專利名稱：人細胞纖連蛋白的外用藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人細胞纖連蛋白(Human Cellular Fibronectin)的外用藥物組合物及其制備方法。更具體地說，本發(fā)明涉及一種人細胞纖連蛋白和/或其片斷為活性成分，與外用基質(zhì)組成的組合物。本發(fā)明的外用藥物組合物局部使用治療各種皮膚損傷、創(chuàng)傷及潰瘍；燒燙傷、美容；用于癌癥切除手術(shù)后的傷面；治療角膜炎、宮頸炎等上皮損傷性疾病。
背景技術(shù)：
纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)是脊椎動物體內(nèi)的一類具有多種生物學功能的大分子糖蛋白。纖連蛋白主要有兩種類型，即血漿纖連蛋白(Plasm Fibronectin，pFN)和細胞纖連蛋白(Cellular Fibronectin，cFN)。兩類纖連蛋白的分布、分子結(jié)構(gòu)和生物學功能有明顯的不同。
血漿纖連蛋白是由兩條多肽鏈組成的二聚體，以可溶型存在于血漿、羊水、精液、腦脊液等體液中。細胞纖連蛋白由二聚體或多聚體組成，以不溶型的微纖維絲或無定形結(jié)構(gòu)存在于細胞表面、細胞外基質(zhì)或基底膜中。
血漿纖連蛋白的分子結(jié)構(gòu)中不含EDA、EDB的結(jié)構(gòu)域，其二聚體中只有一個亞基含有可變區(qū)IIICS。細胞纖連蛋的分子結(jié)構(gòu)中含有數(shù)量不同的EDA和/或EDB結(jié)構(gòu)域，其所有亞基都含有可變區(qū)IIICS。
血漿纖連蛋白具有調(diào)理素作用，化學趨動作用，參與止血過程，促進傷口愈合，與細胞的分化和腫瘤有關(guān)。細胞纖連蛋具有粘附能力，維持細胞正常結(jié)構(gòu)，參與細胞運動，促進細胞分裂，在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移以及創(chuàng)傷修復(fù)等病理生理過程中起重要作用。
目前，人們只是從動物血液如牛血或人血中提取獲得血漿纖連蛋白進行研究，特別是用于治療燒傷、創(chuàng)傷(Grinnel F.J cell Biol，1984；26107)、角膜炎、宮頸炎等(NishidaT，etal.Arch ophthalmol，1984，102455)疾病有顯著療效。還發(fā)現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移與纖連蛋白密切有關(guān)，有試驗表明纖連蛋白和/或片斷有明顯的抗癌作用(Yi M，Proc NatlAcad Sci USA；2001，98(2)620)。
但是，血漿纖連蛋白作為一種血液制品，它可能攜帶病毒或污染物，如牛血的瘋牛病病毒，人血的的乙肝、丙肝、梅毒、艾滋等。因此，用血漿纖連蛋白治療疾病有極大的不安全因素，同時也受到資源的局限。這成為血漿纖連蛋白難以廣泛使用的主要障礙。
從動物組織中提取細胞纖連蛋白更為困難。因此，長期以來細胞纖連蛋白的研究和應(yīng)用更難進行。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人們能夠通過分離人體細胞，并進行人工培養(yǎng)，經(jīng)提取、純化制備人細胞纖連蛋白。它不僅能大量制備，不受資源限制；而且更重要的是避免血源性傳染病的發(fā)生，并且應(yīng)用臨床有更好的同源性。
