μL BufferRPE到RNease旋轉(zhuǎn)柱，10,000rpm離心15sec進(jìn)行洗滌，棄去過濾液和收集管。
5)小心的打開RNease旋轉(zhuǎn)柱，加入500μL Buffer RPE，蓋上蓋子，14,000rpm離心3min。
6)轉(zhuǎn)移RNease旋轉(zhuǎn)柱到一個(gè)新的2mL收集管中，14,000rpm離心1min。
7)轉(zhuǎn)移RNease旋轉(zhuǎn)柱到1.5mL離心管中，在RNease membrane表面加入30μL RNase-free水，室溫放置1min后，10,000rpm離心1min。
8)再加入30μL RNase-free水，10,000rpm離心1min。
步驟6蚯蚓RNA檢測所得總RNA在1％瓊脂糖凝膠中檢測，如圖1所示。
注意事項(xiàng)所有的實(shí)驗(yàn)步驟(包括離心)必須在室溫下(15～25℃)進(jìn)行。
實(shí)施例2 通過RT-PCR得到Etau化學(xué)合成如下寡核苷酸序列(上海生工)引物15’ATGGAGCCCCGCCAGGAGTTCGAA 3’引物25’CAAACCCTGCTTGGCCAGGGAGGC 3’取實(shí)施例1中的蚯蚓總RNA，采用RT-PCR one step kit(Qiagen Inc.)，按照說明書所述方法來操作。利用引物1和引物2，使用Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，95℃保溫5分鐘，50℃保溫30分鐘之后，進(jìn)入如下循環(huán)94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，循環(huán)35次，72℃延伸10分鐘，冷卻至4℃，得到Etau的核苷酸序列。將所得的DNA克隆于克隆載體pBluescript II KS-質(zhì)粒(NOVAGEN)EcoR I位點(diǎn)，其序列如SEQ ID NO.1所示。
根據(jù)載體pBluescript II KS的特性，采用T3 primer和T7 primer為引物，分別用T3聚合酶和T7聚合酶對Etau的正反兩個(gè)方向進(jìn)行測序(上海生工)，該基因的核酸序列總長1053bp。其基因核甘酸序列(即全部的可讀框)結(jié)果見SEQ ID NO.1，由該核甘酸序列所推導(dǎo)的蛋白質(zhì)為351個(gè)氨基酸，序列如SEQ ID NO.2所示。
實(shí)施例3Etau的限制性酶切圖譜的的確定和各種亞克隆的構(gòu)建步驟1對本發(fā)明的Etau克隆進(jìn)行單酶切、雙酶切及多酶切，并通過瓊脂糖凝膠電泳計(jì)算各酶切片段大小，并分析其多克隆位點(diǎn)，繪制出限制性酶切圖譜，見圖3。
步驟2用Pst I對Etau進(jìn)行酶切，并通過瓊脂糖凝膠電泳回收該酶切片段，然后以pET28a載體，用同樣的酶(Pst I)將其酶切，最后通過連接反應(yīng)構(gòu)建得到亞克隆A和B；用Pfu I/Ace II對Etau進(jìn)行雙酶切，構(gòu)建得到亞克隆C；另外分別用BlpI/Pfu I、Pfu I/Pst I、Pst I/Hind III、Pfu I/BsrFI、BsrF I/Xho I及Ace II/Xho I對Etau雙酶切，構(gòu)建得到亞克隆D、E、F、G、H和I；共獲得Etau不同片段大小的亞克隆9種，但不局限于此，見圖9。
實(shí)施例4綠色熒光蛋白質(zhì)與Etau融合蛋白質(zhì)(pEGFP-N1-Etau)的構(gòu)建我們應(yīng)用pEGFP-N1真核表達(dá)載體(CLONTECH)將GFP的氨基端連接到Etau的羧基端。Etau全長DNA是從蚯蚓總RNA中應(yīng)用RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增獲得。上游引物為5’CTCGAGATGGAGCCCCGCCAGGAGTTCGAA 3’，在起始密碼ATG前加入了Xho I位點(diǎn)；下游引物為5’-GGATCCAACAAACCCTGCTTGGCCAGGGAGGC 3’，在GFP的起始密碼ATG前引入了BamH I位點(diǎn)。為構(gòu)建Etau-GFP融合基因，Etau DNA先通過Xho I和BamH I雙酶切克隆入pEGFP-N1載體中，構(gòu)建成pEGFP-N1-Etau并經(jīng)測序驗(yàn)證，如圖4所示。
實(shí)施例5Etau全長基因的表達(dá)與純化步驟1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。用Nco I和Xho I酶切Etau，同時(shí)將所用的表達(dá)載體pET 28a也用這兩種酶進(jìn)行雙酶切，然后用T4DNA連接酶將上述片段連接起來，命名為pET 28a-Etau。酶切圖譜和DNA測序結(jié)果表明表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建準(zhǔn)確無誤。
步驟2重組蛋白質(zhì)的的表達(dá)和純化。用CaCl2法將pET 28a-Etau轉(zhuǎn)化BL21(DE3)(Stratagene)菌株感受態(tài)細(xì)胞，用LB培養(yǎng)基37℃液體培養(yǎng)。當(dāng)OD600＝0.6時(shí)，加入IPTG(終濃度0.4mM)開始誘導(dǎo)本發(fā)明基因的表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)，離心收集菌體。用添加蛋白質(zhì)酶抑制劑的磷酸緩沖液(pH 7.3，aprotinin 1μg/ml，PMSF 100μg/ml)懸浮菌體，每1升培養(yǎng)液用50ml緩沖液懸浮，于冰浴中超聲裂解菌體。隨后，加入TritonX-100(終濃度1％)，輕輕攪拌均勻30分鐘。離心取上清(4℃，10000rpm)，用Ni++-螯合Sepharose 4B柱親和吸附，用50mM咪唑洗脫除去雜蛋白質(zhì)。然后收集200mM咪唑洗脫組分，透析，真空冷凍干燥，最后用SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證該樣品，結(jié)果顯示其分子量與預(yù)期一致(約為46KDa)，并且其純度在90％以上，見圖5。
實(shí)施例5轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的表達(dá)模式選擇HEK 293，HeLa，COS-7，CHO，5HSY-5Y等真核細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
