專利名稱：一種調(diào)控藥物釋放速度的載體及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高分子材料學(xué)領(lǐng)域，更具體涉及一種調(diào)控藥物釋放速度的載體，同時(shí)還涉及該藥物載體的制備方法，該共混聚合物可作為抗菌藥物(如氧氟沙星或利福平或慶大霉素)或抗腫瘤藥物(如氨甲喋啉)的控釋載體用于臨床骨科，以防治不同疾病的需要。
背景技術(shù)：
急性血源性骨髓炎、開放性骨折感染所致的骨髓炎都是臨床常見、多發(fā)病，治療措施不當(dāng)或治療難以奏效時(shí)炎癥會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)槁浴Ｒ坏┭葑優(yōu)槁怨撬柩?，全身?yīng)用抗生素往往難以在局部形成有效抗菌濃度，且長時(shí)間靜脈用藥還會(huì)增加抗生素的全身毒副作用。因此抗生素局部緩釋或控釋技術(shù)的發(fā)展可提高局部治療療效和減少全身不良反應(yīng)，為骨髓炎的抗生素治療開辟了新的、有效的方法，并帶來全新的思維理念。
1980年Klemm首次研制并將慶大霉素骨水泥PMMA珠鏈成功應(yīng)用于骨感染。雖然慶大霉素PMMA珠鏈作為經(jīng)典的骨髓炎局部治療方法一直在沿用，但其亦有明顯的缺點(diǎn)，藥物釋放完后需二次手術(shù)拔鏈，否則將被纖維組織包裹，細(xì)菌易在其表面或內(nèi)部滋生。為解決這一矛盾，人們研究和開發(fā)了一系列生物可降解材料來作為抗生素局部釋放的載體。聚乳酸(poly-D，L-lactide，PLA)就是其中研究和應(yīng)用的非常成熟的一個(gè)突出代表。近年來，另一類新的生物可降解高分子材料聚酸酐(polyanhydride)問世，并日益受到重視，該類材料具有生物相容性好、降解時(shí)以表面溶蝕為特征、呈現(xiàn)勻速降解釋放的特點(diǎn)，已成為藥物控釋領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)。目前，聚[1，3-雙(對(duì)羧基苯氧基)丙烷-癸二酸]和聚乳酸/聚羥基乙酸是美國FDA認(rèn)可的僅有的兩種藥物控釋材料。
1993年Laurencin率先研究了含10％慶大霉素的聚[1，3-雙(對(duì)羧基苯氧基)丙烷-癸二酸]對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性骨髓炎的治療作用，實(shí)驗(yàn)表明在聚酸酐的載藥量、藥物釋放動(dòng)力學(xué)和聚酸酐載體降解動(dòng)力學(xué)方面還應(yīng)該有更多可改進(jìn)之處(Laurencin CT，Gerhart T，Witschger P，et al.Bioerodible polyanhydrides for antibiotic drug deliveryin vivoosteomyelitis treatment in a rat model[J].J Orthop Res.1993；11(2)256-62)。Nelson采用聚(脂肪二聚酸—癸二酸)[P(FAD-SA)]，分別裝載20％和10％的慶大霉素，做成直徑4mm、長12mm的棒狀顆粒進(jìn)行體內(nèi)藥物釋放及骨髓炎治療，均有較好效果(Nelson CL，Hickmon SG，Skinner RA，et al.Treatment of experimental osteomyelitis by surgicaldebridement and the implantation of bioerodable，polyanhydride-gentamicin beads[J].JOrthop Res.1997；15(2)249-55)。Li等研究了含慶大霉素的聚(芥酸二聚體—癸二酸)的規(guī)模合成、體外釋放、動(dòng)物體內(nèi)釋放和人體內(nèi)釋放。該制劑中芥酸二聚體與癸二酸比例為1∶1，重150mg，其中含硫酸慶大霉素20mg。在體內(nèi)藥物釋放、骨髓炎模型治療和臨床應(yīng)用中，與全身用藥相比，可提高局部藥物濃度達(dá)一個(gè)數(shù)量級(jí)，可減少全身毒副作用和提高治療效果(Li LC，Deng J，Stephens D.Polyanhydride implant for antibioticdelivery--from the bench to the clinic[J].Adv Drug Deliv Rev.200216；54(7)963-86)。90年代中期，國內(nèi)從事高分子材料研究的學(xué)者也開始了對(duì)聚酸酐控釋性能的研究，并且合成了一系列新型聚酸酐，并用于藥物控制釋放，如含磷聚酸酐(傅杰，卓仁禧，范昌烈.含磷聚酸酐藥物控制釋放材料的研究.高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào).1997；18813)、聚酯酸酐(傅杰，卓仁禧，范昌烈.聚酯酸酐的合成及其藥物釋放性能研究.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào).1998；19813.)和聚(二聚酸-癸二酸)(周志彬，黃開勛，張治國等.慶大霉素-聚酸酐緩釋制劑的制備及釋藥性能.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào).2001；29112)等。但這些工作缺乏相應(yīng)體內(nèi)研究的支持。