人細胞纖連蛋白作為一種活性蛋白在常溫下是不穩(wěn)定的，特別是在含水的介質(zhì)中更容易變性或降解，而使得其生物活性喪失。為了開展人細胞纖連蛋白的研究和應(yīng)用，特別是能夠滿足臨床有關(guān)適應(yīng)癥的應(yīng)用要求，非常需要一種適宜的劑型。這種劑型不僅要求穩(wěn)定性好、能長期貯藏、使用方便，而且能充分顯示出生物活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供人細胞纖連蛋白的外用劑型，適宜在臨床上用于治療各種皮膚損傷、創(chuàng)傷及潰瘍；燒燙傷、美容；用于癌癥切除手術(shù)后的傷面；治療角膜炎、宮頸炎等上皮損傷性疾病。
本發(fā)明人進行了大量的研究，篩選出外用劑型，制劑的配方和制備工藝，不僅滿足了上述適應(yīng)癥在治療中的應(yīng)用，而且穩(wěn)定性好、能長期貯藏、使用方便，并顯示出良好的療效。由此，完成了本發(fā)明。
本發(fā)明涉及一種外用藥物組合物，它包含人細胞纖連蛋白和/或其片斷作為活性成分與外用基質(zhì)組成的藥物組合物。
本發(fā)明的外用藥物組合物的形式包括溶液劑、噴霧劑、洗劑、搽劑、甘油劑、糊劑、霜劑、軟膏劑、凝膠劑、涂膜劑、膜劑。
在臨床上用于治療皮膚損傷、創(chuàng)傷、潰瘍、燒燙傷時配制成噴霧劑更為適宜，它不僅使人細胞纖連蛋白均勻分布在損傷區(qū)，而且對損傷區(qū)不會因摩擦涂抹造成物理刺激。噴霧劑型也適應(yīng)于外科手術(shù)切除癌癥組織后在傷口處使用，既有止血、促進傷口愈合的作用，又可抑制癌癥的術(shù)后復(fù)發(fā)。
本發(fā)明中的活性成分人細胞纖連蛋白，它包含人細胞纖連蛋白和/或其片斷。人細胞纖連蛋白為有2個或2個以上的多肽鏈組成的完整分子；人細胞纖連蛋白的片斷為完整分子的降解片斷，它包含有活性結(jié)構(gòu)域，同樣具有生物學功能。
本發(fā)明中的人細胞纖連蛋白和/或片斷是通過人細胞的培養(yǎng)、分離提取、精制獲得的。在組合物中的含量以制劑的總重計在0.001mg/g至10mg/g范圍內(nèi)，優(yōu)選的含量以制劑的總重計在0.1mg/g至2mg/g范圍內(nèi)。
本發(fā)明中的外用基質(zhì)包含水凝膠、緩沖劑、等滲劑、防腐劑和溶劑。
本發(fā)明中的水凝膠包含有聚羧乙烯(卡波姆)、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸樹脂、纖維素及其衍生物、帕洛沙姆。
本發(fā)明中的緩沖劑包含有磷酸鹽緩沖劑、醋酸鹽緩沖劑、Tris-HCL緩沖劑，在組合物中維持PH在4至9的范圍，優(yōu)選為6至8的范圍。
本發(fā)明中的等滲劑包含有氯化鈉。
本發(fā)明中的防腐劑包含有對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、青霉素、鏈霉素。
本發(fā)明中的溶劑包含有水、甘油、丙二醇、乙醇。
本發(fā)明中的所使用的各種水凝膠、緩沖劑、等滲劑、防腐劑和溶劑的用量，依據(jù)制備的劑型需要，按常規(guī)用量配制。
本發(fā)明外用藥物組合物的制備方法如下(1)制備人細胞纖連蛋白凍干粉劑將氯化鈉和緩沖劑溶解于適量的注射用水中，并與人細胞纖連蛋白和/或片斷溶液混合，然后分裝成每瓶含量為規(guī)定量的人細胞纖連蛋白，經(jīng)真空冷凍干燥制成無菌凍干粉劑。
(2)制備外用基質(zhì)將防腐劑和/或水凝膠用溶劑溶解或溶脹，分裝制成規(guī)定量的無菌溶液或半固體基質(zhì)。
(3)使用前的貯藏人細胞纖連蛋白凍干粉劑在低溫-10℃～-20℃下冷藏，有效期為2年。外用基質(zhì)在低溫-10℃～-20℃下或室溫貯藏，有效期為2年。
(4)使用的配制將人細胞纖連蛋白凍干粉劑與注射用水或外用基質(zhì)混合，配制成所需要的劑型。現(xiàn)用現(xiàn)配，或配制后在短期內(nèi)冷藏使用。
具體實施例方式
以下實施實例進一步說明本發(fā)明。但是，應(yīng)當理解本發(fā)明不以任何方式限于這些實例。
