專利名稱：治療肝癌的虎眼萬年青多糖藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從虎眼萬年青中提取的虎眼萬年青多糖提取物為單一組分，以虎眼萬年青多糖為有效活性成分治療肝癌的虎眼萬年青多糖藥物
背景技術(shù)：
虎眼萬年青(Ornithogalum caudatum Ait.)是長白山地區(qū)特有的民間藥材，雖然未見歷代本草收載，但民間多用其全草或球莖入藥，外用其鮮汁液涂抹于患處以治療疔瘡、消炎；內(nèi)服可治療無名腫毒、肝炎、腮腺炎、肝硬化、肝癌等，而且療效確切，毒副作用小。
近幾年來，國內(nèi)外對(duì)其基礎(chǔ)研究的報(bào)道較多，1992年，國外科學(xué)家從同屬植物虎眼萬年青(Ornithogalum Saundersiae)中分離出具有強(qiáng)抗癌作用的?；窃碥疹惢衔颫SW-1。生理活性篩選實(shí)驗(yàn)表明，其體外對(duì)肺癌、乳房癌有明顯抗癌活性，對(duì)P388小鼠白血病細(xì)胞有細(xì)胞毒作用，對(duì)P388細(xì)胞蛋白合成前體的結(jié)合及核酸的合成有抑制作用，比常見抗癌藥喜樹堿、阿霉素、紫杉醇的抗癌活性高10倍以上，而且對(duì)正常細(xì)胞沒有毒性作用。
目前，科學(xué)家正在對(duì)虎眼萬年青皂苷的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，以期進(jìn)一步提高其活性，使其更有可能成為抗癌藥物，而美國同行則正在利用我國科學(xué)家提供的樣品進(jìn)行抗癌機(jī)理的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用新的方法從虎眼萬年青提取的虎眼萬年青多糖提取物，以虎眼萬年青多糖提取物為單一組分，將虎眼萬年青多糖作為活性成分用于制備治療肝癌的藥物。
本發(fā)明提供的從虎眼萬年青提取的虎眼萬年青多糖提取物，它是通過如下的方法提取的以虎眼萬年青為原料，粉碎成粗顆粒，分別按13mL/g生藥、10mL/g生藥及10mL/g生藥加水，加熱至沸騰，提取三次，每次2小時(shí)，濾過，合并濾液，濃縮至相對(duì)密度1.03～1.05(80℃)，放冷，加乙醇至含醇量為20％，靜置24小時(shí)，抽濾，棄去沉淀物，濾液再加乙醇至含醇量為70％，靜置24小時(shí)，抽濾，收取沉淀，沉淀以無水乙醇適量洗滌，干燥(50℃)，粉碎成80目細(xì)粉，得虎眼萬年青多糖干粉提取物，其中虎眼萬年青多糖含量以葡萄糖計(jì)達(dá)50％～60％(W/W)。
本發(fā)明所述的虎眼萬年青多糖含有阿拉伯糖(arabinose)和半乳糖(galactose)成分，其主要組分是阿拉伯半乳糖蛋白。
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明提供的從虎眼萬年青提取的虎眼萬年青多糖對(duì)于肝癌有良好的治療作用。本發(fā)明提供的虎眼萬年青多糖即使大劑量使用時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的行為也無任何顯著變化。對(duì)動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)無明顯影響。大鼠長期毒性試驗(yàn)結(jié)果表明給藥組及對(duì)照組大鼠在給藥期間及恢復(fù)期內(nèi)均活動(dòng)正常，毛發(fā)光澤，未見尿、糞便異常，無一死亡；動(dòng)物體重增長給藥組與對(duì)照組比較無顯著性差異；動(dòng)物血液血象和血液生化學(xué)檢查總體未見異常，病理組織學(xué)檢查未見異常，其它送檢的臟器均未見有規(guī)律的形態(tài)學(xué)改變，在大鼠長期毒性恢復(fù)期后也未見有各臟器有規(guī)律的形態(tài)學(xué)改變。故可認(rèn)為虎眼萬年青多糖對(duì)大鼠長期毒性極低。