目前國內(nèi)外技術(shù)發(fā)展趨勢及存在問題主要有三(1)同一高分子聚合物材料，可通過改變其分子結(jié)構(gòu)上的親、疏水基團(tuán)來改變釋藥時(shí)間。但要做到隨意調(diào)節(jié)釋藥時(shí)間尚難以達(dá)到。(2)相同種類的高分子聚合物材料，可通過以不同比例將兩種同類的單體“共聚”來達(dá)到調(diào)節(jié)釋放時(shí)間的目的。如將脂肪聚酯類的聚乳酸和聚乙烯酸共聚，通過調(diào)節(jié)兩相的比例來調(diào)節(jié)材料的水解時(shí)間。又如將疏水芳香族聚酸酐單體和親水脂肪族聚酸酐單體共聚形成共聚酸酐來調(diào)節(jié)釋放時(shí)間。但前者可能在局部誘發(fā)無菌性炎癥，后者制作工藝復(fù)雜，要求苛刻，條件難以控制。(3)有學(xué)者提出將不同種類的已知生物相容性好的高分子材料共混，通過改變共混比例來達(dá)到調(diào)節(jié)釋藥時(shí)間的目的。但幾無實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道。
基于上述(3)，本發(fā)明將聚乳酸和脂肪族聚酸酐—聚癸二酸酐共混作為藥物釋放載體，籍此結(jié)合兩類材料的釋藥優(yōu)點(diǎn)，并通過調(diào)整兩類材料的不同比例以方便地調(diào)節(jié)釋藥時(shí)間，可滿足臨床治療和預(yù)防多種疾病的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種調(diào)控藥物釋放速度的載體，可作為抗菌藥物或抗腫瘤藥物的控釋載體，用于臨床骨科疾病的防治。該藥物載體具有調(diào)節(jié)釋藥時(shí)間、長效、安全的特點(diǎn)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種藥物控釋載體的制備方法，其方法簡便，操作容易，藥物分布均勻，易于形成。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施提供一類調(diào)控釋藥速度的藥物載體，該類藥物載體包括a)聚乳酸；b)聚癸二酸酐。其特征是將聚癸二酸酐與聚乳酸以5～90∶10～95％的比例共混，該藥物載體可有效的調(diào)節(jié)和控制所裝載藥物(如抗菌藥物或抗腫瘤藥物)的釋放時(shí)間。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，選擇了能同時(shí)溶解聚癸二酸酐和聚乳酸且能快速揮發(fā)的四氫呋喃作為溶劑來溶解兩聚合物，將裝載藥物粉末(如氧氟沙星或利福平或慶大霉素)混懸于含聚癸二酸酐、聚乳酸的四氫呋喃溶液中不斷研磨、攪拌，隨著四氫呋喃的快速揮發(fā)，得到了膜狀的、較為均勻的三者共混材料。隨后，再利用聚乳酸在加熱狀態(tài)下的粘結(jié)性，于加壓狀態(tài)下壓制成所需狀態(tài)和大小的緩釋藥片。本發(fā)明具體步驟如下(1)將聚乳酸材料剪成面積約為3×3mm2大小的碎片后，稱取一定量聚乳酸材料置于5～6倍量w/v的四氫呋喃溶液中緩慢加熱直至完全溶解，溫度控制在85～95℃；再加入相應(yīng)重量的聚癸二酸酐，使之與聚乳酸溶液充分溶解。聚癸二酸酐與聚乳酸的比例為5～90∶10～95％。
(2)在攪拌、研磨過程中，逐漸加入藥物粉末(如氧氟沙星7～9∶1 w/w或利福平7～9∶1 w/w或慶大霉素13～15∶1 w/w)，使其均勻地分散于含兩聚合物的四氫呋喃溶液中，隨著四氫呋喃在20～25℃下的快速揮發(fā)，聚癸二酸酐、聚乳酸和藥物粉末共混物呈膜狀貼附于容器壁上，并逐漸干燥。
(3)將聚癸二酸酐、聚乳酸和藥物粉末共混物放入40～70℃烤箱中加熱4～5小時(shí)促使殘余的四氫呋喃揮發(fā)，將完全干燥的三者共混物從容器壁上刮下，并剪成面積為3×3mm2大小的碎片；(4)稱取一定量的聚癸二酸酐、聚乳酸和藥物粉末共混物加入預(yù)制的金屬模具中，將模具連同其中的共混物置烤箱中80～90℃加熱5～15分鐘；(5)取出模具置于壓片機(jī)中300kg壓力下壓模，取出模具放入乳膠手套中置自來水中冷卻，脫模。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，通過調(diào)節(jié)脂肪族聚酸酐—聚癸二酸酐與分子量較大的聚乳酸的不同共混比例5～90∶10～95％達(dá)到較容易地改變共混聚合物的降解，有效的調(diào)控裝載藥物在體內(nèi)外釋放時(shí)間的目的和療程。在本發(fā)明的具體方案中，調(diào)節(jié)聚癸二酸酐和聚乳酸的共混比例，可使氧氟沙星、利福平和慶大霉素的體外釋藥時(shí)間呈不同程度的延長，劑型穩(wěn)定，所釋放藥物具殺菌活力。且使氧氟沙星在骨中的維持時(shí)間延長，能有效的治療金黃色葡萄球菌所致的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物慢性骨髓炎。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果1、藥片制作技術(shù)簡單主要采用化學(xué)溶劑達(dá)到均勻物理共混的目的。