實施例1人細胞纖連蛋白凍干粉劑的制備人細胞纖連蛋白 0.1g氯化鈉 0.88g磷酸氫鈉 0.14g20％磷酸 適量注射用水 適量總量 100g將氯化鈉，磷酸氫鈉溶解于適量注射用水中，用20％磷酸調(diào)節(jié)溶液PH后，將其滅菌，并與人細胞纖連蛋白在注射用水中經(jīng)過濾和滅菌的溶液混合，得到100g溶液。然后分裝于滅菌的小瓶中，每瓶分裝1g，經(jīng)真空冷凍干燥成干粉，密封，即得人細胞纖連蛋白凍干粉劑。該凍干粉劑，每瓶中人細胞纖連蛋白的含量為1mg，在-10℃～-20℃的溫度冷藏保存，有效期為2年。
實施例2人細胞纖連蛋白凍干粉劑的使用配制將注射用水2ml注入含量為1mg的人細胞纖連蛋白凍干粉劑小瓶中，輕輕振搖使溶解，呈無肉眼可見不溶物的透明溶液，即得到濃度為0.5mg/ml的溶液劑。依據(jù)臨床需要將上述溶液的一定量噴霧或滴涂到使用部位。該溶液可一次性用完，也可在低溫下冷藏一個月內(nèi)使用。
實施例3液體基質(zhì)的制備卡波姆9400.08g氫氧化鈉 適量注射用水 適量總量 100g將卡波姆940加入適量的注射用水中，充分溶脹，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的PH后，分裝小瓶，每瓶2ml，密封，滅菌，即得液體基質(zhì)。液體基質(zhì)在室溫下貯藏，有效期為2年。
使用時將液體基質(zhì)2ml注入含量為1mg的人細胞纖連蛋白凍干粉劑小瓶中，輕輕振搖使溶解，呈無肉眼可見不溶物的透明溶液，即得到濃度為0.5mg/ml的溶液劑。依據(jù)臨床需要將上述溶液的一定量噴霧或滴涂到使用部位。該溶液可一次性用完，也可在低溫下冷藏一個月內(nèi)使用。
實施例4凝膠劑基質(zhì)的制備卡波姆940 1g丙二醇 20g對羥基苯甲酸甲酯0.2g三乙醇胺適量注射用水適量總量100g將對羥基苯甲酸甲酯溶解于適量的注射用水中，加入卡波姆940使充分溶脹，加入丙二醇，再攪拌下緩緩加入三乙醇胺并調(diào)節(jié)PH后，即得粘稠狀的凝膠劑基質(zhì)100g。然后分裝小瓶，每瓶4g，密封，滅菌。凝膠劑基質(zhì)在室溫下貯藏，有效期為2年。
使用時將凝膠劑基質(zhì)4g注入含量為1mg的人細胞纖連蛋白凍干粉劑小瓶中，輕輕振搖使溶解，即得到濃度為0.25mg/g的凝膠劑。依據(jù)臨床需要將上述凝膠劑的一定量涂抹到使用部位。該凝膠劑可一次性用完，也可在低溫下冷藏一個月內(nèi)使用。
實施例5涂膜劑基質(zhì)的制備聚乙烯吡咯烷酮 5.5g甘油5g對羥基苯甲酸甲酯0.2g注射用水適量總量100g將對羥基苯甲酸甲酯溶解于適量的注射用水中，加入聚乙烯吡咯烷酮使充分溶脹，加入甘油，即得涂膜劑基質(zhì)100g。然后分裝小瓶，每瓶5g，密封，滅菌。涂膜劑基質(zhì)在室溫下貯藏，有效期為2年。
使用時將涂膜劑基質(zhì)5g注入含量為1mg的人細胞纖連蛋白凍干粉劑小瓶中，輕輕振搖使溶解，即得到濃度為0.2mg/g的涂膜劑。依據(jù)臨床需要將上述涂膜劑的一定量涂抹到使用部位。該涂膜劑可一次性用完，也可在低溫下冷藏一個月內(nèi)使用。
實驗人細胞纖連蛋白對豚鼠傷口促愈合作用的研究取荷蘭種豚鼠40只，體重200～250g，雌雄各半，隨機分為2組，即試驗組20只，對照組20只。在動物腹部脫毛，用手術(shù)刀造成長5cm的傷口，用鑷子分開傷口，可見腹腔內(nèi)容物。試驗組動物的傷口用人細胞纖連蛋白溶液噴霧0.5ml(內(nèi)含人細胞纖連蛋白0.25mg)，常規(guī)縫合皮膚，紗布包扎傷口，連續(xù)3天噴霧給藥。對照組動物的傷口用無菌生理鹽水溶液噴霧0.5ml，其他操作與試驗組相同。連續(xù)15天觀察傷口部位的變化并判定療效。傷口10天內(nèi)愈合且不感染的為顯效；15天愈合且不感染的為有效；15天未愈合或傷口感染的為無效。結(jié)果如下表表 人細胞纖連蛋白對豚鼠傷口促愈合作用的試驗