虎眼萬年青多糖鑒定將本發(fā)明提供的從虎眼萬年青提取的虎眼萬年青多糖提取物粗品溶解配成20％水溶液，經(jīng)唾液淀粉酶37℃酶解除淀粉，Sevage法除蛋白，蒸餾水透析48h除鹽濃縮后的樣品在熱水(60℃)中溶解，然后加入不同體積的乙醇使含醇量分別達(dá)到40％、60％進(jìn)行分級(jí)沉淀。這樣多糖被分成3個(gè)部分40％乙醇沉淀(OC-1)、60％乙醇沉淀(OC-2)和60％乙醇溶解部分(即60％乙醇沉淀的上清液)(OC-3)。
將60％乙醇沉淀部分(OC-2)溶于熱水(60℃)后與Sephadex DEAE樹脂在一個(gè)燒杯中混合。平衡后，將樹脂置于漏斗中并用0.5M NH4HCO3溶液洗滌，由此分成2個(gè)組分0.5M NH4HCO3洗脫液(OC-2-1)和結(jié)合在樹脂上的殘余組分(OC-2-2)。0.5M NH4HCO3洗脫液蒸干后溶解在水中裝在DEAE柱上，將此多糖用0.2M NH4HCO3溶液等度洗脫，測定各洗脫液的215nm和280nm的吸收值(OD值)，用收集管數(shù)對(duì)OD值繪制洗脫曲線。將同一洗脫峰的組分合并，產(chǎn)生4個(gè)主要組分OC-2-1-a(未結(jié)合部分)，OC-2-1-b，OC-2-1-c，OC-2-1-d，OC-2-1-e。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60℃以下將各組分蒸干，然后用PD 10柱除去鹽和小分子。
我們采用改良硫酸-咔唑法，首先對(duì)其中OC-2-1-b，OC-2-1-c，OC-2-1-d，OC-2-1-e四個(gè)組分糖醛酸含量法進(jìn)行了測定，結(jié)果表明，OC-2-1-b，OC-2-1-c，OC-2-1-d，OC-2-1-e各組分含有較高的糖醛酸含量，其含量分別為22％，25％，52％，53％。
其次，OC-2-1-b，OC-2-1-c，OC-2-1-d，OC-2-1-e四個(gè)組分在SDS凝膠(SDS PAGE 4-15％)電泳后用考馬斯亮藍(lán)(Coomasssie Blue)試劑和β-葡萄糖基-Yariv(1，3，5-三-(4-β-D-葡萄吡喃糖基-氧化苯基-偶氮基)-2，4，6-三羥基苯)試劑分別染色，所用Marker是Benchmarker預(yù)先染色的蛋白梯度(分子量從6.0到181.8kDa)OC-2-1-b，OC-2-1-c，OC-2-1-d，OC-2-1-e四個(gè)組分用考馬斯亮藍(lán)試劑染色后未發(fā)現(xiàn)明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn)；用β-葡萄糖基-Yariv試劑染色后現(xiàn)出4個(gè)明顯的紅色條帶。由于β-葡萄糖基-Yariv試劑是阿拉伯半乳糖蛋白(arabino-galactan proteins，AGPs)的特異性染色劑，因此可以初步說明OC-2-1-b，OC-2-1-c，OC-2-1-d，OC-2-1-e四個(gè)組分是阿拉伯半乳糖蛋白。
將糖醛酸還原，然后甲基化，用氣相色譜法進(jìn)行連接和組成分析，結(jié)果表明，OC-2-1-b，OC-2-1-c，OC-2-1-d，OC-2-1-e四個(gè)組分含有較高的阿拉伯糖(arabinose)和半乳糖(galactose)成分，這進(jìn)一步說明四個(gè)組分主要是阿拉伯半乳糖蛋白。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的虎眼萬年青多糖對(duì)昆明小鼠肝癌H22的平均抑瘤率分別為16.72％、23.86％、40.75；對(duì)小鼠肉瘤S180的平均抑瘤率分別為27.49％、33.53％、49.61％；對(duì)腹腔接種肝癌腹水(HepA)小鼠的平均生命延長率分別為35.4％、51.4％、49.2％。提示虎眼萬年青多糖200mg/kg劑量組對(duì)小鼠肝癌H22及肉瘤S180生長有明顯的抑制作用，可使腹腔接種肝癌腹水(HepA)小鼠的生命延長率明顯延長。