步驟1準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染細(xì)胞(應(yīng)用Inventrogen的轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000)轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞鋪板在500μL/2mL含血清，不含抗生素的正常生長的培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)中(每孔0.5-2×105/3×105個(gè)細(xì)胞)。使其在轉(zhuǎn)染日能達(dá)到90-95％的融合。
步驟2準(zhǔn)備DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物1)對于每孔細(xì)胞，使用50μL/250μL無血清培養(yǎng)基(如OPTI-MEMI、DMEM培養(yǎng)基)稀釋0.8μg DNA/4.0μg DNA，輕輕混勻。
2)使用前將Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑輕輕混勻，每孔細(xì)胞用50μL/250μL無血清培養(yǎng)基稀釋2μL/10μL Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑。輕輕混勻，室溫孵育5分鐘。
3)混合稀釋的DNA和稀釋的Lipofectamine 2000，此時(shí)總體積是100μL/500μL。輕輕混勻，室溫放置20分鐘以使DNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物形成。溶液可能會(huì)比較渾濁，但這不影響轉(zhuǎn)染效率。
步驟3轉(zhuǎn)染細(xì)胞1)將24孔板中的舊營養(yǎng)液吸出，用無血清培養(yǎng)基清洗兩次。加入0.5ml/2ml無血清配養(yǎng)基。
2)逐滴加入100μL/500μL脂質(zhì)體/DNA混合物到每孔中(從培養(yǎng)孔一邊到另一邊)，邊加邊前后來回?fù)u動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻。
3)在37℃，5％CO2中孵育24-48小時(shí)。無需去掉復(fù)合物或更換培養(yǎng)基?；蛘咴?-5小時(shí)后更換培養(yǎng)生長基也不會(huì)降低轉(zhuǎn)染活性。
4)在細(xì)胞中加入復(fù)合物24-72小時(shí)后，熒光鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，分析細(xì)胞抽提物或進(jìn)行原位細(xì)胞染色，檢測各項(xiàng)指標(biāo)。
步驟4篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系1)轉(zhuǎn)染24h后施加篩選壓力，改用含G418(C20H40N4O10·2H2SO4，無中文名稱，是一種抗生素)的培養(yǎng)基培養(yǎng)。在G418篩選濃度下持續(xù)培養(yǎng)14天后，挑出單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，期間每3天換液一次。
2)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在非選擇性培養(yǎng)液中培養(yǎng)18～24h，使轉(zhuǎn)染的外源基因得到表達(dá)后，胰酶消化，按1∶15～1∶20稀釋傳代，接種入各種選擇性培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，在2～3周內(nèi)每2～4天更換培養(yǎng)液一次，使抗性克隆得以生長(如圖6)。
3)挑選克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后進(jìn)行DNA或RNA的雜交分析，新合成的蛋白質(zhì)的檢測以及相關(guān)各項(xiàng)指標(biāo)的檢測。
實(shí)施例5應(yīng)用純化的Etau產(chǎn)物以制備抗體經(jīng)純化的重組表達(dá)的Etau產(chǎn)物進(jìn)一步純化后，直接溶于水中，這樣得到的單一蛋白質(zhì)可用本領(lǐng)域所熟知的方法免疫動(dòng)物以制備多克隆抗體。得到多克隆抗體后，檢測其效價(jià)及免疫特性。如圖7。
實(shí)施例6純化的Etau產(chǎn)物適用于分子神經(jīng)生物學(xué)已知該基因的產(chǎn)物Etau是一種神經(jīng)Tau蛋白質(zhì)具有啟動(dòng)微管裝配和穩(wěn)定微管網(wǎng)絡(luò)的作用(如圖8)，與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)運(yùn)輸以及神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育相關(guān)，神經(jīng)tau與神經(jīng)退行性疾病，特別是與早老性癡呆(Alzheimer’sdisease，AD)的病理過程密切相關(guān)。因此應(yīng)用該蛋白質(zhì)產(chǎn)物可研究其與DNA和蛋白質(zhì)的相互作用，以進(jìn)一步明確Tau神經(jīng)退行性疾病中的調(diào)控作用。因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)E-Tau還可以用于制備治療神經(jīng)退行性疾病的藥物，該神經(jīng)退行性疾病特別是早老性癡呆。
實(shí)施例7Etau產(chǎn)物的抗體適用于免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫組織化學(xué)按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊》(Cold Spring Harbor Laboratories，1989)中所述方法，應(yīng)用Etau的抗體可對蚯蚓組織和細(xì)胞進(jìn)行原位雜交，從而進(jìn)行Etau基因的表達(dá)模式以及Tau蛋白質(zhì)執(zhí)行功能的時(shí)間和部位，以及表達(dá)強(qiáng)度。