試驗結(jié)果表明對照組的顯效率為25％，試驗組的顯效率為60％，兩組有明顯的統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。對照組總有效率為65％，試驗組的總有效率為95％，兩組有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。觀察感染情況，對照組有4只動物感染，試驗組無一感染。兩組愈合后傷口組織光學鏡檢結(jié)果表明對照組在新生上皮下，有一薄層的纖維組織排列紊亂，有大量炎性細胞(以中性白細胞為主)和少量的巨噬細胞；試驗組在新生上皮下，有較厚層的纖維組織，平行排列，毛細血管豐富，有大量炎性細胞，巨噬細胞較多等。統(tǒng)計傷口愈合時間，試驗組為9.85±3.12天，對照組為12.85±3.71天。
結(jié)果證實本發(fā)明藥物組合物外用手術(shù)傷口，具有明顯的促進傷口愈合，減少感染，抑制病變的療效。試驗中未見任何不良反應(yīng)發(fā)生。
權(quán)利要求
1.一種外用藥物組合物，其特征在于所述的外用藥物組合物包含以人細胞纖連蛋白和/或片斷為活性成分和外用基質(zhì)組成。
2.按照權(quán)利要求1所述的外用藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物形式包括溶液劑、噴霧劑、洗劑、搽劑、甘油劑、糊劑、霜劑、軟膏劑、凝膠劑、涂膜劑、膜劑。
3.按照權(quán)利要求1和2所述的外用藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物形式為噴霧劑。
4.按照權(quán)利要求1所述的外用藥物組合物，其特征在于所述的外用藥物組合物的活性成分人細胞纖連蛋白和/或片斷是通過人細胞培養(yǎng)的方法，經(jīng)提取、精制獲得的。
5.按照權(quán)利要求1所述的外用藥物組合物，其特征在于所述的外用組合的活性成分人細胞纖連蛋白和/或片斷的含量以制劑的總重計在0.001mg/g至10mg/g范圍內(nèi)。
6.按照權(quán)利要求1和5所述的外用藥物組合物，其特征在于所述的外用組合的活性成分人細胞纖連蛋白和/或片斷的含量以制劑的總重計在0.1mg/g至2mg/g范圍內(nèi)。
7.按照權(quán)利要求1所述的外用藥物組合物，其特征在于所述的外用基質(zhì)包含水凝膠、緩沖劑、等滲劑、防腐劑和溶劑。
8.按照權(quán)利要求1所述的外用藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物分別以兩種形式長期貯藏，即含有人細胞纖連蛋白的凍干粉劑和基質(zhì)。
9.按照權(quán)利要求1和8所述的外用藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物分別以兩種形式長期貯藏，使用時將人細胞纖連蛋白凍干粉劑和注射用水或基質(zhì)混合，現(xiàn)用現(xiàn)配，或配制后短期冷藏使用。
全文摘要
本發(fā)明外用藥物組合物，是以細胞培養(yǎng)方法制備的人細胞纖連蛋白和/或片斷為活性成分，與外用基質(zhì)配制成的。本發(fā)明的外用藥物組合物局部使用治療各種皮膚損傷、創(chuàng)傷及潰瘍；燒燙傷、美容；用于癌癥切除手術(shù)后的傷面；治療角膜炎、宮頸炎等上皮損傷性疾病。
文檔編號A61P17/00GK1762488SQ200510018079
公開日2006年4月26日 申請日期2005年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月8日
發(fā)明者張怡, 于 玲, 陳小蘭, 金城, 張若飛 申請人:張怡