2、控釋的可調(diào)性通過調(diào)節(jié)共混聚合物兩組分的比例，以達(dá)到較容易地改變其降解、釋藥時(shí)間的目的，以滿足不同治療目的的需要。
3、長效性應(yīng)用時(shí)，給藥局部的藥物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其血藥濃度，且維持時(shí)間較長。
4、安全性高血濃度極低，全身毒性小。且聚癸二酸酐、聚乳酸生物相容性好。


圖1為聚癸二酸酐/聚乳酸共混氧氟沙星控釋植入藥片。
圖2為聚癸二酸酐、聚乳酸共混氧氟沙星控釋藥片的體外抑菌試驗(yàn)。
其中A.金黃色葡萄球菌；B.大腸埃希氏菌；C.銅綠假單胞菌圖3為聚癸二酸酐、聚乳酸共混氧氟沙星控釋藥片在體外抑菌試驗(yàn)第89天時(shí)的抑菌圈。
其中A.金黃色葡萄球菌；B.大腸埃希氏菌；C.銅綠假單胞菌；D.對(duì)照共混材料。
圖4為植入藥片6周后的X線片檢查。
其中A.給藥組未顯示慢性骨髓炎征象；B.對(duì)照組呈現(xiàn)軟組織膿腫和慢性骨髓炎改變圖5為植入藥片6周后的組織學(xué)檢查。
其中A.給藥組髓腔內(nèi)釋放材料顆粒被薄層纖維組織包裹(HE，100×)；B.對(duì)照組髓腔內(nèi)大片液化、壞死組織—膿液(HE，100×)；C.對(duì)照組髓腔內(nèi)死骨和液化、壞死組織(HE，100×)；D.對(duì)照組髓腔內(nèi)壞死組織中大量革蘭氏陽性球菌(結(jié)晶紫熒光桃紅革蘭法，1000×)
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例子，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
實(shí)施例1 溶劑混懸揮發(fā)法制備聚癸二酸酐、聚乳酸共混藥物控釋藥片已知高分子材料控釋藥片的制備方法主要有熔解分散法和溶劑揮發(fā)法兩種(高波，魯格，蘇同芳.植入顱內(nèi)治療腦瘤的的生物可降解藥物控釋體系.藥學(xué)進(jìn)展.2000；24274)。熔解分散法系將聚合物加熱至熔點(diǎn)使其呈現(xiàn)熔融狀態(tài)，按所需載藥比例加入固體粉末狀藥物并充分?jǐn)嚢杈鶆?，再倒入預(yù)熱的模具中，室溫下冷卻后加工成所需的大小和形狀。溶劑揮發(fā)法是將高分子材料和裝載藥物溶解于某一共溶的溶劑中，低溫下傾于模具，待溶劑揮發(fā)完后再進(jìn)一步加工或?qū)⑷芙庖航?jīng)噴霧干燥形成顆粒極小的固體微粒，再在高壓下于模具中加工成所需要的形狀和大小。熔解分散法要求裝載的藥物必須具備熱穩(wěn)定性，否則藥物易遭受分解、破壞，而熔點(diǎn)過高的聚合物也會(huì)給實(shí)際操作、制備帶來困難。應(yīng)用溶劑揮發(fā)法的前提是高分子聚合物和藥物必須能同時(shí)溶解于某一可揮發(fā)的化學(xué)溶劑。
本發(fā)明采用的是兩種不同的聚合物載體—聚癸二酸酐和聚乳酸，但在熔融狀態(tài)時(shí)聚乳酸為粘度較大的粘流態(tài)，聚癸二酸酐則呈現(xiàn)流動(dòng)性好的液態(tài)，由于性狀上的差異，兩者明顯分相，無法混合?；瘜W(xué)溶劑N甲基吡咯烷酮雖然能將聚癸二酸酐、聚乳酸和氧氟沙星三者完全溶解，但在溶劑緩慢揮發(fā)過程中由于溶解度的差異較大，聚癸二酸酐先從溶劑中析出而與仍處于溶解狀態(tài)的聚乳酸分相，也無法達(dá)到均勻混合的目的。鑒于上述問題，本發(fā)明選擇了能同時(shí)溶解聚癸二酸酐和聚乳酸且能快速揮發(fā)的四氫呋喃作為溶劑來溶解兩聚合物，再將藥物(如氧氟沙星)粉末混懸于聚癸二酸酐、聚乳酸的四氫呋喃溶液中不斷研磨、攪拌，隨著四氫呋喃的快速揮發(fā)，得到膜狀的、較為均勻的共混材料。隨后，再利用聚乳酸在加熱狀態(tài)下的粘結(jié)性，于加壓狀態(tài)下制備了實(shí)驗(yàn)所需要的控釋植入藥片。
一類調(diào)控釋藥速度的藥物載體配比為將聚癸二酸酐與聚乳酸以5∶95或10∶90或15∶85或20∶80或25∶75或30∶70或40∶60或50∶50或60∶40或70∶30或80∶10或90∶10％混合均勻后，然后將上述混合均勻的混合物與裝載藥物以氧氟沙星7～9∶1 w/w或利福平7～9∶1 w/w或慶大霉素13～15∶1 w/w混合，再壓制而成。
以下以氧氟沙星為例，其具體制備步驟如下(1)將聚乳酸材料剪成面積約為3×3mm2大小的碎片后，稱取一定量的聚乳酸材料置于5～6倍量w/v的四氫呋喃溶液中緩慢加熱直至完全溶解，溫度控制在85～95℃；再加入相應(yīng)重量的聚癸二酸酐，使之與聚乳酸溶液充分溶解。
(2)在攪拌、研磨過程中，逐漸加入相應(yīng)重量的氧氟沙星粉末，使其均勻地分散于含兩聚合物的四氫呋喃溶液中，聚癸二酸酐、聚乳酸混合物與氧氟沙星粉末的比例為7～9∶1 w/w。隨著四氫呋喃在20～25℃下的快速揮發(fā)，聚癸二酸酐、聚乳酸和氧氟沙星共混物呈膜狀貼附于容器壁上，并逐漸干燥。