吉林省長白山區(qū)野生和人工種植虎眼萬年青資源十分豐富。本發(fā)明提供的從虎眼萬年青提取的虎眼萬年青多糖，有豐富的原料來源。本發(fā)明對(duì)其有效成分和藥理活性作了進(jìn)一步的研究，由于虎眼萬年青多糖所具有的明顯的抗輻射、提高機(jī)體免疫功能和抗腫瘤的功效，其可以用于制備治療肝癌的藥物本發(fā)明的虎眼萬年青多糖可以按照醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)及生產(chǎn)方法，以虎眼萬年青多糖提取物為單一組分，以虎眼萬年青多糖為有效活性成分制備藥物的各種劑型，包括片劑和膠囊劑。本發(fā)明的虎眼萬年青多糖藥物對(duì)于人的用量可以是0.9g/次。一日3次服用。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例一虎眼萬年青多糖提取物的制備取虎眼萬年青藥材6000g，粉碎成粗顆粒，分別加水13mL/g生藥、10mL/g生藥及10mL/g生藥，加熱至沸騰，提取三次，每次2小時(shí)，濾過，合并濾液，濃縮至相對(duì)密度1.03～1.05(80℃)放冷，加乙醇至含醇量為20％，靜置24小時(shí)，抽濾，棄去沉淀物，濾液繼續(xù)加乙醇至含醇量為70％，靜置24小時(shí)，抽濾，收取沉淀，沉淀以無水乙醇適量洗滌，干燥(50℃)，粉碎成細(xì)粉，得虎眼萬年青多糖提取物干粉300g，經(jīng)分光光度法測定虎眼萬年青多糖含量以葡萄糖計(jì)達(dá)50％～60％(W/W)。
實(shí)施例二取虎眼萬年青多糖提取物細(xì)粉，裝入1#膠囊，制成1000粒，每粒0.3g，即得藥物成品。
其它項(xiàng)目應(yīng)符合中華人民共和國藥典2005版膠囊項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定。
實(shí)施例三取虎眼萬年青多糖提取物細(xì)粉，用85％乙醇濕法制粒，整粒，干燥，壓片。每片0.3g，即得藥物成品。
其它項(xiàng)目應(yīng)符合中華人民共和國藥典2005版片劑項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定。
實(shí)施例四虎眼萬年青多糖對(duì)肝癌的治療作用的實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)是用本發(fā)明的實(shí)施例一所得的虎眼萬年青多糖提取物50、100、200mg/kg劑量組對(duì)昆明種小鼠進(jìn)行試驗(yàn)。昆明種小鼠，6～8周齡，體重18～22g，雌雄兼用。每批實(shí)驗(yàn)采用同一性別，實(shí)驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)飼養(yǎng)一周。
將小鼠按體重隨機(jī)分為5組對(duì)照組給予蒸餾水陽性藥對(duì)照組給予環(huán)磷酰胺20mg/kg藥物多糖小劑量組給予虎眼萬年青多糖提取物50mg/kg藥物多糖中劑量組給予虎眼萬年青多糖提取物100mg/kg藥物多糖大劑量組給予虎眼萬年青多糖提取物200mg/kg藥物組每日灌胃給藥1次，給藥容量均為0.2ml/10g，共10～15天。
按抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)方法制備體內(nèi)移植性腫瘤模型，取接種于昆明種小鼠第7天的肝癌H22腹水，在無菌條件下配制成瘤細(xì)胞懸液，調(diào)整活細(xì)胞數(shù)為1×107/ml，接種于昆明種小鼠左腹股溝皮下，每只小鼠接種0.2ml，接種次日起分組給藥。于停藥后24小時(shí)頸椎脫臼處死荷瘤小鼠，剝離腫瘤組織，稱重。結(jié)果以腫瘤生長抑瘤率表示抑瘤率＝(1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對(duì)照平均瘤組)×100％取符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)要求(對(duì)照組平均瘤重＞1g，且瘤重＜400mg的動(dòng)物數(shù)不超過總數(shù)的20％)的三批試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