實(shí)施例8Etau亞克隆產(chǎn)物蛋白生物活性的鑒定按照Etau全長基因的表達(dá)方法，將實(shí)施例3中的亞克隆片段B、E經(jīng)對應(yīng)的雙酶切后用T4連接酶連接到相應(yīng)酶切的表達(dá)載體pET 28a中，然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞，表達(dá)純化得到相應(yīng)的蛋白(見圖11)，發(fā)現(xiàn)亞克隆蛋白B、E、都具有一定的活性，即促進(jìn)微管蛋白的組裝(見圖12)。
實(shí)施例9蚯蚓Etau和人Htau的活性比較Etau與人類tau(Htau)蛋白活性的對比(在37℃保溫的微管蛋白質(zhì)(10μM)溶液中加入E-Tau或Htau(2μM)(微管蛋白自豬腦內(nèi)提取，提取方法參考文獻(xiàn)(Robley C.1982)，Htau蛋白是按照文獻(xiàn)先將連接到表達(dá)載體上的人tau基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)、純化后得到的，表達(dá)和純化方法參考文獻(xiàn)(Goedert和Jakes，1990)，用日立分光光度計(jì)檢測溶液在350nm吸光值的變化)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖10。由此可見，蚯蚓Etau具有比已知的人Htau更高的促進(jìn)微管蛋白組裝的活性。
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序列表<110>中國科學(xué)院生物物理研究所<120>蚯蚓微管結(jié)合蛋白Tau、其編碼基因及其應(yīng)用<130>IB052846<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1053<212>DNA<213>蚯蚓(Esiena fetida)<400>1atggagcccc gccaggagtt cgaagtgatg gaagatcacg ctgggacgta cgggttgggg 60gacaggaaag atcagggggg ctacaccatg caccaagacc aagagggtga cacggacgct120ggcctgaaag ctgaagaagc aggcattgta gacaccccca gcctggaaga cgaagctgct180ggtcacgtga cccaagctcg catggtcagt aaaagcaaag acgggactgg aagcgatgac240aaaaaagcca agggggctga tggtaaaacg aagatcgcca caccgcgggg agcagcccct300ccaggccaga agggccaggc caacgccacc aggattccag caaaaacccc gcccgctcca360aagacaccac ccagctctgg tgaacctcca aaatcagggg atcgcagcgg ctacagcagc420cccggctccc caggcactcc cggcagccgc tcccgcaccc cgtcccttcc aaccccaccc480acccgggagc ccaagaaggt ggcagtggtc cgtactccac ccaagtcgcc gtcttccgcc540aagagccgcc tgcagacagc ccccgtgccc atgccagacc tgaagaatgt caagtccaag600atcggctcca ctgagaacct gaagcaccag ccgggaggcg ggaaggtgca aatagtctac660aaaccagttg acctgagcaa ggtgacctcc aagtgtggct cattaggcaa catccatcat720
aaaccaggag gtggccaggt ggaagtaaaa tctgagaagc ttgacttcaa ggacagagtc 780cagtcgaaga ttgggtccct ggacaatatc acccacgtcc ctggcggagg aaataaaaag 840attgaaaccc acaagctgac cttccgcgag aacgccaaag ccaagacaga ccacggggcg 900gagatcgtgt acaagtcgcc agtggtgtct ggggacacgt ctccacggca tctcagcaat 960gtctcctcca ccggcagcat cgacatggta gactcgcccc agctcgccac gctagctgac1020gaggtgtctg cctccctggc caagcagggt ttg 1053<210>2<211>351<212>PRT<213>蚯蚓(Esiena fetida)<400>2Met Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly Thr1 5 10 15Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His Gln20 25 30Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Ala Glu Glu Ala Gly35 40 45Ile Val Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr50 55 60Gln Ala Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp65 70 75 80Lys Lys Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg85 90 95Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile100 105 110Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu115 120 125Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro130 135 140Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro145 150 155 160Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser165 170 175Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro
180 185 190Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys195 200 205His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp210 215 220Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His225 230 235 240Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe245 250 255Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His260 265 270Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe275 280 285Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr290 295 300Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn305 310 315 320Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala325 330 335Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu340 345 350
權(quán)利要求
1.一種多核苷酸，該多核苷酸的序列與SEQ ID NO.1所示序列的同源性至少為80％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中，該多核苷酸的序列與SEQID NO.1所示序列的同源性至少為90％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其具有SEQ ID NO.1所示序列。
4.一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列與SEQ ID NO.2所示序列的同源性至少為80％。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)，其中，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列與SEQ ID NO.2所示序列的同源性至少為90％。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)，其具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
7.一種重組載體，該重組載體的特征在于含有權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
8.一種含有權(quán)利要求7所述的重組載體的宿主細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其選自原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
10.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的多核苷酸轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞，該細(xì)胞系包括HEK 293，HeLa，NIH 3T3，BNL CL2，HepG2，COS-7，CHO，5HSY-5Y，IMR 32，MRC5，MCF7，562，SKOV-3，IGROV-1，HUV-EC和C6等真核細(xì)胞系。
11.一種GFP融合蛋白，其特征在于含有權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的多核苷酸所表達(dá)的蛋白質(zhì)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的多核苷酸在調(diào)控細(xì)胞微管組裝中的應(yīng)用。
13.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任何一項(xiàng)的蛋白質(zhì)在制備治療神經(jīng)退行性疾病的藥物中的應(yīng)用。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的應(yīng)用，其中所述神經(jīng)退行性疾病為早老性癡呆。
15.根據(jù)權(quán)利要求4-6及11中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)在免疫組織化學(xué)或抗體制備中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種從蚯蚓總RNA中通過RT－PCR得到的基因E－tau和該基因表達(dá)的蛋白質(zhì)E－Tau、含有上述基因序列的重組載體及其亞克隆和重組微生物，以及由該基因構(gòu)建的真核表達(dá)載體、轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。該基因?qū)儆谝环N新的微管相關(guān)蛋白質(zhì)Tau的基因，其表達(dá)產(chǎn)物屬于一種新的蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域已部分了解神經(jīng)tau與神經(jīng)退行性疾病，特別是與早老性癡呆(Alzheimer’s disease，AD)的病理過程密切相關(guān)；該蛋白質(zhì)具有促進(jìn)微管裝配和穩(wěn)定微管網(wǎng)絡(luò)的作用。本發(fā)明還涉及該基因在治療神經(jīng)退行性疾病中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K38/16GK1873005SQ200510011850
公開日2006年12月6日 申請日期2005年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月2日
發(fā)明者赫榮喬, 趙靜, 王東亮, 王興勝, 赫堅(jiān) 申請人:中國科學(xué)院生物物理研究所