(3)將聚癸二酸酐、聚乳酸和氧氟沙星共混物放入40～70℃烤箱中加熱4～5小時(shí)促使殘余的四氫呋喃揮發(fā)，將完全干燥的三者共混物從容器壁上刮下，并剪成面積為3×3mm2大小的碎片。
(4)稱取聚癸二酸酐、聚乳酸和氧氟沙星共混物120mg，加入預(yù)制的金屬模具中，將模具連同其中的共混物置烤箱中80～90℃加熱5～15分鐘。
(5)取出模具置于壓片機(jī)中300kg壓力下壓模，取出模具放入乳膠手套中置自來水中冷卻，脫模后即制成直徑為6mm、厚為3.4mm的聚癸二酸酐、聚乳酸共混氧氟沙星藥片(見圖1)。
(6)塑料袋封裝藥片，60Co 25KGy消毒。
從理論上分析，該法制備的共混藥片其藥物分布雖不及溶劑揮發(fā)法均勻，但也應(yīng)和熔融分散法相當(dāng)或與其接近。從本發(fā)明各比例共混藥片體外釋藥和體內(nèi)釋藥結(jié)果證實(shí)，同比例藥片在相同時(shí)間點(diǎn)的釋藥結(jié)果非常接近(標(biāo)準(zhǔn)差極小)，所裝載的藥物(氧氟沙星)在共混聚合物的基質(zhì)中能均勻分布。
實(shí)施例2 聚癸二酸酐、聚乳酸共混氧氟沙星控釋藥片的體外釋藥實(shí)驗(yàn)取樣取聚癸二酸酐和聚乳酸比例分別為5∶95或10∶90或15∶85或20∶80或25∶75或30∶70或40∶60或60∶40或80∶20％的氧氟沙星藥片各3枚，分別置于試管中，各加入0.1M磷酸緩沖液(pH7.4)10ml，37℃恒溫水浴。分別于實(shí)驗(yàn)開始后第2小時(shí)、5小時(shí)、10小時(shí)更換緩沖液；實(shí)驗(yàn)第1～14天每天更換一次緩沖液，之后第15～28天每2天更換一次緩沖液；第29～58天每3天更換一次緩沖液；再后每7天更換一次緩沖液，直至釋放后3月。取出液離心后取上清液試管封裝，-20℃保存待測。
標(biāo)準(zhǔn)曲線制作準(zhǔn)確稱取氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品，分別配制成濃度為1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，-20℃冷凍保存。檢測時(shí)，分別于每管標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸取0.1ml，加入醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.0)1.0ml混勻，在熒光分光光度計(jì)上檢測OD293值，并計(jì)算回歸方程和制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
樣本檢測將所有樣本用醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.0)進(jìn)行不同程度的稀釋，然后于每管稀釋液中移取0.1ml，加入醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.0)1.0ml，記錄各樣本OD293值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算各樣本釋放量、累積釋放量和累積釋放百分率(％)。
結(jié)果表明(表1)，各組藥片在釋放的第1天均呈現(xiàn)出不同程度的“突釋”效應(yīng)，聚癸二酸酐和聚乳酸比例為5∶95的藥片第1天釋藥量最小，其釋藥量為所載藥量的3.4％；10∶90比例的共混藥片釋藥量為裝載量的6.8％，略高于前者；15∶85或20∶80或25∶75或30∶70或40∶60或60∶40或80∶20％比例的共混藥片第1天釋放量分別為14.8％、32.1％、36.8％、38.1％、39.1％、41.5％和44.2％。說明共混聚合物的“突釋”效應(yīng)隨著聚癸二酸酐含量增大而變得越明顯，這主要與聚癸二酸酐降解速率較快和氧氟沙星從聚癸二酸酐中向緩沖液的溶解、擴(kuò)散較快有關(guān)。
結(jié)果還表明(表2)，聚乳酸在共混聚合物中所占比例越大，其釋藥時(shí)間就越長。聚癸二酸酐和聚乳酸比例為95∶5的藥片其有效釋藥時(shí)間(＞2μg/ml，Katzung BG.Basic &Clinical Pharmacology.8thedition.BeijingPeople’s Hygiene Publishing House，2001，797)長達(dá)68天；而比例為10∶90或15∶85或20∶80或25∶75或30∶70或40∶60或60∶40或80∶20藥片中氧氟沙星的的有效釋藥時(shí)間分別為49天、36天、18天、15天、13天、12天、12天和12天。
各組藥片氧氟沙星累積釋藥率、“突釋”效應(yīng)及有效釋藥時(shí)間等結(jié)果見表1和表2。
表1 聚癸二酸酐和聚乳酸不同比例對(duì)所載氧氟沙星累積釋藥率的影響.

表2 聚癸二酸酐和聚乳酸不同比例對(duì)氧氟沙星“突釋”效應(yīng)及有效釋放時(shí)間的影響.