三批試驗(yàn)結(jié)果表明，虎眼萬年青多糖多糖提取物50、100、200mg/kg劑量組對(duì)小鼠肝癌H22的平均抑瘤率分別為16.72％、23.86％、40.75％；虎眼萬年青純化前多糖50、100、200mg/kg劑量組對(duì)小鼠肝癌H22的平均抑瘤率分別為15.02％、21.86％、30.06％，表明虎眼萬年青多糖大劑量組對(duì)小鼠肝癌H22生長有明顯抑制作用，虎眼萬年青多糖小、中劑量組及虎眼萬年青純化前多糖對(duì)小鼠肝癌H22生長有一定的抑制作用，見表1-1、1-2、1-3。
表1-1虎眼萬年青多糖對(duì)小鼠肝癌H22的生長抑制作用(x±s)組別 例數(shù)藥前體重 藥后體重 瘤重抑瘤率(藥前/藥后) (g) (g) (g) (％)對(duì)照組20ml/kg 21/20 21.40±1.96 23.55±3.82 2.44±1.13 -環(huán)磷酰胺20mg/kg 21/17 20.67±1.35 19.93±1.98 1.09±0.31 55.43***虎眼萬年青多糖50mg/kg 12/12 20.11±1.44 22.20±2.90 2.10±0.83 14.00100mg/kg 12/12 20.58±1.44 21.50±2.81 2.03±0.58 16.88200mg/kg 12/920.11±1.27 23.78±2.44 1.49±0.68 38.93*虎眼萬年青純化前多糖50mg/kg 12/11 21.80±1.40 24.20±2.90 2.06±0.74 15.90100mg/kg 12/12 22.08±1.56 24.50±2.84 1.96±0.72 19.92200mg/kg 12/920.56±2.01 23.56±4.19 2.00±1.31 18.22注與對(duì)照組比較***P＜0.001
表1-2虎眼萬年青多糖對(duì)小鼠肝癌H22的生長抑制作用(x±s)組別 例數(shù)藥前體重 藥后體重 瘤重抑瘤率(藥前/藥后) (g) (g) (g) (％)對(duì)照組20ml/kg 22/16 19.75±1.48 26.56±3.93 2.07±1.06 -環(huán)磷酰胺20mg/kg 22/14 19.50±1.51 20.71±4.78 0.80±0.71 61.16**虎眼萬年青多糖50mg/kg 12/12 20.80±1.40 25.20±2.90 1.77±0.62 14.42100mg/kg 12/11 20.55±1.21 27.27±4.78 1.71±0.72 17.42200mg/kg 12/11 20.11±0.78 24.89±3.86 1.23±0.62 40.58**虎眼萬年青純化前多糖50mg/kg 12/11 20.80±1.40 26.20±2.90 1.84±0.46 11.08100mg/kg 12/12 20.58±1.16 27.00±5.13 1.64±0.96 20.78200mg/kg 12/12 20.58±1.16 27.08±3.92 1.60±0.86 22.54注與對(duì)照組比較**P＜0.01表1-3虎眼萬年青多糖對(duì)小鼠肝癌H22的生長抑制作用(x±s)組別 例數(shù)藥前體重 藥后體重 瘤重抑瘤率(藥前/藥后) (g) (g) (g) (％)對(duì)照組20ml/kg 18/14 18.12±0.86 26.21±3.04 2.20±1.58 -環(huán)磷酰胺20mg/kg 18/15 18.13±1.13 