實(shí)施例3 聚癸二酸酐、聚乳酸共混氧氟沙星緩釋藥片的體外抑菌實(shí)驗(yàn)取聚癸二酸酐、聚乳酸共混氧氟沙星緩釋藥片9片，每3片為一組，分別置于接種有金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的瓊脂糖培養(yǎng)基中央(一個(gè)培養(yǎng)皿中只放置一片)，37℃培養(yǎng)24小時(shí)后測量其抑菌圈大小。然后將藥片轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基中每3天測量一次抑菌圈、更換新的培養(yǎng)基，如此重復(fù)至實(shí)驗(yàn)后2月，以后每一周更換一次新的培養(yǎng)基至實(shí)驗(yàn)后3月。另取不含氧氟沙星且同樣大小、形狀及共混比例的聚癸二酸酐、聚乳酸共混物藥片置于上述菌種培養(yǎng)基中作對(duì)照。
結(jié)果表明，聚癸二酸酐、聚乳酸共混氧氟沙星緩釋藥片的各菌抑菌圈最大值都出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)的第一天。在體外抑菌實(shí)驗(yàn)的89天時(shí)間內(nèi)，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的平均抑菌圈直徑分別為31.8±2.3mm(28～40mm)，37.4±1.9mm(34～45mm)和21.2±3.7mm(15～35mm)(見圖2)，而不含氧氟沙星的對(duì)照藥片對(duì)上述各菌種均未形成抑菌圈。聚癸二酸酐、聚乳酸共混氧氟沙星緩釋藥片在體外抑菌試驗(yàn)第89天時(shí)的抑菌圈見圖3。
實(shí)施例4 聚癸二酸酐、聚乳酸共混氧氟沙星緩釋藥片的體內(nèi)釋藥實(shí)驗(yàn)取樣取大白兔20只，雄性、雌性各10只，體重1.8～2.5kg。3％戊巴比妥鈉30mg/kg經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉，手術(shù)區(qū)域去毛，活力碘消毒，鋪無菌巾。取小腿近端內(nèi)側(cè)縱切口長3cm，顯露脛骨近端內(nèi)側(cè)面并注意避免損傷膝關(guān)節(jié)囊，在髕韌帶與“鵝足”之間略偏后、脛骨結(jié)節(jié)水平以上3mm左右造成一8mm×4mm的骨缺損區(qū)，骨缺損長軸與脛骨縱軸一致。在骨缺損區(qū)植入聚癸二酸酐、聚乳酸共混氧氟沙星緩釋藥片各一片，縫合關(guān)閉傷口各層。術(shù)畢傷口涂擦活力碘。麻醉清醒后分籠飼養(yǎng)。分別于術(shù)后3天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周各取兩只動(dòng)物耳緣靜脈血1.0ml，置肝素化EP管中抗凝，然后處死動(dòng)物。以骨缺損為中心取脛骨近段2cm，去處附著于骨標(biāo)本上的肌肉、骨膜、韌帶等軟組織和關(guān)節(jié)面軟骨，取出骨缺損區(qū)內(nèi)藥片的殘留物。血標(biāo)本9000轉(zhuǎn)/分低速離心5分鐘，吸取血漿(上清液)，-20℃保存待測。骨標(biāo)本用無菌紗布拭干，錫紙包裝-80℃保存，檢測前置冷凍干燥機(jī)中真空凍干48小時(shí)，取出后在研缽中用咬骨鉗咬成碎塊，再充分研碎、拌勻，精確稱取標(biāo)本重量，按一定比例加入25％冰醋酸(3ml/g)，浸泡24小時(shí)后，離心后取上清液。
標(biāo)準(zhǔn)曲線制作配制一組不同濃度的氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml、25.0μg/ml、50.0μg/ml)備用。將各標(biāo)準(zhǔn)溶液取0.01ml分別加入空白血漿或骨空白樣本上清液0.1ml，加入10％三氯醋酸0.19ml，立刻搖勻，3000rpm離心10min，取上清0.2ml加入醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.0)1.8ml，以激發(fā)波長293nm、發(fā)射波長498nm測定熒光強(qiáng)度。以濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程和制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
樣本檢測于每管血漿或骨樣本上清液中準(zhǔn)確移取0.1ml，加生理鹽水0.01ml，加入10％三氯醋酸0.19ml，立刻混勻，3000rpm離心10min，取上清0.2ml加入醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.0)1.8ml，以激發(fā)波長293nm、發(fā)射波長498nm測定熒光強(qiáng)度，然后換算成氧氟沙星濃度。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，釋藥前4周藥片在骨孔內(nèi)保持形態(tài)完整，但4周時(shí)藥片量明顯減少，為原藥片大小的1/2～2/3，藥片質(zhì)地易碎。釋藥第5周藥片碎裂成位于中央的小塊及周圍的細(xì)小顆粒狀。第6～8周，骨孔內(nèi)僅可見藥片的沙粒狀殘留物分布于脛骨近端的髓腔內(nèi)。體內(nèi)釋藥結(jié)果如表3。實(shí)驗(yàn)第3天、第1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周氧氟沙星在骨組織中的平均藥物濃度為20.1±10.3μg/g；而平均血濃度為0.036±0.019μg/ml，平均骨/血濃度比為863倍。釋藥第8周時(shí)，氧氟沙星在骨組織中的濃度仍遠(yuǎn)高于2μg/ml的有效殺菌濃度。氧氟沙星在骨組織中的釋放存在“突釋”效應(yīng)。
表3 聚癸二酸酐、聚乳酸共混氧氟沙星緩釋藥片中氧氟沙星在骨和血中的濃度.

實(shí)施例5 聚癸二酸酐、聚乳酸共混氧氟沙星緩釋藥片的體內(nèi)抗骨感染實(shí)驗(yàn)骨髓炎模型制備取大白兔22只，雌雄不拘，雄性8只，雌性14只，體重1.8～2.3kg。3％戊巴比妥鈉30mg/kg經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉，手術(shù)區(qū)域去毛，活力碘消毒，鋪無菌巾。取小腿近端內(nèi)側(cè)縱切口長3m，顯露脛骨近端內(nèi)側(cè)面、保護(hù)膝關(guān)節(jié)囊，在髕韌帶與“鵝足”之間略偏后、脛骨結(jié)節(jié)水平以上約3mm造成一8mm×4mm、長軸與脛骨縱軸一致的骨缺損區(qū)。在缺損區(qū)內(nèi)各注入1×108cfu/ml濃度的金黃色葡萄球菌菌液60μl，并置入一段長4cm的7號(hào)絲線作為異物，關(guān)閉傷口各層。
術(shù)后4周，所有動(dòng)物局部均可捫及腫脹或隆起，皮溫略高，但均無竇道形成。手術(shù)切開病灶部位部分動(dòng)物在軟組織中形成明顯膿腫，可見黃白色粘稠膿液。所有接種的脛骨近段髓腔內(nèi)均可見多量炎性肉芽組織。X線片檢查見有接種動(dòng)物脛骨近段X線正、側(cè)位片均顯示不同程度軟組織腫脹影，骨鉆孔接種部位下方多可見增生性骨膜反應(yīng)，髓腔內(nèi)骨質(zhì)密度高低不均，骨密度明顯增高和降低部位緊密相鄰，部分可見死骨形成。取髓腔內(nèi)肉芽組織培養(yǎng)，所有標(biāo)本均培養(yǎng)出金黃色葡萄球菌。
抗骨感染實(shí)驗(yàn)將骨髓炎模型動(dòng)物分為二組給藥組和對(duì)照組，3％戊巴比妥鈉30mg/kg經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉。給藥組12只動(dòng)物先行骨髓炎病灶清除術(shù)，包括清除異物、死骨，刮除髓腔內(nèi)的炎性肉芽組織，病灶沖洗等，然后于髓腔內(nèi)分別各植入聚癸二酸酐、聚乳酸共混氧氟沙星緩釋藥片一片；對(duì)照組8只動(dòng)物的病灶經(jīng)病灶清除術(shù)后則植入不含氧氟沙星且同樣大小、形狀的聚癸二酸酐、聚乳酸共混物藥片一片。關(guān)閉傷口。術(shù)后觀察傷口皮溫、有無紅腫、竇道形成等情況；術(shù)后6周處死動(dòng)物，先行肉眼觀察炎癥征象，攝X片，再取病灶區(qū)組織作細(xì)菌培養(yǎng)，取脛骨近端10％福爾馬林固定，脫鈣后石蠟包埋、切片，分別用HE和結(jié)晶紫熒光桃紅革蘭法染色后光鏡觀察。
實(shí)驗(yàn)中給藥組和對(duì)照組因腹瀉死亡動(dòng)物各1只，最終給藥組存活10只，對(duì)照組7只。各項(xiàng)檢查結(jié)果如下1.肉眼觀察給藥組在觀察的6周時(shí)間內(nèi)，局部皮溫與對(duì)側(cè)肢體相比無明顯增高，無軟組織膿腫和竇道形成。6周時(shí)取材所有10只動(dòng)物軟組織和髓腔內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)膿腫或膿液。對(duì)照組術(shù)后2周左右所有動(dòng)物局部皮溫開始明顯增高，7只動(dòng)物中有6只動(dòng)物漸出現(xiàn)軟組織腫脹、波動(dòng)，但均未在局部形成竇道。6周時(shí)取材，6只動(dòng)物局部發(fā)現(xiàn)明顯軟組織膿腫及黃色、粘稠膿液。所有7只動(dòng)物髓腔內(nèi)均發(fā)現(xiàn)黃色、粘稠膿液。
2.X線片檢查給藥組術(shù)后6周，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)側(cè)脛骨近段X線正、側(cè)位片均未顯示軟組織腫脹影，脛骨近端骨密度均勻，無骨膜反應(yīng)。側(cè)位片仍可見手術(shù)所致的骨缺損區(qū)。各片均未顯示慢性骨髓炎征象(圖4A)。對(duì)照組術(shù)后6周，7例X片中6例顯示較大軟組織膿腫影。7只動(dòng)物的手術(shù)側(cè)脛骨近段均顯示出慢性骨髓炎的征象炎性增生性骨膜反應(yīng)、死骨形成、溶解性骨破壞、某些區(qū)域骨密度增高等(圖4B)。
3.細(xì)菌培養(yǎng)給藥組細(xì)菌培養(yǎng)均無細(xì)菌生長，對(duì)照組各動(dòng)物送檢標(biāo)本均培養(yǎng)出與置入細(xì)菌相同的金黃色葡萄球菌。
4.組織學(xué)檢查給藥組(圖5A)骨髓腔內(nèi)可見少數(shù)微小灶性組織壞死及少量炎性細(xì)胞。有纖維骨痂及骨性骨痂生長。骨髓腔內(nèi)藥物釋放材料的顆粒被薄層纖維組織包裹。對(duì)照組(圖5B、5C)骨髓腔內(nèi)可見大片組織壞死、液化區(qū)(膿液)，其間分布有多量變性、壞死的中性粒細(xì)胞和其它白細(xì)胞，可見死骨形成及纖維骨痂和骨性骨痂生長。釋放材料的顆粒被薄層纖維組織包裹。對(duì)照組各送檢標(biāo)本中均可見多量深染的革蘭氏陽性球菌—金黃色葡萄球菌(圖5D)。
實(shí)施例6 聚癸二酸酐、聚乳酸共混利福平緩釋藥片的的體外釋藥實(shí)驗(yàn)取樣取聚癸二酸酐和聚乳酸比例分別為10∶90或15∶85或20∶80％的藥片(含利福平15mg)各3枚，分別置于試管中，各加入0.1M磷酸緩沖液(pH7.4)10ml，37℃恒溫水浴。于實(shí)驗(yàn)開始后24時(shí)更換緩沖液；之后在實(shí)驗(yàn)第1～14天每2天更換一次緩沖液，第15～28天每3天更換一次緩沖液；第29～58天每7天更換一次緩沖液；直至釋放后2月。取出液離心后取上清液試管封裝，-20℃保存待測。