22.67±3.64 0.46±0.25 79.12***虎眼萬年青多糖50mg/kg 13/11 19.80±1.40 24.20±2.90 1.72±0.46 21.97100mg/kg 13/11 19.27±0.65 25.27±5.20 1.38±0.84 37.28200mg/kg 13/13 18.92±0.95 26.85±3.02 1.26±0.77 42.73*虎眼萬年青純化前多糖50mg/kg 13/11 18.80±1.40 26.20±2.90 1.80±0.66 18.09100mg/kg 13/12 18.53±0.79 26.83±2.66 1.66±0.86 24.88200mg/kg 13/12 18.58±0.79 26.67±1.92 1.11±0.56 49.42**注與對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.00權(quán)利要求
1.一種治療肝癌的虎眼萬年青多糖藥物，其特征在于虎眼萬年青多糖含有阿拉伯糖(arabinose)和半乳糖(galactose)成分，其主要組分是阿拉伯半乳糖蛋白。所述的虎眼萬年青多糖是用如下的方法提取的將虎眼萬年青藥材粉碎成粗顆粒，加水量分別為13mL/g生藥、10mL/g生藥及10mL/g生藥，加熱至沸騰，提取三次，每次2小時(shí)，濾液濃縮至相對(duì)密度1.03～1.05(80℃)，加乙醇至含醇量為20％，靜置24小時(shí)，抽濾，棄去沉淀，濾液繼續(xù)加乙醇至含醇量為70％，靜置24小時(shí)，抽濾，收取沉淀，沉淀以無水乙醇適量洗滌，干燥(50℃)，得虎眼萬年青多糖干粉提取物，其中虎眼萬年青多糖含量以葡萄糖計(jì)達(dá)50％～60％(W/W)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療肝癌的虎眼萬年青多糖藥物，其特征在于，所述的虎眼萬年青多糖的提取方法是在沉淀以無水乙醇適量洗滌，干燥(50℃)后，粉碎成80目細(xì)粉，得虎眼萬年青多糖干粉提取物，其中虎眼萬年青多糖含量以葡萄糖計(jì)達(dá)50％～60％(W/W)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療肝癌的虎眼萬年青多糖藥物，其特征在于，以虎眼萬年青多糖提取物為單一組分，以虎眼萬年青多糖為有效活性成分，可以制成膠囊劑型。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療肝癌的虎眼萬年青多糖藥物，其特征在于，以虎眼萬年青多糖提取物為單一組分，以虎眼萬年青多糖為有效活性成分，可以制成片劑劑型。
全文摘要
本發(fā)明涉及從虎眼萬年青中提取的治療肝癌的虎眼萬年青多糖藥物，其含有阿拉伯糖(arabinose)和半乳糖(galactose)成分，其主要組分是阿拉伯半乳糖蛋白。所述的虎眼萬年青多糖提取物是通過如下的方法提取的以虎眼萬年青為原料，采用水提醇沉方法使虎眼萬年青多糖含量以葡萄糖計(jì)達(dá)50％～60％(W/W)；以虎眼萬年青多糖為活性成分，不加任何輔料可以制成治療肝癌藥物，療效確切。吉林省長白山區(qū)野生和人工種植虎眼萬年青資源十分豐富。本發(fā)明的虎眼萬年青多糖，有豐富的原料來源。由于虎眼萬年青多糖所具有的明顯的抗輻射、提高機(jī)體免疫力和抗腫瘤的功效，可以用于制備有效治療肝癌的藥物，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1739548SQ20051001712
公開日2006年3月1日 申請日期2005年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月9日
發(fā)明者劉志強(qiáng), 宋鳳瑞, 王淑敏, 劉淑瑩, 石磊, 白進(jìn)發(fā) 申請人:中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所