檢測采用高效液相色譜方法(劉榮、張顯杰、王仲元等.HPLC測定人血清中利福平的濃度.華西藥學(xué)雜志，2003；18(6)446)測定取出液的藥物濃度，方法是將取出液用甲醇稀釋成不同濃度，取20μl進(jìn)樣，另取用甲醇配制的相應(yīng)濃度的利福平標(biāo)準(zhǔn)品直接進(jìn)樣。用標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程求得各取出液中利福平濃度，并計(jì)算各樣本釋放量、累積釋放量和累積釋放百分率(％)。
結(jié)果表明(表4)，各組藥片在釋放的第1天均呈現(xiàn)出不同程度的“突釋”效應(yīng)，聚癸二酸酐和聚乳酸比例為10∶90、15∶85和20∶80的共混藥片第1天釋放量分別為5.8％、12.8％和29.2％；其有效釋藥時(shí)間(＞0.05μg/ml，Carl W，Shaffer M.Treatment ofexperimental chronic osteomyelitis due to staphylococcus aureus with vancomycin andrefampin.J Infection Diseases.1983；147352)分別為56天、43天和26天。
表4 聚癸二酸酐和聚乳酸不同比例對(duì)利福平“突釋”效應(yīng)及有效釋放時(shí)間的影響.

實(shí)施例7 聚癸二酸酐、聚乳酸共混利福平緩釋藥片的體外抑菌實(shí)驗(yàn)取聚癸二酸酐、聚乳酸共混利福平緩釋藥片3片，置于接種有金黃色葡萄球菌的瓊脂糖培養(yǎng)基中央(一個(gè)培養(yǎng)皿中只放置一片)，37℃培養(yǎng)24小時(shí)后測量其抑菌圈大小。然后將藥片轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基中每3天測量一次抑菌圈、更換新的培養(yǎng)基，如此重復(fù)至實(shí)驗(yàn)后40天。另取不含利福平且同樣大小、形狀及共混比例的聚癸二酸酐、聚乳酸共混物藥片置于上述菌種培養(yǎng)基中作對(duì)照。
取體外已釋放40天的聚癸二酸酐、聚乳酸共混利福平緩釋藥片3片，置于在臨床上分離得到的結(jié)核桿菌菌液中3天，然后將該菌液接種在10ml改良羅氏斜面培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)8周，觀察有無結(jié)核桿菌生長。另取不含利福平且同樣大小、形狀及共混比例的聚癸二酸酐、聚乳酸共混物藥片作對(duì)照。
結(jié)果表明，聚癸二酸酐、聚乳酸共混利福平緩釋藥片對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈最大值出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)的第一天，為64.3±3.3mm。在體外抑菌實(shí)驗(yàn)的40天時(shí)間內(nèi)，平均抑菌圈直徑分別為39.8±1.3mm，而不含利福平的對(duì)照藥片未形成抑菌圈。結(jié)果還表明，結(jié)核桿菌抑菌試驗(yàn)培養(yǎng)到8周時(shí)，對(duì)照組培養(yǎng)基均有結(jié)核桿菌生長，而給藥組均無結(jié)核桿菌生長。說明聚癸二酸酐、聚乳酸共混利福平緩釋藥片在體外釋放40天后仍具有較強(qiáng)的抗結(jié)核桿菌作用。
實(shí)施例8 聚癸二酸酐、聚乳酸共混慶大霉素控釋藥片的體外釋藥實(shí)驗(yàn)取樣取聚癸二酸酐和聚乳酸比例分別為10∶90或15∶85或20∶80％的藥片(含慶大霉素8mg)各3枚，分別置于試管中，各加入0.1M磷酸緩沖液(pH7.4)10ml，37℃恒溫水浴。于實(shí)驗(yàn)開始后24時(shí)更換緩沖液；之后在實(shí)驗(yàn)第1～14天每2天更換一次緩沖液，第15～28天每3天更換一次緩沖液；第29～58天每7天更換一次緩沖液；直至釋放后2月。取出液離心后取上清液試管封裝，-20℃保存待測。
樣本檢測以上取出液的藥物濃度采用熒光光譜法(李好枝、高光恩、田潔等.熒光光譜法測定硫酸慶大霉素注射液的含量.西北藥學(xué)雜志，1995；10(1)5)進(jìn)行測定，方法是將取出液1.5ml加1.5ml衍生化試劑(見參考文獻(xiàn))，混勻，100℃水浴加熱10min，取出冷至室溫，在激發(fā)波長為422nm、發(fā)射波長為482nm處測定熒光強(qiáng)度。另取相應(yīng)濃度的慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品各1.5ml，加入衍生化試劑1.5ml，測熒光強(qiáng)度。用標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程求得各取出液中慶大霉素濃度，并計(jì)算各樣本釋放量、累積釋放量和累積釋放百分率(％)。
結(jié)果表明(表5)，各組藥片在釋放的第1天均呈現(xiàn)出不同程度的“突釋”效應(yīng)，聚癸二酸酐和聚乳酸比例為10∶90、15∶85和20∶80的共混藥片第1天釋放量分別為9.2％、18.8％和34.2％；其有效釋藥時(shí)間(＞0.3μg/ml，陳愛民，侯春林，屠開元.幾丁糖慶大霉素藥物釋放系統(tǒng)的研制及體外釋放實(shí)驗(yàn).中華骨科雜志.1997；17(9)591)分別為45天、32天和17天。
表5 聚癸二酸酐和聚乳酸不同比例對(duì)慶大霉素“突釋”效應(yīng)及有效釋放時(shí)間的影響.

實(shí)施例9 聚癸二酸酐、聚乳酸共混慶大霉素緩釋藥片的體外抑菌實(shí)驗(yàn)取聚癸二酸酐、聚乳酸共混慶大霉素緩釋藥片9片，每3片為一組，分別置于接種有金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的瓊脂糖培養(yǎng)基中央(一個(gè)培養(yǎng)皿中只放置一片)，37℃培養(yǎng)24小時(shí)后測量其抑菌圈大小。然后將藥片轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基中每3天測量一次抑菌圈、更換新的培養(yǎng)基，如此重復(fù)至實(shí)驗(yàn)后40天。另取不含慶大霉素且同樣大小、形狀及共混比例的聚癸二酸酐、聚乳酸共混物藥片置于上述菌種培養(yǎng)基中作對(duì)照。
結(jié)果表明，聚癸二酸酐、聚乳酸共混慶大霉素緩釋藥片的各菌抑菌圈直徑最大值都出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)的第一天。隨著時(shí)間的推移，抑菌圈逐漸減小。在體外抑菌實(shí)驗(yàn)的40天時(shí)間內(nèi)，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的平均抑菌圈直徑分別為45.8±4.3mm、42.4±1.7mm和39.2±2.7mm，而不含慶大霉素的對(duì)照藥片對(duì)上述各菌種均未形成抑菌圈。
權(quán)利要求
1.一種調(diào)控藥物釋放速度的載體，其特征是原料％聚癸二酸酐 5～90聚乳酸 10～95。
2.根據(jù)專利要求1所述的一種調(diào)控藥物釋放速度的載體，其特征是原料％聚癸二酸酐 10聚乳酸 90。
3.根據(jù)專利要求1所述的一種調(diào)控藥物釋放速度的載體，其特征是原料％聚癸二酸酐 15聚乳酸 85。
4.根據(jù)專利要求1所述的一種調(diào)控藥物釋放速度的載體，其特征是原料％聚癸二酸酐 20聚乳酸 80。
5.根據(jù)專利要求1所述的一種調(diào)控藥物釋放速度的載體，其特征是原料％聚癸二酸酐 25聚乳酸 75。
6.一種用于實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述的制備調(diào)控藥物釋放速度的方法，它包括下列步驟A、將聚乳酸剪成面積為3×3mm2的碎片后，稱量置于5～6倍量w/v的四氫呋喃溶液中加熱直至溶解，溫度控制在85～95℃，再加入聚癸二酸酐，使之與聚乳酸溶液溶解；B、在攪拌、研磨過程中加入藥物粉末，使其均勻地分散于含兩聚合物的四氫呋喃溶液中，隨著四氫呋喃在20～25℃下的揮發(fā)，聚癸二酸酐、聚乳酸和藥物粉末的共混物呈膜狀貼附于容器壁上，并逐漸干燥；C、將聚癸二酸酐、聚乳酸和藥物粉末的共混物置入40～70℃烤箱中加熱4～5小時(shí)促使殘余的四氫呋喃揮發(fā)，將干燥的共混物從容器壁上刮下，并剪成面積為3×3mm2的碎片；D、稱取聚癸二酸酐、聚乳酸和藥物粉末的共混物，加入預(yù)制的金屬模具中，將模具連同其中的共混物置烤箱中加熱，溫度控制在80～90℃，時(shí)間在5～15分鐘；E、取出模具置于壓片機(jī)中300kg壓力下壓模，取出模具放入乳膠手套中置自來水中冷卻，脫模，為藥物載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種制備調(diào)控藥物釋放速度的載體的方法，其特征在于藥物粉末為氧氟沙星或利福平或慶大霉素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種調(diào)控藥物釋放速度的載體及制備方法，該類藥物載體由不同比例的聚癸二酸酐與聚乳酸共混而成，其步驟是首先將聚乳酸剪碎并置于四氫呋喃溶液中加熱至溶解；再加入聚癸二酸酐，溶解；其次是在攪拌、研磨過程中加入藥物粉末；將共混物放入烤箱中加熱使四氫呋喃揮發(fā)；將干燥的共混物從容器壁上刮下，并適當(dāng)剪碎；第三是稱取共混物加入模具中，將模具連同其中的共混物置于烤箱中加熱；第四是將模具壓模，加熱；取出模具放入乳膠手套中置自來水中快速冷卻，脫模后即為含藥物粉末的藥物載體。本發(fā)明配比合理，具有調(diào)節(jié)釋藥時(shí)間、長效、安全的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K47/34GK1679960SQ20051001824
公開日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2005年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月3日
發(fā)明者汪暉, 陳廖斌, 王鈞, 傅杰 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)